CN104830867A

CN104830867A - 一种能够特异性结合癌细胞中的dkk1蛋白的适配子

Info

Publication number: CN104830867A
Application number: CN201510303692.1A
Authority: CN
Inventors: 杨洋
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-06-07
Filing date: 2015-06-07
Publication date: 2015-08-12

Abstract

本发明公开了一种靶向人DKK1蛋白的核酸适配子及其序列。本发明应用新的组合化学技术SELEX，以DKK1蛋白为靶蛋白，从单链RNA随机文库中筛选出了能与DKK1蛋白特异性结合的DNA适配子。所述适配子在其随机序列区域能形成特殊的茎环结构，能特异性、高亲和力地结合DKK1蛋白或靶向结合至癌细胞。该适配子为癌症诊疗领域提供了一种特异高效的标记分子，并为开发癌症诊断试剂与治疗药物提供了新的选择。

Description

一种能够特异性结合癌细胞中的DKK1蛋白的适配子

技术领域

本发明属于医学检测领域，具体涉及一种能够特异性结合癌细胞中的DKK1蛋白的适配子。

背景技术

DKK1编码一种分泌蛋白，其在脊椎动物发育至关重要的作用，并且是被称为Wnt信号通路的结肠癌细胞的负调节。DKKl是Wnt信号通路的抑制因子，最早克隆于1998年，发现其在非洲爪蟾早期发育中能够抑制fct诱导的轴的复制而参与头部的形成。Wnt通路是一条对胚胎发育起重要调节作用的信号通路，参与细胞增殖、分化、凋亡、细胞极性和运动等过程，其通路中信号分子的突变或异常表达与多种疾病及癌症相关。fct通路受几种分泌蛋白的调控，包括DKK、WIF(ffnt-1nhibitor factor)和 SFRP(secreted frizzled related protein)等。DKK 家族包含进化上相对保守的4个成员(DKK1-4)。DKKl编码一个分泌型糖蛋白，含有两个富含半胱氨酸的保守区域(Cysl、Cys2),能够与低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6 (low_densitylipoprotein receptor-related protein 5/6,LRP5/6)结合，并在膜蛋白 Kremenl/2 参与下通过引起LRP5/6内吞,抑制Wnt-Frizzled_LRP5/6复合体的形成,而抑制经典的fct信号通路。已知在10种不同类型人肿瘤细胞培养上清中检测出高浓度的DKKl蛋白，提示多种人肿瘤细胞分泌和高表达DKKl，DKKl可用于人类恶性肿瘤的临床血清诊断。而且，最新的研究表明ＤＫＫ１蛋白（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－１）可作为肿瘤标志物用于肝细胞癌（ＨＣＣ）的血清诊断，可用于筛检甲胎蛋白（ＡＦＰ）阴性患者，对肝脏良、恶性疾病有较好的区分效用。因此，对DKK1蛋白进行特异性的检测具有较好的应用价值。

核酸适配子(aptamer)是一种生物大分子的人工单链寡核苷酸配体,通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术从随机单链寡核苷酸文库中筛选获得。SELEX技术（即系统进化指数富集技术）是20世纪90年代初研制/发展起来的一种新的组合化学技术，其运用大容量的随机寡核苷酸文库，结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得亲和力高、特异性强的核苷酸适配子（aptamers)。该技术己成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、蛋白质、氨基酸以及各种细胞因子等。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具许多优势：a.本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成本。b.具有比抗体更高的亲和性和特异性。c.便于标记，可以在不同部位有选择性的标记。d.重复性好，稳定性好，易于保存，对高温和剧烈条件不敏感。因此，寡核苷酸适配子/SELEX技术具有良好的应用前景，特别是在抗体工程领域。消减SELEX技术是识别癌与非癌细胞间微小差异、筛选癌细胞特异性亲和适配子的有力工具。

核酸适配子筛选的基本步骤如下:设计并合成随机单链寡核苷酸文库；将文库与靶标共孵育，使文库中能与靶标特异性结合的寡核酸与靶标形成复合物，分离复合物并洗脱寡核酸，以洗脱的寡核酸为模板进行PCR扩增，制备成新的单链随机寡核苷酸文库，开始下一轮筛选；重复数轮孵育-洗脱-扩增，与靶标高特异性和高亲和力结合的核酸序列将从文库中筛选出来并被指数富集；对最后一轮筛选后制备的文库进行克隆、测序，其中长度及两端序列与文库相符者即为核酸适配子；测定各核酸适配子与靶标结合的特异性和亲和力，选出能高特异性和高亲和力结合靶标者，即可应用于靶标的检测分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种DNA适配子，能够特异性结合癌细胞中的DKKl蛋白，可以来实现癌的诊断与治疗。

本发明采用以下技术方案：

体外合成一个含有38个随机序列的单链DNA文库，通过体外转录构建出单链DNA适配子随机文库；以人DKKl蛋白其为靶蛋白，采用SELEX技术筛选具有高亲和力的表面抗原特异性DNA适配子；通过结构预测软件RNA Structure Program分析预测适配子的二级结构；通过膜结合测定实验、凝胶阻滞实验鉴定筛选适配子对靶蛋白的特异性和亲和力，得到了多个与表面抗原亲和力高、特异性强的适配子。所述的适配子都能形成各自的特异茎环结构。所述适配子能特异性、高亲和力地结合癌DKK1蛋白。所述适配子序列如下：

DKK1-ap-2：GATAGCTAGATTAATGGTACAACACCTCCTCTCCTCTCCTAAGATACAATCCTCAACA AGCATAAGATAGGATCAGTAC；

DKK1-ap-4：GATAGCTAGATTAATGGTACACAACCTCCTCCATAACCACCACAATTGTAACAACTTC AGCATAAGATAGGATCAGTAC；

DKK1-ap-5：GATAGCTAGATTAATGGTACTTAACGCACAAAACTGTCATCCAATACTCAACCTTCTT AGCATAAGATAGGATCAGTAC；

DKK1-ap-6：GATAGCTAGATTAATGGTACCCACTATTATTACCGCTTCAATCACACACACCATTATA AGCATAAGATAGGATCAGTAC；

DKK1-ap-9：GATAGCTAGATTAATGGTACATCTTCACGCCTCATTACATTCACCTTTATCAGAACAA AGCATAAGATAGGATCAGTAC；

DKK1-ap-11:GATAGCTAGATTAATGGTACAAACCCTTAGACTCAACTTCTTCCGCCATAAACTTCTA AGCATAAGATAGGATCAGTAC；

DKK1-ap-12:GATAGCTAGATTAATGGTACCACATCCACCTCACATACGCACTAACTTACATCCTCAT AGCATAAGATAGGATCAGTAC；

DKK1-ap-14：GATAGCTAGATTAATGGTACCATCGCTCATTTACCTCCTATAACTCTCAGATACACCC AGCATAAGATAGGATCAGTAC；

DKK1-ap-15：GATAGCTAGATTAATGGTACATATATTCTACCGCCTCTAAAACAAAGACTCTTCAATC AGCATAAGATAGGATCAGTAC；

DKK1-ap-17：GATAGCTAGATTAATGGTACCATTTATATTCACTTCTTCCTCACGCACTATACTTAAT AGCATAAGATAGGATCAGTAC；

DKK1-ap-18：GATAGCTAGATTAATGGTACTCTAAGATAAACCACCACCAACTCTTATATATTACTTC AGCATAAGATAGGATCAGTAC；

DKK1-ap-18’：AACACCTCCTCTCCTCTCCTAAGATACAATCCTCAACA。

本发明的有益效果： (1)获得了能够特异高效结合癌细胞中DKK1蛋白的适配子。该适配子可以大量人工制备，方法简单，成本低廉。 (2)以核酸适配子为基础可以制备成为靶向癌细胞的诊断和治疗药物。

具体实施方式

实施例1 DKK1蛋白特异性结合DNA适配子的SELEX筛选

采用本领域常规的DKK1蛋白表达的方法。根据已知的基因序列，通过常规基因合成或者基因组调取的方式来获得相应的基因序列，采用酵母表达的方法体外表达DKK1蛋白，获得了相应的蛋白。也可以通过购买的方式获得，比如ProSpec，货号：PRO-673 。

化学合成初始寡核苷酸随机文库及引物，序列如下：(5′-GATAGCTAGATTAATGGTAC----N38----AGCATAAGATAGGATCAGTAC-3′)，其中N38为38个随机寡核苷酸；

引物P1：GATAGCTAGATTAATGGTAC;

引物P2：GTACTGATCCTATCTTATGCT。

将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。70 μg RNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA 分子，然后与2ug DKK1蛋白 37°C孵育30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液（6mol/L尿素，0. 6mol/L醋酸铵，l.5mmol/L EDTA,0. 15% SDS)中煮沸4min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20 μ 1 DEPC水中；以RNA为模板 RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行11轮。最后获得了12个能够具有较好的与DKK1蛋白特异性结合的适配子，其序列分别如SEQ ID NO：1-12所示。

实施例2 特异性高亲和力的DKK1结合适配子的获得

将RNA适配子分别取1.5μ g，用牛小肠碱性磷酸酶（CIP) 37°C 消化lh，纯化回收去磷酸化的RNA ；通过T4多核苷酸激酶标记[γ -32P]ATP于去磷酸化的 RNA分子末端。10nmol放射性标记的RNA适配子分别与不同浓度（1-200nM)的DKK1蛋白 37°C 孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与DKK1的解离常数。结果如下：

实施例3 所述适配子特异性分析以及稳定性分析

分别采用人血白蛋白，RASAL1蛋白，YAP蛋白，TRIM59蛋白，TS/MDEP蛋白与12条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与DKK1结合保持较高的特异性。

将所述的适配子，取0.1ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置三周。通过RT-PCR检测，发现二周的放置其结构稳定，没有被降解。

实施例4 适配子与各癌细胞结合特异性分析

细胞爬片，孵育、结合、共聚焦流图:

1)分别培养正常胃粘膜细胞GES-1、结肠癌细胞Lovo、胃癌细胞SGC-7901、临床胃癌标本细胞悬液、肝癌HepG2细胞，调整浓度为1X 10³/ml，接种于预先放置了盖玻片的6孔板，爬片过夜；甲醛-20°C固定2小时，PBS冲洗。

2)取50 pmol的TAMRA标记的筛选的12种适配子，与靶细胞结合于1OOul含20%FBS的结合液；

3)冰上放置50min令其结合；

4)以0.7ml结合液(含0.1%的NaN3)洗涤两次；

5)以0.4ml结合液(含0.1%的NaN3)重悬；

6)激光共聚焦显微观察与靶细胞结合的情况。

实验结果:

结肠癌细胞Lovo、胃癌细胞SGC-7901、临床胃癌标本细胞悬液、肝癌HepG2细胞中都高亮的显示较强的结合特性，并且结合在细胞的表面。而在正常胃粘膜细胞GES-1表现出忽略不计的结合特性。由此可见，所述的适配子能够对癌细胞具有选择性识别作用。

〈110〉杨洋

〈120〉一种能够特异性结合癌细胞中的DKK1蛋白的适配子

〈160〉12

〈210〉1

〈211〉80

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉 DKK1-ap-2

GATAGCTAGATTAATGGTACAACACCTCCTCTCCTCTCCTAAGATACAATCCTCAACA AGCATAAGATAGGATCAGTAC

〈210〉2

〈211〉 80

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉DKK1-ap-4

GATAGCTAGATTAATGGTACACAACCTCCTCCATAACCACCACAATTGTAACAACTTC AGCATAAGATAGGATCAGTAC

〈210〉3

〈211〉 80

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉DKK1-ap-5

GATAGCTAGATTAATGGTACTTAACGCACAAAACTGTCATCCAATACTCAACCTTCTT AGCATAAGATAGGATCAGTAC

〈210〉4

〈211〉 80

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉DKK1-ap-6

GATAGCTAGATTAATGGTACCCACTATTATTACCGCTTCAATCACACACACCATTATA AGCATAAGATAGGATCAGTAC

〈210〉5

〈211〉 80

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉DKK1-ap-9

GATAGCTAGATTAATGGTACATCTTCACGCCTCATTACATTCACCTTTATCAGAACAA AGCATAAGATAGGATCAGTAC

〈210〉6

〈211〉 80

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉DKK1-ap-11

GATAGCTAGATTAATGGTACAAACCCTTAGACTCAACTTCTTCCGCCATAAACTTCTA AGCATAAGATAGGATCAGTAC

〈210〉7

〈211〉 80

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉DKK1-ap-12

GATAGCTAGATTAATGGTACCACATCCACCTCACATACGCACTAACTTACATCCTCAT AGCATAAGATAGGATCAGTAC

〈210〉8

〈211〉 80

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉DKK1-ap-14

GATAGCTAGATTAATGGTACCATCGCTCATTTACCTCCTATAACTCTCAGATACACCC AGCATAAGATAGGATCAGTAC

〈210〉9

〈211〉 80

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉DKK1-ap-15

GATAGCTAGATTAATGGTACATATATTCTACCGCCTCTAAAACAAAGACTCTTCAATC AGCATAAGATAGGATCAGTAC

〈210〉10

〈211〉 80

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉DKK1-ap-17

GATAGCTAGATTAATGGTACCATTTATATTCACTTCTTCCTCACGCACTATACTTAAT AGCATAAGATAGGATCAGTAC

〈210〉11

〈211〉 80

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉DKK1-ap-18

GATAGCTAGATTAATGGTACTCTAAGATAAACCACCACCAACTCTTATATATTACTTC AGCATAAGATAGGATCAGTAC

〈210〉12

〈211〉38

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉DKK1-ap-18’

AACACCTCCTCTCCTCTCCTAAGATACAATCCTCAACA

Claims

1.一种特异性识别DKK1蛋白寡核苷酸序列，其特征在于为包括SEQ ID No.1-12任一条序列所示，或者在该序列的基础上进行的一个或几个核苷酸的替换，并保留其活性。

2.权利要求1所示的寡核苷酸序列在检测癌症中的应用。

3. 权利要求1所示的寡核苷酸序列在用于制备识别DKK1蛋白的试剂盒应用。

4. 权利要求1所示的寡核苷酸序列在用于制备检测癌症中的试剂盒应用。

5. 如权利要求4所示的应用，其特征在于：所述癌症为结肠癌、胃癌或肝癌。