JP7390002B2

JP7390002B2 - 頭頸部がんの検出を補助する方法

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Publication number: JP7390002B2
Application number: JP2019559214A
Authority: JP
Inventors: 栄俊田原; 信田原
Original assignee: Hiroshima University NUC
Current assignee: Hiroshima University NUC
Priority date: 2017-12-13
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2023-12-01
Anticipated expiration: 2038-12-13
Also published as: US20210071259A1; JPWO2019117270A1; EP3725897A4; WO2019117270A1; EP3725897A1

Description

本発明は、頭頸部がんの検出を補助する方法に関する。

頭頸部がんとは、脳よりも下方で鎖骨よりも上方の領域に発生するがんである。頭頸部には呼吸や食事など人間が生きる上で必要な機能や、発声、味覚、聴覚など社会生活を送る上で重要な機能が集中している。そのため、この部分に障害が起きると直接ＱＯＬに影響するため、がんを治すための根治性とＱＯＬとのバランスを保った治療が必要である。また、頭頸部は、顔面の形態の維持や表情の形成を行うため、整容的な配慮も必要である。

このような頭頸部がんを含む癌を検出する方法として、血液中のマイクロRNA（以下、「miRNA」）の存在量を指標とする方法が提案されている（特許文献１～５）。

国際公開第2009/133915号公報国際公開第2012/161124号公報特表2013-539018号公報特表2015-502176号公報特開2015-51011号公報

上記の通り、種々のmiRNAが、頭頸部がんを含むがんの検出のための指標として提案されているが、より正確に頭頸部がんを検出することができれば有利であることは言うまでもない。

したがって、本発明の目的は、頭頸部がんを高精度に検出することを補助する、頭頸部がんの検出を補助する方法を提供することである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、頭頸部がんにおいて存在量が増大又は減少するmiRNA、そのアイソフォーム(isomiR）、miRNA前駆体、転移ＲＮＡ断片(tRF)、非コードRNA断片 (LincRNA、MiscRNA)を新たに見出し、これらを指標とすることにより、高精度に頭頸部がんが可能になることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1) 生体から分離された血液試料中に含まれる、塩基配列が配列番号１６１、１６２、１６０、１４５、１４３、１４６、１４０、１４１のいずれかで示されるmiRNAのアイソフォーム (isomiR）または非コードRNA断片 (LincRNA）の少なくとも１種の存在量を指標とする舌がんの検出を補助する方法であって、前記少なくとも１種の存在量が健常者よりも少ないことが、舌がんを発症している可能性が大きいことを示す、方法。
(2) 前記少なくとも１種が、塩基配列が配列番号１６１で示されるmiRNAのアイソフォーム (isomiR）である(1)に記載の方法。
(3) 前記血液試料が、血清又はエクソソームである(1)または(2)に記載の方法。

本発明の方法によれば、高精度に、かつ、それでいて簡便に頭頸部がんを検出することが可能であるので、頭頸部がんの検出に大いに寄与する。

上記の通り、本発明の方法では、生体から分離された被検試料中に含まれる特定のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片（tRF）、非コードRNA断片 (LincRNA、MiscRNA)（以下、便宜的に「miRNA等」と呼ぶことがある）の存在量を指標とする。これらのmiRNA等自体の塩基配列は配列表に示すとおりである。本発明の方法に用いるmiRNA等の一覧を下記表１－１～表１－７に示す。

これらのmiRNA等のうち、塩基配列が配列番号１～１６２で示されるmiRNA等（以下、便宜上、例えば「塩基配列が配列番号１で示されるmiRNA等」を単に「配列番号１のmiRNA等」や「配列番号１のもの」と呼ぶことがある）は、血清中又はエクソソーム中に存在するものである。
これらのmiRNA等は、頭頸部がん患者の血清又はエクソソーム中の存在量と、健常者の血清又はエクソソーム中の存在量との比の対数（底が２の対数で「log FC」（FCは、fold change)と呼ばれる）の絶対値が1.00以上のものが多く、統計学的に有意(t検定でp<0.05)のものである。

配列番号１～７１および１１８～１３６のmiRNA等は、頭頸部がん患者中の存在量が健常者中の存在量よりも多いものであり、配列番号７２～１１７および１３７～１６２のmiRNA等は、頭頸部がん患者中の存在量が健常者中の存在量よりも少ないものである。

これらのうち、配列番号１１と３０のmiRNAの組合せ、配列番号１１と２６のmiRNAの組合せ、配列番号１１と１１７のmiRNAの組合せ、配列番号３０と１１８のmiRNAの組合せ、および配列番号１５７と１６２のmiRNAの組合せのものを指標とする方法では、下記実施例に具体的に記載するとおり、初期の舌がんでも検出可能である。

がんマーカーの精度を示す指標としてROC曲線下面積(AUC(Area Under Curve))が用いられており、一般的にAUCが0.7以上のものががんマーカーとして有効であると言われている。AUCが0.90以上のものは高精度であり、0.97以上は非常に高精度、0.99以上は極めて高精度、1.00で完璧（偽陽性及び偽陰性が全くない）である。したがって、本発明においても、AUCが0.90のものが好ましく、さらに0.97以上のものが好ましく、さらに0.99以上のものが好ましく、1.00のものが最も好ましい。塩基配列が配列番号１６２、１６０、１４５、１４３、１４６、１４０、１４１のものがAUC 0.97以上で好ましく、これらのうち、配列番号１６２、１６０のものがAUC 0.98以上でさらに好ましい。

さらに、配列番号１１５または１１６のisomiRは、舌がんの術前と術後でFC（fold change)が変化するため、これらを用いることにより、手術が成功したか否かを確認することが可能となる。

被検試料としては、miRNA等を含む体液であれば特に限定されないが、通常、血液試料（血漿、血清及び全血を包含する）が好ましく用いられる。血清中に存在するものは、血清又は血漿を被検試料とすることが簡便で好ましい。エクソソーム中に存在するものは、血清又は血漿を被検試料として、この中のエクソソームから全ＲＮＡを抽出して各miRNA等の存在量を測定することが好ましい。血清又は血漿中の全ＲＮＡの抽出方法は周知であり、下記実施例に具体的に記載されている。血清又は血漿中のエクソソームからの全ＲＮＡの抽出方法自体も公知であり、詳細は下記実施例に具体的に記載されている。

各miRNA等の存在量の測定（定量）は、次世代シーケンサーを用いて行うことが好ましい。次世代シーケンサーのように配列を読む機器であれば、機種を特定しない。下記実施例に具体的に記載されるように、本発明の方法では、定量するmiRNA等には、例えば、通常の成熟型miRNAの5’末端および／または3’末端からわずか１塩基以上が欠失または付加されているだけのisomiRを、基本となるmiRNAと区別して定量する必要があるので、精度の観点から、miRNAの定量に広く用いられている定量的逆転写ＰＣＲ(qRT-PCR)よりも次世代シーケンサーを用いて行うことが好ましい。具体的には下記実施例において詳細に記載するが、簡単に述べると、この定量方法は、次のようにしておこなうことができる。血清或いは血漿中に存在するRNAが一定である場合、それらを用いた次世代シークエンス解析において読まれたリード数のうち、ヒト由来のシーケンスを100万リード数に換算して、100万リード数当たりのそれぞれのisomiRや成熟型miRNAのリード数を測定値とする。疾患によって健常人に比較して血清中または血漿中のRNAが変化する場合は、血清及び血漿中で存在量の変動が少ないmiRNAを用いる場合がある。なお、血清又は血漿中のmiRNA等を定量する場合には、血清及び血漿中で存在量の変動が少ないmiRNAであるlet-7g-5p、miR-425-3p及びmiR-425-5pから成る群より選ばれる少なくとも１種のmiRNAを内部標準として用いることが好ましい。

判定に用いる、各miRNA等の存在量のカットオフ値としては、各miRNA等について、健常者に対する統計学的有意差(t検定で、p<0.05、好ましくはp<0.01、さらに好ましくはp<0.001)の有無を基準とすることが好ましい。具体的には、好ましくは、例えば、偽陽性率が最良の値（最も低くなる値）なるプロット点におけるlog₂リード数（カットオフ値）を各miRNA等について設定することができ、例えば、いくつかの各miRNA等におけるカットオフ値(log₂リード数)は表２に示すとおりである。なお、表２に示されるカットオフ値は、単なる例に過ぎず、統計学的有意差が出る限り、他の値をカットオフ値として採用することができる。また、データを採取する患者及び健常者の集団が異なれば、最良のカットオフ値も異なる。もっとも、通常、表２又は表３に示されるカットオフ値の±２０％の範囲内、特には±１０％の範囲内でカットオフ値を設定することができる。

なお、上記した各miRNA等は、頭頸部がん患者と健常者の間でそれぞれ統計学的有意差を持つので、単独で指標として用いることもできるが、複数のmiRNA等を組み合わせて指標としてもよく、その場合にはさらに正確な頭頸部がん検出の補助が可能になる。

また、頭頸部がんが疑われるか又は頭頸部がんに罹患するヒトの被検試料中のmiRNA等の存在量を検出する方法も提供される。
すなわち、頭頸部がんが疑われる又は頭頸部がんに罹患するヒトの被検試料中の塩基配列が配列番号１６２、１６０、１４５、１４３、１４６、１４０、１４１、１～１３９、１４２、１４４、１４７～１５９および１６１のいずれかで示されるmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR)、miRNA前駆体、転移RNA断片 (tRF)、又は非コードRNA断片 (LincRNA、MiscRNA)の少なくとも1種の存在量を検出する方法であって、
ヒトから血液試料を得る工程、及び
次世代シーケンサーまたはqRT-PCRを用いて、前記血液試料内のmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR)、miRNA前駆体、転移RNA断片 (tRF)、又は非コードRNA断片 (LincRNA、MiscRNA)の存在量を測定する工程を含み、
ここで、塩基配列が配列番号１～７１、１１８～１３６のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片、若しくは非コードRNA断片の存在量が健常者よりも多い、又は塩基配列が配列番号７２～１１７、１３７～１６２のいずれかで示される少なくとも1種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片、若しくは非コードRNA断片の存在量が健常者よりも少ない、方法、も提供される。

本発明において、頭頸部がんとしては、舌がん（口腔がん）、上顎洞がん、上咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん、喉頭がん、甲状腺がん、唾液腺がん、原発不明頸部転移がん等が挙げられる。

また、上記した本願発明の方法により、頭頸部がんが検出された場合、頭頸部がんが検出された患者に有効量の抗頭頸部がん剤を投与することにより、頭頸部がんを治療することができる。抗頭頸部がん剤としては、シスプラチン（CDDP）、5-FU（5-フルオロウラシル）、ドセタキセル（Docetaxel）等を挙げることができる。

以下、本発明を実施例及び比較例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例１～１６５
１．材料及び方法
(1) 臨床検体
頭頸部がん患者２４例、健常者１０例の血漿を用いた。

(2) 血清中のＲＮＡの抽出
血清中 RNA の抽出は、miRNeasy Mini kit (QIAGEN) を用いて行った。
1) 凍結した血漿サンプルを融解し、10000 rpm で 5 分間、室温で遠心し、凝集タンパク質や血球成分を沈殿させた。
2) 上清 200 μＬを新しい 1.5 mL チューブに移した。
3) 1000 μＬの QIAzol Lysis Reagent を加えて十分に混和し、タンパク質成分を変性した。
4) RNA 抽出のコントロール RNA として 0.05 nM cel-miR-39 を 10 μＬ加え、ピペッティングで混和した後、室温で 5 分間静置した。
5) 水層と有機溶媒層の分離促進のため、200μＬのクロロホルムを加え、十分に混和し、室温で 3 分間静置した。
6) 12000 xg、15分間、4℃で遠心し、上層の水層650μＬを新しい2mLチューブに移した。
7) RNA を析出させるため、975μＬの 100% エタノールを加え、ピペッティングで混和した。
8) 650 μＬの 7) を miRNeasy Mini spin column (以下、カラム) に移し、室温で 1 分間静置後、8000 xg、15 秒間、室温で遠心し、RNA をカラムのフィルターに吸着させた。カラムから通過した溶液は廃棄した。
9) 7) の溶液を全てカラムに通すまで 8) を繰り返し、全ての RNA をフィルターに吸着させた。
10) フィルターに付着した夾雑物の除去のため、650 μＬの Buffer RWT をカラムに加え、 8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。カラムから通過した溶液は廃棄した。
11) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μＬのBuffer RPE をカラムに加え、8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。カラムから通過した溶液は廃棄した。
12) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μＬのBuffer RPE をカラムに加え、8000 xg、2 分間、室温で遠心した。カラムから通過した溶液は廃棄した。
13) フィルターに付着している溶液を完全に除去するため、カラムを新しい 2 mL collection チューブに移し、10000 xg、1 分間、室温で遠心した。
14) カラムを 1.5 mL チューブに移し、50 μＬの RNase-free water を加え、室温で 1 分間静置した。
15) 8000 xg、1 分間、室温で遠心し、フィルターに吸着した RNA を溶出した。溶出した RNAは、そのまま次の実験に用い、残りは -80 ℃ で保存した。

(3) エクソソームからのＲＮＡの抽出
血清中のエクソソームは、次のようにして回収した。
サーモフィッシャーサイエンティフィック社の＿Total Exosome Isolation (from serum)で精製した。回収したエクソソームからのＲＮＡの抽出は、miRNeasy Mini kit (QIAGEN) を用いて行った。

(4) miRNA等の定量
miRNA等の定量は、次のようにして行った。
二群等でmiRNA等の定量を行う場合は、同様の方法で回収した細胞外小胞(エクソソームを含む)を用いて同様の方法でRNAを精製してcDNAライブラリーを作成して次世代シークエンス解析を行う。次世代シークエンス解析は、配列を読む機器であれば機器を限定しない。

(5) カットオフ値及びAUCの算出
定量結果からのカットオフ値及びAUCの算出は、具体的に次のようにして行った。JMP Genomics 8を用いてロジスティック回帰分析を実施し、ROC曲線とAUCの算出を行った。また、ROC曲線の左上隅の点（感度1.0, 特異度 1.0）との距離が最小となる点をカットオフ値とした。

２．結果
結果を表２－１～表２－１０に示す。

これらの結果からわかるように、配列番号１～７１および１１８～１３６のmiRNA等は、頭頸部がん患者中の存在量が健常者中の存在量よりも有意に多く、配列番号７２～１１７および１３７～１６２のmiRNA等は、頭頸部がん患者中の存在量が健常者中の存在量よりも有意に少なかった。本発明の方法（実施例１～１１６、１２２～１６５、１６７～１６８）によれば、高精度に頭頸部がんの検出が可能であることが示された。

また、表２－９の結果から、配列番号１１５または１１６のisomiRは、舌がんの術前と術後でFC（fold change)が変化するため、これらを用いることにより、手術が成功したか否かを確認することが可能となることが示された。さらに、表２－１０の結果から、配列番号１１と３０のmiRNAの組合せ、配列番号１１と２６のmiRNAの組合せ、配列番号１１と１１７のmiRNAの組合せ、配列番号３０と１１８のmiRNAの組合せ、および配列番号１５７と１６２のmiRNAの組合せの場合には、ＡＵＣ値が0.91406～0.97628となり、初期の舌がんでも検出可能であることが明らかになった。

Claims

生体から分離された血液試料中に含まれる、塩基配列が配列番号１６１、１６２、１６０、１４５、１４３、１４６、１４０、１４１のいずれかで示されるmiRNAのアイソフォーム (isomiR）または非コードRNA断片 (LincRNA）の少なくとも１種の存在量を指標とする舌がんの検出を補助する方法であって、前記少なくとも１種の存在量が健常者よりも少ないことが、舌がんを発症している可能性が大きいことを示す、方法。
前記少なくとも１種が、塩基配列が配列番号１６１で示されるmiRNAのアイソフォーム (isomiR）である請求項１記載の方法。
前記血液試料が、血清又はエクソソームである請求項１または２に記載の方法。