CN116064768A - 视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎诊断分子标记物circRNA试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域,特别涉及视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎诊断分子标记物circRNA试剂盒及应用。实验发现,相对于对照组人群,hsa_circRNA_054220在视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎患者的脑脊液中表达下调。提示hsa_circRNA_054220是视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎中的低表达circRNA,是有助于视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎诊断的生物标志物。本发明为视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎诊断提供了强有力的分子生物学基础,具有深远的临床意义和推广性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,特别涉及视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎诊断分子标记物circRNA试剂盒及应用。
背景技术
视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎是特发性视神经炎的下位概念,根据《视神经炎诊断和治疗专家共识(2014年)》特发性视神经炎包括(1) 特发性脱髓鞘性视神经炎亦称经典多发性硬化相关性视神经炎和(2)视神经脊髓炎相关性视神经炎(NMO-ON),以及(3)其他中枢神经系统脱髓鞘疾病相关性视神经炎。2015年《NMOSD诊断标准国际共识》共识取消了 NMO的个别定义,而将NMO归入视神经脊髓炎谱系疾病(Neuromyelitis opticaspectrum disorder,NMOSD)。
视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎(Neuromyelitis optica spectrumdisorderrelated optic neuritis,NMOSD-ON)在亚洲人群中的发病率显著高于其他群体,占中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病的比例可达到22.4-28%,由于其高复发、高致残性的特点,严重影响了患者的生活和心理健康。
在过去的20年中,NMOSD-ON的诊断除依靠临床症状外主要依赖于自身抗体的检测,例如水通道蛋白4抗体(Aquaporin-4 antibodies,AQP4- IgG)作为NMOSD的主要诊断标准之一,可以通过攻击星形胶质细胞膜上分布的AQP4导致细胞的炎症反应及脱髓鞘改变;髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体(Anti-myelin oligodendrocyte glycoproteinantibodies,MOG-IgG)则可以通过激活补体系统参与NMOSD病变等。但是,以血清抗体为主要依据的诊断方式仍具有一定局限性,有研究显示10%-30%具有临床症状的 NMOSD患者无法检测到AQP4-IgG,并且由于患者所处病程的影响,血清抗体并不能被持续稳定的检出。
更重要的是,中枢脱髓鞘疾病各个亚类之间的非特异性症状和阳性抗体的交叉极易造成诊断的混淆。故在临床诊断过程中,常需要综合多种检查结果对遗传性、外伤性、中毒性和压迫性等视神经病变进行排除性诊断,此过程为患者造成了严重的经济和心理负担,所以寻找新的可靠而准确的临床生物标志物对提高NMOSD-ON的诊断效率具有非常重要的意义。
目前,针对NMOSD-ON的生物标志物研究已有较多的报道,除上述 AQP4抗体和MOG抗体外,MBP(Myelin basic protein,MBP)抗体和OCB (Oligoclonal bands,OCB)也可辅助诊断。细胞因子和趋化因子类型的生物标志物的则包括IL-6、IL-8等,是T细胞和B细胞参与免疫应答的体现。血脑屏障和胶质细胞的破坏也可以使一些蛋白质特异性增加,例如MMP-9、 GFAP等。所以,生物标志物本质上是疾病在病理代谢过程中的产物,综合目前的研究进展,大多数标志物只反应了中枢神经系统的炎症状态,并未反应出NMOSD-ON特异性的病理过程。
因此,提供具有较高的特异性和灵敏度,便于检测,经济成本相对较低,并且适用于疾病的早期诊断的生物标志物具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎诊断分子标记物circRNA试剂盒及应用。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了环状非编码RNA在制备视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎诊断的分子标记物中的应用;所述环状非编码RNA为 hsa_circRNA_054220。
在本发明的一些具体实施方案中,hsa_circRNA_054220表达量下调。
本发明还提供了检测环状非编码RNA表达水平的产品在制备视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎诊断工具中的应用;所述环状非编码RNA为 hsa_circRNA_054220。
在本发明的一些具体实施方案中,hsa_circRNA_054220表达量下调。
在本发明的一些具体实施方案中,所述产品包括:通过实时荧光定量 PCR检测所述环状非编码RNA表达水平的试剂。
在本发明的一些具体实施方案中,所述产品为特异性扩增所述环状非编码RNA的引物,序列如SEQ ID No.2~3所示。
此外,本发明还提供了检测环状非编码RNA表达水平的产品,包括特异性扩增所述环状非编码RNA的引物;所述环状非编码RNA为 hsa_circRNA_054220。
在本发明的一些具体实施方案中,所述引物的序列如SEQ ID No.2~3所示。
在本发明的一些具体实施方案中,所述检测的样本包括脑脊液、血浆、全血样本。
此外,本发明还提供了检测环状非编码RNA表达水平的试剂盒,包括所述的产品以及可接受的试剂。
本申请人通过实验发现,相对于对照组人群,hsa_circRNA_054220在视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎患者的脑脊液中表达下调。提示 hsa_circRNA_054220是视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎中的低表达 circRNA,是有助于视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎诊断的生物标志物。本发明为视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎诊断提供了强有力的分子生物学基础,具有深远的临床意义和推广性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示对照组与特发性视神经炎患者脑脊液微阵列分析热图;对照组 (control)与特发性视神经炎患者组(Test)脑脊液之间差异表达环状RNA的分层聚类分析产生的热图;色标显示不同样本中circRNA的相对表达水平,红色代表上调,绿色代表下调;
图2示特发性视神经炎患者脑脊液中差异表达circRNA火山图;图中以绿色直线划分相应的fold change和P-values fold change上调或下调1.5倍,且P <0.05;
图3示脑脊液目标circRNA经qPCR扩增后检测结果;图中数据以 means±SD展示(Control n=4,NMOSD-ON n=6)*P<0.05,**P<0.01,***P< 0.001;图中hsa_circRNA_054220为芯片命名,circbase中命名为 hsa_circRNA_0054220;
图4示qPCR检测hsa_circRNA_054220在不同分组脑脊液中的表达情况;图中数据以中位数±四分位数间距展示*P<0.05;NMOSD-ON为视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎,NC为对照组,ION为特发性视神经炎;
图5示hsa_circRNA_054220的ROC曲线;AUC=0.919;P<0.05;
图6示qPCR检测hsa_circRNA_054220在不同分组血浆中的表达情况;图中数据以中位数±四分位数间距展示*P<0.05;
图7示hsa_circRNA_406587扩增曲线;
图8示hsa_circRNA_406587溶解曲线
图9示hsa_circRNA_406587qPCR产物测序;
图10示hsa_circRNA_406587产物测序结果与数据库序列对比;
图11示hsa_circ_054220 SEQ ID No.4和5所示引物扩增曲线;
图12示hsa_circ_054220 SEQ ID No.4和5所示引物溶解曲线;
图13示hsa_circ_054220 SEQ ID No.4和5所示引物产物测序;
图14示hsa_circ_054220 SEQ ID No.4和5所示引物qPCR产物与数据库序列对比;
图15示如SEQ IDNo.2和3所示引物的qPCR扩增曲线;
图16示如SEQ IDNo.2和3所示引物qPCR溶解曲线;
图17示两对引物参与qPCR扩增后产物琼脂糖凝胶电泳结果;
图18示如SEQ ID No.4和5所示引物参与qPCR扩增后产物琼脂糖凝胶电泳结果。
具体实施方式
本发明公开了视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎诊断分子标记物 circRNA试剂盒及应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种用于视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎早期诊断的环状非编码RNA,对NMOSD-ON的发病检测有重要意义。用于NMOSD-ON 早期诊断的分子标记物hsa_circRNA_054220(如SEQ ID No.1所示),其序列为(来源于circbase):
>hsa_circ_054220|NR_037875|LOC728730
GAAGAAGAGGATTTATCTGACTCAACTGGAGATGGCTCCCTTCCCTTAT TTATTGTTGCATCCTGAAGCTTCCCCCATGCTGGGCTCAGTGTGAACAA ACAGCGCGGGAGAATGCAACCACTGCAGAGGCATATGTTTGAGATACC TGGCCACTGGAGGTCATCTCGTCTACTATATTCACCGCAGATAAAGAAT GAAAAGAGAATACACAACCTTGTGATTGCTAGCAGTGAAAGCTCAGAG TTATGACATAACA
本发明还提供上述分子标记物hsa_circ_054220的应用。检测 hsa_circ_054220表达水平的产品在制备视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎早期诊断工具中的应用。所述的检测表达水平的产品包括:通过实时荧光定量PCR检测hsa_circ_054220表达水平的制剂。包括特异性扩增 hsa_circ_054220的引物。序列如表1所示。
本发明还提供一种用于视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎早期诊断的试剂盒,包含检测hsa_circ_054220表达水平的试剂,包含一对通过实时荧光定量PCR特异性扩增hsa_circ_054220的引物,其引物序列。申请人发现相对于对照组人群,hsa_circRNA_054220在视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎患者的房脑脊液中表达下调。提示hsa_circRNA_054220是视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎中的低表达circRNA,是有助于视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎诊断的生物标志物。本发明为视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎诊断提供了强有力的分子生物学基础,具有深远的临床意义和推广性。
本技术方案采用的样本为脑脊液,由于视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎往往结合全身系统疾病,也可采用血浆、全血样本等其他临床常用样本进行试验。本试验同时已采用血浆进行试验,发现患者与对照组表达水平统计学差异较小,诊断价值低于脑脊液样本。如图6所示。
circRNA具有稳定性好,不易降解等优点,有较高的辅助诊断价值,利于临床推广使用。我们采用circRNA芯片检测以获取异常表达的脑脊液 circRNAs表达谱,并应用qRT-PCR的方法进行验证,具有严密的设计和成熟的评价体系。首次发现脑脊液中hsa_circRNA_054220作为一个重要的生物学检测指标,检测指标微创廉价,可广泛应用于临床检测,解决视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎临床诊断时间长,过程繁琐,成本较高,并且灵敏度低的问题。为视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎的诊断提供新的思路,同时为完善视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎的发病机制以及治疗靶点提供新的方向。
本发明提供的视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎诊断分子标记物 circRNA试剂盒及应用中,所用原料及试剂均可有市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1特发性视神经炎circRNA表达谱的建立
1、样本收集
该研究已通过中南大学湘雅二医院伦理委员会审批。所有脑脊液标本通过腰椎穿刺获得:嘱患者采取胸膝位,以L3/4椎间隙为穿刺点,常规消毒,以2%利多卡因逐层局麻后穿刺,使用普通管采集脑脊液1ml,冻存管每管 250ul分装,在离体15分钟内放入-80℃冰箱保存,以进行circRNA生物标记物分析。
NMOSD-ON纳入标准:1)符合2015年《NMOSD诊断标准国际共识》,2)急性视神经炎,3)MRI显示视神经肿胀、增粗,脱髓鞘改变; 4)VEP异常。排除标准:1)缺血性、外伤性、压迫及浸润性、中毒性、营养代谢性、遗传性视神经病变等;2)其他视网膜疾病、青光眼等眼科疾病。
对照组纳入标准:1)临床诊断为头痛查因;2)头部MRI检查显示无明显异常;3)脑脊液检查生化、常规、革兰氏染色、抗酸、墨汁染色阴性; 4)排除眼科疾病、全身传染性疾病、外伤及遗传疾病病史。
2、RNA提取
从-80℃冰箱中取出脑脊液,解冻后于4℃ 12,000×g离心10分钟,去除可能存在的杂质,取250ul脑脊液液体,转至1.5ml的离心管中,加入750μl的 TRIzol LS Reagent(Invitrogen life technologies)试剂,手动剧烈振荡管体至混匀。于15到30℃孵育5分钟,以便核酸蛋白复合体完全解离。每管样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育 2到3分钟。4℃下12,000×g离心15分钟。将上层的无色的水相转移到新离心管中,并加入500μl异丙醇,混匀以沉淀其中的RNA。混匀后15到30℃孵育10分钟,于4℃ 12,000×g离心10分钟。移去上清液,加入至少1ml的 75%乙醇,清洗RNA沉淀。振荡后,4℃ 7,500×g离心5分钟。去除乙醇溶液,空气中干燥RNA沉淀5-10分钟,再加入无RNA酶水15ul。
3、cRNA合成及标记
利用Rnase R去除线性RNA并富集circRNA。使用随机引物法,根据试剂盒说明书扩增circRNA并逆转录(Arraystar Super RNA Labeling kit)成为带荧光标记的cRNA。标记的cRNA通过RNeasy Mini Kit(Qiagen)纯化。利用NanoDrop ND-1000测量标记的cRNA的浓度及活性。
4、芯片杂交和数据分析
在标准条件下将标记好的探针和芯片(Human Circular RNA Array 2.0)进行杂交。使用Agilent Scanner G2505C扫描芯片的荧光强度,并将实验结果数据转换保存。P值<0.05为差异有统计学意义。
5、结果
脑脊液是临床常用的体液样本,由于其在临床上易取、具有个体特异性并且直接参与维护中枢神经系统微环境,所以适宜作为生物标志物相关研究的研究对象。目前已有多种研究报道以脑脊液作为中枢神经系统疾病诊断的介质,并广泛用于临床。因此,我们认为脑脊液具有应用于特发性视神经炎研究的潜能。在10份脑脊液样本中(4份对照组,6份患者组),芯片检测目标包括13617个,对于荧光强度过低的circRNAs进行过滤后共检测到3476个目标circRNA(图1),其中表达有显著差异的目标circRNA(Fold Change≥1.5且P-value<0.05)包括55个上调目标,149个下调目标(图2)。目前,这是第一个建立的特发性视神经炎脑脊液相关circRNAs表达谱。
实施例2 qRT-PCR验证
在先前建立的表达谱中挑选出14个有显著差异表达的目标circRNAs,利用qPT-PCR在10例样本中再次进行验证。2种circRNAs在两组脑脊液中的差异表达量具有统计学差异,且改变趋势与芯片一致, hsa_circRNA_406587、hsa_circRNA_054220相对于对照组下调(图3)。然后选取具有统计学差异的circRNA:hsa_circRNA_054220进行进一步验证。
实施例3利用qRT-PCR的方法进一步扩大样本量验证
hsa_circRNA_054220在脑脊液中的表达水平,检验其诊断价值
1、样品采集及总RNA提取同前。
2、cDNA合成及qRT-PCR
使用RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Thermofisher)按照说明书配制逆转录体系进行逆转录。逆转录产物可-20℃保存或立即使用。通过 circbase数据库或者UCSC genome browser下载circRNA序列,利用引物设计软件Primer 5.0对目标序列及内参序列设计引物。(表1)使用2X FastStart Universal SYBR Green Master(Roche)进行qPCR检测。将96孔板置于Realtime PCR仪(StepOnePlusTMReal-Time PCR System,AppliedBiosystems) 上进行反应。条件为95℃,10分钟;40个PCR循环(95℃,10秒;60℃, 60秒),扩增反应结束后建立PCR产物的熔解曲线。
表1 circRNA引物序列
3、数据利用-2ΔΔCt法计算结果。计量资料以中位数±四分位数间距表示,利用Mann-whitney进行U检验。P值<0.05为有统计学差异(表2)。
4、结果
我们检测了26个脑脊液样本(11个NMOSD-ON患者样本,6个ION (特发性视神经炎)患者样本,9个对照组样本,年龄性别无统计学差异)中 hsa_circRNA_054220的表达水平。结果显示,NMOSD-ON患者hsa_circRNA_054220的表达量相较对照组明显下降,而hsa_circRNA_054220 的表达量在ION患者与对照组之间表达不具有统计学差异,说明 hsa_circRNA_054220可特异性诊断NMOSD-ON,并且与ION相鉴别(图 4)。
表2 hsa_circRNA_054220在不同分组中的表达水平
5、为进一步检验hsa_circRNA_054220在脑脊液中诊断NMOSD-ON的有效性,我们绘制了受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线(图5)。发现hsa_circRNA_054220在脑脊液样本中诊断NMOSD-ON的 ROC曲线下面积为0.919。当hsa_circRNA_054220在脑脊液中的诊断值设为 0.433时,其诊断的敏感性和特异性分别为1.00和0.889(图5)。
实施例4采用血浆作为样本检测
本发明同时已采用血浆进行试验,发现患者与对照组表达水平统计学差异较小,诊断价值低于脑脊液样本。结果如图6所示。
实施例5对NMOSD-ON的特异性
针对hsa_circ_054220这个指标,我们可以通过下图看到其对于 NMOSD-ON的特异性,其他类型特发性视神经炎组(Idiopathic optic neuritis,ION)不具有特异性,如图4所示。
hsa_circRNA_406587,在后续脑脊液的qPCR实验中,对于NMOSD- ON无法得到稳定的有效扩增(图7),产物特异性差(图8),产物经过测序(图9)与数据库序列不符(图10)。此次本发明的hsa_circ_054220指标,对于NMOSD-ON具有可靠的扩增曲线、溶解曲线以及产物测序结果 (图11-14)。
实施例6引物扩增效果对比
针对hsa_circ_054220设计引物的方法是:根据目标circRNA序列首尾各 150bp进行拼接,末尾150bp作为拼接后的首序列,将该部分300bp用primer-blast进行引物设计(ttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer- blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)。
经验证,引物组1无法对目标进行有效扩增,产物长度错误(图15- 17)。组2扩增曲线和溶解曲线情况如图18所示,其产物长度正确。
表3
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.环状非编码RNA在制备视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎诊断的分子标记物中的应用;所述环状非编码RNA为hsa_circRNA_054220。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,hsa_circRNA_054220表达量上调。
3.检测环状非编码RNA表达水平的产品在制备视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎诊断工具中的应用;所述环状非编码RNA为hsa_circRNA_054220。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,hsa_circRNA_054220表达量下调。
5.如权利要求3或4所述的应用,其特征在于,所述产品包括:通过实时荧光定量PCR检测所述环状非编码RNA表达水平的试剂。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述产品为特异性扩增所述环状非编码RNA的引物,序列如SEQ ID No.2~3所示。
7.检测环状非编码RNA表达水平的产品,其特征在于,包括特异性扩增所述环状非编码RNA的引物;所述环状非编码RNA为hsa_circRNA_054220。
8.如权利要求7所述的产品,其特征在于,所述引物的序列如SEQ ID No.2~3所示。
9.如权利要求7或8所述的产品,其特征在于,所述检测的样本包括脑脊液、血浆、全血样本。
10.检测环状非编码RNA表达水平的试剂盒,其特征在于,包括如权利要求7至9任一项所述的产品以及可接受的试剂。
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CN202211012509.9A CN116064768A (zh) | 2022-08-23 | 2022-08-23 | 视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎诊断分子标记物circRNA试剂盒及应用 |
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