KR102329555B1

KR102329555B1 - 비용종을 갖는 비부비동염의 진단을 위한 정보 제공 방법

Info

Publication number: KR102329555B1
Application number: KR1020190108206A
Authority: KR
Inventors: 이용철; 김종승; 정재석; 김소리
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2019-09-02
Filing date: 2019-09-02
Publication date: 2021-11-19
Also published as: KR20210026852A

Abstract

본 발명은 비용종을 갖는 비부비동염의 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 본 발명에서 PI3K-δ의 특정 값이 난치성 질환인 만성 비부비동염 및 비용종의 질병중증도, 특히 치료 불응성 질환과 연관성이 높다고 잘 알려진 비강 조직내의 호산구성 염증 반응과 밀접한 상관 관계를 나타낸다는 것을 확인하였고, 이를 기반으로 유병률이 매우 높은 난치성 질환인 만성 비부비동염 및 비용종에 대한 훌륭한 질병표지자로 사용될 수 있음을 증명하였다. 더 나아가 PI3K-δ 저해제가 만성 비부비동염 및 비용종, 특히 난치성인 호산구성 비용종을 수반하는 만성 비부비동염에 대한 치료제로 사용될 수 있음을 제시한다.

Description

비용종을 갖는 비부비동염의 진단을 위한 정보 제공 방법{Method for providing the information for diagnosing rhinosinusitis with nasal polyps}

본 발명은 비용종을 갖는 비부비동염의 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

비부비동염(rhinosinusitis)(축농증)은 전세계적으로 가장 흔한 질환 중 하나이나, 아직까지 명확한 정의나 분류 기준이 정해져 있지 않다. 만성 비부비동염 환자는 삶의 질의 저하로 고통받고, 이러한 증후군은 천식, 습진 및 중이염 같은 다른 심각한 질병과 관련되어 있다.

만성 비부비동염은 형태에 따라 비용종(nasal polyp)이 동반된 만성 비부비동염과 비용종이 동반되지 않은 만성 비부비동염으로 나뉜다. 비용종은 많은 경우 비부비동염 및 만성 비부비동염의 원인이며, 알러지성 비염, 급성 및 만성 비염 또는 바이러스성 또는 세균성 감염에 의해 야기될 수 있다.

비용종이란 다양한 원인에 의해 발생하는 비부비동의 점막 어디에서나 발생할 수 있는 매우 흔한 난치성 질환으로, 재발률이 매우 높아 절반 이상의 경우에 적절한 치료에도 불구하고 재발할 수 있음이 문헌상에서 보고되고 있다. 이러한 비용종은 비부비동의 입구를 막아서 만성 비부비동염의 발생과 밀접한 연관이 있고, 임상적으로 코막힘, 두통, 콧물, 후각저하, 일상생활의 저하 등을 일으킨다. 또한 삶의 질을 저하시키는 등 사회경제적으로도 큰 손실을 일으키는 질환이다.

현재까지 비용종의 정확한 병인은 알려지지 않았으나, 다양한 해부학적, 신경혈관적, 염증성, 그리고 조직학적 요인을 포함하는 것으로 생각된다. 현재까지는, 비강 내 국소적 세균이나, 바이러스 감염 등으로 비용종의 형성이 시작되며, 이러한 요인에 대한 생체내 염증/면역 반응, 점막의 외상에 대한 재생을 담당하는 요인들이 복합적으로 작용하여 결국 비용종을 생성하게 한다는 가설이 주로 인정받고 있다. 최근에는 비강 내 조절되지 않는 만성 염증과정이 비용종의 발생에 있어 중요하다는 점이 발견되고 있고, 특히 전신 혹은 비강 조직 내의 증가된 호산구 및 이와 연관된 2형 조력 T 세포 연관 면역 반응이 만성 비부비동염 및 비용종의 병인에 중요하다는 사실이 여러 실험실적 질병 모델 연구를 통해 밝혀지고 있다. 따라서, 호산구성 염증 및 연관 2형 면역반응(type 2 immune response)을 잘 반영하여 결국 만성 비부비동염 및 비용종의 질병 활성도를 반영할 수 있는 새로운 생체표지자를 발굴하려는 시도가 최근 많은 연구자에 의해 이루어지고 있다. 그러나, 현재까지 만성 비부비동염 및 비용종의 질병 활성도를 잘 반영하는 것으로 널리 인정되는 생체표지자는 없는 상태이다.

Class I PI3K는 α, β, γ, δ 네 개의 아형으로 이루어져 있는데, 그 중 α, β는 모든 세포에서 존재하는 아형인데 반하여, δ 아형은 주로 혈관을 통해 전신을 이동하여 작용할 수 있는 면역/염증 세포들과 내피세포, 기도 상피세포와 같은 국소적 조직 세포에 그 분포가 국한되어 있음이 잘 알려져 있다.

한편, 현재, 이러한 비부비동염 등을 진단하기 위하여 일반적으로 x-ray 촬영을 한다. 그러나, x-ray 촬영을 위한 장비는 일반적으로 비싸기 때문에 병원 및 환자 모두에게 경제적인 부담이 될 수 있고, 또한 x-ray와 같은 방사선 촬영은 환자에게 부작용을 초래할 수 있다는 점에서 바람직하지 못하다. 인체에 무해한 가시광선을 이용한 램프로 축농증을 진단하는 방법도 개발되었다. 그러나, 가시광선이 인체를 투사하여 외부로 발산하는 것을 육안으로 식별하기란 불가능하며, 이를 위해서는 별도의 암실 공간이 필요하다. 암실을 위한 별도의 공간 및 고가의 x-ray 촬영 장비는 모두 자본 규모가 작은 소규모의 의원급 병원에서는 설치하기가 어렵다.

따라서, 이들을 대체할 수 있는 간편하고 저렴하며 효과적인 진단 방법의 개발이 요구된다.

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Seok Hyun Cho, et al., Spontaneous Eosinophilic Nasal Inflammation in a Genetically-Mutant Mouse: Comparative Study with an Allergic Inflammation Model, PLoS ONE, 7(4), e35114, pp.1~7 (2012.04.11.) Jae Seok Jeong, et al., Airway epithelial phosphoinositide 3-kinaseδ contributes to the modulation of fungi-induced innate immune response, Thorax, 73, pp.758~768 (2018.04.05.)

이러한 상황 하에서, 본 발명자들은 비용종을 수반하는 만성 비부비동염을 정확하게 진단할 수 있는 마커를 개발하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)-δ의 효소 활성도가 정상 비점막조직에 비해 만성 비부비동염 환자들의 비점막 및 용종 조직에서 증가되어 있고, 이 효소의 활성도가 높을수록 만성 비부비동염 환자의 내시경적, 영상의학적 및 임상 증상의 정도가 심각하다는 것을 확인하였다. 특히, 이 효소의 활성도는 혈액 내 호산구 증가를 동반한 만성 비부비동염 환자에서 비점막 및 비용종 조직의 호산구 관련 주요 Th2 사이토카인인 인터루킨-5 (interleukin-5, IL-5) 농도 및 만성 비부비동염의 질병 중증도와 밀접한 연관성이 있음을 발견하였다. 또한, 만성 비부비동염 환자들의 임상적 질병의 중증도 및 호산구성 염증의 정도를 반영하는 바이오마커로서 PI3K-δ 값을 측정 및 분석하여 적용한 경우, 호산구성 또는 비-호산구성 비용종을 동반하는 비부비동염을 정확하게 구분하여 진단할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일 목적은 호산구성 비용종(Eosinophilic nasal polyps, EP) 또는 비-호산구성 비용종(Non-eosinophilic nasal polyps, NEP)을 갖는 비부비동염의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 호산구성 비용종 또는 비-호산구성 비용종을 갖는 비부비동염의 진단을 위한 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 호산구성 비용종 또는 비-호산구성 비용종을 갖는 비부비동염의 진단을 위한 키트를 제공하는 데 있다.

이하, 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 대상으로부터 분리된 생물학적 시료 내 PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)-δ 유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 측정된 PI3K-δ 유전자 또는 이의 단백질 발현 수준을, 정상 대조군의 PI3K-δ 유전자 또는 이의 단백질 발현 수준에 대한 비로 산출하여 PI3K-δ 값을 결정하는 단계; 를 포함하는 호산구성 비용종(Eosinophilic nasal polyps, EP) 또는 비-호산구성 비용종(Non-eosinophilic nasal polyps, NEP)을 갖는 비부비동염의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하며, 상기 (b) 단계에서 산출된 상기 대상의 PI3K-δ값이 1.67 내지 2.83 미만인 경우 비-호산구성 비용종(non-eosinophilic nasal polyps, NEP)을 갖는 비부비동염으로 진단하고; 상기 (b) 단계에서 산출된 상기 대상의 PI3K-δ 값이 2.83 이상인 경우 호산구성 비용종(eosinophilic nasal polyps, EP)을 갖는 비부비동염으로 진단한다.

임상적으로 동일한 질환이더라도 그 병리학적 상태는 각기 다르며, 이를 신속히 진단하여 적절한 치료 방법을 사용하여야 환자의 치료 효율을 높일 수 있다.

이에, 본 발명은 만성 비부비동염 및 비용종 환자들의 임상적 질병의 중증도 및 호산구성 염증의 정도를 반영하는 바이오마커로서 PI3K-δ의 발현 수준을 이용하여, 대상의 호산구성 비용종(Eosinophilic nasal polyps, EP) 또는 비-호산구성 비용종(Non-eosinophilic nasal polyps, NEP)을 갖는 비부비동염을 정확히 진단하고, 이에 따른 적절한 치료방향을 설정할 수 있도록 정보를 제공하는 데 특징이 있다.

본 명세서에서 사용되는 표현 "유전자의 발현 수준; 또는 이의 단백질의 발현 수준 측정"은 해당 시료 내에서 검출하고자 하는 대상을 검출하는 것을 의미한다. 본 발명에서는, 그 검출하고자 하는 대상은 시료 내 해당 유전자의 mRNA 및/또는 단백질이다. 즉, 타겟의 전사 산물인 RNA 또는 유전자 산물인 단백질을 검출함으로써 상기 유전자의 발현 여부를 확인할 수 있다.

RNA 또는 단백질의 검출은 통상적으로는 시료부터 RNA 또는 단백질을 추출하여, 추출물 중의 RNA 또는 단백질을 검출함으로써 실시할 수 있다. 이러한 RNA 또는 단백질의 검출은 면역분석학적 방법, 하이브리드화 반응 및 증폭반응에 의해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 용이하게 실시될 수 있다.

본 발명에서, 상기 유전자 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 포함할 수 있다.

상기 mRNA의 발현 여부를 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 즉, 핵산의 검출은 유전자를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 하이브리드화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 증폭반응에 의해 수행될 수 있다.

예컨대, 프라이머를 이용한 mRNA의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 증폭 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.

상기 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.

상기 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 발명에서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 펩타이드를 포함할 수 있다.

상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 의미하고, 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 이들의 조합을 모두 포함한다.

상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv를 모두 포함한다. 항체 생산은 본 발명이 속하는 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있고, 제조되어 상업적으로 판매되는 항체를 이용할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "마커"는 생물학적 현상의 존재와 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미하며, 본 발명의 마커는 호산구성 비용종(Eosinophilic nasal polyps, EP) 또는 비-호산구성 비용종(Non-eosinophilic nasal polyps, NEP)을 갖는 비부비동염을 진단해내는 기준을 지칭하며, 본 발명에서는 정상 대조군에 대한 EP 군이나 NEP 군의 PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)-δ 유전자 또는 단백질의 발현 비율(ratio)을 의미하며 'PI3K-δ 값'으로 상호교환된다.

본 발명의 마커인 PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)-δ은 p 값이 유의하며 상기 질환 진단에 대한 신뢰도가 높으며, 상기 마커의 수준을 산출 및 비교함으로써 이의 수준에 따라 환자군을 호산구성 비용종(Eosinophilic nasal polyps, EP)을 수반하는 비부비동염 또는 비-호산구성 비용종(Non-eosinophilic nasal polyps, NEP)을 수반하는 비부비동염 그룹으로 정확하게 분류하여 진단할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적 시료"란 본 발명의 유전자 또는 단백질의 발현이 검출될 수 있는 대상 개체로부터 얻어지는 모든 시료를 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 위액, 타액(saliva), 생검(biopsy), 혈액, 혈장, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 특별히 이에 제한되지 않고, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)-δ 유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 호산구성 비용종(Eosinophilic nasal polyps, EP) 또는 비-호산구성 비용종(Non-eosinophilic nasal polyps, NEP)을 갖는 비부비동염 진단용 조성물 및 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 조성물 및 키트는 바이오마커로서 상술한 PI3K-δ의 특정 수치를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명에 따르면, 본 발명에서 PI3K-δ의 특정 값이 난치성 질환인 만성 비부비동염 및 비용종의 질병중증도, 특히 치료 불응성 질환과 연관성이 높다고 잘 알려진 비강 조직내의 호산구성 염증 반응과 밀접한 상관 관계를 나타낸다는 것을 확인하였고, 이를 기반으로 유병률이 매우 높은 난치성 질환인 만성 비부비동염 및 비용종에 대한 훌륭한 질병표지자로 사용될 수 있음을 증명하였다. 더 나아가 PI3K-δ 저해제가 만성 비부비동염 및 비용종, 특히 난치성인 호산구성 비용종을 수반하는 만성 비부비동염에 대한 치료제로 사용될 수 있음을 제시한다.

도 1은 비용종이 있는 만성 비부비동염 환자의 비용종(Nasal polyp, NP)과 대조군(CS)으로서 비용종이 없는 만성 비부비동염 환자의 하비갑개(Inferior turbinate)에서의 PI3K-δ 발현 수준을 측정한 결과를 보여준다.
도 2는 PI3K-δ 발현 수준을 토대로 k-평균 군집분석(k-means cluster analysis)을 실시하여 비용종(nasal polyp)을 분류한 결과를 보여준다.
도 3은 unsupervised learning의 한 부류인 decision tree analysis 분석을 실시하여 PI3K-δ의 컷오프 값(cut-off value)을 산출한 결과를 보여준다.
도 4는 호산구성 또는 비-호산구성 비용종을 갖는 비부비동염에 대해 유의한 진단 인자로서 본 발명의 특정 PI3K-δ 값에 따른 진단 결과를 보여준다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 환자 시료에서의 PI3K-δ의 발현 수준 확인

통상적으로 당업계에서 비부비동염은 크게 표현형으로서 비용종이 없는 비부비동염, 비용종이 있는 비부비동염으로 나뉘고, 다시 비부비동염의 비용종은 호산구성 비용종(Eosinophilic nasal polyps, EP)과 비-호산구성 비용종(Non-eosinophilic nasal polyps, NEP)으로 구분되었다. 그러나, 이러한 구분법에 대한 분자생물학적인 근거는 부족한 실정이었다. 분자 수준에서의 명확한 구분에 대한 근거를 제시하지 못하였기 때문이다.

본 발명은 이에 대한 근거를 제시한다.

본 발명자들은 유병율이 많은 비부비동염(축농증)과 비용종에서 질병의 표지자로서 PI3K-δ를 활용하기 위하여, 전북대학교병원 의학연구 윤리심의위원회를 통과한 후, 43 명의 환자에 대해 혈액검사를 통해 말초혈액 호산구 수치, 혈중 면역글로불린 E (immunoglobulin E, Ig-E) 수치, 알레르기 반응검사, 엑스레이 검사와 전산화단층 촬영(computed tomography, CT)을 진행하였고, 비강 조직을 통해 PI3K-δ 효소의 발현 및 관련 마커, 호산구 관련 마커의 발현 수준을 측정하였다(표 1).

N, number; NP, nasal polyps; CRS, chronic rhinosinusitis; NEP, non-eosinophilic polyps; EP, eosinophilic polyps; M, male; F, female; IT, inferior turbinate; DM, diabetes mellitus; SD, standard deviation

구체적으로 다음과 같다:

본 실시예에 이용된 비강 조직은, 비용종이 있는 만성 비부비동염 환자의 비용종(Nasal polyp, NP)과 대조군(CS)으로서 비용종이 없는 만성 비부비동염 환자의 하비갑개(Inferior turbinate)로부터 얻었고, 각 조직은 두 조각으로 분리하여 하나는 즉시 동결하여 PI3K-δ 발현 측정을 위한 웨스턴 블롯팅에 사용하였고, 남은 하나의 조직은 4% 파라포름알데히드에 고정하여 면역형광염색에 이용하였다.

그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 공초점현미경적 분석(confocal microscopic analysis)했을 때, 비용종을 갖는(비용종이 있는) 만성 비부비동염 환자의 비강 조직에서 PI3K-δ 효소의 발현 수준이 대조군에 비해 높음을 시각적으로 확인할 수 있다.

또한, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 웨스턴 블롯팅을 통해 단백질을 생화학적 분석했을 때, 비용종이 있는 만성 비부비동염 환자군의 비강 조직에서 통계적으로 유의한 효소활성을 갖는 PI3K-δ 단백질이 대조군에 비해 높게 발현되는 것을 확인할 수 있다(P <0.05).

또한, 도 1c에 나타낸 바와 같이, PI3K-δ 신호전달체계의 하위 작용 단백질인 인산화 AKT (phosphorylated AKT, p-AKT) 발현 수준이, 비용종을 갖는 만성 비부비동염 환자의 비강 조직에서 대조군에 비해 유의하게 증가되어 있음을 확인하였다(P <0.05).

특히, PI3K-δ의 활성도가 높을수록 비용종을 갖는 만성부비동염 환자의 영상의학적(Lund-Mackay CT score, L-M score, 도 1D), 내시경적(Lund-Kennedy endoscopic score, L-K score, 도 1E), 및 임상 증상의 중증도(Sino-Nasal Outcome Test-22 questionnaire score, SNOT-22, 도 1F)가 심각하다는 것을 확인하였다.

실시예 2. 중증 호산구성 염증을 매개하는 세포생물학적 병인으로서 PI3K-δ의 역할 확인

본 발명자들은 비용종이 있는 만성 비부비동염의 중증 호산구성 염증을 매개하는 세포생물학적 병인으로서 PI3K-δ의 역할 및 관련 질병 표지자로서의 역할을 규명하기 위하여, 말초혈액 호산구 200 개/μL 기준으로 모든 환자군에서 비용종이 있는 만성 비부비동염의 비용종을 호산구성 비용종(Eosinophilic nasal polyps, EP) 또는 비-호산구성 비용종(Non-eosinophilic nasal polyps, NEP)으로 분류한 후 PI3K-δ 발현 수준을 확인하였다.

그 결과, 도 1g 및 1h에 나타낸 바와 같이, 공초점현미경을 이용한 분석을 통해 호산구성 비용종에서 PI3K-δ의 발현이 높음을 확인하였고, 호산구의 주요 마커 중의 하나인 ECP(eosinophil cationic protein)와 PI3K-δ 효소활성단위 단백의 세포질 내의 분포가 일치하는 것을 증명하였다.

실시예 3. PI3K-δ 값과 호산구성 비용종이 있는 비부비동염 간의 상관 관계 분석

본 발명자들은 표현형 연구(phenotype-free approach)로 연구를 진행하였다. 먼저 본 연구자들은 말초혈액 호산구와 PI3K-δ의 발현 사이에 깊은 상관관계가 있음에 유의하여, 두 지표를 토대로 k-평균 군집 분석(k-means cluster analysis)을 실시한 후 비용종(nasal polyp)을 분류하였다.

이를 실행한 결과 도 2와 같은 플롯(plot)을 획득하였다.

도 2에서, 비용종이 eosinophil과 PI3K-δ에 대한 k-평균 군집 분석 에 의해 세 군으로 나뉘는 것을 볼 수 있고, 이를 두 군으로 나눌 때 호산구 수가 195개/μL를 기준으로 나뉘는 것을 볼 수 있다.

이에 말초혈액 호산구수 195개/μL 기준으로 모든 환자군에서 만성 비부비동염의 비용종을 호산구성 또는 비호산구성으로 분류하였고, 그 결과 호산구성 비용종에서 PI3K-δ의 발현이 높음을 확인하였고, 공초점현미경을 이용한 분석을 통해 호산구의 주요 마커 중의 하나인 ECP(eosinophil cationic protein)와 PI3K-δ 효소활성단위 단백의 세포질 내의 분포가 일치하는 경향이 보임을 증명하였다(도 1G 및 1H).

더 나아가, 본 연구자들은 표현형에 대한 정보를 제공하지 않은 상태로 진행하는 연구(phenotype-free approach)를 통해 PI3K-δ값에 따른 각 군의 특징을 살펴보았다.

본 발명자들은 군집 분석 방법 중 하나로서 unsupervised learning의 한 부류인 decision tree analysis 분석을 실시하여 PI3K-δ의 컷오프 값(cut-off value)을 산출하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, PI3K-δ의 컷오프 값이 1.67 보다 작을 때는 정상군(healthy control); PI3K-δ의 컷오프 값이 1.67에서 2.83까지는 비호산구성 비용종(non-eosinophilic nasal polyps, NEP) 군; 및 PI3K-δ의 컷오프 값이 2.83 이상일때는 호산구성 비용종(eosinophilic nasal polyps, EP) 군으로 나누어 지는 것을 확인할 수 있었다.

이들 결과를 통해, 기존에 비용종 및 비부비동염의 병인에 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려진 비점막의 호산구성 염증의 정도가 PI3K-δ 효소 활성도와 밀접한 연관을 보임이 증명되었고, 이러한 사실은 호산구성과 비호산구성 비부비동염 및 비용종의 질병표지자로서 PI3K-δ의 컷오프 값 2.83의 수치가 활용될 수 있음을 시사한다. 또한 PI3K-δ 값이 1.67을 기준으로 하여 정상군과 비용종 군도 나뉘게 됨을 알 수 있었다.

이에, 상술한 바와 같이 본 발명자들은 특정 PI3K-δ 값이 호산구성 또는 비-호산구성 비용종을 갖는 비부비동염에 대해 유의한 진단 인자가 될 수 있음을 확인하였고, 이러한 값에 따른 진단 결과를 실제 환자례를 통해 입증하였다.

구체적으로, 모든 환자를 PI3K-δ 값이 2.83 이하인 군과 이상인 군 (cut off value: 2.83)으로 나누어 호산구 관련 중요 Th2 사이토카인인 IL-5, 말초혈액 호산구 수치, 혈청 면역글로불린 E 수치, 내시경적 중증도(Lund-Kennedy endoscopic score, L-K score), 영상의학적 중증도(Lund-Mackay CT score, L-M score), 및 임상 증상의 정도(Sino-Nasal Outcome Test-22 questionnaire score, SNOT-22)를 비교하였다.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, PI3K-δ 효소활성단위 단백의 세포질 내의 발현은 ECP를 통해 확인된 호산구의 분포와 일치하는 양상을 보였고, PI3K-δ 발현은 호산구성 비용종군에서 비호산구성 비용종군에 비해 뚜렷한 증가를 나타냈다.

또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, PI3K-δ 발현의 정도가 말초혈액 호산구 수치의 정도와 잘 연관됨을 확인하였다.

또한, 도 4c에 나타낸 바와 같이, 비용종 조직 내의 대표적 호산구 관련 중요 Th2 사이토카인인 IL-5는 PI3K-δ 발현이 높은 환자군에서 그렇지 않은 환자군에 비해 유의하게 증가되었다.

마지막으로, PI3K-δ 발현의 차이는 두 환자군에서 내시경적, 영상의학적 및 임상 증상의 정도의 분석을 통한 질병의 중증도 측면의 뚜렷한 차이와 연관되었고, L-M score, L-K score, 및 SNOT 22 모두 PI3K-δ이 높게 발현되는 군에서 의미 있게 높음을 확인하였다(도 4E, 4F 및 4G).

종합적으로, 본 발명에서는 용종이 없는 군보다 용종이 있는 환자군에서 PI3K-δ 효소의 활성도가 의미 있게 높은 수준으로 발현되었고, 특히, 말초혈액 내 호산구 수가 높은 비부비동염 및 비용종 조직에서 그렇지 않은 비부비동염 및 비용종 조직에 비해 PI3K-δ 효소의 활성도가 의미 있게 높은 수준으로 발현되는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명에서는 이를 근거로, PI3k-δ 값에 따른 환자군 진단시 분류에 대한 기준점을 정해 수치를 한정하였고, 상기 특정 수치에 따라 비-호산구성 비용종(non-eosinophilic nasal polyps, NEP)을 갖는 비부비동염 환자 또는 호산구성 비용종(eosinophilic nasal polyps, EP)을 갖는 비부비동염 환자를 진단할 수 있음을 입증함으로써, 이는 PI3K-δ가 호산구성 비부비동염 및 비용종의 중요한 질병 표지자로 활용될 수 있다는 것을 제시한다. 또한, 향후 PI3K-δ 저해제가 만성 비부비동염 및 비용종, 특히, 호산구성 비용종에 대한 치료제로 사용될 수 있음을 제시한다.

Claims

다음 단계를 포함하는, 호산구성 비용종(Eosinophilic nasal polyps, EP) 또는 비-호산구성 비용종(Non-eosinophilic nasal polyps, NEP)을 갖는 비부비동염의 진단을 위한 정보 제공 방법:
(a) 대상으로부터 분리된 생물학적 시료 내 PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)-δ 유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 PI3K-δ 유전자 또는 이의 단백질 발현 수준을, 정상 대조군의 PI3K-δ 유전자 또는 이의 단백질 발현 수준에 대한 비로 산출하여 PI3K-δ 값을 결정하는 단계로서,
상기 (b) 단계에서 산출된 상기 대상의 PI3K-δ 값이 1.67 내지 2.83 미만인 경우 비-호산구성 비용종(non-eosinophilic nasal polyps, NEP)을 갖는 비부비동염으로 판단하고;
상기 (b) 단계에서 산출된 상기 대상의 PI3K-δ 값이 2.83 이상인 경우 호산구성 비용종(eosinophilic nasal polyps, EP)을 갖는 비부비동염으로 판단함.
제1항에 있어서,
상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 PI3K-δ 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 및 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 호산구성 비용종(Eosinophilic nasal polyps, EP) 또는 비-호산구성 비용종(Non-eosinophilic nasal polyps, NEP)을 갖는 비부비동염의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제1항에 있어서,
상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 PI3K-δ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 펩타이드인 것을 특징으로 하는, 호산구성 비용종(Eosinophilic nasal polyps, EP) 또는 비-호산구성 비용종(Non-eosinophilic nasal polyps, NEP)을 갖는 비부비동염의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제1항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 대상 유래의 조직, 세포, 위액, 타액(saliva), 생검(biopsy), 혈액, 혈장, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 호산구성 비용종(Eosinophilic nasal polyps, EP) 또는 비-호산구성 비용종(Non-eosinophilic nasal polyps, NEP)을 갖는 비부비동염의 진단을 위한 정보 제공 방법.
PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)-δ 유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 호산구성 비용종(Eosinophilic nasal polyps, EP) 또는 비-호산구성 비용종(Non-eosinophilic nasal polyps, NEP)을 갖는 비부비동염 진단용 조성물로서;
상기 PI3K-δ유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 대한 비로 산출하였을 때, 산출된 PI3K-δ비가 1.67 내지 2.83 미만인 경우 비-호산구성 비용종(non-eosinophilic nasal polyps, NEP)을 갖는 비부비동염으로 판단하거나; 2.83 이상인 경우 호산구성 비용종(eosinophilic nasal polyps, EP)을 갖는 비부비동염으로 판단하는 조성물.
PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)-δ 유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 호산구성 비용종(Eosinophilic nasal polyps, EP) 또는 비-호산구성 비용종(Non-eosinophilic nasal polyps, NEP)을 갖는 비부비동염 진단용 키트로서;
상기 PI3K-δ유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 대한 비로 산출하였을 때, 산출된 PI3K-δ비가 1.67 내지 2.83 미만인 경우 비-호산구성 비용종(non-eosinophilic nasal polyps, NEP)을 갖는 비부비동염으로 판단하거나; 2.83 이상인 경우 호산구성 비용종(eosinophilic nasal polyps, EP)을 갖는 비부비동염으로 판단하는 키트.