KR102178922B1

KR102178922B1 - 당뇨병성 신증 진단을 위한 마이크로RNA let-7 또는 마이크로RNA-150 바이오마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102178922B1
Application number: KR1020180147729A
Authority: KR
Inventors: 류성호; 배윤위; 최철원; 권순효
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2018-11-26
Filing date: 2018-11-26
Publication date: 2020-11-13
Also published as: KR20200061893A

Abstract

본 발명은 당뇨병성 신증 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 마이크로RNA인 let-7c, let-7i 및 마이크로RNA-150(miR-150)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 마커 조성물, 상기 miRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 조성물 및 진단 키트, 상기 마커를 이용하여 당뇨병성 신증을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신장합병증 유무에 특이적 microRNAs는 당뇨병성 신증을 진단하고 진행정도를 예측하기 위한 바이오마커로 유용하게 이용할 수 있을 것이다.

Description

당뇨병성 신증 진단을 위한 마이크로RNA let-7 또는 마이크로RNA-150 바이오마커 및 이의 용도{Biomarker microRNA let-7 or microRNA-150 for diagnosing diabetic nephropathy and use thereof}

본 발명은 당뇨병성 신증 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 마이크로RNA인 let-7c, let-7i 및 마이크로RNA-150(miR-150)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 마커 조성물, 상기 miRNAs의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 조성물 및 진단 키트, 상기 마커를 이용하여 당뇨병성 신증을 진단하는 방법에 관한 것이다.

당뇨병은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환의 일종으로, 혈중 포도당의 농도가 높아지는 고혈당을 특징으로 하며, 고혈당으로 인하여 여러 증상 및 징후를 일으키고 소변에서 포도당을 배출하게 된다. '소아 당뇨병'이라고도 불리는 제1형 당뇨병은 자가면역 기작에 의해 췌장의 베타세포가 파괴되어 인슐린의 절대적 또는 상대적 생산 결핍이 원인으로 발생하는 반면, 제2형 당뇨병은 인슐린 저항성에 의해 유도되며 비만, 인슐린 수용체의 감소, 인슐린 분비 저하, 유전적 요인 등 다양한 요인에 의해서 생기는 것으로 알려져 있다.

대한당뇨병학회의 2016년 발표에 따르면, 2014년 기준 국내 30세 이상 성인 인구의 당뇨병 유병률이 13.7%로 역대 최고치를 기록하였으며, 당뇨병의 동반질환 위험도 역시 심각한 수준으로 당뇨병 환자의 비만과 복부비만 유병률이 48.6%와 58.9%에 이르며 고혈압과 고콜레스테롤혈증 역시 각각 54.7%, 31.6%가 동반되어 있는 것으로 나타났다. 이처럼 당뇨병은 그 자체의 위험성뿐만 아니라 심혈관계 질환, 망막증, 신부전, 말초신경합병증 등 매우 심각한 합병증을 초래할 수 있다.

당뇨병에 의해 나타나는 합병증의 하나인 당뇨병성 신증(diabetic nephropathy)은 고혈당 등에 의해 지속적으로 신장 내부의 사구체가 손상되어 신장 기능이 저하되는 질환으로, 당뇨병은 10~15년에 걸쳐 천천히 신장질환을 진행시키므로 당뇨 초기에 잘 치료하지 않으면 어느새 신장 기능이 망가지게 되고 심할 경우에는 투석과 이식을 필요로 하는 말기 신부전이 초래될 수 있다. 당뇨병성 신증의 병인은 아직 정확하게 밝혀지지는 않았으나, 신장 내의 혈역학적인 변화(intrarenal hemodynamic alterations), 사구체 단백의 포도당화(glycosylation of glomerular proteins), 소르비톨(sorbitol)의 축적 등 복합적 요인들이 당뇨병성 신증의 병인과 관련이 있는 것으로 여겨진다.

현재 당뇨병성 신증을 예방하기 위하여 레닌-안지오텐신계(renin-angiotensin system: RAS) 억제제를 주로 사용하고 있는데, RAS 억제제는 혈액동력학적 효능뿐 아니라 만성염증반응 혹은 섬유화를 유도하는 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 성장인자(growth factor) 등의 생성을 저해하여 신장 기능을 보호하는 탁월한 효과를 나타낸다. 그러나 환자 개개의 유전적 성향이 다르고 장기적 치료로 인한 부작용 및 치료제에 대한 내성 문제가 있어 치료효과가 그 기대에 못 미치고 있다. 또한, 지난 수년간 신증에 대한 원인규명, 진단방법 및 치료방법에 대한 집중적인 연구가 이루어졌음에도 불구하고 아직까지 신증을 효과적으로 치료할 수 있는 확실한 치료제가 개발되지 못하고 있다. 따라서 당뇨병성 신증을 초기 단계에 발견하고 치료하는 것이 가장 효과적인 방법이라 할 수 있다.

종래 당뇨병성 신증을 진단하기 위한 바이오마커는 한정적이다. 임상에서 당뇨병성 신증의 진단은 정기적이고 반복적으로 임상적 증상, 환자의 병력을 통하여 이루어지는데, 예컨대 오랜 기간의 당뇨병력을 가진 환자가 신증 범위의 단백뇨(nephrotic-range proteinuria), 망막병증(retinopathy)이 있으면서 신질환의 명확한 다른 원인이 없으면 당뇨병성 신증으로 진단된다.

미세단백뇨(24시간 요 알부민 30-300 mg/d 또는 알부민 배설 비율 20-200 ug/min)는 당뇨병성 신증의 진행을 조기에 예측하고, 신증 외 혈관합병증을 예측하는 바이오 마커로 가장 많이 사용되고 있다. 기존 연구에 의하면, 미세단백뇨는 사구체여과율이 감소를 예측하는 위험인자이자, 만성신부전으로 진행하는 독립적인 위험인자이기도 하므로, 현재 당뇨병 진단 및 치료 지침에도 미세단백뇨의 측정을 권고하고 있다. 하지만 최근 연구들은 당뇨 환자에서 미세단백뇨의 자연 소실 빈도가 높고(Diabetes Care. 2001 Sep;24(9):1560-6.), 미세단백뇨가 없이 신기능이 저하된(사구체 여과율 < 60 ml/min/1.73m²) 당뇨환자의 빈도가 높다는 이유로 미세단백뇨 만으로 당뇨병성 신증을 조기 진단하고 진행 지표로 판단하는 것에 제한이 있다고 보고하고 있다.

이에, 본 발명자들은 당뇨병성 신증을 효과적으로 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하기 위해 피검자의 혈청 유래 엑소좀에 존재하는 miRNAs를 분석하여 정상대조군에 비해 신장합병증이 있는 당뇨환자군에서 발현이 유의하게 증가하는 3종의 miRNAs를 발굴함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 정상군, 신장합병증이 없는 당뇨군, 및 신장합병증이 있는 당뇨군에 해당하는 대상자들로부터 혈청을 채취하고 이로부터 엑소좀(exosome) RNA를 분리한 후 NGS 분석을 통해 엑소좀 microRNA의 발현수준을 비교분석한 결과, 정상군에 비해 신장합병증이 있는 당뇨군에서만 발현수준이 유의하게 증가하는 3종의 마이크로RNAs를 발견하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 마이크로RNA(microRNA) let-7c, let-7i 및 마이크로RNA-150(miR-150)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 당뇨병성 신증 진단용 마커 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 마이크로RNA(microRNA) let-7c, let-7i 및 마이크로RNA-150(miR-150)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 당뇨병성 신증 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 키트를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로RNA(microRNA) let-7c, let-7i 및 마이크로RNA-150(miR-150)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 당뇨병성 신증 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이크로RNA(microRNA) let-7c, let-7i 및 마이크로RNA-150(miR-150)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 당뇨병성 신증 진단용 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 마이크로RNA(microRNA) let-7c, let-7i 및 마이크로RNA-150(miR-150)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 let-7c는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 let-7i는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 miR-150은 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 발현수준을 측정하는 제제는 상기 microRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.

또한, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로RNA(microRNA) let-7c, let-7i 및 마이크로RNA-150(miR-150)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 당뇨병성 신증 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈청 유래 엑소좀(exosome)일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 발현수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것일 수 있다.

본 발명자들은 정상군, 신장합병증이 없는 당뇨군, 및 신장합병증이 있는 당뇨군의 혈액에서 분리한 엑소좀 내에 포함된 microRNA를 분석한 결과, 정상군에 비해 신장합병증이 있는 당뇨군에서만 발현이 유의하게 증가하는 신장합병증 유무에 특이적 microRNA인 let-7c, let-7i 및 miR-150을 발굴하였다. 이에, 상기 발굴된 microRNAs를 당뇨병성 신증을 진단하고 진행정도를 예측하기 위한 바이오마커로 유용하게 이용할 수 있을 것이다.

도 1은 정상군(HV) 및 신장합병증이 없는 당뇨군(Nephro-X) 대상자들의 혈청에서 분리한 엑소좀 내 microRNAs의 발현수준을 비교분석한 결과로서, 도 1a는 정상군에 비해 신장합병증이 없는 당뇨군에서 유의적으로 2배 이상(p < 0.05) 발현이 감소 또는 증가한 microRNAs의 발현수준에 따른 계층적 클러스터링을 수행한 히트맵 결과이고, 도 1b는 상기에서 검출된 microRNAs의 발현수준에 따른 산점도(scatter plot) 결과이다.
도 2는 정상군(HV) 및 신장합병증이 있는 당뇨군(Nephro-O) 대상자들의 혈청에서 분리한 엑소좀 내 microRNAs의 발현수준을 비교분석한 결과로서, 도 2a는 정상군에 비해 신장합병증이 있는 당뇨군에서 유의적으로 2배 이상(p < 0.05) 발현이 감소 또는 증가한 microRNAs의 발현수준에 따른 계층적 클러스터링을 수행한 히트맵 결과이고, 도 2b는 상기에서 검출된 microRNAs의 발현수준에 따른 산점도(scatter plot) 결과이다.
도 3은 신장합병증이 없는 당뇨군(Nephro-X) 및 신장합병증이 있는 당뇨군(Nephro-O) 대상자들의 혈청에서 분리한 엑소좀 내 microRNAs의 발현수준을 비교분석한 결과로서, 도 3a는 신장합병증이 없는 당뇨군에 비해 신장합병증이 있는 당뇨군에서 유의적으로 2배 이상(p < 0.05) 발현이 감소 또는 증가한 microRNAs의 발현수준에 따른 계층적 클러스터링을 수행한 히트맵 결과이고, 도 3b는 상기에서 검출된 microRNAs의 발현수준에 따른 산점도(scatter plot) 결과이다.
도 4는 상기 도 1 내지 도 3의 결과를 바탕으로 정상군(HV), 신장합병증이 없는 당뇨군(Nephro-X) 및 신장합병증이 있는 당뇨군(Nephro-O)에 대하여 다차원척도법(MDS) 분석을 실시한 결과이다.
도 5는 상기 도 1 내지 도 3의 결과로부터 발현이 유의하게 증가된 microRNAs만을 벤다이어그램으로 표현하여 정상군에 비해 신장합병증이 있는 당뇨군에서만 발현이 유의하게 증가된 microRNAs만을 도출한 결과이다.
도 6은 정상군(HV)과 신장합병증이 있는 당뇨군(Nephro-O) 간의 hsa-let-7c-5p, hsa-let-7i-3p 및 hsa-miR-150-3p의 발현수준을 측정하여 비교한 결과이다.

본 발명자들은 당뇨병 진단을 위한 바이오마커를 발굴하기 위해 예의 연구한 결과, 당뇨병성 신증 진단에 이용할 수 있는 바이오마커로 마이크로RNA(microRNA) hsa-let-7c-5p, hsa-let-7i-3p 및 hsa-miR-150-3p를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 마이크로RNA(microRNA) let-7c, let-7i 및 마이크로RNA-150(miR-150)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 당뇨병성 신증 진단용 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 마이크로RNA(microRNA) let-7c, let-7i 및 마이크로RNA-150(miR-150)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 당뇨병성 신증 진단용 조성물 및 상기 진단용 조성물을 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 키트를 제공한다.

이에, 본 발명에서 발굴한 당뇨병성 신증 진단용 바이오마커인 상기 let-7c, 보다 바람직하게 hsa-let-7c-5p는 서열번호 1 (NCBI, MIMAT0000064)로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 이때, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 발굴한 당뇨병성 신증 진단용 바이오마커인 상기 let-7i, 보다 바람직하게 hsa-let-7i-3p는 서열번호 2 (NCBI, MIMAT0004585)로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 이때, 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 발굴한 당뇨병성 신증 진단용 바이오마커인 상기 miR-150, 보다 바람직하게 hsa-miR-150-3p는 서열번호 3 (NCBI, MIMAT0004610)으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 이때, 상기 서열번호 3으로 표시되는 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “진단(diagnosis)”이란 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다. 본 발명에서 진단은 당뇨 합병증의 발병 여부 및 진행단계 수준 등을 판단하는 것으로, 보다 바람직하게 상기 당뇨 합병증은 당뇨병성 신증일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 let-7c, let-7i 및/또는 miR-150의 발현수준을 측정하는 제제는 상기 microRNAs의 각각에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, “프라이머”란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “프로브”란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.

본 발명의 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.

예컨대, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl₂를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 당뇨병성 신증 진단용 바이오마커로써 상기 let-7c, let-7i 및 miR-150을 발굴 및 동정하였다.

본 발명의 일실시예에서는, 정상군, 신장합병증이 없는 당뇨군 및 신장합병증이 있는 당뇨군에 해당하는 대상자들을 모집하고 이들의 혈청을 제공받아 혈청으로부터 엑소좀을 분리하여 엑소좀 내 miRNA의 발현수준을 비교분석하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 각각 정상군 및 신장합병증이 없는 당뇨군, 정상군 및 신장합병증이 있는 당뇨군, 신장합병증이 없는 당뇨군 및 신장합병증이 있는 당뇨군에서 차이가 있는 microRNAs를 각각 분석하였으며, 상기 microRNAs 발현수준 결과를 이용하여 다차원척도법으로 분석한 결과 2차원 상에서 정상군과 당뇨군이 구분되는 패턴을 보이며 신장합병증 유무와 관련해서는 큰 차이는 나타나지 않는 것을 확인하였다. 또한, 상기 각 비교분석 결과에서 유의한 발현 증가를 보이는 microRNAs을 벤다이어그램으로 도시하여 비교하였는데, 구체적으로 정상군에 비해 신장합병증이 있는 당뇨군에서 발현이 증가한 40개의 miRNAs에서, 정상군에 비해 신장합병증이 없는 당뇨군에서도 발현이 증가한 공통된 32개의 miRNAs를 제외한 8종을 선별하고, 나아가 상기 8종의 miRNAs 중에서 신장합병증이 없는 당뇨군에 비해 신장합병증이 있는 당뇨군에서도 발현이 증가된 1종을 제외한 7종 가운데 가장 유의한 발현 차이를 보이는 3종의 miRNAs를 최종적으로 선별하였다. 상기에서 선별된 hsa-let-7c-5p, hsa-let-7i-3p 및 hsa-miR-150-3p는 실제로 정상군과 신장합병증이 있는 당뇨군 간에 유의한 발현 차이를 나타내는 것을 확인하였다(실시예 2-1 내지 2-4).

이에 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로RNA(microRNA) let-7c, let-7i 및 마이크로RNA-150(miR-150)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 당뇨병성 신증 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

상기 피검체 유래의 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨 등을 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 혈액 또는 혈청 유래 엑소좀일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 방법에 따라 피검자 유래 시료에서 분리한 엑소좀 내 let-7c, let-7i 및/또는 마이크로RNA-150(miR-150)의 발현수준이 정상인보다 높을 경우 당뇨병성 신증으로 판정할 수 있다.

상기 microRNAs의 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 또는 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 분석 대상 모집

본 발명자들은 당뇨병으로 인한 신장합병증인 당뇨병성 신증을 조기에 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하기 위해, 각각 정상군(HV) 18명, 신장합병증이 없는 당뇨환자군(Nephro-X) 33명, 및 신장합병증이 있는 당뇨환자군(Nephro-O) 23명을 모집하였고, 이들로부터 혈청 샘플을 채취하여 그룹 간 차이를 나타내는 생체지표를 찾고자 하였다. 이를 위해, 상기 각 군의 대상자들로부터 혈청을 제공받았다.

1-2. 혈청으로부터 RNA 분리 및 서열분석 수행

상기 실시예 1-1에서 각 군의 대상자들로부터 채취한 혈청 샘플에 대하여 Exoquick(SBI, USA)을 사용해 엑소좀(exosome)을 분리하였고, 상기 분리된 엑소좀으로부터 Qiagen miRNeasy kit을 이용하여 총 RNA를 추출하였으며, 추출된 총 RNA의 질은 Agilent RNA Bioanalyzer를 이용해 제조사의 지시에 따라 측정하였다.

이후 상기 분리된 RNA를 이용하여 마크로젠사에서 Takara SMARTer smRNA for illumina kit을 사용하여 라이브러리를 제작한 후 Hiseq 2500으로 차세대 염기서열 분석(NGS)을 실시하여 microRNA를 검출하였다.

실시예 2. 당뇨병성 신증 진단용 microRNA 발굴

2-1. 정상군 vs. 신장합병증이 없는 당뇨군의 발현수준에 차이가 있는 microRNA 분석

먼저, 본 발명자들은 상기 정상군 18명과 신장합병증이 없는 당뇨군 33명의 혈액 유래 엑소좀에서 발현수준의 차이가 나는 microRNA(miRNA)를 동정하기 위하여, 상기 실시예 1-1 및 1-2의 방법에 따라 각 대상자들에서 채취한 혈청으로부터 엑소좀을 분리하고 추출된 총 RNA에 대한 NGS 분석을 실시하였다. 분석 결과 107개의 miRNAs가 검출되었으며, 나아가 상기 검출된 miRNAs의 발현수준을 비교하였다.

그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이 107개의 miRNAs 중에 정상군(HV)에 비해 신장합병증이 없는 당뇨군(Nephro-X)에서 2배 이상(p < 0.05) 발현이 감소하는 miRNA가 62개, 발현이 증가하는 miRNA가 45개로 나타났다. 또한, 상기 유의한 발현 변화를 보이는 miRNAs의 발현수준에 따른 산점도(scatter plot) 결과를 도 1b에 나타내었다.

2-2. 정상군 vs. 신장합병증이 있는 당뇨군의 발현수준에 차이가 있는 microRNA 분석

상기 결과에 더하여, 본 발명자들은 상기 정상군 18명과 신장합병증이 있는 당뇨군 23명의 혈액 유래 엑소좀에서 발현수준의 차이가 나는 miRNA를 동정하기 위하여, 상기와 동일한 방법으로 얻은 엑소좀 내 총 RNA에 대한 NGS 분석을 실시하였다. 분석 결과 95개의 miRNA가 검출되었으며, 나아가 상기 검출된 miRNAs의 발현수준을 비교하였다.

그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 95개의 miRNAs 중에 정상군(HV)에 비해 신장합병증이 있는 당뇨군(Nephro-O)에서 2배 이상(p < 0.05) 발현이 감소하는 miRNA가 55개, 발현이 증가하는 miRNA가 40개로 나타났다. 또한, 상기 유의한 발현 변화를 보이는 miRNAs의 발현수준에 따른 산점도(scatter plot) 결과를 도 2b에 나타내었다.

2-3. 신장합병증이 없는 당뇨군 vs. 신장합병증이 있는 당뇨군의 발현수준에 차이가 있는 miRNA 분석

또한, 본 발명자들은 상기 신장합병증이 없는 당뇨군 33명과 신장합병증이 있는 당뇨군 23명의 혈액 유래 엑소좀에서 발현수준의 차이가 나는 miRNA를 동정하기 위하여, 상기와 동일한 방법으로 얻은 엑소좀 내 총 RNA에 대한 NGS 분석을 실시하였다. 분석 결과 12개의 miRNAs가 검출되었으며, 나아가 상기 검출된 miRNAs의 발현수준을 비교하였다.

그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이 12개의 miRNAs 중에 신장합병증이 없는 당뇨군(Nephro-X)에 비해 신장합병증이 있는 당뇨군(Nephro-O)에서 2배 이상(p < 0.05) 발현이 감소하는 miRNA가 9개, 발현이 증가하는 miRNA가 3개로 나타났다. 또한, 상기 유의한 발현 변화를 보이는 miRNAs의 발현수준에 따른 산점도(scatter plot) 결과를 도 3b에 나타내었다.

2-4. 정상군 vs. 신장합병증이 없는 당뇨군 vs. 신장합병증이 있는 당뇨군 간의 발현수준에 차이가 있는 miRNA 분석

나아가 정상군, 신장합병증이 없는 당뇨군 및 신장합병증이 있는 당뇨군에 대하여 다차원척도법(MDS)을 통해 개별 샘플에 대한 변화량을 도출하여 이를 시각화하여 분석하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 정상군과 당뇨군에서 각각 나타나는 2차원상의 공간적 위치가 두개의 그룹으로 확연하게 구분되어 나타났으나, 신장합병증 유무에 따른 차이는 크게 구분되어 나타나지 않았다. 그러나 신장합병증 유무에 따라 차이가 나는 miRNA를 발굴한다면 신장합병증을 진단할 수 있는 유용한 바이오마커로 이용할 수 있으므로, 본 발명자들은 상기 실시예 2-1 내지 2-3의 결과를 통해 얻은 분석 결과에 기초하여 신장합병증 진단용 miRNA 발굴을 위한 추가적인 비교분석을 실시하였다.

이를 위해, 상기 각 분석결과 발현이 유의하게 증가하는 것으로 확인된 miRNAs를 도 5의 벤다이어그램으로 나타내었다. 그 결과, 정상군(HV)에 비해 신장합병증이 있는 당뇨군(Diabetes-Nephro-O)에서 발현이 유의하게 증가한 40개 miRNAs(C/A), 및 정상군에 비해 신장합병증이 없는 당뇨군(Diabetes-Nephro-X)에서 발현이 유의하게 증가한 45개 miRNAs(B/A)를 비교하여 공통적으로 존재하는 32개 miRNAs(C/A & B/A)를 제외함으로써 정상군에 비해 신장합병증이 있는 당뇨군에서만 발현이 증가한 8개 miRNAs를 확보하였다. 이후 상기 실시예 2-3에서 신장합병증이 없는 당뇨군에 비해 신장합병증이 있는 당뇨군에서 유의하게 발현이 증가한 3개 miRNAs(C/B) 결과를 상기 확보된 8개 miRNAs와 비교한 결과, 공통적으로 발현이 증가하는 1종의 miRNA를 확인하였다. 이에, 상기 8개 miRNAs에서 상기 공통된 1종의 miRNA를 제외한 7종을 확보하였으며, 이들 중 가장 유의한 발현수준 차이를 보이는 3종의 miRNAs를 최종적으로 선별하였다. 상기 선별된 3종의 miRNAs를 하기 표 1에 나타내었으며, 정상군에 비해 신장합병증이 있는 군에서 각각 2.49, 2.36 및 2.48배의 유의한 차이를 나타내는 것을 확인하였다.

	당뇨-신장합병증군/정상군 (C/A) fold change
hsa-let-7c-5p	2.49	***
hsa-let7i-3p	2.36	**
hsa-miR-150-3p	2.48	**

또한, 도 6에 나타낸 바와 같이 정상군(HV)과 신장합병증이 있는 당뇨군(Nephro-O) 간에 상기에서 발굴된 3종의 miRNAs 즉, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7i-3p, 및 hsa-miR-150-3p의 발현이 유의한 차이를 나타내는 것을 확인하였다.

따라서 상기 결과들은 각각 정상인에 비해 신장합병증이 있는 당뇨군에서만 발현이 유의하게 증가한 3종의 miRNAs를 당뇨병성 신증을 특이적으로 진단할 수 있는 바이오마커로 유용하게 이용할 수 있음을 보여주는 것이다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> Biomarker microRNA let-7 or microRNA-150 for diagnosing diabetic nephropathy and use thereof <130> PD18-144 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> hsa-let-7c-5p <400> 1 ugagguagua gguuguaugg uu 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> hsa-let-7i-3p <400> 2 cugcgcaagc uacugccuug cu 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> hsa-miR-150-3p <400> 3 cugguacagg ccugggggac ag 22

Claims

마이크로RNA-150-3p(miR-150-3p)을 포함하는, 당뇨병성 신증 진단용 마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 마커 조성물은 마이크로RNA let-7c-5p 또는 let-7i-3p를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
제2항에 있어서,
상기 let-7c-5p 및 let-7i-3p는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 miR-150-3p는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
마이크로RNA-150-3p(miR-150-3p)의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 당뇨병성 신증 진단용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 진단용 조성물은 마이크로RNA let-7c-5p 또는 let-7i-3p의 발현수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 당뇨병성 신증 진단용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 let-7c-5p 및 let-7i-3p는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 당뇨병성 신증 진단용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 miR-150-3p는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 당뇨병성 신증 진단용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 발현수준을 측정하는 제제는 상기 microRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 당뇨병성 신증 진단용 조성물.
제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 당뇨병성 신증 진단용 키트.
피검체 유래의 혈액 또는 혈청 유래 엑소좀(exosome)에서 마이크로RNA-150-3p(miR-150-3p)의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 당뇨병성 신증 진단을 위한 정보제공방법.
제11항에 있어서,
상기 정보제공방법은 마이크로RNA let-7c-5p 또는 let-7i-3p의 발현수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
제12항에 있어서,
상기 let-7c-5p 및 let-7i-3p는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
제11항에 있어서,
상기 miR-150-3p는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
삭제
제11항에 있어서,
상기 발현수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.