CN115418397A - 一种用于扩张型心肌病辅助诊断的生物标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明医药生物技术领域，涉及一种用于扩张型心肌病辅助诊断的生物标志物及其应用，所述生物标志物为miR‑126‑3p、miR‑126‑5p、miR‑26a‑5p、miR‑30c‑5p中的至少一种。检测所述生物标志物在扩张型心肌病患者和正常对照人群血清中的表达情况，发现miR‑126‑3p、miR‑126‑5p、miR‑26a‑5p、miR‑30c‑5p在扩张型心肌病患者血清中的表达水平均显著低于正常对照人群，差异具有统计学意义。而且，本发明还提供了一种用于扩张型心肌病辅助诊断的试剂盒，该试剂盒含有用于检测上述生物标志物的检测试剂。本发明通过检测人血清中miR‑126‑3p、miR‑126‑5p、miR‑26a‑5p、miR‑30c‑5p的水平，可有效区分扩张型心肌病患者与健康对照，可用于DCM的辅助诊断。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种用于扩张型心肌病辅助诊断的生物标志物及其应用。
背景技术
扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)是病理性心肌病的一种，是导致心衰的重要因素之一，主要表现为，在没有压力或容量过载或冠状动脉疾病足以解释功能障碍的情况下，左室(Left Ventricular)或双室(biventricular)扩张和收缩功能障碍，发病率约为1/2500-1/250。尽管治疗手段的提高，DCM患者生存率不断增高，但仍有一些病人容易发生心源性猝死和顽固性心力衰竭。DCM的发病因素众多，除基因异常，动脉疾病，心肌梗死以及其他因素(化疗药物，病毒，免疫，酒精等)引起的心肌细胞损伤均可导致疾病的发生。尽管病因众多，DCM在结构，功能，生化与分子的表型均十分相似。因此，深入探究扩张型心肌病的发病机制对于DCM的防治具有重要意义。
MicroRNA(缩写为miRNA)是22nt的短链非编码RNA，通过调控不同的靶基因，参与到机体的各种生理病理过程。多篇研究报道，miRNA通过多种机制调控心肌肥厚、心肌细胞损伤、心肌纤维化、血管生成和炎症反应，在心肌重构的发病机制中发挥核心作用。然而，miRNA是否调控参与DCM的发病过程，并能作为其分子早期诊断的标志物，有待探讨。
发明内容
针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的旨在提供一种用于扩张型心肌病辅助诊断的生物标志物及其应用。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种可用于扩张型心肌病辅助诊断的生物标志物，所述生物标志物为miR-126-3p、miR-126-5p、miR-26a-5p、miR-30c-5p中的至少一种。
通过实时荧光定量QPCR检测所述生物标志物在扩张型心肌病患者和正常对照人群血清中的表达情况，发现miR-126-3p、miR-126-5p、miR-26a-5p、miR-30c-5p在扩张型心肌病患者血清中的表达水平均显著低于正常对照人群；说明miR-126-3p、miR-126-5p、miR-26a-5p、miR-30c-5p在扩张型心肌病患者血清中表达下调。
第二方面，本发明提供了了上述第一方面所述生物标志物的检测试剂在制备扩张型心肌病辅助诊断的产品中的应用。
根据上述的应用，优选地，所述产品通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、Northern Blotting、芯片、高通量测序平台检测样本中所述生物标志物的表达水平。
根据上述的应用，优选地，所述产品中含有扩增所述生物标志物的特异性引物或与所述生物标志物杂交的探针。
根据上述的应用，优选地，扩增所述生物标志物的特异性引物的核苷酸序列如下：
扩增miR-126-3p的特异性引物的核苷酸序列为：
miR126-3p-F：gcagtcgtaccgtgagt，
miR126-3p-R：tccagtttttttttttttttcgca；
扩增miR-126-5p的特异性引物的核苷酸序列为：
miR126-5p-F：cgcagcattattacttttggt，
miR126-5p-R：ccagtttttttttttttttcgcgta；
扩增miR-26a-5p的特异性引物的核苷酸序列为：
miR26a-5p-F：gcagttcaagtaatccaggatag，
miR26a-5p-R：ggtccagtttttttttttttttagc；
扩增miR-30c-5p的特异性引物的核苷酸序列为：
miR30c-5p-F：gcgcagtgtaaacatcctac，
miR30c-5p-R：ccagtttttttttttttttgctgaga。
根据上述的应用，优选地，所述生物标志物为miR-126-3p与miR-30c-5p的组合时，所述产品进行扩张型心肌病诊断时，预测扩张型心肌病的概率计算公式为：
PRE(P＝DCM)＝1/(1+EXP(-(1.962-3729×miR30c-205.2×miR126-3p)))；
所述生物标志物为miR-126-3p、miR-30c-5p与miR-26a-5p的组合时，所述产品进行扩张型心肌病诊断时，预测扩张型心肌病的概率计算公式为：
PRE(P＝DCM)＝1/(1+EXP(-(2.427-260.9×miR26a–2863×miR30c-185.7×miR126-3p)))；
所述生物标志物为miR-126-3p、miR-30c-5p、miR-26a-5p与miR-126-5p的组合时，所述产品进行扩张型心肌病诊断时，预测扩张型心肌病的概率计算公式为：
PRE(P＝DCM)＝1/(1+EXP(-(2.671-226.1×miR26a-2167×miR30c-438.8×miR126-5p-183.7×miR126-3p)))；
其中，PRE表示预测概率，EXP表示以自然常数e为底的指数函数，miR26a表示受试者样本中miR-26a-5p表达量；miR30c表示受试者样本中miR-30c-5p表达量；miR126-5p表示受试者样本中miR-126-5p表达量；miR126-3p表示受试者样本中miR-126-3p表达量。
根据上述的应用，优选地，所述产品的检测样本为细胞、组织、全血、血浆或血清。
根据上述的应用，优选地，所述产品为芯片、制剂或试剂盒。
第三方面，本发明提供了一种用于扩张型心肌病辅助诊断的试剂盒，所述试剂盒中含有权利要求1所述生物标志物的检测试剂。
根据上述的试剂盒，优选地，所述检测试剂为通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、Northern Blotting、芯片、高通量测序平台检测样本中所述生物标志物的表达水平的试剂。
根据上述的试剂盒，优选地，所述检测试剂为扩增所述生物标志物的特异性引物或与所述生物标志物杂交的探针。
根据上述的试剂盒，优选地，扩增所述生物标志物的特异性引物的核苷酸序列如下：
其中，扩增miR-126-3p的特异性引物的核苷酸序列为：
miR126-3p-F：gcagtcgtaccgtgagt(SEQ ID NO.1)，
miR126-3p-R：tccagtttttttttttttttcgca(SEQ ID NO.2)；
扩增miR-126-5p的特异性引物的核苷酸序列为：
miR126-5p-F：cgcagcattattacttttggt(SEQ ID NO.3)，
miR126-5p-R：ccagtttttttttttttttcgcgta(SEQ ID NO.4)；
扩增miR-26a-5p的特异性引物的核苷酸序列为：
miR26a-5p-F：gcagttcaagtaatccaggatag(SEQ ID NO.5)，
miR26a-5p-R：ggtccagtttttttttttttttagc(SEQ ID NO.6)；
扩增miR-30c-5p的特异性引物的核苷酸序列为：
miR30c-5p-F：gcgcagtgtaaacatcctac(SEQ ID NO.7)，
miR30c-5p-R：ccagtttttttttttttttgctgaga(SEQ ID NO.8)。
根据上述的试剂盒，优选地，所述生物标志物为miR-126-3p与miR-30c-5p的组合时，所述试剂盒预测扩张型心肌病的概率计算公式为：
PRE(P＝DCM)＝1/(1+EXP(-(1.962-3729×miR30c-205.2×miR126-3p)))；
所述生物标志物为miR-126-3p、miR-30c-5p与miR-26a-5p的组合时，所述试剂盒预测扩张型心肌病的概率计算公式为：
PRE(P＝DCM)＝1/(1+EXP(-(2.427-260.9×miR26a–2863×miR30c-185.7×miR126-3p)))；
所述生物标志物为miR-126-3p、miR-30c-5p、miR-26a-5p与miR-126-5p的组合时，所述试剂盒预测扩张型心肌病的概率计算公式为：
PRE(P＝DCM)＝1/(1+EXP(-(2.671-226.1×miR26a-2167×miR30c-438.8×miR126-5p-183.7×miR126-3p)))；
其中，PRE表示预测概率，EXP表示以自然常数e为底的指数函数，miR26a表示受试者样本中miR-26a-5p表达量；miR30c表示受试者样本中miR-30c-5p表达量；miR126-5p表示受试者样本中miR-126-5p表达量；miR126-3p表示受试者样本中miR-126-3p表达量。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果如下：
(1)本发明首次发现miR-126-3p、miR-126-5p、miR-26a-5p、miR-30c-5p在扩张型心肌病患者血清中表达显著下调，具有统计学差异，因此，通过检测人血清中miR-126-3p、miR-126-5p、miR-26a-5p、miR-30c-5p的水平，可以有效区分扩张型心肌病患者和正常人；而且，经验证，本发明单独采用miR-126-3p、miR-126-5p、miR-26a-5p、miR-30c-5p中任意一个microRNA作为标志物诊断区分扩张型心肌病患者和正常人时，其ROC曲线的AUC均能达到0.65以上，多个标志物联合使用时，ROC曲线的AUC值比单个标志物更接近于1，诊断效果更好。因此，本发明用于扩张型心肌病辅助诊断的标志物可用于扩张型心肌病的辅助诊断，为临床医生对扩张型心肌病的诊断提供了新的参考依据。
(2)本发明将miR-126-3p、miR-126-5p、miR-26a-5p、miR-30c-5p四种标志物作为一个组合用于诊断区分扩张型心肌病患者和正常人时，其ROC曲线的AUC为0.7895，检测灵敏度高达71.88％(即扩张型心肌病患者应用这四个标志物进行诊断时被正确的诊断为肝癌的比率为71.88％)，特异度达到了77.78％(即健康对照中应用这四个标志物进行诊断时确定为健康者的比率为77.78％)。因此，本发明的标志物具有较高的灵敏度和特异度，极大地提高了扩张型心肌病的检出率，有利于扩张型心肌病的早期发现。
(3)本发明的试剂盒通过检测miR-126-3p、miR-126-5p、miR-26a-5p、miR-30c-5p四种标志物的水平，可以较准确地将扩张型心肌病患者与健康对照诊断区分开，为临床医生对扩张型心肌病的诊断提供了新的参考依据。
(4)本发明的试剂盒检测样本为血清，通过微创方式取血清检测即可获得肝癌的患病风险，需血量少，被检测人员痛苦小、依从性高；而且，操作简单，检测出结果时间短，具有广阔的市场前景和社会效益。
附图说明
图1为DCM模型小鼠心脏HE染色图；其中，control代表空白对照组小鼠，DCM代表DCM模型小鼠；
图2为小鼠血清microRNA的QPCR检测结果；其中，control代表空白对照组小鼠，DCM代表DCM模型小鼠，*表示p≤0.05，**表示p≤0.01，ns表示无统计学差异；
图3为人血清microRNA的QPCR检测结果；其中，control代表健康受试者，DCM代表DCM患者，**表示p≤0.01；
图4为四种microRNA单独诊断区分DCM患者和正常对照的ROC曲线；
图5为miR-30c-5p和miR-126-3p联合诊断区分DCM患者和正常对照的ROC曲线；
图6为miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p联合诊断区分DCM患者和正常对照的ROC曲线；
图7为miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p联合诊断区分DCM患者和正常对照的ROC曲线。
具体实施方式
以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均采用本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例一：采用microRNA测序筛选用于DCM治疗的标志物
1、实验样本：
收集来自河南省阜外华中心血管病医院10例DCM患者血清(DCM组)和10例正常人血清(正常对照组)；其中，10例DCM患者血清来源于经超声诊断确诊且无家族遗传史；10例正常人血清来源于健康受试者，健康受试者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无自身免疫性疾病，无任何肿瘤相关的证据；而且，10例DCM患者和10例健康受试者在性别之间的差异没有统计学意义。本研究获得郑州大学伦理委员会批准，所有的研究对象均已签署知情同意书。
血清采集：采集研究对象在空腹状态时的外周血液5ml放于无抗凝剂的采血管中，室温静置1h后置于4℃离心机中，3000rpm离心10min。然后将采血管上层的血清吸出并液氮速冻，于-80℃冰箱冷冻保存。
2、血清microRNA测序
(1)实验方法
于华大基因进行microRNA测序。其具体方法如下：
1)样本提取及检测：使用Trizol-LS试剂(ambion)按照其说明书提取样本中的RNA，使用安捷伦2100生物分析仪检测样本完整度和浓度，使用NanoDrop检测盐离子污染，这一步为文库构建和后期信息分析提供参考。
2)文库构建：
富集Small RNA：取200ng-1ug步骤1)提取的RNA样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离回收18-30nt的Small RNA。
接头连接：先进行3’接头反应，再进行5’接头反应；
反转录-PCR扩增：根据逆转录试剂盒中给出的反应体系配制溶液，具体如下：
将上述各成分按体积加入到200μl PCR管中，混匀并离心，将PCR管放入PCR仪中，进行逆转录反应：37℃，15分钟；85℃，1分钟。逆转录结束后得到的逆转录产物即cDNA。
回收PCR产物：对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，回收PCR后的文库目的条带，并保存于EB缓冲液中。
3)文库质检：
文库采用安捷伦2100生物分析仪检测浓度与文库长度。
4)环化：
变性打开双链PCR产物，加入环化引物，使PCR单链成环状。
5)上机测序：
使用BGISEQ-500测序平台，通过联合探针锚定聚合技术进行测序。
(2)数据处理：
原始数据去除一些低质量的数据后，获得有效数据。将有效数据与数据库(如miRbase数据库、siRNA数据库、piRNA数据库等)比对后注释。使用miRDeep2软件预测新的miRNA。使用RNAhybrid、miRnanda、TargetScan等软件预测miRNA的靶基因。使用DEGseq进行差异表达的检测，Q值≤0.001，且Log2实验组比值≥1的miRNA认为差异明显。使用phyper进行GO分析，使用Bonferroni进行校正的P值≤0.05被认为有意义。
3、实验结果：
经筛选，最终筛选出8个与心腔扩大相关的microRNA，它们分别是miR-126-3p、miR-126-5p、miR-133a-3p、miR-24-3p、miR-26a-5p、miR-27b-3p、miR-30c-5p、miR-451a。
实施例二：QPCR检测DCM模型小鼠的microRNA水平
采用QPCR进一步在DCM模型小鼠中验证实施例1筛选到的八种microRNA的水平。
1、DCM模型小鼠的构建：
(1)小鼠选取：
选取6-7周龄的C57BL/6雄性小鼠(购自北京维通利华公司)，并在研究开始前接受适应性喂养1周。所有小鼠均在特定(温度：20-25℃；湿度：50±5％)屏障条件下，在单独的通风笼中饲养。
(2)DCM模型小鼠构建：
实验小鼠尾静脉注射DOX(阿霉素)，DOX注射剂量为5mg/kg，每周注射一次，连续注射四周，建立DCM模型小鼠。小鼠注射最后一剂DOX 4周后，取小鼠心脏组织，进行HE染色。
小鼠心脏的HE染色结果如图1所示。由图1可知，DCM模型小鼠心脏室壁变薄、心腔变大，属于典型的DCM病症，说明小鼠DCM模型造模成功。
(3)QPCR检测DCM模型小鼠的microRNA水平：
1)实验方法：
使用Trizol-LS试剂(ambion)按照说明书提取DCM模型小鼠血清中的RNA，使用Poly(A)加尾酶试剂盒(购自诺唯赞公司，货号DD4111)依据说明书给RNA加尾。使用特异性引物CAGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTVN进行逆转录(逆转录试剂盒购自Thermo，货号为K1691)。
使用如下引物进行QPCR检测：
扩增miR-126-3p的特异性引物的核苷酸序列为：
miR126-3p-F：gcagtcgtaccgtgagt，
miR126-3p-R：tccagtttttttttttttttcgca；
扩增miR-126-5p的特异性引物的核苷酸序列为：
miR126-5p-F：cgcagcattattacttttggt，
miR126-5p-R：ccagtttttttttttttttcgcgta；
扩增miR-26a-5p的特异性引物的核苷酸序列为：
miR26a-5p-F：gcagttcaagtaatccaggatag，
miR26a-5p-R：ggtccagtttttttttttttttagc；
扩增miR-30c-5p的特异性引物的核苷酸序列为：
miR30c-5p-F：gcgcagtgtaaacatcctac，
miR30c-5p-R：ccagtttttttttttttttgctgaga；
扩增miR133a-3p的特异性引物的核苷酸序列为：
miR133a-3p-F：tggtccccttcaaccag，
miR133a-3p-R：ggtccagtttttttttttttttcag；
扩增miR27b-3p的特异性引物的核苷酸序列为：
miR27b-3p-F：gcagttcacagtggctaag，
miR27b-3p-R：tccagtttttttttttttttgcaga；
扩增miR24-3p的特异性引物的核苷酸序列为：
miR24-3p-F：agtggctcagttcagca，
miR24-3p-R:ccagtttttttttttttttctgttcct；
扩增miR451a-5p的特异性引物的核苷酸序列为：
miR451a-5p-F：cgcagaaaccgttacca，
miR451a-5p-R：ggtccagtttttttttttttttaactca。
QPCR反应体系如下：
根据QPCR反应体系配制溶液。扩增程序为：95℃5分钟；40个循环：95℃15秒钟，65℃45秒钟。以U6作为内参基因。按照2-△△CT法计算microRNA的相对表达水平。
2)实验结果：
DCM模型小鼠血清microRNA的检测结果如图2所示。
由图2可知，与空白对照组小鼠相比，DCM模型小鼠中miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p显著下调，差异具有统计学意义。
实施例三：QPCR检测DCM患者血清中四种microRNA的水平
1、实验样本：
收集来自河南省阜外华中心血管病医院54例DCM患者血清(DCM组)和46例正常人血清(正常对照组)；其中，54例DCM患者血清来源于经超声诊断确诊且无家族遗传史；46例正常人血清来源于健康受试者，健康受试者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无自身免疫性疾病，无任何肿瘤相关的证据；而且，54例DCM患者和46例健康受试者在性别之间的差异没有统计学意义。本研究获得郑州大学伦理委员会批准，所有的研究对象均已签署知情同意书。
血清采集：采集研究对象在空腹状态时的外周血液5ml放于无抗凝剂的采血管中，室温静置1h后置于4℃离心机中，3000rpm离心10min。然后将采血管上层的血清吸出并液氮速冻，于-80℃冰箱冷冻保存。
2、QPCR检测DCM患者和健康受试者血清中四种microRNA的表达水平：
1)实验方法：
QPCR检测的实验方法与实施例二相同，在此不再赘述。
2)实验结果：
QPCR检测的实验结果如图3所示。
由图3可知，与健康受试者相比，DCM患者血清中miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p显著下调，差异具有统计学意义。
实施例四：四种microRNA用于DCM诊断的能力评估
根据实施例三采用QPCR检测54例DCM患者和46例康受试者血清中miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p的表达水平结果，采用GraphPad Prism 8.0分别绘制对应的ROC曲线，分析四种microRNA用于DCM诊断的价值。
1、单一microRNA诊断区分DCM患者和正常对照的能力评估：
基于实施例三检测的54例患者和46例健康受试者血清样本中miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p的表达量，绘制每一种microRNA的ROC曲线，通过ROC曲线来评估每一种microRNA单独诊断区分DCM患者和正常人的能力。
miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p诊断区分DCM患者和正常人的ROC曲线如图4所示。根据ROC曲线，以约登指数最大的OD值为截断值，同时计算相应的AUC以及95％置信区间、灵敏度和特异度。
由图4可知，miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p单独用于诊断区分DCM患者和正常人时，其AUC分别为0.7146、0.7176、0.7198、0.6876。因此，单一一种microRNA用于诊断区分DCM患者和健康对照的ROC曲线的AUC均能达到0.65以上，其中，miR-126-3p的诊断价值最高。由此说明，四种microRNA均可以用于DCM的辅助诊断。
2、两种microRNA组合诊断区分DCM患者和正常对照的能力评估：
以实施例三检测的54例患者和46例正常对照血清样本中miR-30c-5p、miR-126-3p的表达量平作为自变量，是否患DCM为因变量，对miR-30c-5p、miR-126-3p在DCM组和正常组血清样本中的表达量进行Logistic回归分析，构建诊断区分DCM患者和正常对照的诊断模型，该诊断模型为：PRE(P＝DCM)＝1/(1+EXP(-(1.962-3729×miR30c-205.2×miR126-3p)))，该诊断模型中：EXP表示以自然常数e为底的指数函数；PRE表示预测概率；miR30c表示受试者血清中miR30c-5p的表达量(表达量是以QPCR方法检测到的miR-30c-5p的2-△CT值计量)；miR126-3p表示受试者血清中miR-126-3p的表达量(表达量以reatimePCR方法检测到的miR-126-3p的2-△CT值计量)。再将各血清样本中miR-30c-5p、miR-126-3p的表达量代入该诊断模型，即可得到各个血清样本的预测概率(即PRE值)，以预测概率PRE＝0.5为诊断区分DCM患者和正常人的最佳截断值(若PRE值大于等于截断值，则判定受试者为DCM患者，若PRE值小于截断值，则判定受试者为正常人)，并计算对应的灵敏度和特异度。根据预测概率绘制ROC曲线，ROC曲线如图5所示。
由图5可知，miR-30c-5p、miR-126-3p组合诊断区分DCM患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.7476，对应的灵敏度为70.49％，特异度为71.79％。
3、三种microRNA组合诊断区分DCM患者和正常对照的能力评估：
以实施例三检测的54例患者和46例正常对照血清样本中miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p的表达量作为自变量，是否患DCM为因变量，对miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p在DCM组和正常组血清样本中的表达量进行Logistic回归分析，构建诊断区分DCM患者和正常对照的诊断模型，该诊断模型为：PRE(P＝DCM)＝1/(1+EXP(-(2.427-260.9×miR26a–2863×miR30c-185.7×miR126-3p)))，该诊断模型中：EXP表示以自然常数e为底的指数函数；PRE表示预测概率；miR26a表示受试者血清中miR-26a-5p表达量(表达量以QPCR方法检测到的miR26a-5p的2-△CT值计量)；miR30c表示受试者血清中miR-30c-5P的表达量(表达量以QPCR方法检测到的miR-30c-5p的2-△CT值计量)；miR126-3p表示受试者血清中miR-126-3p的表达量(表达量以QPCR方法检测到的miR-126-3p的2-△CT值计量)。再将各血清样本中miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p的表达量代入该诊断模型，即可得到各个血清样本的预测概率(即PRE值)，以预测概率PRE＝0.5为诊断区分DCM患者和正常人的最佳截断值(若PRE值大于等于截断值，则判定受试者为DCM患者，若PRE值小于截断值，则判定受试者为正常人)，并计算对应的灵敏度和特异度。根据预测概率绘制ROC曲线，ROC曲线如图6所示。
由图6可知，miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p组合诊断区分DCM患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.7701，对应的灵敏度为68.75％，特异度为72.22％。
4、四种microRNA组合诊断区分DCM患者和正常对照的能力评估：
以实施例三检测的54例患者和46例正常对照血清样本中miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p的表达量作为自变量，是否患DCM为因变量，对miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p在DCM组和正常组血清样本中的表达量进行Logistic回归分析，构建诊断区分DCM患者和正常对照的诊断模型，该诊断模型为：PRE(P＝DCM)＝1/(1+EXP(-(2.671-226.1×miR26a-2167×miR30c-438.8×miR126-5p-183.7×miR126-3p)))，该诊断模型中：EXP表示以自然常数e为底的指数函数；PRE表示预测概率；miR26a表示受试者血清中miR26a-5p的表达量(表达量以QPCR方法检测到的miR-26a-5p的2-△CT值计量)；miR30c表示受试者血清中miR30c-5P的表达量(含表达量以QPCR方法检测到的miR-30c-5p的2-△CT值计量)；miR126-5p表示受试者血清中miR126-5P的表达量(表达量以QPCR方法检测到的miR126-5p的2-△CT值计量)；miR126-3p表示受试者血清中miR126-3P的表达量(表达量以QPCR方法检测到的miR-126-3p的2-△CT值计量)。再将各血清样本中miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p的表达量代入该诊断模型，即可得到各个血清样本的预测概率(即PRE值)，以预测概率PRE＝0.5为诊断区分DCM患者和正常人的最佳截断值(若PRE值大于等于截断值，则判定受试者为DCM患者，若PRE值小于截断值，则判定受试者为正常人)，并计算对应的灵敏度和特异度。根据预测概率绘制ROC曲线，ROC曲线如图7所示。
由图7可知，miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p组合诊断区分DCM患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.7895，对应的灵敏度为71.88％，特异度为77.78％。
将上述单一microRNA与多种microRNA的组合进行对比，发现与单一microRNA相比，两种、三种或四种microRNA组合时，诊断区分DCM患者和正常人的ROC曲线的AUC均明显高于单一microRNA；而且，随着组合中microRNA数目的增加，其AUC值逐渐增大，当四种microRNA组合诊断区分DCM患者和正常人时，其ROC曲线的AUC达到了最大为0.7895，诊断的灵敏度达到了71.88％，特异度达到77.78％，由此说明，四种microRNA联合诊断效果最佳。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种用于扩张型心肌病辅助诊断的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为miR-126-3p、miR-126-5p、miR-26a-5p、miR-30c-5p中的至少一种。
2.权利要求1所述生物标志物的检测试剂在制备扩张型心肌病辅助诊断的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、Northern Blotting、芯片、高通量测序平台检测样本中所述生物标志物的表达水平。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品中含有扩增所述生物标志物的特异性引物或与所述生物标志物杂交的探针。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，扩增所述生物标志物的特异性引物的核苷酸序列如下：
扩增miR-126-3p的特异性引物的核苷酸序列为：
miR126-3p-F：gcagtcgtaccgtgagt，
miR126-3p-R：tccagtttttttttttttttcgca；
扩增miR-126-5p的特异性引物的核苷酸序列为：
miR126-5p-F：cgcagcattattacttttggt，
miR126-5p-R：ccagtttttttttttttttcgcgta；
扩增miR-26a-5p的特异性引物的核苷酸序列为：
miR26a-5p-F：gcagttcaagtaatccaggatag，
miR26a-5p-R：ggtccagtttttttttttttttagc；
扩增miR-30c-5p的特异性引物的核苷酸序列为：
miR30c-5p-F：gcgcagtgtaaacatcctac，
miR30c-5p-R：ccagtttttttttttttttgctgaga。
6.根据权利要求2-5任一所述的应用，其特征在于，所述生物标志物为miR-126-3p与miR-30c-5p的组合时，所述产品进行扩张型心肌病诊断时，预测扩张型心肌病的概率计算公式为：
PRE(P＝DCM)＝1/(1+EXP(-(1.962-3729×miR30c-205.2×miR126-3p)))；
所述生物标志物为miR-126-3p、miR-30c-5p与miR-26a-5p的组合时，所述产品进行扩张型心肌病诊断时，预测扩张型心肌病的概率计算公式为：
PRE(P＝DCM)＝1/(1+EXP(-(2.427-260.9×miR26a–2863×miR30c-185.7×miR126-3p)))；
所述生物标志物为miR-126-3p、miR-30c-5p、miR-26a-5p与miR-126-5p的组合时，所述产品进行扩张型心肌病诊断时，预测扩张型心肌病的概率计算公式为：PRE(P＝DCM)＝1/(1+EXP(-(2.671-226.1×miR26a-2167×miR30c-438.8×miR126-5p-183.7×miR126-3p)))；
其中，PRE表示预测概率，EXP表示以自然常数e为底的指数函数，miR26a表示受试者样本中miR-26a-5p表达量；miR30c表示受试者样本中miR-30c-5p表达量；miR126-5p表示受试者样本中miR-126-5p表达量；miR126-3p表示受试者样本中miR-126-3p表达量。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品的检测样本为细胞、组织、全血、血浆或血清；所述产品为芯片、制剂或试剂盒。
8.一种用于扩张型心肌病辅助诊断的试剂盒，所述试剂盒中含有权利要求1所述生物标志物的检测试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂为通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、Northern Blotting、芯片、高通量测序平台检测样本中所述生物标志物的表达水平的试剂。
10.根据权利要求9所述试剂盒，其特征在于，所述生物标志物为miR-126-3p与miR-30c-5p的组合时，所述试剂盒预测扩张型心肌病的概率计算公式为：
PRE(P＝DCM)＝1/(1+EXP(-(1.962-3729×miR30c-205.2×miR126-3p)))；
所述生物标志物为miR-126-3p、miR-30c-5p与miR-26a-5p的组合时，所述试剂盒预测扩张型心肌病的概率计算公式为：
PRE(P＝DCM)＝1/(1+EXP(-(2.427-260.9×miR26a–2863×miR30c-185.7×miR126-3p)))；
所述生物标志物为miR-126-3p、miR-30c-5p、miR-26a-5p与miR-126-5p的组合时，所述试剂盒预测扩张型心肌病的概率计算公式为：
PRE(P＝DCM)＝1/(1+EXP(-(2.671-226.1×miR26a-2167×miR30c-
438.8×miR126-5p-183.7×miR126-3p)))；
其中，PRE表示预测概率，EXP表示以自然常数e为底的指数函数，miR26a表示受试者样本中的miR26a-5p表达量；miR30c表示受试者样本中的miR30c-5p表达量；miR126-5p表示受试者样本中的miR126-5p表达量；
miR126-3p表示受试者样本中miR126-3p表达量。
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