CN102481310A - 牵涉心肌梗死后重塑和心力衰竭的微小rna的鉴定 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鉴定牵涉心脏组织中的心力衰竭和心肌梗死后重塑过程的miRNA。描述了调控这些鉴定的miRNA作为对于心肌梗死、心脏重塑、和心力衰竭的治疗。

Description

牵涉心肌梗死后重塑和心力衰竭的微小RNA的鉴定

对相关申请的交叉引用

本申请要求2009年5月20日提交的美国临时申请No.61/179,775的优先权权益，通过提及将其完整收入本文。

关于政府资助的声明

本发明是在国家卫生研究院授予的拨款号HL53351-06下在政府支持下做出的。政府具有本发明的某些权利。

发明领域

一般而言，本发明涉及发育生物学、心脏病学、病理学和分子生物学领域。更具体而言，它关注心肌梗死后(MI后)的组织和人心力衰竭样品中改变的miRNA表达。操作受调节的miRNA的表达提供了一种治疗心肌梗死和心力衰竭的新治疗方法。

发明背景

心脏病及其表现，包括冠心病、心肌梗死、充血性心力衰竭和心脏肥大，清楚地呈现了美国当今的一项重大健康风险。诊断、治疗和支持罹患这些疾病的患者的花费完全达到数十亿美元。心脏病的一种特别严重的表现是心肌梗死。心肌梗死(MI)(更通常称为心脏病发作)是一种在对心脏的一部分的血液供应被中断(最通常是由于易损斑块的破裂所致)时发生的医学状况。所致的缺血或氧缺乏引起心脏组织的损伤和潜在的死亡。它在全世界对于男性和女性都是主要死亡原因。仅在美国，冠状动脉性心脏病占死亡的五分之一，而且大约7,200,000名男性和6,000,000名女性正在承受某种形式的冠状动脉性心脏病。这些之中，1,200,000人每年遭受新的或复发的冠状动脉发作(coronary attack)，并且他们之中的约40％由于发作而死亡。这意味着大约每65秒，就有一名美国人死于冠状动脉事件。

若受损的对心脏的血流量持续得足够久，则它触发缺血性级联，其中心脏细胞死于坏死，并且在其位置上形成胶原瘢痕。最近的研究指示来自凋亡的细胞死亡也在心肌梗死后的组织损伤过程中发挥作用。因此，患者的心脏会受到永久地损伤。此瘢痕组织还使患者面临潜在危及生命的心律失常的风险，而且可以导致心室壁瘤的形成，所述心室壁瘤可以破裂，伴有灾难性后果。受损伤的心脏组织比正常的心脏组织更缓慢地传导电脉冲。受损伤的与未受损伤的组织间的传导速度差异可以触发被认为是许多致命性心律失常的原因的再进入或反馈环。心输出量和血压可能下降到危险的水平，其可以导致进一步的冠状动脉缺血和梗死的扩散。

在对梗死组织的直接影响外，梗死周围的边界区中的相邻组织也经历由改变的基因调节触发的病理性重塑。此重塑导致此区域中的进一步的肌细胞丧失、增生和进一步的胶原沉积。梗死后，远处的心肌(myocardium)通过心肌细胞肥大和间质性纤维化的发作来响应梗死。如此，虽然对梗死组织的损伤可能到临床上诊断并解决MI时已在很大程度上不可挽回，但是由于MI后重塑所致的进一步变化呈现治疗性干预的一个很有可能的点。然而，目前，没有解决心脏病的此方面的已知治疗。

以鉴定可容许对受损伤的心脏恢复功能的治疗性靶物为目的，已经广泛研究了与MI后重塑有关的基因表达和信号传导途径的变化。目前，已经描述了微小RNA在心脏肥大和心力衰竭中的关键作用，指向调节心脏病的一种新模式。微小RNA(miRNA)是长度为约18至约25个核苷酸的小的、非蛋白质编码RNA，其源自单独的miRNA基因、蛋白质编码基因的内含子、或经常编码多种紧密相关的miRNA的多顺反子转录物。参见Carrington等的综述(Science，第301卷(5631)：336-338，2003)。miRNA通过促进靶mRNA的降解(在它们的序列完全互补时)，或者通过抑制翻译(在它们的序列含有错配时)来充当其阻抑物。

miRNA通过RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III；参见Qi等(2006)Cellular&Molecular Immunology，第3卷：411-419)转录，并且产生自一般长几千个碱基的初始转录物，其称作初级miRNA转录物(pri-miRNA)。pri-miRNA在细胞核中被RNA酶Drosha加工成约70至约100个核苷酸的发夹形前体(pre-miRNA)。转运到胞质后，发夹pre-miRNA被Dicer进一步加工以生成双链miRNA。然后，成熟的miRNA链掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，在那里它通过碱基对互补性与其靶mRNA结合。在miRNA碱基与mRNA靶物完全配对的相对罕见的情况中，它促进mRNA降解。更通常地，miRNA与靶mRNA形成不完美的异双链体，影响mRNA稳定性或者抑制mRNA翻译。

基于小鼠和人中的一大批遗传研究，变得越来越清楚的是，miRNA实际上积极参与心脏重塑、生长、传导、和收缩性(综述见van Rooij和Olson(2007)Journal of Clinical Investigation，第117卷(9)：2369-2376)。牵涉心血管疾病的miRNA的鉴定和表征对于开发用于治疗心血管疾病，诸如心肌梗死和心力衰竭的新治疗方法是重要的。

发明概述

本发明部分基于数种miRNA的发现，所述miRNA在人的心肌梗死和心力衰竭后在心脏组织中受到调节。调控这些鉴定出的miRNA呈现一种用于治疗或预防心肌梗死、心脏重塑、和心力衰竭的新治疗方法。因而，本发明提供了一种在有此需要的受试者中治疗或预防心肌梗死、心脏重塑、或心力衰竭的方法，包括调控一种或多种鉴定的miRNA在受试者的心脏细胞中的表达或活性。在一个实施方案中，所述一种或多种miRNA选自下组：let-7家族成员、miR-15b、miR-21、miR-199a、miR-199b、miR-214、miR-10a、miR-10b、miR-16、miR-146a、miR-146b、miR-221、miR-222、miR-497、miR-20a、miR-20b、miR-93、miR-101、miR-126、miR-30家族成员、miR-143、miR-145、miR-150、miR-29a-c、miR-34a、miR-34c、miR-574、miR-451、miR-499、miR-100、miR-378、miR-24、miR-379、miR-762、miR-335、miR-711、miR-149、miR-218、miR-181a-d、miR-22、和miR-185。

在一个实施方案中，所述方法包括对受试者施用一种或多种鉴定的miRNA的抑制剂。例如，抑制剂可以是选自下组的miRNA的表达或活性的抑制剂：let-7家族成员、miR-15b、miR-21、miR-199a、miR-199b、miR-214、miR-10a、miR-10b、miR-16、miR-146a、miR-146b、miR-221、miR-222、miR-30家族成员、和miR-497。一种或多种miRNA的抑制剂可以包括微小RNA拮抗剂(antagomir)、反义寡核苷酸、或抑制性RNA分子。

在另一个实施方案中，所述方法包括对受试者施用一种或多种鉴定的miRNA的激动剂。在一些实施方案中，激动剂提高选自下组的miRNA的表达或活性：miR-20a、miR-20b、miR-93、miR-101、miR-126、miR-143、miR-145、miR-150、miR-29a、miR-29b、和miR-29c。在某些实施方案中，一种或多种miRNA的激动剂是包含一种或多种miRNA的成熟序列的多核苷酸。激动剂可以在体内自表达构建体表达。

在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括对所述受试者施用第二心脏肥大疗法，诸如β阻断剂、肌力药(ionotrope)、利尿药、ACE-I、AII拮抗剂、BNP、-Ca⁺⁺阻断剂、内皮缩血管肽受体拮抗剂、或HDAC抑制剂。可以与所述miRNA调控剂(例如，抑制剂或激动剂)同时或者在所述miRNA调控剂之前或之后施用第二疗法。

附图简述

附图形成本说明书的一部分，并且包括在内以进一步表明本发明的某些方面。可以通过与本文中所呈现的具体实施方案的详细描述结合参考这些附图中的一幅或多幅来更好地理解本发明。

图1：响应MI的miRNA概况分析。A：对心脏切片的Masson三色染色(Masson Trichrome staining)指示MI后3天的瘢痕形成，伴有肌细胞肥大、进行中的肌细胞损失和胶原沉积。梗死后14天，存在着变薄的伸展开的梗死，其导致非梗死区域中的间质性纤维化和心脏肥大。(I，梗死；BZ，边界区；R，远处的心肌)。B：微阵列分析指示miRNA响应MI而非常受到动力学调节。即使在初始梗死愈合后，即MI后14天，11种miR在边界区中受到重叠地上调，而15种miR受到下调。C：在MI后3天和14天，边界区区域中的上调的miR(左侧小图)和下调的miR(右侧小图)的柱状图。D：实时PCR分析确认与假操作的动物(n＝3-4)相比响应MI的miRNA的调节。E：与未衰竭的心脏(n＝5-6)相比响应MI的人心脏样品中的指定miRNA的实时PCR分析。F：3个未衰竭的人心脏和5个MI后的人心脏中的miR-21的Northern印迹分析。

图2：miR-29在MI后的梗死区域中受到下调。A：miR-29家族成员的序列比对指示保守的种子区(5’端的bp 2-8)和miRNA3’端中的高水平序列保守。B：对多种组织的Northern印迹分析指示所有三种miR-29成员在表达方面的较大重叠，其中在肺和肾中的表达水平较高。在miR-29成员中，miR-29b表现为在心脏中最高度表达。C：对miR-29的实时PCR分析指示与无血清培养基(SF)中保持的或用去氧肾上腺素(PE)刺激的心肌细胞相比要在成纤维细胞中高度表达的此miR。D：对MI后3天的心脏组织的Northern印迹分析显示与假操作的动物相比响应MI的miR-29的一致下调。miR-29的下调在边界区中比在远处的心肌中更明显。E：实时PCR分析指示要响应MI而受调节的所有miR-29成员。虽然下调在MI后3天的梗死边界区(BZ)中最明显，但是此下调在梗死后14天在已经发生初始梗死愈合时仍存在。

图3：miR-29调节胞外基质蛋白的表达。A：关键的纤维化基因的3’UTR区中潜在的miR-29结合位点。B：对MI后3天的边界区和远处的心肌两者中的预测的靶基因的实时PCR分析。miR-29表达降低与胶原(COL1A1、COL1A2和COL3A1)和肌原纤蛋白(FBN1)的表达升高相关联。没有观察到弹性蛋白(ELN1)的显著变化。C：对用增加量的miR-29b-1/miR-29a簇转染的COS细胞的Northern印迹分析显示miR-29的有效的过表达。D：使用预测的靶基因的内源UTR序列的萤光素酶实验。miR-29b-1/miR-29a的表达阻抑萤光素酶的表达，而阻抑在表达无关的miR，即miR-206时是缺乏的。

图4：miR-29表达响应TGFβ。A：实时PCR分析指示所有三种miR-29家族成员在成纤维细胞中响应TGFβ而下调。B：Northern分析，其显示了miR-29表达在miR-208突变体动物中受到上调，这与BNP表达升高刚好一致，如通过实时PCR所测定的。

图5：miR-29抑制在体内诱导纤维化。A：anti-miR-29和错配(mm)miR-29寡核苷酸的化学结构。B：Northern印迹分析，其显示了响应静脉内注射80mg/kg anti-miR-29或mm miR-29中任一或相当体积的盐水的3天后的组织特异性敲低。C：对肝提取物的实时PCR分析指示响应miR-29敲低的胶原表达的明显升高。此效应在盐水或mm miR-29注射后是缺乏的。D：对在连续两天静脉内注射80mg/kg anti-miR-29或mm miR-29寡核苷酸中任一或相当体积的盐水后3周收集的组织的Northern印迹分析。anti-miR-29的注射在心脏、肝和肾中产生对miR-29的严格敲低(severe knockdown)，而肺中的miR-29水平表现得不受影响。E：对心脏提取物的实时PCR分析指示响应miR-29敲低的心脏胶原表达的升高。F：实时PCR分析，其指示在miR-29b模拟物处理后2天在成纤维细胞中的miR-29b表达升高，而miR-29a水平未改变，并且miR-29c水平仅略微升高。G：成纤维细胞中的miR-29b过表达阻抑胶原基因的表达，如通过实时PCR分析所测定的。

发明详述

本发明部分基于在心肌梗死后受到调节的miRNA子集的鉴定。具体地，发明人发现了在梗死区的边界区中显著受到调节的40种miRNA和在心肌梗死(MI)诱导后3天在远处的心肌中受到调节的22种miRNA。此外，69种miRNA的表达在MI诱导后2周在梗死区的边界区中是改变的，而40种miRNA在远处的心肌中受到调节。另外，发明人发现了在来自衰竭的人心脏的心脏组织中受到调节的不同的、但是重叠的miRNA子集。发现在来自人心力衰竭患者的心脏组织中31种miRNA受到显著上调，而45种miRNA受到显著下调。受调节的miRNA的重叠提示这些miRNA可能牵涉不同心脏病过程，而且积极地影响疾病状态。因而，本发明提供了一种在有此需要的受试者中治疗或预防心肌梗死、心脏重塑、或心力衰竭的方法，包括调控表3-6中所列的一种或多种miRNA在该受试者的心脏细胞中的表达或活性。在某些实施方案中，所述一种或多种miRNA选自下组：let-7家族成员(例如let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、和let-7i)(SEQ ID NO：1-8)、miR-15b(SEQ ID NO：9)、miR-21(SEQ ID NO：10)、miR-199a(SEQ ID NO：11)、miR-199b(SEQ IDNO：12-13)、miR-214(SEQ ID NO：14)、miR-10a(SEQ ID NO：15)、miR-10b(SEQ ID NO：16)、miR-16(SEQ ID NO：17)、miR-146a(SEQ ID NO：18)、miR-146b(SEQ ID NOs：19-20)、miR-221(SEQ ID NO：21)、miR-222(SEQ IDNO：22)、miR-497(SEQ ID NO：23)、miR-20a(SEQ ID NO：24)、miR-20b(SEQID NO：25)、miR-93(SEQ ID NO：26)、miR-101(SEQ ID NO：27)、miR-126(SEQ ID NO：28)、miR-30家族成员(例如miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d、和miR-30e)(SEQ ID NO：29-33)、miR-143(SEQ ID NO：34)、miR-145(SEQ ID NO：35)、miR-150(SEQ ID NO：36)、miR-29a-c(SEQ IDNOs：37-39)、miR-34a(SEQ ID NO：40)、miR-34c(SEQ ID NOs：41-42)、miR-574(SEQ ID NO：43-44)、miR-451(SEQ ID NO：45)、miR-499(SEQ IDNO：46)、miR-100(SEQ ID NO：47)、miR-378(SEQ ID NO：48)、miR-24(SEQID NO：49)、miR-379(SEQ ID NO：50)、miR-762(SEQ ID NO：51)、miR-335(SEQ ID NO：52)、miR-711(SEQ ID NO：53)、miR-149(SEQ ID NO：54)、miR-218(SEQ ID NO：55)、miR-181a-d(SEQ ID NO：56-59)、miR-22(SEQ IDNO：60)、和miR-185(SEQ ID NO：61)。

如本文中所使用的，术语“受试者”或“患者”指任何脊椎动物，包括但不限于人和其它灵长类(例如，黑猩猩和其它猿和猴物种)、家畜(例如，牛、绵羊、猪、山羊和马)、家养哺乳动物(例如，犬类和猫类)、实验室动物(例如，啮齿类诸如小鼠、大鼠和豚鼠)、和禽类(例如，家养的、野生的和猎禽诸如鸡、火鸡及其它家禽、鸭、鹅等)。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在其它实施方案中，受试者是人。在要治疗的受试者是人的此类实施方案中，要调控的一种或多种miRNA是人miRNA序列。

如本文中所使用的，术语“调控”指miRNA的生物学活性的变化或变更。调控可以是miRNA表达水平的变化、miRNA的结合特征(例如对靶mRNA或对RISC复合物的组分)的变化、或与miRNA有关的生物学或功能性特征的任何其它变化。调控可以是miRNA的表达或功能的升高或降低。术语“调控”指能够改变或变更如上文所描述的miRNA的表达或生物学活性的任何分子或化合物。

在一个实施方案中，所述方法包括对受试者施用表3-6中所列的一种或多种miRNA(或对应的人miRNA)的抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂靶向pre-miRNA或pri-miRNA序列。在其它实施方案中，所述抑制剂靶向成熟的miRNA序列。在另一个实施方案中，所述抑制剂是一种或多种选自下组的成熟miRNA序列的表达或活性的抑制剂：let-7家族成员(例如let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、和let-7i)(SEQ ID NO：1-8)、miR-15b(SEQID NO：9)、miR-21(SEQ ID NO：10)、miR-199a(SEQ ID NO：11)、miR-199b(SEQ ID NO：12-13)、miR-214(SEQ ID NO：14)、miR-10a(SEQ ID NO：15)、miR-10b(SEQ ID NO：16)、miR-16(SEQ ID NO：17)、miR-146a(SEQ ID NO：18)、miR-146b(SEQ ID NOs：19-20)、miR-221(SEQ ID NO：21)、miR-222(SEQ ID NO：22)、miR-497(SEQ ID NO：23)、和miR-30家族成员(例如miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d、和miR-30e)(SEQ ID NO：29-33)。

在某些实施方案中，一种或多种miRNA的抑制剂是反义寡核苷酸。反义寡核苷酸可以包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其组合。优选地，反义寡核苷酸具有至少一处化学修饰(例如，糖或主链修饰)。例如，合适的反义寡核苷酸可以由一个或多个“构象约束性”或二环糖核苷修饰(BSN)”构成，所述修饰对含有BSN的寡核苷酸与其互补微小RNA靶标链间形成的复合物赋予增强的热稳定性。例如，在一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个“锁定核酸(locked nucleic acid)”。锁定核酸(LNA)含有2’-O，4’-C-亚甲基核糖核苷(结构A)，其中核糖糖模块为“锁定”构象。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个2’，4’-C-桥接的2’脱氧核糖核苷(CDNA，结构B)。参见例如美国专利No.6,403,566和Wang等(1999)Bioorganic and MedicinalChemistry Letters，第9卷：1147-1150，通过提及而将这两篇都完整收入本文。在又一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个经修饰的核苷，其具有结构C中所显示的结构。靶向一种或多种miRNA的反义寡核苷酸可以含有BSN(LNA、CDNA等)或其它经修饰的核苷酸和核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的组合。

或者，反义寡核苷酸可以包含肽核酸(PNA)，其含有基于肽的主链，而非糖-磷酸酯主链。还涵盖对反义寡核苷酸的其它经修饰的糖或磷酸二酯修饰。例如，反义寡核苷酸可含有的其它化学修饰包括但不限于糖修饰，诸如2’-O-烃基(例如2’-O-甲基、2’-O-甲氧乙基)、2’-氟、和4’-硫修饰，及主链修饰，诸如一个或多个硫代磷酸酯、吗啉代、或膦羧酸酯(phosphonocarboxylate)连接(参见例如美国专利No.6,693,187和7,067,641，通过提及而完整收入本文)。在一个实施方案中，靶向一种或多种miRNA的反义寡核苷酸含有对每个碱基的2’O-甲基糖修饰，并且通过硫代磷酸酯联接来连接。反义寡核苷酸，特别是那些具有较短长度(例如小于15个核苷酸)的反义寡核苷酸可以包含一处或多处亲和力增强性修饰，诸如但不限于LNA、二环核苷、膦酰基甲酸酯、2’O烃基修饰等。在一些实施方案中，合适的反义寡核苷酸是2’-O-甲氧乙基“缺口聚物”(gapmer)，其在5’和3’端都含有2’-O-甲氧乙基修饰的核糖核苷酸，且中央有至少十个脱氧核糖核苷酸。这些“缺口聚物”能够触发RNA酶H依赖性的对RNA靶物的降解机制。增强稳定性和提高功效的对反义寡核苷酸的其它修饰(诸如美国专利No.6,838,283中记载的那些，通过提及而完整收入本文)是本领域已知的，而且适合于在本发明的方法中使用。例如，为了便于体内投递和稳定性，可以将反义寡核苷酸在其3’端与类固醇诸如胆固醇模块、维生素、脂肪酸、碳水化合物或糖苷、肽或其他小分子配体连接。

可用于抑制miRNA活性的优选的反义寡核苷酸长约5至约25个核苷酸，长约10至约30个核苷酸、或长约20至约25个核苷酸。在某些实施方案中，靶向本文中所描述的一种或多种miRNA的反义寡核苷酸长约8至约18个核苷酸，且在其它实施方案中，长约12至16个核苷酸。可以使用与靶miRNA互补的任何8聚体或更长，即与miRNA的5’端互补并向前推进经过所述靶miRNA的完整互补序列的任何antimiR。反义寡核苷酸可以包含至少部分与来自一种或多种miRNA的成熟miRNA序列互补的序列。“部分互补”指与靶miRNA序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％互补的序列。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸可以与成熟miRNA序列实质性(substantially)互补，也就是与靶miRNA序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、或99％互补。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸包含与成熟miRNA序列100％互补的序列。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸是微小RNA拮抗剂。“微小RNA拮抗剂”指单链的、经化学修饰的、至少部分与至少一种成熟miRNA序列互补的核糖核苷酸。微小RNA拮抗剂可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，诸如2’-O-甲基-糖修饰。在一些实施方案中，微小RNA拮抗剂仅包含经修饰的核苷酸。微小RNA拮抗剂也可包含一个或多个硫代磷酸酯连接，导致部分或完全是硫代磷酸酯的主链。为了便于体内投递和稳定性，可以将微小RNA拮抗剂在其3’端与胆固醇或其它模块连接。适合于抑制一种或多种miRNA家族成员的微小RNA拮抗剂可以长约15个至约50个核苷酸，更优选长约18个至约30个核苷酸，且最优选长约20个至约25个核苷酸。微小RNA拮抗剂可以与成熟miRNA序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％互补。在一些实施方案中，微小RNA拮抗剂可以与成熟miRNA序列实质性互补，也就是与靶多核苷酸序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、或99％互补。在其它实施方案中，微小RNA拮抗剂与成熟miRNA序列100％互补。

在另一个实施方案中，所述方法包括对受试者施用表3-6中所列的一种或多种miRNA(或相应的人miRNA)的激动剂。在某些实施方案中，激动剂是选自下组的一种或多种miRNA的激动剂：miR-20a(SEQ ID NO：24)、miR-20b(SEQ ID NO：25)、miR-93(SEQ ID NO：26)、miR-101(SEQ ID NO：27)、miR-126(SEQ ID NO：28)、miR-143(SEQ ID NO：34)、miR-145(SEQ ID NO：35)、miR-150(SEQ ID NO：36)、miR-29a(SEQ ID NO：37)、miR-29b(SEQ IDNO：38)、和miR-29c(SEQ ID NO：39)。

如本文中所使用的，“激动剂”是增强靶miRNA的表达或活性的分子或化合物。激动剂可以是编码miRNA序列的多核苷酸。例如，在一个实施方案中，一种或多种miRNA的激动剂是包含一种或多种miRNA的成熟序列的多核苷酸。在另一个实施方案中，一种或多种miRNA的激动剂可以是包含一种或多种miRNA的pri-miRNA或pre-miRNA序列的多核苷酸。包含成熟的pre-miRNA或pri-miRNA序列的多核苷酸可以是单链或双链。多核苷酸可以含有一处或多处化学修饰，诸如锁定核酸、肽核酸、糖修饰，诸如2’-O-烃基(例如2’-O-甲基、2’-O-甲氧乙基)、2’-氟、和4’-硫修饰，及主链修饰，诸如一个或多个硫代磷酸酯、吗啉代、或膦羧酸酯连接。在一些实施方案中，包含一种或多种miRNA序列的多核苷酸与类固醇诸如胆固醇、维生素、脂肪酸、碳水化合物或糖苷、肽或另一种小分子配体缀合。在某些实施方案中，一种或多种miRNA的激动剂是与miRNA自身不同的药剂，其发挥提高、补充、或替换一种或多种miRNA的功能的作用。

可以自载体体内表达本发明的miRNA的抑制剂和激动剂。“载体”指可用于将感兴趣核酸投递至细胞内部的物质组合物。本领域已知众多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子的或两亲性的化合物结合的多核苷酸、质粒、和病毒。如此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。病毒载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、等等。表达构建体能在活细胞中复制，或者它能合成制备。为了本申请，术语“表达构建体”、“表达载体”、和“载体”可互换使用，以概括性的、例示性的意义演示本发明的应用，而且并非意图限制本发明。

在一个实施方案中，用于表达一种或多种miRNA的激动剂的表达载体包含与编码一种或多种miRNA的序列的多核苷酸“可操作连接”的启动子。如本文中所使用的，短语“可操作连接”或“在转录控制下”意味着启动子相对于多核苷酸处于正确的定位和取向以控制启动RNA聚合酶进行的转录和多核苷酸的表达。编码一种或多种miRNA的多核苷酸可以编码本文中所描述的一种或多种miRNA的初级微小RNA序列(primary microRNA sequence)、前体-微小RNA序列、成熟的miRNA序列、或星(例如次要)序列。包含一种或多种miRNA的序列的多核苷酸可以长约18至约2000个核苷酸、长约70至约200个核苷酸、长约20至约50个核苷酸、或长约18至约25个核苷酸。

可以在体内自载体表达一种或多种miRNA的抑制剂(例如，反义寡核苷酸和微小RNA拮抗剂)。例如，在一个实施方案中，用于表达一种或多种miRNA的抑制剂的表达载体包含与编码反义寡核苷酸的多核苷酸可操作连接的启动子，其中表达的反义寡核苷酸的序列与一种或多种miRNA的成熟序列至少部分互补。

在某些实施方案中，编码感兴趣的多核苷酸的核酸在启动子的转录控制下。“启动子”指启动基因的特定转录需要的由细胞的合成机构或引入的合成机构识别的DNA序列。术语启动子在本文会用于指一组在RNA聚合酶I、II、或III的启动位点周围簇集的转录控制模块。

在一些实施方案中，可以使用人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复、大鼠胰岛素启动子、和甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子来获得感兴趣的多核苷酸序列的高水平表达。还涵盖使用本领域众所周知的其它病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子来实现感兴趣多核苷酸序列的表达，只要表达水平对于给定目的是足够的。

通过采用具有公知特性的启动子，可以优化转染或转化后感兴趣的多核苷酸的表达水平和样式。此外，响应特定生理信号而受到调节的启动子的选择可以容许多核苷酸的诱导型表达。表1和2列出了可以在本发明的背景中用于调节感兴趣的多核苷酸表达的数种调节元件(例如本发明的miRNA的激动剂或抑制剂)。此表并不意图穷举所有可能的牵涉促进基因表达的元件，而是仅为其例示性的。

下文是可以在表达构建体中与感兴趣多核苷酸组合使用的病毒启动子、细胞启动子/增强子和诱导型启动子/增强子的列表(表1和表2)。另外，也可以使用任何启动子/增强子组合(按照真核启动子数据库EPDB)来驱动多核苷酸的表达。若提供合适的细菌聚合酶作为投递复合物的一部分或者作为额外的遗传表达构建体，则真核细胞可以支持自某些细菌启动子的胞质转录。

特别感兴趣的是肌肉特异性启动子，且更特别地心脏特异性启动子。这些包括肌球蛋白轻链-2启动子(Franz等，1994；Kelly等，1995)、α肌动蛋白启动子(Moss等，1996)、肌钙蛋白1启动子(Bhavsar等，1996)；Na⁺/Ca²⁺交换器启动子(Barnes等，1997)、抗肌萎缩蛋白启动子(Kimura等，1997)、α7整联蛋白启动子(Ziober和Kramer，1996)、脑利尿钠肽启动子(LaPointe等，1996)和αB-晶体蛋白/小热休克蛋白启动子(Gopal-Srivastava，1995)、α肌球蛋白重链启动子(Yamauchi-Takihara等，1989)和ANF启动子(LaPointe等，1988)。

可以包括多腺苷酸化信号以在期望的情况中实现基因转录物的正确多腺苷酸化。认为多腺苷酸化信号的性质对于本发明的成功实施不是至关重要的，并且可以采用任何此类序列，诸如人生长激素和SV40多腺苷酸化信号。表达盒的元件还涵盖终止子。这些元件可用于增强信息水平及将自所述盒通读至其它序列的情况降至最低。

在本发明的某些实施方案中，可以通过在表达构建体中包含标志物在体外或在体内鉴定含有本发明的核酸构建体的细胞。此类标志物会对细胞赋予可鉴定的变化，容许容易地鉴定含有表达构建体的细胞。通常，包含药物选择标志有助于克隆和转化体的选择，例如，赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、Zeocin和组氨醇的抗性的基因是有用的选择标志物。或者，可以采用酶诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰基转移酶(CAT)。也可以采用免疫标志物。认为所采用的选择标志物不是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达或者作为编码基因产物的核酸的指示物表达。选择标志物的别的例子是本领域技术人员公知的。

存在着可以将表达载体导入细胞中的多种方式。在本发明的某些实施方案中，表达构建体包含源自病毒基因组的病毒或经工程化改造的构建体。某些病毒经由受体介导的胞吞进入细胞、整合入宿主细胞基因组中、及稳定且有效地表达病毒基因的能力已经使它们成为用于将外来基因转移到哺乳动物细胞中的有吸引力的候选物(Ridgeway，1988；Nicolas和Rubenstein，1988；Baichwal和Sugden，1986；Temin，1986)。

用于体内投递的优选方法之一牵涉使用腺病毒表达载体。“腺病毒表达载体”意图包括含有足以(a)支持构建体的包装并(b)表达已经在其中克隆的反义多核苷酸的腺病毒序列的那些构建体。表达载体包含经遗传工程化改造形式的腺病毒。腺病毒，即36kB线性双链DNA病毒的遗传构造的知识容许用多至7kB的外来序列替换大段腺病毒DNA(Grunhaus和Horwitz，1992)。与逆转录病毒相反，腺病毒对宿主细胞的感染不导致染色体整合，因为腺病毒DNA可以在无潜在基因毒性的情况中以附加体方式复制。此外，腺病毒是结构稳定的，而且尚未在广泛的扩增后检出基因组重排。腺病毒能感染事实上所有上皮细胞，不管它们的细胞周期阶段。

腺病毒由于其中等大小的基因组、容易操作、高效价、靶细胞范围宽和高感染性而特别适合于作为基因转移载体使用。病毒基因组的两端均含有100-200个碱基对反向重复(ITR)，其是对于病毒DNA复制和包装必需的顺式元件。

除了腺病毒载体为复制缺陷或至少为条件性缺陷的要求外，认为腺病毒载体的性质对于本发明的成功实施不是至关重要的。腺病毒可以是42种不同的已知血清型或A-F亚群之任一的。为了获得本发明中使用的条件性复制缺陷型腺病毒载体，腺病毒C亚群5型是优选的起始材料。这是因为5型腺病毒是已知关于它的大量生物化学和遗传信息的人腺病毒，而且其在历史上已经用于采用腺病毒作为载体的大多数构建。

依照本发明的典型载体是复制缺陷的，并且不会具有腺病毒E1区。如此，在已经除去E1编码序列的位置处引入编码感兴趣的基因的多核苷酸会是最方便的。然而，腺病毒序列内的构建体插入位置对于本发明不是至关重要的。也可以将编码感兴趣基因的多核苷酸插入E3置换型载体中替代已删除的E3区，如Karlsson等(1986)所记载的，或者插入E4区，其中辅助细胞系或辅助病毒补足了E4缺陷。

已经在真核基因表达(Levrero等，1991；Gomez-Foix等，1992)和疫苗开发(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1991)中使用了腺病毒载体。最近，动物研究提示了可以使用重组腺病毒进行基因疗法(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991；Stratford-Perricaudet等，1990；Rich等，1993)。对不同组织施用重组腺病毒中的研究包括气管滴注(Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1992)、肌肉注射(Ragot等，1993)、周围静脉内注射(Herz和Gerard，1993)和立体定向(stereotactic)接种入脑中(Le Gal La Salle等，1993)。

可以采用其它病毒载体作为本发明中的表达构建体。可以采用源自病毒的载体，诸如逆转录病毒、痘苗病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、腺伴随病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Hermonat和Muzycska，1984)和疱疹病毒。它们为各种哺乳动物细胞提供数项有吸引力的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。

为了实现有义或反义基因构建体的表达，必须将表达构建体投递入细胞中。此投递可以在体外(如在用于转化细胞系的实验室规程中)或者在体内或离体(如在治疗某些疾病状态中)实现。一种投递机制是经由病毒感染，其中将表达构建体封装在感染性病毒颗粒中。

本发明还涵盖数种用于将表达构建体转移入培养的哺乳动物细胞中的非病毒方法。这些包括磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)、DEAE-葡聚糖(Gopal，1985)、电穿孔(Tur-Kaspa等，1986；Potter等，1984)、直接显微注射(Harland和Weintraub，1985)、加载有DNA的脂质体(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979)及Lipofectamine-DNA复合物、细胞超声处理(Fechheimer等，1987)、使用高速微粒的基因轰击(Yang等，1990)、和受体介导的转染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)。这些技术中有些可以成功地适应体内或离体用途。

一旦已经将表达构建体投递入细胞中，可以在不同位点处定位并表达编码感兴趣的基因的核酸。在某些实施方案中，可以将编码基因的核酸稳定整合入细胞的基因组中。此整合可以借由同源重组(基因置换)处于同类(cognate)位置和取向，或者它可以是在随机的、非特异性位置的整合(基因加强(geneaugmentation))。在又一些实施方案中，可以以分开的、附加体的DNA区段形式在细胞中稳定地维持核酸。此类核酸区段或“附加体”编码足以容许不依赖于宿主细胞周期或者与宿主细胞周期同步地维持和复制的序列。如何将表达构建体投递到细胞及核酸在细胞中保留于何处取决于所采用的表达构建体的类型。

在本发明的又一个实施方案中，表达构建体可以仅由裸重组DNA或质粒组成。可以通过以物理或化学方式使细胞膜透化的上文所提及的任何方法来实施构建体的转移。这特别可适用于体外转移，但是它也可以用于体内使用。Dubensky等(1984)将磷酸钙沉淀物形式的多瘤病毒DNA成功注射入成年和新生小鼠的肝或脾中，表明积极的病毒复制和急性感染。Benvenisty和Neshif(1986)也表明磷酸钙沉淀的质粒的直接腹膜内注射导致经转染基因的表达。涵盖的是，编码感兴趣的多核苷酸的DNA也可以以相似的方式在体内转移，并表达基因产物。

在本发明的又一个实施方案中，用于将裸DNA表达构建体转移入细胞中可以牵涉颗粒轰击。此方法取决于将经DNA包被的微粒加速到高速度，容许它们穿透细胞膜并进入细胞但不杀死它们的能力(Klein等，1987)。已经开发出用于加速小颗粒的数种装置。一种此类装置依赖于高压放电来产生电流，其继而提供了动力(Yang等，1990)。所使用的微粒由生物学惰性物质组成，诸如钨或金珠。

已经在体内轰击选定的器官，包括大鼠和小鼠的肝、皮肤、和肌肉组织(Yang等，1990；Zelenin等，1991)。这可能需要手术暴露组织或细胞以消除任何介于枪与靶器官间的任何组织，即离体处理。此外，可以藉由此方法投递编码感兴趣的特定多核苷酸的DNA，并且仍然收入本发明。

在本发明的又一个实施方案中，可以将表达构建体包埋在脂质体中。脂质体是以磷脂双层膜和内部水性介质为特征的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。当磷脂在过量水溶液中悬浮时，它们自发形成。脂质组分经历自身重排，之后形成封闭结构并且在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat，1991)。还涵盖的是Lipofectamine-DNA复合物。

在本发明的某些实施方案中，可以将脂质体与血凝病毒(HVJ)复合。这已经显示了便于与细胞膜的融合，而且促进脂质体封装的DNA进入细胞(Kaneda等，1989)。在其它实施方案中，可以联合核非组蛋白染色体蛋白(HMG-I)来复合或采用脂质体(Kato等，1991)。在又一些实施方案中，可以联合HVJ和HMG-I二者来复合或采用脂质体。既然此类表达构建体已经成功地用于在体外和在体内转移和表达核酸，那么它们适用于本发明。在DNA构建体中采用细菌启动子的情况中，还会期望在脂质体内包含合适的细菌聚合酶。

可以用于将编码特定基因的核酸投递入细胞中的其它表达构建体是受体介导的投递媒介物。这些利用在几乎所有真核细胞中的通过受体介导的胞吞来选择性摄取大分子。由于各种受体的细胞类型特异性分布，投递可以是高度特异性的(Wu和Wu，1993)。

受体介导的基因靶向媒介物一般由两种组分组成：细胞受体特异性配体和DNA结合剂。已经使用数种配体进行受体介导的基因转移。最广泛表征的配体是无唾液血清类粘蛋白(asialoorosomucoid，ASOR)(Wu和Wu，1987)和运铁蛋白(Wagner等，1990)。最近，已经使用合成的拟糖蛋白(其与ASOR识别相同受体)作为基因投递媒介物(Ferkol等，1993；Perales等，1994)，而且还已经使用表皮生长因子(EGF)来将基因投递到鳞状细胞癌(squamous carcinoma)细胞(Myers，EPO 0273085)。

在一个具体的例子中，可以与阳离子脂质或中性脂质，或在一起产生中性电荷的阳离子和阴离子脂质的组合联合施用多核苷酸(参见例如WO05007196和WO05026372，通过提及而将其完整收入本文)。阳离子脂质的例子包括但不限于Lipofectin、DOTMA、DOPE、和DOTAP。WO0071096公开文本(通过提及而将其明确收录)描述了可以有效用于基因疗法的不同配制剂，诸如DOTAP：胆固醇或胆固醇衍生物配制剂。其它公开内容还讨论了不同脂质或脂质体配制剂(包括纳米微粒(nanoparticle))及施用方法；这些包括但不限于美国专利公开文本20030203865，20020150626，20030032615，及20040048787，通过提及而以它们披露配制剂及施用和投递核酸的其它相关方面的程度将它们明确收录。用于形成颗粒的方法也披露于美国专利5,844,107，5,877,302，6,008,336，6,077,835，5,972,901，6,200,801，及5,972,900，通过提及而将它们收录用于那些方面。

在某些实施方案中，可以在离体条件下更容易地实施基因转移。离体基因疗法指自动物分离细胞，在体外将核酸投递入细胞中，然后将经修饰的细胞返回入动物中。这可以牵涉自动物以手术取出组织/器官或者细胞和组织的原代培养。

优选地，施用表3-6中所列的一种或多种miRNA(或相应的人miRNA)的抑制剂或激动剂导致心肌梗死、心力衰竭、或心脏重塑的一种或多种症状的改善。一种或多种改善的症状可以例如是增加的运动能力、增加的心脏射血体积、降低的左心室舒张末期压、降低的肺毛细血管楔压、增加的心输出量、增加的心指数(cardiac index)、降低的肺动脉压、降低的左心室收缩和舒张末期内径、降低的左和右心室壁压、降低的壁张力、改善的生命质量、和疾病相关发病率或死亡率降低。在一个实施方案中，在患有心肌梗死的受试者的心脏细胞中调控一种或多种miRNA可以通过降低心脏细胞的损失(例如降低梗死区中的凋亡)来缩小梗死大小。在另一个实施方案中，在患有心肌梗死的受试者的心脏细胞中调控一种或多种miRNA可以降低梗死区中的纤维化。在又一个实施方案中，在患有心肌梗死的受试者的心脏细胞中调控一种或多种miRNA后，在该受试者中稳定心脏功能。

本发明涵盖鉴定的miRNA的激动剂和抑制剂在治疗和预防受试者中的梗死周围的心脏组织的MI后重塑及随后的心力衰竭形成中的用途。治疗方案会随临床情况而存在变化，其中寻求最早的干预。然而，MI后的至少某个时段的长期维持在大多数情况中似乎会是合适的。还可以期望间歇地用miRNA的调控剂治疗，或者改变给予的miRNA，以使保护效应最大化。

在另一个实施方案中，涵盖的是与其它治疗形态组合使用miRNA功能或表达的调控剂。如此，在上文所描述的miRNA疗法外，还可以对受试者提供更多“标准的”药物心脏疗法。其它疗法的例子包括但不限于所谓的“β-阻断剂”、抗高血压药、强心剂、抗血栓药、血管扩张药、激素拮抗剂、肌力药(iontrope)、利尿药、内皮缩血管肽受体拮抗剂、钙通道阻断剂、磷酸二酯酶抑制剂、ACE抑制剂、血管紧张肽2型拮抗剂和细胞因子阻断剂/抑制剂、和HDAC抑制剂。

可以通过使心脏细胞与包含一种或多种miRNA调控剂和第二心脏疗法的单一组合物或药物配制剂接触，或者通过同时使细胞与两种不同的组合物或配制剂(其中一种组合物包含一种或多种miRNA调控剂，而另一种包含第二心脏疗法)接触来实现组合。或者，一种或多种miRNA调控剂的施用可以以范围为几分钟至几周的时间间隔在其他心脏药剂的施用之前或之后。在分开对受试者应用另外的心脏药剂和一种或多种miRNA调控剂的实施方案中，一般会确保在每次投递的时间之间没有过去一大段时间，使得心脏药剂和一种或多种miRNA调控剂仍会能够对细胞施加有利地组合效应。在此类情况中，涵盖的是，通常会在彼此的约12-24小时内，且更优选地在彼此的约6-12小时内施用两种组合物，其中仅约12小时的延迟时间是最优选的。然而，在一些情况中，可以期望显著延长治疗的时段，其中各次施用之间经过几天(2、3、4、5、6或7)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8)。

一种或多种miRNA的调控剂或另外的心脏药剂的超过一次施用会是期望的。在这点上，可以采用各种组合。举例而言，在miRNA调控剂是“A”，而另外的心脏药剂是“B”的情况中，基于总共3和4次施用的下列排列是例示性的：

A/B/A    B/A/B    B/B/A    A/A/B    B/A/A    A/B/B    B/B/B/A  B/B/A/B

A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A  B/A/B/A  B/A/A/B  B/B/B/A

A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A  A/B/B/B  B/A/B/B  B/B/A/B

同样涵盖其它组合。

药理学治疗剂和施用方法、剂量等是本领域技术人员公知的(参见例如“Physicians Desk Reference”、Klaassen的“The Pharmacological Basis ofTherapeutics”、“Remington’s Pharmaceutical Sciences”、和“The Merck Index，第11版”，通过提及将它们以相关部分收入本文)，并且根据本文中的公开内容，可以与本发明组合。根据所治疗受试者的状况，必须要出现剂量的一些变型。负责施用的人会在任何事件中确定适合于个别受试者的剂量，并且此类个别确定在本领域普通技术人员的技术范围内。

可以与本发明的miRNA调控剂组合使用的药理学治疗剂的非限制性例子包括抗高脂蛋白剂、抗动脉硬化剂、抗血栓/溶纤维蛋白剂、血液促凝剂、抗心律不齐剂、抗高血压剂、血管加压药、用于充血性心力衰竭的治疗剂、抗心绞痛剂、抗细菌剂或其组合。

在某些实施方案中，施用降低一种或多种血脂和/或脂蛋白的浓度的药剂(在本文中称为“抗高脂蛋白药”)可以与依照本发明的心血管疗法(例如miRNA调控剂)组合，特别地在治疗动脉粥样硬化和血管组织的增厚或阻塞中。在某些实施方案中，抗高脂蛋白剂可以包含芳氧基链烷酸/纤维酸(fibricacid)衍生物、树脂/胆汁酸螯合剂(sequesterant)、HMG CoA还原酶抑制剂、烟酸衍生物、甲状腺激素或甲状腺激素类似物、混杂药剂(miscellaneous agent)或其组合。芳氧基链烷酸/纤维酸衍生物的非限制性例子包括苄氯贝特(beclobrate)、enzafibrate、比尼贝特(binifibrate)、环丙贝特(ciprofibrate)、克利贝特(clinofibrate)、氯贝丁酯(clofibrate)(安妥明(atromide)-S)、氯贝酸(clofibric acid)、依托贝特(etofibrate)、非诺贝特(fenofibrate)、吉非贝齐(gemfibrozil)(lobid)、尼可贝特(nicofibrate)、吡贝特(pirifibrate)、氯烟贝特(ronifibrate)、双贝特(simfibrate)和益多酯(theofibrate)。树脂/胆汁酸螯合剂的非限制性例子包括考来烯胺(cholestyramine)(cholybar，消胆胺(questran))、考来替泼(colestipol)(colestid)和降胆葡胺(polidexide)。HMG CoA还原酶抑制剂的非限制性例子包括洛伐他汀(lovastatin)(美降脂(mevacor))、普伐他汀(pravastatin)(普拉固(pravochol))或辛伐他汀(simvastatin)(舒降之(zocor))。烟酸衍生物的非限制性例子包括烟酸盐、阿昔莫司(acepimox)、戊四烟酯(niceritrol)、尼可氯酯(nicoclonate)、尼可莫尔(nicomol)和氧烟酸。甲状腺激素及其类似物的非限制性例子包括etoroxate、甲状丙酸和甲状腺素。

混杂的抗高脂蛋白药的非限制性例子包括阿昔呋喃(acifran)、阿扎胆醇(azacosterol)、苯氟雷司(benfluorex)、β-苯亚甲基丁酰胺、肉碱、硫酸软骨素、氯雌酮甲醚(clomestrone)、考来糖苷(detaxtran)、右旋糖苷硫酸钠、5，8，11，14，17-二十碳五烯酸、香茹嘌呤(eritadenine)、夫拉扎勃(furazabol)、美格鲁托(meglutol)、甲亚油酰胺(melinamide)、双甲雌三醇(mytatrienediol)、鸟氨酸、γ-谷维素、泛硫乙胺、季戊四醇四乙酸酯、α-苯基丁酰胺、吡扎地尔(pirozadil)、普罗布考(probucol)(普罗布考(lorelco))、β-谷固醇、磺托酸-哌嗪盐、硫地醇(tiadenol)、曲帕拉醇(triparanol)和联苯丁酸(xenbucin)。抗动脉硬化药的非限制性例子包括吡卡酯(pyridinol carbamate)。

在某些实施方案中，帮助除去或预防血液凝块的药剂的施用可以与miRNA调控剂的施用组合，特别地在动脉粥样硬化和血管系统(例如动脉)阻塞的治疗中。抗血栓和/或溶纤维蛋白剂的非限制性例子包括抗凝血药、抗凝血药拮抗剂、抗血小板剂、血栓溶解剂、血栓溶解剂拮抗剂或其组合。在某些实施方案中，可以口服施用的抗血栓剂，诸如例如阿司匹林(aspirin)和华法林(wafarin)(香豆定(coumadin))是优选的。

在一些实施方案中，miRNA调控剂可以与一种或多种抗凝血药组合。抗凝血药的非限制性例子包括醋硝香豆素(acenocoumarol)、安克洛酶(ancrod)、茴茚二酮(anisindione)、溴茚二酮(bromindione)、氯茚二酮(clorindione)、库美香豆素(coumetarol)、环香豆素(cyclocumarol)、右旋糖苷硫酸钠、双香豆素、二苯茚酮、双香豆乙酯(ethyl biscoumacetate)、乙叉双香豆素(ethylidenedicoumarol)、氟茚二酮(fluindione)、肝素、蛭素、阿朴酸钠(lyapolate sodium)、奥沙二酮(oxazidione)、戊聚糖多硫酸酯(pentosan polysulfate)、苯茚二酮、苯丙香豆素(phenprocoumon)、卵黄高磷蛋白、吡考他胺(picotamide)、噻氯香豆素(tioclomarol)和华法林(warfarin)。

miRNA调控剂可以与抗血小板剂和/或溶血栓剂组合。抗血小板剂的非限制性例子包括阿司匹林(aspirin)、右旋糖苷(dextran)、双嘧达莫(dipyridamole)(潘生丁(persantin))、肝素(heparin)、磺吡酮(sulfmpyranone)(安特灵(anturane))和噻氯匹定(ticlopidine)(力抗栓(ticlid))。血栓溶解剂的非限制性例子包括组织纤溶酶原激活物(Activase)、纤溶酶、尿激酶原、尿激酶(雅激酶(Abbokinase))、链激酶(Streptase)、阿尼普酶(anistreplase)/APSAC(依米那酶(eminase))。

在患者患有出血或出血可能性升高的某些实施方案中，可以与miRNA调控剂组合使用可增强血液凝固的药剂。血液凝固促进剂的非限制性例子包括血栓溶解剂拮抗剂和抗凝剂拮抗剂。抗凝剂拮抗剂的非限制性例子包括鱼精蛋白(protamine)和维生素K1。

可以与miRNA调控剂组合的血栓溶解剂拮抗剂的非限制性例子包括氨基己酸(amicar)和氨甲环酸(amstat)。抗血栓药的非限制性例子包括阿那格雷(anagrelide)、阿加曲班(argatroban)、西鲁唑啉(cilstazol)、达曲班(daltroban)、去纤苷(defibrotide)、依诺肝素(enoxaparin)、速避凝(fraxiparine)、吲哚布吩(indobufen)、lamoparan、奥扎格雷(ozagrel)、吡考他胺(picotamide)、普拉贝脲(plafibride)、替地肝素(tedelparin)、噻氯匹定(ticlopidine)和三氟柳(triflusal)。

在某些实施方案中，miRNA调控剂可以与抗心律不齐剂组合以治疗心血管状况。抗心率不齐药的非限制性例子包括I类抗心率不齐剂(钠通道阻断剂)、II类抗心率不齐剂(β-肾上腺素能阻断剂)、III类抗心率不齐剂(复极延长药)、IV类抗心率不齐药(钙通道阻断剂)和混杂的抗心率不齐剂。

钠通道阻断剂包括但不限于IA类、IB类和IC类抗心率不齐剂。IA类抗心率不齐剂的非限制性例子包括丙吡胺(disppyramide)(诺佩斯(norpace))、普鲁卡因胺(procainamide)(pronestyl)和奎尼丁(quinidine)(quinidex)。IB类抗心率不齐剂的非限制性例子包括利多卡因(lidocaine)(赛洛卡因(xylocaine))、妥卡尼(tocainide)(妥卡胺(tonocard))和美西律(mexiletine)(脉舒律(mexitil))。IC类抗心率不齐剂的非限制性例子包括恩卡尼(encainide)(恩犬(enkaid))和氟卡尼(flecainide)(tambocor)。例示性的β阻断剂(在其它情况中称为β-肾上腺素能阻断剂、β-肾上腺素能拮抗剂或II类抗心率不齐剂)包括醋丁洛尔(acebutolol)(sectral)、阿普洛尔(alprenolol)、氨磺洛尔(amosulalol)、阿罗洛尔(arotinolol)、阿替洛尔(atenolol)、苯呋洛尔(befunolol)、倍他洛尔(betaxolol)、贝凡洛尔(bevantolol)、比索洛尔(bisoprolol)、波吲洛尔(bopindolol)、布库洛尔(bucumolol)、布菲洛尔(bufetolol)、丁呋洛尔(bufuralol)、布尼洛尔(bunitrolol)、布拉洛尔(bupranolol)、盐酸布替君(butidrine hydrochloride)、丁非洛尔(butofilolol)、卡拉洛尔(carazolol)、卡替洛尔(carteolol)、卡维地洛(carvedilol)、塞利洛尔(celiprolol)、塞他洛尔(cetamolol)、氯拉洛尔(cloranolol)、地来洛尔(dilevalol)、依泮洛尔(epanolol)、艾司洛尔(esmolol)(brevibloc)、茚诺洛尔(indenolol)、拉贝洛尔(labetalol)、左布诺洛尔(levobunolol)、甲吲洛尔(mepindolol)、美替洛尔(metipranolol)、美托洛尔(metoprolol)、莫普洛尔(moprolol)、纳多洛尔(nadolol)、萘肟洛尔(nadoxolol)、硝苯洛尔(nifenalol)、尼普地洛(nipradilol)、氧烯洛尔(oxprenolol)、喷布洛尔(penbutolol)、吲哚洛尔(pindolol)、普拉洛尔(practolol)、丙萘洛尔(pronethalol)、propanolol(心得安(inderal))、索他洛尔(sotalol)(betapace)、sulfmalol、他林洛尔(talinolol)、特他洛尔(tertatolol)、噻吗洛尔(timolol)、托利洛尔(toliprolol)和希波酚(xibinolol)。在某些实施方案中，β阻断剂包括芳氧丙醇胺衍生物。芳氧丙醇胺衍生物的非限制性例子包括醋丁洛尔(acebutolol)、阿普洛尔(alprenolol)、阿罗洛尔(arotinolol)、阿替洛尔(atenolol)、倍他洛尔(betaxolol)、贝凡洛尔(bevantolol)、比索洛尔(bisoprolol)、波吲洛尔(bopindolol)、布尼洛尔(bunitrolol)、丁非洛尔(butofilolol)、卡拉洛尔(carazolol)、卡替洛尔(carteolol)、卡维地洛(carvedilol)、塞利洛尔(celiprolol)、塞他洛尔(cetamolol)、依泮洛尔(epanolol)、茚诺洛尔(indenolol)、甲吲洛尔(mepindolol)、美替洛尔(metipranolol)、美托洛尔(metoprolol)、莫普洛尔(moprolol)、纳多洛尔(nadolol)、尼普地洛(nipradilol)、氧烯洛尔(oxprenolol)、喷布洛尔(penbutolol)、吲哚洛尔(pindolol)、propanolol、他林洛尔(talinolol)、特他洛尔(tertatolol)、噻吗洛尔(timolol)和托利洛尔(toliprolol)。

III类抗心率不齐剂的例子包括延长复极的药剂诸如胺碘酮(amiodarone)(可达龙(cordarone))和索他洛尔(sotalol)(β-pace)。IV类抗心率不齐剂(又称为钙通道阻断剂)的非限制性例子包括芳烃胺(arylalkylamine)(例如bepridile、地尔硫卓(diltiazem)、芬地林(fendiline)、戈洛帕米(gallopamil)、普尼拉明(prenylamine)、特罗地林(terodiline)、维拉帕米(verapamil))、二氢吡啶衍生物(非洛地平(felodipine)、伊拉地平(isradipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼莫地平(nimodipine)、尼索地平(nisoldipine)、尼群地平(nitrendipine))、哌嗪衍生物(例如桂利嗪(cinnarizine)、氟桂利嗪(flunarizine)、利多氟嗪(lidoflazine))或混杂的钙通道阻断剂诸如苄环烷(bencyclane)、依他苯酮(etafenone)、镁(magnesium)、米贝拉地尔(mibefradil)或哌克昔林(perhexiline)。在某些实施方案中，钙通道阻断剂包括长效二氢吡啶(硝苯地平型)钙拮抗剂。

也可以与本发明的miRNA调控剂组合的混杂抗心率不齐剂的合适的例子包括但不限于阿糖腺苷(adenosine)(腺苷(adenocard))、地高辛(digoxin)(lanoxin)、乙酰卡尼(acecainide)、阿义马林(ajmaline)、克冠吗啉(amoproxan)、阿普林定(aprindine)、溴苄胺甲苯磺酸盐(bretylium tosylate)、丁萘夫汀(bunaftine)、布托苯定(butobendine)、卡泊酸(capobenic acid)、西苯唑啉(cifenline)、吡二丙胺(disopyranide)、二氢奎尼丁(hydroquinidine)、英地卡尼(indecainide)、ipatropium bromide、利多卡因(lidocaine)、劳拉义明(lorajmine)、劳卡尼(lorcainide)、甲氧苯汀(meobentine)、莫雷西嗪(moricizine)、吡美诺(pirmenol)、丙缓脉灵(prajmaline)、普罗帕酮(propafenone)、吡诺林(pyrinoline)、奎尼丁聚半乳糖醛酸盐(quinidine polygalacturonate)、硫酸奎尼丁(quinidinesulfate)和维喹地尔(viquidil)。

在本发明的又一个实施方案中，可以与抗高血压剂组合施用miRNA调控剂。抗高血压剂的非限制性例子包括交感神经阻滞药(sympatholytic)、α/β阻断剂、α阻断剂、抗血管紧张素II药、β阻断剂、钙通道阻断剂、血管扩张剂和混杂的抗高血压药。

α阻断剂(又称为α-肾上腺素能阻断剂或α-肾上腺素能拮抗剂)的非限制性例子包括氨磺洛尔(amosulalol)、阿罗洛尔(arotinolol)、达哌唑(dapiprazole)、多沙唑嗪(doxazosin)、甲磺酰二氢麦角毒(ergoloid mesylates)、芬司匹利(fenspiride)、吲哚拉明(indoramin)、拉贝洛尔(labetalol)、尼麦角林(nicergoline)、哌唑嗪(prazosin)、特拉唑嗪(terazosin)、妥拉唑林(tolazoline)、曲马唑嗪(trimazosin)和育亨宾(yohimbine)。在某些实施方案中，α阻断剂可以包括喹唑啉衍生物。喹唑啉衍生物的非限制性例子包括阿夫唑嗪(alfuzosin)、布那唑嗪(bunazosin)、多沙唑嗪(doxazosin)、哌唑嗪(prazosin)、特拉唑嗪(terazosin)和曲马唑嗪(trimazosin)。在某些实施方案中，抗高血压剂既是α肾上腺素能拮抗剂又是β肾上腺素能拮抗剂。α/β阻断剂的非限制性例子包括拉贝洛尔(labetalol)(normodyne、湍泰低(trandate))。

抗血管紧张素II剂的非限制性例子包括血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素II受体拮抗剂。血管紧张素转化酶抑制剂(ACE抑制剂)的非限制性例子包括阿拉普利(alacepril)、依那普利(enalapril)(vasotec)、卡托普利(captopril)、西拉普利(cilazapril)、地拉普利(delapril)、依那普拉利(enalaprilat)、福辛普利(fosinopril)、赖诺普利(lisinopril)、moveltopril、培哚普利(perindopril)、喹那普利(quinapril)和雷米普利(ramipril)。血管紧张素II受体阻断剂(也称为血管紧张素II受体拮抗剂、ANG受体阻断剂或ANG-II型-1受体阻断剂(ARBS))的非限制性例子包括angiocandesartan、依普罗沙坦(eprosartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、氯沙坦(losartan)和缬沙坦(valsartan)。

交感神经阻滞药的非限制性例子包括作用于中枢的交感神经阻滞药或作用于外周的交感神经阻滞药。作用于中枢的交感神经阻滞药(也称为中枢神经系统(CNS)交感神经阻滞药)的非限制性例子包括可乐定(clonidine)(catapres)、胍那苄(guanabenz)(wytensin)、胍法辛(guanfacine)(tenex)和甲基多巴(methyldopa)(爱道美(aldomet))。作用于外周的交感神经阻滞药的非限制性例子包括神经节阻断剂、肾上腺素能神经元阻断剂、β-肾上腺素能阻断剂或α1-肾上腺素能阻断剂。神经节阻断剂的非限制性例子包括美卡拉明(mecamylamine)(inversine)和曲美芬(trimethaphan)(arfonad)。肾上腺素能神经元阻断剂的非限制性例子包括胍乙啶(guanethidine)(依斯迈林(ismelin))和利舍平(reserpine)(serpasil)。β-肾上腺素能阻断剂的非限制性例子包括醋丁洛尔(acenitolol)(sectral)、阿替洛尔(atenolol)(tenormin)、倍他洛尔(betaxolol)(卡尔仑(kerlone))、卡替洛尔(carteolol)(cartrol)、拉贝洛尔(labetalol)(normodyne、湍泰低(trandate))、美托洛尔(metoprolol)(lopressor)、纳多洛尔(nadanol)(corgard)、喷布洛尔(penbutolol)(levatol)、吲哚洛尔(pindolol)(visken)、普萘洛尔(propranolol)(心得安(inderal))和噻吗洛尔(timolol)(blocadren)。α1-肾上腺素能阻断剂的非限制性例子包括哌唑嗪(prazosin)(脉宁平(minipress))、doxazocin(卡杜雷(cardura))和特拉唑嗪(terazosin)(高特灵(hytrin))。

在某些实施方案中，心血管扩张剂治疗剂(cardiovasculator therapeuticagent)可以包括可以与本发明的miRNA调控剂共施用的血管扩张剂(例如脑血管扩张剂、冠状动脉血管扩张剂或周围血管扩张剂)。在某些优选的实施方案中，血管扩张剂包括冠状动脉血管扩张剂。冠状动脉血管扩张剂的非限制性例子包括胺氧三苯(amotriphene)、地巴唑(bendazol)、琥珀苯呋地尔(benfurodil hemisuccinate)、苯碘达龙(benziodarone)、氯酚嗪(chloracizine)、chromonar、氯苯呋醇(clobenfurol)、氯硝甘油(clonitrate)、地拉卓(dilazep)、双嘧达莫(dipyridamole)、氢普拉明(droprenilamine)、乙氧黄酮(efloxate)、erythrityl tetranitrane、依他苯酮(etafenone)、芬地林(fendiline)、夫洛地尔(floredil)、更利芬(ganglefene)、乙烷雌酚双(β-二乙氨乙基醚)(herestrolbis(β-diethylaminoethyl ether)、海索苯定(hexobendine)、硝乙醇胺甲苯磺酸盐(itramin tosylate)、凯林(khellin)、利多氟嗪(lidoflanine)、mannitol hexanitrane、美地巴嗪(medibazine)、nicorglycerin、戊四硝酯(pentaerythritol tetranitrate)、戊硝醇(pentrinitrol)、哌克昔林(perhexiline)、匹美茶碱(pimefylline)、曲匹地尔(trapidil)、tricromyl、曲美他嗪(trimetazidine)、磷酸三硝乙醇胺(trolnitratephosphate)和维斯那定(visnadine)。

在某些实施方案中，血管扩张剂可以包括长期疗法血管扩张剂或高血压紧急血管扩张剂。长期疗法血管扩张剂的非限制性例子包括肼屈嗪(hydralazine)(apresoline)和米诺地尔(minoxidil)(loniten)。高血压紧急血管扩张剂的非限制性例子包括硝普盐(nitroprusside)(nipride)、二氮嗪(diazoxide)(hyperstat IV)、肼屈嗪(hydralazine)(apresoline)、米诺地尔(minoxidil)(loniten)和维拉帕米(verapamil)。

混杂的抗高血压药的非限制性例子包括阿义马林(ajmaline)、γ-氨基丁酸、丁苯碘胺(bufeniode)、西氯他宁(cicletainine)、环西多明(ciclosidomine)、鞣酸绿藜安(cryptenamine tannate)、非诺多泮(fenoldopam)、氟司喹南(flosequinan)、酮色林(ketanserin)、美布氨酯(mebutamate)、美卡拉明(mecamylamine)、甲基多巴(methyldopa)、甲基4-吡啶基酮硫代缩氨基脲(methyl 4-pyridyl ketone thiosemicarbazone)、莫唑胺(muzolimine)、帕吉林(pargyline)、潘必啶(pempidine)、吡那地尔(pinacidil)、哌罗克生(piperoxan)、普立哌隆(primaperone)、原藜芦碱(protoveratrine)、萝巴新(raubasine)、瑞西美托(rescimetol)、利美尼定(rilmenidene)、沙拉新(saralasin)、sodiumnitrorusside、ticrynafen、樟脑磺酸曲美芬(trimethaphan camsylate)、酪氨酸酶(tyrosinase)和乌拉地尔(urapidil)。

在某些实施方案中，抗高血压药可以包括芳基乙醇胺衍生物、苯噻二嗪衍生物、N-羧烃基(肽/内酰胺)衍生物、二氢吡啶衍生物、胍衍生物、肼/酞嗪、咪唑衍生物、季铵化合物、利舍平衍生物或磺胺衍生物(suflonamidederivative)。芳基乙醇胺衍生物的非限制性例子包括氨磺洛尔(amosulalol)、丁呋洛尔(bufuralol)、地来洛尔(dilevalol)、拉贝洛尔(labetalol)、丙萘洛尔(pronethalol)、索他洛尔(sotalol)和硫氧洛尔(sulfinalol)。苯噻二嗪衍生物的非限制性例子包括阿尔噻嗪(althizide)、苄氟噻嗪(bendroflumethiazide)、苄噻嗪(benzthiazide)、苄氢氯噻嗪(benzylhydrochlorothiazide)、布噻嗪(buthiazide)、氯噻嗪(chlorothiazide)、氯噻酮(chlorthalidone)、环戊噻嗪(cyclopenthiazide)、环噻嗪(cyclothiazide)、二氮嗪(diazoxide)、依匹噻嗪(epithiazide)、乙噻嗪(ethiazide)、芬喹唑(fenquizone)、氢氯噻嗪(hydrochlorothizide)、氢氟噻嗪(hydroflumethizide)、甲氯噻嗪(methyclothiazide)、美替克仑(meticrane)、美托拉宗(metolazone)、对氟噻嗪(paraflutizide)、泊利噻嗪(polythizide)、四氯噻嗪(tetrachlormethiazide)和三氯噻嗪(trichlormethiazide)。N-羧烃基(肽/内酰胺)衍生物的非限制性例子包括阿拉普利(alacepril)、卡托普利(captopril)、西拉普利(cilazapril)、地拉普利(delapril)、依那普利(enalapril)、依那普拉利(enalaprilat)、福辛普利(fosinopril)、赖诺普利(lisinopril)、莫维普利(moveltipril)、培哚普利(perindopril)、喹那普利(quinapril)和雷米普利(ramipril)。二氢吡啶衍生物的非限制性例子包括氨氯地平(amlodipine)、非洛地平(felodipine)、伊拉地平(isradipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼伐地平(nilvadipine)、尼索地平(nisoldipine)和尼群地平(nitrendipine)。胍衍生物的非限制性例子包括倍他尼定(bethanidine)、异喹胍(debrisoquin)、胍那苄(guanabenz)、胍那克林(guanacline)、胍那决尔(guanadrel)、胍那佐定(guanazodine)、胍乙啶(guanethidine)、胍法辛(guanfacine)、胍氯酚(guanochlor)、胍诺沙苄(guanoxabenz)和胍生(guanoxan)。肼/酞嗪的非限制性例子包括布屈嗪(budralazine)、卡屈嗪(cadralazine)、双肼屈嗪(dihydralazine)、恩屈嗪(endralazine)、肼卡巴嗪(hydracarbazine)、肼屈嗪(hydralazine)、苯异丙肼(pheniprazine)、匹尔屈嗪(pildralazine)和托屈嗪(todralazine)。咪唑衍生物的非限制性例子包括可乐定(clonidine)、洛非西定(lofexidine)、酚妥拉明(phentolamine)、噻美尼定(tiamenidine)和托洛尼定(tolonidine)。季铵化合物的非限制性例子包括阿扎溴铵(azamethoniumbromide)、松达氯铵(chlorisondamine chloride)、六甲双铵(hexamethonium)、pentacynium bis(methylsulfate)、五甲溴铵(pentamethonium bromide)、酒石酸戊双吡胺(pentolinium tartrate)、芬托氯铵(phenactropinium chloride)和甲硫曲美替定(trimethidinium methosulfate)。利舍平衍生物的非限制性例子包括比他舍平(bietaserpine)、地舍平(deserpidine)、瑞西那明(rescinnamine)、利舍平(reserpine)和昔洛舍平(syrosingopine)。磺胺衍生物的非限制性例子包括安布赛特(ambuside)、氯帕胺(clopamide)、呋塞米(furosemide)、吲达帕胺(indapamide)、喹乙宗(quinethazone)、曲帕胺(tripamide)和希帕胺(xipamide)。

在另一个实施方案中，本发明的miRNA调控剂可以与血管加压药共施用。血管加压药一般用于在外科规程中可能发生的休克过程中提高血压。血管加压药(也称作抗低血压药)的非限制性例子包括氨甲氧苯嗪甲基硫酸盐(amezinium methyl sulfate)、血管紧张素酰胺、二甲福林(dimetofrine)、多巴胺(dopamine)、etifelmin、依替福林(etilefrin)、吉培福林(gepefrine)、间羟胺(metaraminol)、米多君(midodrine)、去甲肾上腺素(norepinephrine)、福来君(pholedrine)和昔奈福林(synephrine)。

在某些实施方案中，本发明的miRNA调控剂可以与充血性心力衰竭的治疗组合施用。例示性的用于治疗充血性心力衰竭的药剂包括但不限于抗血管紧张素II剂、后负荷-前负荷还原处理(reduction treatment)、利尿药和肌力剂。利尿剂的非限制性例子包括噻嗪(thiazide)或苯噻二嗪(benzothiadiazine)衍生物(例如阿尔噻嗪(althiazide)、苄氟噻嗪(bendroflumethazide)、苄噻嗪(benzthiazide)、苄氢氯噻嗪(benzylhydrochlorothiazide)、布噻嗪(buthiazide)、氯噻嗪(chlorothiazide)、氯噻嗪(chlorothiazide)、氯噻酮(chlorthalidone)、环戊噻嗪(cyclopenthiazide)、依匹噻嗪(epithiazide)、乙噻嗪(ethiazide)、乙噻嗪(ethiazide)、芬喹唑(fenquizone)、氢氯噻嗪(hydrochlorothiazide)、氢氟噻嗪(hydroflumethiazide)、甲氯噻嗪(methyclothiazide)、美替克仑(meticrane)、美托拉宗(metolazone)、对氟噻嗪(paraflutizide)、泊利噻嗪(polythizide)、四氯噻嗪(tetrachloromethiazide)、三氯噻嗪(trichlormethiazide))、有机汞(例如氯汞君(chlormerodrin)、美拉鲁利(meralluride)、汞罗茶碱(mercamphamide)、硫汞林钠(mercaptomerin sodium)、汞香豆酸(mercumallylic acid)、汞香豆林钠(mercumatilin dodium)、氯化亚汞(mercurous chloride)、汞撒利(mersalyl))、蝶啶(例如呋氨蝶啶(furterene)、氨苯蝶啶(triamterene))、嘌呤(例如茶碱乙酸哌嗪(acefylline)、7-吗啉甲茶碱(7-morpholinomethyltheophylline)、pamobrom、丙可可碱(protheobromine)、可可碱(theobromine))、类固醇(steroid)包括醛甾酮拮抗剂(例如坎利酮(canrenone)、夹竹桃苷(oleandrin)、螺内酯(spironolactone))、磺酰胺衍生物(例如乙酰唑胺(acetazolamide)、安布赛特(ambuside)、阿佐塞米(azosemide)、布美他尼(bumetanide)、布他唑胺(butazolamide)、氯米非那胺(chloraminophenamide)、氯非那胺(clofenamide)、氯帕胺(clopamide)、氯索隆(clorexolone)、二苯基甲烷-4，4′-二磺酰胺(diphenylmethane-4，4′-disulfonamide)、二磺法胺(disulfamide)、依索唑胺(ethoxzolamide)、呋塞米(furosemide)、吲达帕胺(indapamide)、美夫西特(mefruside)、醋甲唑胺(methazolamide)、吡咯他尼(piretanide)、喹乙宗(quinethazone)、托拉塞米(torasemide)、曲帕胺(tripamide)、希帕胺(xipamide))、尿嘧啶(例如氨美啶(aminometradine)、阿米美啶(amisometradine))、钾节约拮抗剂(potassium sparing antagonist)(例如阿米洛利(amiloride)、氨苯蝶啶(triamterene))或混杂的利尿剂诸如aminozine、熊果苷(arbutin)、氯拉扎尼(chlorazanil)、依他尼酸(ethacrynic acid)、依托唑啉(etozolin)、尿素(urea)。

在某些实施方案中，可以用联合疗法来治疗不能耐受血管紧张素拮抗剂的动物患者，诸如施用肼屈嗪(hydralazine)(apresoline)和硝酸异山梨酯(isosorbide dinitrate)(isordil，sorbitrate)与miRNA调控剂。

本发明的miRNA调控剂可以与肌力剂组合。在一些实施方案中，肌力剂是正性肌力剂。正性肌力剂(也称作强心药)的非限制性例子包括acefylline、醋洋地黄毒苷(acetyldigitoxin)、2-氨基-4-皮考啉(2-amino-4-picoline)、氨力农(amrinone)、琥珀苯呋地尔(benfurodil hemisuccinate)、布拉地新(bucladesine)、cerberosine、樟吡他胺(camphotamide)、铃兰毒苷(convallatoxin)、磁麻苷(cymarin)、地诺帕明(denopamine)、去乙酰毛花苷(deslanoside)、毛地黄苷(digitalin)、毛地黄(digitalis)、洋地黄毒苷(digitoxin)、地高辛(digoxin)、多巴酚丁胺(dobutamine)、多巴胺(dopamine)、多培沙明(dopexamine)、依诺昔酮(enoximone)、红皮素(erythrophleine)、非那可明(fenalcomine)、吉他林(gitalin)、羟基洋地黄毒苷(gitoxin)、胍基乙酸(glycocyamine)、辛胺醇(heptaminol)、白毛莨分碱(hydrastinine)、异波帕胺(ibopamine)、毛花洋地黄苷(lanatoside)、甲氧酚酰胺(metamivam)、米力农(milrinone)、黄夹次苷B(nerifolin)、欧夹竹桃苷(oleandrin)、哇巴因(ouabain)、奥昔非君(oxyfedrine)、普瑞特罗(prenalterol)、proscillaridine、蟾力苏(resibufogenin)、海葱苷(scillaren)、海葱苷配基(scillarenin)、strphanthin、硫马唑(sulmazole)、可可碱(theobromine)和扎莫特罗(xamoterol)。

在具体的实施方案中，肌力药是强心苷、β-肾上腺素能激动剂或磷酸二酯酶抑制剂。强心苷的非限制性例子包括地高辛(digoxin)(lanoxin)和洋地黄毒苷(digitoxin)(crystodigin)。β-肾上腺素能激动剂的非限制性例子包括albuterol、班布特罗(bambuterol)、比托特罗(bitolterol)、卡布特罗(carbuterol)、克仑特罗(clenbuterol)、氯丙那林(clorprenaline)、地诺帕明(denopamine)、双羟乙麻黄碱(dioxethedrine)、多巴酚丁胺(dobutamine)(独步催(dobutrex))、多巴胺(dopamine)(intropin)、多培沙明(dopexamine)、麻黄碱(ephedrine)、乙非君(etafedrine)、乙基去甲肾上腺素(ethylnorepinephrine)、非诺特罗(fenoterol)、福莫特罗(formoterol)、海索那林(hexoprenaline)、异波帕胺(ibopamine)、isoetharine、异丙肾上腺素(isoproterenol)、马布特罗(mabuterol)、metaproterenol、甲氧那明(methoxyphenamine)、奥昔非君(oxyfedrine)、吡布特罗(pirbuterol)、丙卡特罗(procaterol)、普罗托醇(protokylol)、瑞普特罗(reproterol)、利米特罗(rimiterol)、利托君(ritodrine)、索特瑞醇(soterenol)、特布他林(terbutaline)、曲托喹酚(tretoquinol)、妥洛特罗(tulobuterol)和扎莫特罗(xamoterol)。磷酸二酯酶抑制剂的非限制性例子包括氨力农(amrinone)(inocor)。

抗心绞痛药可以包括有机硝酸酯(organonitrate)、钙通道阻断剂、β阻断剂及其组合。

有机硝酸酯(也称作硝基血管扩张剂)的非限制性例子包括硝酸甘油(nitroglycerin)(nitro-bid，nitrostat)、二硝酸异山梨醇酯(isosorbide dinitrate)(isordil，sorbitrate)和硝酸戊酯(amyl nitrate)(aspirol，vaporole)。

在某些实施方案中，本发明的miRNA调控剂与用于治疗心血管疾病的内皮缩血管肽共施用。内皮缩血管肽(ET)是21个氨基酸的肽，其具有似乎牵涉心力衰竭形成的有力的生理学和病理生理学效应。ET的效应是经由与两类细胞表面受体的相互作用来介导的。A型受体(ET-A)与血管收缩和细胞生长有关，而B型受体(ET-B)与内皮细胞介导的血管舒张及与其它神经激素(诸如醛固酮)的释放有关。可抑制ET生成或其刺激相关细胞的能力的药理学药剂是本领域已知的。对ET生成的抑制牵涉阻断称作内皮缩血管肽转化酶的酶的药剂的使用，内皮缩血管肽转化酶牵涉将肽的前体加工成活性形式。对ET刺激细胞的能力的抑制牵涉阻断ET与其受体相互作用的药剂的使用。内皮缩血管肽受体拮抗剂(ERA)的非限制性例子包括波生坦(Bosentan)、恩拉生坦(Enrasentan)、Ambrisentan、达卢生坦(Darusentan)、替唑生坦(Tezosentan)、阿曲生坦(Atrasentan)、Avosentan、Clazosentan、Edonentan、sitaxsentan、TBC3711、BQ 123、和BQ 788。

在某些实施方案中，可以与miRNA调控剂组合的次要(secondary)治疗剂可以包括一些类型的手术，包括例如预防性、诊断性或用于分期或分类的(staging)、治愈性和姑息性手术。手术，特别是治愈性手术，可以与其它疗法联合使用，诸如本发明的miRNA调控剂和一种或多种其它药剂。

此类用于血管和心血管疾病和病症的外科治疗剂是本领域技术人员众所周知的，而且可以包括但不限于对生物体实施手术、提供心血管机械假体(cardiovascular mechanical prostheses)、血管成形术、冠状动脉再灌注、导管消融(catheter ablation)、给受试者提供可植入的心复律器除颤器(cardioverterdefibrillator)、机械循环支持(mechanical circulatory support)或其组合。可用于本发明的机械循环支持的非限制性例子包括主动脉内球囔反搏(intra-aorticballoon counterpulsation)、左心室辅助装置(left ventricular assist device)或其组合。

在涵盖临床应用的情况中，以适合于预定应用的形式制备包含表3-6中所鉴定的一种或多种miRNA的调控剂的药物组合物。通常，这会需要制备基本上不含热原以及其它会对人类或动物有害的杂质的组合物。可以使用胶状分散系统(诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠、和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束(micelle)、混合胶束、和脂质体)作为微小RNA功能的寡核苷酸抑制剂或miRNA激动剂(例如表达特定miRNA的构建体或编码miRNA的多核苷酸)的递送媒介物。对于将本发明的核酸递送至诸如心肌组织等组织合适的商品化脂肪乳剂包括

II、

III、Nutrilipid、和其它类似的脂质乳剂。一种作为体内递送媒介物使用的优选的胶状系统是脂质体(即人工膜囊泡)。此类系统的制备和使用是本领域公知的。例示性的配制剂还披露于US 5,981,505；US 6,217,900；US6,383,512；US 5,783,565；US 7,202,227；US 6,379,965；US 6,127,170；US5,837,533；US 6,747,014；和WO03/093449，通过提及完整收入本文。

一般会希望采用适宜的盐和缓冲剂来使得核酸、激动剂、抑制剂和递送载体稳定且容许被靶细胞摄取。当将重组细胞导入患者中时，也会采用缓冲液。本发明的水性组合物包含有效量的药剂，其溶解或分散在药学可接受载体或水性介质中。短语“药学可接受的”或“药理学可接受的”指在对动物或人类施用时不产生不利的、变应性的、或其它不想要的反应的分子实体和组合物。如本文中所使用的，“药学可接受载体”包括溶剂、缓冲剂、溶液、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等可接受用于配制药物(诸如适合对人施用的药物)的。此类介质和试剂用于药学活性物质的使用是本领域公知的。除非任何常规介质或试剂与本发明的活性成分不相容，否则就涵盖它在治疗性组合物中的使用。还可以将补充性活性成分掺入组合物中，只要它们不灭活所述组合物的载体或核酸。

本发明的活性组合物可包括经典的药学制备物。依照本发明的这些组合物的施用可以经由任何常用路径，只要靶组织经由该路径可及。这包括口服、鼻、或含服。或者，施用可以是经过皮内、皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射，或者通过直接注射入心脏组织。包含miRNA抑制剂或激动剂的药物组合物也可以通过导管系统或分离冠状动脉循环以供投递治疗剂至心脏的系统施用。用于投递治疗剂至心脏和冠状动脉系统(coronary vasculature)的多种导管系统是本领域已知的。适合用于本发明中的基于导管的投递方法或灌装动脉分离方法公开在美国专利No.6,416,510；美国专利No.6,716,196；美国专利No.6,953,466，WO 2005/082440，WO 2006/089340，美国专利公开No.2007/0203445，美国专利公开No.2006/0148742和美国专利公开No.2007/0060907，将他们全部通过提述以其整体并入本文。此类组合物通常会作为如上所述的药学可接受组合物来施用。

活性化合物也可以胃肠外或腹膜内施用。举例而言，可以在与表面活性剂(诸如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备游离碱或药理学可接受盐形式的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中及在油中制备分散体。在普通贮存和使用条件下，这些制备物一般含有防腐剂以防止微生物生长。

适合于注射使用或导管投递的药物形式包括例如无菌水溶液或分散体及用于临场制备无菌注射液或分散体的无菌粉剂。一般而言，这些制备物是无菌的，而且以存在易于注射性的程度流动。制备物在制造和贮存条件下应当是稳定的，而且应当针对微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用进行保存。适宜的溶剂或分散介质可含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇、等等)、它们的合适混合物、及植物油。可以通过例如使用涂层(诸如卵磷脂)、通过维持所需粒度(在分散体的情况中)和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来实现对微生物作用的预防，例如paraben、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞、等等。在许多情况中，会优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂来实现可注射组合物的吸收的延长，例如单硬脂酸铝和明胶。

可如下制备无菌注射液，即以适宜的量将活性化合物掺入根据需要含有任何其它成分(例如上文所列)的溶剂中，接着过滤除菌。一般而言，如下制备分散体，即将各种经灭菌的活性成分掺入含有基本分散介质和想要的其它成分(例如上文所列)的无菌媒介物中。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况中，优选的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，它们自先前无菌过滤的溶液产生其活性成分加任何别的想要的成分的粉末。

本发明的组合物一般可配制成中性或盐形式。药学可接受盐包括例如自无机酸(例如盐酸或磷酸)或自有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸、等等)衍生的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成的)。也可以自无机碱(例如氢氧化钠、钾、铵、钙、或铁)或自有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等等)衍生与蛋白质的游离羧基形成的盐。

配制后，优选以与剂型相容的方式和以治疗上有效的量施用溶液。所述配制剂可以容易地以多种剂量形式来施用，诸如注射液、药物释放胶囊等等。例如，为了以水溶液形式胃肠外施用，一般将溶液适当缓冲，并且首先例如用足够的盐水或葡萄糖使得液体稀释剂等渗。此类水溶液可用于例如静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。优选的是，采用无菌水介质，正如本领域技术人员知道的，特别是根据本公开内容。举例而言，可以将单个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，并且或是添加至1000ml皮下输液或是在建议的输注部位注射(参见例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”第15版，第1035-1038页和第1570-1580页)。取决于所治疗的受试者的状况，剂量必然会发生一些变化。在任何情况中，负责施用的人会为各受试者决定适宜的剂量。此外，对于人类施用，制备物应当达到FDA生物制剂标准室要求的无菌度、热原度、一般安全和纯度标准。

如本文中所使用的，术语“心力衰竭”广泛用于指任何降低心脏泵血的能力的状况。因此，在组织中形成充血和水肿。最常见的是，心力衰竭是由源自冠状动脉血流降低的心肌收缩性降低引起的；然而，许多其它因素可导致心力衰竭，包括对心瓣膜的损伤、维生素缺乏、和原发性心肌疾病。尽管尚未完全了解心力衰竭的精确生理学机制，但是一般认为心力衰竭牵涉数项心脏自主特性的紊乱，包括交感的、副交感的、和压力感受器应答。短语“心力衰竭的表现”广泛用于涵盖所有与心力衰竭有关的后遗症，诸如呼吸短促、压凹性水肿、扩大的触痛的肝、颈静脉充盈、肺罗音、等等，包括与心力衰竭有关的实验室发现。

术语“治疗/处理”或语法等同物涵盖心力衰竭症状的改善和/或逆转(即心脏泵血的能力)。心脏“生理学功能的改善”可以使用本文所述任何度量(例如测量射血分数、缩短分数、左心室内径、心率等)，以及任何对动物存活的效应来评估。

如本文中所使用的，术语“心脏肥大”指成年心肌细胞通过肥大生长来应答压力的过程。此类生长的特征在于细胞尺寸增大而没有细胞分裂、在细胞内装配额外的肌节以最大化力量产生、和胎儿心脏基因程序的活化。心脏肥大常常与发病率和死亡率风险升高有关，如此，致力于了解心脏肥大的分子机制的研究对人类健康可具有重大影响。

术语“心肌梗死”或MI指由供氧与心肌需要间的不平衡(其经常源自斑块破裂及冠状动脉血管中的血栓形成，导致对心肌的一部分的血液供应剧烈降低)引起的心肌坏死的快速形成。许多MI事件是“沉默的”或者是临床上无法识别的，但是仍然在此定义内涵盖。循环中的心脏标志物的存在一般指示心肌坏死，并且是一种可用于诊断的辅助物。此类标志物包括ST-升高性MI(STEMI)、非-ST-升高性MI(NSTEMI)、和不稳定性心绞痛。

涵盖的是，可以在本发明的任何方法或组合物方面执行本文中所讨论的任何实施方案，反之亦然。此外，可以使用本发明的组合物和试剂盒来实现本发明的方法。贯穿本说明书，术语“约”用于指示数值包括用于测定数值的装置或方法的误差的标准偏差。权利要求书中术语“或”的使用用于表示“和/或”，除非明确指明指只选一项或各备选项相互排斥，即使公开文本支持只选一项的定义和“和/或”。

如本说明书和权利要求书中所使用的，词语“包含”(及其任何形式)、“具有”(及其任何形式)、“包括”(及其任何形式)或“含有”(及其任何形式)是包含性/包括性的或开放式的，不排除别的未提及的成分或方法步骤。

本发明通过以下另外的实施例来进一步例示，所述实施例不应解释为限制性的。根据本公开内容，本领域技术人员应当领会可以对所公开的具体实施方案做出许多改变，并且在不背离本发明的精神和范围的前提下仍得到同样或相似的结果。

实施例

实施例1：在心肌梗死后重塑期间受调节的微小RNA的鉴定

在心肌梗死后(MI后)重塑期间，可以将左心室大致分成两个区域：(a)梗死区和(b)远处的心肌。广泛的纤维化和肌细胞损失是梗死愈合期间心肌重塑的初始阶段的主要特征，而在MI后的非梗死心肌中发生心肌细胞肥大和间质性纤维化(图1A)。为了鉴定牵涉MI后重塑的miRNA，通过左前降动脉(LAD)的阻塞来诱导MI，并在梗死区的边界区和非梗死(远处的)心肌两者中在MI后3天和14天比较小鼠心脏中的miRNA表达概况与假操作动物的miRNA表达概况(图1B-C和表3和4)。在微阵列上呈现的569种单独的miRNA中，40种miRNA在MI的诱导后3天的梗死区的边界区中受到显著调节；17种miRNA显示2倍或更大的表达升高，而23种miRNA显示2倍或更大的表达降低。另外，22种miRNA表现为在远处的心肌中变化；12种miRNA显示2倍或更大的表达升高，而10种miRNA显示2倍或更大的表达降低(表3和4)。在MI后2周，69种miRNA在梗死区的边界区中受到调节超过2倍，而40种miRNA在远处的心肌中显示大于2倍的变化(表3和4)。使用miRNA特异性探针通过实时PCR分析确定阵列数据(图1D)。

表3：响应MI显著上调的miRNA(大于2倍变化)

表4：响应MI显著下调的miRNA(大于2倍变化)

为了检查对人心脏中的这些鉴定的miRNA的调节，获得来自接受心脏移植的患者的梗死区的边界区的心脏组织。实时PCR分析确认在鼠MI模型中的受调节的miRNA之数种在人心脏中类似地受到调节。例如，miR-21、miR-214和miR-223显示了梗死边界区中的表达的显著升高，而miR-29b和miR-149的表达受到显著下调(图1E)。对miR-21的Northern印迹分析证实实时表达数据(图1F)。这些结果揭示了在心脏重塑期间响应缺血而受调节的miRNA的集合。

特定的方法

手术规程。用2.4％异氟烷麻醉成年C57/BL6雄性小鼠，并以仰卧位置放置在加热垫(37℃)上。用19G残肢针把管子插进动物，并使用MiniVent小鼠通气机(Hugo Sachs Elektronik，德国；每搏量250μl，呼吸速率每分钟210次呼吸)用室内空气通气。经由第四与第五根肋骨间的左胸廓切开术，在显微镜下显现左前降动脉(LAD)，并使用6-0聚丙烯缝合线结扎。通过阻塞的远端心肌的褪色在解剖显微镜(Leica)下通过目视检查确认局部缺血。假操作的动物在没有阻塞LAD动脉的情况中经历相同的规程。

组织学分析和RNA原位杂交。将用于组织学的组织在Krebs-Henselheit溶液中温育，在4％多聚甲醛中固定，切片，并通过标准技术(Shelton等，2000)为苏木精和曙红(H&E)及Masson氏三色染色或原位杂交进行加工。

miRNA的微阵列。使用服务供应商(LC Sciences)来实施微阵列测定法。测定法自10μg总RNA样品(其使用YM-100Microcon离心过滤器(来自Millipore)进行大小分级)开始，并使用多聚(A)聚合酶用多聚(A)尾部在3’延伸分离的小RNA(小于300nt)。然后，将寡核苷酸标签与多聚(A)尾部连接，用于后来的荧光染料染色；在双重样品实验中对两个RNA样品使用两种不同标签。使用微循环泵(Atactic Technologies)在μParaflo微射流芯片上将杂交实施过夜(Gao等，2004)。在微射流芯片上，每个检测探针由与靶微小RNA(来自miRBase网站)或其它RNA(对照或客户定义的序列)互补的经化学修饰的核苷酸编码区段和使编码区段远离基片延伸的聚乙二醇的间隔物区段组成。使用PGR(光生成试剂)化学通过原位合成来生成检测探针。通过化学修饰检测探针来平衡杂交解链温度。杂交于34℃使用100μL含有25％甲酰胺的6xSSPE缓冲液(0.90M NaCl，60mM Na2HP04，6mM EDTA，pH 6.8)。在RNA杂交后，将缀合有标签的Cy3和Cy5染料遍及整个微射流芯片循环以进行染料染色。使用激光扫描仪(GenePix 4000B，Molecular Device)来收集荧光图像，并使用Array-Pro图像分析软件(Media Cybernetics)来数字化。通过首先扣除背景，然后使用LOWESS滤器(局部加权的回归)(Bolstad等，2003)标准化信号来分析数据。对于两次颜色实验，计算两组检测信号的比率(经log2转化的，平衡的)和t检验的p值；差别检出的信号是那些具有小于0.01的p值的。

RT-PCR和实时分析。为了检测miRNA的水平，使用Taqman微小RNA逆转录酶试剂盒(Applied Biosystems，ABI)依照制造商的推荐来实施RT-PCR。用miRNA特异性引物使用5ng RNA来生成cDNA，之后，miRNA特异性Taqman探针用来检测感兴趣的miRNA的表达水平。在对RNA样品用随机六聚体引物(Invitrogen)进行RT-PCR后，通过PCR或定量实时PCR使用购自ABI的Taqman探针来分析基因子集的表达。

Northern印迹分析。通过使用Trizol试剂(GibcoIBRL)自小鼠和人心脏组织样品或分离的肌细胞分离总RNA。获得诊断为已经患有心肌梗死的匿名人的边界区区域的心脏组织样品。通过用溴化乙锭染色Northern凝胶来确认相等的加载。实施检测微小RNA的Northern印迹，如先前所描述的(van Rooij等，2006)。U6探针充当加载对照。

实施例2：人心力衰竭中受调节的微小RNA的鉴定

为了测定哪些miRNA在人心力衰竭期间受调节，自健康心脏组织和来自患有特发性扩张型心肌病(IDC)的患者的心脏组织两者分离RNA，并实施miRNA的微阵列。自测量的所有711种miRNA，发现了31种受到显著上调(表5)，而45种miRNA受到显著下调(表6)。

在上调的miRNA中，鉴定了我们先前发现在小鼠中的心脏肥大和重塑期间受到调节的数种miRNA(例如miR-214、miR-21、miR-195、miR-15b、miR-199a、miR-26a和miR-23a及b)。上调的miRNA的此重叠提示了这些miRNA可能牵涉心脏的不同疾病过程，而且积极地影响疾病状态。令人感兴趣地，还存在着患病样品中显著诱导的数种其它miRNA，其可以积极地参与该疾病(表5)。例如，观察到let-7家族的所有成员的上调。

表5：上调的miRNA(差别表达的转录物p-值＜0.01)

探针_ID	对照心脏样品	IDC	log2(对照/IDC)	倍数变化
					hsa-miR-122	36.48	33,353.67	9.91	962.1
hsa-miR-34c-3p	120.04	3,688.10	4.96	31.1
					hsa-miR-574-5p	36.05	185.22	2.47	5.5
hsa-miR-768-5p	201.39	1,104.72	2.46	5.5
					hsa-miR-192	52.95	369.76	2.34	5.1

hsa-miR-194	38.82	231.95	2.16	4.5
					hsa-miR-155	99.52	325.71	1.95	3.9
hsa-miR-768-3p	280.05	1,016.11	1.86	3.6
					hsa-miR-146b-5p	87.28	338.66	1.63	3.1
hsa-miR-923	5,664.60	15,261.52	1.45	2.7
					hsa-miR-214	3,017.13	6,445.66	1.10	2.1
hsa-miR-21	9,352.69	18,911.79	1.05	2.1
					hsa-let-7b	14,443.06	28,418.81	0.98	2.0
hsa-miR-320	3,008.50	5,235.72	0.82	1.8
					hsa-miR-361-5p	2,038.60	3,579.68	0.80	1.7
hsa-miR-151-5p	3,889.12	6,518.96	0.78	1.7
					hsa-let-7c	21,340.60	36,334.98	0.77	1.7
hsa-let-7f	26,168.09	41,535.81	0.64	1.6
					hsa-let-7e	9,971.13	15,426.06	0.64	1.6
hsa-let-7a	27,230.53	42,854.32	0.61	1.5
					hsa-let-7d	20,734.80	31,073.26	0.58	1.5
hsa-miR-92a	4,400.94	6,449.08	0.57	1.5
					hsa-miR-423-5p	1,428.18	1,971.57	0.52	1.4
hsa-miR-195	7,087.24	10,192.41	0.49	1.4
					hsa-let-7i	8,125.02	11,287.99	0.48	1.4
hsa-miR-15b	1,803.83	2,508.34	0.43	1.3
					hsa-miR-145	15,652.98	19,878.56	0.38	1.3
hsa-miR-199a-3p	5,183.21	6,586.60	0.33	1.3
					hsa-miR-26a	28,400.25	33,441.32	0.21	1.2
hsa-miR-23b	30,446.26	34,173.02	0.17	1.1
					hsa-miR-23a	28,557.77	32,402.43	0.14	1.1

在下调的miRNA中鉴定了先前发现在小鼠中的心脏肥大和重塑期间受调节的数种miRNA。例如，miR-29家族的所有三种成员(miR-29a、miR-29b、和miR-29c)在人心力衰竭样品中是下调的。最近确认miR-101(其在人心力衰竭样品中也是下调的)在小鼠中的心肌梗死后是下调的。miR-133和miR-1在人样品中都是下调的，而且已经报告了这两种miRNA在心脏肥大和重塑的鼠模型中都是下调的(综述见van Rooij等(2008)Trends in Genetics，第24卷(4)：159-166)。受调节的miRNA的此重叠暗示这些鉴定的miRNA在心脏病中的有希望的作用(promising role)(表6)。令人感兴趣地，miR-30家族的所有5种成员(miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d、和miR-30e)在人心力衰竭样品中是下调的。

表6：下调的miRNA(差别表达的转录物p-值＜0.01)

探针_ID	对照心脏样品	IDC	log2(对照/IDC)	倍数变化
					hsa-miR-186*	239.29	19.41	-3.62	12.3
hsa-miR-221	3,710.66	513.54	-2.88	7.4
					hsa-miR-223	545.53	80.34	-2.45	5.5
hsa-miR-424	275.07	50.70	-2.38	5.2
					hsa-miR-19b	423.96	91.17	-2.21	4.6
hsa-miR-422a	930.72	207.10	-2.17	4.5
					hsa-miR-148b	160.81	36.01	-2.16	4.5
hsa-miR-22*	508.92	125.15	-2.08	4.2
					hsa-miR-365	323.15	79.34	-2.00	4.0
hsa-miR-30e	4,519.51	1,233.35	-1.90	3.7
					hsa-miR-29b	2,144.01	585.56	-1.90	3.7
hsa-miR-30e*	740.74	238.94	-1.76	3.4
					hsa-miR-101	1,073.51	337.36	-1.74	3.3
hsa-miR-208b	6,727.23	2,240.12	-1.67	3.2
					hsa-miR-222	2,068.85	750.11	-1.54	2.9
hsa-miR-148a	746.38	310.46	-1.36	2.6
					hsa-miR-451	5,961.19	2,371.72	-1.33	2.5
hsa-miR-374b	393.62	164.80	-1.26	2.4
					hsa-miR-499-5p	25,411.64	10,824.22	-1.19	2.3
hsa-miR-29c	16,048.49	7,854.79	-1.08	2.1
					hsa-miR-30a*	428.86	198.99	-1.04	2.1
hsa-miR-22	5,618.80	2,819.54	-0.99	2.0

hsa-miR-30a	13,199.11	7,102.96	-0.99	2.0
					hsa-miR-100	1,844.31	1,000.95	-0.94	1.9
hsa-miR-106a	702.52	347.90	-0.93	1.9
					hsa-miR-572	427.56	227.14	-0.91	1.9
hsa-miR-99a	3,069.97	1,599.97	-0.83	1.8
					hsa-miR-17	813.93	458.48	-0.80	1.7
hsa-miR-20a	1,107.04	689.68	-0.75	1.7
					hsa-miR-27a	17,024.56	10,573.08	-0.73	1.7
hsa-miR-29a	16,781.16	10,252.74	-0.72	1.6
					hsa-miR-143	16,361.00	9,648.78	-0.72	1.6
hsa-miR-30c	17,367.39	10,276.92	-0.71	1.6
					hsa-miR-30b	20,618.98	12,470.91	-0.69	1.6
hsa-miR-133b	20,977.84	13,035.90	-0.62	1.5
					hsa-miR-30d	10,983.35	7,310.62	-0.57	1.5
hsa-miR-125a-5p	10,632.39	6,632.28	-0.57	1.5
					hsa-miR-133a	22,072.52	14,581.49	-0.57	1.5
hsa-miR-99b	2,284.52	1,673.43	-0.47	1.4
					hsa-miR-378	4,105.84	2,979.18	-0.44	1.4
hsa-miR-24	16,343.42	12,119.99	-0.43	1.3
					hsa-miR-126	33,190.01	24,588.55	-0.42	1.3
hsa-miR-27b	20,014.47	15,876.32	-0.40	1.3
					hsa-miR-125b	23,475.53	19,94125	-0.20	1.1
hsa-miR-1	51,258.16	45,360.53	-0.17	1.1

这些数据显示了miR受到调节，并且活跃地牵涉人心力衰竭的过程。这些鉴定的miRNA的操作为治疗开发提出数个独特的机会。

实施例3：MI后的miR-29表达的下调。

在MI后受调节的miR中，miR-29家族的所有三种成员响应MI而受到下调。此miRNA家族由自两种双顺反子miRNA簇表达的三种成员组成。miR-29b-1与miR-29a共表达，而miR-29b的第二拷贝(miR-29b-2)与miR-29c共表达。所有家族成员共享保守的种子区，并且miR-29a和miR-29c与miR-29b序列仅相差一个碱基(图2A)。对多种小鼠组织的Northern分析指示所有三种miR-29家族成员的相当的表达样式，其中肺和肝中的表达最高。在三种成员中，miR-29b表现为在心脏中是最显著的(图2B)。通过分离心肌细胞和成纤维细胞，发明人发现了miR-29优先在成纤维细胞群体中表达。与无血清培养基(SF)中保持的或用肥大激动剂苯肾上腺素(PE)刺激的心肌细胞中的表达水平相比，miR-29家族成员的表达水平在心脏成纤维细胞中高5-12倍(图2C)。

对四种不同动物中的梗死区的边界区和远处的心肌两者中的miR-29b表达的Northern分析证实响应MI的非常一致的表达降低。与基线水平和远处的心肌中的表达相比，miR-29b的水平在MI后三天的梗死区中一致地受到下调(图2D)。实时RT-PCR分析进一步确认MI后3天内的miR-29家族的所有三种成员的表达降低。然而，到第14天，在梗死已经愈合，并且继发性重塑正在进行时，miR-29表达在与梗死相邻的区域(例如边界区)中仍然降低(图2E)。

实施例4：miR-29调节纤维化基因的表达。

为了开始限定miR-29a-c在MI后的心脏中可能的功能，发明人利用计算机预测来鉴定可能的miR-29a-c靶物。Targetscan预测网站指示数目高得出乎意料的纤维化相关的编码胶原、金属肽酶和整联蛋白的mRNA为可能的miR-29a-c的靶物(万维网站在targetscan.org)。为了测定miR-29a-c的下调是否可以调节心脏纤维化，发明人聚焦于牵涉心脏中的ECM生成的预测的靶物。弹性蛋白(ELN)、肌原纤蛋白1(FBN1)、胶原I型、α1和α2(COL1A1，COL1A2)及胶原III型，α1(COL3A1)均含有一个或多个保守的潜在的miR-29a-c种子序列(图3A)。

因为miRNA可以下调稳态水平及其靶mRNA的翻译，所以发明人分析预测的miR-29a-c mRNA靶物的表达。对MI后3天的心脏样品实时RT-PCR分析心脏纤维化的这些关键调节基因指示梗死区中的miR-29a-c的特异性下调与COL1A1、COL1A2、COL3A1、和FBN1的表达升高相关联。相反，ELN在边界区中似乎未变化，而且甚至在远处的心肌中显示升高(图3B)。

使用CMV驱动的表达质粒，发明人在具有萤光素酶表达质粒的COS细胞中过表达miR-29b-1和miR-29a(图3C)，所述萤光素酶表达质粒含有预测的miR-29a-c靶物的3’-UTR。增加量的CMV驱动的miR-29b-1/miR-29a导致萤光素酶活性的剂量依赖性降低，而相当量的miR-206，即一种对照miRNA没有影响(图3D)。这些结果支持如下的结论，即这些mRNA是miR-29a-c所进行的阻抑的靶物。

特定的方法

细胞培养、转染和萤光素酶测定法。通过PCR扩增涵盖miR-29b-1和miR-29a编码区的1793-bp基因组片段，并将其连接入pCMV6中。将涵盖miR-29结合位点的鼠3’UTR的基因组片段进行PCR扩增，并连接入萤火虫萤光素酶(f-luc)报告构建体(pMIR-REPORTTM，Ambion)中。用Fugene 6(Stratagene)依照制造商的指令转染COS细胞。通过添加相应量的没有cDNA插入物的表达载体来将每孔的DNA总量保持恒定。转染后48小时，使用萤光素酶测定试剂盒(Promega)来对细胞提取物测定萤光素酶表达。相对启动子活性表述为相对于细胞提取物中的β-半乳糖苷酶表达标准化的发光相对单位。

实施例5：心脏成纤维细胞中的miR-29的调节。

心脏纤维化是通常在衰竭的心脏中看到的重塑过程的主要方面。成纤维细胞的增殖和胞外基质组分的沉积增加导致心肌僵硬和舒张功能障碍。已经显示了转化生长因子β(TGFβ)在心脏中的胶原生成和沉积中发挥主要的作用，并且诱导成纤维细胞转化成肌成纤维细胞(Border和Noble，1994)。对暴露于TGFβ的心脏成纤维细胞的实时PCR分析揭示miR-29a-c表达的降低，提示MI后的miR-29a-c降低可能被TGFβ调节(图4A)。令人感兴趣地，已经显示了利钠肽如B型利钠肽(BNP)抑制与纤维化和肌成纤维细胞转化有关的TGFβ调节的基因表达(Kapoun等，2004)。在这点上，发明人先前报告了缺乏心脏特异性miRNA miR-208的小鼠对心脏纤维化和重塑有抗性，而且展现出基线处BNP的表达升高(van Rooij等，2007)。因为已知BNP拮抗TGFβ的效应，所以本发明人假设这些小鼠中的BNP水平升高可以增强miR-29a-c的表达。实际上，Northern分析显示了除去miR-208后miR-29a-c表达的剂量依赖性升高，这与BNP的表达水平升高刚好一致(图4B)。这些数据指示TGFβ至少部分经由降低miR-29a-c(其可以被由心肌细胞分泌的BNP抑制)的水平来诱导成纤维细胞中的胶原相关基因的表达。

特定的方法

分离心脏成纤维细胞(CF)，如先前所描述的(Simpson和Savion，1982)。简言之，将心脏自麻醉的新生1-2天龄Sprague-Dawley大鼠(Harlan SpragueDawley，Indianapolis，IN)切出，切碎，并用胰酶制剂0.1％消化。将细胞铺板在Primaria板上，保持2小时，并取出含有经消化组织的心肌细胞级分的培养基。心脏成纤维细胞比心肌细胞快得多地附着并增殖；这在第一次传代后产生实质上纯的成纤维细胞培养物，其通过重复的差别铺板和显微镜检评估来确认。用0.05％胰蛋白酶使细胞脱附以进行传代，并在传代2至4代时实施培养研究。将细胞在高葡萄糖(4.5gm/L)Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)(其含有10％热灭活的FBS和抗生素(青霉素和链霉素))中培养。通过将培养基更换成具有L-抗坏血酸(10μg/μl)的低血清(2％FBS)，并施用10ng/mlTGFβ1达48小时来诱导肌成纤维细胞分化。

实施例6：miR-29的体内敲低诱导纤维化和胶原基因的表达。

为了进一步探索miR-29a-c作为胶原表达的负调节物的潜在作用，发明人使用与miR-29b的成熟miRNA序列互补的经胆固醇修饰的寡核苷酸(anti-miR-29b)和盐水或包含四碱基错配的寡核苷酸(错配miR-29b)作为阴性对照在体内敲低miR-29b(图5A)。在anti-miR-29b(80mg/kg)的单次尾静脉注射后3天，发明人观察到所检查的所有组织中的miR-29b表达的显著降低(图5B)。相反，与盐水对照相比，相当剂量的错配miR-29b反义寡核苷酸对miR-29b的表达水平没有影响。通过anti-miR-29b进行的敲低表现为对成熟的miRNA是特异性的，因为pre-miRNA的水平在anti-miR与错配处理的动物间保持相当。虽然肝和肾中的敲低表现为完全的，但是miR-29b的低水平在心脏和肺中保持可检出(图5B)。实时PCR分析指示miR-29b敲低足以在肝中特异性诱导胶原基因表达，而此效应在错配对照中是没有的(图5C)。

为了增强miR-29b的心脏敲低，发明人在连续两天静脉内注射80mg/kg寡核苷酸，并在3周后收集材料。Northern分析指示与注射错配miR-29b后看到的表达水平相比，肾和肝中响应anti-miR-29b的对miR-29b的完全敲低(图5D)。miR-29b的心脏水平也显著降低，而肺中的miR-29b的表达表现为不受anti-miR-29b影响(图5D)。心脏中的胶原表达响应miR-29b抑制而升高(图5E)。总之，这些数据指示miR-29b在体内发挥胶原基因表达的负调节物的功能，并且由此影响心脏和肝中的胶原沉积和纤维化。

特定的方法

通过合成的寡核苷酸处理进行的体内miR-29b抑制。使用包含与成熟miR-29b互补的序列的经化学修饰的寡核苷酸(anti-miR-29b)来抑制miR-29b活性。所有核苷是2’-OMe经修饰的，即5’端两个和3’端四个碱基含有硫代磷酸酯核苷间键，并且分子含有经由羟脯氨醇接头附接的3’胆固醇。经由尾静脉注射，8周龄C57BL/6雄性小鼠以80mg/kg体重的剂量接受anti-miR-29b或错配miR-29b或相当体积的盐水。在处理后3天或3周收集组织。

实施例7：用miR-29模拟物下调胶原表达。

为了测定miR-29a-c的过表达是否能够降低胶原表达，发明人将成纤维细胞暴露于miR-29b模拟物。成纤维细胞培养物中的miR-29b表达水平在暴露于miR-29b模拟物的3天后升高多达400倍(图5F)。通过miR-29b模拟物，miR-29a表达不受影响，并且miR-29c表达仅略有升高(图5F)。实时PCR分析指示响应miR-29b模拟物而降低胶原基因的表达(图5G)。然而，与miR-29b的表达升高相比，胶原表达降低的量级是适度的，指示miR-29a-c水平不是胶原水平的唯一决定因素。

特定的方法

通过合成的寡核苷酸处理进行的体内miR-29b增强。miR-29b模拟物是一种由指导和乘客(passenger)链组成的双链构建体。指导链在每个嘧啶残基处含有2’-F核苷，即两个3’端硫代磷酸酯连接，并且在5’端是化学磷酸化的。乘客链含有两个5’端2’-OMe残基和两个3’端硫代磷酸酯键。胆固醇经由羟脯氨醇接头附接于乘客链的3’端。经由尾静脉注射，8周龄C57BL/6雄性小鼠以80mg/kg体重的剂量接受miR-29模拟物或相当体积的盐水。处理后3天或3周收集组织。

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通过提及将本文中所讨论和引用的所有出版物、专利、和专利申请完整收入本文。根据本公开文本，无需过度实验就能做出和执行本文中所公开的和要求保护的所有组合物和方法。虽然已经在优选实施方案方面描述了本发明的组合物和方法，但是对本领域技术人员会显而易见的是，可以对本文所述组合物和方法，及所述方法的各步骤或各步骤的顺序进行改变而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体的说，会显而易见的是，在化学和生理学这两方面相关的某些试剂可以替代本文所述药剂，而会实现相同或相似的结果。认为对本领域技术人员显而易见的所有此类相似替代和修改在本发明的精神、范围和概念内，它们由所附权利要求限定。

序列表

人miRNA	成熟miRNA序列	SEQ ID NO：
			hsa-let-7a	5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’	1
hsa-let-7b	5’-UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU-3’	2
			hsa-let-7c	5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU-3’	3
hsa-let-7d	5’-AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU-3’	4
			hsa-let-7e	5’-UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU-3’	5
hsa-let-7f	5’-UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU-3’	6
			hsa-let-7g	5’-UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU-3’	7
hsa-let-7i	5’-UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU-3’	8
			hsa-miR-15b	5’-UAGCAGCACAUCAUGGU UUACA-3’	9
hsa-miR-21	5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’	10
			hsa-miR-199a	5’-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3’	11
hsa-miR-199b-5p	5’-CCCAGUGU UUAGACUAUCUGU UC-3’	12
			hsa-miR-199b-3p	5’-ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA-3’	13
hsa-miR-214	5’-ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU-3’	14
			hsa-miR-10a	5’-UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG-3’	15
hsa-miR-10b	5’-UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG-3’	16
			hsa-miR-16	5’-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3’	17
hsa-miR-146a	5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3’	18
			hsa-miR-146b-5p	5’-UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU-3’	19
hsa-miR-146b-3p	5’-UGCCCUGUGGACUCAGUUCUGG-3’	20
			hsa-miR-221	5’-AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC-3’	21
hsa-miR-222	5’-AGCUACAUCUGGCUACUGGGU-3’	22
			hsa-miR-497	5’-CAGCAGCACACUGUGGUUUGU-3’	23
hsa-miR-20a	5’-UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG-3’	24

人miRNA	成熟miRNA序列	SEQ ID NO：
			hsa-miR-20b	5’-CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG-3’	25
hsa-miR-93	5’-CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG-3’	26
			hsa-miR-101	5’-UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3’	27
hsa-miR-126	5’-UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG-3’	28
			hsa-miR-30a	5’-UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG-3’	29
hsa-miR-30b	5’-UGUAAACAUCCUACACUCAGCU-3’	30
			hsa-miR-30c	5’-UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC-3’	31
hsa-miR-30d	5’-UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG-3’	32
			hsa-miR-30e	5’-UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG-3’	33
hsa-miR-143	5’-UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3’	34
			hsa-miR-145	5’-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3’	35
hsa-miR-150	5’-UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG-3’	36
			hsa-miR-29a	5’-UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA-3’	37
hsa-miR-29b	5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’	38
			hsa-miR-29c	5’-UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA-3’	39
hsa-miR-34a	5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’	40
			hsa-miR-34c-5p	5’-AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC-3’	41
hsa-miR-34c-3p	5’-AAUCACUAACCACACGGCCAGG-3’	42
			hsa-miR-574-5p	5’-UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU-3’	43
hsa-miR-574-3p	5’-CACGCUCAUGCACACACCCACA-3’	44
			hsa-miR-451	5’-AAACCGUUACCAUUACUGAGUU-3’	45
hsa-miR-499	5’-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3’	46
			hsa-miR-100	5’-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3’	47
hsa-miR-378	5’-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG-3’	48
			hsa-miR-24	5’-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3’	49
hsa-miR-379	5’-UGGUAGACUAUGGAACGUAGG-3’	50
			hsa-miR-762	5’-GGGGCUGGGGCCGGGGCCGAGC-3’	51
hsa-miR-335	5’-UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU-3’	52
			hsa-miR-711	5’-GGGACCCAGGGAGAGACGUAAG-3’	53

人miRNA	成熟miRNA序列	SEQ ID NO：
			hsa-miR-149	5’-UCUGGCUCCGUGUCUUCACUCCC-3’	54
hsa-miR-218	5’-UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU-3’	55
			hsa-miR-181a	5’-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3’	56
hsa-miR-181b	5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU-3’	57
			hsa-miR-181c	5’-AACAUUCAACCUGUCGGUGAGU-3’	58
hsa-miR-181d	5’-AACAUUCAUUGUUGUCGGUGGGU-3’	59
			hsa-miR-22	5’-AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU-3’	60
hsa-miR-185	5’-UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA-3’	61

参考文献

将下列参考文献明确通过提及收入本文，到它们提供对本文所列补充性的例示性规程或其它详情的程度。

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Claims (17)

1.一种在有此需要的受试者中治疗或预防心肌梗死、心脏重塑、或心力衰竭的方法，包括调控表3-6中所列的一种或多种miRNA在所述受试者的心脏细胞中的表达或活性。

2.权利要求1的方法，其中所述一种或多种miRNA选自下组：let-7家族成员、miR-15b、miR-21、miR-199a、miR-199b、miR-214、miR-10a、miR-10b、miR-16、miR-146a、miR-146b、miR-221、miR-222、miR-497、miR-20a、miR-20b、miR-93、miR-101、miR-126、miR-30家族成员、miR-143、miR-145、miR-150和miR-29a-c。

3.权利要求2的方法，其中调控包括对所述受试者施用选自下组的一种或多种miRNA的抑制剂：let-7家族成员、miR-15b、miR-21、miR-199a、miR-199b、miR-214、miR-10a、miR-10b、miR-16、miR-146a、miR-146b、miR-221、miR-222、miR-30家族成员、和miR-497。

4.权利要求3的方法，其中所述一种或多种miRNA的抑制剂是反义寡核苷酸或微小RNA拮抗剂(antagomir)。

5.权利要求4的方法，其中所述反义寡核苷酸包含与所述一种或多种miRNA的成熟序列至少部分互补的序列。

6.权利要求4的方法，其中所述反义寡核苷酸包含至少一处糖和/或主链修饰。

7.权利要求4的方法，其中所述反义寡核苷酸的长度为约8至约18个核苷酸。

8.权利要求2的方法，其中调控包括对所述受试者施用选自下组的一种或多种miRNA的激动剂：miR-20a、miR-20b、miR-93、miR-101、miR-126、miR-143、miR-145、miR-150、miR-29a、miR-29b、和miR-29c。

9.权利要求8的方法，其中所述一种或多种miRNA的激动剂是包含所述一种或多种miRNA的成熟序列的多核苷酸。

10.权利要求9的方法，其中所述激动剂是自表达构建体表达的。

11.权利要求3或8的方法，其中通过静脉内施用或者直接注射入心脏组织来对所述受试者施用所述抑制剂或激动剂。

12.权利要求3或8的方法，其中通过口服、经皮、持续释放、受控释放、延迟释放、栓剂、导管或舌下施用来对所述受试者施用所述抑制剂或激动剂。

13.权利要求1的方法，其进一步包括对所述受试者施用第二心脏疗法。

14.权利要求13的方法，其中所述第二疗法选自下组：β阻断剂、肌力药(ionotrope)、利尿药、ACE-I、AII拮抗剂、BNP、Ca⁺⁺阻断剂、内皮缩血管肽受体拮抗剂、或HDAC抑制剂。

15.权利要求1的方法，其中梗死区中的纤维化在调控一种或多种miRNA后降低。

16.权利要求1的方法，其中梗死区中的凋亡在调控一种或多种miRNA后降低。

17.权利要求1的方法，其中所述受试者是人。

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