CN109862914A

CN109862914A - 微核糖核酸let-7及转化生长因子β第三类受体调控轴作为心脏损伤靶标的用途

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Publication number: CN109862914A
Application number: CN201780061009.5A
Authority: CN
Inventors: 谢清河; 陈贞云; 郑宇哲
Original assignee: Academia Sinica
Current assignee: Academia Sinica
Priority date: 2016-09-30
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2019-06-07
Also published as: US11246883B2; TWI654996B; TW201815416A; US20190275070A1; WO2018064515A1

Abstract

本发明提供一种改善心脏损伤(如心肌梗塞)的方法，其藉由促进微核糖核酸let‑7的活性、或者抑制转化生长因子β第三类受体(transformation growth factor beta receptor III,TGFBR3)的活性所达成。本发明另提供一种测量生物样品内TGFBR3含量、微核糖核酸let‑7的含量、或两者的检测方法。

Description

微核糖核酸let-7及转化生长因子β第三类受体调控轴作为心脏损伤靶标的用途

相关申请

本案主张于2016年9月30日提交美国临时申请号62/402,255的权益，其全部内容并入本文作为参考。

发明背景

心脏损伤可由阻断正常心肌细胞膜的完整性所导致。目前可藉由侦测多种生物性代谢物、微核糖核酸(micro-ribonucleic acid，miRNA)、及蛋白质(例如：肌钙蛋白(troponin)、mir-1、mir-133a/b、mir-499a、miR-22、miR-101、miR-103和miR-199a-3p、肌氨酸激酶(creatine kinase)、肌红素(myoglobin)、心脏型脂肪酸结合蛋白(heart-typefatty acid binding protein)、及/或乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase))来判定心肌细胞膜的完整性缺失。

心脏损伤可能由创伤、毒素和病毒感染所引起。最常见的心脏损伤为心脏缺血或心肌梗塞，其由氧气(及营养物)供需失衡所导致。

由冠状动脉阻塞所引起的心肌梗塞(Myocardial infarction，MI)是全球性的主要死因之一。可用多种生物标记(例如肌钙蛋白(Troponin)和脑利钠激素(BNP))来评估心肌梗塞后的心脏功能。然而，肌钙蛋白虽然可于发病14天内侦测到，但其表达高峰值仅在3天内显现，因此难以评估疾病的发展(参考Morrow et al.Circulation,115(13):e356-375；2007)。需结合多种标记来协助心脏损伤的诊断。

发明内容

本发明提供一种治疗心脏损伤的方法，包括：对一有需要的个体投予有效量的let-7促进剂或转化生长因子β第三类受体(transformation growth factor betareceptor III,TGFBR3)抑制剂。在部分实施方式中，心脏损伤包括心肌梗塞(myocardialinfarction)、急性冠状动脉综合症(acute coronary syndrome)、心肌炎(myocarditis)、心肌病变(cardiomyopathy)、术后损伤(post-operation injury)、或其组合。

在部分实施方式中，TGFBR3抑制剂可为：一结合至TGFBR3的抗体、或一抑制TGFBR3表达的干扰核糖核酸(interfering ribonucleic acid，RNAi)。此种抗体可与糖基化的TGFBR3作专一性结合，例如：与TGFBR3的N端抗原表位(epitope)作专一性结合，其中TGFBR3可经过糖基化处理。在部分实施方式中，抗体结合至TGFBR3的穿膜质区(transmembrane-cytoplasmic region)，例如结合至SEQ ID NO:2。本揭示内容方法中使用的抗体可为一全长抗体或其抗原结合片段。或者或再者，该抗体为一人类抗体、一人源化抗体、一嵌合抗体、或一单链抗体。

在部分实施方式中，本揭示内容方法中所使用的抗-TGFBR3抗体结合至与抗-RIII-1抗体(将于下文描述5)相同的TGFBR3抗原表位、或该抗-TGFBR3抗体与抗-RIII-1抗体竞争结合至TGFBR3。在部份实例中，抗-TGFBR3抗体包括与抗-RIII-1抗体相同的一重链互补决定区(complementary determining regions,CDRs)及/或一轻链互补决定区(CDRs)。在一实施方式中，抗-TGFBR3抗体包括与抗-RIII-1抗体相同的重链变异区(V_H)及/或轻链变异区(V_L)；该重链变异区的氨基酸序列为SEQ ID NO:95，而该轻链变异区的氨基酸序列为SEQ ID NO:96。

在部分实施方式中，let-7促进剂为一let-7核酸，此类核酸可包括SEQ ID NO:94的核苷酸序列。在另一实施方式中，let-7促进剂可为一Lin28抑制剂。

在本揭示内容本文所述的任何方法中，待治疗的个体可为一具有心脏损伤或可能具有心脏损伤的人类患者；其中心脏损伤如上所述。在部分实施方式中，该个体为一具有心肌梗塞或可能具有心肌梗塞的人类患者。在部分实施方式中，与一没有心脏损伤的个体相比，前述个体可具有增高的TGFBR3含量、降低的let-7含量、或同时具有两者。

在本文所述的本揭示内容任何方法中，该let-7促进剂及/或该TGFBR3抑制剂透过一全身性路径或一局部性路径输送，例如心肌内注射或冠状动脉内注射。

本揭示内容的另一方面，提供一种测量生物样品内TGFBR3存在的方法。该方法可包括：(i)提供一可能含有TGFBR3的生物样品；(ii)将该生物样品与一抗体接触，该抗体与一切割型(cleaved form)TGFBR3结合，该切割型TGFBR3可为SEQ ID NO:3的氨基酸序列，以形成抗体与该切割型TGFBR3的复合体；(iii)以该复合体的含量为基准，测量该生物样品内的切割型TGFBR3的含量；以及(iv)判定该生物样品内为存在TGFBR3或不含TGFBR3。在部分实施方式中，本揭示内容的任何检测方法中所使用的抗体可与糖基化的SEQ ID NO:3序列作专一性结合。该抗体可与SEQ ID NO:3的序列的N端抗原表位结合。该抗原表位可经过糖基化处理。

该生物样品可来自一可能具有心脏损伤的人类个体。此类生物样品可为一血清样品或一血浆样品。

本揭示内容的任何检测方法中，可更包括：测量该生物样品内的let-7含量。或者或再者，该方法可更包括：基于该生物样品内的切割型TGFBR3的含量、let-7的含量、或两者，以评估该生物样品的来源个体是否具有心脏损伤或具有心脏损伤的风险。若判定该个体具有心脏损伤或具有心脏损伤的风险，可对该个体进行一心脏损伤疗法。

本揭示内容的范围中，亦包括：(i)用于治疗于本文所述心脏损伤的医药组合物，其中该医药组合物包括：一TGFBR3抑制剂、一let-7促进剂、或两者；以及一药学上可接受的载体。(ii)TGFBR3抑制剂或let-7促进剂任一者于制备治疗心脏损伤药物上的用途。

下列叙述详细记载本发明的一个以上实施方式，由附加图示和多个实施方式的详细说明，再参照依附的申请专利范围，可明显推知本发明的其他特征和优点。

图式简单说明

图1绘示早期心肌梗塞所对应的miRNA let-7a及let-7f。A小图为实验设计：对猪体进行左前下行(left anterior descending,LAD)冠状动脉结扎1、2、及4小时；从梗塞组织和远程组织两处抽取核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)，进行次世代测序(next-generation sequencing,NGS)。B小图为猪组织的终端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，Tunel)染色结果，其展现在心肌梗塞(MI)后24小时(图示中以H或h表示，以下其余图示均同)心脏梗塞区域的凋亡细胞；比例尺：100毫米。C小图至G小图为茎环定量聚合酶链反应(Stem-loopqPCR)的结果，其绘示在猪心脏心肌梗塞(MI)发生1、2、4及24小时(另有假手术组(以sham表示)1、24小时)之后检测miRNA的表达情形；I/R比率是指梗塞区域对远程区域的miRNA表达量比值；远程区域作为每一猪体个别的内部控制组；在心脏梗塞后24小时，miRNA let-7a.f、miR-101、miR-103及miR199a-3p显著下调，miR-22则从心脏梗塞后4小时开始下调。H小图为以TaqMan为探针的定量聚合酶链反应(qPCR)结果，检测猪心脏中let-7a及let-7f表现情形。I小图为三只个别猪体中猪心脏远程区域的次世代测序结果，其绘示let-7家族的表现情形；TPM：每百万次的转录数(transcripts per million)。J小图：在心脏梗塞后24小时，于梗塞区域和远程区域相较于U6的let-7a及let-7f表达量。K小图：在小鼠模式中心脏梗塞1天(1D)及2天(2D)后发现let-7a及let-7f的下调现象。

图2为验证let-7靶标基因的结果。A小图是靶标基因验证的方式；从同时有心脏RISC-seq数据库验证及TargetScan 6.0预测的188个基因中筛选出29个基因。B小图至E小图为于初生大鼠心肌细胞转染let-7a及let-7f抑制剂后的潜力靶标基因表现结果；柱状条和误差线是指三个独立实验下的平均值和标准偏差(SEM)。F小图至G小图为Western Blot法结果，其展现初生大鼠心肌细胞转染let-7a及let-7f抑制剂后的Hmga2和Tgfbr3表达量。H小图至J小图则分别展现在心脏梗塞后24小时猪心脏的HMGA2、TGFBR1及TGFBR3的RNA表达量。K小图为在心脏梗塞后24小时猪心脏的初代let-7a.f转录表达量。L小图显示为在心脏梗塞后24小时猪心脏的LIN28A表达量；I/R比率是指梗塞区域对远程区域的RNA表达量比值。M小图为Western Blot法结果图，其分别展现在猪体梗塞及远程组织中的TGFBR3、TGFBR1及HMGA2表达量。N小图为猪体梗塞组织中对HMGA2及TGFBR3的免疫化学染色结果图。O小图为在心脏梗塞后24小时，猪体梗塞心脏组织中对TGFBR3及心肌肌钙蛋白T(troponinT)的免疫荧光染色结果图；TGFBR3表达于心肌细胞中。

图3为Tgfbr3透过p38MAPK来诱发心肌细胞凋亡的结果。A小图为在初生大鼠心肌细胞中腺病毒调控Hmga2及Tgfbr3的表达情形；转染后1天收集细胞，经切割的LC3B是自噬体指标品且经切割的(活化的)凋亡蛋白酶3(caspase3)是代表细胞凋亡。B小图为在剂量依赖性Tgfbr3表达下的Smad2及p38MAPK信号活化情形；MOI：感染多重性(multiplicity ofinfection)。C小图为在初生大鼠心肌细胞中，以p38MAPK抑制剂SB239063处理后，可部分回复Tgfbr3所诱发的细胞凋亡的结果；细胞以腺病毒感染1天，然后于培养液中添加SB239063再处理1天。D小图：以心肌内注射腺病毒(该病毒携带GFP和Tgfbr3)至小鼠心脏作用2天，从心脏组织中萃取出蛋白质，Tgfbr3过量表达会引发p38MAPK活化。E小图：在初生大鼠心肌细胞中，利用慢病毒(lentivirus)介导强诱饵(Tough Decoy，TuD)RNA抑制let-7的表达，以增进因血清及葡萄糖耗竭所引起的细胞凋亡现象；细胞以慢病毒感染并利用嘌呤霉素(puromycin)筛选1周，待回复4天后，从培养液中移除血清和葡萄糖后再培养1天，去除血清和葡萄糖1天后收集细胞。F小图为心肌梗塞活化p38MAPK活性的结果；从心肌梗塞后2天的小鼠心脏中萃取远程区域和梗塞区域的蛋白质。G小图为在H9C2细胞株中，去除血清后诱发p38MAPK活化的结果。

图4显示为let-7过量表达和Tgfbr3抑制能回复血清去除所引发的细胞凋亡。A小图至B小图绘示去除血清24小时的下调let-7表达以及慢病毒介导let-7过量表达，呈现出let-7显著增加；柱状条和误差线是指三个独立实验下的平均值和标准偏差(SEM)。C小图：藉由次G1(subG1)的分析得知，去除血清24小时后会诱发细胞凋亡，然let-7过量表达能回复此现象；柱状条和误差线是五个独立实验下的平均值和标准偏差(SEM)。D小图至F小图为血清去除及let-7过量表达下的Tgfbr3、Hmga2、及Tgfbr1表达量；let-7表现显著抑制Tgfbr3、Hmga2、及Tgfbr1的表达；血清去除诱发Tgfbr3和Tgfbr1表达；在去除血清下let-7过量表达能够抑制Tgfbr3的增加量；柱状条和误差线是四个独立实验下的平均值和标准偏差(SEM)。G小图为let-7表达能够回复无血清所诱发的凋亡蛋白酶3活化的结果。H小图展现let-7表达可抑制经去除血清所诱发的Tgfbr3。I小图为流式细胞仪的结果图，其展现经短发夹核糖核酸(short hairpin ribonucleic acid，shRNA)调控的Tgfbr3基因减量(knockdown)细胞中所减少的subG1数量；柱状条和误差线是三个独立实验下的平均值和标准偏差(SEM)。J小图为Western Blot法的结果，展现在血清去除的压力下，Tgfbr3基因减量能够降低p38MAPK和经切割凋亡蛋白酶3的活化。

图5为循环性let-7及TGFBR3对应心肌梗塞的结果。A小图至D小图绘示：经LAD结扎1周后的猪血浆中，let-7a及let-7f为显著下调；于心肌梗塞之前、心肌梗塞之后24小时及1周后收集血浆样品；Cel-mir-39RNA用作为探针式控制组(spike-in control)。E小图及F小图：在25名急性心肌梗塞病患中，相较于9名健康受试者，人类血浆的let-7a及let-7f为显著下调。G小图及H小图则展现出，心肌梗塞24小时后及1周后，透过酶联免疫测定法(ELISA)可测量出猪血浆TGFBR3表达量显著上调。

图6为在人类及小鼠心脏中，心脏发展期间的miRNA let-7表达以及let-7家族含量的结果。A小图为猪体的左前下行动脉(LAD)结扎手术；箭号所指为结扎处且箭头所指为结扎后的梗塞区域。B小图为手术后评估所测量的心电图(Electrocardiogram，EKG)。C小图为茎环定量聚合酶链反应结果，显示在小鼠心脏发展期间的Let-7a.f表达；柱状条和误差线指平均值和标准偏差(SEM)(n≧3)。D小图及E小图为根据NGS数据库所得的人类及小鼠心脏中的let-7家族的表达(参考Meunier et al,Genome Res23,34-45(2013))。

图7为let-7a及let-7f靶标基因的扫描结果。根据心脏RISC(RNA引发的静默复合物(RNA-induced silencing complex))测序及TargetScan挑选出29个基因，Hmga2用作为正控制组；let-7a及let-7f抑制剂短暂转染至初生大鼠心肌细胞，转染后1天收集其RNA；柱状条和误差线指三个以上独立实验的平均值和标准偏差(SEM)。

图8为TuD RNA抑制let-7a及let-7f表达以及对Tgfbr3表达去除抑制作用的结果图。以携带TuD RNA的慢病毒感染初生大鼠心肌细胞，待抗生素筛选以后，移除未感染的细胞，萃取出RNA和蛋白质之后，进行TaqMan qPCR和Western Blot法分析。A小图绘示为TuDRNA表达会抑制let-7a(n＝2)。B小图绘示TuD RNA表达抑制let-7f(n＝2)。C小图绘示TuDRNA表达后能够增加Tgfbr3表达量。

实施方式

急性心肌梗塞起因于冠状动脉阻塞，并导致缺血心肌细胞死亡(参考Senter etal.,Cleve Clin J Med 76,159-166(2009))。本研究利用次世代测序(next-generationsequencing，NGS)，在猪的心肌梗塞模式中证实微核糖核酸(miRNA)let-7(例如let-7a和let-7f)为显著效应子(effector)。虽然let-7为早期发现的miRNA中之一者，含量丰富且在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)至哺乳动物上皆可观察到(参考Roush et al.,Trends Cell Biol 18,505-516(2008))，然而对于let-7在心肌梗塞中的功能却知之甚少。此外，本研究显示let-7的下游基因TGFBR3以及let-7的潜在功能。令人惊艳的是，在血浆let-7及TGFBR3两者皆发现到对心肌梗塞的反应。这些结果指出miRNA let-7/TGFBR3调控轴在心脏损伤(如心肌梗塞)上扮演重要角色，故而推测let-7及TGFBR3，单独一者或两者，皆可做为心脏损伤的治疗及诊断/预测两者的可靠疾病靶标。

据此，本发明提供一种治疗心脏损伤的方法，其藉由阻断TGFBR3活性及/或促进let-7活性；另提供一种测量生物样品内TGFBR3及/或let-7含量的检测方法，由此检测方法中得到的结果可用于多种目的，包含评估心脏损伤的存在及/或风险。

I.治疗心脏损伤

本揭示内容提供一种治疗心脏损伤的方法，该方法包括：将有效量的TGFBR3抑制剂、let-7促进剂或其的组合注入一有需要的个体。

(A)TGFBR3抑制剂

TGFBR3，亦称为β聚糖(betaglycan)，为一种膜蛋白聚糖，其透过肝素硫酸盐链进而结合至配体TGF-β超家族的多种成员，常作为TGF-β超家族成员的辅助受体(coreceptor)。TGFBR3参与滑膜纤维母细胞(synovial fibroblasts)的细胞凋亡路径和G蛋白偶连受体(GProtein-Coupled Receptors,GPCR)路径，TGFBR3蛋白和基因编码来自本技术领域中已知的合适品种(例如人类、大鼠、小鼠及猪)。举例来说，实验例用的人类TGFBR3蛋白和基因序列可在GenBank数据库编号Nos.Q03167及XM_006710868.2中找到，相关的揭露内容并入本文作为参考。

例示性成年人类TGFBR3，其氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO:1)：

C端的斜体字部分指的是穿膜质区(transmembrane-cytoplasmic domain)(SEQID NO:2)，以及N端粗体字部分指的是细胞外区域(SEQ ID NO:3)。

本揭示内容方法使用的TGFBR3抑制剂(TGFBR3inhibitors)是能够阻断、抑制、或减少(包含显著阻断、抑制或减少))TGFBR3的生物活性，包含经TGFBR3调控的下游路径。「抑制剂」(inhibitor)一词没有限制于特定生物作用的机制，而是表示包括所有可能与TGFBR3直接或间接有关的药学、生理学和生化学交互作用。就本发明的目的而言，可清楚了解「抑制剂」一词(包含先前记载的所有名词、标题、及功能性状态与特性)，指对TGFBR3本身(例如人类TGFBR3)、TGFBR3生物活性(包含但不限于：调节心肌细胞死亡的能力)、或生物活性的序列，以任何有意义程度上(例如至少20％、50％、70％、85％、90％、100％、150％、200％、300％、或500％、或10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、或10⁴倍)进行实质无效化、降低、或中和。

TGFBR3抑制剂的例子包括但不限于：抗-TGFBR3抗体、导向TGFBR3的反义(antisense)核酸(包含：导向「能编码出TGFBR3的核酸」的反义核酸)、导向TGFBR3核酸的小分子干扰核糖核酸(small interfering ribonucleic acid，siRNA或RNAi)、导向TGFBR3核酸的miRNA、TGFBR3核酸适体(aptamer)、或TGFBR3抑制性化合物。

结合至TGFBR3的抗体

在部分实施方式中，TGFBR3抑制剂为结合至TGFBR3的抗体，其抑制TGFBR3生物活性及/或TGFBR3信号调控的下游路径。在部分实施方式中，用于本发明方法中的抗-TGFBR3抗体，抑制TGFBR3相关的信号路径至少20％、至少40％、至少50％、至少75％、至少90％、至少100％、或至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。在部分实施方式中，抗-TGFBR3抗体结合至TGFBR3的胞外区域(例如SEQ ID NO:3)。在其他实施方式中，抗-TGFBR3抗体结合至TGFBR3的穿膜质区内位置(例如SEQ ID NO:2)。

抗体是一种免疫球蛋白分子，能够透过位于免疫球蛋白分子的变异区的至少一抗原辨识位置，进而专一性结合至靶标(例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)。在此使用的「抗体」(antibody)一词不仅包括完整的(即：全长)多克隆或单克隆抗体，亦包括其抗原结合片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv)、单链(scFv)、其变异体、融合蛋白(具有抗体部分)、人源化抗体、嵌合抗体、双链抗体(diabodies)、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及任何他种具有所需专一性抗原辨识位置的免疫球蛋白分子的修饰构型，包括抗体的糖基化变异体、抗体的氨基酸序列变异体、及经共价修饰的抗体。「抗体」包含所有层级的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA、或IgM(或其次单位)，且不需限定至任一特定层级。根据抗体重链稳定区(constant domain)的氨基酸序列，免疫球蛋白可区分成不同层级。免疫球蛋白有五种主要层级：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，且这些当中多数可再进一步分成次单位(亚型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。重链稳定区对应至免疫球蛋白的不同层级，分别称为α、δ、ε、γ及μ。免疫球蛋白的不同层级的次单位结构和三维构型皆为已知。

本发明所述方法中使用的抗体可为小鼠、大鼠、人类、或其他来源(包含嵌合抗体或人源化抗体)。在部分实施方式中，抗体包含经修饰的稳定区，例如呈免疫惰性(immunologically inert)的稳定区，例如：不会启动补体介导的溶解作用、或不会激发抗体依赖型细胞调控的细胞毒杀性(antibody-dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC)。可利用美国专利号5,500,362案件中所揭露的方法来检测ADCC活性。在其他实施方式中，稳定区可修饰成下列参考文件：文献Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624、国际专利申请号PCT/GB99/01441、及/或英国专利申请号9809951.8中所述者。

本揭示内容的任何抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体其中一者。「单克隆抗体」(monoclonal antibody)指的是同源抗体群集，以及「多克隆抗体」(polyclonal antibody)指的是异种抗体群集。这两种名词不会限制抗体来源或其制备方式。

在一实施方式中，本发明所述方法中使用的抗体为人源化抗体。人源化抗体指非人类(例如小鼠)的抗体型式，其为专一嵌合性免疫球蛋白、免疫球蛋白链、或其抗原结合片段(包含来自非人类免疫球蛋白的最小序列)。一般而言，人源化抗体为人类免疫球蛋白(受体抗体(recipient antibody))，其中受体的互补决定区(complementary determiningregion，以下以CDR称之)部分由非人类物种(供体抗体(donor antibody))的CDR所取代，非人类物种可举例如：具有所需专一性、亲和力及容载力的小鼠、大鼠、或兔子。在部分例子中，人类免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)部分由对应的非人类部分取代。此外，人源化抗体可不包括从受体抗体中或引入CDR或骨架序列中所发现的部分，而是包含能够进一步提升及优化抗体性能的部分。通常，人源化抗体包括实质上全部的变异区，变异区至少为一个、且常见为两个。全部或实质上全部的CDR区对应至这些非人类免疫球蛋白，且全部或实质上全部的FR区为这些人类免疫球蛋白的共通序列(consensus sequence)。人源化抗体也可包含：至少一部分免疫球蛋白稳定区或结晶区域片段(Fragment crystallizable region,以下以Fc称之)，免疫球蛋白一般为人类的免疫球蛋白。抗体可具有经修饰的Fc区域(如WO 99/58572所述)。其他种的人源化抗体具有一个以上(一个、两个、三个、四个、五个、或六个)的CDR，其根据原始抗体而变化，也可以说是一个以上的CDR「衍生自」(derived from)原始抗体的一个以上CDR。人源化抗体亦可参予亲和力成熟(affinity maturation)过程。

在另一实施方式中，本揭示内容抗体为嵌合抗体，其可包括来自人类抗体的重链稳定区和轻链稳定区。嵌合抗体指抗体具有：来自第一种源的变异区或部分变异区、以及来自第二种源的稳定区。一般而言，这些嵌合抗体中，轻链与重链两者的变异区是衍生自一种哺乳动物(例如非人类哺乳动物，如小鼠、兔子、及大鼠)抗体的变异区，并且稳定区与来自另一哺乳动物(如人类)的抗体序列同源。在部分实施方式中，可对于变异区及/或稳定区的氨基酸进行修饰。

本揭示内容的抗体可专一性结合至靶标或抗原表位(epitope)，例如人类TGFBR3。抗体「专一性结合」(specifically bind)至靶标或抗原表位为本技术领域中已熟知的用词，且用来判定此种「专一性结合」的方法亦为本技术领域中所熟知。当分子与特定靶标抗原比其他靶标能够更频繁、更快速地反应或连结，且能持续一段时间及/或具有较佳的亲和力，即称为展现「专一性结合」的分子。若抗体结合至靶标抗原时，相较于结合至其他物质能具有较佳的亲和力、结合力、更快速、及/或更长的持续时间，即称该抗体「专一性结合」至该抗原靶标。例如，抗体专一性(或优先)地结合至TGFBR3抗原表位，即为该抗体结合至该TGFBR3抗原表位时，相较于其他TGFBR3抗原表位或非TGFBR3抗原表位，能具有较佳的亲和力、结合力、更快速、及/或具有更长的持续时间。参阅此定义亦能了解，例如：抗体专一性结合至第一靶标抗原，可以或不可以专一地或优先地结合至第二靶标抗原。因此，「专一性结合」或「优先性结合」(preferential binding)并非绝对必需是(虽然可包含)排他性的结合。通常提到结合表示优先性结合，但本发明不限于此。

在部分实施方式中，本揭示内容的方法使用的抗体可专一性结合至膜连型(membrane-bound)TGFBR3。此种抗体能够辨识并结合至细胞(表达此受体)表面显露的TGFBR3抗原表位。在部分实施方式中，本揭示内容的方法使用的抗-TGFBR3抗体可专一性结合至TGFBR3的胞外区域，例如SEQ ID NO:3。在其他实施方式中，本揭示内容本方法使用的抗-TGFBR3抗体可专一性结合至TGFBR3的穿膜质区，例如SEQ ID NO:2。另一实施方式中，本揭示内容方法使用的抗-TGFBR3抗体可专一性结合至TGFBR3或其糖基化片段。例如，抗体可专一性结合至TGFBR3的N端糖基片段。在部分实施方式中，糖基化作用位置包含但不限于：141氮连结位(GlcNAc...)、369氧连结位、(GalNAc...)、492氮连结位(GlcNAc...)、534氧连结位(Xyl...)(葡萄糖胺聚糖)、545氧连结位(Xyl...)(葡萄糖胺聚糖)、571氮连结位(GlcNAc...)、590氮连结位(GlcNAc...)、及697氮连结位(GlcNAc...)。

抗-TGFBR3抗体对TGFBR3(例如人类TGFBR3)的结合亲和力可少于约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM、或约50pM至约2pM。在部分实施方式中，抗体为人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、或单链抗体。结合亲和力可表示为K_D或解离常数，且增加的结合亲和力对应至下降的K_D。判定抗体对TGFBR3的结合亲和力的一种方法为：测量抗体的单功能Fab片段的结合亲和力。要取得单功能Fab片段，可使用木瓜蛋白酶(papain)切割抗体(例如IgG)或重组表达。抗TGFBR3的Fab片段对抗体的亲和力可由表面电浆共振仪(BIACORE3000^TM surface plasmon resonance(SPR)system,BIAcore,INC,Piscaway N.J.)来判定。求得动力结合速率(k_on)和解离速率(k_off)(一般于25℃测量)，k_off/k_on可计算出平衡解离常数(K_D)值。

在部分实施方式中，抗体结合至人类TGFBR3，且不显著结合至另一哺乳类品种的TGFBR3。在部分实施方式中，抗体结合至人类TGFBR3以及一种或多种其他哺乳类品种的TGFBR3。抗体结合的抗原表位可为连续或不连续的。在部分实施方式中，抗体可与TGFBR3及糖基(glycosyl group)结合。

于此提供抗-TGFBR3抗体的一实施范例，抗-RIII-1，其包括重链变异区(V_H)和轻链变异区(V_L)，其分别具有以下氨基酸序列：

抗-RIII-1V_H的氨基酸序列：

抗-RIII-1V_L的氨基酸序列：

粗体字部分为V_H和V_L的互补决定区。

在部分实施方式中，本揭示内容的抗-TGFBR3抗体结合至与抗-RIII-1抗体相同的抗原表位、或与抗-RIII-1抗体竞争结合至TGFBR3。

当第一抗体结合至靶标化合物上与第二抗体相同的结合位置，或者与第二抗体结合位置重迭(例如50％、60％、70％、80％、90％、或100％重迭，就氨基酸序列或其他分子特征(例如糖基、磷酸酯基或硫酸盐基)来说)的位置，即可称为第一抗体与第二抗体「结合至相同的抗原表位」(bind to the same epitope)。

假使第一结合蛋白与抗原表位的结合会降低结合至抗原表位的第二结合蛋白数量(例如降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或以上)，即为第一抗体与第二抗体「竞争结合」(competes for binding)。竞争可为直接(例如第一抗体结合的抗原表位与第二抗体结合的抗原表位相同或重迭)或间接(例如第一抗体结合至抗原表位引发靶标化合物的立体变化，降低第二抗体结合至抗原表位的可能性)。

在其他的例子中，抗-TGFBR3抗体可包括与本揭示内容抗-RIII-1相同的V_H CDRs及/或V_L CDR。可利用本技术领域中已知的方法检测抗-RIII-1的重链/轻链的氨基酸序列(如上所示)，判定出负责抗原结合的区域。可参考网站www.bioinf.org.uk/abs；或文献Almagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)及Chothia et al.,J.Mol.Biol.227:799-817(1987)。第一抗体具有与第二抗体相同的V_H及/或V_L CDRs表示：利用本技术领域中相同的已知方法，可检测出第一抗体与第二抗体具有相同的对应V_H及/或V_L CDR。

测定抗体中CDR区域的方法是本技术领域所熟知的。至少有两种测定CDRs的方法：(1)基于跨物种序列的变异性的方法(即依照Kabat et al.Sequences of Proteins ofImmunological Interest,(5th ed.,1991,National Institutes of Health,BethesdaMd.)所揭示的方法)；以及(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学的方法(Chothia et al.(1989)Nature 342:877；Al-lazikani et al(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))。于此，可由其中一种方法或综合两种方法来判定CDR。

本发明所揭露的范围内亦包括抗-RIII-1的功能性变异体，其可具有与抗-RIII-1实质上相同的对抗原表位的结合亲和力，并展现出相对于抗-RIII-1，至少20％(例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或以上)的中和TGFBR3活性能力。

在部分实施方式中，抗-RIII-1的功能性变异体包括：V_H链，其包含与抗-RIII-1对应的V_H CDRs具至少75％(例如80％、85％、90％、95％、或98％)相似度的V_H CDR1、V_H CDR2、及V_H CDR3；以及V_L链，其包含与抗-RIII-1对应的V_H CDRs75％具至少(例如80％、85％、90％、95％、或98％)相似度的V_L CDR1、V_L CDR2、及V_L CDR3。或者，抗-RIII-1的功能性变异体包括：与抗-RIII-1的V_H链(成熟体或前驱物)具至少75％(例如80％、85％、90％、95％、或98％)的相似度的V_H链、以及与抗-RIII-1的V_L链(成熟体或前驱物)至少75％(例如80％、85％、90％、95％、或98％)相似度的V_L链。

两氨基酸序列的「相似百分比」(percent identity)，利用Karlin及Altschul发表(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990)，后经Karlin及Altschul修改(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993)的运算法。此种运算法并入NBLAST及XBLAST程序(2.0版)(Altschul et al.J.Mol.Biol.215:403-10,1990)。使用XBLAST程序(分数＝50,字符串长度＝3)进行蛋白质搜寻，得到氨基酸序列与指定蛋白质分子的同源性。两序列之间存在的空缺(gaps)，可利用Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997中所述的Gapped BLAST来处理。当使用及Gapped BLAST程序时，可使用各别程序的默认参数(例如XBLAST及NBLAST)。

在部分实施方式中，抗-RIII-1的功能性变异体包括：V_H链及/或V_L链，在V_H CDR(V_HCDR1、CDR2、及/或CDR3)中包含最多5个(例如1、2、3、4、或5)相较于抗-RIII-1的V_H CDRs的氨基酸基团变异，在V_L CDR(V_L CDR1、CDR2、及/或CDR3)中包含最多5个(例如1、2、3、4、或5)相较于抗-RIII-1的V_L CDRs的氨基酸基团变异。

本揭示内容能够抑制TGFBR3相关序号路径的抗体，可由本技术领域中任何已知方法所制成。例如，可参考Harlow and Lane,(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York。

在部分实施方式中，对靶标抗原(例如人类TGFBR3)呈专一性的抗体可由传统的融合瘤(hybridoma)技术所制备而成。选择性结合至载体蛋白(例如KLH)的全长靶标抗原或其片段，可用于使产生抗体(与抗原结合)的宿主动物免疫化。一般将宿主动物免疫化的路径和流程符合抗体激发和制造所建构的常规技术，下文将进一步说明。一般来说，本文描述用于制造小鼠、人源化、及人类抗体的技术为本技术领域中所熟知的。已知任何哺乳类物种(包含人类)或来自哺乳类物种的抗体产生细胞，可用作为制造哺乳类(包含人类)融合瘤细胞株的基础。一般而言，本揭示内容描述的宿主动物从腹腔内、肌肉内、口内、皮下、足底内及/或皮内注射一定含量的免疫原。

利用Kohler,B.and Milstein,C.(1975)Nature 256:495-497中所述的、或Buck,D.W.,et al.,In Vitro,18:377-381(1982)所修改的常规体细胞杂交技术，由淋巴细胞和永久骨髓瘤细胞可制造出融合瘤。杂交可用的骨髓瘤细胞株包含但不限于：X63-Ag8.653及可购自Salk研究所的细胞分配中心(San Diego,Calif.,USA)。一般而言，常规技术包括：利用本技术领域中通常知识者熟知的融合剂(例如聚乙二醇(polyethylene glycol))或电性方法融合骨髓瘤细胞和淋巴细胞。融合后，从融合液中分离出细胞，并使其于选择性生长培养液(例如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(hypoxanthine-aminopterin-thymidine，HAT)培养液)内生长，用以清除未杂交成功的母细胞。本文的任何培养液(添加或不添加血清)，可用于培养融合瘤，使其分泌单克隆抗体。另一种替代的细胞融合技术，可使用EBV(Epstein-Barr病毒)永久化B细胞来制造本发明的抗TGFBR3单克隆抗体。若有需要，融合瘤可被扩增及次选殖，以及可利用传统的免疫检测流程(例如放射免疫分析法、酶联免疫分析法、或荧光免疫分析法)检测上清液的抗免疫原活性。

可作为抗体的来源的融合瘤包括所有母代融合瘤的衍生物及子代细胞，母代融合瘤可制造出能够干扰TGFBR3相关信号路径的单克隆抗体。利用已知流程，融合瘤制造出的抗体可于体外或体内生长。若有需要，透过传统的免疫球蛋白纯化流程(例如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、层析和超滤)，可将单克隆抗体从培养液或体液中分离出。也可藉由在免疫原贴附至固体制成的吸附剂上执行制备过程，并且从免疫原析出或释出所需抗体，来移除不需要的活性(若存在的话)。藉由双功能或衍生试剂(举例来说：马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(通过半胱氨酸残基共轭)、-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide(透过赖氨酸残基))、戊二醛(glutaraldehyde)、琥珀酸酐(succinic anhydride、SOCl、或R1N＝C＝NR，其中R和R1为不同的烷基)，以靶标抗原或含靶标氨基酸序列的片段共轭至物种内待免疫化的免疫性蛋白质(例如匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白(serum albumin)、牛甲状腺球蛋白(bovinethyroglobulin)、或大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor))对宿主动物进行免疫作用，则可制造出大量抗体(例如单克隆抗体)。

若有需要，可测序所需的(例如由融合瘤所制造的)抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)，且多核苷酸序列可接续被植入载体(vector)用以表达或增殖。编码出所需抗体的序列可保存在宿主细胞的载体中，并且宿主细胞可以接续被扩增及冷冻待未来使用。替代方案是，多核苷酸序列可用于基因操作使抗体「人源化」(humanize)、或提升亲和力(亲和力成熟)或其他抗体性质。例如，稳定区可被改造成与人类稳定区更相似，以防抗体用于临床试验及人类治疗时发生免疫反应。抗体序列可能需要进行基因操作，进而得到对靶标抗原的较佳亲和力、以及在抑制TGFBR3相关信号路径上有更好的效果。本技术领域中具有通常知识者可清楚明白：抗体可进行一个以上的多核苷酸变化，并且仍保持其对靶标抗原的结合专一性。

在其他实施方式中，利用表达特定人类免疫球蛋白的市售基因转殖小鼠，可得到全长人类抗体。设计成可制造更多所需抗体(例如全长人类抗体)或更稳健免疫反应的基因转殖动物，亦可用于产生人源化或人类抗体。此种技术的范例如：Amgen公司的XENOMOUSE^RTM(Fremont,Calif.)以及Medarex公司的HUMAB-MOUSE^RTM与TC MOUSE^TM(Princeton,N.J.)。或者，可透过噬菌体展示技术来重组制造出抗体。例如：可参考美国专利号5,565,332、5,580,717、5,733,743、及6,265,150案件以及文献Winter et al.,(1994)Annu.Rev.Immunol.12:433-455。或者，噬菌体展示技术(McCafferty et al.,(1990)Nature 348:552-553)可将来自未经免疫化供体的免疫球蛋白变异区(V)基因，于体外制造出人类抗体及抗体片段。

可经由常规方法制得完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段。例如，可使用木瓜酶分解抗体分子以制备出F(ab’)2片段，以及还原F(ab’)2片段的双硫键可生成Fab片段。

可透过如传统重组技术制造出基因改造抗体，例如人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、及双特异性抗体。在一实施方式中，能编码出对靶标抗原专一性的单克隆抗体的DNA，可利用传统流程(例如利用寡核苷酸探针，其能专一性结合至编码出单克隆抗体重链及轻链的基因)快速分离出来并测序。融合瘤细胞是这种DMA的较佳来源。一旦分离出来，DNA可置入一个以上的表达载体，在转染到不会额外制造免疫球蛋白的宿主细胞内(如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞)，以得到在重组宿主细胞内合成的单克隆抗体。可参考如国际专利申请号WO 87/04462案件。可对DNA进行后续修饰，例如将人类重链及轻链稳定区的编码序列置换成同源小鼠序列(Morrison et al.,(1984)Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851)，或者共价结合至全部的免疫球蛋白编码序列、或部分非免疫球蛋白多肽的编码序列。在此方式下，基改抗体，例如「嵌合」(chimeric)或「杂交」(hybrid)抗体，可制备成具有结合专一性的靶标抗原。

发展「嵌合抗体」(chimeric antibodies)的技术为本技术领域中所熟知的，参考文献Morrison et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851、Neuberger et al.(1984)Nature 312,604、以及Takeda et al.(1984)Nature 314:452。

建构人源化抗体的方法亦为本技术领域中所熟知的，参考文献Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033(1989)。在一实施方式中，母代非人类抗体的变异区V_H及V_L利用下列本技术领域中已知的方法进行三维分子模型分析。接着，要形成正确的CDR结构，氨基酸的骨架部分相当重要，需利用相同的分子模型分析氨基酸的骨架部分。同时，利用任何抗体基因数据库，以母代V_H及V_L序列进行搜寻，可判定具有氨基酸序列的人类V_H及V_L链与亲代非人类抗体的V_H及V_L链是同源的。然后，接着将人类V_H及V_L受体基因筛选出。

在筛选出的人类受体基因中，CDR可置换成母代非人类抗体的CDR或其功能性变异体。若必要的话，亲链骨架区内的基团对于与CDR的交互作用相当重要(如上所述)，可用于取代人类受体基因中的对应基团。

透过重组技术，将编码出重链变异区的核苷酸序列连接至编码出轻链变异区的核苷酸序列，藉此可制备出单链抗体。较佳为在两个变异区之间插入软性连接剂(flexiblelinker)。或者，在美国专利号4,946,778及4,704,692案件中所述的制备单链抗体技术，可用于制造噬菌体scFv抗体库，以及按照常规程序从数据库中能判定出对TGFBR3专一性的scFv群落。阳性群落(Positive clones)可进一步进行扫描判断其抑制TGFBR3的活性。

依照本技术领域中公知方法及本揭示内容方法得到的抗体，可利用本技术领域中已知的方法来定性。例如，有一种方法是判别抗原结合的抗原表位(或「抗原表位图谱」(epitope mapping))。本技术领域中已知用于定位和定性蛋白质上抗原表位位置的方法很多，其包含解出抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争试验、基因片段表达试验、及合成肽类试验(synthetic peptide-based assays)，如上所述，例如Harlow and Lane第11章(UsingAntibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1999)。在另一实施方式中，可用抗原表位图谱决定抗体结合的序列。抗原表位可为线性抗原表位(即为一简单延伸的氨基酸)、或由氨基酸的三维交互作用所形成的构象抗原表位(conformational epitope)，构象抗原表位不一定是简单延伸的结构(一级结构为线性序列)。可由抗体分离出来或合成多种长度(例如至少4-6个氨基酸长)的肽，且该些肽可用于结合试验。在另一实施方式中，可利用来自靶标抗原序列的重迭肽进行系统扫描并决定抗体的结合，进而判定出抗体结合的抗原表位。根据基因片段表达试验，编码出靶标抗原的开启读码框(open reading frame)可被随机分割或透过特定基因建构来分割，接着再测试判定该表达抗原片段对抗体的反应性。例如，在放射活性氨基酸的存在下，藉由PCR于体外转录及转译出蛋白质，以制造出基因片段。然后，抗体结合至具放射活性标志的抗原片段，可利用免疫沉积法和电泳凝胶法所测定。亦可利用噬菌体颗粒表面上展现的随机肽序列的庞大数据库(噬菌体数据库)确认出精准的抗原表位。或者，也可藉由重迭肽片段的精确数据库来进行简易结合试验以测试其对待测抗体的结合性。在另一实施方式中，可进行抗原结合部分的突变、结构域交换试验(domain swapping experiments)及丙氨酸扫描突变(alanine scanning mutagenesis)来确认抗原表位结合所需的、足够的、及/或必需的基团。举例来说，可利用靶标抗原的突变体来进行结构域交换试验，突变体中多种TGFBR3多肽的片段已置换/交换成一序列极度相近的但抗原性不同的蛋白(例如神经营养素蛋白家族的其他成员)。藉由测定抗体对突变TGFBR3的结合性，可判定出特定抗原片段对抗体结合的重要性。

或者，可利用其他已知结合至相同抗原的抗体来进行竞争试验，藉此决定抗体是否结合至与其他抗体相同的抗原表位。本技术领域中具有通常知识者已熟知竞争试验。

其他TGFBR3抑制剂

本揭示内容的方法可使用前述能够干扰TGFBR3信号路径的抗体以外的其他TGFBR3抑制剂。

在本发明部分实施方式中，TGFBR3抑制剂包括至少一个反义核酸分子，其能够阻断或减少功能性TGFBR3表达。TGFBR3的核苷酸序列为本技术领域中已知的。根据常规方法制备出能够专一性结合靶标传讯核糖核酸(messanger ribonucleic acid，mRNA)而不会与其他多核苷酸交叉反应的反义寡核苷酸分子。靶标位置的范例包含但不限于：起始密码子、5’调控区、密码序列及3’非转译区。在部分实施方式中，寡核苷酸的长度为约10至100个核苷酸、约15至50个核苷酸、约18至25个核苷酸、或更长。寡核苷酸可包括主干修饰，例如本技术领域中已知的硫代磷酸化(phosphorothioate)连结键、及2’-O端糖修饰。

或者，利用本技术领域中已知的方法，如基因减量、吗啉寡核苷酸(morpholinooligonucleotides)、siRNA或RNAi、miRNA或核糖酶(ribozymes)，以减少TGFBR3表达及/或释放。RNA干扰(RNAi)的过程中，双链核糖核酸(double-stranded RNA，dsRNA)直接被mRNA进行同源的专一序列降解。在哺乳类细胞中，无需活化宿主的干扰素反应便可利用siRNA的21个核苷酸双链体启动RNA干扰。本揭示内容方法中使用的dsRNA可为siRNA(含两个分开的互补RNA链)或短发夹(short hairpin)RNA(即形成紧密发夹结构的RNA链)，两种都可以基于靶标基因序列来设计。或者，也可以是miRNA。

非必要性地，本揭示内容方法中使用的核酸分子(例如反义核酸、siRNA或miRNA)可选择包含非自然发生的核碱基、糖类或共价性核苷酸间连结键(主干)。此种经修饰的核苷酸赋予所需的性质，例如提高细胞摄入量、增强对靶标核酸的亲和力、以及增加体内稳定性。

在一实施方式中，核酸具有经修饰的主干，包含保留磷原子(例如参考美国专利号3,687,808、4,469,863、5,321,131、5,399,676、及5,625,050)以及不具有磷原子(例如参考美国专利号5,034,506、5,166,315、及5,792,608)。含磷修饰主干的例子包含但不限于：硫代磷酸酯(phosphorothioates)、手性硫代磷酸酯(chiral phosphorothioates)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioates)、磷酸三酯(phosphotriesters)、氨烷基-磷酸三酯(aminoalkyl-phosphotriesters)、甲基和其他烷基膦酸酯(alkyl phosphonates)(包含3’-亚烷基磷酸酯、5’-亚烷基磷酸酯及手性磷酸酯)、亚磷酸盐(phosphinates)、磷酰胺酯(phosphoramidates)(包含3’-氨基磷酰胺酯及氨烷基磷酰胺酯)、硫代磷酰胺酯(thionophosphoramidates)、硫代烷基膦酸酯(thionoalkylphosphonates)、硫代烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriesters)、硒代磷酸酯(selenophosphates)和硼烷磷酸酯(boranophosphates)(具有3’-5’连结键或2’-5’连结键)。此种主干亦包含具有相反极性者，即3’至3’、5’至5’或2’至2’连结键。可透过短链烷基或环烷基的核苷酸间连结键、混合杂原子及烷基或环烷基的核苷酸间连结键、或一个以上短链杂原子或杂环的的核苷酸间连结键以形成不包含磷原子的经修饰主干。此种主干包含具有吗啉(morpholino)连结键(生成在核苷酸的糖部)者；硅氧烷主干；硫化物、亚砜(sulfoxide)及砜(sulfone)主干；甲酰基(formacetyl)及硫代甲酰基(thioformacetyl)主干；亚甲基甲酰基及硫代甲酰基主干；核糖乙酰基(riboacetyl)主干；含烯烃主干；氨基磺酸(sulfamate)主干；亚甲基亚氨基(methyleneimino)和亚甲基肼基(methylenehydrazino)主干；磺酸盐(sulfonate)和磺酰胺(sulfonamide)主干；酰胺主干；及其他具有混合N、O、S及CH₂组成者。

在另一实施方式中，用于本发明方法中的核酸包含一个以上的经取代糖部分(moieties)。此种经取代糖部分在其2’位置可包含下列群组中之一者：OH、F、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基、O-炔基、S-炔基、N-炔基、及O-烷基-O-烷基。在这些基团中，烷基、烯基及炔基可为经取代或未经取代的C₁至C₁₀烷基或烯基及C₂至C₁₀炔基。糖基在其2’位置也可包含杂环烷基(heterocycloalkyl)、杂环烷芳基(heterocycloalkaryl)、氨基烷基氨基(aminoalkylamino)、聚烷氨基(polyalkylamino)、经取代硅烷基(substitutedsilyl)、RNA切割基团(RNA cleaving group)、报导者基团(reporter group)、嵌合剂(intercalator)、增加寡核苷酸的药物动力学(pharmacokinetic)特性的基团、或增加寡核苷酸的药效动力学(pharmacodynamic)特性的基团。经取代的糖基较佳包含：具有2’-甲氧乙氧基(2’-methoxyethoxy)、2’-二甲基氨氧乙氧基(2’-dimethylaminooxyethoxy)、以及2’-二甲基氨乙氧乙氧基(2’-dimethylaminoethoxyethoxy)者。可参考文献Martin etal.,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504。

再一实施方式中，核酸可包含一个以上的经修饰天然核碱基(即腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)。经修饰的核碱基可参考美国专利号3,687,808及文献：TheConcise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley&Sons,1990,Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613,and Sanghvi,Y.S.,Chapter 15,AntisenseResearch and Applications,pages 289-302,CRC Press,1993.所述者。上述特定核碱基对于增加反义寡核苷酸与其靶标核酸的结合亲和力特别有效。这些包含5-经取代嘧啶、6-氮杂嘧啶(azapyrimidines)及N-2、N-6及O-6经取代嘌呤(例如2-氨基丙基-腺嘌呤(2-aminopropyl-adenine)、5-丙炔基尿嘧啶(5-propynyluracil)及5-丙炔基胞嘧啶(5-propynylcytosine))。可参考文献Sanghvi,et al.,eds.,Antisense Research andApplications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)。

任何核酸皆可由本技术领域中已知方法来合成。例如，可参考文献Caruthers etal.,1992,Methods in Enzymology 211,3-19、Wincott et al.,1995,Nucleic AcidsRes.23,2677-2684、Wincott et al.,1997,Methods Mol.Bio.74,59、Brennan et al.,1998,Biotechnol Bioeng.,61,33-45以及Brennan的美国专利号6,001,311。亦可由表达载体转录出核酸以及利用标准技术分离出核酸。

在其他实施方式中，TGFBR3抑制剂包括至少一个TGFBR3或TGFBR3次单位抑制化合物。在此使用的「TGFBR3抑制化合物」(TGFBR3inhibitory compound)或「TGFBR3次单位抑制化合物」(TGFBR3subunit inhibitory compound)指除了抗TGFBR3以外的化合物，其直接或间接降低、抑制、中和、或消除TGFBR3的生物活性。TGFBR3抑制化合物应展现下列任一特性：(a)结合至TGFBR3并抑制其生物活性及/或TGFBR3信号功能调控的下游路径；(b)预防、改善、或治疗任何形式的心脏损伤；(c)阻断或减少TGFBR3受体活化；(d)增加TGFBR3清除率；(e)抑制(降低)TGFBR3合成、制造或释放，本技术领域中具有通常知识者可制备出其他小分子抑制化合物。

在部分实施方式中，TGFBR3抑制化合物是TGFBR3突变体，其结合至TGFBR3受体但不会引起信号传导。此种突变体可阻断野生型TGFBR3与TGFBR3受体间的结合，进而抑制TGFBR3信号传导。

在其他实施方式中，本揭示内容的TGFBR3抑制化合物为小分子，其分子量为约100至20,000道尔顿(daltons)、500至15,000道尔顿、或1000至10,000道尔顿中任一者。可于市面上购得小分子数据库。可利用本技术领域中已知方式注射小分子，包含吸入、腹腔内、静脉内、肌肉内、皮下、鞘内(intrathecally)、心室内(intraventricularly)、口内、肠内、肠胃外、鼻内或皮内。一般而言，当本发明的TGFBR3抑制剂为小分子时，以病患每公斤0.1至300毫克的给药速率对病患、分成一至三次以上的剂量给药。对于正常体重的成年患者，可给予每剂1毫克至5公克的剂量。

可从化合物数据库中得到上述小分子。数据库在空间上可分成平行的固相或液相数据库。例如可参考文献Zuckermann et al.J.Med.Chem.37,2678-2685,1994以及LamAnticancer Drug Des.12:145,1997。本技术领域中已知合成化合物数据库的方法，例如文献DeWitt et al.PNAS USA90:6909,1993、Erb et al.PNAS USA 91:11422,1994、Zuckermann et al.J.Med.Chem.37:2678,1994、Cho et al.Science 261:1303,1993、Carrell et al.Angew Chem.Int.Ed.Engl.33:2059,1994、Carell et al.AngewChem.Int.Ed.Engl.33:2061,1994、及Gallop et al.J.Med.Chem.37:1233,1994。化合物数据库中的呈现方式可为溶液(例如文献Houghten Biotechniques 13:412-421,1992)、或颗粒(文献Lam Nature 354:82-84,1991)、片体(文献Fodor Nature 364:555-556,1993)、菌体(美国专利号5,223,409)、孢子(美国专利号No.5,223,409)、质体(文献Cull et al.PNASUSA 89:1865-1869,1992)、或噬菌体(文献Scott and Smith Science249:386-390,1990、Devlin Science 249:404-406,1990、Cwirla et al.PNAS USA 87:6378-6382,1990、Felici J.Mol.Biol.222:301-310,1991、及美国专利号5,223,409)。

在其他实施方式中，TGFBR3抑制剂可为多肽，包括TGFBR3受体的胞外部分，其中多肽专一性结合至TGFBR3配体并阻断其与一个以上TGFBR3受体作用。在部分实施方式中，TGFBR3受体的胞外部分与抗体的Fc部分融合。可溶性受体的范例如国际专利号WO 01/46232中所述。

鉴定TGFBR3抑制剂

TGFBR3抑制剂可利用本技术领域中已知方法来鉴定或定性，藉此侦测及/或测量其降低、减少、或中和TGFBR3的生物活性。举例来说，藉由测量TGFBR3相关级联反应(cascade)活化的蛋白质磷酸化，ELISA类型的试验侦测可适合用于TGFBR3调控激酶活化的定性或定量测量。也可将TGFBR3与预设试剂(candidate agent)作用后，侦测下列任一或多种特性：(a)结合至TGFBR3并抑制其生物活性及/或TGFBR3信号功能调控的下游路径；(b)预防、改善、或治疗任何心脏损伤的形式；(c)阻断或减少TGFBR3受体活化；(d)增加TGFBR3清除率；(e)抑制(降低)TGFBR3的合成、制造或释放，藉此以鉴定TGFBR3抑制剂。在部分实施方式中，将TGFBR3与预设试剂作用后，透过侦测与TGFBR3的结合以及伴随的TGFBR3的生物活性降低或中和的情形来进行TGFBR3抑制剂的鉴定。可使用纯化的TGFBR3多肽、或天然表达TGFBR3多肽的细胞、或转染至表达TGFBR3多肽的细胞来进行结合试验。在一实施方式中，结合试验是竞争结合试验，其评估预设抗体与已知TGFBR3抑制剂竞争结合至TGFBR3的能力。该试验可以多种形式进行，包含ELISA的形式。在其他实施方式中，鉴定TGFBR3抑制剂是将TGFBR3与预设试剂作用后，侦测产生的TGFBR3抑制效果。根据最初的鉴定结果，可再利用生物试验确认及精量预设TGFBR3抑制剂的活性，已知的方式为测量靶标生物活性。或者，生物试验可用于直接扫描默认试剂。

下文提供的实施方式提出：多种可用于扫描默认TGFBR3抑制剂的试验。生物试验包含但不限于：流式细胞仪，判定在预设TGFBR3抑制剂存在下TGFBR3对细胞的竞争性结合；以及在心肌细胞中对TGFBR3诱导细胞凋亡的抑制情形。此外，可使用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)或实时聚合酶链反应(real time PCR)直接测量TGFBR3表达、或测量TGFBR3正调控的基因表达。

(B)Let-7促进剂

微核糖核酸(micro ribonucleic acid，microRNA/miRNA)为小的非编码RNA，其最初由RNA聚合酶II转录出来，然后经由两个核酸内切酶系统处理后，形成成熟的单股RNA(参考文献Ha et al.,Nat Rev Mol Cell Biol 15,509-524(2014))。RISC(RNA诱导沉默)复合物使miRNA导向mRNA的3’-UTR，透过序列互补性，进而抑制蛋白质转译、mRNA降解及去腺苷酸化(参考文献Meister et al.,Nat Rev Genet 14,447-459(2013))。

let-7是一种演化上保留的miRNA，遍布于所有哺乳类组织中并且具有丰富表达量(参考文献Roush et al.,Trends Cell Biol 18,505-516(2008))。miRNA let-7在心脏发展上(参考Rustagi et al.,PLoS One 10,e0139359(2015)、Cao et al.,Int J Mol Med30,1095-1104(2012))及心肌细胞成熟上(参考Kuppusamy et al.,Proc Natl Acad Sci US A 112,E2785-2794(2015))扮演重要角色。虽然let-7为早期发现的miRNA中之一者，且可于C.elegans至哺乳动物上观察到其高量表达(参考Roush et al.,Trends Cell Biol 18,505-516(2008))，然而对于let-7在心肌梗塞中的功能却知之甚少。作为范例，以下提供人类前驱let-7a及let-7f的核苷酸序列(SEQ ID NO:89至93)，斜体字为成熟区(SEQ ID NO:94)：

hsa-let-7a-1

hsa-let-7a-2

hsa-let-7a-3

hsa-let-7f-1

hsa-let-7f-2

本揭示内容方法中使用的let-7促进剂用以提升、活化、或增加(包含显著增加)内生性miRNA let-7(包含let-7的任何亚型，例如let-7a或let-7f)的生物活性。「促进剂」(enhancer)一词未限定生物行为的机制，应视为明确包含及涵盖：与内生性let-7、或其直接或间接的下游基因相关的所有可能的药学、生理学和生物化学的交互作用。就本发明的目的而言，可清楚了解「促进剂」一词(包含先前记载的所有名词、标题、及功能性状态与特性)，指任何有意义程度上(例如至少20％、50％、70％、85％、90％、100％、150％、200％、300％、或500％、或10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、或10⁴倍)对let-7自身(例如人类let-7)实质提升、活化、或增强。

在部分实施方式中，本揭示内容方法中使用的let-7促进剂为let-7核酸，泛指所有与天然miRNA let-7具有相似生物活性的核酸，例如let-7a或let-7f。此种let-7核酸可包括miRNA let-7的成熟核苷酸序列(SEQ ID NO:94)。或者，let-7核酸可为前驱let-7分子，其可进一步生成可抑制其下游基因表达的功能性、成熟miRNA。在部分实施方式中，let-7核酸包含一个以上的经修饰核苷酸，例如于本文中所述的经修饰核苷酸。

在其他实施方式中，本揭示内容方法中使用的let-7促进剂可为LIN28抑制剂，LIN28是一个RNA结合蛋白的家族，其可经由调控miRNA let-7进而促进多能性(pluripotency)。LIN28蛋白可藉由与let-7结合并且去除对let-7靶标的抑制作用，进而抑制let-7成熟。LIN28蛋白的范例包括：LIN28A(也被称为：CSDD1、LIN-28、LIN28、ZCCHC1、lin-28A、或lin-28同源物A)、及LIN28B(也被称为：CSDD2、或Lin-28.2)。在Genbank数据库的编号NC_000001.11(LIN28A)及Genbank数据库的编号NC_000006.12(LIN28B)可取得人类LIN28蛋白。本揭示内容的方法中，可使用任一LIN28抑制剂作为let-7促进剂。LIN28抑制剂可为抑制LIN28活性的抗LIN28抗体。或者，LIN28抑制剂可为：靶标LIN28基因及/或mRNA的小分子干扰RNA(siRNA或RNAi)或反义RNA，进而阻断其转录/转译(例如透过RNA干扰)。在其他实施方式中，LIN28抑制剂可为抑制蛋白质活性的小分子，例如N-甲基-N-[3-(3-甲基[1,2,4]三唑[4,3-b]哒嗪-6-基)苯基]乙酰胺(参考Roos et al.,A Small-MoleculeInhibitor of Lin28.ACS Chem Biol.2016Aug 22)、以及硫代葡萄糖水合物(Aurothioglucose hydrate)。此种小分子抑制剂可透过常规作法，利用扫描合并式化合物数据库(combinatory compound library)而得。

任一核酸类let-7促进剂可包含非自然发生的核碱基、糖类、或共价核苷酸间连结键(主干)。此种经修饰的寡核苷酸赋予所需性质，如提高细胞摄入量、增强对靶标核酸的亲和力、以及增加体内稳定性。

在一实施方式中，核酸类的let-7促进剂可具有经修饰的主干，包含保留磷原子(例如参考美国专利号3,687,808、4,469,863、5,321,131、5,399,676、及5,625,050)以及不具有磷原子(例如参考美国专利号5,034,506、5,166,315、及5,792,608)。含磷修饰主干的例子包含但不限于：硫代磷酸酯(phosphorothioates)、手性硫代磷酸酯(chiralphosphorothioates)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioates)、磷酸三酯(phosphotriesters)、氨烷基-磷酸三酯(aminoalkyl-phosphotriesters)、甲基和其他烷基膦酸酯(alkyl phosphonates)(包含3’-亚烷基磷酸酯、5’-亚烷基磷酸酯及手性磷酸酯)、亚磷酸盐(phosphinates)、磷酰胺酯(phosphoramidates)(包含3’-氨基磷酰胺酯及氨烷基磷酰胺酯)、硫代磷酰胺酯(thionophosphoramidates)、硫代烷基膦酸酯(thionoalkylphosphonates)、硫代烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriesters)、硒代磷酸酯(selenophosphates)和硼烷磷酸酯(boranophosphates)(具有3’-5’连结键或2’-5’连结键)。此种主干亦包含具有相反极性者，即3’至3’、5’至5’或2’至2’连结键。形成不包含磷原子的经修饰主干，可透过短链烷基或环烷基的核苷酸间连结键、混合杂原子及烷基或环烷基的核苷酸间连结键、或一个以上短链杂原子或杂环的的核苷酸间连结键。此种主干包含具有吗啉连结键(生成在核苷酸的糖部)者；硅氧烷主干；硫化物、亚砜(sulfoxide)及砜(sulfone)主干；甲酰基(formacetyl)及硫代甲酰基(thioformacetyl)主干；亚甲基甲酰基及硫代甲酰基主干；核糖乙酰基(riboacetyl)主干；含烯烃主干；氨基磺酸(sulfamate)主干；亚甲基亚氨基(methyleneimino)和亚甲基肼基(methylenehydrazino)主干；磺酸盐(sulfonate)和磺酰胺(sulfonamide)主干；酰胺主干；及其他具有混合氮、氧、硫及CH₂组成者。

在另一实施方式中，用于本发明方法中的核酸类let-7促进剂可包含一个以上的经取代糖基。此种经取代糖基在其2’位置可包含下列群组中之一者：OH、F、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基、O-炔基、S-炔基、N-炔基、及O-烷基-O-烷基。在这些基团中，烷基、烯基及炔基可为经取代或未经取代的C₁至C₁₀烷基或烯基及C₂至C₁₀炔基。糖基在其2’位置也可包含杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷氨基、经取代硅烷基、RNA切割基(RNA cleaving group)、报导者基(reporter group)、嵌合剂(intercalator)、增加寡核苷酸的药物动力学(pharmacokinetic)特性的基团、或增加寡核苷酸的药效动力学(pharmacodynamic)特性的基团。经取代的糖基较佳包含：具有2’-甲氧基乙氧基、2’-二甲基氨基氧基乙氧基、以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基者。可参考文献Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504。

再一实施方式中，核酸类let-7促进剂可包含一个以上的经修饰天然核碱基(即腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)。经修饰的核碱基包含如美国专利号3,687,808及文献：The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley&Sons,1990,Englisch et al.,AngewandteChemie,International Edition,1991,30,613,and Sanghvi,Y.S.,Chapter 15,Antisense Research and Applications,pages 289-302,CRC Press,1993所述。上述特定核碱基对于增加反义寡核苷酸与其靶标核酸的结合亲和力特别有效。这些包含5-经取代嘧啶、6-氮杂嘧啶及N-2、N-6及O-6经取代嘌呤(例如2-氨基丙基-腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶)。可参考文献Sanghvi,et al.,eds.,Antisense Research andApplications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278。

任何核酸类let-7促进剂皆可由本技术领域中已知方法来合成。例如，可参考文献Caruthers et al.,1992,Methods in Enzymology 211,3-19、Wincott et al.,1995,Nucleic Acids Res.23,2677-2684、Wincott et al.,1997,Methods Mol.Bio.74,59、Brennan et al.,1998,Biotechnol Bioeng.,61,33-45以及Brennan的美国专利号6,001,311。核酸类let-7促进剂亦可由表达载体转录出来以及利用标准技术分离出来。

(C)药物组合物

本揭示内容的一种以上TGFBR3抑制剂(例如抗体)、及/或一种以上let-7促进剂可与药学上可接受的载剂(赋形剂)混合，以形成用于治疗目标疾病、损伤或病症的医药组合物。在部分实施方式中，该组合物用于治疗心脏损伤。在部分实施方式中，本揭示内容的TGFBR3抑制剂及let-7促进剂或聚乙二醇(PEG)共轭物皆可与药学上可接受的载剂(赋形剂)混合，以形成用于治疗目标疾病的医药组合物。「可接受的」(acceptable)表示该载剂必须具备与组合物中活性成分的兼容性(较佳为能够稳定活性成分)，且不会对待治疗个体造成伤害。药学上可接受的赋形剂(载剂)包含本技术领域中已知的缓冲剂。例如：可参考文献Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000)LippincottWilliams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover。

本发明方法中所使用的医药组合物可包括药学上可接受的载剂、赋形剂、或稳定剂(冻干制剂或水溶液型式)。例如：可参考文献Remington:The Science and Practice ofPharmacy 20th Ed.(2000)Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover。可接受的载剂、赋形剂、或稳定剂所使用的剂量和浓度对接受者无毒性，且可包括：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐、及其他有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，如十八烷基二甲基芐基氯化铵(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)、氯化六甲铵(hexamethonium chloride)、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、芐索氯铵(benzethonium chloride)、苯酚(phenol)、丁基或苯甲醇(butyl or benzyl alcohol)、烷基对羟基苯甲酸酯(alkyl parabens)(例如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯)、邻苯二酚(catechol)、间苯二酚(resorcinol)、环己醇(cyclohexanol)、3-戊醇(3-pentanol)、及间甲酚(m-cresol)；低分子量多肽(约低于10个残基)；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)；氨基酸，例如甘氨酸(glycine)、谷氨酸(glutamine)、天冬门氨酸(asparagine)、组氨酸(histidine)、精氨酸(arginine)、或赖氨酸(lysine)；单糖类、双糖类、及其他碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖(mannose)或葡聚糖(dextrans)；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraceticacid,EDTA)；糖类，例如蔗糖、甘露糖、海藻糖(trehalose)或山梨糖醇(sorbitol)；形成盐类的抗衡离子(counter-ions)，例如钠；金属复合物(例如锌(Zn)蛋白复合物)；及/或非离子性界面活性剂，例如TWEEN^TM、PLURONICS^TM、或聚乙二醇(PEG)。

在部分实施方式中，本揭示内容的医药组合物包括：含抗-TGFBR3抗体的脂质体，其可由本技术领域中已知的方法所制备出来，例如文献Epstein,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985)、Hwang,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980)、及美国专利号4,485,045及4,544,545中所述者。美国专利号5,013,556中记载脂质体可促进循环时间。逆向挥发法(Reverse Phase Evaporation)可生产出特别有用的脂质体，其具有脂质组成分，包括磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-derivatized phosphatidylethanolamine,PEG-PE)。透过精准孔径的过滤器，可挤压出具有所需尺寸的脂质体。

本揭示内容的抗-TGFBR3抗体及/或let-7促进剂亦可包埋至微囊中，制备方法如凝聚技术或接口聚合，微囊例如羟甲基纤维素(hydroxymethylcellulose)或明胶微囊及聚甲基甲基丙烯酸甲酯(poly-(methylmethacylate))微囊，分别于胶体药物输送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳液(macroemulsion)。此类技术为本技术领域中已知的，例如可参考文献Remington,The Science and Practice ofPharmacy 20th Ed.Mack Publishing(2000)。

在其他实施方式中，本揭示内容的医药组合物可以为持续释放的剂型。适当的持续释放制备范例包含：固态疏水性聚合物的半渗透性基材，其中固态疏水性聚合物包含抗-TGFBR3抗体，且基材是成型物品如薄膜或微囊。持续释放基材的范例包含：聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(poly(2-hydroxyethyl-methacrylate))、或聚(乙烯醇))、聚乳酸(如美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸及7乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可分解的乙烯-乙酸乙烯酯、可分解的乳酸-乙醇酸共聚物(例如LUPRON DEPOT^TM(注射性微球，由乳酸-乙醇酸共聚物及利普安(leuprolide acetate)所组成)、蔗糖乙酸异丁酸酯(sucroseacetate isobutyrate)及聚-D-(-)-3-羟丁酸(poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid)。

用于体内注射的医药组合物必须为无菌的。利用如无菌过滤膜进行过滤即可快速达成。具疗效的抗-TGFBR3抗体组合物可置入具有无菌入口的容器内，例如具封口的静脉注射液体袋或小瓶，可利用皮下注射针刺穿封口。

本揭示内容的医药组合物可为单位剂量形式，例如片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、颗粒、溶液或悬浮液、或栓剂，用于口服、肠胃外或直肠给药，或通过吸入或吹入给药。

制备如片剂的固体组合物时，主要的活性成分可与药学载剂以及其他医药稀释剂(如水)混合，药学载剂例如传统的片剂成分，如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树脂(gums)；以形成含本发明化合物的匀相混合物、或其药学上可接受的无毒性盐类的固体预配方(preformulation)组合物。当这些预配方组合物为匀相时，表示活性成分均匀分散在组合物整体中，使组合物可快速分成等量的有效单位剂量形式，例如片剂、丸剂、或胶囊。此固态预配方组合物接续可分成：包含本发明活性成分约0.1至500毫克的上述单位剂量形式。该新颖化合物的锭剂或丸剂可经涂布处理或其他复合处理，以提供具有长时间反应的优点的剂型。例如，锭剂或丸剂可包括内部剂量(innerdosage)和外部剂量(outer dosage)成份，后者为包覆前者的包膜形式。两种成分可藉由肠溶层(enteric layer)分隔开来，肠溶层用以抵抗在肠胃中解体，使内部成份通过胃进而完整进入十二指肠或延迟释放。可使用各种材料作为此肠溶层或涂层，此种材料包含多种聚合酸以及聚合酸的混合物(例如含虫胶(shellac)、鲸蜡醇(cetyl alcohol)和醋酸纤维素(cellulose acetate))。

适合的界面活性剂特别包括：离子性试剂，例如聚氧乙烯山梨聚糖(polyoxyethylenesorbitans)(例如TWEEN^TM 20、40、60、80或85)及其他山梨聚糖(例如SPAN^TM 20、40、60、80或85)。包含界面活性剂的组合物可适当包括介于0.05至5％之间、及介于0.1至2.5％之间的界面活性剂。视需要也可以添加其他成份，例如甘露醇或其他药学上可接受的媒介物。

可利用市购的脂肪乳液(例如INTRALIPID^TM、LIPOSYN^TM、INFONUTROL^TM、LIPOFUNDIN^TM及LIPIPHYSAN^TM)制备出适合的乳液。活性成份亦可溶于事先混合好的乳状组合物、或可溶解于油中(例如大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)，且可混合磷脂质(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水进而形成乳液。亦可添加其他成份，例如甘油或葡萄糖，藉以调整乳液的张力(tonicity)。适当的乳液一般包含最多20％的油，例如介于5至20％之间。脂肪乳液可包括介于0.1及1.0微米之间、尤其是0.1及0.5微米之间的脂肪滴(fat droplet)，且其pH值介于5.5至8.0的范围内。

透过混合抗TGFBR3或let-7促进剂与INTRALIPID^TM或其成份(大豆油、卵磷脂、甘油及水)，可制备乳状组合物。

吸入性或吹入性的医药组合物包括药学上可接受的溶液及悬浮液、水性或有机溶剂、或其混合物、以及粉末。液态或固态组合物可包含适当的药学上可接受赋形剂(如上述)。在部分实施方式中，经口给予或经鼻呼吸路径给予组合物，可伴随局部或全身的效果。

较佳地，可将组合物置于无菌的药学上可接受溶剂中，并以气体雾化。雾化的溶液可直接从雾化装置吸入，或雾化装置可与一面罩、帐幕、或间歇性正压呼吸机连接。较佳地，溶液、悬浮液或粉末组合物可以合适方法从输送药剂的装置经口或鼻给药。

(D)心脏损伤的治疗

心脏损伤包括但不限于：心脏急性冠状动脉综合症、心肌梗塞(包含MI及其他非MI的由冠状动脉疾病引起的急性心脏损伤)、心肌炎、心肌病变、及术后心脏保护(post-operation cardio-protection)。「心脏损伤」(cardiac injury)定义为引发心肌细胞死亡(例如细胞凋亡)。在部分实施方式中，p38MAPK路径活化的心肌细胞凋亡可引起心肌细胞死亡。在其他实施方式中，压力因素可引起心肌细胞死亡。心脏损伤的压力因素包括但不限于：外伤、毒素、血块形成、血栓、缺氧、营养匮乏。

两大冠状动脉及其分支供应血流至心肌。冠状动脉阻塞(即使只有一个以上的血管阻塞)是引发心肌梗塞的主因之一。在部分实施方式中，当动脉粥样化血栓破裂，穿过血管分层，造成血块突然生成，进而导致阻塞发生。在其他实施方式中，硬化动脉窄化且内壁粗糙，导致形成血栓。MI的其他因素可归因于心脏的供血需求不足量的骤增，例如休克、出血、及严重体力消耗，并限制血流通过主动脉(aorta)(例如主动脉瓣狭窄(aorticstenosis))。

本揭示内容的抗-TGFBR3抗体、或let-7促进剂中任一者可用于改善心脏损伤，例如本发明中所述。执行本揭示内容的方法，经由适当路径对一有需要的个体投予有效量的含抗-TGFBR3抗体或let-7促进剂的医药组合物，适当路径例如静脉注射(单次推进(bolus)或持续一段时间的连续输入)、肌肉内注射、腹腔内注射、脑脊髓内(intracerebrospinal)注射、皮下注射、关节内(intra-articular)注射、滑膜内(intrasynovial)注射、鞘内注射、口服、吸入或局部途径。市售用于液体剂型的喷雾器(包含喷射式喷雾器及超音波喷雾器)均可有效地给药。液体剂型可直接雾化，且冻干粉末经重组后可被雾化。或者，本揭示内容的含抗-TGFBR3抗体或let-7促进剂的组合物，可利用氟碳化合物及定量吸入器进行雾化，或者吸入冻干后经研磨的粉末。

在此使用的「有效量」(an effective amount)一词表示：各活性剂给予个体治疗效果所需要的含量，不论是单独或与一种以上他种活性剂的组合皆适用。在部分实施方式中，医疗效果是指降低心脏损伤及/或增加免疫活性。对本技术领域中具有通常知识者而言，判断抗-TGFBR3抗体或let-7促进剂的含量是否达到治疗效果为显而易见的。本技术领域中具有通常知识者，考虑特定的待处理病症、病症严重性、病患个别条件(包含年龄、健康状况、身高、性别及体重)、治疗期间、合并治疗的性质(若有的话)、具体给药路径等因素，根据医疗就业者的专业知识及经验，进而改变有效量。对本技术领域中具有通常知识者而言，这些因素都是已知的，不需额外进行常规实验即可处理。个别成份或其组合使用的最大剂量一般较佳为：根据合理医疗判断(sound medical judgment)的最高安全剂量。

经验上的考虑，例如半衰期，通常可助于决定剂量。给药的频率可视疗程调整，通常(但非必需)以治疗及/或抑制及/或改善及/或延迟目标疾病/症候群为基准作考虑。或者，抗-TGFBR3抗体或let-7促进剂的持续连续释放剂型也很合适。本技术领域中已知达到持续释放的各种剂型及装置。

在一实施方式中，所述抗-TGFBR3抗体或let-7促进剂的剂量，可根据已经接受过一种以上抗-TGFBR3抗体或let-7促进剂的个体经验来决定。个体可给予增加剂量的拮抗剂。可追踪疾病/症候群的指标，以评估拮抗剂的效果。

一般而言，给予所述抗-TGFBR3抗体或let-7促进剂任一者的初始预设剂量可为约每公斤2毫克。就本发明的目的而言，典型的每日剂量可介于约每公斤0.1微克至3微克、每公斤0.1微克至30微克、每公斤0.1微克至300微克、每公斤0.1微克至3毫克、每公斤0.1微克g至30毫克、每公斤0.1微克至100毫克以上的范围内，每日剂量可依据上述因素而加以变化。多日或更长时间的重复给药根据病症来决定，治疗持续到显现出理想的症状抑制、或持续到达成足够的疗效，用以减缓目标疾病或症候群或其症状。抗-TGFBR3抗体或let-7促进剂的给药方案范例包括：给予约每公斤2毫克的初始剂量；接着为约每公斤1毫克的一周维持剂量、或约每公斤1毫克的隔周维持剂量。然而，依据药物动力学衰退的模式，其他给药方案也可能有效达成病患所需。例如，可考虑一个礼拜给予一到四次的剂量。在部分实施方式中，可使用约每毫克3微克至约每公斤2毫克的剂量(例如每毫克3微克、约每毫克10微克、约每毫克30微克、约每毫克100微克、约每毫克300微克、约每公斤1毫克、及约每公斤2毫克)。在部分实施方式中，给药频率为一周一次、两周一次、四周一次、五周一次、六周一次、七周一次、八周一次、九周一次、或十周一次；或一个月一次、两个月一次、或三个月一次、或更长时间给予一次。可利用传统的技术和试验轻易监控疗程的进度。在部分实施方式中使用ELISA试验。可随时变化给药方案(包含抗-TGFBR3抗体或let-7促进剂)。

在部分实施方式中，正常体重的成年病患，可给予介于约每公斤0.3至5.00毫克之间的剂量。特定的给药方案(即剂量、时程及处方)可依照特定的个人状况及其用药历史、以及个别药剂的特性(例如药剂半衰期、及本技术领域中已知的其他考虑)而决定。

就本发明的目的而言，上述抗-TGFBR3抗体或let-7促进剂的适当剂量是依据特定的抗-TGFBR3抗体/let-7促进剂、疾病/症候群的类型和严重程度(不论给予抗-TGFBR3抗体/let-7是预防还是治疗用途)、先前的疗程、病患的临床病史及对拮抗剂的反应、以及主治医生的评估而决定。临床医生可给予抗-TGFBR3抗体/let-7促进剂，直到达到期望效果所需的计量。在部分实施方式中，期望效果是指减少心脏损伤及/或增加免疫活性。本技术领域中具有通常知识者可轻易得知：剂量是否能达到期望效果的判定方法。不论给药目的是治疗或预防，给予一种以上的抗-TGFBR3抗体或let-7促进剂可为连续或间歇性给药，例如可依据接受者的健康条件及其他专业医护人员已知因素来决定。例如：在目标疾病或症候群发展之前、之中或之后，给予抗-TGFBR3抗体或let-7促进剂可为实质上连续进行一预选时期、或可为一列列的间隔剂量。

在此所使用的「治疗」(treating)一词指：对具有目标疾病或症候群、疾病/症候群的症状、或倾向疾病/症候群的个体，在治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、改进或影响该症候群、疾病的症状、或倾向疾病或症候群的目的下，应用或给予包含一种以上活性试剂的组合物。

减缓目标疾病/症候群包含：延迟疾病的发展或进展、或减轻疾病的严重程度。减缓疾病不一定需要达到治愈性的结果。在此所使用的「延迟」(delaying或delay)目标疾病或症候群的发展指：推迟、阻碍、缓速、延缓、固定和/或推延疾病的进展。根据待治疗个体的疾病史，延迟可能为多种时间长度。「延迟」或减缓疾病发展、或延迟疾病发作的方法，相较于未使用该方法，为在预设时间内降低一种以上疾病症状发展的可能性、及/或在预设时间内降低症状程度。此种比较通常以临床研究为基础，利用大量受试者才够得到统计上具显著意义的结果。

疾病的「发展」(development)或「进展」(progression)表示疾病初始表达及/或后续进展。可利用本技术领域中已知的指标性临床技术侦测或评估疾病的发展。然而，发展亦指侦测不到的进展。就本发明的目的而言，发展或进展指症状的生物时程。「发展」包含发生、复发、及发作。在此所使用的目标疾病或症候群「发作」(onset)或「发生」(occurrence)，包含初始发作及/或复发。

在部分实施方式中，对有治疗需要的个体给予在活体内足够降低至少5％(例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或以上)心肌细胞死亡的有效量的抗-TGFBR3抗体或let-7促进剂。在其他实施方式中，是投予有效降低TGFBR3或促进let-7活性至少5％(例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或以上)的有效量的抗-TGFBR3抗体或let-7促进剂。

根据待治疗的疾病/损伤类型或疾病/损伤位置，可使用医药技术领域中具有通常知识者已知的传统方法，将医药组合物注射至个体内。组合物也可透过其他传统路径给予，例如利用经口、肠胃外、吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、口腔、阴道给药或植入储存库(reservoir)。在此使用的「肠胃外」(parenteral)一词包含：皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内(intrasternal)、鞘内、病灶内(intralesional)和颅内(intracranial)注射或输入技术。在部分实施方式中，医药组合物经由局部注射。在部分实施方式中，局部注射为心肌内注射或冠状动脉内注射。此外，可透过注射补给(depot)的给药方式供应至个体，例如使用1、3、或6个月的补给注射或生物性可分解材料及方法。在部分实施方式中，医药组合物透过眼内(intraocularlly)或玻璃体内(intravitreally)给药。

注射用组合物可包含各种载体，例如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、碳酸乙酯、肉荳蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)。用于静脉注射，可利用滴注法(drip method)注入水溶性抗-TGFBR3抗体，进而注入含抗-TGFBR3抗体及生理上可接受的赋形剂的药物组合物。生理上可接受的赋形剂可包括：例如5％右旋糖(dextrose)、0.9％生理食盐水、Ringer’s溶液及其他适当的赋形剂。制备用于肌肉内注射者，例如抗-TGFBR3抗体的适当水溶性盐类型式的无菌剂型，可溶解于医药赋形剂(例如注射用水、0.9％食盐水、或5％葡萄糖溶液)中并注射。

在一实施方式中，抗-TGFBR3抗体或let-7促进剂透过位点专一性(site-specific)或目标局部输送(targeted local delivery)技术。位点专一性或目标局部输送技术包括多种可植入的抗-TGFBR3抗体或let-7促进剂的储存库来源、或局部输送导管，例如输液导管、留置导管(indwelling catheter)或针导管、合成移植物(syntheticgrafts)、外膜覆膜(adventitial wraps)、分流器及支架或其他可植入性装置、位点专一性载体、直接注入或直接供给。例如，可参考世界专利号WO 00/53211及美国专利号5,981,568案件。

亦可使用包含反义多核苷酸、表达载体、或次基因多核苷酸(polynucleotides)的医药组合物作标靶输送。受体调控的DNA传输技术描述于：例如文献Findeis et al.,生物技术趋势(1993)11:202、Chiou et al.,基因疗法:直接基因转移的方法及应用(J.A.Wolff,ed.)(1994)、Wu et al.,J.Biol.Chem.(1988)263:621、Wu et al.,J.Biol.Chem.(1994)

269:542、Zenke et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:3655、Wu et al.,J.Biol.Chem.(1991)266:338。

在基因疗法的指南中，局部注射包含多核苷酸(例如核酸类TGFBR3抑制剂或核酸类let-7促进剂)的医药组合物，注入介于约100纳克至约200毫克范围内的DNA。在部分实施方式中，基因疗法的指南中亦可使用浓度范围介于500纳克至约50毫克、约1微克至约2毫克、约5微克至约500微克、及约20微克至约100微克之间、或更高浓度的DNA。

本揭示内容的待治疗个体可为哺乳类，例如农场动物、运动动物(sportanimals)、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。在一实施方式中，个体为人类。含抗-TGFBR3抗体或let-7促进剂的组合物可用于保护心肌细胞免于多种因素导致的心肌细胞死亡。在部分实施方式中，个体可为具有心脏损伤、预期具有心脏损伤、或存在心脏损伤风险的病患，心脏损伤可举例如心脏急性冠状动脉综合症、心肌梗塞(包含MI及其他非MI的由冠状动脉疾病引起的急性心脏损伤)、心肌炎、心肌病变、及术后心脏保护(post-operationcardio-protection)。此种病患亦可由常规医药实验判断出来。

可由常规医药实验判断出来具有目标疾病或症候群(例如心血管疾病)的个体，常规医药实验可举例如：实验室测试、器官功能性测试、计算机断层扫描(CT)、或超音波。预期具有任一目标疾病/症候群的个体可能显示出一种以上的疾病/症候群症状。存在疾病/症候群风险的个体可为：具有一种以上与疾病/症候群相关的风险因子的病患。可由常规医药实验判断出该些个体。

本揭示内容方法中使用的具体剂量方案(即剂量、时间及重复性)，可根据特定个体(例如人类病患)的状况及其医药历史来决定。

在部分实施方式中，抗-TGFBR3抗体或let-7促进剂可与其他适当的心脏损伤疗法(例如本文中所述者)并用。或者或此外，抗-TGFBR3抗体或let-7促进剂亦可与其他作为促进及/或补充效果的试剂共同使用。

目标疾病/症候群的治疗效果可经由如下方实施方式中所述方法进行检测。

II.用于减缓目标疾病的套组

本发明亦提供用于减缓心脏损伤的套组，该套组可包含：一种以上含TGFBR3抑制剂(例如结合TGFBR3的抗体，如本文中所述中任一者)或let-7促进剂(例如let-7核酸)的容器。

在部分实施方式中，该套组可包括：根据本文中所述方法中任一者的使用说明书。包含的说明书中可包括：注射适体(aptamer)以达到治疗、延迟发病、或减缓目标疾病(如本文中所述)的描述。该套组可更包括：基于判别个体是否具有目标疾病，进而挑选出适合治疗的个体的叙述。再一实施方式中，说明书包括：将适体注入一存在目标疾病风险的个体的叙述。

关于使用TGFBR3抑制剂或let-7促进剂的说明，一般包含治疗所需的剂量、给药流程、及给药路径等信息。该容器可为单位剂量、大量包装(例如多剂量包装)或次单位剂量。本发明套组中提供的说明书一般为：在标签或仿单(package insert)(例如包含于套组内的纸张)上印刷指示说明，亦可接受为需要机器判读的说明书(例如磁性或光学性储存盘片所携带的说明书)。

标签或仿单指出：组合物用于治疗、延迟发作及/或减缓与心脏损伤相关的疾病或损伤(如本文中所述)。说明书可用于执行本文中所述方法中的任一者。

本发明的套组位于适当包装中。适当的包装包含但不限于：小瓶、瓶子、罐子、软性包材(例如密封的Mylar或塑料袋)等。用于与特定装置并用的包材同样需要考虑，装置可举例如：吸入器、经鼻给药装置(例如喷雾器)或如微型泵的注入装置。套组可具有无菌入口部(例如该容器可为具封口的静脉注射液体袋或小瓶，可利用皮下注射针刺穿封口)。该容器亦可具有无菌入口部(例如该容器可为具封口的静脉注射液体袋或小瓶，可利用皮下注射针刺穿封口)。组合物中至少一活性试剂为本文中所述的TGFBR3抑制剂及/或let-7促进剂。

套组可选择性提供：额外构件，例如缓冲液及解释信息。正常来说，该套组包括：一容器；及一位于容器上(或与容器相关)的标签或仿单。在部分实施方式中，本发明亦提供：包括上述套组内容的制造叙述。

III.用于测量TGFBR3及/或Let-7的试验

本揭示内容亦提供测量生物样品中的TGFBR3含量、let-7含量、或两者的试验方法。此种方法可包括：(i)提供一预期含有TGFBR3、let-7、或两者的生物样品；(ii)将该生物样品与一试剂(例如抗体)接触，该试剂与一切割型TGFBR3(例如序列SEQ ID NO:3)、let-7、或两者结合；(iii)测量该生物样品内的切割型TGFBR3、let-7、或两者的含量；以及(iv)判定该生物样品内为存在或不含TGFBR3、let-7、或两者。可使用任何传统方法来测量生物样品中的TGFBR3、let-7、或两者的含量，例如ELISA、杂交技术、或PCR。

合适的生物样品可经由常规实验从上述个体中取得，生物样品的范例包括但不限于：液态样品，如血液(例如全血、血浆、血清)、尿液、及唾液；固态样品，如组织(例如皮肤、肺脏、鼻腔)及粪便。可利用本技术领域中已知方法或上述方法中任一者来搜集此种样品，例如口腔擦拭取样、鼻腔擦拭取样、静脉穿刺、切片、尿液采集或粪便采集。在特定实施方式中，所述试验方法中使用的生物样品为血浆样品或血清样品。

用于测量TGFBR3的试剂(例如抗体)可专一性结合至切割型(可溶型)受体。在部分实施方式中，此种抗体不会结合至膜连型TGFBR3。用于试验方法中的抗体可专一性结合至经糖基化的切割型TGFBR3。例如，抗体可结合至经糖基化的N端抗原表位。

测量let-7的试剂可为核酸分子(DNA或RNA)，其包括与let-7互补或部分互补的核甘酸序列。在此所使用的「互补」(complementary)一词是指本技术领域中已知的核碱基互补。例如：腺嘌呤在DNA中与胸腺嘧啶互补、在RNA中与尿嘧啶互补；以及鸟嘌呤与胞嘧啶互补。在此使用的「序列互补」(sequence complementarity)或「核酸序列彼此互补」(nucleicacid sequences being complementary to one another)表示：当两个核酸分子彼此呈反向平行排列时，序列中每一位置、或大部分位置的核苷酸碱基为互补的，以及该两核酸分子在适当条件(例如杂交温度)下可融合并形成双链体(duplex)。本技术领域中已知：融合形成双链体的两核酸分子不一定必须为100％序列互补。撷取探针(或上述侦测探针)及靶标核酸之间的序列互补性可为：与靶标核酸中对应区域至少80％互补。在部分实施方式中，撷取探针包含：一与靶标核酸的第一节段至少80％(例如85％、90％、95％、98％、或100％)互补的片段。在部分实施方式中，撷取探针包含：一与靶标核酸的第一节段完全互补(100％互补)的片段。从实质相同核酸中分化出靶标核酸可使用此种撷取探针，实质相同核酸可举例如：具有1、2、或3个与靶标核酸不同的碱基的核酸。

用于测量let-7的核酸类试剂最多可包含100个核苷酸(例如最多80个核苷酸、60个核苷酸、50个核苷酸、或30个核苷酸)。在部分实施方式中，核酸的长度可为8-50个核苷酸，例如长度为8-40、8-30、10-30、15-30、或15-20个核苷酸。在其他实施方式中，核酸可包含：用于连接至支撑件(如下述)的连接剂(例如poly A或poly T连接剂)。或者或此外，核酸可与标志试剂直接共轭结合或透过连接剂结合。

所述测量let-7的试剂可由传统方法固定在支撑件上。在此所使用的「固定」(immobilized)表示共价性或非共价性的黏结、附加、或绑定，藉此防止撷取探针脱落或遗失，但不需要绝对固定至撷取探针或支撑件。支撑件可为具有表面的固态或半固态组件，该表面用以具体贴附、结合、甚至撷取一核苷酸探针(例如本发明所述的撷取探针)，进而使核苷酸探针固定至支撑件上。用于测量let-7的试剂可与标志试剂共轭结合。在此使用的「共轭」(Conjugated)一词表示：标志试剂共价性或非共价性的附加至侦测探针上。标志试剂可为任何分子、粒子、或类似物，用以辅助直接或间接性的侦测(利用合适的侦测技术)。在直接性侦测的例子中，标志试剂可为：能够释放信号的分子或基团，而该信号可被直接判读及/或侦测(例如荧光标志或染剂)。在间接性侦测的第一个非限定例子中，标志试剂可为能够将基质(例如酶)转换成产物的分子或基团，该产物能够释放可侦测的信号。例如：标志试剂可为荧光素酶(luciferase)，其将荧光素转换成氧基荧光素，藉以发出可侦测的光线。在间接性侦测的另一个非限定例子中，标志试剂为结合至分子或基团的结合配体，该分子或基团能够转换基质(例如酶)，其中转换后的基质会释放可侦测的信号。

结合至切割型TGFBR3的抗体或用于测量let-7的试剂，在适当条件下可与上述生物样品作用一段适当时间，使切割型TGFBR3结合至抗体、或let-7结合至试剂。然后，透过常规技术可侦测到此结合。

在生物样品中，由所述试验方法中任一者所判定的TGFBR3及/或let-7的存在及/或含量，可具有多种临床及非临床应用。

如上所述，具MI病患的样品中，已发现let-7(例如let-7a及let-7f)的下调现象。此外，在损伤心脏组织中，心肌梗塞24小时后已发现TGFBR3(miRNA let-7靶标基因)的上调情形。因TGFBR3可被切割并释放至胞外基质，血浆TGFBR3可用于作为检测MI及其他心脏损伤的生物标剂。let-7含量下降及/或血浆TGFBR3含量上升可作为心脏损伤的指标。

不同于肌钙蛋白，TGFBR3在血浆中有基础表达量。根据实施方式1中的猪体实验，每一个别猪体中的血浆TGFBR3浓度相当一致。因此，可建立出诊断用的标准浓度范围。

如上所述，来自个体(例如人类病患)的生物样品中，可溶性TGFBR3、let-7、或两者的含量可用于判定个体是有具有心脏损伤(如MI)的风险。在部分实施方式中，TGFBR3/Let-7的含量可与所述预定值作比较。与预定值相比，生物样品中增高的TGFBR3含量及/或降低的let-7含量指出：个体具有心脏损伤或存在心脏损伤的风险。

在此使用的「增高的TGFBR3含量」(an elevated level of TGFBR3)表示TGFBR3的含量高于预定值(例如TGFBR3的预定阈值或控制组含量)。于此详述控制组含量。增高的TGFBR3含量包含如：比预定值高1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或以上的TGFBR3含量。增高的TGFBR3含量也包含：从零状态(zero state)(例如控制组中没有或侦测不到TGFBR3)到非零状态(non-zero state)(例如样品中少量TGFBR3或可侦测到TGFBR3)的现象增加。

在此使用的「降低的let-7含量」(a decreased level of let-7)表示let-7的含量低于预定值(例如let-7的预定阈值或控制组含量)。降低的let-7含量包含如：比预定值低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更低的let-7含量。降低的let-7含量也包含：从可侦测状态到无法侦测状态。

预定值可为控制组中的TGFBR3或let-7的含量(控制组含量)，预定值可使用所述本技术领域中已知方法中任一者来测量。在部分实施方式中，预定值利用相同的方法测量生物样品中的TGFBR3或let-7的含量。控制组含量可为控制组样品、控制组个体、或控制组个体群集中的TGFBR3或let-7的含量。

控制组可为一正常个体、或可来自正常个体群集。于此使用的「正常个体」(normalsubjects)是指明显健康且未表达出心脏损伤迹象或症状的个体。控制组个体的群集可为正常个体的群集。

应了解本文所述方法不需要在每次测量个体时重新测量控制组含量。或者，在部分实施方式中，得到控制组含量并记录下来，然后任一测试含量皆与此控制组含量相比。默认值可为单一断值(single-cutoff value)或范围值。

将来自个体的生物样品的TGFBR3及/或let-7值与所述预定值作比较，可判断个体是否具有心脏损伤或存在心脏损伤的风险。

常见技术

除非额外说明，可采用本技术领域中已知的分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的传统技术实行本发明。可参考下列文献：MolecularCloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook,et al.,1989)Cold SpringHarbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods inMolecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-8)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weirand C.C.Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Millerand M.P.Calos,eds.,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,et al.,eds.,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis,et al.,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991)；ShortProtocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janewayand P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practical approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)；Using antibodies:alaboratory manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood AcademicPublishers,1995)。

不需深入阐述，相信本技术领域中具有通常知识者可以基于上述说明，最大程度地诠释本发明。因此，下方具体实施方式仅用于说明本发明，并未以任何方式限制本发明所揭露范围。关于本发明目的或申请靶标，本文中引用的所有出版物皆合并至此作为参考。

实施例

多种动物模式用以仿真心肌梗塞(MI)(心肌梗塞是全球死亡及心脏衰竭的主因)。为了观察MI的重点机制或探讨潜在治疗策略，在费用、基因操作技术及简易操作考虑下，常使用小动物模式。然而，小动物的心率、收缩蛋白表达、代谢等与人类大不相同(参考Zaragoza et al.,J Biomed Biotechnol 2011,497841(2011))，因此难以直接将小动物研究转换到人类临床用。不同于小的实验室动物，在人类冠状动脉疾病方面，因猪体的心血管解剖学及疾病进展与人类相似，故猪体提供了理想的动物模式(参考Munz et al.,CompMed 61,445-452(2011))。因此，猪的MI模式利于在早期MI阶段显现多种小分子非编码RNA的功能。

其中，猪被认为是最具代表性的模式。在本案研究中，猪体MI模式及次世代测序技术应用至探讨早期MI中不同miRNA的表达。本案研究的主旨在于：利用猪体MI模式确认miRNA对早期心肌梗塞的反应。采集心肌梗塞的猪心脏组织。使用RNA进行次世代测序(NGS)。由实时qPCR确认个别表达量，并利用扫描判定潜在靶标基因。利用获得功能(gainof function)及丧失功能(loss of function)的方法研究miRNA及靶标基因的功能。再者，为了将实验结果延伸至潜在临床应用，从实验猪体和临床病患中采集血浆样本作进一步观察。

实验发现：在心脏组织中miRNA let-7a及let-7f含量丰富，并在MI后24小时内显现显著的下调。它们的下游靶标基因TGFBR3及HMGA2相对上调。在压力下，由TuD RNA抑制let-7可促进心肌细胞凋亡。TGFBR3过量表达活化p38MAPK并导致心肌内细胞凋亡。抑制p38MAPK可回复TGFBR3引起的凋亡蛋白酶3活化。这些实验数据推论出：let-7(包含let-7a及let-7f)的下调将透过TGFBR3及p38MAPK信号路径促进心肌细胞死亡。let-7过量表达或TGFBR3抑制能降低p38MAPK活性并回复无血清所引发的细胞死亡，此结果同样支持上述论点。最后，在急性MI病患(n＝25)中，血浆let7含量相较于正常控制组(n＝9)显著下降(P>0.05)。本项研究确认早期MI中不同miRNA的表达，揭露let-7及TGFBR3在心血管疾病中的角色，同时提供用于心脏损伤(如MI)的潜在生物标记和治疗靶标。在早期心肌梗塞中，miRNAlet-7/TGFBR3调控轴引起心肌细胞死亡，且血浆let-7及TGFBR3两者皆对心脏损伤有反应。

材料及方法

(i)猪体模式的LAD结扎

在插管前，对约22公斤的兰屿迷你猪导入舒泰(Zoletil,每公斤12.5毫克；Virbac，法国)、若朋(Rompun,每公斤0.2毫升；Bayer健康中心，德国)、及阿托品(atropine,每公斤0.05毫克；TBC，台湾)进行麻醉。将猪体贴覆至呼吸器，给予间歇性正压通入氧气、空气、及异氟醚(1.5至2％；Baxter健康中心,Guayama,PR)的混合物。在手术过程中，于耳静脉设置一静脉留置导管，持续注入食盐水或麻醉剂。手术后，给予抗生素(Ampolin,YSP)防止感染，以及镇痛药(Keto,YSP)用以缓解疼痛。MI手术于左前下行动脉中段(midleftanterior descending artery)进行永久性闭塞处理。

(ii)总RNA及血浆miRNA萃取

使用Trizol反应试剂(Invitrogen)，从组织及细胞中萃取总RNA。透过离心周边血液得到猪血浆；然后利用mirVana PARIS套组(Ambion)，按照使用说明，从200微升血浆中萃取出miRNA。取5飞摩耳(femto-moles)的合成miRNA：cel-mir-39添加至样品中，作为校正操作误差的内控制组。

(iii)以次世代测序(NGS)进行miRNA分析

在MI后1、2、及4小时，从梗塞组织和远程组织抽取RNA样品。按照Small RNA(Illumina)说明书制备miRNA数据库，并根据HiSeq 2000平台的Illumina方法进行测序。产生的原始fastq数据利用miRSeq(Pan et al.,Biomed Res Int 2014,462135(2014))进行分析，以检验全部的测序质量以及导出miRNA表达的特性。

(iv)miRNA茎环实时聚合酶链反应(stem-loop real-time PCR)

利用Taqman miRNA反转录套组(Applied Biosystems)，使用合成的寡核苷酸(生成茎环结构)及反义miRNA(作为RT引物)，将50纳克总RNA进行反转录。使用普遍引物(universal primer)(辨认茎环序列)及miRNA专一性引物(位于OmicsGreen qPCR主混合试剂(Omics Bio)中)，在ABI 7500实时PCR系统(Applied Biosystems)进行定量PCR。表1条列出RT引物、普遍引物及miRNA专一性引物。同时利用TaqMan miRNA侦测系统进行定量PCR。茎环RT引物及每一miRNA的侦测探针由TaqMan提供。按照TaqMan miRNA试验(AppliedBiosystems)提供的操作手册，使用普遍PCR主混合试剂(Applied Biosystems)执行定量PCR步骤。

表1：茎环qPCR引物列表

(v)实时聚合酶链反应(Real-time PCR)

利用SuperScript III(Invitrogen)进行总RNA的反转录，使用OmicsGreen qPCR主混合试剂(Omics Bio)，在ABI 7500实时PCR系统(Applied Biosystems)进行定量实时PCR。使用的引物系列于表2中。

表2：qPCR引物

(vi)分离初生大鼠的心肌细胞

分离初生大鼠的心肌细胞系如先前所述。从初生大鼠(P1-P3)中取出心脏，置入冷的HBSS/PBS(1:1)缓冲液中洗去血液。将心室捣碎后加入浓度为每毫升1毫克的胰蛋白酶(Sigma)，于4℃下进行4小时切割前处理。切割前处理后移除胰蛋白酶，添加浓度为每毫升0.8毫克的胶原酶第II型(Worthington)，于37℃下分解剩余组织(15分钟)。分解后，使用含血清的培养液中和酶活性，然后将细胞通过筛目为40-微米的细胞过滤器。在每分钟1200回转数(rpm)的转速下离心5分钟，用以移除酶。将细胞团块重新悬浮在电度培养液中(含10％FBS的低葡萄糖DMEM培养液)，在培养箱中进行1小时电镀前处理，以移除纤维母细胞。将细胞团块置于1％明胶涂盘中，待心肌细胞贴覆后，将细胞维持于培养液中(含1％FBS的低葡萄糖DMEM培养液)，供后续实验使用。

(vii)慢病毒调控let-7过量表达、抑制let-7及TGFBR3基因减量

Let-7a及let-7f基因序列利用正向引物及反向引物扩增。正向引物：5’-CCAAAAGGCCTGGTCCTAGA(SEQ ID NO:84)及反向引物：5’-CCA AAAGGCCTGGTCCTAGA(SEQ IDNO:85)。将大鼠TGFBR3的shRNA设计成标靶CTGTAGACAAAGACTCTTTC(SEQ ID NO:86；shTGFBR3-2)及CATTGCATTTGCAGCATTTG(SEQ ID NO:87；shTGFBR3-3)。使用AgeI和EcoRI，将不规则shRNA及shTGFBR3序列插入至pLKO_TRC014。自Sigma购得携带let-7及TuD RNA的慢病毒。

实验结果

(i)于猪体模式下MI后24小时内let-7a及let-7f对心肌梗塞的反应

为了探讨早期心肌梗塞的miRNA表达变化，猪体进行左前下行动脉(LAD)结扎1、2、及4小时。为了最小化个体差异，除了梗塞区域以外，采集远程区域作为内部控制组。请参照图1的A小图，使用MI之后经1、2、及4小时的样品进行次世代测序(NGS)。图6的A小图指出LAD结扎位置及梗塞区域。为了确认手术确实成功，进行心电图(ECG)(图6的B小图)以及Tunel试验(图1的B小图)。将心脏内含量丰富的miRNA筛选出并列于下表3中。根据它们的丰富性及不同表达量，挑选miRNA let-7a、let-7f、miR-22、miR-101、miR-103及miR-199a-3p进行茎环定量聚合酶链反应(Stem-loop qPCR)以再次分析。在MI之后4小时，这些miRNA全部呈现下调趋势，并在MI之后24小时达到显著下调(如图1的C小图至G小图所示)。miR-22为压力下心脏重塑(cardiac remodeling)的调节子(regulator)。过量表达miR-22会导致心脏肥厚(cardiac hypertrophy)，且在小鼠中，缺乏miR-22会现心脏衰竭及纤维化(可参考Huanget al.,Circ Res 112,1234-1243(2013)；and Gurha et al.,Circulation 125,2751-2761(2012)。miR-101在心肌梗塞后的抗纤维化中扮演重要的角色(可参考Pan et al.,Circulation 126,840-850(2012))。近年来，报导指出miR-103可调控心肌细胞的程序性坏死(programmed necrosis)(可参考Wang et al.,Circ Res117,352-363(2015)。miR-199a调节心脏代谢及自噬作用(可参考el Azzouzi et al.,Cell Metab 18,341-354(2013)；Liet al.,Cell Death Differ,(2015)。在这些miRNA中，含量非常丰富的let-7a及let-7f在MI后1天内显著下降。为了进一步确认此结果，使用TaqMan专一性探针侦测let-7a及let-7f的表达量。如图1的H小图所示：证实let-7a及let-7f专一性探针在MI后24小时皆呈现显著下调。

表3：miRNA序列(每百万次的转录数(TPM)>1000)

根据本项研究得到的NGS结果(图1的I小图)，在猪心脏中，let-7a及let-7f为含量最丰富的let-7成员。在人类中，含量最丰富的let-7成员同样为let-7a及let-7f(图6的D小图)。而在小鼠中，含量最丰富的let-7成员为let-7a、let-7b、let-7c及let-7f(图6的E小图)(可参考Meunier et al.,Genome Res 23,34-45(2013))。请参照图6的C小图，在小鼠模式中心脏内的let-7a/f表达与心脏发展呈现相关性，此结果证实let-7在心脏发展中占重要一环。

为了检验let-7下调是否起因于远程区域内的let-7上调，发明人进一步比较梗塞区域和远程区域的let-7a及let-7f表达量。请参照图1的J小图，let-7a及let-7f的下调现象仅在猪心脏梗塞区域中发现，而并未于猪心脏远程区域中观察到此现象。在小鼠MI模式中也检测到相似结果。请参照图1的K小图，在MI的后1天及2天，let-7a显著下调，并在MI之后6天逐渐上升。

(ii)Hmga2、Tgfbr1、TGFBR3及Trappc1为心肌细胞中let-7的潜在靶标

在心肌细胞和非心肌细胞内皆存在丰富含量的miRNA let-7(可参考Seeger etal.,J Mol Cell Cardiol 94,145-152(2016))。请参照图2的A小图，为了证明let-7的靶标基因，比较心脏RISC-seq数据库(参考Matkovich et al.,Circ Res 108,18-26(2011))及TargetScan软件(参考Shin et al.,Mol Cell 38,789-802(2010))。请见图7，发明人筛选出29个指标基因及Hmga2(正控制组)于心肌细胞中进行后续验证。请见图2的B小图至E小图及图7，于初生大鼠心肌细胞转染let-7a及let-7f抑制剂后，多种潜能靶标基因(包含Hmga2、Tgfbr1、TGFBR3及Trappc1)呈现上调现象。Hmga2为let-7的已知靶标(可参考Mayret al.,Science 315,1576-1579(2007)；Copley et al.,Nat Cell Biol 15,916-925(2013))。Tgfbr1及TGFBR3也分别被证实为let-7的靶标(可参考Tzur et al.,PLoS One 4,e7511(2009)；Tay et al.,Cell Res 24,259-260(2014))。另外，图2的F小图及G小图则呈现心肌细胞内Hmga2及TGFBR3的蛋白表达量。

在猪的MI模式中，HMGA2显著上调(如图2的H小图所示)。虽然TGFBR1和TGFBR3只有少量增加(如图2的I小图和J小图所示)，但在猪的梗塞组织中，HMGA2、TGFBR1及TGFBR3的蛋白表达是呈现上调(如图2的M小图所示)。为了探讨可能的let-7上游调控子，发明人进一步评估let-7初级转录及LIN28表达。LIN28为疾病发展时抑制let-7成熟的RNA结合蛋白(请参考Thornton et al.,Trends Cell Biol 22,474-482(2012))，且参予多种生物反应(请参考Zhu et al.,Cell 147,81-94(2011)；Iliopoulos et al.,Cell 139,693-706(2009))。本结果显示：在梗塞区域中，let-7初级转录并未减少(如图2的K小图所示)，而LIN28A则相对增加(如图2的L所示)。这样的结果指出：在梗塞区域中，let-7的下调可能是受到LIN28的表达所影响，并非单纯由本身转录的减少所致。

此外，为了确认在猪梗塞组织中的HMGA2及TGFBR3表达，进行免疫化学分析实验。HMGA2的表达在健康组织和坏死组织边界中，而在被免疫细胞环绕的心肌细胞中发现TGFBR3(如图2的N小图和O小图所示)。这些实验数据可推论出：在梗塞区域中，抑制let-7会诱发Hmga2及TGFBR3表达，如此Hmga2及TGFBR3在缺血性损伤的进展中可能扮演重要的角色。

(iii)TGFBR3活化非典型TGFβ信号-p38MAPK并促进心肌细胞凋亡

为了进一步了解let-7在心肌梗塞中的重要机制，制备可过量表达Hmga2及TGFBR3的腺病毒。有趣的是，Hmga2过量表达会引发自噬体指标-LC3B的裂解(如图3的A小图所示)，且TGFBR3过量表达会引发细胞凋亡指标(凋亡蛋白酶3)被切割(如图3的A小图所示)。TGFBR3，亦称为β聚糖，是一种TGF-β超家族成员的辅助受体，在不同组织中有多种功能(可参考Bilandzic et al.,Mol Cell Endocrinol 339,180-189；2011)。为了观察心肌细胞中TGFBR3的下游信号，使用不同感染单位(MOI)的TGFBR3过量表达的腺病毒感染初生大鼠心肌细胞。检测典型和非典型TGFβ信号。请见图3的B小图，结果显示：在心肌细胞中，p38MAPK的活化呈现明显的剂量依赖性，可说明在心肌细胞内TGFBR3过量表达后，如何引发细胞凋亡。请参见图3的C小图，在心肌细胞中，以p38MAPK抑制剂SB239063处理能够部分回复Tgfbr3所诱发的细胞凋亡。请参见图3的D小图，在活体实验中，经TGFBR3过量表达的腺病毒感染小鼠心脏后2天，亦发现p38MAPK的活化作用。为了在初生大鼠心肌细胞中抑制let-7，利用腺病毒表达TuD RNA。TuD RNA充分抑制let-7a及let-7f两者表达，并引起TGFBR3的表达量增加(如图8的A小图至C小图所示)。在葡萄糖及血清去除后24小时，TuD RNA对let-7表达的抑制会促进心肌细胞凋亡(如图3的E小图所示)。p38MAPK的活化对心脏重塑及心肌细胞凋亡相当重要(可参考Ren et al.,J Mol Cell Cardiol 38,617-623(2005))。MI后2天的小鼠梗塞组织中也侦测到p38MAPK活化(如图3的F小图所示)，以及在无血清诱发的大鼠胚胎细胞株H9C2中也侦测到p38MAPK活化(如图3的G小图所示)。这些结果指出：let-7/TGFBR3调控轴参予由p38MAPK活化引起的心肌细胞凋亡。除了所述TGFBR3抑制剂或let-7促进剂以外，可预期p38MAPK抑制剂也可以用于减缓心脏损伤。

(iv)过量表达Let-7及抑制TGFBR3可回复无血清引发的细胞凋亡

为了观察let-7在压力下的心脏保护(cardiac protection)中是否具有功能，利用慢病毒感染及抗生素筛选制造出过量表达Let-7的H9C2细胞株。请参见图4的A小图和B小图，过量表达let-7的H9C2细胞株显著表达let-7a和let-7f两者。在体外实验中，血清去除24小时后降低let-7a表达(如图4的A小图所示)，其可能由Lin28表达所导致(如图3的G小图所示)，并且引发细胞凋亡(如图4的C小图和G小图所示)。请参照图4的C小图和G小图，就subG1比例及经切割的凋亡蛋白酶3表达量而言，过量表达let-7能回复将血清去除所引发的细胞凋亡。请参照图4的D小图、H小图及J小图，就RNA和蛋白质表达而言，血清去除的压力会诱发TGFBR3，而let-7表达可抑制TGFBR3。虽然过量表达Let-7能显著抑制Hmga2及Tgfbr1的mRNA表达，然而在血清去除压力下，抑制效果并未显著(如图4的E小图及F小图)。

为了检测TGFBR3是否主宰血清去除所引发的细胞凋亡，制造两个shRNA调控的TGFBR3基因减量细胞株。如图4的J小图所示，在血清去除确认减量效果(knockdownefficiency)。两种shRNA调控的TGFBR3基因减量细胞株皆显著回复24小时无血清所引发的细胞凋亡(如图4的I小图所示)。在两种shRNA调控的TGFBR3基因减量细胞株中，血清去除压力下也观察到活化的p38MAPK及经切割凋亡蛋白酶3的减少(如图4的J小图所示)。这些体外实验结果指出：let-7在透过抑制TGFBR3-p38MAPK信号路径的心脏保护上扮演重要的角色。

(v)循环性let-7及TGFBR3对缺血性心脏损伤的反应

由于循环性miRNA的稳定性和可及性(accessibility)，循环性miRNA为多种疾病的重要指标(参考Cortez et al.,Nat Rev Clin Oncol 8,467-477(2011))。因此，评估血浆let-7是否对缺血性损伤有反应。在LAD手术之前、24小时之后及一周之后采集猪的血浆样品，从这些样品中萃取出血浆miRNA，测量let-7a及let-7f两者。有趣的是，在MI后一周，let-7a及let-7f两者皆显著下降(如图5的A小图和B小图所示)；从猪个体来看，亦观察到下调情形(如图5的C小图和D小图所示)。

为了进一步确认这些结果在临床上的应用，分析从急性MI病患上取得的血浆。相较于控制组，病患的血浆let-7a及let-7f表达明显较低(如图5的E小图及F小图所示)。这些结果指出：循环性let-7a及let-7f对心肌梗塞后的组织损伤可能有反应。

TGFBR3是一种膜蛋白，但也可被切割并释放到胞外基质(参考Bilandzic et al.,Mol Cell Endocrinol 339,180-189(2011))。在组织中TGFBR3的上调，可能导致血浆中TGFBR3的浓度增加。因此，分析猪血浆TGFBR3的浓度。请参照图5的G小图和H小图，猪血浆中的TGFBR3基础量大约每毫升10纳克。经MI之后24小时及1周之后，血浆TGFBR3的含量显著上调(如图5的G小图所示)。就每一猪个体而言，同样观察到血浆TGFBR3增加(如图5的H小图所示)。这些实验结果推论出：在血浆中所侦测到miRNA let-7a和let-7f的表达差异性，及其靶标基因TGFBR3的表达，可以作为治疗标靶或深入研究用的生物标记。

藉由使用大型动物模式及次世代测序技术，本案研究证实let-7a及let-7f为缺血性心脏损伤的效应子。这些miRNA的下调可去除TGFBR3表达的抑制作用。在心肌细胞中，TGFBR3调控p38MAPK活化及细胞凋亡。let-7表达及抑制TGFBR3两者都能回复压力引起的细胞凋亡。令人惊艳的是，在MI后的血浆中可侦测到let-7下调和TGFBR3上调，指出此类的miRNA可做为早期MI检测用的可靠生物标记。

本案研究的结果指出：miRNA let-7/TGFBR3可透过p38MAPK活化来调控缺血诱导的细胞凋亡。血浆miRNA let-7a和let-7f、以及血浆TGFBR3皆对心脏损伤反应。因此，这些miRNA及其靶标基因(例如TGFBR3)不仅期望成为潜在医疗标靶，同时期望作为诊断用的潜力生物标记。

其他实施方式

本案说明书中所揭露的所有特征可利用任何方式合并，说明书中揭露的每一个特征可置换成相同、对等或相似目的的替换特征。因此，除非额外陈述，于此揭露的每一个特征仅为一系列对等或相似特征中的一个范例。

如上所述，本技术领域中具有通常知识者可以轻易了解本发明的必要特征，在不背离其精神及范围下，本发明可以进行多种变化和改良，适用于多种用途及状况。因此，本案申请专利范围同样涵盖其他实施方式。

Claims

1.一种治疗心脏损伤的方法，包括：对有需要的个体投予有效量的let-7促进剂或转化生长因子β第三类受体抑制剂。

2.根据权利要求1的方法，其中该心脏损伤包括心肌梗塞、急性冠状动脉综合症、心肌炎、心肌病变、术后损伤或其组合。

3.根据权利要求1或2的方法，其中该TGFBR3抑制剂为：结合至TGFBR3的抗体、或抑制TGFBR3表达的干扰核糖核酸。

4.根据权利要求3的方法，其中该TGFBR3抑制剂为结合至TGFBR3的抗体。

5.根据权利要求4的方法，其中该抗体与糖基化TGFBR3作专一性结合。

6.根据权利要求5的方法，其中该抗体与该糖基化TGFBR3的N端抗原表位作专一性结合。

7.根据权利要求4至5的任一方法，其中该抗体结合至细胞表面的膜连型TGFBR3。

8.根据权利要求7的方法，其中该抗体结合至SEQ ID NO:2的序列。

9.根据权利要求4的方法，其中该抗体结合至与抗-RIII-1抗体相同的TGFBR3抗原表位、或该抗体与抗-RIII-1抗体竞争结合至TGFBR3；且其中抗-RIII-1包括一重链变异区及一轻链变异区，该重链变异区的氨基酸序列为SEQ ID NO:95，该轻链变异区的氨基酸序列为SEQ ID NO:96。

10.根据权利要求9的方法，其中该抗体包括：与氨基酸序列为SEQ ID NO:95相同的重链互补决定区、以及与氨基酸序列为SEQ ID NO:96相同的轻链互补决定区。

11.根据权利要求10的方法，其中该抗体包括：氨基酸序列为SEQ ID NO:95的重链变异区、以及氨基酸序列为SEQ ID NO:96的轻链变异区。

12.根据权利要求4至11中的任一方法，其中该抗体为全长抗体或其抗原结合片段。

13.根据权利要求4至12中的任一方法，其中该抗体为人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、或单链抗体。

14.根据权利要求1或2的方法，其中该let-7促进剂为let-7核酸。

15.根据权利要求14的方法，其中该let-7核酸包括SEQ ID NO:94的核苷酸序列。

16.根据权利要求1至15中的任一方法，其中该个体为具有心脏损伤或可能具有心脏损伤的人类患者。

17.根据权利要求1至15中的任一方法，其中该个体为具有心肌梗塞或可能具有心肌梗塞的人类患者。

18.根据权利要求1至17中的任一方法，其中，与没有心脏损伤的个体相比，该个体具有增高的TGFBR3含量、降低的let-7含量、或同时具有两者。

19.根据权利要求1至18中的任一方法，其中，该let-7促进剂或该TGFBR3抑制剂透过全身性路径或局部性路径递送。

20.根据权利要求19的方法，其中该局部性路径为心肌内注射或冠状动脉内注射。

21.一种测量生物样品内TGFBR3存在的方法，该方法包括：

(i)提供可能含有TGFBR3的生物样品；

(ii)将该生物样品与抗体接触，该抗体与切割型TGFBR3结合，该切割型TGFBR3包括SEQID NO:3的氨基酸序列；

(iii)测量该生物样品内切割型TGFBR3的含量；以及

(iv)判定该生物样品内为存在TGFBR3或不含TGFBR3。

22.根据权利要求21的方法，其中该抗体与糖基化的该SEQ ID NO:3的氨基酸序列作专一性结合。

23.根据权利要求22的方法，其中该抗体与SEQ ID NO:3的该序列的N端抗原表位结合，其中该抗原表位经糖基化处理。

24.根据权利要求21至23中的任一方法，其中该生物样品来自可能具有心脏损伤的人类个体。

25.根据权利要求21至24中的任一方法，其中该生物样品为血清样品或血浆样品。

26.根据权利要求21至25中的任一方法，其中该方法更包括：测量该生物样品内的let-7含量。

27.根据权利要求21至26中的任一方法，其中该方法更包括：基于该生物样品内的切割型TGFBR3的含量、let-7的含量或两者，评估该生物样品的来源个体是否具有心脏损伤或具有心脏损伤的风险。

28.根据权利要求27的方法，其中该方法更包括：若判定该个体具有心脏损伤或具有心脏损伤的风险，对该个体进行心脏损伤疗法。