CN102281898A - Il-20拮抗剂在治疗类风湿性关节炎和骨质疏松症中的应用 - Google Patents
Il-20拮抗剂在治疗类风湿性关节炎和骨质疏松症中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种通过给予IL-20拮抗剂来预防或治疗类风湿性关节炎和骨质疏松症的方法和组合物是。该IL-20拮抗剂可以是抗IL-20抗体,例如mAB 7E,所述IL-20拮抗剂能够结合人IL-20并阻断IL-20与其受体的相互作用。
Description
相关申请的交叉引用
本申请主张2008年10月7日递交的美国专利申请系列号No.12/246,715和2009年8月31日递交的美国临时专利申请系列号No.61/238,661的权益。每一申请都在此通过整体引用而引入本文。
发明领域
本发明涉及IL-20拮抗剂在预防、延缓骨质疏松症和类风湿性关节炎(风湿性关节炎,rheumatoid arthritis)发病或治疗骨质疏松症和类风湿性关节炎中的用途。
发明背景
骨质疏松症的病征在于低骨骼质量及骨骼组织的流失,导致骨骼的衰弱与易碎性。净骨质的流失可由各种因素所引起,如:低量的雌激素、钙质与维生素D摄取不正常及炎症等。就停经后骨质疏松症而言,其主要的病因为骨骼的再吸收。骨质疏松症为一种骨骼强度受损的疾病,该疾病会形成脆弱的骨骼并且提高骨折的风险性(Theill,LE,et al.,(2002)Annu Rev Immunol 20:795-823;Boyle,WJ,et al.,(2003)Nature 423;337-342)。更年期雌激素及雄激素的缺乏,将使骨骼的再吸收作用大于骨骼的形成,使骨骼代谢的失衡提高,因而导致骨质的流失相对较快,并且随之带来骨骼微架构的损坏(Simonet,WS,et al.,(1997)Cell 89:309-319;McClung,M,(2007)Arthritis Res Ther 9Suppl 1:S3)。在大多数的例子中,破骨细胞数目的增加或过高的破骨细胞活性,将使骨骼质量变低(Walsh,NC,et al.,(2005)Immunol Rev 208:228-251)。破骨细胞为一种表达耐酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)及降钙素受体的多核巨细胞,其破骨细胞的形成需具备下列两种因素:巨噬细胞群落刺激因子(M-CSF)及NF-κB受体活化子配体(RANKL)(Takayanagi,H,et al.,(2005)Immunol Rev 208:181-193;Ross,FP & Teitelbaum,SL,(2005)Immunol Rev 208:88-105)。其中,M-CSF主要可由基质成纤维细胞、成骨细胞、活化T细胞所产生,其与介导单核细胞/巨噬细胞前体的存活与增殖有关。RANK为RANKL的单一信号受体,且RANK能诱导破骨细胞的发育与活化作用(Suda,T,etal.,(1999)Endpcr Rev 20:345-357)。透过观察具严重骨质疏松症(增加骨骼质量)与缺乏破骨细胞的小鼠中,其小鼠体内的基因缺陷,已确定与生物体内的RANK-RANKL的信号递送极度相关(Kong,YY,et al.,(1999)Nature 397:315-323;Li,J,et al.,(2000)ProcNatl Acad Sci USA 97:1566-1571)。此外,几种前炎性细胞因子,如:TNF-α、IL-1β、IL-15、IL-17及IL-23,可协同RANKL作为诱导破骨前体细胞或破骨细胞的表型进行多核作用的细胞因子(Feldmann,M,et al.,(2001)Curr Dir Autoimmun 3:188-199;O’Gradaigh,D,et al.,(2004)Ann Rheum Dis 63:354-359;Sato,K,et al.,(2006)J Exp Med203:2673-2682;Ju,JH,et al.,(2008)J Immunol 181:1507-1518)。
IL-20为一种表达于单核细胞、上皮细胞及内皮细胞的多效性炎性细胞因子,且IL-20属于IL-10家族(即IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL-24及IL-26)的成员之一(Blumberg,H,et al.,(2001)Cell 104:9-19;Pestka,S,et al.,(2004)Annu Rev Immunol 22:929-979)。透过活化IL-20R1/IL-20R2或IL-22R1/IL-20R2等异质二聚物受体复合体(heterodimerreceptor complex),IL-20可与多种类型的细胞产生作用(Dumoutier,L.,et al.,(2001)JImmunol 167:3545-3549)。此外,IL-20也涉及各种炎性疾病的形成(Wei,CC,et al.,(2006)J Biomed Sci 13:601-612),如:银屑病(Blumberg,H,et al.,(2001)Cell 104:9-19;Sa,SM,etal.,(2007)J Immunol 178:2229-2240;Wei,CC,et al.,(2005)Clin Immunol 117:65-72)、类风湿性关节炎(Hsu,YH et al.,(2006)Arthritis Rheum 54:2722-2733)、动脉硬化症(Caligiuri,G,et al.,(2006)Arterioscler Thomb Vasc Biol 26:1929-1930;Chen,WY,et al.,(2006)Arterioscler Thomb Vasc Biol 26:2090-2095)、缺血性中风(Chen,WY & Chang,MS,(2009)J Immunol 182:5003-5012)、及肾衰竭(Li,HH,et al.,(2008)Genes Immnu 9:395-404)等。通过缺氧及发炎性刺激反应(如IL-1β及LPS)可调控IL-20的作用(Chen,WY & Chang,MS,(2009)J Immunol 182:5003-5012;Otkjaer,K,et al.,(2007)J Invest Dermatol)。近来有文献报导(Heuze-Vourc’h,N,et al.,(2005)Biochem Biophys Res Commun 333:470-475;Hsieh,MY,et al.,(2006)Genes Immun 7:234-242;Tritsaris,K,et al.,(2007)Proc Natl AcadSci USA 104:15363-15369)指出,IL-20会调控血管的新生作用(aniogensis)。于类风湿性关节炎的实验中,IL-20可作为一种前炎性细胞因子,其会诱导滑液膜成纤维母细胞分泌MCP-1、IL-6及IL-8(Hsu,YH,et al.,(2006)Arthritis Rheum 54:2722-2733)。
近年来,也有文献报导指出IL-20与类风湿性关节炎的发病有关,利用IL-20的可溶性受体可达到阻断IL-20的作用,进而降低胶原蛋白引发性关节炎的严重性(Hsu,YH,et al.,(2006)Arthritis Rheum 54:2722-2733)。因此,IL-20于类风湿性关节炎的发病过程中扮演一种促进因子的角色。然而,现今对于IL-20在骨质再吸收的作用,或是对于IL-20在RANKL-RANK信号介导的破骨细胞新生作用(osteoclastogenesis)中所扮演的功能的了解却是少之又少。
发明内容
本发明提供一种在个体中治疗、延缓骨质疏松症发病或预防骨质疏松症的方法,其包含向该个体给予一有效剂量的IL-20拮抗剂。
本发明也提供一种在个体中治疗、延缓类风湿性关节炎发病或预防类风湿性关节炎的方法,其包含向该个体给予一有效剂量的IL-20拮抗剂及TNFα拮抗剂(如依那西普多肽(etanercept polypeptide))。
本发明中描述的任一种IL-20拮抗剂可用于治疗、延缓骨质疏松症或类风湿性关节炎发病或预防骨质疏松症或类风湿性关节炎。于某些实施例中,IL-20拮抗剂是诸如mAb 7E或其功能等效物的抗IL-20抗体。
于一些方面,本发明提供通过向需要治疗的主体给予有效量的抗-IL-20抗体7E来治疗风湿性关节炎或骨质疏松症的方法。在一个实例中,抗-IL-20抗体7E是含有mAb7E的重链和轻链可变区的抗体,mAb 7E是由以保藏在美国菌种保存中心编号PTA-8687的杂交瘤细胞系所产生的。这一抗体的实例包括mAb 7E、其功能片段(例如F(ab’)2、Fab)、单链抗体或嵌合抗体。在其它实例中,抗-IL-20抗体7E是mAb 7E的人化抗体。
在上述方法中,优选地向主体进一步给予有效量的依那西普多肽。在一个实例中,依那西普多肽是含有人可溶性TNF受体(下示SEQ ID NO:5)和人IgG1的Fc部分(即依那西普)的融合蛋白。
本发明的范围中也包括抗-IL-20抗体7E在治疗骨质疏松症或制造用于治疗骨质疏松症的药物中的应用。本发明的范围也包括抗-IL-20抗体7E,优选与依那西普多肽一起在治疗骨质疏松症或制造用于治疗骨质疏松症的药物中的应用。
本发明的内容将更详尽地描述于以下一种以上实施例中。本发明其它的特征或优点也将以下列图示、多项实施例的详细说明及权利要求中,更加清楚地阐明本发明的内容。
附图简要说明
图1是显示健康的大鼠与分别以PBS、mIgG、mAb 7E、依那西普、或同时以mAb7E及依那西普处理患有胶原蛋白引发性关节炎的大鼠,其后脚掌严重肿胀发生率的数据图。
图2是显示健康的大鼠与分别以mIgG、mAb 7E、依那西普、或同时以mAb 7E及依那西普处理患有胶原蛋白引发性关节炎的大鼠,其TNF-α表达量(图2A)、IL-1β表达量(图2B)及IL-20表达量(图2C)的数据图。
图3a是小鼠体内IL-20的血清表达量的数据图,显示OVX-组小鼠IL-20的血清表达量增加,而以mAb 7E治疗OVX-小鼠体内IL-20的血清表达量减少,其中,*代表与对照组比较,P<0.05,#代表与OVX-mIgG组比较,P<0.05。图3b是显示经过下列方式处理的小鼠:假手术对照组(Sham control)(健康的小鼠)、卵巢移除后未经其它处理的小鼠(OVX)、以及以17β-雌二醇、OVX+mIgG、OVX+7E(3mg/kg)、或OVX+7E(6mg/kg)处理的小鼠,于两个月过后小鼠右胫骨的微断层扫描(micro-CT)分析图。图3c是显示每个实验组别中膝关节的骨骼矿物密度的数据图,其中该数据为平均值±标准差。
图4a是代表破骨细胞分化过程的培养系统分析图。图4b显示以肿瘤坏死因子(TNF)-α、mIgG或mAb 7E结合巨噬细胞群落刺激因子(M-CSF)及可溶性细胞核因子受体活化子配体(sRANKL)进行处理,利用耐酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)进行染色,其破骨细胞的分析图。图4c是显示每孔TRAP+破骨细胞的数量分析图。图4d是代表早期培养时以mAb 7E处理破骨细胞,其破骨细胞分化过程的培养系统示意图。图4e显示利用耐酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)染色破骨细胞的分析图。图4f是显示每孔TRAP+破骨细胞的数量分析图,其结果由三个独立实验所得到的结果。
图5a是显示具有M-CSF或不具有M-CSF的骨髓源造血干细胞(HSCs)中IL-20表达的数据图。图5b是显示以流式细胞分析实验中,IL-20处理造血干细胞(HSCs)的RANK蛋白质表面表达分析图,其中同工型表示以同工型抗体的阴性对照染色的细胞。图5c是显示经过IL-20处理的HSCs,其RANK mRNA的表达量增加的数据图。图5d是显示透过实时PCR测量,mAb 7E会抑制IL-20诱导蚀骨(OC)前体细胞中RANKmRNA的表达量的数据图。
图6a是以RT-PCR反应,检测IL-20及其受体于MC3T3-E1成骨细胞中的表达结果图。图6b是显示IL-20及其受体于MC3T3-E1细胞中的染色细胞:红色(IL-20及受体,AEC)、蓝色(细胞核)。图6c是显示以Western印迹分析法,分别使用下列的特异抗体,将细胞与IL-20一起持续培养特定时间长度的结果图:磷酸化(phospho-JNK,JNK)、磷酸化(phospho-ERK,ERK)、磷酸化(phospho-AKT,AKT)、磷酸化(phospho-p38,p38)、磷酸化(phospho-STAT3,STAT3)、β-肌动蛋白。图6d是显示RT-PCR实验中,以IL-20处理MC3T3-E1细胞中IL-17 mRNA的表达的分析结果图。图6e是以实时PCR进行测量,在IL-20处理的MC3T3-E1细胞中RANKL mRNA的表达量的数据图。图6f是显示在IL-20处理的MC3T3-E1细胞中RANKL蛋白质表达量的数据图。
图7是显示mAb 7E在MC3T3-E1成骨细胞中,抑制IL-20诱导RANKL表达的数据图,其中,其代表的结果是显示由三个独立实验所得到的结果。
发明详述
本发明基于发现IL-20为一种新的破骨细胞新生细胞因子(osteoclastogeniccytokines),其能引发破骨前体细胞上RANK的表达与成骨细胞上RANKL的表达。而IL-20拮抗剂,例如:IL-20特异单克隆抗体mAb 7E,将抑制IL-20诱导RANK及RANKL的表达。此结果显示,IL-20拮抗剂可抑制破骨细胞的分化,并且可于生物体内保护个体免于受到骨质流失等骨质疏松的问题。本发明也基于发现单独使用IL-20的特异单克隆抗体、或结合依那西普与IL-20的特异单克隆抗体一起使用,于类风湿性关节炎的动物模型中,能显着减少后脚掌厚度及肿胀,并达到防止软骨的损伤与骨质流失的功效。
本发明提供一种向个体给予有效剂量的IL-20拮抗剂(如:抗IL-20抗体或其抗原-结合片段),以达到治疗、延缓骨质疏松症发病或预防骨质疏松症的方法。于某些实施例中,IL-20拮抗剂结合其它用于骨质疏松症的医疗用药一起给予。于某些实施例中,骨质疏松症为停经后骨质疏松症。于某些实施例中,骨质疏松症与荷尔蒙缺乏有关。例如,在某些例子中,骨质疏松症是经过荷尔蒙去除处理而发生。荷尔蒙去除处理的例子包含乳癌治疗及前列腺癌治疗。此外,于某些实例中,骨质疏松症为类固醇引发性骨质疏松症或与类固醇相关的骨质疏松症。于某些实例中,骨质疏松症也与类风湿性关节炎相关。
本发明也提供一种向有此需要的个体给予有效剂量的IL-20拮抗剂(如:一抗IL-20抗体或其抗原-结合片段)以及有效剂量的TNFα拮抗剂(如:依那西普多肽),以治疗、延缓类风湿性关节炎发病或预防类风湿性关节炎的方法。
通用技术
透过本技术领域中常用的技术,如分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学与免疫学等领域中使用的一般技术,除非特别指明,均可用以实行本发明的内容。各种技术的详细内容请参阅下列参考文献:Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Second edition(Sambrook,et al.,1989)Cold Spring Harbor Press;Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984);Methods in Molecular Biology,HumanPress;Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press;AnimalCell Culture(R.I.Freshney,ed.,1987);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Matherand P.E.Roberts,1998)Plenum Press;Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-8)J.Wiely and Sons;Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.);Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weirand C.C.Blackwell,eds.);Gene Transfer Vectors for Mammaloan Cells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,et al.,eds.,1987);PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis,et al.,eds.,1994);Current Protocols inImmunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991);Short Protocols in Molecular Biology(Wileyand Sons,1999);Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997);Antibodies(P.Finch,1997);Antibodies:a practical approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989);Monoclonalantibodies:a practical approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000);Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring HarborLaboratory Press,1999);The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,HarwoodAcademic Publishers,1995)。
定义
“抗体”(通用于复数形)一词意指一免疫球蛋白分子,能透过位于免疫球蛋白分子可变区中的至少一个抗原识别位点,特异地结合一靶标,如:糖类、多核苷酸、脂质、多肽等。本发明中“抗体”一词不仅包含完整的单克隆或多克隆抗体,也包含其片段(如:Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、dAb(结构域抗体;参见Ward,et al.,1989,Nature,341:541-546)、包含抗体部分的融合蛋白、人化抗体、二价抗体(diabody)、嵌合抗体、线性抗体、单链抗体、如双重特异抗体(bispecific antibody的多重特异抗体(multispecific antibody)及其它任何一种免疫球蛋白分子的修饰构型,其中,此种免疫球蛋白分子的修饰构型包含抗原识别时所需的特异位点。此抗体包含任一类别的抗体,如:免IgG、IgA或IgM(或其亚型),且其抗体无需为任一特定的类别。依据抗体重链的恒定域的抗体氨基酸序列,免疫球蛋白可分为不同的主类,其中免疫球有五种主要的主类:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM,且上述的几种主类可更划分为几种亚型(同型),如:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。不同主类的免疫球蛋白对应的重链恒定域,分别称之为α、δ、ε、γ和μ,且不同免疫球蛋白类别的亚基结构及三维构型都是公知的。
“单克隆抗体”一词意指同源性抗体群(homogeneous antibody population),其中,单克隆抗体包含参与抗原选择性结合的氨基酸(自然存在及非自然存在)。这群单克隆抗体具有高度的特异性,并且直接针对单一抗原性位点进行结合。“单克隆抗体”一词不仅包含完整的单克隆抗体与全长的单克隆抗体,也包含其片段(如:Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白、人化抗体、嵌合单克隆抗体及其它任何一种免疫球蛋白分子的修饰构型,且此种免疫球蛋白分子的修饰构型具备结合至一抗原时所需的特异性及结合能力的抗原识别位点。本发明的抗体并不限制于其来源或制备的方法(如:杂交瘤、噬菌体筛选、重组表达、转基因动物等),且“抗体”一词的定义包含以上所述的所有免疫球蛋白及其片段。单克隆抗体可以源自多种物种,例如,鼠和人。
人化抗体意指由一非人类(如:鼠)所形成的抗体,其抗体可为特异的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其包含源自非人类免疫球蛋白的最小序列的片段(如:Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或是抗体的其它抗原-结合子序列)。大部分的人化抗体为人类免疫球蛋白(接受抗体者),其接受者的互补决定区(CDR)的残基是由一非人类物种(提供抗体者)CDR中的残基所取代,且此非人类的物种(如:大白鼠、仓鼠或兔子)的互补决定区中的残基是具备所需的特异性、亲和性及特性(capacity)的抗体。于某些实例中,人类免疫球蛋白的Fv框架区(FR)是由对应的非人类物种上的残基所取代。此外,人化抗体也可包含不存在于接受者抗体中的残基,也可包含不存在于嵌入互补决定区或框架序列的残基,但这些残基却能更佳化或最佳化其抗体性能。通常,人化抗体大致上包含至少一段且通常为两段的可变域,其中,全部或大多数的CDR区对应至非人类免疫球蛋白的CDR区,并且全部或大多数的FR区为人类免疫球蛋白一致序列。最佳化的人化抗体也包含至少一部分的人类免疫球蛋白固定区或区段(Fc),通常为一人类的免疫球蛋白。此抗体可具有Fc区域,其修饰的部分请参阅WO 99/58572的内容。其它形式的人化抗体则具有对应至原始抗体的一种或以上的CDR(一、二、三、四、五、六),也即,一种或以上的CDR是“源自”原始抗体中一种或以上的CDR。
“嵌合”抗体意指具有由第一物种的可变区或部分可变区,并且具有源自第二物种的恒定区的抗体。通常,在嵌合抗体中不论轻链或重链可变区皆模拟源自一种哺乳动物物种抗体的可变区,而其固定部分则源自于另一物种的抗体中的同型序列。于某些实施例中,可变区及/或恒定区皆可经过氨基酸的修饰。
一种抗体或多肽以“特异地结合”或“结合”(于此可交换使用)至一目标或抗原表位,而此为本技术领域中所熟知的用词,且决定特异结合的方法也为此技术领域中熟知。当上述分子与特定的目标反应或结合时,相较于与其它目标可具有更频繁、更快并且持续更长的时间及/或更强的亲合性时,代表该分子具有“特异地结合”能力。相较于抗体或多肽结合至其它物质,当抗体或多肽“特异地结合”至一目标时可展现较强的亲合性、结合性、更容易、和/或结合更长的时间。例如,当抗体特异地或偏好结合至IL-20的抗原表位时,也即抗体结合至IL-20抗原表位时,相较于结合至其它IL-20抗原表位或非IL-20抗原表位,将具有较强的亲合性、结合性、更容易、及/或结合更长的时间。也就是说,当抗体(或部分(moiety))特异地结合至第一目标时,可能可特异地或偏好结合至第二目标,也可能无法特异地或偏好结合至第二目标。因此,“特异地结合”或“偏好性结合”并非一定需要(虽然可能包含)单一的结合,一般而言(但非绝对),此结合意指偏好性的结合。
本发明中“IL-20”意指白介素-20及其变体,其变体包含至少部分的IL-20活性。于此,IL-20包含所有哺乳类物种(包含:人、犬、猫、马或牛)本身的IL-20序列。
“IL-20受体”意指结合或活化IL-20的一种或以上多肽。于某些实例中,IL-20是结合至由IL-20R1及IL-20R2所形成的复合体。于其它实例中,IL-20是结合至由IL-20R2及IL-22R1所形成的复合体。因此,IL-20受体包含任一哺乳类物种的IL-20R1、IL-20R2及IL-22R1,其哺乳类物种包含人、犬、猫、马、猿或牛,但并非仅限于此。人类IL-20受体的例子包含hIL-20R1(Genebank登录号No.NM_014432.2)、hIL-20R2(Genebank登录号No.NM_144717.2)及hIL-22R1(NM_181309.1),而人类IL-20受体的序列已于美国专利No.6,610,286、7,122,632、7,393,684及7,537,761,以及美国专利公开号No.2006/0263850A1、2006/0263851A1、2008/0247945A1及2009/0074661A1中描述。
“IL-20拮抗剂”意指任何一种可阻断、抑制或降低(包含显着地影响)IL-20生物活性的分子,其生物活性包含IL-20下游信号传导途径,如IL-20结合及/或抽离受体对细胞的反应。“拮抗剂”一词并未暗示特异的生物作用机制,其明确地包含及包括IL-20所有可能的直接或间接的药理作用、生理作用与生化作用。IL-20拮抗剂的示范例包括抗IL-20抗体或其片段、对应IL-20的反义分子(包含对应IL-20核酸编码的反义分子)、对应IL-20核酸的小干扰核糖核酸(siRNA)、对应IL-20核酸的microRNA、以及IL-20抑制性化合物,但本发明的IL-20拮抗剂并非仅限于此。为了更详尽地说明本发明的目的,“拮抗剂”包含所有先前提及的用词、标题、及功能叙述与特征,拮抗剂用以大略破坏、减少或中和IL-20本身、IL-20的生物活性(包含介导任一方面的骨质疏松症的能力,但并非仅限于此)、或IL-20生物活性相关反应至一定的程度。于某些实施例中,IL-20拮抗剂透过与IL-20进行结合,达到防止形成IL-20受体复合体的功效。于其它实施例中,IL-20拮抗剂则会抑制或减少IL-20的合成和/或产生(释放)。于本说明书中将提供IL-20拮抗剂类型的实例。
本发明中“抗IL-20抗体”意指一种可结合至IL-20的抗体,以及可以抑制IL-20生物活性和/或IL-20介导的下游信号途径的抗体。
“抗IL-20抗体7E”一词意指单克隆抗体mAb 7E及其功能变体。mAb 7E是由保藏于美国菌种保存中心(American Type Culture Collection,ATCC,10801 UniversityBoulevard,Manassas,VA 20110-2209,U.S.A.)编号PTA-8687的杂交瘤细胞株所产生的抗体。此杂交瘤细胞株将会在美国专利申请后自行无限制/条件地公开,并且将其保存于ATCC,其保存期限是自即日起的五年内,而在维持本专利有效性的前提下,其保存期限是自寄存当日起算至少三十年。
mAb 7E的“功能等效物”是这样的抗体:(1)特异地结合至人类IL-20;(2)包括一个至少70%(例如80%、90%或95%)和mAb 7E的重链可变区(VH)(如SEQ ID NO:2所示,其中,SEQ ID NO:2序列由SEQ ID NO:1的核苷酸序列所编码)相同的重链可变区,以及一个至少70%(例如80%、90%或95%)和mAb 7E的轻链可变区(VL)(如SEQ ID NO:4所示,其中,SEQ ID NO:4由SEQ ID NO:3的核苷酸序列所编码)相同的轻链可变区的抗体。请参阅美国专利申请号11/763,812。
本发明中两个氨基酸序列的“同源性百分比”是依照文献(Karlin and Altschul,Proc,Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268,1990)中的算法所测定,并且依照文献(Karlinand Altschul,Proc,Natl.Acad.Sci.USA 5873-5877,1993)中所述方式进行修饰。此算法是合并文献(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990)中NBLAST及XBLAST两程序。BLAST蛋白质的检索是以XBLAST程序在分数=50、字长=30的设定条件下执行,以得到相关的多肽同源氨基酸序列。使用文献(Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997)中所述的空位BLAST程序进行演算,是为了比较并且得到空位比对的演算结果。当利用BLAST及空位BLAST的程序演算时,是分别使用程序(如XBLAST及NBLAST)中预设的参数进行演算。请参阅网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)。
mAb 7E的功能性等效物可以是其通过酶切产生的片段,例如Fab或F(ab′)2。它也可以是含有mAb 7E的VH和VL区的基因工程抗体。这类抗体的实例包括但不限于:单链抗体,其中mAb 7E的VH和VL是经由接头(例如肽接头)共价地融合;鼠-人嵌合抗体,其中mAb 7E的VH和VL分别与人IgG的重链和轻链恒定区连接。
功能性等效物也可以是人化抗体。术语“人化”抗体指非人抗体,其中它的VH和VL的框架区(FR)与恒定区,如果有的话,被人抗体的FR和恒定区代替。此外,mAb 7E功能性等效物也可以通过在VH或VL的FR中引入突变来产生。熟知的是,抗体的互补决定区(CDR)决定它的抗原特异性。相应地,FR的突变通常不影响抗体特异性。抗体的CDR和FR可以基于它的VH和VL的氨基酸序列来确定。见www.bioinf.org.uk/abs。本文所述的功能性等效物的结合-特异性可以用本领域已知的方法检验,例如ELISA或western印迹分析。
单克隆抗体mAb 7E及其动能性等效物可以通过常规方法,例如通过纯化上述杂交瘤细胞分泌的抗体,或者通过基因工程来制备。
本发明中“治疗”意指采用或给予包含一种或以上活性剂的组合物至主体,且该主体是患有类风湿性关节炎、骨质疏松症、上述两种疾病病症、或具有罹患上述两种疾病倾向的主体,以针对这两种疾病及其病症、或这两种疾病倾向,达到治疗、治愈、减轻、舒缓、改变、补救、改善、改进或影响的目的。
本发明中“有效剂量”意指为达到治疗功效的目的,每种活性剂(不论是单独使用或与其它一种或以上的活性剂共同使用)给予个体所需的剂量。有效剂量为本领域技术人员可依据给药方式、使用的赋形剂及合并使用其它活性剂的不同而改变有效剂量的多寡。
本发明中“延缓”如骨质疏松症或类风湿性关节炎的疾病发生,意指缓发、阻止、减慢、延迟、安定和/或顺延此类疾病的进展。此种延缓可依处理的疾病和/或个体改变延缓的时间长度。本领域技术人员可推知足够或显着的延缓也包含预防的涵义,因而可以避免发病。相较于使用其它方法,此方法“延缓”病征发病是指于一设定时间内降低病征发病的机率,和/或于一设定时间内降低此病征的程度。此比较通常是利用临床试验,透过足够的数据得到统计上显着的结果。
疾病(如骨质疏松症或类风湿性关节炎)的“发生”或“进展”意指疾病开始的表现和/或疾病确切的进展。使用此技术领域中熟知的标准临床技术,可检测或评估疾病的发生。然而,疾病的发生或进展也可能无法侦测。本发明中,发生或进展是指此病征的生理过程。于此,“发生”包含形成、复发以及开始。于本发明中,骨质疏松症的“开始”或“形成”包含起始的开始和/或复发。
本发明中“试剂”意指生物、药学、或化学化合物,非限制性的举例可包含:单一或复合的有机或无机化合物、肽、蛋白质、寡核苷酸、抗体、抗体衍生物、抗体片段、维生素衍生物、糖类、毒素或化疗化合物。可经由合成形成各种化合物,如:小分子、寡聚物(如寡肽与寡核苷酸)及以各种核心结构为基础的合成有机化合物。此外,各种如植物或动物的提取物天然源料等皆可用以筛选化合物。任何本领域技术人员可了解本发明对试剂结构并无任何限制。
本发明中“共同-给予”或“一起给予”包含同时给予及/或于不同时间给予。共同-给予也包括共同制剂(即IL-20拮抗剂与试剂所组成的组合物)给予或分开组成的给予。于此,共同-给予可指将试剂与IL-20拮抗剂同时和/或分开给予至一个体的情形。此外,共同-给予更可解读为以不同给药频率或给药间隔进行IL-20拮抗剂与试剂的给予。举例来说,抗IL-20抗体可以周期性给予,或者可更频繁地给予此试剂,也可解读为可使用相同的给药路径或不同给药路径给予IL-20拮抗剂与试剂。
“个体”或“主体”指哺乳类动物,较佳为人类。哺乳动物包含饲养动物、突变动物(sport animal)、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠与仓鼠。
关于本发明中提及所有方法中所指IL-20拮抗剂,也包含具有一种或以上试剂的组合物。此组合物更包含此技术领域中熟知的适当赋形剂,例如:一种包含缓冲液的医药可接受的赋形剂(载体)。本发明可单独使用或与其它传统治疗方法一起使用。
于发明内容与申请专利范围项中,单数型的一/此包含其复数型,除非于说明书中有特别强调其它涵意。例如,“抗体”包含一个或多个(摩尔量)抗体,也包含此领域中熟知的其等效涵意等。
于本发明所述的方面及其变化,应解读为包含方面及其变化的“组成”和/或“基本组成”。
IL-20拮抗剂
本发明可用于在有需要的个体中治疗、延缓骨质疏松症及类风湿性关节炎疾病的发生和/或预防罹患骨质疏松症及类风湿性关节炎疾病,且上述个体包含人类或非人类的哺乳类动物。
本发明提供的方法使用IL-20拮抗剂,其为任何可阻断、抑制或降低(包含显着地影响)IL-20的生物活性的分子。其中,生物活性包含由IL-20信号介导的下游途径,如IL-20结合和/或引出受体对细胞的应答。IL-20的实例为人类IL-20。在一些实施方式中,IL-20包括IL-20的天然变体。人IL-20的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)如下所示:
MKASSLAFSLLSAAFYLLWTPSTGLKTLNLGSCVIATNLQEIRNGFSEIRGSVQAKDGNIDIRILRRTESLQDTKPANRCCLLRHLLRLYLDRVFKNYQTPDHYTLRKISSLANSFLTIKKDLRLCHAHMTCHCGEEAMKKYSQILSHFEKLEPQAAVVKALGELDILLQWMEETE(下划线部分为信号肽)
IL-20拮抗剂的范例包含:抗IL-20抗体或其片段、对应IL-20的反义分子(包含对应IL-20核酸编码的反义分子)、对应IL-20核酸的小干扰核糖核酸(siRNA)、对应IL-20核酸microRNA、IL-20抑制性化合物、及包含IL-20受体的胞外部分的多肽,但本发明的IL-20拮抗剂并非仅限于此。为了更详尽地说明本发明的目的,“拮抗剂”包含所有先前提及的用词、标题、及功能叙述与特征,拮抗剂用以大略移除、减少或中和IL-20本身、IL-20的生物活性(包含介导任一方面的骨质疏松症、发炎疾病的能力,但并非仅限于此)、或IL-20生物活性相关反应至一定的程度。于某些实施例中,IL-20拮抗剂将与IL-20结合,并且防止IL-20与一种或以上的IL-20受体形成复合体。于其它实施例中,IL-20拮抗剂将抑制或减少IL-20的合成和/或产生(释放)。据此,于某些实施例中,IL-20拮抗剂将与IL-20结合(物理性相互作用)。于某些实施例中,IL-20拮抗剂为与IL-20结合的多肽。于某些实施例中,IL-20拮抗剂为肽或经过修饰的肽(如IL-20结合肽,包含融合至Fc域的可溶性受体IL-20R1、IL-20R2和/或IL-22R1)。请参阅美国专利号6,610,286、7,189,394、7,364,732、7,393,684及7,537,761,以及美国专利公开号2006/0263850A1、2006/0263851A1、2008/0171041A1及2008/0233115A1。于其它实施例中,IL-20拮抗剂为抗IL-20抗体。同样于其它实施例中,IL-20拮抗剂为人化抗体。于某些实施例中,抗IL-20抗体为抗体mAb 7E或与mAb 7E的功能等效物。于其它实施例中,抗IL-20抗体包含抗体mAb 7E一种或以上的CDR(s)(如一、二、三、四、五,或于某些实施例中,所有六个CDRs皆源自mAb 7E)。于其它实施例中,抗IL-20抗体为人化的抗体。同样于其它实施例中,抗IL-20抗体包含重链可变区(SEQID NO:2)的氨基酸序列和/或轻链可变区(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。同样于其它实施例中,抗体包含修饰的恒定区,如免疫惰性的恒定区(如不会诱发互补介导裂解或不会刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))。于其它实施例中,恒定区的修饰请参阅Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624、国际专利申请号PCT/GB99/01441和/或英国专利申请号9809951.8。于其它实施例中,IL-20拮抗剂将抑制(减少)IL-20的合成和/或释放。
mAb 7E重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)及氨基酸序列(SEQ ID NO:2)
gaa ttg aag ctt gag gag tct gga gga ggc ttg gtg cag cct gga 45
E L K L E E S G G G L V Q P G 15
gga tcc atg aaa ctc tct tgt gct gcc tct gga ttc act ttt agt 90
G S M K L S C A A S G F T F S 30
gac gcc tgg atg gac tgg gtc cgc cag tct cca gag aag ggg ctt 135
D A W M D W V R Q S P E K G L 45
gag tgg att gct gaa att aga agc aaa gct aat aat tat gca aca 180
E W I A E I R S K A N N Y A T 60
tac ttt gct gag tct gtg aaa ggg agg ttc acc atc tca aga gat 215
Y F A E S V K G R F T I S R D 75
gat tcc aaa agt ggt gtc tac ctg caa atg aac aac tta aga gct 270
D S K S G V Y L Q M N N L R A 90
gag gac act ggc att tat ttc tgt acc aag tta tca cta cgt tac 315
E D T G I Y F C T K L S L R Y 105
tgg ttc ttc gat gtc tgg ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc 360
W F F D V W G A G T T V T V S 120
tca 363
S 121
mAb 7E轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)及氨基酸序列(SEQ ID NO:4)
gat ttt gtg atg acc cag act cca ctc act ttg tcg gtt acc att 45
D F V M T Q T P L T L S V T I 15
gga caa cca gcc tcc atc tct tgc aag tca agt cag agc ctc ttg 90
G Q P A S I S C K S S Q S L L 30
gat agt gat gga aag aca tat ttg aat tgg ttg tta cag agg cca 135
D S D G K T Y L N W L L Q R P 45
ggc cag tct cca aag cac ctc atc tat ctg gtg tct aaa ctg gac 180
G Q S P K H L I Y L V S K L D 60
tct gga gtc cct gac agg ttc act ggc agt gga tca ggg acc gat 215
S G V P D R F T G S G S G T D 75
ttc aca ctg aga atc agc aga gtg gag gct gag gat ttg gga gtt 270
F T L R I S R V E A E D L G V 90
tat tat tgc tgg caa agt aca cat ttt ccg tgg acg ttc ggt gga 315
Y Y C W Q S T H F P W T F G G 105
ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgg 339
G T K L E I K R 113
抗IL-20抗体
本发明某些实施例中,IL-20拮抗剂包含抗IL-20抗体,抗IL-20抗体为此领域中已知的知识,请参阅美国专利号7,435,800、7,115,714、7,119,175及7,393,684,以及PCT公开号WO 2007/081465、WO 99/27103、WO 2004/085475及WO 2005/052000。
于其它实施例中,抗IL-20抗体包含抗体mAb 7E一种或以上的CDR(如一、二、三、四、五,或于某些实施例中,所有六个CDR皆源自mAb7E)。于某些实施例中,抗IL-20抗体包含三个抗体重链的CDR及三个抗体轻链的CDR,且此抗体由ATCC编号PTA-8687的细胞株或其子代所生产。于某些实施例中,抗IL-20抗体包含三个重链CDR(如SEQ ID NO:2所示)的氨基酸序列和/或三个轻链CDR(如SEQ ID NO:4所示)的氨基酸序列。
测定CDR区域为此技术领域中已熟知的技术。CDR可为Kabat、Chothia或Kabat与Chothia的结合。至少有两种技术可测定CDR:(1)以交叉物种序列变异性为基础的方法(即,Kabat et al.Sequences of Proteis of Immunological Interest(5th ed.,1991,国家卫生研究院Bethesda MD));及(2)以抗原-抗体复合体的结晶学研究为基础的方法(Chothia et al.(1989)Nature 342:877;Al-lazikani et al.(1997)J.Molec.Biol.273:927-948)。于此,CDR可分别由上述两种方法中其中一种或同时使用上述两种方法的组合所测定。
本发明使用的抗体可包含单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)、嵌合抗体、双重特异抗体、异源结合抗体、单链抗体(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白、人化抗体、及其它任何一种免疫球蛋白分子的修饰构型,且此种免疫球蛋白分子的修饰构型包含抗原识别时需要的特异位点,且包含抗体糖基化变体、抗体氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。此抗体可由小鼠、鼠、人类或及其它任何来源(包含嵌合抗体或人化抗体)取得。本发明的目的在于使抗体与IL-20反应,以抑制IL-20和/或IL-20的信号功能下游传导途径。于实施例中,抗体为人类抗体、人化抗体或嵌合抗体,且该抗体能识别人类IL-20上一种或以上的抗原表位。于某些实施例中,抗IL-20抗体结合至人类IL-20上相同抗原表位,其抗体即为mAb 7E。于其它实施例中,抗体包含经过修饰的恒定区,如免疫惰性的恒定区(如不会诱发互补传导裂解或不会刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))。ADCC活性可使用于美国专利号5,500,362的方法评估。于其它实施例中,修饰的恒定区请参阅Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624、国际专利申请号PCT/GB99/01441;和/或英国专利申请号9809951.8。
抗IL-20抗体结合至IL-20(如人类IL-20)的结合亲和力可小于任何约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM、或约50pM至任何约2pM。结合亲和力可以KD或解离常数表达,当结合亲和力增加时将降低KD的大小。通过测量抗体的单功能性Fab片段的结合亲和力,可测定抗体结合至IL-20的结合亲和力大小。为了得到功能性Fab片段,可使用木瓜蛋白酶切断一抗体(如IgG)或可由抗体重组表达得到。抗体的抗IL-20Fab片段的亲和力可由表面等离子体共振(BlAcore3000TM表面等离子体共振(SPR)系统,BIAcore,INC,Piscaway NJ)所测定,可得到动力结合常数(kon)和解离常数(koff)(通常于25℃下测量),并经由计算koff/kon得到平衡解离常数(KD)。
于某些实施例中,抗体可与人类IL-20结合,但并不会与其它哺乳动物物种上的IL-20有明显的结合。于某些实施例中,抗体会与人类IL-20结合,也可与其它哺乳动物物种上一种或以上的IL-20有显着的结合。于其它实施例中,抗体可结合IL-20,但并不会与其它细胞因子(如相关的细胞因子IL-10、IL17A、IL-19、IL-22、IL-24及IL-26)有明显的交叉反应。抗体结合的抗原表位可为连续性或非连续性的区域。于其它实施例中,抗体通常与抗体mAb 7E结合相同的人类IL-20的抗原表位。
抗IL-20抗体可以此技术领域中已知的方法制作。例如,可使用IL-20的全长或部分序列作为免疫原,透过免疫反应制成可抑制IL-20的抗体。于下将更详尽地描述已建立的及传统的技术中,宿主动物通常用以刺激并且生成抗体的免疫作用的路径与方案。此外,也于此加以详尽描述本技术领域中通常用于生产鼠、人化及人类抗体的方法。
任何哺乳动物主体(包含人类或其生产抗体细胞)皆可提供哺乳类动物作为生产(包含人类、杂交瘤细胞株)的基础。通常,宿主动物是经由腹腔、肌肉注射、口头、皮下、脚底和/或皮内接种一剂量的免疫原,并且包含于此所述的方法。
可使用一般体细胞杂交技术(Kohler,B.及Milstein,C.(1975)Nature 256:495-497)或改良的体细胞杂交技术(Buck,D.W.,et al.,In Vitro,18:377-381(1982)),以从淋巴细胞及永生骨髓瘤细胞制备杂交瘤。杂交反应时可使用的骨髓瘤细胞株包含X63-Ag8.653及其它由Salk Institute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA取得的细胞株,但并非仅限于此。一般而言,使用融合剂(如聚乙二醇)融合骨髓瘤细胞及淋巴细胞细胞的技术或电方法皆为此技术领域公知技术。于融合后,将细胞从融合培养基中相互分离,并且于选择性生长培养基中成长,如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT)培养基,以去除未杂交的母细胞。于此所述的任何一种培养基,不论是含有血清或不含血清的培养基,皆可用来培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。而以另一种细胞融合技术,可使用EBV永生B细胞生产本发明的抗IL-20单克隆抗体。于此技术中杂交瘤将扩大并经过子克隆,需要时,可使用一般免疫法的步骤(如放射免疫分析法、酶免疫分析法或荧光免疫分析法)检验其上清液中的抗免疫原的活性。
杂交瘤包含所有杂交瘤母细胞的衍生物及子代细胞,皆可作为生产对IL-20或其部分具有特异的单克隆抗体的抗体来源。
可使用已知方法于体内或体外生长用以生产此类抗体的杂交瘤。需要时,也可使用传统纯化免疫球蛋白的方法(如硫酸铵沉淀法、凝胶电泳法、透析法、层析法及超滤),将单克隆抗体由培养基或体液中分离出来。当其中含有不想要的活性抗体存在时,可使用固相上接有由免疫原制成的吸附剂进行纯化,再将想要的抗体由免疫原上洗脱并且释放出来。将宿主动物与人类IL-20或包含目标氨基酸序列的片段与蛋白质结合的免疫作用,可形成一群抗体(如单克隆抗体),其中此蛋白质为待免疫物种的免疫原,如匙孔戚血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或使用双功能性或衍生化试剂的大豆胰蛋白酶抑制剂,例如:磺酸基琥珀酰亚胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimideester)(由半胱氨酸残基结合)、N-羟基琥珀酰亚胺(由离赖酸残基结合)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N=C=NR,其中,R及R1为不同的烷基。
需要时,可对想要的(如由杂交瘤生产的抗体)抗IL-20抗体(单克隆或多克隆抗体)测序,且可随后将其多核苷酸序列克隆到用以表达或增殖的载体上。编码目的抗体的序列可维持于宿主细胞的载体中,之后可扩增宿主细胞,并且将其冰冻以供将来利用。此外,多核酸序列也可用于基因操作,以将此抗体“人化”或增进其抗体的亲和力或其它特性。例如,可将此恒定区基因化为更像人类的恒定区,以避免抗体使用于人体临床试验及治疗时产生免疫反应。此外,也可对抗体序列进行基因操作,使其对IL-20具有更强的亲和力与抑制IL-20的效率。于此,本领域技术人员可轻易将抗IL-20抗体进行一种或以上多核苷酸的改变,并且可依然维持抗体对IL-20的结合能力。
通常,“人化”抗体意指一个具有抗原结合位点的分子,且其抗原结合位点多半衍生自非人类物种的免疫球蛋白,而分子中其余的免疫球蛋白结构则以人类的免疫球蛋白的结构和/或序列形成。其中,抗原结合位点可包含融合恒定域的完整可变区,或仅包含可变区中移植(graft)至适当框架区的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可为野生型或经过一种或以上氨基酸取代(如修饰成更类似于人类的免疫球蛋白)修饰的序列。人化抗体的一些类型可保留所有互补决定区的序列(例如,人化的小鼠抗体包含小鼠抗体的六个互补决定区)。其它的人化抗体类型则可具有对应原有抗体且具有一种或以上的互补决定区(一、二、三、四、五、六)。于某些例子中,人类免疫球蛋白的框架区(FR)残基或其它残基,可以非人类物种中对应的残基取代。此外,人化抗体也可包含不存在于接受抗体或供体抗体中的残基。其中,人化也可包含亲合力成熟(affinity maturation)的涵义。
此外,本发明也可利用市售小鼠透过基因工程表达特定的人类免疫球蛋白,以此取得完整的人类抗体。于此,可设计转基因动物技术,制得更想要的免疫球蛋白(如完整的人类抗体)或具有更强免疫反应的人化抗体或人类抗体。此技术的例子如:Amegn,Inc.(Fremon,CA)的XenomouseHuMAb-Mouse及Medarex,Inc.(Princeton,NJ)的TCMouseTM。或者,可透过噬菌体展示技术重组抗体,请参阅如美国专利编号5,565,332;5,580,717;5,733,743;及6,265,150;以及文献(Winter et al.,(1994)Annu.Rev.Immunol.12:433-455)。另外,可由未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因序列(immunoglobulinvariable domain gene repertoires),透过噬菌体展示技术,于体外实验制造人类的抗体及其抗体片段(McCafferty et al.,(1990)Nature 348:552-553)。
使用传统的方法(如使用能与编码单克隆抗体中重链与轻链的基因特异结合的寡核酸探针)可轻易地将编码单克隆抗体的DNA分离并且测序,且此DNA较佳的来源为杂交瘤细胞。一旦分离之后,DNA可置于一种或以上的表达载体中,再转染至如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞等宿主细胞上,以利于在重组的宿主细胞中得到合成的单克隆抗体,而不是产生免疫球蛋白。请参阅PCT公开号WO 87/04462。于此,例如以人类的重链或轻链恒定域的编码序列取代同工型的小鼠序列(Morrison et al.,(1984)Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851),或将非免疫球蛋白多肽中全部或部分的编码序列,以共价方式结合至免疫球蛋白编码序列中,使DNA也可为一种经过修饰的DNA。于此方法中,所制得的”嵌合”或”杂交”抗体可为具有特异结合的抗-IL-20的单克隆抗体。
抗IL-20抗体可由此技术领域中已知的方法表征,例如可使用一种鉴定抗原表位的结合或”抗原定位”(epitope mapping)的方法。目前于此技术领域中有多种方法用以定位及测定蛋白质上抗原表位的位点,包含解出抗体-抗原复合体的晶体结构、竞争试验、基因片段表达试验法、以及合成肽-基试验法等详细内容请参阅书目(Chapter 11 ofHarlow and Lane,Using Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Habor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,New York,1999)。于其它实例中,可使用抗原定位法测定抗-IL-20抗体结合的序列。其抗原表位可为线性的抗原表位,即单一延伸的氨基酸、或可能以非单一延伸的氨基酸三维作用力形成的构型抗原表位(一级结构线性序列)。不同长度(如至少4-6个氨基酸长度)的肽可分离或合成(如重组),并用于抗IL-20抗体的结合试验法。于另一实例中,可将源自IL-20的肽重叠及测定抗IL-20抗体结合的位点,以系统筛选结合抗IL-20抗体的抗原表位。透过基因片段表达试验法,可随机或经由特异基因构建体将编码IL-20的开放读码框片段化,并藉此将IL-20的表达片段与抗体进行测试,并且测定其反应性大小。例如,可将PCR制得的基因片段,在放射性氨基酸存在下,于体外转录并且翻译成蛋白质,再透过免疫沉淀法及凝胶电泳,测定抗体与放射性标记的IL-20的结合片段。此外,也可使用大文库中会呈现于噬菌体颗粒表面(噬菌体文库)的随机肽序列,辨识某些抗原表位。再者,也可透过单一结合试验法,测试特定数据库中结合至试验抗体的重叠肽片段。于额外的实例中,可透过突变抗原结合区段、区段互换实验(domain swapping experiments)及丙氨酸扫描性突变(alaninescanning mutagenesis),识别抗原表位结合所需要、足够和/或必要的残基。例如,可使用各种高相关性但并非独特抗原蛋白质(如神经营养素蛋白质家族的另一成员)的序列,替代(交换)IL-20多肽的各种片段,并且以此突变的IL-20进行区段交换实验。通过取得抗体与突变的IL-20结合的位点,可得到特定IL-20片段对抗体结合的重要性。
在一些实施方式中,本文所述的抗体与mAb 7E识别的IL-20表位相结合。在一些实施方式中,本文所述的抗体竞争或者显着抑制mAb 7E与IL-20多肽(例如人IL-20)的结合。在一些实施方式中,本文所述的抗体与包含抗体mAb 7E的重链可变区和/或mAb 7E的轻链可变区的抗体竞争,以便与IL-20多肽结合。
另外,也可使用此技术领域中另一种已知的竞争性分析方法,将已知结合相同抗原的其它抗体(即IL-20的各种片段),透过竞争性分析法分析抗-IL-20抗体,以确定抗-IL-20抗体是否如其它抗体一样,也结合至相同的抗原表位。竞争分析是本领域技术人员熟知的。竞争分析可以用于:通过识别同样的或立体重叠的表位确定是否两种抗体与相同的抗原结合;或者是否一种抗体竞争性地抑制另一种抗体与抗原的结合。这些分析是本领域已知的。典型地,当孵育时,随着竞争性抗体的量增加,mAb 7E与人IL-20的结合减少至少约50%,至少约60%,至少约70%,至少约80%,或者至少约90%。可用于标示抗体结合的其它方法在Morris(1996)″Epitope Mapping Protocols,″Methods in Molecular Biology v.66(Humana Press,Totowa,NJ)中有提供。
其它IL-20拮抗剂
于本发明中,可使用除了抗-IL-20抗体以外的分子作为IL-20拮抗剂。于本发明的某些实施例中,IL-20拮抗剂包含至少一种能阻断或减少功能性IL-20的表达的反义分子。IL-20的核苷酸序列为已知并且可轻易由公开性可取得的数据库中取得,请参阅如基因银行取得编号NM 018724.3及NP 061194.2。利用不需与其它多核苷酸行交叉反应的常规方法,即可制备对IL-20mRNA特异结合的反义寡核苷酸分子。其对应的目标示范位点可包含但不仅限于起始密码子、5’调节区、密码序列及3’非转译区。于某些实施例中,寡核苷酸的长度约为10至100个核苷酸、约15至50个核苷酸长、约18至25个核苷酸长或更多。寡核苷酸可包含如此技术领域中已知的两种方法(磷硫酰键(phosphorothioate linkage)和2’-O糖修饰)进行骨架的修饰。
另外,可使用于此技术领域中已知的基因敲除、吗啉寡核苷酸小干扰RNA(siRNA或RNAi)、microRNA或核糖核酸酶等方法,可达到降低细胞的表达和/或释放的目的。
于其它实施例中,IL-20拮抗剂包含至少一种IL-20抑制性化合物。于此,“IL-20抑制性化合物”指除了抗-IL-20抗体外,可直接或间接减少、抑制、中和或破坏IL-20生物活性的化合物。一种IL-20抑制性化合物应具备下列任何一种或以上的特性:(a)结合IL-20,并且抑制IL-20的生物活性和/或抑制IL-20信号功能下游传导途径;(b)预防、改善或治疗骨质疏松症或类风湿性关节炎的任一方面;(c)阻断或降低IL-20受体的活化作用;(d)提高清除IL-20;(e)抑制(减少)IL-20的合成、生产或释放。本领域技术人员可制备其它小分子的IL-20抑制性化合物。
于某些实施例中,IL-20抑制性化合物为一种可结合至IL-20受体,但不会引起信号的传导的IL-20突变体。于某些实施例中,IL-20抑制性化合物为一种可阻断野生型IL-20结合至IL-20受体,并且藉此防止IL-20的信号转导的IL-20的突变型。
于某些实施例中,IL-20抑制性化合物包含小分子,其小分子的分子量可约为介于100至20,000道尔顿、500至15,000道尔顿或1000至10,000道尔顿的任一分子量。小分子的数据库为市售的数据库。上述小分子可以此技术领域中已知的任一方法,包含:吸入、腹腔内、静脉内、肌肉内、皮下、脑脊髓膜内、脑室、口服、肠内、肠胃外、鼻内或真皮等给予方法给予小分子。当本发明的IL-20拮抗剂为小分子时,通常以小分子的重量与病人体重为0.1至300mg/kg的比率给予,并将其分成一种至三种或以上的剂量服用。对正常体重的成年病人而言,其每次给予的剂量可为1mg至5g。
在一些实施方式中,IL-20拮抗剂包括:包含IL-20受体(例如IL-20R1、IL-2082、或IL-22R1)的胞外部分(例如胞外域)的多肽,其中该多肽特异性地与IL-20结合并且阻止它与一种或多种IL-20的相互作用。在一些实施方式中,IL-20受体的胞外部分是与多肽的恒定区融合,例如免疫球蛋白(Ig)分子(例如人免疫球蛋白)的重链或轻链恒定区的全部或者部分。在一些实施方式中,重链的恒定区包括CH1域、CH2域以及连接CH1域与CH2域的铰链序列。在一些实施方式中,轻链的恒定区包括CL域。在一些实施方式中,受体的胞外部分与抗体的Fc域融合。在一些实施方式中,多肽拮抗剂是二聚体(例如同型二聚体或异型二聚体)。PCT WO01/46232中描述了胞外域和可溶性受体的实例。
IL-20拮抗剂的鉴定
抗IL-20抗体及其它IL-20拮抗剂可使用此技术领域中已知的方法进行鉴定或表征,藉此检测和/或测量IL-20的生物活性的减少、改善或中和作用。例如,透过ELISA分析法,可通过测量透过IL-20级联的蛋白质活化磷酸化反应,对IL-20介导的激酶活化进行定量或定性实验。上述例子包含JNK、ERK、AKT、p38、STAT3及TRAF6。
IL-20拮抗剂的鉴定,也可通过将IL-20与候选试剂(candidate agent)一起培养,并且监测下列任何一种或以上的特性:(a)结合IL-20,并且抑制IL-20的生物活性和/或抑制IL-20信号功能的下游传导途径;(b)预防、改善或治疗骨质疏松症或类风湿性关节炎的任一方面;(c)阻断或降低IL-20受体的活化作用;(d)提高清除IL-20;(e)抑制(减少)IL-20的合成、生产或释放。于某些实施例中,可透过将IL-20与候选试剂一起培养,通过监测IL-20的结合与所导致的生物活性的减少或中和反应,对IL-20拮抗剂进行鉴定。其中,结合分析法的操作,可利用纯化的IL-20多肽或利用细胞天然表达或转染而感染IL-20多肽所进行。于一实施例中,结合分析法为一种竞争性结合分析法,利用候选抗体与已知用于结合IL-20的IL-20拮抗剂相互竞争,评估竞争抗体的竞争力。此试验法可以各种方式进行,包含ELISA方式。于其它实施例中,将IL-20与候选试剂一起培养,通过监测IL-20R1/IL-20R2复合体或IL-20R2/IL-22R1复合体的形成所导致的抑制功效,对IL-20拮抗剂进行鉴定。经过起始鉴定后,透过生物分析法可更进一步确认且准确地得知竞争性抗-IL-20拮抗剂的生物活性。此外,也可直接利用生物分析法筛选这些竞争试剂。
以下提供数种试验法的例子,其可用以筛选竞争性IL-20拮抗剂。生物分析法包含但并不仅限于HUVEC细胞增殖的细胞存活侦测(3-(4,5-二甲基噻唑基-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑,MTT)分析法;例如透过TRAP染色测试且分析竞争试剂对破骨细胞分化作用;以流式细胞法于竞争性IL-20拮抗剂的存在下检测IL-20对细胞的竞争性结合;以及在肾脏上皮细胞中IL-20诱发细胞凋亡的抑制作用。此外,也可使用RT-PCR或实时PCR直接测量IL-20的表达,或测量因IL-20而向上调控的基因表达,如TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6及VEGF等。
用于本发明方法的组合物
本发明的方法使用的组合物包含有效剂量的一种或以上的IL-20拮抗剂(如抗-IL-20抗体),此外,于某些实施例中,本发明的组合物更包含一种医药上可接受的赋形剂。于某些实施例中,该组合物用于本说明书中描述的任一方法。于本说明书中,将描述IL-20拮抗剂的实例,且该组合物可包含一种以上的IL-20拮抗剂。例如,一种组合物可包含一种以上的IL-20拮抗剂类型(如识别不同IL-20抗原表位的抗IL-20抗体的混合物),以及不同类型的IL-20拮抗剂(如抗IL-20抗体及IL-20抑制性化合物)。其它示范性组合物包含能辨识相同的抗原表位的一种以上抗IL-20抗体、结合IL-20不同抗原表位的不同物种的抗IL-20抗体、或不同的IL-20抑制性化合物。
本发明使用的组合物,以冻干制剂或水溶液的组合物形式中,可更包含医药上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂(Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000)Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)。可接受的载体、赋形剂、或稳定剂是使用对接受者无毒的剂量或浓度,且可包含:缓冲溶液,如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸;包含抗坏血酸及甲硫氨酸的抗氧化剂;防腐剂(例如:十八烷基二甲基苄基氯化铵(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)、氯化六甲双铵(hexamethoniumchloride)、氯化苯二甲烃铵(benzalkonium chloride)、氯化苄甲乙氧铵(benzethoniumchloride)、酚、丁醇或苄醇、如甲基或丙基对羟苯甲酸的烷基对羟苯甲酸酯(alkylparabens)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇、及间甲酚(m-cresol));低分子量(约小于10个残基)多肽;蛋白质,如血清白蛋白、胶质(gelatin)或免疫球蛋白;亲水性聚合物,如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、双糖及其它包含葡萄糖、甘露糖或葡萄聚糖的糖类;如乙烯二胺四乙酸(EDTA)的螯合剂;糖类,如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇;盐类形成的反离子(salt-forming couter-ions),如钠;金属错合物(如锌-蛋白质错合物);及/或非离子性界面活性剂,如TWEENTM或PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。于此,将更详尽描述医药上可接受的赋形剂。
当用于治疗风湿性关节炎或骨质疏松症时,本文所述的抗体,可选择地与依那西普多肽相结合,可以与医药上可接受的载体混合,以形成药物组合物。“可接受的”指载体应该与该组合物中的活性成分相容(并且优选地,能够稳定该活性成分)并且对治疗的主体无害。合适的载体包括微晶纤维素、甘露醇、葡萄糖、脱脂奶粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉及其结合。
根据待治疗的疾病的类型或者疾病的部位,可以使用药学领域的普通技术人员知晓的常规方法将含有抗-IL-20-抗体的药物组合物施予主体。对于治疗风湿性关节炎来说,含有该抗体的组合物可以通过注射直接输至滑膜关节。该组合物还可以通过其它常规途径给药,例如皮下。此外,它可以通过注射补给的给药途径,例如使用1-、3-或6-个月补给注射或者可生物降解的材料和方法施予主体。
注射组合物可以包含各种载体,例如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉注射来说,水溶性抗体可以通过滴注法给药,由此注入含有该抗体和生理学上可接受的载体的药物配方。生理学上可接受的载体可包含:例如5%葡萄糖、0.9%盐水、Ringer′s溶液或其它适宜的赋形剂。肌内制剂,例如该抗体的适宜的可溶盐形式的无菌制剂,可以溶解并加在药物赋形剂中,例如注射用水、0.9%盐水、或0.5%葡萄糖溶液。
为了实施本申请提供的方法,上述药物组合物可以通过口服、肠道外、通过雾化吸入、局部地、经直肠、鼻腔、颊内、阴道或经由植入性药盒给药。本文使用的术语“肠道外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内或颅内的注射或输注技术。
无菌注射组合物,例如注射用无菌水性或油性悬浮液,可以根据本领域已知的技术使用适宜的分散剂或润湿剂(如吐温80)和悬浮剂来配制。无菌注射制剂也可以是存在于无毒的肠道外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液,例如1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的载体和溶剂是甘露醇、水、Ringer′s溶液和等渗氯化钠溶液。此外,无菌的不挥发性油也被常规地用作溶剂或悬浮介质(例如合成的单甘油酯或甘油二酯)。脂肪酸,例如油酸甘油酯及其衍生物,可用在注射制剂中,作为天然的医药上可接受的油,例如橄榄油或蓖麻油,尤其是以它们的聚氧乙烯化的形式存在。这些油溶液或悬浮液也可以包含长链醇稀释剂或分散剂、或羧甲基纤维素或类似的分散剂。其它常用的表面活性剂,例如医药上可接受的固体、液体或其它的剂型生产中常用的吐温类、或司盘类、或其它类似的乳化剂或生物利用度增强剂,也可以用于该制剂中。
口服给药的组合物可以是任意口服可接受的剂型,包括但不限于胶囊、片剂、乳剂或水性悬浮液、分散液或溶液。对于口服用片剂来说,常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。润滑剂,例如硬脂酸镁也经常添加。对于胶囊形式的口服给药来说,有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当水性悬浮液或乳剂经口服给药时,活性成分可悬浮或溶解在与乳化剂或悬浮剂相结合的油相中。如果需要,也可以添加某些甜味剂、调味剂、或着色剂。鼻气雾或吸入组合物可以根据药物制剂领域中已知的技术来制备。含有恶二唑化合物的组合物也可以以栓剂的形式通过直肠给药。
IL-20拮抗剂及其组合物,也可与其它适用于增强及/或辅助此试剂的功效的试剂一起使用。
IL-20拮抗剂的给予及其治疗评估
本发明提供一种个体用以治疗、延缓骨质疏松症发病或预防骨质疏松症的方法。如上所述,IL-20为一种在破骨细胞的发展与活化过程中,作为上游RANKL-RANK信号级联的破骨细胞新生细胞因子。IL-20过度表达可刺激破骨细胞的分化作用,进而降低修补骨骼损坏(与骨质疏松症相关)的能力。
有许多种因素皆会提高罹患骨质疏松症的风险性,例如,与停经后低量的雌激素相关的骨质疏松症。低量的雌激素也可由于早期移除两个卵巢的手术所导致。此外,也可能由于化学治疗法对卵巢造成毒害的影响,而提早经绝期的发生。如上所述的例子,IL-20拮抗剂会改善卵巢切除手术的小鼠中骨质疏松的效力。因此,于此描述的IL-20拮抗剂,可通过给予有效剂量的IL-20拮抗剂,对停经后的个体达到治疗、延缓骨质疏松症发病或预防骨质疏松症的目的。
骨质疏松症也可由经过荷尔蒙去除处理所导致。对前列腺癌及乳癌患者而言,普遍需接受荷尔蒙去除处理的治疗,例如,去除前列腺癌患者的雄激素,以及去除乳癌患者的雌激素,皆可能导致骨骼质量的降低与提高骨骼碎裂风险性的影响。因此,于此所述的IL-20拮抗剂,可通过给予有效剂量的IL-20拮抗剂,对经过荷尔蒙去除处理的个体,达到治疗、延缓骨质疏松症发病或预防骨质疏松症的功效。
由类风湿性关节炎及慢性肝脏疾病的疾病(可包含上述两种疾病,但并不仅限于此),所造成的慢性炎症可导致骨骼的损坏。如实例中所示,IL-20拮抗剂会减轻类风湿性关节炎的小鼠模型中骨骼损坏的情形。因此,于此所述的IL-20拮抗剂,可通过给予有效剂量的IL-20拮抗剂,对慢性发炎性症状的个体,达到治疗、延缓发病或预防骨质疏松症的功效。
IL-20拮抗剂可透过适当的路径给予至个体中。例如,IL-20拮抗剂可经由口服、静脉内、舌下、皮下、动脉内、滑液内、囊内(如经由膀胱)、肌肉内、心脏内、胸腔内、腹腔内、脑室、舌下的吸入、栓剂及透皮给药方式给予IL-20拮抗剂。经由口服给药的制剂,可依此技术领域的采取的制备方式,例如:片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、薄片(wafer)、棒棒糖、口香糖的方式服用。本领域技术人员可清楚了解本发明不限于上述实例,而可参考任何已知的技术。
因此,于某些实施例中,如抗-IL-20抗体的IL-20拮抗剂可依已知的方法给予IL-20拮抗剂至个体,如静脉内给予,如服用大药剂,或以肌肉内、腹腔内、脑脊髓液内、皮下、关节内、滑液内、脑脊髓膜内、口服、吸入或其它典型给予路径连续长时间给予IL-20拮抗剂。市面上出售的用于给予液体制剂的喷雾剂包含射出喷雾剂及超声喷雾剂。液体制剂可直接喷雾使用,或将冻干的粉末重新组成后喷雾使用。另外,IL-20拮抗剂可使用碳氟化物及定量吸入器喷雾,或以冻干及磨碎的粉末吸入IL-20拮抗剂。
于一实施例中,IL-20拮抗剂透过位点特异的或靶向局部递送技术(targeted localdelivery techniques)给予。位点特异的或靶向局部递送技术的例子包含各种IL-20拮抗剂的注入补给源,或如注入导管、内部导管(indwelling catheter)或针状导管的局部输送导管、合成移植物、动脉外包覆(adventitial wrap)、分流器及模具或其它注入装置、特定位点载体、直接注射或直接使用。请参阅如PCT公开号WO 00/53211及美国专利号5,981,568。
IL-20拮抗剂(如抗IL-20抗体)可使用各种制剂给予。于某些实施例中,IL-20拮抗剂可熟练地给予。于某些实施例中,包含抗IL-20抗体的IL-20拮抗剂可为各种制剂,包含医药上可接受的赋形剂的制剂。于此技术领域中已知的医药上可接受的赋形剂为相对惰性的物质,以利于给予有医药效力的物质。例如,赋形剂可作为成型或作为稀释液的物质。适当的赋形剂包含但不仅限于稳定剂、润湿及乳化剂、改变渗透性的盐类、胶囊剂、缓冲溶液及皮肤渗透增强剂。赋形剂及用于肠胃外或非肠胃外药物输送的制剂请参阅书目(Remington,The Science and Pracrice of Pharmacy 20th Ed.MackPublishing(2000))。
于某些实施例中,该给予的药剂是依注射方式(如:腹腔、静脉、皮下、肌肉内等注射方式)而制备。因此,该试剂可与医药上可接受的介载体结合,如盐水、林格试剂(Ringer’s solution)、葡萄糖溶液及其它类似物。特定服药控制(如剂量、时间、及重复性)依据特定个体及其病史所决定。
抗IL-20抗体可使用适当的方式给予,其方式包含注射给予方式(如:腹腔、静脉、皮下、肌肉内等方式)。于此,抗IL-20抗体也可使用吸入的注入方式给予抗IL-20抗体。通常,给予抗IL-20抗体时,起始的参考剂量可约为2mg/kg。为达到本发明的目的,典型每天服用的剂量依据前述的因素,可约为任一下列的剂量范围:0.1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg至30mg/kg至100mg/kg或以上。服药经过几天或更长的时间后,重复服药的时间依据该疗效能维持至预定压抑病症的范围或达到足够的疗效,以减少骨质疏松症或类风湿性关节炎的发病程度所决定。示范性服药控制包含给予一起始剂量约2mg/kg,接着在周期性地维持给予约1mg/kg的抗-IL-20抗体,或是接着维持每周给予约1mg/kg的剂量。然而,其它服药控制可依药物动力衰减情形而有所调整。例如,可考虑其剂量为一周给予一至四次。于某些实施例中,剂量可使用的范围约由3μg/mg至2μg/mg(如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kh及约2mg/kg)。于某些实施例中,服药频率为每周、每两周、每四周、每五周、每六周、每七周、每八周、每九周、或每十周一次,每个月、每两个月、或每三个月一次,或更长时间一次。此疗效可由传统技术及分析法监测其疗效的进展。该服药控制(包含使用IL-20拮抗剂)可依时间而有所调整。
通常,当IL-20拮抗剂非为抗体时(于某些实施例中),通常以病人体重的0.1至300mg/kg的比率给予,并将其分成一种至三种或以上的剂量服用。于某些实施例中,对正常体重的成年病人而言,每次给予的剂量范围约0.3至5.00mg/kg。特定剂量的控制,如剂量、时间、重复性等,依据特定个体及其病史,以及独立试剂的特性(如试剂的半衰期及此技术领域中已知的考虑)而有所改变。
为达到本发明的目的,IL-20拮抗剂是依据下列因素而调整适当的剂量,如:使用的IL-20拮抗剂(或其组合物)、治疗骨质疏松症或类风湿性关节炎的类型及严重性、给予该试剂是用以作为预防或治疗的目的、先前治疗(previous therapy)、患者病史与对该试剂的反应、及其医生的判断等因素而有所调整。通常,临床医生会给予如抗IL-20抗体的IL-20拮抗剂,直到该剂量达到上述功效为止。
剂量的多寡通常是透过经验考虑因素(如半衰期)所决定。例如,与人类免疫系统兼容的抗体(如人化抗体或完整人类抗体),可用于延长抗体的半衰期,并且达到预防抗体受到宿主的免疫系统攻击的目的。为了治疗和/或抑制和/或改善和/或延缓骨质疏松症的目的,服药的频率通常(但并非绝对)可由治疗方式所决定并且加以调整。此外,也可使抗IL-20抗体做成连续性释出的药物制剂。达到持续释出各种制剂及装置是此技术领域中已知的。
于一实施例中,可经由已输送过一种或以上次数的IL-20拮抗剂(如抗IL-20抗体)的个体的给予经验,测定IL-20拮抗剂应给予的剂量,再输送个体更多剂量的IL-20拮抗剂(如抗IL-20抗体)。服药后可透过骨质疏松症判断指针(如骨骼矿物密度)或类风湿性关节炎的判断指标(如关节中肿胀、疼痛、僵硬及组织损坏情形),了解IL-20拮抗剂的功效。
利用本发明的方法给予IL-20拮抗剂,可依据其接受者的身体状况,或临床医生投药的目的(治疗或预防)或其它因素等,调整IL-20拮抗剂可为连续性或不连续的方式给予。IL-20拮抗剂(假设IL-20拮抗剂为抗IL-20抗体)的给予方式,可于一预定时间内必须为连续给予,或可以一连串间隔剂量(如在骨质疏松症或类风湿性关节炎发病之前、发病期间、或发病后)给予。
于某些实施例中,可使用一种以上的IL-20拮抗剂,如抗IL-20抗体,且其拮抗剂可为相互相同或不同的拮抗剂,其中,可使用至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同的IL-20拮抗剂。通常,其IL-20拮抗剂可互补之间的活性,并且不会对其它拮抗剂造成反作用。IL-20拮抗剂可与其它试剂一起使用,以增强和/或辅助该试剂的功效。
于某些实施例中,IL-20拮抗剂可与另一试剂一起使用。于某些实施例中,其它使用的试剂为一种用于治疗或改善类风湿性关节炎的试剂。抗类风湿性关节炎试剂的例子包含TNFα拮抗剂,例如,一种多肽,其能结合TNF并且透过TNF与TNF-受体结合而显示TNF活性受到抑制的多肽分子。TNFα拮抗剂的例子包含依那西普(ENBREL)及例如因福利美(infliximab)(REMICADE)及阿达木单抗(adalimumab)(HUMIRA)的抗-TNFα抗体。于一例子中依那西普多肽为一含有人类可溶性TNF受体(下示SEQ ID NO:5)及人类免疫球蛋白IgG1的Fc部分(即,依那西普)的融合蛋白。于某些实施例中,其它试剂为用以治疗或改善骨质疏松症的试剂。抗骨质疏松症试剂的例子包含阿仑膦酸盐(alendronate)、伊班膦酸酯(ibandronate)、利塞磷酸(risedronate)、唑来磷酸(zoledronic acid)、抑钙激素(calcitonin)、雌激素、选择性雌激素受体调节剂、ralozifene、甲状旁腺激素(parathyroid hormone)及特立帕肽(teriparatide)。
人类可溶性TNF受体的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)
aqvaft pyapepgstc rlreyydqta qmccskcspg qhakvfctkt sdtvcdsced stytqlwnwv peclscgsrcssdqvetqac treqnrictc rpgwycalsk qegcrlcapl rkcrpgfgva rpgtetsdvv ckpcapgtfs nttsstdicr phqic
于本发明的某些实施例中,例如mAb 7E或其它衍生物的IL-20拮抗剂可与依那西普多肽一起使用,以治疗类风湿性关节炎或骨质疏松症。“依那西普多肽”一词意指一种包含肿瘤坏死因子(TNF)的可溶性TNF受体及免疫球蛋白的Fc部分的融合蛋白。于一实例中,可溶性TNF受体具有下示SEQ ID NO:5的氨基酸序列及其功能等效物,即,能与人类TNF结合并且与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少有85%(90%、95%、或98%)相同的多肽。此依那西普多肽可由常规重组技术所制得。
本发明中使用的IL-20拮抗剂(如一抗体)的治疗用制剂,是将具有想要纯度的抗体选择性地与医药上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂混合,制成可储存的冻干制剂或水溶液的形式,请参阅书目(Remington,The Science and Pracrice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing(2000)。于此,可接受的载体、赋形剂、或稳定剂是使用对接受者无毒的剂量或浓度,且可包含:缓冲溶液,如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸;盐类,如氯酸钠;包含抗坏血酸及甲硫氨酸的抗氧化剂;防腐剂(例如:十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、氯化苯二甲烃铵、氯化苄甲乙氧铵、酚、丁醇或苄醇、如甲基或丙基对羟苯甲酸的烷基对羟苯甲酸酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇、及间甲酚);低分子量(约小于10个残基)多肽;蛋白质,如血清白蛋白、胶质或免疫球蛋白;亲术性聚合物,如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或离氨酸;单糖、双糖及其它包含葡萄糖、甘露糖或葡萄聚糖的糖类;如乙烯二胺四乙酸(EDTA)的螯合剂;糖类,如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇;盐类形成的反离子,如钠;金属复合体(如锌-蛋白质复合体);和/或非离子性界面活性剂,如TWEENTM或PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
包含IL-20拮抗剂(如抗体)的脂质体可由此技术领域中已知的方法制备,详细内容请参考Epstein,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985);Hwang,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980);美国专利号4,485,045及4,544,545。增强脂质体的循环时间请参考美国专利号5,013,556。特别有用的脂质体,可透过逆相蒸发法,以包含磷脂酰胆碱、胆固醇及聚乙二醇-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物所制备,且该脂质体是通过具有特定孔径大小的过滤器,以制得具有预定直径的脂质体。
透过如凝聚技术或界面聚合反应,也可将活性成分包覆于微胶囊内,例如:分别于胶体药物输送系统(如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒、及纳米胶囊)或巨乳液(macroemulsion)中的羟乙基纤维素(hydromethylcellulose)或胶质-微胶囊(gelatin-microcapsule)及聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊(poly-(methylmethacylate)microcapsule))。其技术内容请参阅Remington,The Science and Pracrice ofPharmacy 20thEd.Mack Publishing(2000)。
本发明可制成持续释出的药剂型式,适当的持续释出药剂的例子包含一种含有抗体的固态疏水聚合物半渗透模型(matrices),且该模型为具有形状的物体,如膜或微胶囊。持续释出模型的例子包含聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸与7乙基-谷氨酸盐(7ethyl-L-glutamate)的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯(non-degradable ethylene-vinyl acetate)、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物,如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物与利普安(Leuprolideacetate)组成的可注射微球)、乙酸异丁酸蔗糖酯(sucrose acetate isobutyrate)及聚-D-(-)3-羟基丁酸(poly-D-(-)3-hydroxybutyric acid)。
用于体内服用的药剂需为无菌药剂,其可透过无菌过滤膜的过滤法轻易达到此条件。治疗用的抗IL-20抗体组合物通常是设置于具有无菌连接阀的容器中,例如,该容器可为静脉输注液袋或样品瓶,且该容器具有皮下注射针可刺穿的塞子。
本发明的组合物可以片剂、药丸、胶囊、粉末、颗粒、溶液或悬液或栓剂作为单位的剂型,通过口服、肠胃外或直肠注入,或通过吸入或喷射的方式给药。
为了制备如片剂的固态组合物,将主要的活性成分与医药用载体混合,例如常规片剂的成分,如:玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸氢钙或胶、及其它医药用稀释液,如:水,以形成含有本发明的化合物或及其非毒性的医药上可接受的盐类的均相混合物的固态预制剂组合物(solid preformulationcomposition)。其中,均相的预制剂组合物意指该活性成分是均匀分布于整个组合物,使整个组合物可易于分为相等有效的单位剂型(如片剂、药丸及胶囊),且该固态预制剂组合物将分成如上所述的单位剂型的类型,该剂量是含有0.1至大约500mg的本发明的活性成分。可覆有一涂层于该新的组合物的片剂或药丸,或以其它方式的组合物,使本发明的剂型可具有延长其反应时间至优势。例如,该片剂或药丸可包含内层剂量或外层剂量成分,且其后者是以包膜的形式包覆前者。此两种成分可以肠溶层隔开,使其可避免于胃中分解,并且确保内部成分可通过十二指肠以延缓其药物的释放。肠溶层或涂层可使用各种材质制作,如包含一组聚合酸(polymeric acid)的材料,以及包含聚合酸及其它材料(如漆皮(shellac)、鲸蜡醇(cetyl alcohol)、纤维素酯)组成的混合物的材料。
适当的表面活性剂尤其包含如:聚氧基乙烯基去水山梨醇(polyoxyethylenesorbitans)(如TweenTM 20、40、60、80或85)的非离子性试剂及其它去水山梨醇(sorbitans)(如SpanTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物可含有0.05及5%的表面活性剂,也可为0.1至2.5%,较佳为需要时可加入其它的成分,例如:甘露醇或其它医药上可接受的介载体。
适当的乳液可使用市售的脂肪乳剂制备,如:IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM、LipiphysanTM。于预混合的乳液组合物可溶有活性成分,或将活性成分溶解于油(黄豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中,并且将磷脂(蛋磷脂、黄豆磷脂或黄豆卵磷脂)与水混合可形成乳液。较佳为,可加入其它活性成分,例如甘油或葡萄糖,以调整乳液的渗性(tonicity)。适当的乳液一般包含20%以上的油,例如5至20%。使用的脂肪乳剂可包含0.1至1.0nm的油滴,较佳为0.1至0.5nm,且其pH值为5.5至8.0。
乳状组合物可通过混合IL-20拮抗剂与IntralipidTM或其它成分(黄豆油、蛋磷脂、甘油及水)所制备。
用以吸入或喷射注入的组合物包含医药上可接受的溶液与悬浮液、水溶液或有机溶剂、或其混合物、及粉末。此液态或固态组合物可含有适当医药上可接受的赋形剂,其如上所述。于某些实施例中,该组合物可经由口服或鼻吸的方式给予,以得到局部或整体的功效。此组合物较佳为溶于无菌的医药上可接受的溶剂,且该组合物可使用气体喷雾,并可直接由喷雾装置吸入喷雾溶剂,或者该喷雾装置可贴在脸部面具、屏蔽或不连续正压呼吸器上。液体、悬浮液、或粉末组合物较佳可经由口服、鼻吸以适合的方法由装置中输送制剂。
透过此技术领域中公知的方法可得知治疗的功效。
主要递送的治疗用组合物包含反义多核苷酸、表达载体、或也可使用亚基因组多核苷酸。受体-介导DNA输送技术参考如Findeis et al.,Trends Biotechnol.(1993)11:202;Chiou et al.,Gene Therapeutics:Methods And Applications Of Direct Gene Transfer(J.A.Wolff,ed.)(1994);Wu et al.,J.Biol.Chem.(1988)263:621;Wu et al.,J.Biol.Chem.(1994)269:542;Zenke et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA(1990)87:3655;Wu et al.,J.Biol.Chem.(1991)266:338。以基因治疗法局部给予包含多核苷酸的治疗用组合物,是给予大约100ng至约200mg的DNA。于某些实施例中,于基因治疗法中使用的DNA可介于大约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg、约20μg至约100μg或以上。本发明中治疗用的多核苷酸及多肽可使用基因输送载体给予。此基因输送载体可为病毒或非病毒源的载体(请参阅Jolly,Cancer Gene Therapy(1994)1:51;Kimura,Human Gene Therapy(1994)5:845;Connelly,Human Gene Therapy(1995)1:185;及Kaplitt,Nature Genetics(1994)6:148)。每个编码序列的表达可使用内源性哺乳动物或异源性启动子和/或增强子诱导。此外,编码序列的表达可为组成型或经调控的。
用以输送想要的多核苷酸的病毒-基载体以及表达于想要细胞的病毒-基载体为此技术领域中已知的。示范性的病毒-基载体包含:重组反转录酶病毒(请参阅如PCT公开号WO 90/07936、WO 94/03622、WO 93/25698、WO 93/25234、WO 93/11230、WO93/10218、WO 91/02805、美国专利号5,219,740及4,777,127、英国专利号2,200,651以及欧洲专利号0345242)、α病毒-基载体(如Sinbis病毒载体Semliki森林病毒(ATCCVR-67;ATCC VR-1247)、玫瑰河病毒(ATCC VR-373;ATCC VR-1246)及委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuela equine encephalitis virus)(ATCC VR-923;ATCC VR-1250;ATCC VR1249;ATCC VR-532)、及腺相关病毒(AVV)载体(请参阅如PCT公开号WO 94/12679;WO 93/03769;WO 93/19191;WO 94/28938;WO 95/11984及WO 95/00655)),但并非仅限于此。此外,也可采用DNA连结杀手腺病毒(killed adenovirus)给予方式,详细内容请参考Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3:147。
此外,也可采用非病毒输送载体及其方法,包含聚阳离子浓缩DNA(polycationiccondensed DNA)连结或未连结杀手腺病毒(请参阅如Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3:147);配位基结合DNA(ligand-linked DNA)(请参阅如Wu,J.Biol.Chem.(1989)264:16985);真核细胞输送载体细胞(请参阅如美国专利号5,814,482;PCT公开号WO95/07994;WO 96/17072;WO 95/30763及WO 97/42338);以及核电荷中和作用或与细胞膜融合,但并非仅限于此。另外,也可利用裸露DNA实行。示范性裸露DNA的方法请参阅PCT公开号WO 90/11092及美国专利号5580859。可作为基因输送载体的脂质体,详细内容请参阅美国专利号5,422,120;PCT公开号WO 95/13796;WO 94/23697;WO 91/14445及欧洲专利号0524968。其它另外的方法请参阅文献(Phillip,Mol.Cell Biol.(1994)14:2411及Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci(1994)91:1581)。
于此,显然可使用一种表达载体直接表达任一蛋白质-基的IL-20拮抗剂(ptotein-based IL-20 antagonists)(如抗IL-20抗体、免疫黏附素等)。例如,其它于此技术领域中已知的IL-20受体片段,其能阻断(由部分阻断变成完全阻断)IL-20及/或IL-20的生物活性。
试剂盒
本发明也提供立即使用的试剂盒。本发明的试剂盒包含一种或以上的容器,该容器含有IL-20拮抗剂(如上所述抗体mAb 7E或其衍生物的抗体),且于某些实施例中,更包含本发明所述的任一方法的使用说明书。于某些实施例中,IL-20拮抗剂为本说明书中所述的任一种IL-20拮抗剂。于其它实施例中,此试剂盒包含一种IL-20拮抗剂,该IL-20拮抗剂不同于抗IL-20抗体。于某些实施例中,此试剂盒包含一抗IL-20抗体(如本说明书所述的抗体mAb 7E)。于其它实施例中,此试剂盒包含一抗IL-20抗体,且该一抗IL-20抗体含有一种或以上抗体mAb 7E的互补决定区(CDR)(如一、二、三、四、五,或于某些实施例中,所有六个CDR皆源自mAb 7E)。于某些实施例中,该说明书包含本发明中服用IL-20拮抗剂,用以治疗、延缓发病或预防骨质疏松症与类风湿性关节炎的方法的服药说明书。此试剂盒更包含如何判定该个体是否患有骨质疏松症或类风湿性关节炎,并且是否适用此方法治疗上述疾病的说明书。于其它实施例中,该说明书也包含患有骨质疏松症或类风湿性关节炎的个体服用IL-20拮抗剂的风险性。
关于使用IL-20拮抗剂的说明书,通常包含用以治疗的剂量、服用时间及投药方式等信息。其中,容器可包含单位剂量、大批包装(bulk packages)(如多剂量包装)或子单位剂量。本发明中试剂盒的说明书通常可撰写于标签或包装内页(如存于试剂盒中的纸张),或者,该说明书为机器可读取的说明书(如在磁盘或光学存取盘上记载的说明书)也是可接受的形式。
由标签或包装内页的说明书中,显示该组合物是用以治疗、延缓骨质疏松症发病和/或预防骨质疏松症,此外,该说明书也可包含以任一方法实行本发明的说明内容。
本发明的试剂盒存于适合的包装,该适合的包装包含样品瓶、瓶子、罐子、软性包装(如密封聚脂树脂(Mylar)或塑料袋)及其它类似包装。此外,也可考虑结合特定装置使用的包装,如吸入器、由鼻服药装置(如喷雾器)、或如微泵的注入装置。此试剂盒应具有无菌的出入口(例如,该容器可为静脉输注液袋或样品瓶,且该容器具有皮下注射针可刺穿的塞子)。此外,容器也可具有无菌的出入口(例如,该容器可为静脉输注液袋或样品瓶,且该容器具有皮下注射针可刺穿的塞子)。该组合物中至少有一活性成分为如抗IL-20抗体的IL-20拮抗剂。且此容器可更包含第二医药活性试剂,如TNF-α拮抗剂或其它用以治疗骨质疏松症的药物。
此试剂盒可选择性地提供其它如缓冲溶液及说明数据的部分。一般而言,此试剂盒包含容器及贴于容器上的标签或包装内容物。
于某些实施例中,本发明提供包含上述试剂盒内容物的制作方法。于某些实施例中,该试剂盒包含IL-20拮抗剂(如抗IL-20抗体)以及使用其药剂用以治疗或预防骨质疏松症或类风湿性关节炎的说明书。
本领域技术人员可轻易基于上述的叙述,不需额外的详细说明即可运用本发明的内容。于下,将配合特定实施例更加详细地说明本发明的内容,而该实施例仅是为了方便说明而举例而已,并非将本发明的范畴仅限于此。所有本说明书中列举的参考文献、书目、专利及公开专利皆可作为本发明的参考文献以完整表达本发明的内容。
实施方式
实施例1、以单克隆抗体7E(mAb 7E)治疗类风湿性关节炎
患有胶原蛋白引发性关节炎(collagen-induced arthritis(CIA))的小鼠是适用于研究人类类风湿性关节炎的动物模型,本研究将以此模型检验单克隆抗体7E(mAb 7E)治疗此类疾病的功效。
本研究将以下列所述的方法诱发八周龄雄性Sprague-Dawley大白鼠罹患CIA疾病。首先,由大白鼠皮肤(背部)注射200μl乳液,使其产生初始免疫反应,其中,该乳液含有佛氏完整佐剂(Freund’s complete adjuvant)、4mg/ml被热杀死的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis(Arthrogen-CIA Chondrex,Redmond,WA,USA))及牛胶原蛋白第二型(CH;2mg/ml溶解于0.05M醋酸),以体积比为1∶1∶1组成注射的乳液。八天后,再透过皮下注射,由大白鼠的尾巴根部注入100μl相同的乳液,以补强其免疫反应。在初始免疫作用发生后11至13天,可观察到大白鼠已罹患胶原蛋白引发性关节炎。
本研究主要以下列四组大白鼠作为研究对象:第1组:健康的大白鼠;第2组:将上述已罹患CIA的大白鼠,待CIA发病一周后给予磷酸盐缓冲溶液(PBS(s.c.));第3组:对已罹患CIA的大白鼠,待CIA发病一周后给予mAb 7E(3mg/kg,s.c.);以及第4组:对已罹患CIA的大白鼠,待CIA发病一周后给予依那西普(EnebrelWeyth,USA,3mg/kg,s.c.)。之后,以双角规形夹测量每只经过处理的大白鼠的后脚掌厚度(hind-pawthickness),并且使用统计软件Prism 4.0(GraphPad Software,San Diego,CA,USA.)将所有得到的数据进行统计分析,接着,再以克-瓦二氏单因子等级变异数分析(Kruskal-Wallis Test)比较后脚掌厚度当P-值<0.05视为显着数据,并以T检验(student’st-test)或单因子变异分析(ANOVA))判定其显着的差异,统计上以P<0.05视为显着数据。
如下列表一所示,使用mAb 7E可显着降低患有CIA大白鼠的后脚掌厚度(P<0.05),且其治疗功效已接近市售抗类风湿性关节炎药物Etanercept(请参阅Mihara etal.,BrJ Pharmacol.,2008,154:153-164)。实验结果显示mAb 7E和Etanercept对于治疗类风湿性关节炎具有类似的功效。
表一:对照组与经过下列处理的大白鼠的后脚掌厚度
组别 | 平均后脚掌厚度 | 25th-75th百分比 |
1(健康对照组) | 0.53cm | 0.52-0.54cm |
2(PBS处理) | 1.05cm | 1.02-1.13cm |
3(mAb 7E处理) | 0.84cm | 0.72-0.93cm |
4(Etanercept处理) | 0.86cm | 0.78-0.91cm |
下列是检验mAb 7E于滑液组织内降低炎症介导物(inflammatory mediators)表达量的功效。首先,将经过药物治疗的CIA大白鼠,其膝关节外的滑液组织分离并将其悬浮于PBS溶液中,之后,进一步将该组织进行均质化,于4℃下以3000rpm离心十分钟,最后,再将得到的上清液保存于80℃进行后续分析。依据厂商提供的操作说明,以夹心ELISA测量TNF-α、IL-1β(TNF-α与IL-1β试剂盒;R&D Systems,Minneapolis,MN)及IL-20(IL-20试剂盒;PeproTech Asia/CytoLab,Rehovot,Israel)的表达量。而在此技术领域中已知患有CIA的大白鼠将提高这些所有炎症介导物的表达量。
实验结果显示相较于mIgG,mAb 7E与Etanercept皆可显着地降低TNF-α、IL-1β及IL-20的表达量。尤其,以mIgG处理患有CIA的大白鼠,其滑液组织内的TNF-α、IL-1β及IL-20的表达量比健康对照组的大白鼠更高,然而,使用mAb 7E及Etanercept治疗患有CIA的大白鼠,则可显着地降低其TNF-α、IL-1β及IL-20的表达量。
实施例2、同时使用mAb 7E及Etanercept治疗类风湿性关节炎
使用如实施例1的方法诱发大白鼠体内CIA的发病,并将患有CIA的大白鼠随机分为五组(每组n=9),待CIA发病后,再依据下列的试剂每周处理三次:第1组:PBS;第2组:鼠IgG(由Chemicon International,Inc.,Temecula,CA,USA取得);第3组:Etanercept(6mg/kg,s.c.);第4组:mAb 7E(6mg/kg,s.c.);第5组:mAb 7E(3mg/kg,s.c.)及Etanercept(3mg/kg,s.c.)。首先,以实施例1所述的方法测量每只经过试剂处理后的大白鼠的后脚掌厚度。实验结果显示,相较于单独以mAb 7E或Etanercept治疗,同时使用mAb 7E及Etanercept治疗大白鼠可显着降低患有CIA大白鼠的后脚掌厚度。
接着,以Hsu等人所提出的方法(Hsu et al.,Arthritis Rheum.2006,54:2722-2733)监测大白鼠每只后脚掌CIA严重程度并给予评分。通常,当大白鼠的CIA严重性评分大于3时,代表大白鼠的后脚掌为严重肿胀。接着,以Kruskal-Wallis分析比较不同组中的严重性评分,并以此判断该结果是否具有统计上的意义。如下列表二所示,相较于单独以mAb 7E治疗或单独以Etanercept治疗大白鼠,同时使用mAb 7E及Etanercept治疗大白鼠的平均严重性评分显着较低,且该结果具有统计上的意义(P<0.05)。
表二:健康的大白鼠与经过各种试剂处理的大白鼠的严重性评分
组别 | 平均严重性评分 | 25th-75th百分比 |
健康对照组 | 0.2 | 0.0-0.4 |
1(PBS) | 4.2 | 3.9-4.5 |
2(mIgG) | 4.0 | 3.5-4.2 |
3(mAb 7E) | 2.0 | 0.5-3.1 |
4(Etanercept) | 2.1 | 0.7-3.6 |
5(mAb 7E+Etanercept) | 0.9 | 0.0-2.2 |
如图1所示,其为检验每只经过试剂处理的CIA大白鼠发生后脚掌严重肿胀的实验结果。当单独使用mAb 7E或Etanercept治疗患有CIA的大白鼠时,其严重肿胀的发生率分别由100%降至22%以及由100%降至33%;当同时以mAb 7E及Etanercept处理患有CIA的大白鼠时,其严重肿胀的发生率却可由100%降至仅仅6%。此结果经由Fisher’s精确检验来分析,确定该实验结果确实具有统计上的意义。此实验结果证实,相较于单独使用mAb 7E或Etanercept,同时结合mAb 7E及Etanercept可具有较强的治疗功效。
此外,利用牛胶原蛋白引发初始免疫反应后的第25天,以放射线影像(radio imaging)检视各种试剂处理患有CIA大白鼠的骨质损坏的严重性。经观察发现以PBS及mIgG处理患有CIA的大白鼠(即第1组及第2组的大白鼠),其大白鼠的后脚掌关节仍有严重的骨质损坏情形;然而,令人意外地,当以mAb 7E、Etanercept或将上述两者同时使用处理患有CIA的大白鼠时(即第3组至第5组的大白鼠),其局部脚踝骨骼损坏的严重性将相对较轻微。且第1组与第2组及第3-5组间的差异具有统计上的意义(P<0.01-0.05)。实验结果更加证实mAb 7E对患有CIA的大白鼠,可如同Etanercept具有减缓骨骼损坏的疗效;此外,本实验结果也证实合并使用mAb 7E及Etanercept可比上述两者单独使用时具有更强的疗效。
此外,更使用具有高分辨率及低剂量X光扫描仪的1076microCT-40系统(Skyscan,Aarselaar,Belgium),透过高分辨率计算机断层扫描(microcomputed tomographic analysis)分析,得知单独使用mAb 7E或合并使用mAb 7E及Etanercept,皆可具有保护CIA的大白鼠中骨质损坏的功效。其中,扫描仪中的X光管设定光子能量为48kV、电流为200μA以及在0.5-mm厚的滤光镜下曝光长达1180ms,其影像画素大小为17.20μm,扫描时间大约为15min。待扫描的影像进行标准化重建后,将每个胫骨样本的数据组透过软件(CTAn;Skyscan)重新抽样,使每个样本皆以相同方式进行定位。如界限(threshold)的实验条件则在所有分析过程中皆维持相同的设定。另外,骨骼矿物密度为一种三维的骨骼特性参数,其是利用50片的连续切片进行分析得到,再将其结果换算为相对mIgG对照组的百分比对价值(percentage versus values)。
以PBS或mIgG处理患有CIA的大白鼠,取出其胫骨与健康对照组的大白鼠的完整关节进行比较,发现以PBS或mIgG处理的CIA大白鼠仍呈现显着骨质损坏情形。然而,比较以mAb 7E或mIgG处理患有CIA的大白鼠,可发现mAb 7E确实能减缓骨质流失的情形。此外,相较于单独使用mAb 7E或单独使用Etanercept处理患有CIA的大白鼠,当合并使用mAb 7E及Etanercept处理患有CIA的大白鼠时,可呈现相对较低的骨质流失严重程度。
骨骼矿物密度为一种可用来评估每只经过处理的CIA大白鼠,分析该大白鼠患有CIA疾病严重性的定量参数。相较于以mIgG处理的CIA大白鼠,以mAb 7E治疗患有CIA的大白鼠可显着抑制其骨质流失的情形(P<0.05);此外,同时以mAb 7E及Etanercept治疗患有CIA的大白鼠,可更加提升其保护的功效(P<0.01)。于此,脚踝关节的高分辨率计算机断层扫描结果,也可支持由放射实验中所得到的实验结果。实验结果证实mAb 7E不仅可用于降低关节炎的严重程度,也可抑制骨质流失的情形。
最后,同时以mAb 7E及Etanercept处理患有CIA的大白鼠,并检验其TNF-α、IL-1β及IL-20的表达量。实验结果显示以mAb 7E及Etanercept处理可显着降低患有CIA的大白鼠中上述细胞因子的表达量(如图2所示)。此外,以mAb 7E、Etanercept及同时使用mAb 7E及Etanercept处理也可降低IL-6的表达。
总而言之,由上述的实验结果证实:mAb 7E具有治疗胶原蛋白引发性关节炎的功效,不仅可用于降低关节炎的严重程度,也可抑制骨质流失的情形。此外,实验结果也显示合并使用mAb 7E及Etanercept的疗效显着高于单独使用上述两者试剂的疗效。
实施例3、以mAb7E治疗骨质疏松症
使用十四周龄雌性BALB/C小鼠(由台南国立成功大学实验动物中心提供),将其饲养于环境控制实验室适应4天,并将小鼠分配至设置于温度/湿度控制室(20-25℃及40-45%)内的聚碳酸酯笼子(每笼3只)中。其中,光亮∶黑暗的循环时间设定为12-小时光亮∶12-小时黑暗,并供应可自行取得的食物及水源。之后,先对小鼠进行普通麻醉,给予戊巴比妥(以小鼠体重的50mg/kg比率给予;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO),再对动物进行背部卵巢切除手术(dorsal ovariectomized,OVX)或假性对照(Shamcontrols)。其中,Sham对照组指将小鼠经过手术使两侧的卵巢暴露在外,之后不经移除即将小鼠皮肤缝合。待受到OVX手术或控制手术的小鼠经过一周的时间恢复后,将每只小鼠随机分为六组:第1组:Sham对照组(数目=5);第2组:无进一步处理的OVX小鼠(数目=5);第3组:以17β-雌二醇(17β-estradiol)处理OVX小鼠(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,10μg/kg/天,数目=6);第4组:以mIgG处理OVX小鼠(ChemiconInternational,Inc.,Temecula,CA,USA,3mg/kg/3天,数目=7);第5组:以mAb 7E处理OVX小鼠(3mg/kg/3天,数目=5);第6组:以mAb 7E处理OVX小鼠(6mg/kg/3天,数目=5)。做为正对照组的17β-雌二醇,其剂量是以先前技术中已知可对OVX小鼠达到治疗效果的剂量而使用,详细内容请参阅Cano et al.,Osteoporos Int.2008 Jun;19(6):793-800。
待两个月后解剖所有组别中的小鼠,并将每一只小鼠的胫骨于无菌环境下收集且经过清洗以移除附着的软性组织,再沉淀于装有3.7%的甲醛中。之后,如实施例2所述的方法,透过高分辨率计算机断层扫描及骨骼矿物密度进行分析。
实验结果显示经过OVX手术处理的小鼠,将提高体内IL-20的血清表达量,而以mAb 7E处理经过OVX的小鼠可降低其IL-20的血清表达量(如图3a所示)。经由小鼠胫骨的骨骼矿物密度的微断层扫瞄影像图,显示第2组及第3组小鼠(未经其它处理或以mIgG处理)的骨质损坏程度远高于第4-6组(分别以3mg/kg的mAb 7E、6mg/kg的mAb 7E及17β-雌二醇处理),此实验结果显示mAb 7E具有类似于17β-雌二醇的功效,也可降低OVX小鼠中骨质流失的情形(如图3b所示)。此外,以mAb 7E与17β-雌二醇处理OVX的小鼠的体内骨骼矿物密度皆远高于Sham对照组及以mIgG处理的小鼠(如图3b所示)。于这些小鼠中,也可观察到随着剂量增加,也可增加骨骼密度,且此结果具有统计上显着的差异(与mIgG对照组比较,P<0.05)。总而言之,本结果证实mAb 7E确实可通过减少骨质流失的情形,达到治疗骨质疏松症的功效。
实施例4、IL-20抗体mAb 7E抑制破骨细胞的分化
透过成骨细胞与破骨细胞之间密切的交叉作用可调控骨骼的形成。不平衡的破骨细胞新生作用会造成骨质的流失,导致骨质疏松症与类风湿性关节炎的发生(Takayanagi,H,et al.,(2005)Immunol Rev 208:181-193;Ross,FP and Teitelbaum,SL(2005)Immunol Rev 208:88-105)。因此,为了了解mAb 7E是否可通过抑制破骨细胞的分化,避免经过OVX的小鼠面临骨质流失的问题。
首先,由小鼠的胫骨中取出骨髓细胞(bone marrow cells(BMCs))并且培养12小时(37℃/5%CO2)。之后,收集非附着型细胞(non-adherent cell),将其接种至24孔盘(每孔2×106细胞数)中,并且培养在含有30ng/ml重组小鼠巨噬细胞群落刺激因子(M-CSF)(PreproTech)的相同的培养基中。待48小时后,将M-CSF源骨髓细胞与小鼠M-CSF(40ng/ml)及sRANKL(100ng/ml)(PreproTech)一起培养直到实验终了。为了测试mAb 7E的功效,也在具有M-CSF与sRANKL的α-MEM中,以IL-20(200ng/ml)、mAb 7E(2μg/ml)、mIgG(2μg/ml)处理M-CSF源骨髓细胞,直到实验终了。
然而,于早期处理的实验中,以mAb 7E处理BMC,并且培养12小时。之后,将非附着型细胞接种到24孔盘(每孔2×106细胞数)中,加入M-CSF(40ng/ml)后,于含有mAb 7E(2μg/ml)或对照组mIgG(2μg/ml)的α-MEM中培养。待40小时mAb 7E处理完成后,再使用无血清培养基清洗。接着,置于α-MEM(40ng/ml)及sRANKL(100ng/ml)一起培养直到实验终了。最后,为了计算破骨细胞的数目,将细胞以丙酮固定,再使用酸性磷酸酶试剂盒(Sigma-Aldrich)以TRAP染色。
实验中将骨髓源造血干细胞(HSCs)的破骨前体细胞与M-CSF及可溶性RANKL同时如入培养基中,以促进骨髓细胞的分化。于此,使用两种培养实验方法,分析在破骨细胞新生作用的早期及晚期过程中,IL-20抗体mAb 7E对破骨细胞分化作用的影响(如图4所示)。待48小时后,将M-CSF源骨髓巨噬细胞与鼠M-CSF(40ng/ml)及sRANKL(100ng/ml)一起培养,直到实验终了。其中,使用TRAP染色法定量分化的破骨细胞数量。于mAb 7E(2μg/ml)的存在下,TRAP+的破骨细胞数目显着(P<0.01)低于同型对照组的数目(如图4b及图4c所示)。于mAb 7E的存在下并未观察到任何破骨细胞的存在。为了厘清mAb 7E是否影响破骨细胞的早期或晚期的分化过程,在实验中将骨随细胞与mAb 7E或mIgG进行预培养1小时,之后,再加入M-CSF培养48小时。接着,收集该些细胞并且将其置于含有M-CSF及sRANKL但不含mAb 7E抗体的培养基中培养长达3天以上(如图4d所示)。实验结果显示在早期培养中使用mAb7E,可有效抑制破骨细胞的分化(与mIgG对照组比较,P<0.01)(如图4e及图4f所示)。因此,IL-20抗体可具有同时阻断破骨细胞早期阶段与后期阶段的分化作用。
此外,于类风湿性关节炎的CIA小鼠模型中,IL-20可诱导滑液膜纤维母细胞中TNFα及RANKL的表达,但却不会诱导健康小鼠体内滑液膜纤维母细胞中上述两者的表达。
实施例5、M-CSF提高HSCs中的IL-20
IL-20抗体mAb 7E可用以阻断骨髓细胞源HSC中破骨细胞的分化作用(如图4所示)。为了测试HSC分泌IL-20至培养基中的可能性,以M-CSF处理并且培养骨髓源HSC长达48小时后,检验骨髓源HSC中IL-20的表达。由实时PCR(RT-PCR)实验的结果显示,以M-CSF处理HSC的IL-20mRNA的表达量高于对照组的表达(如图5a所示),证实IL-20受到M-CSF的刺激会进行自体分泌反应。于RT-PCR实验中,使用荧光检测系统(DNA Engine Option 2;Bio-Rad)检测荧光染剂(SYBR Green I(Bio-Rad)),同时使用厂商提供的软件取得荧光-与时间-依赖的产生信号。
此外,IL-20受体也可表达于M-CSF源的破骨前体细胞中。本实验结果也显示IL-20可以自分泌的方式作用于HSC-源破骨前体细胞中。
实施例6、IL-20诱导骨髓细胞中M-CSF源破骨前体细胞的RANK表达
RANKL-RANK信号为破骨细胞的分化过程中所必需(Wada,T et al.,(2006)TrendsMol Med 12:17-25)。而RANK为一种在破骨细胞表面表达的蛋白质。为了了解IL-20是否透过增加RANKL-RANK信号增加破骨细胞的分化作用,将分析骨髓细胞中的M-CSF源破骨前体细胞内的RANK表达量。将细胞经过破碎后收集,并且与0.5mg/ml的抗鼠RANK抗体(eBioscience)或同型对照组抗体一起培养30分钟,之后,再加入异硫氰酸荧光素-结合二级抗体(fluoroisothiocyanate(FITC)-conjugated secondary antibody)一起培养,最后使用流式细胞技术(FACSCalibur;BD Bioscience)进行分析,每个样品需要20000数。由流式细胞分析结果显示,以IL-20处理的M-CSF源破骨前体细胞中,皆提高了破骨前体细胞表面RANK蛋白质(如图5b所示)及RANK mRNA(如图5c所示)的表达量。
此实验结果与mAb 7E具有抑制破骨细胞分化的功效相吻合,证实经过mAb 7E的处理,不仅可抑制RANK转录的表达(如图5d所示),也可抑制RANK蛋白质在表面的表达。将M-CSF源的骨髓细胞(BMC)在含有M-CSF(50ng/ml)与sRANKL(100ng/ml)的α-MEM中,加入特定浓度的IL-20、mIgG、mAb 7E、或IL-20与mAb 7E一起培养24小时。为了分析RANK的生成情况,先以200ng/ml的IL-20刺激细胞并且将其胰蛋白酶化,接着,以抗RANK的PE结合抗体进行染色,以利于使用如上述的方法进行流式细胞法的分析。实验结果证实IL-20可通过增加RANK的表达,在破骨细胞新生过程中扮演细胞因子的角色,与破骨前体细胞作用。
实施例7、IL-20靶标成骨细胞并且向上调控RANK的表达
于破骨细胞新生过程中,成骨细胞中的RANKL表达量的增加也为一个关键的因素(Jordan,WJ et al.(2005)Eur J Immunol 35:1576-1582)。透过RT-PCR分析法(如图6a所示)与细胞化学染色法(如图6b所示)以厘清IL-20于成骨细胞中的功能。两种体外试验结果均显示IL-20及其三种受体亚基皆表达于MC3T3-E1的成骨细胞中。为了了解几种信号递送的蛋白质进行磷酸化的过程,使用鼠的IL-20(200ng/ml)(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)刺激MC3T3-E1细胞特定的时间长度。接着,根据厂商的操作手册,使用对磷酸化的ERK、AKT、STAT3、p38及JNK(Cell Signaling Technology)具有特异的抗体进行Western印迹分析法的实验。如图4c所示,JNK、ERK、AKT及p38在IL-20处理的MC3T3-E1成骨细胞中皆已磷酸化,此实验结果提供更多的证据证实IL-20是自体表达于成骨细胞中,并且以自分泌的方式诱发信号的递送作用。近年来的报导中指出Th17在诱发类风湿性关节炎及其疾病的进展中扮演极为重要的角色,Th17参与类风湿性关节炎的发病,主要是因为IL-17会刺激破骨细胞新生作用所导致(Kotake,S,et al.(1999)J.Clin.Invest.103:1345-1352)。于IL-20处理的MC3T3-E1成骨细胞中,IL-17的转录作用较高(如图6d所示)。为了确定IL-20是否通过诱发成骨细胞中RANKL的表达造成破骨细胞的新生作用,将MC3T3-E1与IL-20一起,使用RT-PCR反应分析法与流式细胞技术分析RANKL的表达。于使用IL-20处理的细胞中,RANKL的表达与时间相关并且远高于未经处理的对照组中的表达,并且于处理6小时后呈现一高峰(如图6e所示)。此外,于IL-20处理的MC3T3-E1细胞中,RANKL蛋白质的表面表达也较高(如图6f所示)。此实验结果显示IL-20可与Th17细胞作用,并且诱发RANKL的释出。此外,IL-20与IL-17可协同诱导更多RANKL的表达,也即,可提高破骨细胞的分化作用并且造成骨骼的损坏情形。
实施例8、IL-20抗体抑制IL-20诱导成骨细胞中RANKL的表达
如上所述,以IL-20处理的MC3T3-E1细胞中,其RANKL表达高于未经处理的MC3T3-E1细胞的表达(如图6e及图6f所示)。为了确认IL-20抗体mAb 7E抑制IL-20诱导RANKL表达的情形,将细胞与IL-20及mAb 7E共同处理。RT-PCR反应分析结果显示,并未于共同处理的细胞中观察到RANKL转录(如图7所示)。实验结果显示IL-20在成骨细胞中对RANKL的表达扮演上游活化子的角色,且mAb 7E可抑制IL-20诱导RANKL的表达。本实验结果提供一个强而有力的证据,证实IL-20在成骨细胞中可扮演RANKL上游诱导物的角色,并且藉此促进破骨细胞的新生作用。
其它实施例
本说明书中揭示的所有特征可以任何组合方式合并,且本说明书中所揭示的特征可被相同、相当、或类似目的的另一种特征所取代。因此,除非有其它特别的叙述,否则所揭示的各个特征仅为一般的相当或类似特征的实例。
上述实施例仅是为了方便说明而举例而已,本发明所主张的权利范围应以权利要求所述为准,而非仅限于上述实施例。
Claims (35)
1.一种在个体中治疗、延缓骨质疏松症发病或预防骨质疏松症的方法,包括给予该个体有效量的IL-20拮抗剂。
2.权利要求1的方法,其中该IL-20拮抗剂是特异结合IL-20的抗体或该抗体的抗原结合片段。
3.权利要求2的方法,其中该抗体或抗原结合片段特异结合人IL-20(SEQ ID NO:6)。
4.权利要求3的方法,其中该抗体或抗原结合片段包括来自由ATCC No.PTA-8587杂交瘤表达的抗体的轻链的三个互补决定区和重链的三个互补决定区。
5.权利要求4的方法,其中该抗体是人化抗体。
6.权利要求4的方法,其中该抗体是嵌合抗体。
7.权利要求6的方法,其中该嵌合抗体包括来自由ATCC No.PTA-8587细胞系产生的抗体的重链和轻链可变区序列。
8.权利要求6或7的方法,其中该抗体包括来自人抗体的重链恒定区序列和轻链恒定区序列。
9.权利要求3的方法,其中该抗体包括来自由ATCC No.PTA-8587细胞系生产的抗体的重链可变区序列。
10.权利要求3的方法,其中该抗体包括来自由ATCC No.PTA-8587细胞系生产的抗体的轻链可变区序列。
11.权利要求4的方法,其中该抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv;并且其中该抗原结合片段保留了由ATCC No.PTA-8587细胞系生产的抗体的结合特异性。
12.权利要求1的方法,其中该IL-20拮抗剂是包括IL-20R1、IL-20R2或IL-22R1的胞外结构域的多肽,并且其中该多肽特异地结合所述IL-20。
13.权利要求1的方法,其中IL-20拮抗剂是特异地抑制所述IL-20表达的siRNA、反义RNA、或microRNA。
14.权利要求1的方法,其中骨质疏松症与炎性疾病相关。
15.权利要求14的方法,其中炎性疾病是风湿性关节炎。
16.权利要求1的方法,其中骨质疏松症与雌激素缺乏相关。
17.权利要求16的方法,其中雌激素缺乏与更年期相关。
18.权利要求1的方法,其中骨质疏松症与雄激素缺乏相关。
19.权利要求1的方法,其中IL-20拮抗剂与另一治疗剂组合给予。
20.权利要求19的方法,其中该治疗剂是TNFa拮抗剂。
21.权利要求20的方法,其中该TNF拮抗剂选自依那西普多肽、因福利美和阿达木单抗组成的组。
22.权利要求21的方法,其中该依那西普多肽是含有人可溶性TNF受体和人免疫球蛋白G1的Fc部分的融合蛋白。
23.一种用于治疗、延缓骨质疏松症的发病或预防骨质疏松症的试剂盒,包括IL-20拮抗剂。
24.权利要求23的试剂盒,其中该试剂盒进一步包括用于使用该IL-20拮抗剂来治疗、延缓骨质疏松症的发病或预防骨质疏松症的说明书。
25.一种治疗风湿性关节炎的方法,包括给予有需要的受试者有效量的IL-20拮抗剂以及有效量的TNFa拮抗剂。
26.权利要求25的方法,其中IL-20拮抗剂是抗-IL-20抗体。
27.权利要求26的方法,其中抗-IL-20抗体是mAb 7E,所述mAb 7E是由保藏于美国菌株保藏中心的编号PTA-8687的杂交瘤细胞系所生产的。
28.权利要求25的方法,其中该抗-IL-20抗体是mAb 7E的功能等效物,该mAb7E是由保藏于美国菌株保藏中心的编号PTA-8687的杂交瘤细胞系所生产的。
29.权利要求28的方法,其中该抗-IL-20抗体是含有mAb 7E的VH和VL区的抗体,该mAb 7E是由保藏于美国菌株保藏中心的编号PTA-8687的杂交瘤细胞系所生产的。
30.权利要求28的方法,其中该抗-IL-20抗体是单链抗体或嵌合抗体。
31.权利要求28的方法,其中该抗-IL-20抗体是人化抗体或mAb 7E。
32.权利要求25的方法,其中该TNFa拮抗剂选自依那西普多肽、因福利美和阿达木单抗组成的组。
33.权利要求32的方法,其中该依那西普多肽是含有人可溶性TNF受体和人免疫球蛋白G1的Fc部分的融合蛋白。
34.权利要求33的方法,其中IL-20拮抗剂是含有mAb 7E的VH和VL区的抗体,该mAb 7E是由保藏于美国菌株保藏中心的编号PTA-8687的杂交瘤细胞系所生产的。
35.权利要求34的方法,其中该抗-IL-20抗体是人化抗体或mAb 7E。
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Cited By (3)
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---|---|---|---|---|
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CN106661105A (zh) * | 2014-04-01 | 2017-05-10 | 成功大学 | 用il‑20拮抗剂治疗炎性疼痛 |
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Families Citing this family (5)
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WO2011130611A2 (en) | 2010-04-16 | 2011-10-20 | National Cheng Kung University | Treating disorders associated with il-20 receptor-mediated signaling pathway by blocking il-20 receptor activity |
WO2014006230A1 (en) | 2012-07-06 | 2014-01-09 | Novo Nordisk A/S | Il-20 epitopes and il-20 ligands |
US20150203556A1 (en) * | 2012-07-10 | 2015-07-23 | The Uab Research Foundation | Compositions and methods for modulation of il-20 family cytokine activity |
US9982043B2 (en) | 2016-06-03 | 2018-05-29 | National Cheng Kung University | Use of IL-20 antagonists for treating pancreatic cancer |
KR101796025B1 (ko) | 2017-04-25 | 2017-11-10 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 사포그릴레이트, 프라바스타틴 및 tnf-억제제를 유효성분으로 포함하는 죽상동맥경화증 예방 또는 치료용 약학조성물 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003039534A1 (en) * | 2001-11-08 | 2003-05-15 | Merck & Co., Inc. | Compositions and methods for treating osteoporosis |
US20030148955A1 (en) * | 1999-04-19 | 2003-08-07 | Pluenneke John D. | Soluble tumor necrosis factor receptor treatment of medical disorders |
US6649779B2 (en) * | 1997-05-02 | 2003-11-18 | Wyeth | Estrenes |
US20050143333A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-06-30 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of interleukin and interleukin receptor gene expression using short interfering nucleic acid (SINA) |
US20060142550A1 (en) * | 2003-05-23 | 2006-06-29 | Chi-Mei Medical Center | Antibodies to interleukin-20 and method for inhibiting interleukin-20 induced cell proliferation |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
HU230515B1 (hu) * | 1996-02-09 | 2016-10-28 | Abbvie Biotechnology Ltd | Humán TNFalfa-kötő antitestek alkalmazásai |
AU739420B2 (en) * | 1997-11-26 | 2001-10-11 | Zymogenetics Inc. | Mammalian cytokine-like polypeptide-10 |
US6610286B2 (en) * | 1999-12-23 | 2003-08-26 | Zymogenetics, Inc. | Method for treating inflammation using soluble receptors to interleukin-20 |
AU2458001A (en) * | 1999-12-23 | 2001-07-03 | Zymogenetics Inc. | Method for treating inflammation |
DK1246846T3 (da) * | 1999-12-23 | 2008-12-08 | Zymogenetics Inc | Oplöselig interleukin-20-receptor |
US7122632B2 (en) * | 1999-12-23 | 2006-10-17 | Zymogenetics, Inc. | Soluble Interleukin-20 receptor |
CA2459943A1 (en) * | 2001-09-21 | 2003-04-03 | Merck & Co., Inc. | Androstanes as androgen receptor modulators |
US20050170468A1 (en) * | 2003-11-21 | 2005-08-04 | Wenfeng Xu | Anti-IL-20 receptor antibodies and binding partners and methods of using in inflammation |
MY167262A (en) * | 2006-03-30 | 2018-08-14 | Toray Industries | Hyperbranched-polyester, method for producing the same, and thermoplastic resin composition |
JP5330829B2 (ja) * | 2006-08-04 | 2013-10-30 | 憲弘 西本 | 関節リウマチ患者の治療予後予測方法 |
-
2009
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2015
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6649779B2 (en) * | 1997-05-02 | 2003-11-18 | Wyeth | Estrenes |
US20030148955A1 (en) * | 1999-04-19 | 2003-08-07 | Pluenneke John D. | Soluble tumor necrosis factor receptor treatment of medical disorders |
US20050143333A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-06-30 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of interleukin and interleukin receptor gene expression using short interfering nucleic acid (SINA) |
WO2003039534A1 (en) * | 2001-11-08 | 2003-05-15 | Merck & Co., Inc. | Compositions and methods for treating osteoporosis |
US20060142550A1 (en) * | 2003-05-23 | 2006-06-29 | Chi-Mei Medical Center | Antibodies to interleukin-20 and method for inhibiting interleukin-20 induced cell proliferation |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104853774A (zh) * | 2012-08-07 | 2015-08-19 | 国立成功大学 | Il-20拮抗剂用于治疗肝脏疾病 |
CN104853774B (zh) * | 2012-08-07 | 2018-11-02 | 成功大学 | Il-20拮抗剂用于治疗肝脏疾病 |
CN106661105A (zh) * | 2014-04-01 | 2017-05-10 | 成功大学 | 用il‑20拮抗剂治疗炎性疼痛 |
CN106661105B (zh) * | 2014-04-01 | 2022-07-19 | 永福生物科技股份有限公司 | 用il-20拮抗剂治疗炎性疼痛 |
CN107249630A (zh) * | 2014-11-24 | 2017-10-13 | 国家健康与医学研究院 | 通过il‑20r的拮抗作用治疗慢性阻塞性肺疾病的急性加重 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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