BR112020025504A2 - Anticorpo que induz a imunotolerância, linfócito induzido, e agente de terapia celular método terapêutico usando o linfócito induzido - Google Patents
Anticorpo que induz a imunotolerância, linfócito induzido, e agente de terapia celular método terapêutico usando o linfócito induzido Download PDFInfo
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Abstract
''anticorpo que induz a imunotolerância, linfócito induzido, e agente de terapia celular método terapêutico usando o linfócito induzido. a presente invenção proporciona um anticorpo para induzir a imunotolerância, um linfócito induzido e um agente de terapia celular/ método terapêutico usando o linfócito induzido. especificamente, a presente invenção proporciona um anticorpo que inibe a interação entre cd80 e/ou cd86, expressa sobre a superfície de uma determinada célula, e cd28, expressa sobre a superfície de outra célula, e não induz substancialmente as citocinas induzidas por ativação imunológica. em uma modalidade específica, a parte fc do anticorpo não produz substancialmente as citocinas induzidas por ativação imunológica.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPO QUE INDUZ A IMUNOTOLERÂNCIA, LINFÓCITO INDUZI- DO, E AGENTE DE TERAPIA CELULAR MÉTODO TERAPÊUTICO USANDO O LINFÓCITO INDUZIDO". Campo Técnico
[0001] A presente invenção se refere a uma nova tecnologia rela- cionada à imunotolerância. Mais especificamente, a presente invenção se refere a um anticorpo que induz a imunotolerância, ao linfócito in- duzido ou ao agente de terapia celular/método terapêutico usando um linfócito induzido. Técnica Antecedente
[0002] O transplante de fígado tem sido amplamente usado como o tratamento final em pacientes com insuficiência hepática terminal.
20.000 ou mais transplantes de fígado são realizados no exterior, e mais de 500 são realizados no Japão, anualmente.
[0003] O transplante é um dos tratamentos primários escolhidos para a insuficiência de órgãos terminais do rim, coração, fígado, pân- creas ou similares. Apesar do grande avanço no tratamento de rejei- ção de enxertos nos últimos anos, a maioria dos transplantes é, no fi- nal, rejeitada, sem qualquer regime imunossupressor. O regime imu- nossupressor com fármacos de hoje, que é dependente da terapia contínua com fármacos, suprime não apenas as respostas que são claramente direcionadas ao transplante, como também todas as res- postas imunes, de modo que os pacientes com transplante de órgãos se tornam mais vulneráveis a uma sensibilidade aumentada às infec- ções e ao câncer.
[0004] Embora a medicina regenerativa também tenha chamado a atenção, a rejeição imunológica pode ocorrer essencialmente sem quaisquer células autólogas, mesmo se forem usadas células-tronco pluripotentes induzidas (células iPS) ou similares. Assim, as tecnologi-
as de imunotolerância têm obtido atenção.
[0005] Essas tecnologias para induzir a imunotolerância incluem a indução de uma resposta não imune específica para o antígeno (aner- gia) das células T. As tecnologias específicas descritas incluem uma tecnologia para administrar diretamente um anticorpo, o qual inibe as interações entre CD80/CD86 sobre as células apresentadoras de antí- geno e CD28 sobre as células T não ativadas (virgens), a um paciente com transplante de órgão, para induzir a anergia específica para o an- tígeno do doador no corpo (Literatura de Patente 1), e uma tecnologia de cocultura de células de receptor e células de doador irradiadas com radiação, na presença do mesmo anticorpo, para induzir células anér- gicas específicas para o antígeno do doador ex vivo e retornar as refe- ridas células ao receptor (Literatura de Patente 2, Literatura de Patente 3 e Literaturas que não são de Patentes 1 a 3) Lista de Citações Literatura de Patente
[0006] [PTL 1] Publicação Japonesa Exposta PCT em Fase Naci- onal No. 2002-504120
[0007] [PTL 2] Publicação Japonesa Exposta PCT em Fase Naci- onal No. 2007-131598
[0008] [PTL 3] Publicação Japonesa Exposta PCT em Fase Naci- onal No. 2016-520081 Literatura que não é de Patente
[0009] [NPL 1] Satoru Todo et al. Hepatorogy, 64 (vol.2), 632-643 (2016)
[00010] [NPL 2] Teraoka S, Koyama |, Bashuda H, Uchida K, Tons- ho M, et al. (2017) J Transplant Res 2(1) p1-8
[00011] [NPL 3] Bashuda H et a/., J. Clin. Invest. 115: 1896-1902 (2005).
Sumário da Invenção Solução para o Problema
[00012] Os inventores tentaram induzir uma resposta não imune (anergia) usando um anticorpo com uma região Fc humana específica que inibe a interação entre CD80/CD86 e CD28, resultando na desco- berta que a ligação a uma célula envolvida no sistema imunológico, como um macrófago, um neutrófilo ou uma célula exterminadora natu- ral (NK), ativa essas células e induz a liberação de um fator humoral, como a interleucina ou o interferon (IFN), que é responsável pelas res- postas imunes. Os inventores descobriram recentemente que a libera- ção desses fatores humorais induz a ativação desvantajosa do sistema imunológico, que é o oposto da imunotolerância, de modo que o efeito da imunotolerância pode ser melhorado, ou a atenuação do efeito da imunotolerância pode ser suprimida, ajustando a indução de respostas não imunes (anergia) usando um anticorpo com uma região Fc huma- na que não se liga a essas células. Os inventores proporcionam, as- sim, um anticorpo com uma estrutura tendo uma característica de me- lhorar, ou não atenuar, o efeito da imunotolerância.
[00013] Portanto, a presente invenção proporciona o que se segue.
(1) Um anticorpo ou a sua variante que inibe uma interação entre CD80 e/ou CD86, expressa sobre uma superfície de uma célula, e CD28, expressa sobre uma superfície de outra célula, em que o anti- corpo ou a sua variante não induz substancialmente a produção de uma citocina por imunoestimulação.
(2) O anticorpo ou a sua variante do item precedente, em que a citocina compreende o interferon y.
(3) O anticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens precedentes, o qual é um anticorpo quimérico.
(4) O anticorpo ou a sua variante de qualquer um dos itens precedentes, em que uma subclasse do anticorpo é a IgG1.
(5) O anticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens precedentes, tendo uma cadeia pesada com a sequência de aminoá- cidos apresentada na SEQ ID NO: 38 ou 42, e uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 40 ou 44.
(6) O anticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens precedentes, compreendendo: (a) uma VH compreendendo a CDRH1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 53, a CDRH2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 54 e a CDRH3 da se- quência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 55, e uma VL compreendendo a CDRL1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 56, a CDRL2 da sequência de aminoácidos apresen- tada na SEQ ID NO: 57 e a CDRL3 apresentada na SEQ ID NO: 58; ou (b) uma VH compreendendo a CDRH1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 59, a CDRH2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 60 e a CDRH3 da se- quência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 61, e uma VL compreendendo a CDRL1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 62, a CDRL2 da sequência de aminoácidos apresen- tada na SEQ ID NO: 63 e a CDRL3 apresentada na SEQ ID NO: 64.
(7) O anticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens precedentes, compreendendo: (a) uma VH tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 46 ou uma sequência variante dela, e uma VL tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 48 ou uma sequência variante dela; ou (b) uma VH tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 50 ou uma sequência variante dela, e uma VL tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 52 ou uma sequência variante dela.
(8) O anticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens precedentes, em que uma parte Fc do anticorpo é uma parte que não induz substancialmente a produção de uma citocina por imunoestimu- lação.
(9) O anticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens precedentes, em que uma subclasse do anticorpo é a IgG2 ou a IgG4.
(10) O anticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens precedentes, em que uma subclasse do anticorpo é a IgG4.
(11) O anticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens precedentes, em que a variante do anticorpo é uma variante não tendo uma parte Fc do anticorpo.
(12) O anticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens precedentes, em que a variante do anticorpo é um anticorpo Fab, um anticorpo F(ab')2a, um anticorpo Fab', um anticorpo Fv ou um anticorpo scFv.
(13) O anticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens precedentes, tendo uma capacidade de induzir a imunotolerância.
(14) O anticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens precedentes, em que a célula que expressa CD80 e/ou CD86 é uma célula apresentadora de antígeno e a outra célula que expressa CD28 é uma célula T.
(15) O anticorpo de quaisquer dos itens precedentes, em que o anticorpo ou a sua variante é um anticorpo anti-CD80 antagonís- tico, um anticorpo anti-CD86 antagonístico, um anticorpo anti-CD28 antagonístico ou um anticorpo biespecífico antagonístico para CD80 e CDB86, ou uma variante dele.
(16) O anticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens precedentes, o qual é um anticorpo humanizado ou um anticorpo hu- mano, ou uma variante dele.
(17) O anticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens precedentes, compreendendo uma parte Fc de IgG2 ou IgG4 de um anticorpo humano.
(18) O anticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens precedentes, compreendendo uma parte Fc de IgG4 de um anticorpo humano.
(19) O anticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens precedentes, compreendendo: (a) uma VH compreendendo a CDRH1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 25, a CDRH2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26 e a CDRH3 da se- quência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 27, e uma VL compreendendo a CDRL1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 28, a CDRL2 da sequência de aminoácidos apresen- tada na SEQ ID NO: 29 e a CDRL3 apresentada na SEQ ID NO: 30; ou (b) uma VH compreendendo a CDRH1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 31, a CDRH2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 32 e a CDRH3 da se- quência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 33, e uma VL compreendendo a CDRL1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 34, a CDRL2 da sequência de aminoácidos apresen- tada na SEQ ID NO: 35 e a CDRL3 apresentada na SEQ ID NO 36.
(20) O anticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens precedentes, compreendendo: (a) uma VH tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18 ou uma sequência variante dela, e uma VL tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 20 ou uma sequência variante dela; ou (b) uma VH tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 22 ou uma sequência variante dela, e uma VL tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 24 ou uma sequência variante dela.
(21) Uma molécula de ácido nucleico que codifica a se- quência de aminoácidos ou uma parte dela do anticorpo ou da variante dele de quaisquer dos itens precedentes.
(22) A molécula de ácido nucleico de quaisquer dos itens precedentes, compreendendo: (a) um polinucleotídeo que codifica uma VH, tendo a se- quência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 45, e um polinucleotídeo que codifica uma VL, tendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 47; ou (b) um polinucleotídeo que codifica uma VH, tendo a se- quência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 49, e um polinucleotídeo que codifica uma VL, tendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 51.
(23) Um vetor tendo a molécula de ácido nucleico de quais- quer dos itens precedentes.
(24) Uma célula que compreende a molécula de ácido nu- cleico de quaisquer dos itens precedentes ou o vetor do item 23.
(25) Um método de fabricação do anticorpo ou da variante dele de quaisquer dos itens precedentes, compreendendo a cultura da célula de quaisquer dos itens precedentes.
(26) Uma célula tendo imunotolerância induzida com o anti- corpo ou a sua variante de quaisquer dos itens precedentes.
(27) A célula de quaisquer dos itens precedentes, em que a imunotolerância é induzida pela mistura do anticorpo ou da variante dele, uma célula derivada de um paciente e um antígeno que não é derivado do paciente ou um material que contém um antígeno.
(28) Uma composição para a preparação de uma célula tendo imunotolerância induzida, compreendendo pelo menos um dos anticorpos ou das suas variantes de quaisquer dos itens precedentes.
(29) A composição de quaisquer dos itens precedentes, compreendendo um anticorpo anti-CD80 antagonístico, um anticorpo anti-CD86 antagonístico, um anticorpo anti-CD28 antagonístico ou um anticorpo biespecífico antagonístico para CD80 e CD86, ou uma vari- ante dele, ou qualquer combinação deles.
(30) Um método para fabricar uma célula para tratar ou prevenir uma doença, distúrbio ou condição causada por um antígeno que não é derivado de um paciente, compreendendo a mistura do an- ticorpo ou da sua variante de quaisquer dos itens precedentes, uma célula derivada do paciente e um antígeno que não é derivado do pa- ciente ou um material que contém um antígeno.
(31) O método de quaisquer dos itens precedentes, em que a doença, o distúrbio ou a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em rejeição de enxerto, alergia, doença autoimune, do- ença do enxerto contra hospedeiro e rejeição imunológica causada por transplante de uma célula iPS ou uma célula ES e uma célula, tecido ou órgão derivado das referidas células.
(32) O método de quaisquer dos itens precedentes, em que um material que contém um antígeno é uma célula.
(33) Uma célula fabricada pelo método de quaisquer dos itens precedentes.
(34) A célula de quaisquer dos itens precedentes, compre- endendo uma célula T.
(35) Um agente de terapia celular compreendendo uma cé- lula tendo imunotolerância induzida com o anticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens precedentes, uma célula fabricada pelo método de quaisquer dos itens precedentes ou a célula de quaisquer dos itens precedentes.
(36) Uma composição para tratar ou prevenir uma doença, distúrbio ou condição causada por um antígeno que não é derivado de um paciente, compreendendo uma célula tendo imunotolerância indu- zida com o anticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens prece- dentes, uma célula fabricada pelo método de quaisquer dos itens pre- cedentes, ou a célula de quaisquer dos itens precedentes.
(37) A composição de quaisquer dos itens precedentes, em que a doença, o distúrbio ou a condição é selecionada a partir do gru- po que consiste em rejeição de enxerto, alergia, doença autoimune, doença do enxerto contra hospedeiro e rejeição imunológica causada por transplante de uma célula iPS ou uma célula ES e uma célula, te- cido ou órgão derivado das referidas células.
(38) A composição de quaisquer dos itens precedentes, em que a rejeição é caracterizada pelo fato de que um órgão transplanta- do é um rim, um fígado, um coração, pele, um pulmão, um pâncreas, um esôfago, um estômago, um intestino delgado, um intestino grosso, um nervo, sangue, uma célula sanguínea, incluindo uma célula do sis- tema imunológico, um osso, uma cartilagem, um vaso sanguíneo, uma córnea, um globo ocular ou uma medula óssea.
(39) Um método para tratar ou prevenir uma doença, dis- túrbio ou condição, causada por um antígeno que não é derivado de um paciente, no paciente, compreendendo a administração ao pacien- te de uma quantidade eficaz de uma célula tendo imunotolerância in- duzida com o anticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens pre- cedentes, uma célula fabricada pelo método de quaisquer dos itens precedentes ou a célula de quaisquer dos itens precedentes.
(40) O método de quaisquer dos itens precedentes, em que a doença, o distúrbio ou a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em rejeição de enxerto, alergia, doença autoimune, do- ença do enxerto contra hospedeiro e rejeição imunológica causada por transplante de uma célula iPS ou uma célula ES e uma célula, tecido ou órgão derivado das referidas células.
(41) O método de quaisquer dos itens precedentes, em que a rejeição é caracterizada pelo fato de que um órgão transplantado é um rim, um fígado, um coração, pele, um pulmão, um pâncreas, um esôfago, um estômago, um intestino delgado, um intestino grosso, um nervo, sangue, uma célula sanguínea, incluindo uma célula do sistema imunológico, um osso, uma cartilagem, um vaso sanguíneo, uma cór- nea, um globo ocular ou uma medula óssea.
(39A) Uso de uma célula tendo imunotolerância induzida com o anticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens precedentes, uma célula fabricada pelo método de quaisquer dos itens precedentes, ou a célula de quaisquer dos itens precedentes, para a fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir uma doença, distúrbio ou condição, causada por um antígeno que não é derivado de um pacien- te, no paciente.
(40A) O uso de quaisquer dos itens precedentes, em que a doença, o distúrbio ou a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em rejeição de enxerto, alergia, doença autoimune, doença do enxerto contra hospedeiro e rejeição imunológica causada por transplante de uma célula iPS ou uma célula ES e uma célula, tecido ou órgão derivado das referidas células.
(41A) O uso de quaisquer dos itens precedentes, em que a rejeição é caracterizada pelo fato de que um órgão transplantado é um rim, um fígado, um coração, pele, um pulmão, um pâncreas, um esô- fago, um estômago, um intestino delgado, um intestino grosso, um nervo, sangue, uma célula sanguínea, incluindo uma célula do sistema imunológico, um osso, uma cartilagem, um vaso sanguíneo, uma cór- nea, um globo ocular ou uma medula óssea.
(39B) Uma célula tendo imunotolerância induzida com o an-
ticorpo ou a sua variante de quaisquer dos itens precedentes, uma cé- lula fabricada pelo método de quaisquer dos itens precedentes, ou a célula de quaisquer dos itens precedentes, para a fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir uma doença, distúrbio ou condi- ção, causada por um antígeno que não é derivado de um paciente, no paciente.
(40B) A célula de quaisquer dos itens precedentes, em que a doença, o distúrbio ou a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em rejeição de enxerto, alergia, doença autoimune, do- ença do enxerto contra hospedeiro e rejeição imunológica causada por transplante de uma célula iPS ou uma célula ES e uma célula, tecido ou órgão derivado das referidas células.
(41B) A célula de quaisquer dos itens precedentes, em que a rejeição é caracterizada pelo fato de que um órgão transplantado é um rim, um fígado, um coração, pele, um pulmão, um pâncreas, um esôfago, um estômago, um intestino delgado, um intestino grosso, um nervo, sangue, uma célula sanguínea, incluindo uma célula do sistema imunológico, um osso, uma cartilagem, um vaso sanguíneo, uma cór- nea, um globo ocular ou uma medula óssea.
[00014] A presente invenção também proporciona o que se segue.
(A1) Um anticorpo que inibe uma interação entre CD80 e/ou CD86, expressa sobre uma superfície de uma célula, e CD28, expres- sa sobre uma superfície de outra célula, em que o anticorpo não induz substancialmente a produção de uma citocina por imunoestimulação.
(A2) O anticorpo de (A1), em que a citocina compreende o interferon y.
(A3) O anticorpo de (A1) ou (A2), em que uma parte Fc do anticorpo é uma parte que não induz substancialmente a produção de uma citocina por imunoestimulação.
(A4) O anticorpo de qualquer um de (A1) a (A3), em que uma subclasse do anticorpo é a I9gG2 ou a I9G4.
(A5) O anticorpo de (A4), em que a subclasse do anticorpo é a IgG4.
(A6) O anticorpo de (A1) ou (A2), em que o anticorpo não possui uma parte Fc.
(A7) O anticorpo de (A6), em que o anticorpo é um anticor- po Fab, um anticorpo F(ab'), um anticorpo Fab', um anticorpo Fv ou um anticorpo scFv.
(A8) O anticorpo de qualquer um de (A1) a (A7), tendo uma capacidade de induzir a imunotolerância.
(A9) O anticorpo de qualquer um de (A1) a (A8), em que a célula que expressa CD80 e/ou CD86 é uma célula apresentadora de antígeno e a outra célula que expressa CD28 é uma célula T.
(A10) O anticorpo de qualquer um de (A1) a (A9), em que o anticorpo é um anticorpo anti-CD80 antagonístico, um anticorpo anti- CDB86 antagonístico, um anticorpo anti-CD28 antagonístico ou um anti- corpo biespecífico antagonístico para CD80 e CD86.
(A11) O anticorpo de qualquer um de (A1) a (A10), o qual é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano.
(A12) O anticorpo de qualquer um de (A1) a (A11), compre- endendo uma parte Fc de IgG2 ou IgG4 de um anticorpo humano.
(A13) O anticorpo de qualquer um de (A1) a (A12), compre- endendo uma parte Fc de IgG4 de um anticorpo humano.
(A14) O anticorpo de qualquer um de (A1) a (A13), compre- endendo: (a) uma VH compreendendo a CDRH1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 25, a CDRH2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26 e a CDRH3 da se- quência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 27, e uma VL compreendendo a CDRL1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 28, a CDRL2 da sequência de aminoácidos apresen- tada na SEQ ID NO: 29 e a CDRL3 apresentada na SEQ ID NO: 30; ou (b) uma VH compreendendo a CDRH1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 31, a CDRH2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 32 e a CDRH3 da se- quência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 33, e uma VL compreendendo a CDRL1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 34, a CDRL2 da sequência de aminoácidos apresen- tada na SEQ ID NO: 35, e a CDRL3 apresentada na SEQ ID NO: 36.
(A15) O anticorpo de (A14), compreendendo: (a) uma VH tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18 ou uma sequência variante dela, e uma VL tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 20 ou uma sequência variante dela; ou (b) uma VH tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 22 ou uma sequência variante dela, e uma VL tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 24 ou uma sequência variante dela.
(A16) Uma molécula de ácido nucleico que codifica a se- quência de aminoácidos ou uma parte dela do anticorpo de qualquer um de (A1) a (A15).
(A17) A molécula de ácido nucleico de (A16) que compre- ende: (a) um polinucleotídeo que codifica uma VH, tendo a se- quência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 17, e um polinu- cleotídeo que codifica uma VL, tendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 19; ou (b) um polinucleotídeo que codifica uma VH, tendo a se-
quência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 21, e um polinu- cleotídeo que codifica uma VL, tendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 23.
(A18) Um vetor tendo a molécula de ácido nucleico de (A16) ou (A17).
(A19) Uma célula compreendendo a molécula de ácido nu- cleico de (A16) ou (A17) ou o vetor de (A18).
(A20) Um método de fabricação do anticorpo de qualquer um de (A1) a (A15), compreendendo a cultura da célula de (A19).
(A21) Uma célula tendo imunotolerância induzida com o an- ticorpo de qualquer um de (A1) a (A15).
(A22) A célula de (A21), em que a imunotolerância é indu- zida por mistura do anticorpo, uma célula derivada de um paciente e um antígeno que não é derivado do paciente ou um material que con- tém um antígeno.
(A23) Uma composição para preparar uma célula tendo imunotolerância induzida, compreendendo pelo menos um dos anti- corpos de qualquer um de (A1) a (Aí15).
(A24) A composição de (A23), compreendendo um anticor- po anti-CD80 antagonístico, um anticorpo anti-CD86 antagonístico, um anticorpo anti-CD28 antagonístico ou um anticorpo biespecífico anta- gonístico para CD80 e CD86, ou qualquer combinação deles.
(A25) Um método para fabricar uma célula para tratar ou prevenir uma doença, distúrbio ou condição causada por um antígeno que não é derivado de um paciente, compreendendo a mistura do an- ticorpo de qualquer um de (A1) a (A15), uma célula derivada do paci- ente e um antígeno que não é derivado do paciente ou um material que contém um antígeno.
(A26) O método de (A25), em que a doença, o distúrbio ou a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em rejeição de enxerto, alergia, doença autoimune, doença do enxerto contra hos- pedeiro e rejeição imunológica causada por transplante de uma célula iPS ou uma célula ES e uma célula, tecido ou órgão derivado das refe- ridas células.
(A27) O método de (A25) ou (A26), em que o material que contém um antígeno é uma célula.
(A28) Uma célula fabricada pelo método de qualquer um de (A25) a (A27).
(A29) A célula de (A28), compreendendo uma célula T.
(A3O0) Um agente de terapia celular compreendendo uma célula tendo imunotolerância induzida com o anticorpo de qualquer um de (A1) a (A15), uma célula fabricada pelo método de (A25) ou (A26) ou a célula de (A21), (A22), (A28) ou (A29).
(A31) Uma composição para tratar ou prevenir uma doença, distúrbio ou condição causada por um antígeno que não é derivado de um paciente, compreendendo uma célula tendo imunotolerância indu- zida com o anticorpo de qualquer um de (A1) a (A15), uma célula fa- bricada pelo método de (A25) ou (A26), ou a célula de (A21), (A22), (A28) ou (A29).
(A32) A composição de (A31), em que a doença, o distúrbio ou a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em rejei- ção de enxerto, alergia, doença autoimune, doença do enxerto contra hospedeiro e rejeição imunológica causada por transplante de uma célula iPS ou uma célula ES e uma célula, tecido ou órgão derivado das referidas células.
(A33) A composição de (A32), em que a rejeição é caracte- rizada pelo fato de que um órgão transplantado é um rim, um fígado, um coração, pele, um pulmão, um pâncreas, um esôfago, um estôma- go, um intestino delgado, um intestino grosso, um nervo, sangue, uma célula sanguínea, incluindo uma célula do sistema imunológico, um osso, uma cartilagem, um vaso sanguíneo, uma córnea, um globo ocu- lar ou uma medula óssea.
(A34) Um método para tratar ou prevenir uma doença, dis- túrbio ou condição, causada por um antígeno que não é derivado de um paciente, no paciente, compreendendo a administração ao pacien- te de uma quantidade eficaz de uma célula tendo imunotolerância in- duzida com o anticorpo de qualquer um de (A1) a (A15), uma célula fabricada pelo método de (A23) ou (A24), ou a célula de (A21), (A22), (A28) ou (A29).
(A35) O método de (A34), em que a doença, o distúrbio ou a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em rejeição de enxerto, alergia, doença autoimune, doença do enxerto contra hos- pedeiro e rejeição imunológica causada por transplante de uma célula iPS ou uma célula ES e uma célula, tecido ou órgão derivado das refe- ridas células.
(A36) O método de (A35), em que a rejeição é caracteriza- da pelo fato de que um órgão transplantado é um rim, um fígado, um coração, pele, um pulmão, um pâncreas, um esôfago, um estômago, um intestino delgado, um intestino grosso, um nervo, sangue, uma cé- lula sanguínea, incluindo uma célula do sistema imunológico, um osso, uma cartilagem, um vaso sanguíneo, uma córnea, um globo ocular ou uma medula óssea.
[00015] A presente invenção se refere ainda às invenções que se seguem.
(B1) Um anticorpo tendo uma região Fc humana, em que o anticorpo pode inibir uma interação entre CD80 ou CD86 expressa so- bre uma superfície celular e CD28 expressa sobre outra superfície ce- lular, e não promove a produção de citocinas por uma PBMC humana.
(B2) O anticorpo de (B1), o qual pode inibir uma interação entre CD80 ou CD86 expressa sobre uma superfície da célula apre-
sentadora de antígeno e CD28 expressa sobre uma superfície da célu- laT.
(B3) O anticorpo de (B1) ou (B2), o qual pode induzir a imunotolerância a um antígeno por contato do anticorpo com uma PBMC, juntamente com o antígeno ou uma célula tendo o antígeno sobre uma superfície.
(B4) O anticorpo de qualquer um de (B1) a (B3), em que uma citocina é o IFNy.
(B5) O anticorpo de qualquer um de (B1) a (B4), o qual é um anticorpo anti-CD80 ou um anticorpo anti-CD86.
(B6) O anticorpo de qualquer um de (B1) a (B5), o qual é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano.
(B7) O anticorpo de qualquer um de (B1) a (B6), o qual é um anticorpo monoclonal.
(B8) O anticorpo de qualquer um de (B1) a (B7), cuja sub- classe é a IgG2 ou a IgG4.
(B8A) O anticorpo de qualquer um de (B1) a (B7), cuja sub- classe é a IgG1.
(B8B) O anticorpo de (B8A), tendo uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos apresentada em uma SEQ ID NO. seleci- onada a partir das SEQ ID NOs: 38 e 42.
(B8C) O anticorpo de (B8B), tendo: uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos apre- sentada na SEQ ID NO: 38 e uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID No: 40, ou uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos apre- sentada na SEQ ID NO: 42 e uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 44.
(B8D) O anticorpo de qualquer um de (B1) a (B7) e (BBA) a
(B8C), tendo a CDRH3 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 55 ou 61.
(B8E) O anticorpo de (B8D), o qual é (Bi) um anticorpo tendo a CDRH1 da sequência de aminoá- cidos apresentada na SEQ ID NO: 53, a CDRH2 da sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 54 e a CDRH3 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 55, ou (Bii) um anticorpo tendo a CDRH1 da sequência de amino- ácidos apresentada na SEQ ID NO: 59, a CDRH2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 60 e a CDRH3 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 61 (B8F) O anticorpo de (Bi) de (B8E), tendo a CDRL1 da se- quência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 56, a CDRL2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 57 e a CDRL3 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 58, ou o anticorpo de (Bii) de (B8E), tendo a CDRL1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 62, a CDRL2 da sequên- cia de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 63 e a CDRL3 da se- quência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 64.
(B8G) O anticorpo de (B8D), tendo uma região variável da cadeia pesada (VH) com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 46 ou 50.
(B8H) O anticorpo de (B8G), tendo uma VH com a sequên- cia de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 46 e uma região vari- ável da cadeia leve (VL) com a sequência de aminoácidos apresenta- da na SEQ ID NO: 48, ou tendo uma VH com a sequência de aminoá- cidos apresentada na SEQ ID NO: 50 e uma VL com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 52.
(B81) O anticorpo de (B8G), tendo uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos apresentada em uma SEQ ID NO. seleci-
onada a partir das SEQ ID NOs: 38 e 42.
(B8J) O anticorpo de (B8l) tendo: uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos apre- sentada na SEQ ID NO: 38 e uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 40, ou uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos apre- sentada na SEQ ID NO: 42 e uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 44.
(B9) O anticorpo de qualquer um de (B1) a (B8), tendo a CDRHB3 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO 27 ou 33.
(B10) O anticorpo de (B9), o qual é (Bi) um anticorpo tendo a CDRH1 da sequência de aminoá- cidos apresentada na SEQ ID NO: 25, a CDRH2 da sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 26 e a CDRH3 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 27, ou (Bii) um anticorpo tendo a CDRH1 da sequência de amino- ácidos apresentada na SEQ ID NO: 31, a CDRH2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 32 e a CDRH3 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 33 (B11) O anticorpo de (Bi) de (B10), tendo a CDRL1 da se- quência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 28, a CDRL2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 29 e a CDRL3 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 30, ou o anticorpo de (Bii) de (B10), tendo a CDRL1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 34, a CDRL2 da sequên- cia de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 35 e a CDRL3 da se- quência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 36.
(B12) O anticorpo de (B9), tendo uma região variável da cadeia pesada (VH) com a sequência de aminoácidos apresentada na
SEQ ID NO: 18 ou 22.
(B13) O anticorpo de (B12) tendo uma VH com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18 e uma região variável da cadeia leve (VL) com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 20, ou tendo uma VH com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 22 e uma VL com a sequência de amino- ácidos apresentada na SEQ ID NO: 24.
(B14) O anticorpo de (B12), tendo uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos apresentada em uma SEQ ID NO. seleci- onada a partir das SEQ ID NOs: 2,6, 10 e 14.
(B15) O anticorpo de (B14) tendo: uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos apre- sentada na SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve com a sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 4; uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos apre- sentada na SEQ ID NO: 6 e uma cadeia leve com a sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 8; uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos apre- sentada na SEQ ID NO: 10 e uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12; ou uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos apre- sentada na SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16.
(B16) Uma composição médica compreendendo o anticorpo de qualquer um de (B1) a (B15).
(B17) A composição médica de (B16), compreendendo um anticorpo anti-CD80 anticorpo anti-CD86.
(B18) A composição médica de (B16) ou (B17) usada para induzir a imunotolerância.
(B19) A composição médica de (B18) usada para induzir a imunotolerância em uma célula coletada de um paciente recebendo um transplante de órgão.
(B20) A composição médica de (B19) ou (B20), em que um órgão a ser transplantado é um coração, um rim ou um fígado.
(B21) A composição médica de (B18) usada para induzir a imunotolerância em um paciente com uma doença autoimune ou uma doença alérgica.
(B22) Uma molécula de ácido nucleico que codifica a se- quência de aminoácidos do anticorpo de qualquer um de (B12) a (B15).
(B23) A molécula de ácido nucleico de (B22) compreen- dendo um polinucleotídeo que codifica uma VH com a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma selecionada a partir das SEQ ID NOs: 1,5, 926 13 e um polinucleotídeo que codifica uma VL com a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma sele- cionada a partir das SEQ ID NOs: 3,7, 11 e 15.
(B24) Um vetor tendo a molécula de ácido nucleico de (B22) ou (B23).
(B25) Uma célula hospedeira tendo o vetor de (B24).
(B26) Um método de fabricação do anticorpo de qualquer um de (B1) a (B15), compreendendo a cultura da célula hospedeira de (B25).
(B27) Um método de induzir a imunotolerância a um antí- geno de uma PBMC, compreendendo o contato do anticorpo de qual- quer um de (B1) a (B15), um antígeno para o qual a imunotolerância deve ser induzida ou uma célula com o antígeno sobre uma superfície, e a PBMC.
(B28) O método de induzir de (B27), o qual é realizado ex vivo.
(B29) O método de (B27) ou (B28), em que a PBMC é uma célula coletada de um paciente recebendo o transplante de órgão.
(B30) O método de (B27) ou (B28), em que a PBMC é uma célula coletada de um paciente com uma doença autoimune ou uma doença alérgica.
(B31) Uma PBMC tendo imunotolerância induzida pelo mé- todo de qualquer um de (B27) a (B30).
(B32) Um agente de terapia celular compreendendo a PBMC de (B30) como um ingrediente ativo.
(B33) O agente de terapia celular de (B32) para suprimir a rejeição no transplante de órgãos.
(B34) O agente de terapia celular de (B33), em que um ór- gão transplantado é um rim, um fígado, um coração, pele, um pulmão, um pâncreas, um esôfago, um estômago, um intestino delgado, um intestino grosso, um nervo, sangue, uma célula sanguínea, incluindo uma célula do sistema imunológico, um osso, uma cartilagem, um va- so sanguíneo, uma córnea, um globo ocular ou uma medula óssea.
(B35) O agente de terapia celular de (B32) para o tratamen- to de uma doença autoimune ou uma doença alérgica.
(B36) Um método de suprimir uma rejeição no transplante de órgão, compreendendo a administração do anticorpo de qualquer um de (B1) a (B15) a um paciente recebendo o transplante de órgão.
(B37) O método de (B36), em que um órgão transplantado é um rim, um fígado, um coração, pele, um pulmão, um pâncreas, um esôfago, um estômago, um intestino delgado, um intestino grosso, um nervo, sangue, uma célula sanguínea, incluindo uma célula do sistema imunológico, um osso, uma cartilagem, um vaso sanguíneo, uma cór- nea, um globo ocular ou uma medula óssea.
(B37) Um método de tratar uma doença autoimune ou uma doença alérgica, compreendendo a administração do anticorpo de qualquer um de (B1) a (B15) a um paciente com uma doença autoimu-
ne ou uma doença alérgica.
(B38) Um método de suprimir a rejeição no transplante de órgão, compreendendo a administração do agente de terapia celular de qualquer um de (B32) a (B34) a um paciente recebendo o trans- plante de órgão.
(B39) Um método de tratar uma doença autoimune ou uma doença alérgica, compreendendo a administração do agente de tera- pia celular de (B32) ou (B35) a um paciente com uma doença autoi- mune ou uma doença alérgica.
(B40) O método de qualquer um de (B27) a (B30), compre- endendo ainda a administração de uma PBMC com imunotolerância induzida a um paciente.
(B41) O método de (B40), que compreende a administração a um paciente recebendo um transplante de órgão de uma PBMC de- rivada de um paciente com imunotolerância a um órgão a ser trans- plantado induzida.
(B42) O método de (B40), que compreende a administração a um paciente com uma doença autoimune ou uma doença alérgica de uma PBMC derivada de um paciente com imunotolerância a um antí- geno, que é uma causa de uma doença autoimune ou uma doença alérgica induzida.
[00016] A presente invenção se destina a que uma ou mais das ca- racterísticas descritas acima possam ser proporcionadas não apenas como as combinações explicitamente descritas, porém também como outras combinações delas. As modalidades e as vantagens adicionais da presente invenção são reconhecidas por aqueles versados na téc- nica ao ler e entender descrição detalhada que se segue, conforme necessário.
Efeitos Vantajosos da Invenção
[00017] O anticorpo da presente invenção suprime a produção de
IFNy, ao mesmo tempo mantém a capacidade de induzir a imunotole- rância. Em particular, os anticorpos da subclasse IgG2 ou IgG4 da presente invenção podem fabricar uma célula com imunotolerância induzida, sem produzir o IFNy. Breve Descrição dos Desenhos
[00018] [Figura 1] A Figura 1 mostra os resultados de uma reação de linfócitos mistos (incorporação de 3H-timidina), na presença dos an- ticorpos anti-CD80 e anti-CD86 humanas (Ig9G1). Virgens; nenhum do- ador adicionado, nenhum anticorpo adicionado, Allo; doador adiciona- do, nenhum anticorpo adicionado. 10, 1 e 0,1 são concentrações (ug/ml) de cada anticorpo adicionado. O eixo vertical indica a incorpo- ração de 3H-timidina, com base em nenhum anticorpo adicionado (Allo).
[00019] [Figura 2] A Figura 2 mostra os resultados de uma reação de linfócitos mistos (produção de IFNy), na presença dos anticorpos anti-CD80 e anti-CD86 humanas (I9G1). O eixo vertical indica a con- centração em um meio (pg/ml).
[00020] [Figura 3] A Figura 3 mostra os resultados de uma reação de linfócitos mistos (incorporação de ?H-timidina), na presença dos an- ticorpos anti-CD80 e anti-CD86 humanas (I9G1). O eixo vertical indica a incorporação de %H-timidina, com base em nenhum anticorpo adicio- nado (Allo).
[00021] [Figura 4] A Figura 4 mostra os resultados de uma reação de linfócitos mistos (produção de IFNy), na presença dos anticorpos anti-CD80 e anti-CD86 humanas (Ig9G1). Fileira superior: com estimu- lação do doador, fileira inferior: sem estimulação do doador. * repre- senta 50000 pg/mL ou mais. O eixo vertical indica a concentração em um meio (pg/ml).
[00022] [Figura 5] A Figura 5 mostra os resultados de uma reação de linfócitos mistos (incorporação de ?H-timidina), na presença dos an-
ticorpos anti-CD80 e anti-CD86 (I9G2, IgG4). O eixo vertical indica a incorporação de ?3H-timidina, com base em nenhum anticorpo adicio- nado (Allo). 10, 3 e 1 são as concentrações de cada anticorpo adicio- nado (upg/ml).
[00023] [Figura 6] A Figura 6 mostra os resultados de uma reação de linfócitos mistos (produção de IFNy), na presença dos anticorpos anti-CD80 e anti-CD86 (I9G1, I9gG2, IgG4). O eixo vertical indica a concentração em um meio (pg/ml).
[00024] [Figura 7] A Figura 7 mostra os resultados de uma reação de linfócitos mistos (incorporação de *H-timidina) após a adição de uma célula obtida na presença dos anticorpos anti-CD80 e anti-CD86 (I9G1, IgG2, IgG4). O eixo vertical indica a incorporação de º*H- timidina, com base em nenhum anticorpo adicionado (Allo). 1/2, 1/4 e 1/8 são as razões de mistura de células obtidas na presença dos anti- corpos anti-CD80 e anti-CD86 (I9gG1, IgG2, IgG4) para células respon- dedoras virgens.
[00025] [Figura 8] A Figura 8 mostra os resultados de uma reação de linfócitos mistos (produção de IFNy), na presença de anticorpos an- ti-CD80 quiméricos e anticorpos anti-CD86 quiméricos. O eixo vertical indica a concentração em um meio (pg/ml).
[00026] [Figura 9] A Figura 9 mostra os resultados de uma reação de linfócitos mistos (incorporação de *H-timidina) após a adição de uma célula obtida na presença dos anticorpos anti-CD80 quiméricos e anti-CD86 quiméricos. O eixo vertical indica a incorporação de 3H- timidina, com base em nenhum anticorpo adicionado (Allo). 1/2, 1/4, 1/8 e 1/16 são razões de mistura de células obtidas na presença dos anticorpos anti-CD80 quiméricos e anti-CD86 quiméricos para células respondedoras virgens. Descrição das Modalidades
[00027] Os termos utilizados neste documento devem ser entendi-
dos como sendo utilizados no significado que é comumente utilizado na técnica, a menos que especificamente indicado de outra forma. Portanto, salvo definição em contrário, todas as terminologias e termos técnicos científicos que são utilizados neste documento têm o mesmo significado que o entendimento geral daqueles versados na técnica à qual diz respeito a presente invenção. Em caso de uma contradição, o presente relatório descritivo (incluindo as definições) tem prioridade. Definições dos termos
[00028] Como utilizado neste documento, "cerca de" refere-se a uma faixa de + 10% do valor numérico subsequente.
[00029] Como utilizado neste documento, a "imunotolerância" refe- re-se a um estado onde uma resposta imune específica a um antígeno específico não é exibida ou uma resposta imune específica é suprimi- da. A imunotolerância também pode se referir a qualquer um ou am- bos de um estado onde uma célula imune (especialmente a célula T) não exibe uma resposta imune específica a um antígeno específico ou uma resposta imune específica é suprimida, e um estado onde um ser humano não exibe uma resposta imune específica a um antígeno es- pecífico ou uma resposta imune específica é suprimida. A imunotole- rância tem chamado a atenção porque a provocação da imunotolerân- cia torna possível tratar a rejeição imunológica ou tratar as alergias. Como utilizado neste documento, a "anergia" refere-se a um estado onde a coestimulação não é introduzida quando um antígeno for apre- sentado a partir de uma célula apresentadora de antígeno, de modo que uma célula não pode responder, quando estimulada sob a condi- ção, com a coestimulação na próxima vez. Como utilizado neste do- cumento, a "PBMC (ou célula T) com imunotolerância induzida" é si- nônimo de "PBMC (ou célula T) anérgica".
[00030] Como utilizado neste documento, o "paciente" inclui os animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e ca-
valos), os primatas (por exemplo, seres humanos e primatas não hu- manos, como os macacos), os coelhos e os roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em uma modalidade específica, o paciente é um ser humano.
[00031] “Como utilizado neste documento, a "imunoestimulação" re- fere-se à estimulação aplicada às células no sistema imunológico (por exemplo, macrófago, neutrófilo, célula exterminadora natural (NK), cé- lula T, célula B etc.) ou à proliferação de células no sistema imunológi- co. A produção de citocinas (por exemplo, o INF) ou a atividade citotó- xica é induzida por estimulação das células no sistema imunológico.
[00032] Como utilizado neste documento, "não induzem substanci- almente a produção de uma citocina por imunoestimulação" refere-se a induzir a produção de citocinas de cerca de 20% ou menos da quan- tidade de citocinas produzidas pelas células (por exemplo, macrófago, neutrófilo, célula exterminadora natural (NK), célula T, célula B etc.) derivadas de um paciente, na presença de um antígeno e na ausência do anticorpo da presente invenção.
[00033] Como utilizado neste documento, o "anticorpo" refere-se amplamente a uma molécula ou um grupo desta que pode se ligar es- pecificamente a um epítopo específico sobre um antígeno. Como utili- zado neste documento, o "anticorpo" pode ser amplamente um anti- corpo de tamanho natural (isto é, um anticorpo com uma parte Fc) ou um anticorpo não tendo uma parte Fc. Um anticorpo não tendo uma parte Fc só precisa ser capaz de se ligar a um antígeno de interesse. Os exemplos de tal anticorpo incluem, porém não estão limitados aos, anticorpos Fab, anticorpos F(ab')2, anticorpos Fab', anticorpos Fv e anticorpos scFv e similares. Os anticorpos também incluem os anticor- pos modificados e não modificados. Para os anticorpos modificados, um anticorpo pode ser ligado a várias moléculas, como o polietileno glicol. Um anticorpo modificado pode ser obtido aplicando uma modifi-
cação química a um anticorpo, usando um método conhecido.
[00034] Como utilizado neste documento, o "anticorpo" se refere restritamente à imunoglobulina ou a um grupo desta, que pode se ligar especificamente a um epítopo específico sobre um antígeno. Uma forma variante deste é referida como uma "variante de um anticorpo". Como utilizado neste documento, o "anticorpo" pode ser restritamente um anticorpo de tamanho natural (isto é, um anticorpo com uma parte Fc). Uma "variante de um anticorpo" aqui pode ser uma variante não tendo uma parte Fc de um anticorpo descrito acima. Portanto, como utilizado neste documento, um anticorpo também pode ser restrita- mente referido como um anticorpo de tamanho natural, e uma variante de um anticorpo também pode ser referida como uma variante de um anticorpo de tamanho natural. Uma variante não tendo uma parte Fc só precisa ser capaz de se ligar a um antígeno de interesse. Os exem- plos de tal variante incluem, porém não estão limitados aos, anticorpos Fab, anticorpos F(ab')2, anticorpos Fab', anticorpos Fv e anticorpos scFv e similares. As variantes de um anticorpo também incluem os an- ticorpos modificados e os anticorpos não modificados. Para os anticor- pos modificados, um anticorpo pode ser ligado a várias moléculas, como o polietileno glicol. Um anticorpo modificado pode ser obtido aplicando uma modificação química a um anticorpo, usando um méto- do conhecido.
[00035] Em uma modalidade da presente invenção, o "anticorpo po- liclonal" pode ser gerado, por exemplo, pela administração de um imunógeno compreendendo um antígeno de interesse a um mamífero (por exemplo, rato, camundongo, coelho, vaca, macaco ou similares), ave ou similar, para induzir a produção de um anticorpo policlonal es- pecífico para um antígeno. Um imunógeno pode ser administrado atra- vés de um ou mais agentes imunológicos e infusão de um adjuvante, quando desejado. Um adjuvante pode ser usado para aumentar as respostas imunes e pode incluir o adjuvante de Freund (completo ou incompleto), o gel mineral (hidróxido de alumínio ou similar), o tensoa- tivo (lisolecitina ou similar) ou similares. O protocolo de imunização é conhecido na técnica e pode ser realizado por qualquer método que induza uma resposta imune de acordo com o organismo hospedeiro selecionado ("Tanpakushitsu Jikken Handobukku Manual de experi- mentos com proteínas, Yodosha (2003): 86-91").
[00036] Em uma modalidade da presente invenção, o "anticorpo monoclonal" inclui os anticorpos individuais que constituem uma popu- lação, que são anticorpos idênticos que correspondem substancial- mente a um único epítopo, exceto para os anticorpos tendo uma muta- ção que pode ocorrer naturalmente, em pequenas quantidades. Além disso, os anticorpos individuais que constituem uma população podem ser anticorpos que são substancialmente os mesmos, exceto para os anticorpos tendo uma mutação que pode ocorrer naturalmente, em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente es- pecíficos, os quais são diferentes dos anticorpos policlonais comuns que tipicamente incluem anticorpos diferentes que correspondem a diferentes epítopos e/ou anticorpos diferentes que correspondem ao mesmo epítopo. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclo- nais são úteis, visto que eles podem ser sintetizados a partir de uma cultura de hibridoma que não esteja contaminada com outras imuno- globulinas. A descrição "monoclonal" pode indicar uma característica de ser obtido de uma população de anticorpos substancialmente ho- mogênea. No entanto, tal descrição não significa que os anticorpos devam ser produzidos por um método específico. Por exemplo, os an- ticorpos monoclonais podem ser preparados por um método similar ao método do hibridoma descrito em "Kohler G, Milstein C., Nature. 1975 Aug 7; 256 (5517): 495-497". De forma alternativa, os anticorpos mo- noclonais podem ser preparados por um método similar ao método recombinante descrito na Patente US No. 4816567. Os anticorpos mo- noclonais também podem ser isolados de uma biblioteca de anticorpos em fagos, usando um método similar à tecnologia que é descrita em "Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15; 352 (6336): 624-628. " ou "Marks et al., J Mol Biol. 1991 Dec 5; 222(3): 581-597". Os anticorpos monoclonais também podem ser preparados pelo método descrito no "Tanpakushitsu Jikken Handobukku [Manual de experimentos com pro- teínas], Yodosha (2003): 92-96".
[00037] Em uma modalidade da presente invenção, o "anticorpo quimérico" é, por exemplo, uma região variável de um anticorpo ligada a uma região constante de um anticorpo entre organismos xenogêni- cos e pode ser construído por uma tecnologia de engenharia genética. Um anticorpo quimérico de camundongo-ser humano pode ser prepa- rado, por exemplo, pelo método descrito em "Roguska et al., Proc Nat! Acad Sci USA. 1994 Feb 1; 91(3): 969-973". Por exemplo, o método básico de preparação de um anticorpo quimérico de camundongo-ser humano liga uma sequência líder de camundongo e uma sequência da região variável em um cDNA clonado com uma sequência que codifica uma região constante do anticorpo humano, já presente em um vetor de expressão de uma célula de mamífero. Depois de ligar a sequência líder de camundongo e a sequência da região variável em um cDNA clonado com a sequência que codifica uma região constante do anti- corpo humano, a sequência resultante pode ser ligada a um vetor de expressão de uma célula de mamífero. Um fragmento de uma região constante do anticorpo humano pode ser de qualquer região constante da cadeia H do anticorpo humano e região constante da cadeia L do anticorpo humano. Os exemplos de fragmento da cadeia H humana incluem Cy1, Cy2, Cy3 ou Cy4, e exemplos de fragmento da cadeia L incluem CA ou CK.
[00038] Em uma modalidade da invenção, o "anticorpo humaniza-
do" é, por exemplo, um anticorpo, o qual tem uma ou mais CDRs deri- vadas de uma espécie não humana, uma região de estrutura (FR) de- rivada de uma imunoglobulina humana e uma região constante deriva- da da imunoglobulina humano e se liga a um antígeno desejado. Os anticorpos podem ser humanizados usando várias abordagens conhe- cidas na técnica (Almagro et al., Front Biosci. 2008 Jan 1; 13: 1619- 1633). Os exemplos destas incluem o Enxerto da CDR (Ozaki et al., Blood. 1999 Jun 1; 93(11): 3922-3930), a Remodelagem da Superfície (Roguska et a/., Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Feb 1; 91(3): 969- 973), o Embaralhamento da FR (Damschroder et al., Mol Immunol. 2007 Apr; 44(11): 3049-3060. Epub 2007 Jan 22) e similares. Um resí- duo de aminoácido de uma região FR humana pode ser substituído por um resíduo correspondente de um anticorpo doador de CDR, para alterar (de preferência, para melhorar) a ligação ao antígeno. A substi- tuição da FR pode ser realizada por um método que seja bem conhe- cido na técnica (Riechmann et a/., Nature. 1988 Mar 24; 332 (6162): 323-327). Por exemplo, um resíduo de uma FR que seja importante para a ligação ao antígeno pode ser identificado modelando uma inte- ração entre uma CDR e o resíduo de uma FR. Além disso, um resíduo anormal de uma FR, em uma posição específica, pode ser identificado por comparação da sequência.
[00039] Em uma modalidade da invenção, o "anticorpo humano" é, por exemplo, um anticorpo no qual uma região que compreende uma região variável e uma região constante de uma cadeia pesada e uma região variável e uma região constante de uma cadeia leve, que cons- tituem o anticorpo, é derivada de um gene que codifica uma imunoglo- bulina humana. Os exemplos dos principais métodos de preparação incluem um método que utiliza um camundongo transgênico para a preparação de anticorpos humanos, um método de exibição em fago e similares. Um método que utiliza um camundongo transgênico para a preparação de anticorpos humanos produz anticorpos humanos com diversas capacidades de ligação ao antígeno, em vez de anticorpos de camundongo, se um gene de lg humana funcional for introduzido em um camundongo nocaute de lg endógena. Além disso, este camun- dongo pode ser imunizado para obter anticorpos monoclonais huma- nos por um método de hibridoma convencional. Isto pode ser prepara- do, por exemplo, pelo método descrito em "Lonberg et al., Int Rev Immunol. 1995; 13(1): 65-93". O método de exibição em fago é um sis- tema que tipicamente expressa um gene exógeno como uma proteína de fusão, de modo tal que a infeciosidade do fago não seja perdida sobre o lado da extremidade de N de uma proteína de revestimento (93p, g10p ou similares) de fago fibroso, como um vírus de E. coli M13 ou T7. Os anticorpos podem ser preparados, por exemplo, pelo méto- do descrito em "Vaughan et a/., Nat Biotechnol. 1996 Mar; 14(3): 309- 314".
[00040] “Como utilizado neste documento, a "sequência variante" re- fere-se a uma sequência com pelo menos uma alteração (substituição, adição ou remoção) do resíduo de aminoácido na sequência original para uma sequência de aminoácidos e refere-se a uma alteração (substituição, adição ou remoção) de pelo menos uma base que não resultaria em uma mudança de quadro para uma sequência de ácidos nucleicos. Uma sequência variante tem uma função similar à sequên- cia original, que é, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência origi- nal. Se a sequência original for um anticorpo, uma sequência variante preferivelmente não tem uma alteração dentro de uma CDR, porém pode ter uma ou mais alterações, preferivelmente 3 ou menos altera- ções, mais preferivelmente 2 ou menos alterações e mais preferivel- mente uma alteração, desde que a capacidade de ligação ou a função do anticorpo original seja mantida. Quando uma alteração for introdu- zida dentro de uma CDR, aqueles versados na técnica podem selecio- nar uma alteração apropriada, de modo que a capacidade de ligação ou a função do anticorpo original seja mantida.
[00041] “Como utilizado neste documento, a "célula derivada de um paciente" refere-se a uma célula obtida de um paciente administrado com a composição da presente invenção ou uma célula derivada de uma célula obtida do paciente. Como utilizado neste documento, o "an- tígeno derivado de um paciente" refere-se a um antígeno produzido pelo próprio paciente que induz uma resposta imune, como um antíge- no produzido pelo próprio paciente que causa uma doença autoimune em um paciente com a doença autoimune. Como utilizado neste do- cumento, o "antígeno que não é derivado de um paciente" refere-se a um antígeno exógeno que pode induzir uma resposta imune. Como utilizado neste documento, o "material que contém antígeno que não é derivado de um paciente" refere-se a qualquer substância ou conjunto de substâncias que compreende um antígeno que não é derivado de um paciente. Os seus exemplos incluem uma célula, uma população de células, um tecido e similar que expressa um antígeno que não é derivado de um paciente.
[00042] — Como utilizado neste documento, a "rejeição de enxerto" re- fere-se ao sistema imunológico de um paciente que ataca, danifica ou destrói um órgão, tecido ou célula transplantada em um paciente rece- bendo o transplante do órgão, tecido ou célula.
[00043] “Conforme usado neste documento, a "alergia" refere-se a uma resposta imune hiperativa a um antígeno que não é derivado de um paciente. Um antígeno que não é derivado de um paciente, que induz uma alergia, também é referido como um alérgeno. Os seus exemplos incluem, porém não estão limitados ao, antígeno de carrapa- to, antígeno de clara de ovo, antígeno de leite, antígeno de trigo, antí-
geno de amendoim, antígeno de soja, antígeno de trigo-sarraceno, an- tígeno de gergelim, antígeno de arroz, antígeno de crustáceo, antígeno de kiwi, antígeno de maçã, antígeno de banana, antígeno de pêssego, antígeno de tomate, antígeno de atum, antígeno de salmão, antígeno de cavala, antígeno de carne de boi, antígeno de carne de frango, an- tígeno de carne de porco, antígeno de caspa felina, antígeno de inse- to, antígeno de pólen, antígeno de caspa de cachorro, antígeno fúngi- co, antígeno bacteriano, látex, hapteno, metal e similar.
[00044] “Como utilizado neste documento, a "doença autoimune" re- fere-se a qualquer doença na qual o sistema imunológico exerce uma resposta imune indesejável sobre sua própria célula, tecido ou órgão. Os exemplos de uma doença autoimune incluem, porém não estão limitados à, artrite reumatoide, esclerose múltipla, diabetes tipo 1, do- ença inflamatória intestinal (por exemplo, doença de Crohn ou colite ulcerativa), lúpus eritematoso sistêmico, psoríase, esclerodermia, do- ença autoimune da tireoide, alopecia areata, doença de Graves, sín- drome de Guillain Barre, doença celíaca, síndrome de Sjogren, febre reumática, gastrite, gastrite atrófica autoimune, hepatite autoimune, pancreatite, ovite, orquite, uveite, uveiíte induzida pelo cristalino, mias- tenia gravis, mixedema primário, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoimune, doença de Addison, esclerodermia, síndrome de Goodpas- ture, nefrite (por exemplo, glomerulonetfrite), psoríase, pênfigo vulgar, penfigoide, oftalmia simpática, púrpura trombocitopênica idiopática, leucopenia idiopática, granulomas de Wegener e polimiosite/dermato- miosite.
[00045] — Como utilizado neste documento, "enxerto contra hospedei- ro" refere-se a um órgão, tecido ou célula transplantada que ataca, da- nifica ou destrói uma célula, tecido ou órgão de um paciente que rece- beu o transplante, devido a uma resposta imune.
[00046] “Como utilizado neste documento, a "rejeição imunológica causada pelo transplante de uma célula iPS ou célula ES, ou uma cé- lula, tecido ou órgão derivado das referidas células" refere-se a uma rejeição imunológica resultante de um antígeno de uma célula iPS ou célula ES, ou um antígeno de uma célula, tecido ou órgão derivado de uma célula iPS ou célula ES. Modalidades Preferidas
[00047] As modalidades preferidas são descritas a seguir. Entende- se que as modalidades são exemplificações da presente invenção, de modo que o escopo da presente invenção não esteja limitado a tais modalidades preferidas. Entende-se que aqueles versados na técnica podem se referir às modalidades preferidas a seguir para prontamente fazerem modificações ou alterações dentro do escopo da presente in- venção. Quaisquer dessas modalidades podem ser combinadas apro- priadamente por aqueles versados na técnica.
[00048] “Como resultado da tentativa de induzir uma resposta não imune (anergia), usando um anticorpo tendo uma região Fc humana que inibe a interação entre CD80 e/ou CD86 e CD28, os inventores descobriram que isso ativa uma célula envolvida no sistema imunoló- gico, como o macrófago, o neutrófilo ou a célula exterminadora natural (NK), e induz a liberação de um fator humoral, como a interleucina ou o interferon (IFN), responsável pelas respostas imunes. Os inventores descobriram recentemente que a indução da resposta não imune (ane- rgia), usando um anticorpo tendo uma região Fc humana, tem um pro- blema de atenuação do efeito da imunotolerância, porque a liberação desses fatores humorais induz a ativação não preferível do sistema imunológico, que é o oposto da imunotolerância, e descobriram que o efeito da imunotolerância pode ser melhorado ao ajustar a região Fc humana.
[00049] “Especificamente, um anticorpo quimérico que inibe a inte- ração entre CD80 e/ou CD86 e CD28 e induz a imunotolerância foi preparado imunizando os camundongos Balb/c com uma proteína de fusão de CD80/CD86-Fc recombinante/humana, então extraindo o MRNA do baço dos camundongos, sintetizando um cDNA, selecionan- do um anticorpo Fab com alta afinidade para CD80/CD86 identificado com uma biblioteca de exibição em fago, que foi construída usando um gene amplificado por RT-PCR e, em seguida, proporcionando uma re- gião Fc humana por engenharia genética.
[00050] Para minimizar a rejeição a um anticorpo usado para a in- dução da imunotolerância, os inventores humanizaram um anticorpo quimérico com o método de enxerto da CDR desenvolvido por Xoma, para preparar um anticorpo humanizado (subclasse; I9G1). O anticor- po anti-CD80 e o anticorpo anti-CD86 humanizados resultantes (sub- classe; I9G1) foram adicionados a uma reação de linfócitos mistos com as PBMCs (células mononucleares de sangue periférico) coleta- das de dois voluntários, assumindo um doador ou um receptor, para avaliar a função de supressão após a mesma estimulação com antíge- no das células induzidas. Especificamente, as PBMCs foram coletadas de um voluntário, irradiadas com radiação de 30 Gy e cocultivadas, por 7 dias, com as PBMCs coletadas do outro voluntário, na presença de um anticorpo anti-CD80/CD86 humanizado, para induzir uma célula anérgica específica para o antígeno do doador. As células induzidas foram adicionadas, em uma certa proporção, aos linfócitos mistos de receptor e doador idênticos, e a capacidade de suprimir a divisão e a proliferação das células com a estimulação com antígeno foi medida como a quantidade de incorporação de timidina marcada com trítio. Foi confirmado, como resultado, que os anticorpos anti-CD80 e os anticor- pos anti-CD86 humanizados suprimem significativamente a quantidade de incorporação de timidina e as células induzidas por tais anticorpos adquiriram recentemente uma função de supressão.
[00051] No entanto, quando foi medida a quantidade de IFNy no sobrenadante, após 7 dias de cultura, o IFNy foi produzido após a adi- ção de um anticorpo, mesmo sem uma estimulação que não com antí- geno. Também foi revelado que o IFNy, em geral produzido após esti- mulação com aloantígeno devido à adição das PBMCs irradiadas com radiação, está no sobrenadante quase na mesma quantidade após a adição de um anticorpo.
[00052] A este respeito, os inventores descobriram que pode ser obtida uma célula que induz a imunotolerância, sem produzir o IFNy, utilizando os anticorpos anti-CD80/CD86 humanizados da subclasse IgG2 ou IgG4, como resultado de um estudo diligente para obter um anticorpo que não induzisse a produção do IFNy, ao mesmo tempo mantendo a capacidade de induzir a imunotolerância. Anticorpos
[00053] Em uma modalidade da presente invenção, a presente in- venção proporciona um anticorpo que inibe uma interação entre CD80 e/ou CD86, expressa sobre uma superfície de uma célula, e CD28, expressa sobre uma superfície de outra célula, em que o anticorpo não induz substancialmente a produção de uma citocina por imunoestimu- lação. O anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo anti- CDB80 e/ou anticorpo anti-CD86, um anticorpo biespecífico para CD80 e CD86, um anticorpo anti-CD28 ou uma mistura deles. Em algumas modalidades, uma parte Fc do anticorpo pode ser uma parte que não induz substancialmente a produção de uma citocina por imunoestimu- lação. Em uma modalidade específica, uma subclasse do anticorpo da presente invenção é a IgG2 ou a IgG4. O anticorpo da presente inven- ção cuja subclasse é a IgG2 ou a IgG4 surpreendentemente não indu- ziu qualquer produção de citocina devido a uma célula do sistema imunológico. Uma vez que o anticorpo usado na presente invenção pode resultar em um efeito indesejável pela ativação de um receptor, é preferível um anticorpo antagonístico.
[00054] Em algumas modalidades, um anticorpo que não induz substancialmente a produção de uma citocina por imunoestimulação pode induzir a produção de citocinas de cerca de 20% ou menos, de preferência cerca de 10% ou menos, mais preferivelmente cerca de 5% ou menos, e mais preferivelmente ainda cerca de 0% da quantida- de de citocinas produzidas por uma célula derivada de um paciente (por exemplo, macrófago, neutrófilo, célula exterminadora natural (NK), célula T, célula B ou similares) na ausência do anticorpo da presente invenção.
[00055] “Como utilizado neste documento, "(anticorpo) antagonísti- co" é sinônimo de um (anticorpo) antagonista, (anticorpo) de inibição, (anticorpo) bloqueador ou similares, o qual (é um anticorpo para anti- corpos) tem a função de inibir a função direcionada ou a função de si- nalização, para atenuar ou inativar a ação de um organismo vivo.
[00056] “Uma indução da produção de citocinas foi inesperadamente suprimida ao alterar a subclasse de um anticorpo de IgG1 para I9gG2 ou IgG4, conforme descrito acima. Embora não desejando estar ligado por qualquer teoria, entende-se que a indução da produção de citoci- nas seja devida a uma parte Fc de um anticorpo I9gG1, porque a fun- ção mediada pela parte Fc varia entre as subclasses de IgG. Assim, em outra modalidade, o anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo não tendo uma parte Fc. Os exemplos de tal anticorpo inclu- em, porém não estão limitados a, um anticorpo Fab, um anticorpo F(ab')2, um anticorpo Fab', um anticorpo Fv, um anticorpo scFv e simi- lares.
[00057] Em algumas modalidades, a célula que expressa CD80 e/ou CD86 pode ser uma célula apresentadora de antígeno e a outra célula que expressa CD28 pode ser uma célula T.
[00058] Em outro aspecto da presente invenção, o anticorpo da presente invenção pode inibir uma interação entre CD80 e/ou CD86,
expressa sobre uma superfície celular, e CD28, expressa sobre outra superfície celular. Pode ser determinado se uma interação entre CD80 e/ou CD86, expressa sobre uma superfície celular, e CD28, expressa sobre outra superfície celular, pode ser inibida, por exemplo, através de coimunoprecipitação. Especificamente, essas proteínas são ligadas e então imunoprecipitadas usando um anticorpo que se liga a uma das proteínas (isca), e a outra proteína imunoprecipitada (presa) é medida. Se a presa contida na imunoprecipitação for diminuída quando um an- ticorpo candidato for adicionado, em comparação com um controle sem um anticorpo candidato, o anticorpo candidato é determinado co- mo inibindo a ligação entre as proteínas. Uma presa contida em uma imunoprecipitação pode ser medida marcando a presa ou similar, con- forme necessário. A quantidade de presa ligada a um transportador pode ser comparada ligando uma das proteínas (isca) ao transporta- dor, utilizando o método de ensaio "pull-down", e contatando a outra proteína (presa) na presença/ausência de um anticorpo candidato.
[00059] De preferência, o anticorpo da presente invenção pode ini- bir uma interação entre CD80 e/ou CD86, expressa sobre uma super- fície da célula apresentadora de antígeno, e CD28, expressa sobre uma superfície da célula T. Pode ser determinado se um anticorpo candidato inibe uma interação entre CD80 e/ou CD86, expressa sobre uma superfície da célula apresentadora de antígeno, e CD28, expres- sa sobre uma superfície da célula T, por contato da célula apresenta- dora de antígeno que expressa CD80 e/ou CD86 com uma célula T que expressa CD28, na presença de um anticorpo candidato, e deter- minação que uma interação entre CD80 e/ou CD86, expressa sobre uma superfície da célula apresentadora de antígeno, e CD28, expres- sa sobre uma superfície da célula T, é inibida se a célula T não for ati- vada.
[00060] Além disso, o anticorpo da presente invenção é caracteri-
zado por não promover a produção de citocinas pelas PBMCs huma- nas. Pode ser determinado se um anticorpo candidato não promove a produção de citocinas por uma PBMC humana por contato do anticor- po candidato com a PBMC humana, em um meio, e medição da quan- tidade de citocinas liberadas no meio. Um anticorpo candidato com menor/maior quantidade de citocinas liberadas na presença do anti- corpo candidato, em comparação com a quantidade de citocinas libe- radas por uma PBMC humana na ausência de um anticorpo é deter- minado como não promovendo/promovendo a produção de citocinas por uma PBMC humana. Os exemplos de citocinas incluem as inter- leucinas, como IL-16, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, I1L-14, IL-15, IL-17 e I1L-18; as quimiocinas, como CC, CXC, CX3C e C; os interferons, como IFNa, IFNB e IFNy; e os agentes citotóxicos, como TNFa. As ci- tocinas são preferivelmente as citocinas inflamatórias e mais preferi- velmente o IFNy. As citocinas podem ser medidas usando um Kit dis- ponível comercialmente. Por exemplo, o IFNy pode ser medido usando o Human IFNy ELISA MAXTM Deluxe da Biolegend.
[00061] De preferência, o anticorpo da presente invenção pode ser colocado em contato com uma PBMC, juntamente com um antígeno ou uma célula tendo um antígeno sobre uma superfície, para induzir a imunotolerância ao antígeno. Pode ser determinado se um anticorpo candidato pode induzir a imunotolerância a um antígeno colocando em contato o anticorpo com uma PBMC, juntamente com o antígeno ou uma célula tendo o antígeno sobre uma superfície, por contato do an- tígeno ou da célula tendo o antígeno sobre uma superfície com uma PBMC por vários dias a 7 dias, na presença do anticorpo candidato, em seguida, adição da *H-timidina e remoção da *H-timidina, em cultu- ra, 16 a 20 horas após a adição da %H-timidina e, em seguida, medição da quantidade de incorporação de %H-timidina pela PBMC. Se a quan- tidade de incorporação de ?H-timidina por uma PBMC for baixa quando for adicionado o anticorpo candidato, em comparação com um controle sem utilização do anticorpo candidato, o anticorpo pode ser determi- nado como capaz de induzir a imunotolerância ao anticorpo colocando em contato o anticorpo com a PBMC, juntamente com um antígeno ou uma célula tendo um antígeno sobre uma superfície.
[00062] “Como utilizado neste documento, a "imunotolerância" é uma condição em que uma resposta imune específica a um antígeno específico não é exibida ou uma resposta imune específica é suprimi- da. A imunotolerância pode significar qualquer um ou ambos de um estado onde uma célula imune (especialmente a célula T) não exibe uma resposta imune específica a um antígeno específico ou uma res- posta imune específica é suprimida, e um estado onde um ser humano não exibe uma resposta imune específica a um antígeno específico ou uma resposta imune específica é suprimida. Como utilizado neste do- cumento, a "anergia" refere-se a uma célula T que não pode mais res- ponder, mesmo quando estimulada sob a condição, com a coestimula- ção na próxima vez, devido a nenhuma introdução de coestimulação quando um antígeno for apresentado a partir de uma célula apresen- tadora de antígeno. Como utilizado neste documento, a "PBMC (ou célula T) com imunotolerância induzida" e a "PBMC (ou célula T) anér- gica" são sinônimos.
[00063] De preferência, a presente invenção se refere a um anticor- po anti-CD80 e um anticorpo anti-CD86. O anticorpo anti-CD80 e o anticorpo anti-CD86 aqui se ligam especificamente à CD80 e Cdê6, respectivamente. Como utilizado neste documento, a ligação "especiífi- ca" de um anticorpo refere-se à ligação do anticorpo em uma afinidade substancialmente maior a uma proteína de interesse (CD80 ou CD86) do que a afinidade por outras proteínas ou peptídeos. A este respeito, a "ligação em uma afinidade substancialmente maior" refere-se a uma afinidade maior até o ponto que uma proteína ou peptídeo específico de interesse possa ser detectado distintamente de outras proteínas ou peptídeos por um aparelho ou método de medição desejável. Por exemplo, a afinidade substancialmente maior pode significar cerca de 3 vezes ou mais, cerca de 4 vezes ou mais, cerca de 5 vezes ou mais, cerca de 6 vezes ou mais, cerca de 7 vezes ou mais, cerca de 8 vezes ou mais, cerca de 9 vezes ou mais, cerca de 10 vezes ou mais, cerca de 20 vezes ou mais, cerca de 30 vezes ou mais, cerca de 40 vezes ou mais, cerca de 50 vezes ou mais ou cerca de 100 vezes ou mais a intensidade (por exemplo, a intensidade de fluorescência) detectada por ELISA ou EIA.
[00064] Os exemplos da constante de taxa de associação (Ka1) na ligação do anticorpo da presente invenção com a CD80, a CD86 ou a CD28 incluem cerca de 1 x 10º Ms ou mais, cerca de 1 x 10º Ms ou mais e cerca de 5 x 105º Ms ou mais. Os exemplos da constante de taxa de dissociação (Kd1) na ligação do anticorpo da presente inven- ção com a CD80, a CD86 ou a CD28 incluem cerca de 1 x 10º Ms" ou menos e cerca de 1 x 10º Ms ou menos. Os exemplos da constante de associação (KD) na ligação do anticorpo da presente invenção com a CD80, a CD86 ou a CD28 incluem cerca de 1 x 10º (M) ou menos, cerca de 5 x 10º (M) ou menos, cerca de 1 x 10º (M) ou menos e cer- ca de 5 x 10º (M) ou menos. Para a constante de taxa de associação (Ka1), a constante de taxa de dissociação (Kd1) e a constante de as- sociação (KD) de um anticorpo aqui contido, pode ser usado o BIA- CORE (GE Healthcare Bio-Sciences KK, BIACORE-X100), de acordo com o manual fornecido pelo fabricante, para imobilizar a CD80, a CD86 ou a CD28 biotinilada ou uma célula que as expressa sobre um chip SA, então permitindo que um anticorpo a ser testado flua para medir a constante de taxa de associação Ka1 e a constante de taxa de dissociação Kd1 e usando o ajuste bivalente para medir a constante de associação KD.
[00065] O anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal, porém é preferivelmente um anticorpo monoclonal.
Na presente invenção, os "anticorpos monoclo- nais" são anticorpos com uma estrutura uniforme, que reagem com um único determinante antigênico.
Além disso, o anticorpo da presente invenção inclui um anticorpo tendo uma sequência de aminoácidos de um anticorpo de um animal não humano e uma sequência de aminoá- cidos de um anticorpo derivado de um ser humano e um anticorpo humano.
Os exemplos de anticorpos de um animal não humano inclu- em os anticorpos de um camundongo, rato, hamster, porquinho-da- índia, coelho, cachorro, macaco, ovelha, cabra, camelo, galinha, pato ou similares, de preferência os anticorpos de um animal com o qual um hibridoma pode ser preparado, e mais preferivelmente os anticor- pos de um camundongo, rato ou coelho.
Os exemplos de anticorpos com uma sequência de aminoácidos de um anticorpo de um animal não humano e uma sequência de aminoácidos de um anticorpo deri- vado de um ser humano incluem os anticorpos quiméricos do tipo hu- mano e os anticorpos humanizados.
O "anticorpo quimérico" descrito acima é um anticorpo derivado de animal não humano, alterado por engenharia genética, de modo que uma região constante de um anti- corpo que se liga especificamente a um antígeno de interesse (CD80, CDB86 ou CD28) seja a mesma região constante de um anticorpo hu- mano.
Um anticorpo quimérico é preferivelmente um anticorpo quimé- rico de ser humano camundongo (ver a Publicação do Pedido de Pa- tente EP No. 0125023). Um "anticorpo humanizado" é um anticorpo derivado de animal não humano, alterado por engenharia genética, de modo que a estrutura primária, que não as regiões determinantes de complementaridade (CDR) da cadeia H e da cadeia L, de um anticorpo que se liga especificamente à CD80, CD86 ou CD28 seja uma estrutu- ra primária que corresponda a um anticorpo humano.
A este respeito,
a CDR pode ser definida por um de Kabat et al. ("Sequences of Pro- teins of Immunological Interest", Kabat, E. et al., U.S. Department of Health and Human Services, 1983) ou Chothia et a/. (Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901-917). Um "anticorpo humano" é um anti- corpo humano que é uma produção por expressão gênica de anticor- pos totalmente derivados de seres humanos. Os seus exemplos inclu- em os anticorpos monoclonais preparados utilizando um animal trans- gênico, introduzido com um gene envolvido com a produção de anti- corpos de um humano (Publicação do Pedido de Patente EP No. 0546073), e similares. Quando, por exemplo, o anticorpo da presente invenção for usado no tratamento, na prevenção ou no diagnóstico usando o anticorpo por administração no corpo, o anticorpo da presen- te invenção é, de preferência, um anticorpo quimérico de ser huma- no/animal não humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano.
[00066] De preferência, a classe de imunoglobulina do anticorpo da presente invenção é a IgG. A subclasse do anticorpo da presente in- venção é preferivelmente a IgG2 ou a IgG4. Mais preferivelmente, a subclasse do anticorpo da presente invenção é a IgG4. Alternativa- mente, a subclasse do anticorpo da presente invenção é preferivel- mente a IgG2. O anticorpo da presente invenção pode ser um mono- específico, biespecífico (anticorpo biespecífico), triespecífico (anticorpo triespecífico) (por exemplo, WO 1991/003493), tetraespecífico (anti- corpo tetraespecífico) ou maior, multiespecífico (específico para múlti- plos antígenos).
[00067] Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção tem a CDRH3 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 33. De preferência, o anticorpo da presente inven- ção tem a CDRH1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 25, a CDRH2 da sequência de aminoácidos apresentada na
SEQ ID NO: 26 e a CDRH3 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 27, ou a CDRH1 da sequência de aminoácidos apre- sentada na SEQ ID NO: 31, a CDRH2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 32 e a CDRH3 da sequência de aminoá- cidos apresentada na SEQ ID NO: 33. Mais preferivelmente, o anticor- po da presente invenção tem a CDRH1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 25, a CDRH2 da sequência de aminoáci- dos apresentada na SEQ ID NO: 26 e a CDRH3 da sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 27, e a CDRL1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 28, a CDRL2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 29 e a CDRL3 da se- quência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 30, ou a CDRH1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 31, a CDRH?2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 32 e a CDRH3 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 33, e a CDRL1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 34, a CDRL2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 35 e a CDRL3 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 36.
[00068] Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção po- de ser um anticorpo, ou uma variante dele, tendo uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 38 ou 42 ou uma sequência variante dela, e uma cadeia leve com a sequên- cia de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 40 ou 44 ou uma se- quência variante dela. De preferência, o anticorpo da presente inven- ção pode ser um anticorpo, ou uma variante dele, compreendendo (a) uma VH compreendendo a CDRH1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 53 ou uma sequência variante dela, a CDRH?2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 54 ou uma sequência variante dela e a CDRH3 da sequência de aminoá-
cidos apresentada na SEQ ID NO: 55 ou uma sequência variante dela, e uma VL compreendendo a CDRL1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 56 ou uma sequência variante dela, a CDRL?2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 57 ou uma sequência variante dela e a CDRL3 da sequência de aminoá- cidos apresentada na SEQ ID NO: 58 ou uma sequência variante dela, ou (b) uma VH compreendendo a CDRH1 da sequência de aminoáci- dos apresentada na SEQ ID NO: 59 ou uma sequência variante dela, a CDRH?2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 60 ou uma sequência variante dela e a CDRH3 da sequência de aminoá- cidos apresentada na SEQ ID NO: 61 ou uma sequência variante dela, e uma VL compreendendo a CDRL1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 62 ou uma sequência variante dela, a CDRL?2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 63 ou uma sequência variante dela e CDRL3 da sequência de aminoáci- dos apresentada na SEQ ID NO: 64 ou uma sequência variante dela.
Em uma modalidade específica, o anticorpo pode ser um anticorpo, ou uma variante dele, compreendendo (a) uma VH tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 46 ou uma sequência vari- ante dela e uma VL tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 48 ou uma sequência variante dela, ou (b) uma VH tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 50 ou uma sequência variante dela e uma VL tendo a sequência de aminoá- cidos apresentada na SEQ ID NO: 52 ou uma sequência variante dela.
Uma sequência variante de preferência não compreende uma altera- ção dentro das CDRs (substituição, adição ou remoção de aminoáci- dos), porém pode compreender várias alterações (3 ou menos, 2 ou menos, de preferência 1 ou menos) dentro de cada CDR, desde que a capacidade de se ligar e/ou a função de um anticorpo antes da altera- ção seja mantida.
De preferência, uma sequência variante pode ter pelo menos 90% de identidade com a sequência original.
[00069] “Em outro aspecto, o anticorpo da presente invenção se re- fere a um anticorpo tendo uma VH com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 22. De preferência, o anticorpo da presente invenção tem uma VH com o sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 18 e uma VL com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 20, ou uma VH com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 22 e uma VL com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 24.
[00070] Além disso, a presente invenção se refere a um anticorpo tendo uma VH com uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácidos nucleicos que hibridiza, sob uma condição severa, com uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 22. De preferência, a presente invenção se refere a um anticorpo tendo uma VH com uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácidos nucleicos que hibridiza, sob uma condição severa, com uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 18, e uma VL com uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácidos nucleicos que hibridiza, sob uma condição severa, com uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, ou um anti- corpo tendo uma VH com um sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácidos nucleicos que hibridiza, sob uma condi- ção severa, com uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e uma VL com uma se- quência de aminoácidos codificada por um sequência de ácidos nu- cleicos que hibridiza, sob uma condição severa, com uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. Como utilizado neste documento, hibridizar sob uma condi-
ção severa significa hibridizar sob uma condição de hibridação que é, em geral, usada pelos versados na técnica. Pode ser determinado se uma sequência hibridiza pelo método descrito, por exemplo, em Mole- cular Cloning, a Laboratory Manual, Quarta Edição, Cold Spring Har- bor Laboratory Press (2012), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Online Library ou similares. Por exemplo, uma condição de hi- bridização pode ser uma condição para hibridizar a 42ºC em 6 x SSC (0,9 M de NaCl, 0,09 M de citrato de trissódio) ou 6 x SSPE (3 M de NaCl, 0,2 M de NaH2PO4, 20 mM de EDTA-2Na, pH 7,4) e depois la- var a 42ºC em 0,5 x SSC.
[00071] A presente invenção também compreende um anticorpo tendo uma VH com uma sequência de aminoácidos com 80% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 22. De preferência, o anticorpo da presente invenção tem uma VH com uma sequência de aminoácidos com 80% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma VL com uma sequência de aminoácidos com 80% ou mais de identi- dade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, ou uma VH com 80% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma VL com uma sequência de aminoácidos com 80% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. A identidade das sequências de aminoácidos refere-se a uma razão (%) das quantidades de aminoácidos do mesmo tipo entre dois tipos de proteínas na extensão da sequência de aminoácidos di- recionada para comparação e pode ser determinada usando um pro- grama conhecido, como BLAST ou FASTA. A identidade descrita aci- ma pode ser uma identidade que é maior do que 80% ou mais, como uma identidade de 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, 98% ou mais, ou 99% ou mais.
[00072] Um anticorpo tendo a VH descrita acima, com uma sequên-
cia de aminoácidos codificada por uma sequência de ácidos nucleicos que hibridiza sob uma condição severa, ou um anticorpo tendo uma sequência de aminoácidos com 80% ou mais de identidade preferivel- mente tem a sequência da CDR descrita acima.
[00073] Como um exemplo mais específico, a presente invenção compreende um anticorpo tendo uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos apresentada em uma SEQ ID NO. selecionada a partir de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 14. De preferência, o anticorpo da presente invenção tem uma cadeia pe- sada com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4, uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10 e uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12, ou uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16.
[00074] Em uma modalidade preferida, um anticorpo pode compre- ender (a) uma VH compreendendo a CDRH1 da sequência de amino- ácidos apresentada na SEQ ID NO: 25, a CDRH2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26 e a CDRH3 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 27, e uma VL compreen- dendo a CDRL1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 28, a CDRL2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 29 e a CDRL3 apresentada na SEQ ID NO: 30, ou (b) uma VH compreendendo a CDRH1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 31, a CDRH2 da sequência de aminoácidos apresen- tada na SEQ ID NO: 32 e a CDRH3 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 33, e uma VL compreendendo a CDRL1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 34, a CDRL?2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 35 e a CDRL3 apresentada na SEQ ID NO: 36. Em outra modalidade pre- ferida, um anticorpo pode compreender (a) uma VH tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18 ou uma sequência variante dela e uma VL tendo a sequência de aminoácidos apresenta- da na SEQ ID NO: 20 ou uma sequência variante dela, ou (b) uma VH tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 22 ou uma sequência variante dela e uma VL tendo a sequência de aminoá- cidos apresentada na SEQ ID NO: 24 ou uma sequência variante dela. Uma sequência variante de preferência não compreende uma altera- ção (substituição, adição ou remoção de aminoácido) dentro de uma CDR, porém pode compreender uma alteração de várias alterações (3 ou menos, 2 ou menos, de preferência 1 ou menos) dentro de cada CDR, desde que a capacidade de se ligar e/ou a função de um anti- corpo antes da alteração seja mantida. De preferência, uma sequência variante pode ter pelo menos 90% de identidade com a sequência ori- ginal.
[00075] O anticorpo da presente invenção pode ser preparado imu- nizando um animal não humano com uma resposta imune, de prefe- rência um animal não humano (por exemplo, o camundongo MRL/Ipr) com uma resposta imune (autoanticorpo) a si mesmo, devida à hiperi- munização, com uma proteína CD80, CD86 ou CD28 ou um domínio extracelular dela, ou uma célula que expressa CD80, CD86 ou CD28 como um imunógeno, juntamente com um imunoestimulante (por exemplo, óleo mineral ou precipitado de alumínio e bactérias mortas aquecidas ou lipopolissacarídeo, adjuvante completo de Freund, adju- vante incompleto de Freund ou similares), conforme necessário. Um animal imunizado não está particularmente limitado, desde que ele se-
ja um animal para o qual possa ser preparado um hibridoma, como um camundongo, rato, hamster, porquinho-da-índia, coelho, cachorro, ma- caco, ovelha, cabra, galinha ou pato, porém é preferivelmente um ca- mundongo ou um rato, mais preferivelmente um camundongo, e mais preferivelmente ainda um camundongo MRL/Ipr. Um imunógeno pode ser administrado a um animal por injeção subcutânea, injeção intrape- ritoneal, injeção intravenosa, injeção intradérmica, injeção intramuscu- lar ou injeção na sola do pé de 1 x 106 células, uma ou várias vezes, em um intervalo adequado (em geral, uma imunização a cada 1 a 6 semanas para um total de cerca de 2 a 10 vezes). Após 1 a 2 sema- nas da última imunização, o sangue é coletado da órbita ocular ou da veia caudal do animal imunizado, para medir o título de anticorpo usando o soro deste. O anticorpo da presente invenção pode ser obti- do por purificação do soro de um animal que exiba um título de anti- corpo suficiente.
[00076] Um anticorpo monoclonal pode ser obtido cultivando um hi- bridoma obtido pela fusão de uma célula produtora de anticorpo, obti- da de um animal imunizado que tenha sido imunizado através do mé- todo descrito acima, com uma célula de mieloma. Os exemplos do mé- todo de fusão incluem o método de Milstein et a/. (Galfre, G. & Milstein, C. (1981) Methods Enzymol., 73:3-46). Uma célula produtora de anti- corpo a ser usada pode ser coletada do baço, pâncreas, gânglio linfá- tico ou sangue periférico de um camundongo ou rato, o qual é imuni- zado pelo método descrito acima e tem soro que exibe um título de anticorpo suficiente. Uma célula de mieloma a ser usada não está par- ticularmente limitada, desde que seja uma célula derivada de um ma- mífero, como um camundongo, rato, porquinho-da-índia, hamster, coe- lho ou ser humano, e possa proliferar in vitro. Os exemplos de tal célu- la incluem a P3-X63Ag8 (X63) (Nature, 256, 495, 1975), a P3/NS1/1- Ag4-1 (NS1) (Eur. J. Immunol., 6, 292, 1976), a P3X63Ag8U1 (P3U1)
(Curr. Top. Microbiol. Immunol., 81, 1, 1978), a P3X63Ag8.653 (653) (J. Immunol., 123, 1548, 1979), a Sp2/0-Ag14 (Sp2/O0) (Nature, 276, 269, 1978), a Sp2/0/FO-2 (FO-2) (J. Imnmunol. Methods, 35, 1, 1980), a SP2ab e similares. A célula é preferivelmente uma célula derivada de um animal da mesma espécie que a célula produtora de anticorpo e, mais preferivelmente, uma célula derivada de um animal da mesma árvore filogenética que a célula produtora de anticorpo.
[00077] Após a cultura, o sobrenadante da cultura é coletado e um clone que se liga à CD80, CD86 ou CD28 é selecionado por meio de ELISA, usando uma proteína CD80, CD86 ou CD28 ou um domínio extracelular dela, ou uma célula que expressa CD80, CD86 ou CD28. Um anticorpo monoclonal produtor de células pode ser obtido repetin- do a diluição limitante 1 a 5 vezes no clone selecionado, para preparar uma única célula.
[00078] &—Alternativamente, pode ser obtido um anticorpo que se liga à CD80, CD86 ou CD28, por exemplo, utilizando uma biblioteca de fa- gos de anticorpos (Tomizuka et al. Nature Genet., 15, 146-156 (1997)). Quando se utiliza uma biblioteca de fagos de anticorpos, um clone desejado pode ser obtido, por exemplo, através da imobilização de uma proteína CD80, CD86 ou CD28 ou um domínio extracelular dela, ou uma célula que expressa CD80, CD86 ou CD28 em uma fase sólida, reação desta com uma biblioteca de fagos, lavagem e remoção do fago não ligado e, em seguida, coleta do fago ligado seleção ("pan- ning").
[00079] —Alternativamente, isto pode ser obtido por meio de exame de um anticorpo com alta especificidade para CD80, CD86 ou CD28, de acordo com o método descrito acima, a partir de anticorpos obtidos por projeto da sequência de aminoácidos de um anticorpo de interes- se, ou de um fragmento responsivo imunológico dele, por referência à sequência de aminoácidos descrita neste documento, preparação de um DNA que codifica a sequência de aminoácidos projetada, incorpo- ração do DNA em um vetor de expressão, e introdução e expressão do referido vetor em uma célula hospedeira adequada.
[00080] Quando o anticorpo da presente invenção for um anticorpo quimérico do tipo humano, o anticorpo pode ser obtido por preparação de um DNA que codifica a VH e a VL de um anticorpo monoclonal de animal não humano, ligação deste com um cDNA da região constante de uma imunoglobulina humana e integração deste em um vetor de expressão, e introdução e expressão do vetor em uma célula hospe- deira adequada (Morrison, SL et a/., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, 6851-6855, 1984).
[00081] “Quando o anticorpo da presente invenção for um anticorpo humanizado, o anticorpo pode ser obtido por construção de um DNA que codifica uma região V, preparada por transplante de uma sequên- cia de aminoácidos que codifica uma CDR de uma VH e uma VL de um anticorpo monoclonal de animal não humano em um Região de Estrutura (FR) de uma VH e uma VL de um anticorpo humano, ligação do DNA construído com um cDNA da região constante de uma imuno- globulina derivada de ser humano e integração desta em um vetor de expressão, e introdução e expressão do vetor em uma célula hospe- deira adequada (ver L. Rieohmann et a/., Nature, 332, 323, 1988: Ket- tleborough, C.A. et al., Protein Eng., 4, 773-783, 1991; Clark M,, Immunol. Today., 21, 397-402, 2000). Uma CDR de um anticorpo mo- noclonal de animal não humano pode ser obtida por comparação de uma sequência de aminoácidos prevista a partir de uma sequência de DNA que codifica uma VH e uma VL de um anticorpo monoclonal de animal não humano, obtido pelo método descrito acima, com as se- quências de aminoácidos completas da VH e da VL de um anticorpo conhecido. As sequências de aminoácidos de um anticorpo conhecido podem ser obtidas a partir das sequências de aminoácidos dos anti-
corpos que estão registrados em um banco de dados, como um banco de dados de proteínas. Uma FR de um anticorpo humanizado não está particularmente limitada, desde que um anticorpo, após o transplante, atinja o efeito da presente invenção, porém é, de preferência, uma FR de um anticorpo humano com uma estrutura tridimensional, onde a região variável (doravante, referida como a "região V") do anticorpo humanizado é similar à região V de um anticorpo monocional de ani- mal não humano a partir do qual a CDR é derivada, ou uma FR de um anticorpo humano com alta homologia com a sequência de aminoáci- dos de uma FR de um anticorpo monoclonal de animal não humano a ser usado. Alguns dos aminoácidos que constituem uma FR derivada de um anticorpo humano (particularmente os aminoácidos posiciona- dos na vizinhança de uma CDR tridimensionalmente) podem ser subs- tituídos por uma sequência da FR de um anticorpo monoclonal de animal não humano a partir do qual uma CDR é derivada, conforme necessário, em um anticorpo humanizado (ver Queen et al., Patente US No. 5585089). Uma sequência de DNA que codifica uma região V de um anticorpo humanizado a ser usado é projetada como uma se- quência de DNA que corresponde a uma sequência de aminoácidos preparada por ligação de uma sequência de aminoácidos de uma CDR de um anticorpo monoclonal de animal não humano com uma sequên- cia de aminoácidos de uma FR de um anticorpo humano. Um DNA que codifica uma região V de um anticorpo humanizado pode ser prepara- do por um método que é bem conhecido dos versados na técnica, com base em uma sequência de DNA projetada.
[00082] Por exemplo, um anticorpo humano pode ser obtido utili- zando uma biblioteca de fagos de anticorpos humanos ou um camun- dongo transgênico produtor de anticorpos humanos (Tomizuka et al., Nature Genet., 15, 146-156 (1997)). Ao utilizar uma biblioteca de fagos de anticorpos humanos, um clone desejado pode ser obtido, por exemplo, através da ligação de uma proteína CD80, CD86 ou CD28 ou um domínio extracelular dela, ou uma célula que expressa CDB80, CDB86 ou CD28 a uma fase sólida, reação desta com uma biblioteca de fagos, lavagem e remoção do fago não ligado e, em seguida, coleta do fago ligado (seleção). Um camundongo transgênico produtor de anti- corpos humanos é um camundongo produzido por introdução de um gene de lg de um anticorpo humano em um camundongo nocaute de gene de imunoglobulina (lg) endógena. Pode ser obtido um anticorpo humano que reconheça especificamente a CD80, a CD86 ou a CD28 por imunização de uma proteína de antígeno de acordo com o método de preparação de anticorpo da presente invenção descrito acima, ao mesmo tempo utilizando um camundongo transgênico produtor de an- ticorpos humanos como um animal imunizado.
(Molécula de ácido nucleico/vetor/célula hospedeira)
[00083] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma mo- lécula de ácido nucleico tendo um polinucleotídeo que codifica o anti- corpo da presente invenção, descrito acima. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico da presente invenção compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21 como uma VH. Em outro aspecto, a molécula de ácido nucleico da presente invenção compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 23 como uma VL. Como um exemplo mais específico, a molécula de ácido nucleico da presente invenção compreende um polinucleotídeo que codifica uma VH tendo a sequên- cia de nucleotídeos apresentada em qualquer uma selecionada a partir das SEQ ID NOs: 1, 5, 96 13 e um polinucleotídeo que codifica uma VL com a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma selecionada a partir das SEQ ID NOs: 3, 7, 11 e 15. A molécula de ácido nucleico da presente invenção pode ter uma sequência de áci- dos nucleicos que hibridiza, sob uma condição severa, com a SEQ ID
NO. descrita acima. Além disso, a presente invenção inclui um vetor tendo a referida molécula de ácido nucleico. Esse vetor não está parti- cularmente limitado, desde que ele seja um vetor que possa ser utili- zado na expressão de um anticorpo. Um vetor viral, um vetor de plas- mídio ou similar, adequado, pode ser selecionado de acordo com o hospedeiro que é usado. Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma célula hospedeira que compreende o referido vetor. À célula hospedeira não está particularmente limitada, desde que ela se- ja uma célula hospedeira que possa ser utilizada na expressão de um anticorpo. Os seus exemplos incluem as células de mamífero (células de camundongo, células de rato, células de coelho, células humanas e similares), as leveduras e os microrganismos (E. coli e similares). À presente invenção compreende um método de fabricação do anticorpo da presente invenção, compreendendo a cultura da célula hospedeira descrita acima. Um método de cultura do meio pode ser determinado apropriadamente por meios bem conhecidos dos versados na técnica, de acordo com a célula hospedeira que é usada.
[00084] O ácido nucleico da presente invenção pode ser obtido por clonagem de um hibridoma que produz um anticorpo obtido acima ou projeto de uma sequência de ácidos nucleicos apropriada com base na sequência de aminoácidos do anticorpo obtido acima ou de um frag- mento responsivo imunológico dele. O vetor da presente invenção po- de ser obtido por incorporação do ácido nucleico resultante em um ve- tor adequado para a expressão, conforme apropriado. O vetor da pre- sente invenção pode compreender uma região que seja necessária para a expressão (promotor, reforçador, terminador ou similar), além do ácido nucleico da presente invenção. A célula hospedeira da pre- sente invenção pode ser obtida pela introdução do vetor da presente invenção em uma linhagem celular adequada (por exemplo, célula animal, célula de inseto, célula vegetal, levedura ou microrganismo,
como E. coli). Composição
[00085] Em uma modalidade da presente invenção, a presente in- venção proporciona uma composição para a preparação de uma célula tendo imunotolerância induzida, compreendendo pelo menos um dos anticorpos descritos neste documento. Em uma modalidade da pre- sente invenção, uma composição pode compreender um anticorpo an- ti-CD80, um anticorpo anti-CD86, um anticorpo anti-CD28, um anticor- po biespecífico para CD80 e CD86, ou qualquer combinação deles. À rejeição devida ao transplante de órgãos pode ser reduzida, por exemplo, administrando a célula tendo imunotolerância induzida a um paciente recebendo o transplante de órgãos. Uma célula tendo imu- notolerância induzida pode ser uma célula derivada de um paciente (receptor) ou um doador, ou uma mistura deles. A composição da pre- sente invenção surpreendentemente não induz substancialmente a liberação de citocinas devida a uma célula produtora de citocinas (por exemplo, macrófago, neutrófilo ou célula exterminadora natural (NK)). Uma vez que as citocinas atenuam a imunotolerância, é vantajoso que a liberação de citocinas não seja induzida.
[00086] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição médica que compreende o anticorpo descrito neste do- cumento. Em um exemplo, a composição médica da presente inven- ção compreende um anticorpo anti-CD80, um anticorpo anti-CD86, um anticorpo anti-CD28 ou um anticorpo biespecífico para CD80 e CD86. A composição médica da presente invenção pode ser usada para in- duzir a imunotolerância. Ao longo de todo o relatório descritivo, "para induzir a imunotolerância" inclui os casos de utilização, por exemplo, para induzir a imunotolerância a um órgão transplantado, ou seja, para suprimir as respostas imunes excessivas a um agente causador, que se torna um imunógeno em um paciente com uma doença autoimune ou uma doença alérgica, para aliviar ou tratar um sintoma de tais do- enças, a fim de suprimir a rejeição no transplante de órgãos. Em outra modalidade, a composição farmacêutica da presente invenção é utili- zada para preparar uma célula tendo imunotolerância induzida.
[00087] “Como utilizado neste documento, o "órgão" a ser transplan- tado em um "transplante de órgão" não está particularmente limitado. Os seus exemplos incluem um coração, rim, pulmão, pâncreas, esôfa- go, estômago, intestino delgado, intestino grosso, pele, nervo, sangue, células sanguíneas, incluindo as células do sistema imunológico, osso, cartilagem, vaso sanguíneo, córnea, globo ocular, medula óssea e fi- gado. Conforme utilizado neste documento, o "órgão" inclui uma parte de um órgão e as células que constituem um órgão, além da totalidade ou uma massa de um órgão. Por exemplo, os órgãos transplantados também incluem as células do miocárdio, as células da córnea e simi- lares. O transplante de órgãos também inclui o transplante de um ór- gão preparado usando células-tronco heterólogas, na medicina rege- nerativa ou similar, em um paciente, além do transplante de um órgão de outro indivíduo em um paciente.
[00088] O anticorpo da presente invenção pode ser usado como uma composição médica por purificação e, em seguida, formulação de acordo com um método convencional, conforme necessário. A presen- te invenção também compreende o uso do anticorpo da presente in- venção para a fabricação de uma composição médica para induzir a imunotolerância. Alternativamente, a presente invenção compreende o uso do anticorpo da presente invenção para induzir a imunotolerância. Além disso, a presente invenção se refere a um método de induzir a imunotolerância, compreendendo a adição ou a administração do anti- corpo da presente invenção. Por exemplo, a presente invenção com- preende um método de suprimir a rejeição no transplante de órgão, compreendendo a administração do anticorpo da presente invenção a um paciente recebendo o transplante de órgão, um método de tratar uma doença autoimune ou doença alérgica, compreendendo a admi- nistração do anticorpo da presente invenção a um paciente com uma doença autoimune ou doença alérgica, e um método de suprimir a re- jeição no transplante de uma célula iPS ou célula ES ou uma célula, tecido ou órgão derivado (diferenciado) delas, compreendendo a ad- ministração do anticorpo da presente invenção a um paciente rece- bendo o transplante de uma célula iPS ou célula ES ou uma célula, tecido ou órgão derivado (diferenciado) delas.
[00089] Os exemplos de células, tecidos ou órgãos derivados (dife- renciados) de células iPS ou células ES incluem, porém não estão limi- tados às, células ou tecidos nervosos, células ou tecidos da córnea, células ou tecidos do miocárdio, células ou tecidos do fígado, células ou tecidos da cartilagem, células ou tecidos da pele, células ou tecidos do rim e similares. Em uma modalidade preferida, as células, os teci- dos ou os órgãos derivados (diferenciados) de células iPS ou células ES incluem as células ou os tecidos nervosos, as células ou os tecidos do miocárdio, as células ou os tecidos da cartilagem e as células ou os tecidos da pele.
[00090] A composição médica da presente invenção pode ser usa- da por meio da administração direta a um paciente, ou por meio do contato da composição com uma PBMC coletada de um paciente cuja imunotolerância deva ser induzida, juntamente com um antígeno de interesse que induza a imunotolerância ex vivo, para preparar uma cé- lula imune que seja anérgica ao antígeno.
[00091] “Quando a composição médica da presente invenção for administrada diretamente a um paciente, pode ser usada qualquer formulação oral ou parenteral. Os exemplos de uma composição para a administração parenteral incluem os colírios, as injeções, as gotas nasais, os supositórios, os emplastros, os unguentos e similares. À composição é preferivelmente uma injeção. Os exemplos das formas de dosagem da composição médica da presente invenção incluem um agente líquido e uma formulação liofilizada. Quando a composição médica da presente invenção for usada como uma injeção, pode ser adicionado um aditivo, por exemplo, um agente solubilizante, como o propileno glicol ou a etilenodiamina, um tampão, como o fosfato, um agente de tonicidade, como o cloreto de sódio ou a glicerina, um esta- bilizador, como o sulfito, um conservante, como o fenol, ou um analgé- sico, como lidocaína, conforme necessário (ver "Japanese Pharmaceu- tical Excipients Directory", Yakuji Nippo, Limited, "Handbook of Phar- maceutical Excipients Fifth Edition" APhA Publications). Quando a composição médica da presente invenção for usada como uma inje- ção, os exemplos de um recipiente de armazenamento incluem uma ampola, um frasco pequeno, uma seringa pré-cheia, um cartucho de injeção na forma de caneta, um saco |V e similares.
[00092] “Por exemplo, a composição médica da presente invenção (fármaco terapêutico ou fármaco preventivo) pode ser utilizada como uma injeção. A sua forma de dosagem inclui a injeção intravenosa, a injeção subcutânea, a injeção intradérmica, a injeção intramuscular, a injeção intravítrea, a injeção por gotejamento intravenoso e similares. Tais injeções podem ser preparadas de acordo com um método co- nhecido, por exemplo, por dissolução, suspensão ou emulsificação do anticorpo descrito acima em uma solução aquosa ou oleosa asséptica que seja, em geral, usada em injeção. Por exemplo, a solução de toni- cidade compreendendo a solução salina, a glicose, a sacarose, o ma- nitol ou outro adjuvante ou similar pode ser usada como uma solução aquosa para injeção e pode ser usada em combinação com um agente solubilizante adequado, como o álcool (por exemplo, o etanol), o poli- álcool (por exemplo, o propileno glicol ou o polietileno glicol), o tensoa- tivo aniônico por exemplo, o polissorbato 80, o polissorbato 20, o
HCO-50 (aduto de polioxietileno (50 mol) de óleo de rícino hidrogena- do) ou similar. Por exemplo, o óleo de gergelim, o óleo de soja ou simi- lar pode ser usado como uma solução oleosa, a qual pode ser usada concomitantemente com o benzoato de benzila, o álcool benzílico ou similar como um agente solubilizante. A injeção preparada é, em geral, inserida em uma ampola, frasco pequeno ou seringa adequados. Um excipiente adequado pode ser adicionado ao anticorpo da presente invenção ou a um fragmento responsivo imunológico dele, para prepa- rar uma formulação liofilizada, a qual é dissolvida em água para inje- ção, solução salina ou similar, quando necessário, como uma solução de injeção. Embora a injeção oral de uma proteína, como um anticor- po, seja, em geral, considerada difícil devido à decomposição pelos órgãos digestivos, a administração oral pode ser possível por criativi- dade e engenhosidade na forma de dosagem, como um fragmento de anticorpo ou fragmento de anticorpo modificado. Os exemplos de for- mulações administradas oralmente incluem as cápsulas, os comprimi- dos, o xarope, os grânulos e similares.
[00093] A composição médica da presente invenção é adequada- mente preparada em uma forma de dosagem, em uma unidade de do- sagem que corresponde à dosagem de um ingrediente ativo. A forma de dosagem ilustrativa, em uma unidade de dosagem, inclui uma inje- ção (ampola, frasco pequeno ou seringa pré-cheia). Em geral, 5 a 500 mg, 5 a 100 mg ou 10 a 250 mg do anticorpo da presente invenção, ou de um fragmento responsivo imunológico dele, podem estar contidos por forma de dosagem, em uma unidade de dosagem.
[00094] A administração da composição médica da presente inven- ção pode ser tópica ou sistêmica. O método de administração não está particularmente limitado. A composição é administrada de forma pa- renteral ou oral, conforme descrito acima. Os exemplos das rotas de administração parenterais incluem a intraocular, a subcutânea, a intra-
peritoneal, o sangue (intravenosa ou intra-arterial) ou a injeção de flui- do espinhal, a gota e similares, e é preferivelmente a administração no sangue. A composição médica da presente invenção (fármaco tera- pêutico ou fármaco preventivo) pode ser administrada temporariamen- te ou administrada de forma contínua ou intermitente. Por exemplo, a administração pode ser a administração contínua por 1 minuto a 2 se- manas.
[00095] A dosagem da composição médica da presente invenção não está particularmente limitada, desde que ela seja uma dosagem que atinja um efeito terapêutico ou preventivo desejado. A dosagem pode ser determinada apropriadamente, dependendo do sintoma, se- xo, idade ou similar. A dosagem da composição médica da presente invenção pode ser determinada, por exemplo, com o grau de indução da imunotolerância como um indicador. Por exemplo, como uma dose única de um ingrediente ativo da composição médica da presente in- venção, é vantajoso administrar, em geral, cerca de 0,01 a 20 mg/kg de peso corporal, de preferência cerca de 0,1 a 10 mg/kg de peso cor- poral, e ainda mais preferivelmente cerca de 0,1 a 5 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 a 10 vezes ao mês e, de preferência, cerca de 1 a vezes ao mês, por injeção intravenosa. Uma quantidade que corres- ponda a esta pode ser administrada para outra administração parente- ral ou oral. Se o sintoma for particularmente grave, a quantidade ou o número de administrações pode ser aumentado de acordo com o sin- toma.
[00096] “Quando a composição médica da presente invenção for co- locada em contato com uma PBMC coletada de um paciente cuja imu- notolerância deva ser induzida, juntamente com um antígeno de inte- resse que induza a imunotolerância ex vivo, para preparar uma célula imune que seja anérgica ao antígeno, a composição pode ser prepa- rada em uma forma como líquido, pó, comprimido, gel ou grânulo, de acordo com a composição para a administração descrita acima. (Células com imunotolerância induzida)
[00097] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma célula tendo imunotolerância induzida pelo anticorpo descrito neste documento. A imunotolerância pode ser induzida por mistura de uma célula derivada de um paciente com um antígeno que não é derivado do paciente ou um material que contém um antígeno. Ainda em outro aspecto da presente invenção, a presente invenção proporciona um método para a fabricação de uma célula para tratar ou prevenir uma doença, distúrbio ou condição causada por um antígeno que não é de- rivado de um paciente, compreendendo a mistura do anticorpo descrito neste documento, uma célula derivada de um paciente e um antígeno que não é derivado do paciente ou um material que contém um antí- geno (por exemplo, uma célula). A doença, o distúrbio ou a condição pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em rejeição de enxerto, alergia, doença autoimune, doença do enxerto contra hospe- deiro e rejeição imunológica causada por transplante de uma célula iPS ou uma célula ES e uma célula, tecido, ou órgão derivado das re- feridas células.
[00098] Em uma modalidade onde a doença ou similar visada pela presente invenção for a rejeição de enxerto, uma célula anérgica pode ser induzida por mistura do anticorpo descrito acima com uma célula derivada do receptor (PBMC ou esplenócito) e um antígeno derivado de um doador ou um material que contém um antígeno derivado de um doador. Um material que contém um antígeno derivado de um doador pode ser uma PBMC, um esplenócito ou uma célula derivada de um órgão a ser transplantado.
[00099] Em uma modalidade onde a doença visada pela presente invenção ou similar for a alergia, uma célula anérgica pode ser induzi- da por mistura do anticorpo descrito acima com uma célula derivada do paciente (PBMC ou esplenócito) e um antígeno indutor de alergia que não seja derivado do paciente.
[000100] Em uma modalidade onde a doença visada pela presente invenção ou similar for uma doença autoimune, uma célula anérgica pode ser induzida por mistura do anticorpo descrito acima com uma célula derivada do paciente (PBMC ou esplenócito) e um antígeno de- rivado do paciente que é a causa da doença autoimune.
[000101] Em uma modalidade onde a doença visada pela presente invenção ou similar é uma doença do enxerto contra hospedeiro, uma célula anérgica pode ser induzida por mistura do anticorpo descrito acima com uma PBMC ou um esplenócito de um doador que fornece o enxerto e um antígeno derivado de um receptor ou um material que contém o antígeno. O material que contém um antígeno derivado de um receptor pode ser uma PBMC, um esplenócito, uma célula em tor- no de um local onde um órgão é transplantado ou uma célula derivada dele.
[000102] Em uma modalidade onde a doença visada pela presente invenção ou similar for a rejeição imunológica causada pelo transplan- te de uma célula iPS ou uma célula ES e uma célula, tecido ou órgão derivado das referidas células, uma célula anérgica pode ser induzida por mistura do anticorpo descrito acima com uma célula derivada do paciente (PBMC ou esplenócito) e uma célula diferenciada de uma cé- lula iPS ou célula ES usada no transplante.
[000103] Os exemplos terapêuticos de uma doença ou similar de acordo com a presente invenção são mostrados abaixo, porém não estão limitados a eles. Alergia e doença autoimune
[000104] Para a alergia e as doenças autoimunes, um macrófago ob- tido do sangue periférico de um paciente é diferenciado em uma célula dendrítica (célula dendrítica derivada de um macrófago) com alta ca-
pacidade de apresentação de antígeno, por um método convencional. A célula após irradiação da radiação (raios y) é preparada para apre- sentar um antígeno que seja a causa da hiperreação em alergia ou doença autoimune, e cocultivada por 1 a 2 semanas com um grupo de células T contido a partir do mesmo sangue periférico do paciente, na presença de um anticorpo anti-CD80 e/ou um anticorpo anti-CD86, pa- ra obter uma célula anérgica que é específica para o antígeno que causa a alergia ou a doença autoimune. A célula anérgica é adminis- trada a um paciente, para induzir a imunotolerância específica para o antígeno que causa a alergia ou a doença autoimune, para uso na prevenção ou no tratamento de alergia e doença autoimune. O número de dosagens pode ser múltiplo, dependendo se a dosagem é uma te- rapia preventiva ou um tratamento e de várias condições, como a gra- vidade dos sintomas. Doença do enxerto contra hospedeiro
[000105] Para a doença do enxerto contra hospedeiro, em contraste com o tratamento da rejeição de enxerto, uma célula que possa ser a causa da doença do enxerto contra hospedeiro, como uma PBMC ou uma célula T de um doador que fornece um enxerto, é cocultivada por 1a 2 semanas com uma PBMC derivada de um hospedeiro irradiado com radiação (raios y) ou com outras células, na presença de um anti- corpo anti-CD80 e/ou um anticorpo anti-CD86, para obter uma célula anérgica que seja específica para um hospedeiro. A administração dessa célula anérgica a um hospedeiro suprime as respostas a um hospedeiro por um enxerto que causa a doença do enxerto contra hospedeiro (e induz a imunotolerância), para prevenir ou tratar a doen- ça do enxerto contra hospedeiro. O número de dosagens pode ser múltiplo, dependendo se a dosagem é uma terapia preventiva ou um tratamento e de várias condições, como o tecido a ser transplantado, o tamanho dele ou a gravidade dos sintomas.
Rejeição imunológica causada pelo transplante de uma célula iPS ou uma célula ES e uma célula, tecido ou órgão derivado das referidas células
[000106] Nas aplicações para o tratamento usando uma célula iPS ou uma célula ES, uma célula dendrítica ou uma célula usada no transplante, diferenciada de uma célula iPS ou célula ES, é irradiada com radiação (raios y) e a célula é cocultivada por 1 a 2 semanas com uma PBMC ou um grupo de células T de um paciente recebendo o transplante, na presença de um anticorpo anti-CD80 e/ou um anticorpo anti-CD86, para obter uma célula anérgica que seja específica para uma célula diferenciada de uma célula iPS ou uma célula ES. A admi- nistração dessa célula anérgica a um hospedeiro induz a imunotole- rância que é específica para uma célula, tecido e órgão transplanta- dos, derivados de uma célula iPS ou célula ES, e previne e trata a re- jeição a eles. O número de dosagens pode ser múltiplo, dependendo se a dosagem é uma terapia preventiva ou um tratamento e de várias condições, como o tecido a ser transplantado, o tamanho dele ou a gravidade dos sintomas.
[000107] Em uma modalidade específica, a presente invenção se re- fere a um método de induzir a anergia de uma PBMC de um paciente a um antígeno, compreendendo o contato do anticorpo descrito acima (incluindo uma composição que compreende o anticorpo descrito aci- ma; o mesmo se aplica a seguir) com um antígeno para o qual a imu- notolerância deve ser induzida ou uma célula tendo o referido antígeno sobre uma superfície, e uma PBMC. O método de induzir a imunotole- rância da presente invenção é realizado ex vivo. Se, por exemplo, a supressão da rejeição contra um órgão transplantado de um paciente recebendo o transplante se destinar ao transplante do órgão, uma PBMC é uma célula coletada do paciente recebendo o transplante do órgão. Se uma PBMC se destinar a tratar ou melhorar uma doença autoimune ou uma doença alérgica, a PBMC é uma célula coletada do paciente.
[000108] Por exemplo, a imunotolerância para suprimir a rejeição do transplante de órgãos pode ser induzida pelo método que se segue. Uma PBMC de um paciente (receptor) recebendo o transplante de ór- gão e uma PBMC de um paciente (doador) fornecendo um órgão são preparadas e a PBMC do doador é irradiada com radiação de 30 Gy. À PBMC do doador é misturada com a PBMC do receptor a 1:1,e o anti- corpo da presente invenção (de preferência uma combinação de um anticorpo anti-CD80 humana e um anticorpo anti-CD86 humana) é adicionado. Uma PBMC do receptor que é anérgica ao doador pode ser preparado por cultura, durante 3 a 7 dias, em uma incubadora a 37ºC e 5% de CO», em um meio para PBMCs.
[000109] Por exemplo, a imunotolerância para tratar ou melhorar uma doença autoimune ou uma doença alérgica também pode ser in- duzida pelo método que se segue. Uma PBMC de um paciente é pre- parada e misturada com um antígeno que causa uma doença autoi- mune ou doença alérgica, e o anticorpo da presente invenção (de pre- ferência uma combinação de um anticorpo anti-CD80 humana e anti- corpo anti-CD86 humana) é adicionado. Uma PBMC do receptor que é anérgica ao antígeno pode ser preparada por cultura, durante 3 a 7 dias, em uma incubadora a 37ºC e 5% de CO», em um meio para PBMCsS.
[000110] A presente invenção compreende uma célula (por exemplo, a PBMC) tendo anergia induzida pelo método descrito acima. Uma cé- lula com anergia induzida (por exemplo, a PBMC) pode induzir a imu- notolerância em um paciente pela administração a um paciente, de modo que uma célula com anergia induzida (por exemplo, a PBMC) possa ser usada como um agente de terapia celular. Por conseguinte, a presente invenção se refere a um agente de terapia celular compre-
endendo uma célula (por exemplo, a PBMC) com anergia induzida pe- lo método descrito acima como um ingrediente ativo, de preferência um agente de terapia celular para suprimir a rejeição no transplante de órgãos, compreendendo uma célula (por exemplo, a PBMC) de um paciente recebendo o transplante com anergia induzida a um órgão transplantado como um ingrediente ativo, ou um agente de terapia ce- lular para o tratamento de uma doença autoimune ou uma doença alérgica, compreendendo uma célula (por exemplo, a PBMC) com ane- rgia induzida a um antígeno que causa uma doença autoimune ou uma doença alérgica devida à resposta imune hiperativa como um ingredi- ente ativo, ou um agente de terapia celular para suprimir a rejeição no transplante de uma célula iPS ou uma célula ES e uma célula, tecido ou órgão derivado das referidas células. A rejeição ilustrativa inclui a doença do enxerto contra hospedeiro.
[000111] O agente de terapia celular da presente invenção pode in- duzir a imunotolerância em um paciente pela administração ao pacien- te. Por exemplo, a presente invenção compreende um método de su- primir a rejeição no transplante de órgãos, compreendendo a adminis- tração de um agente de terapia celular para suprimir a rejeição no transplante de órgãos, que compreende uma célula (por exemplo, a PBMC) de um paciente recebendo o transplante com anergia induzida a um órgão transplantado como um ingrediente ativo, ao paciente re- cebendo o transplante de órgãos. A presente invenção também com- preende um método de tratar uma doença autoimune ou uma doença alérgica, compreendendo a administração de um agente de terapia celular para o tratamento de uma doença autoimune ou uma doença alérgica, que compreende uma célula (por exemplo, a PBMC) com anergia induzida a um antígeno que causa uma doença autoimune ou uma doença alérgica devida à resposta imune hiperativa como um in- grediente ativo, a um paciente com uma doença autoimune ou uma doença alérgica. A presente invenção também compreende um méto- do de suprimir a rejeição no transplante de uma célula iPS ou uma cé- lula ES ou uma célula, tecido ou órgão derivado das referidas células, compreendendo a administração de um agente de terapia celular para suprimir a rejeição no transplante de uma célula iPS ou uma célula ES ou uma célula, tecido ou órgão derivado das referidas células, que compreende uma célula (por exemplo, a PBMC) de um paciente rece- bendo o transplante com anergia a uma célula iPS ou uma célula ES ou uma célula, tecido ou órgão derivado das referidas células a ser transplantado como um ingrediente ativo, a um paciente recebendo o transplante de órgão.
[000112] O agente de terapia celular da presente invenção compre- ende uma PBMC em um soro contendo/sem meio ou solução salina que pode ser administrada ao ser humano. Quando as células forem adsorventes, as células podem ser suportadas e armazenadas sobre um substrato separável e usadas ao separar as células durante o uso. Por exemplo, pode ser usado um substrato do qual as células são se- paráveis a partir de uma mudança na temperatura (RepCell, CellSeed Inc. Japão) ou similar.
[000113] A presente invenção pode ser um método de induzir a imu- notolerância em um paciente, compreendendo o contato do anticorpo descrito acima com um antígeno para o qual a imunotolerância deve ser induzida ou uma célula tendo o antígeno sobre uma superfície, e uma célula (por exemplo, a PBMC) para induzir anergia ao antígeno da célula (por exemplo, a PBMC) do paciente e a administração da célula com anergia induzida (por exemplo, a PBMC) ao paciente. Por exemplo, a presente invenção compreende um método de supressão da rejeição no transplante de órgãos, compreendendo a preparação de uma célula (por exemplo, a PBMC) derivada de um paciente com imu- notolerância a um órgão transplantado, induzida por indução da aner-
gia ao órgão transplantado de uma célula (por exemplo, a PBMC) de um paciente ao contatar uma célula derivada de um doador com a cé- lula (por exemplo, a PBMC) do paciente, e a administração da célula preparada (por exemplo, a PBMC) a um paciente recebendo o trans- plante do órgão. A presente invenção também pode ser um método de tratar ou melhorar uma doença autoimune ou uma doença alérgica, compreendendo a preparação de uma célula (por exemplo, a PBMC) derivada de um paciente com imunotolerância a um antígeno que cau- sa uma doença autoimune ou uma doença alérgica, induzida por indu- ção da anergia ao antígeno de uma célula (por exemplo, a PBMC) de um paciente ao contatar o antígeno que causa uma doença autoimune ou uma doença alérgica com a célula (por exemplo, a PBMC) do paci- ente, e a administração da célula preparada (por exemplo, a PBMC) a um paciente de uma doença autoimune ou uma doença alérgica. À presente invenção também compreende um método de suprimir a re- jeição no transplante de uma célula iPS ou uma célula ES ou uma cé- lula, tecido ou órgão derivado das referidas células, compreendendo a preparação de uma célula (por exemplo, a PBMC) derivada de um pa- ciente com imunotolerância a uma célula iPS ou uma célula ES ou uma célula, tecido ou órgão derivado das referidas células a ser trans- plantada, induzida por indução da anergia à célula iPS ou a uma célula ES ou uma célula, tecido ou órgão derivado das referidas células de uma célula (por exemplo, a PBMC) de um paciente ao contatar a célu- la iPS ou uma célula ES ou uma célula, tecido ou órgão derivado das referidas células com a célula (por exemplo, a PBMC) do paciente, e a administração da célula preparada (por exemplo, a PBMC) a um paci- ente recebendo o transplante da célula iPS ou de uma célula ES ou uma célula, tecido ou órgão derivado das referidas células.
[000114] A administração de um agente de terapia celular (célula com anergia induzida, como a PBMC) não está particularmente limita-
da neste documento, desde que a dosagem atinja um efeito terapêuti- co ou preventivo desejado e possa ser determinada apropriadamente, dependendo do sintoma, sexo, idade ou similar. A dosagem do agente de terapia celular da presente invenção pode ser determinada, por exemplo, utilizando o grau de indução da imunotolerância como um indicador. Por exemplo, uma dose única de PBMCs com anergia indu- zida do agente de terapia celular da presente invenção é vantajosa- mente administrada por meio de injeção intravenosa em geral em tor- no de 1,0 a 3,7 x 10” células/kg de peso corporal, de preferência em torno de 2,0 a 5,0 x 107 células/kg de peso corporal, e mais preferi- velmente em torno de 3,0 a 5,0 x 107 células/kg de peso corporal, cer- ca de 1 a 10 vezes ao mês e de preferência 1 a 5 vezes ao mês. Se não for observado um efeito de imunossupressão, a quantidade ou o número de administrações pode ser aumentado, dependendo do sin- toma. (Observação)
[000115] Conforme usado neste documento, "ou" é utilizado quando "pelo menos um ou mais" dos assuntos listados na frase puderem ser empregados. Quando explicitamente descrito neste documento como "dentro da faixa de dois valores", a faixa também inclui os próprios dois valores.
[000116] As literaturas de referência, como as literaturas científicas, as patentes e os pedidos de patentes citados neste documento, são incorporadas neste documento por referência até o ponto em que a totalidade de cada documento for especificamente descrita.
[000117] A presente invenção foi descrita ao mesmo tempo mostran- do as modalidades preferidas para facilitar a compreensão. Embora a presente invenção seja descrita a seguir com base nos Exemplos, as descrições acima e os Exemplos a seguir são proporcionados com o único propósito de exemplificação, não limitação da presente inven-
ção. Assim, o escopo da presente invenção não está limitado às mo- dalidades e aos Exemplos que são especificamente descritos neste documento e está limitado apenas pelo escopo das reivindicações. Exemplos
[000118] A presente invenção é mais especificamente descrita a se- guir com base nos Exemplos. No entanto, a presente invenção não está limitada aos Exemplos. Ao longo de todo o pedido, todas as refe- rências citadas são diretamente incorporadas neste documento por referência.
[000119] Os exemplos são descritos a seguir. Os organismos usados nos Exemplos que se seguem foram manuseados em conformidade com as diretrizes especificadas pela Universidade de Juntendo e pelas agências reguladoras. Os experimentos com animais foram conduzi- dos em conformidade com as Regras de Controle de Experimentos com Animais da Universidade de Juntendo, que foram aprovadas com base na "Act on Welfare and Management of Animals", na "Guideline for Raising and Keeping of Laboratory Animals" (Notificação do Minis- tério do Meio Ambiente No. 88 de 2006), e nas "Fundamental guideli- nes for proper conduct of animal experiment and related activities in Academic research institutions" (Notificação do Ministério de Educa- ção, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia No. 71 de 2006). Os ex- perimentos foram planejados com base nos assim chamados 3R. Um plano já tinha sido aprovado e aceito após a sua apresentação e revi- são pelo comitê de experimentos com animais da Universidade de Juntendo. O uso de camundongos geneticamente modificados foi aprovado após exame do plano experimental para utilização de ani- mais produtores de DNA recombinante pelo comitê de segurança da universidade. Quanto aos experimentos de DNA recombinante, um plano já tinha sido aprovado e aceito após a sua apresentação e revi- são pelo comitê de segurança de DNA da Universidade de Juntendo, e os estudos foram conduzidos de acordo com as regulamentações per- tinentes, como a "Law Concerning the Conservation and Sustainable Use of Biological Diversity through Regulations on the Use of Living Modified Organisms". O experimento usando sangue periférico huma- no (PBMC) foi examinado com base no princípio da revisão justa e da invenção de informações e foi aprovado como sendo adequado pelo comitê de ética da Universidade de Juntendo. Os estudos foram con- duzidos ao mesmo tempo protegendo estritamente as informações pessoais e mantendo o anonimato após a obtenção do consentimento das informações, para o propósito/plano/método dos estudos dos for- necedores das amostras. Os experimentos foram conduzidos ao mesmo tempo cumprindo com as diretrizes éticas especificadas pelos comitês de ética da Escola de Medicina da Universidade de Juntendo e do Hospital Nacional de Sagamihara e as "diretrizes para estudos clínicos" especificadas pelo Ministério da Saúde, Trabalho e Bem- Estar. Quanto aos reagentes, foram usados os produtos específicos descritos nos Exemplos. No entanto, os reagentes podem ser substitu- ídos por um produto equivalente de outro fabricante (Sigma-Aldrich, Wako Pure Chemical, Nacalai Tesque, R & D Systems, USCN Life Science INC, BD bioscience, BioLegend ou similar). (Exemplo 1) Reação de linfócitos mistos (MLR) na presença de anti- corpos anti-CD80 humana e anti-CD86 (subclasse I9G1) Materiais e Métodos
[000120] As células mononucleares (PBMC) foram separadas do sangue periférico humano de três voluntários (um foi especificado co- mo um doador (doador C) e dois foram especificados como receptores (receptor A e receptor B)) usando o Meio de separação de Linfócitos da Promo cells (Cat. No. C — 44010) e ajustadas de modo que a con- centração fosse 4 x 106 células/ml em soro humano a 2% tipo AB da Biowest (agrupamento) contendo meio ALyS50O5N-O (Cell Science &
Technology Institute (CSTI) 1020P10). Uma radiação de 30 Gy (raios y) foi irradiada sobre as PBMCs do doador.
[000121] As PBMCs do doador e as PBMCs dos receptores foram distribuídas em 4 poços de uma placa de 96 poços (Corning, Cat. No. 3799), a 100 ul/poço cada, de modo que a proporção fosse 1:1 (total final de 200 ul/poço). Uma combinação de um anticorpo anti-CD80 humana (v2 (subclasse IgG1)) e um anticorpo anti-CD86 humana (v5 (subclasse IgG1)) humanizados ou uma combinação do anticorpo anti- CD80 humana de camundongo (Cat. No. 16-0809-85) (subclasse I9G1) e anticorpo anti-CD86 humana de camundongo (Cat. No. 16- 0869-85) (subclasse IgG2) da eBioscience foi adicionada a elas, a 10 ul, de modo que a concentração após a adição de cada anticorpo fos- se 0,1, 1 ou 10 ug/mL, e a cultura foi iniciada em uma incubadora a 37ºC e 5% de CO». No dia 4 do início da cultura, a *H-timidina (10 UuL) foi adicionada. No dia 5 do início da cultura (após 16 a 20 horas da adição da *H-timidina), as células cultivadas foram coletadas com um Cell Harvester (Molecular Devices). A quantidade de incorporação de 3H-timidina foi medida com um contador de cintilação.
[000122] Para a produção de IFNy, uma mistura de PBMCs que tinha sido misturada pelo mesmo método descrito acima, com a adição de cada anticorpo da mesma maneira, foi distribuída em 3 poços de uma Placa de 48 poços (Corning, Cat. No. 3548), a 500 uL/poço, e a cultura foi iniciada em uma incubadora a 37ºC e 5% de CO». No dia 6 de cul- tura, o sobrenadante foi coletado. A amostra coletada foi diluída 10 a vezes e, em seguida, a medição foi realizada usando Human IFNy ELISA MAXº Deluxe da Biolegend, Cat. 430104. (Resultados)
[000123] Como resultado, como mostrado na Figura 1, a combinação de um anticorpo anti-CD80 humana humanizado (v2 (subclasse I9G1)) e um anticorpo anti-CD86 humana humanizado (v5 (subclasse I9G1))
teve baixa incorporação de %H-timidina, quase no mesmo nível que a combinação de anticorpo anti-CD80 humana de camundongo e anti- corpo anti-CD86 humana de camundongo da eBioscience, isto é, ati- vação suprimida das células imunes. Entretanto, como mostrado na Figura 2, a avaliação da produção de IFNy resultou em baixa produção na presença dos anticorpos anti-CD80 e CD86 humanas de camun- dongo da eBioscience, ao passo que foi observada uma produção de IFNy dependente da quantidade de anticorpos adicionados na presen- ça dos anticorpos anti-CD80 e CD86 humanas humanizados (subclas- se IgG1). A 10 ug/mL, foi observada uma produção igual ou maior do que aquela na ausência de anticorpos (Figura 2: Allo). Embora não desejando estar ligado por qualquer teoria, entende-se que os anticor- pos da eBioscience têm baixa produção de IFNy devida a serem anti- corpos de camundongo e terem baixa reatividade. (Exemplo 2) Reação de linfócitos mistos (MLR) na presença de anti- corpos anti-CD80 humana e anti-CD86 (subclasse I9G1) Materiais e Métodos
[000124] A incorporação da %H-timidina foi avaliada pelo mesmo mé- todo do Exemplo 1, quando foi adicionada uma combinação de um an- ticorpo anti-CD80 humana (v2 (subclasse I9G1)) e um anticorpo anti- CD86 humana (v5 ou v9 (subclasse IgG1)) humanizados ou uma com- binação de anticorpo anti-CD80 humana de camundongo da eBiosci- ence (Cat. No. 16-0809-85) e anticorpo anti-CD86 humana de camun- dongo (Cat. No. 16-0869-85), de modo que a concentração após a adição de cada anticorpo fosse 10 ug/mL. Dos três voluntários, um foi especificado como doador (doador F) e dois foram especificados como receptores (receptor D e receptor E).
[000125] Além disso, a produção de IFNy foi avaliada para uma combinação de um anticorpo anti-cCD80 humana humanizado (v2 (subclasse I9G1)) e um anticorpo anti-CD86 humana humanizado (v9
(subclasse I9G1)) e uma combinação do anticorpo anti-CD80 humana e o anticorpo anti-CD86 humana de camundongos da eBioscience. Para a combinação de um anticorpo anti-CD80 humana (v2 (subclasse I9G1)) e anticorpo anti-CD86 humana (v9 (subclasse I9G1)) humani- zados, também foi avaliada a produção de IFNy quando não foram adicionadas as PBMCs do doador irradiadas com radiação, além do método do Exemplo 1. Resultados
[000126] Como resultado, como mostrado na Figura 3, a combinação de um anticorpo anti-CD80 humana e um anticorpo anti-CD86 humana humanizados exibiu maior supressão da incorporação de %H-timidina do que a combinação de anticorpo anti-CD80 humana e anticorpo anti- CD86 humana de camundongos. Entretanto, como mostrado na Figura 4, a produção de IFNy foi baixa com os anticorpos anti-CD80 e CD86 humanas de camundongos da eBioscience da mesma maneira que no Exemplo 1. Foi observada uma produção igual ou maior que aquela após a simulação do doador na ausência de um anticorpo para os an- ticorpos anti-CD80 e CD86 humanas humanizados. Além disso, a mesma produção de IFNy foi observada quando foram adicionados os anticorpos anti-CD80 e anti-CD86 humanas humanizados, mesmo quando as PBMCs do doador irradiadas com radiação não foram adi- cionadas. (Exemplo 3) Reação de linfócitos mistos (MLR) na presença de anti- corpos anti-CD80 e anti-CD86 humanos (subclasses IgG1, IgG2 e I9G4)
[000127] No Exemplo 2, a produção de IFNy foi observada mesmo quando as PBMCs do doador irradiadas com radiação não foram adi- cionadas. Assim, as classes do anticorpo anti-CD80 humana e do anti- corpo anti-CD86 humana humanizados foram trocadas e a incorpora- ção de ?H-timidina, quando uma combinação do anticorpo anti-CD80 humana (v2 (subclasse I9gG2 ou IgG4)) e anticorpo anti-CD86 humana (v9 (subclasse IgG2 ou IgG4)) humanizados da mesma subclasse e uma combinação de anticorpo anti-CD80 humana (Cat.
No. 16-0809- 85) e anticorpo anti-CD86 humana (Cat.
No. 16-0869-85) de camun- dongos da eBioscience foram adicionadas, de modo que a concentra- ção após a adição de cada anticorpo fosse 1, 3 ou 10 ug/mL, e a pro- dução de IFNy, quando os anticorpos foram adicionados, de modo que a concentração após a adição de cada anticorpo fosse 10 ug/mL, fo- ram avaliadas.
Dos três voluntários, um foi especificado como doador (doador |) e dois foram especificados como receptores (receptor G e receptor H). O que segue é o sistema experimental específico.
Incorporação de *H-timidina (concentração de cada anticorpo: 1, 3 e pg/mL) (Figura 5) - sem adição de anticorpos (Allo), PBMC do doador irradiada com ra- diação adicionada - anticorpo anti-CD80 humana de camundongo e anticorpo anti-CD86 humana de camundongo da eBioscience - anticorpo anti-CD80 humana humanizado (v2 (I9G2)) e anticorpo an- ti-CD86 humana humanizado (v9 (I9G2)) - anticorpo anti-CD80 humana humanizado (v2 (I9G4)) e anticorpo an- ti-CD86 humana humanizado (v9 (I9G4)) Produção de IFNy (concentração de cada anticorpo: 10 ug/mL) (Figura 6) Com adição de PBMC de doador irradiada com radiação (Allo) - sem adição de anticorpos - anticorpo anti-CD80 humana e anticorpo anti-CD86 humana de ca- mundongos da eBioscience - anticorpo anti-CD80 humana humanizado (v2 (I9G2)) e anticorpo an- ti-CD86 humana humanizado (v9 (I9G2)) - anticorpo anti-CD80 humana humanizado (v2 (I9G4)) e anticorpo an- ti-CD86 humana humanizado (v9 (I9G4))
Sem adição de PBMC de doador irradiada com radiação (Virgem) - sem adição de anticorpos (Allo) - anticorpo para CD80 e anticorpo anti-CD86 de camundongos da eBioscience - anticorpo anti-CD80 humanizado (v2 (I9G1)) e anticorpo anti-CD86 humana humanizado (v9 (I9G1)) - anticorpo anti-CD80 humanizado (v2 (I9G2)) e anticorpo anti-CD86 humana humanizado (v9 (I9G2)) - anticorpo anti-CD80 humanizado (v2 (I9G4)) e anticorpo anti-CD86 humana humanizado (v9 (I9G4)) (Resultados)
[000128] Como resultado, como mostrado na Figura 5, as subclasses IgG2 e IgG4 exibiram supressão da incorporação de *H-timidina na mesma maneira que os Exemplos 1 e 2. Entretanto, como mostrado na Figura 6, a produção de IFNy foi observada na subclasse IgG1, po- rém, surpreendentemente, o IFNy não foi produzido de modo algum nas subclasses IgG2 e IgG4.
(Exemplo 4) Reação de linfócitos mistos (MLR) quando as células obti- das a partir de cultura na presença dos anticorpos anti-CD80 humana e anti-CD86 humana (subclasse IgG1, IgG2 ou IgG4) foram adicionadas (Materiais e Métodos)
[000129] A cultura continuou até o dia 14 pelo método descrito no Exemplo 1, na presença de uma combinação de subclasses IgG1, IgG2 e IgG4 de anticorpo anti-CD80 humana humanizado (v2) e anti- corpo anti-CD86 humana (v9). O anticorpo anti-CD80 humana huma- nizado (v2) da subclasse IgG2 consiste em uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4. O anticorpo anti-CD80 humana humanizado (v2) da subclasse IgG4 consiste em uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 e uma ca-
deia leve com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. O anti- corpo anti-CD86 humana (v9) da subclasse IgG2 consiste em uma ca- deia pesada com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 e uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12. O anticorpo anti-CD86 humana (v9) da subclasse IgG4 consiste em um cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. Após a cultura, as células anérgicas resultantes, as PBMCs dos receptores (R-PBMC) e as PBMCs do doador irradiadas com radi- ação (D-PBMC) foram misturadas de acordo com a tabela a seguir e, em seguida, a incorporação de *H-timidina foi avaliada após mistura pelo método descrito no Exemplo 1. Tabela 1 Suspensão celular IL R-PBMC D-PBMC | Meio | Virgem 200 oo — oo — aco (RPBMC somente) — |[cétuas [40xto o — oo o Allo 2000 oo ——— j2000 100,0 (RPBMC+DPBMC) esidas aoxtor o —lsoxt0 o | R-PBMC:T Anérgica = 200,0 [100,0 2000 joo | 112 aoxtE fo R-PBMC:T Anérgica = 200,0 200,0 114 aoxior o | RPBMCT Anérdica = 20070 200,0 Resultados
[000130] Como resultado, como mostrado na Figura 7, as células ob- tidas na presença de anticorpos de qualquer subclasse suprimiram a incorporação de %H-timidina igualmente. (Exemplo 5) Indução de imunotolerância em paciente que recebeu transplante de órgão
[000131] Os testes foram conduzidos pelo mesmo método descrito em Satoru Todo et al. Hepatorogy, 64 (vol. 2), 632-643 (2016). Resu- midamente, as células T anérgicas que são específicas para um antí-
geno do doador são induzidas por cocultura de linfócitos coletados do baço ou do sangue periférico de um receptor, linfócitos derivados do doador irradiados com radiação de 30 Gy, e anticorpo anti-CD80 hu- manizado e anticorpo anti-CD86 da subclasse IgG4, usados no Exem- plo 4. As células T anérgicas são administradas no dia 13, após a ci- rurgia, a um receptor que recebeu um transplante de fígado. A condi- ção é posteriormente acompanhada. (Exemplo 6) Anticorpos anti-CD80 humana quimérico e anti-CD86 hu- mana quimérico (subclasse I9G1) Preparação de anticorpos
[000132] Os inventores tentaram melhorar os anticorpos anti-CD80 humana e os anticorpos anti-CD86 humana para uso em terapia celu- lar. Especificamente, com base no anticorpo anti-CD80 humana de camundongo e no anticorpo anti-CD86 humana de camundongo da eBioscience, foram preparados anticorpos quiméricos de cada um de- les. O anticorpo anti-CD80 humana quimérico preparado (subclasse IgG1) consiste em uma cadeia pesada com a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 38 e uma cadeia leve com a sequência de amino- ácidos da SEQ ID NO: 40. O anticorpo anti-CD86 humana quimérico preparado (subclasse I9gG1) consiste em uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42 e uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44. Um plasmídeo que os codifica foi encomendado a um fornecedor (TPG Biologics, Inc. Tai- wan) e expresso a partir de uma célula CHO, e os anticorpos foram produzidos/purificados. Reação de linfócitos mistos (MLR) na presença de anticorpos anti- CD80 humana quiméricos e anti-CD86 quiméricos (subclasse I9G1) Produção do IFNy
[000133] Quase da mesma maneira que o método descrito no Exemplo 1, as células mononucleares (PBMCs) foram separadas do sangue periférico humano de dois voluntários (um foi especificado co- mo um doador e o outro foi especificado como um receptor), usando o Meio de separação de Linfócitos da Promo cells (Cat. No. C—44010), e ajustadas de modo que a concentração fosse 2 x 106 células/ml em soro humano a 2% tipo AB da Biowest (agrupamento) contendo meio ALyS505N-O (Cell Science & Technology Institute (CSTI) 1020P10). Uma radiação de 30 Gy (raios y) foi irradiada sobre as PBMCs do do- ador.
[000134] O sistema experimental foi construído como se segue.
1. "virgens": PBMCs do receptor, 1 x 106 células
2. "allo": PBMCs do receptor, 1 x 106 células e PBMCs do doador, 1 x 10º células
3. "anti-CD80 quimérico": PBMCs do receptor, 1 x 106 célu- las e anticorpo anti-CD80 humana quimérico, 4 ug
4. "anti-CD86 quimérico": PBMCs do receptor, 1 x 106 célu- las e anticorpo anti-CD86 humana quimérico, 4 ug
[000135] Os sistemas 1. a 4. foram colocados em cada poço de uma placa de 96 poços (Corning, Cat. No. 3799), de modo que o volume final da reação fosse 200 uL (a concentração final de anticorpos foi cerca de 20 ug/mL), e cultura foi iniciado em uma incubadora a 37ºC e 5% de CO». No dia 5 e no dia 6 do início da cultura, o sobrenadante foi coletado. A amostra coletada foi diluída 20 a 25 vezes e, em seguida, a medição foi realizada usando o Human IFNy ELISA MAXº Deluxe da Biolegend, Cat. 430104. Resultados
[000136] Como mostrado na Figura 8, nem o anticorpo anti-CD80 humana quimérico, nem o anticorpo anti-CD86 humana quimérico de- monstraram produção detectável de IFNy. Medição da quantidade de incorporação de %3H-timidina
[000137] Basicamente, os experimentos foram conduzidos de acordo com os métodos descritos nos Exemplos 1 e 4. Foram usados as PBMCs dos receptores e as PBMCs do doador que foram recentemen- te separados do sangue periférico humano, ou as criopreservadas a - 80ºC foram rapidamente descongeladas e usadas. Ambas as células fo- ram ajustadas de modo que a concentração fosse 4 x 10º células/ml em soro humano a 2% tipo AB da Biowest (agrupamento) contendo meio ALyS505N-O (Cell Science & Technology Institute (CSTI) 1020P10). Uma radiação de 20 Gy (raios y) foi irradiada sobre as PBMCs do do- ador. As PBMCs do doador e as PBMCs dos receptores foram mistu- radas a 1:1, e um anticorpo anti-CD80 humana quimérico e um anti- corpo anti-CD86 humana quimérico foram adicionados à mistura, de modo que cada concentração final fosse 10 ug/ml. As células foram cultivadas por 7 dias, em uma incubadora a 37ºC e 5% de CO;, sobre uma placa de Petri de 6 cm a 10 cm (volume da cultura de 6 a 18 mL).
[000138] No dia 7 do início da cultura, as PBMCs dos receptores cul- tivadas foram coletadas por centrifugação e ajustadas para 4 x 10º cé- lulas/mL no meio descrito acima. Às PBMCs dos receptores cultivados foram adicionadas as PBMCs do doador recém-preparadas e irradia- das, de modo que a proporção de contagem de células fosse 2:1, e um anticorpo anti-CD80 humana quimérico e um anticorpo anti-CD86 hu- mana quimérico foram adicionados, de modo que cada um tivesse um concentração final de 5 ug/ml. As células foram cultivadas durante 7 dias, sob as mesmas condições conforme acima mencionadas (densi- dade celular: 4 x 10º células/mL).
[000139] No dia 14 do início da cultura, as células induzidas foram coletadas por centrifugação. Cada célula foi misturada na seguinte proporção:
1. "virgens": PBMCs dos receptores, 4 x 10º células
2. "“allo"”: PBMCs dos receptores, 4 x 10º células e PBMCs do doador, 4 x 10º células
3. "1:1/2": PBMCs dos receptores, 4 x 10º células, PBMCs do doador, 4 x 10º células, e células induzidas 2 x 10º células
4. "1:1/4": PBMCs dos receptores, 4 x 10º células, PBMCs do doador, 4 x 10º células, e células induzidas 1 x 10º células
5. "1:1/8": PBMCs dos receptores, 4 x 10º células, PBMCs do doador, 4 x 10º células, e células induzidas 5 x 10º células
6. "1:1/16": PBMCs dos receptores, 4 x 10º células, PBMCs do doador, 4 x 10º células, e células induzidas 2,5 x 10º células
[000140] Cada um dos sistemas 1. a 6. foi distribuído em 4 poços de uma placa de 96 poços (Corning, Cat. No. 3799) e cocultivado em uma incubadora a 37ºC e 5% de CO». No dia 4 do início da cocultura, a ?H- timidina (10 ul) foi adicionada. No dia 5 do início da cocultura (16 a 20 horas após a adição da incorporação de *H-timidina), a *H-timidina, na cultura, foi removida para medir a quantidade de incorporação de 3H- timidina. Resultados
[000141] Conforme mostrado na Figura 9, as células induzidas redu- ziram a quantidade de incorporação de %H-timidina em uma maneira dependente da dose (isto é, a ativação das células imunes foi suprimi- da). Portanto, os anticorpos anti-CD80 humana quiméricos e os anti- corpos anti-CD86 humana quiméricos foram demonstrados serem an- ticorpos adequados para a terapia celular, os quais podem induzir as células T anérgicas sem causar produção prejudicial de IFNy. Observação
[000142] Conforme descrito acima, a presente invenção é exemplifi- cada pelo uso de suas modalidades preferidas. No entanto, entende- se que o escopo da presente invenção deve ser interpretado com base apenas nas Reivindicações. Entende-se também que qualquer paten- te, qualquer pedido de patente e quaisquer outras referências citadas neste documento devam ser incorporadas neste documento por refe-
rência, da mesma maneira que os conteúdos são especificamente descritos neste documento. O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Japonesa No. 2018-118996 (depositado em 22 de junho de 2018). Entende-se que o seu conteúdo (pode ser o documen- to completo) é incorporado neste documento por referência. Além dis- so, uma parte ou todo o conteúdo do Pedido de Patente Japonesa No. 2018-119001 e do Pedido de Patente Japonesa No. 2018-1190031 (ambos depositados em 22 de junho de 2018) e dos pedidos internaci- onais que reivindicam prioridade aos mesmos é incorporado neste do- cumento por referência. Aplicabilidade Industrial
[000143] A presente invenção proporciona um anticorpo com uma estrutura tendo uma característica de melhorar o efeito da imunotole- rância ou não atenuar o efeito da imunotolerância. É proporcionada uma tecnologia que pode ser utilizada em indústrias (farmacêuticas) relacionadas a formulações ou similares, com base em tal tecnologia. Texto Livre da Listagem de Sequências SEQ ID NO: 1: sequência de ácidos nucleicos da cadeia pesada do anticorpo anti-CD80 (I9G2) SEQ ID NO: 2: sequência de aminoácidos da cadeia pesa- da do anticorpo anti-CD80 (I9G2) SEQ ID NO: 3: sequência de ácidos nucleicos da cadeia le- ve do anticorpo anti-CD80 (I9G2) SEQ ID NO: 4: sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo anti-CD80 (I9G2) SEQ ID NO: 5: sequência de ácidos nucleicos da cadeia pesada do anticorpo anti-CD80 (Ig9G4) SEQ ID NO: 6: sequência de aminoácidos da cadeia pesa- da do anticorpo anti-CD80 (I9gG4) SEQ ID NO: 7: sequência de ácidos nucleicos da cadeia le-
ve do anticorpo anti-CD80 (IgG4)
SEQ ID NO: 8: sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo anti-CD80 (I9G4)
SEQ ID NO: 9: sequência de ácidos nucleicos da cadeia pesada do anticorpo anti-CD86 (I9G2)
SEQ ID NO: 10: sequência de aminoácidos da cadeia pe- sada do anticorpo anti-CD86 (I9G2)
SEQ ID NO: 11: sequência de ácidos nucleicos da cadeia leve do anticorpo anti-CD86 (I9G2)
SEQ ID NO: 12: sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo anti-CD86 (I9G2)
SEQ ID NO: 13: sequência de ácidos nucleicos da cadeia pesada do anticorpo anti-CD86 (I9G4)
SEQ ID NO: 14: sequência de aminoácidos da cadeia pe- sada do anticorpo anti-CD86 (I9G4)
SEQ ID NO: 15: sequência de ácidos nucleicos da cadeia leve do anticorpo anti-CD86 (I9G4)
SEQ ID NO: 16: sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo anti-CD86 (I9G4)
SEQ ID NO: 17: sequência de ácidos nucleicos da região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-CD80 (I9G2)
SEQ ID NO: 18: sequência de aminoácidos da região variá- vel da cadeia pesada do anticorpo anti-CD80 (I9G2)
SEQ ID NO: 198: sequência de ácidos nucleicos da região variável da cadeia leve do anticorpo anti-CD80 (I9G2)
SEQ ID NO: 20: sequência de aminoácidos da região variá- vel da cadeia leve do anticorpo anti-CD80 (I9G2)
SEQ ID NO: 21: sequência de ácidos nucleicos da região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-CD86 (I9G2)
SEQ ID NO: 22: sequência de aminoácidos da região variá-
vel da cadeia pesada do anticorpo anti-CD86 (I9G2)
SEQ ID NO: 23: sequência de ácidos nucleicos da região variável da cadeia leve do anticorpo anti-CD86 (I9G2)
SEQ ID NO: 24: sequência de aminoácidos da região variá- vel da cadeia leve do anticorpo anti-CD86 (I9G2)
SEQ ID NO: 25: sequência de aminoácidos da CDRH1 do anticorpo anti-CD80 (I9G2)
SEQ ID NO: 26: sequência de aminoácidos da CDRH2 do anticorpo anti-CD80 (I9G2)
SEQ ID NO: 27: sequência de aminoácidos da CDRH3 do anticorpo anti-CD80 (I9G2)
SEQ ID NO: 28: sequência de aminoácidos da CDRL1 do anticorpo anti-CD80 (I9G2)
SEQ ID NO: 29: sequência de aminoácidos da CDRL2 do anticorpo anti-CD80 (I9G2)
SEQ ID NO: 30: sequência de aminoácidos da CDRL3 do anticorpo anti-CD80 (I9G2)
SEQ ID NO: 31: sequência de aminoácidos da CDRH1 de anticorpo anti-CD86 (I9G2)
SEQ ID NO: 32: sequência de aminoácidos da CDRH2 do anticorpo anti-CD86 (I9G2)
SEQ ID NO: 33: sequência de aminoácidos da CDRH3 do anticorpo anti-CD86 (I9G2)
SEQ ID NO: 34: sequência de aminoácidos da CDRL1 do anticorpo anti-CD86 (I9G2)
SEQ ID NO: 35: sequência de aminoácidos da CDRL2 do anticorpo anti-CD86 (I9G2)
SEQ ID NO: 36: sequência de aminoácidos da CDRL3 do anticorpo anti-CD86 (I9G2)
SEQ ID NO: 37: sequência de ácidos nucleicos da cadeia pesada do anticorpo anti-CD80 quimérico
SEQ ID NO: 38: sequência de aminoácidos da cadeia pe- sada do anticorpo anti-CD80 quimérico
SEQ ID NO: 39: sequência de ácidos nucleicos da cadeia leve do anticorpo anti-CD80 quimérico
SEQ ID NO: 40: sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo anti-CD80 quimérico
SEQ ID NO: 41: sequência de ácidos nucleicos da cadeia pesada do anticorpo anti-CD86 quimérico
SEQ ID NO: 42: sequência de aminoácidos da cadeia pe- sada do anticorpo anti-CD86 quimérico
SEQ ID NO: 43: sequência de ácidos nucleicos da cadeia leve do anticorpo anti-CD86 quimérico
SEQ ID NO: 44: sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo anti-CD86 quimérico
SEQ ID NO: 45: sequência de ácidos nucleicos da região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-CD80 quimérico
SEQ ID NO: 46: sequência de aminoácidos da região variá- vel da cadeia pesada do anticorpo anti-CD80 quimérico
SEQ ID NO: 47: sequência de ácidos nucleicos da região variável da cadeia leve do anticorpo anti-CD80 quimérico
SEQ ID NO: 48: sequência de aminoácidos da região variá- vel da cadeia leve do anticorpo anti-CD80 quimérico
SEQ ID NO: 48: sequência de ácidos nucleicos da região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-CD86 quimérico
SEQ ID NO: 50: sequência de aminoácidos da região variá- vel da cadeia pesada do anticorpo anti-CD86 quimérico
SEQ ID NO: 51: sequência de ácidos nucleicos da região variável da cadeia leve do anticorpo anti-CD86 quimérico
SEQ ID NO: 52: sequência de aminoácidos da região variá-
vel da cadeia leve do anticorpo anti-CD86 quimérico
SEQ ID NO: 53: sequência de aminoácidos da CDRH1 do anticorpo anti-CD80 quimérico
SEQ ID NO: 54: sequência de aminoácidos da CDRH2 do anticorpo anti-CD80 quimérico
SEQ ID NO: 55: sequência de aminoácidos da CDRH3 do anticorpo anti-CD80 quimérico
SEQ ID NO: 56: sequência de aminoácidos da CDRL1 do anticorpo anti-CD80 quimérico
SEQ ID NO: 57: sequência de aminoácidos da CDRL2 do anticorpo anti-CD80 quimérico
SEQ ID NO: 58: sequência de aminoácidos da CDRL3 do anticorpo anti-CD80 quimérico
SEQ ID NO: 59: sequência de aminoácidos da CDRH1 do anticorpo anti-CD86 quimérico
SEQ ID NO: 60: sequência de aminoácidos da CDRH2 do anticorpo anti-CD86 quimérico
SEQ ID NO: 61: sequência de aminoácidos da CDRH3 do anticorpo anti-CD86 quimérico
SEQ ID NO: 62: sequência de aminoácidos da CDRL1 do anticorpo anti-CD86 quimérico
SEQ ID NO: 63: sequência de aminoácidos da CDRL2 do anticorpo anti-CD86 quimérico
SEQ ID NO: 64: sequência de aminoácidos da CDRL3 do anticorpo anti-CD86 quimérico.
Claims (41)
1. Anticorpo ou sua variante que inibe uma interação entre CD80 e/ou CD86 expressa sobre uma superfície de uma célula e CD28 expressa sobre uma superfície de outra célula, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou a sua variante não induz substancial- mente a produção de uma citocina por imunoestimulação.
2. Anticorpo ou sua variante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a citocina compreende o interferon y.
3. Anticorpo ou sua variante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo quimérico.
4. Anticorpo ou sua variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que uma subclas- se do anticorpo é a IgG1.
5. Anticorpo ou sua variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que tem uma ca- deia pesada com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 38 ou 42, e uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 40 ou 44.
6. Anticorpo ou sua variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma VH compreendendo a CDRH1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 53, a CDRH2 da sequência de aminoáci- dos apresentada na SEQ ID NO: 54 e a CDRH3 da sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 55, e uma VL compreendendo a CDRL1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 56, a CDRL2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 57 e a CDRL3 apresentada na SEQ ID NO: 58; ou (b) uma VH compreendendo a CDRH1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 59, a CDRH2 da sequência de aminoáci- dos apresentada na SEQ ID NO: 60 e a CDRH3 da sequência de ami-
noácidos apresentada na SEQ ID NO: 61, e uma VL compreendendo a CDRL1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 62, a CDRL2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 63 e a CDRL3 apresentada na SEQ ID NO: 64.
7. Anticorpo ou sua variante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma VH tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 46 ou uma sequência variante dela, e uma VL tendo a sequên- cia de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 48 ou uma sequência variante dela; ou (b) uma VH tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 50 ou uma sequência variante dela, e uma VL tendo a sequên- cia de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 52 ou uma sequência variante dela.
8. Anticorpo ou sua variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que uma parte Fc do anticorpo é uma parte que não induz substancialmente a produção de uma citocina por imunoestimulação.
9. Anticorpo ou sua variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 8, caracterizado pelo fato de que uma sub- classe do anticorpo é a IgG2 ou a IgG4.
10. Anticorpo ou sua variante, de acordo com a reivindica- ção 9, caracterizado pelo fato de que a subclasse do anticorpo é a I9G4.
11. Anticorpo ou sua variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a variante do anticorpo é uma variante não tendo uma parte Fc do anticorpo.
12. Anticorpo ou sua variante, de acordo com a reivindica- ção 11, caracterizado pelo fato de que a variante do anticorpo é um anticorpo Fab, um anticorpo F(ab'),, um anticorpo Fab', um anticorpo
Fv ou um anticorpo scFv.
13. Anticorpo ou sua variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que tem uma ca- pacidade de induzir a imunotolerância.
14. Anticorpo ou sua variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a célula que expressa CD80 e/ou CD86 é uma célula apresentadora de antígeno e a outra célula que expressa CD28 é uma célula T.
15. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou a sua vari- ante é um anticorpo anti-CD80 antagonístico, um anticorpo anti-CD86 antagonístico, um anticorpo anti-CD28 antagonístico ou um anticorpo biespecífico antagonístico para CD80 e CD86, ou uma variante deles.
16. Anticorpo ou sua variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que é um anti- corpo humanizado ou um anticorpo humano, ou uma variante dele.
17. Anticorpo ou sua variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 8 a 16, caracterizado pelo fato de que com- preende uma parte Fc de IgG2 ou IgG4 de um anticorpo humano.
18. Anticorpo ou sua variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 8 a 17, caracterizado pelo fato de que com- preende uma parte Fc de IgG4 de um anticorpo humano.
19. Anticorpo ou sua variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 8 a 18, caracterizado pelo fato de que com- preende: (a) uma VH compreendendo a CDRH1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 25, a CDRH2 da sequência de aminoáci- dos apresentada na SEQ ID NO: 26 e a CDRH3 da sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 27, e uma VL compreendendo a CDRL1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 28,
a CDRL2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 29 e a CDRL3 apresentada na SEQ ID NO: 30; ou (b) uma VH compreendendo a CDRH1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 31, a CDRH2 da sequência de aminoáci- dos apresentada na SEQ ID NO: 32 e a CDRH3 da sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 33, e uma VL compreendendo a CDRL1 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 34, a CDRL2 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: e a CDRL3 apresentada na SEQ ID NO: 36.
20. Anticorpo ou sua variante, de acordo com a reivindica- ção 19, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma VH tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18 ou uma sequência variante dela, e uma VL tendo a sequên- cia de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 20 ou uma sequência variante dela; ou (b) uma VH tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 22 ou uma sequência variante dela, e uma VL tendo a sequên- cia de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 24 ou uma sequência variante dela.
21. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica a sequência de aminoácidos ou uma parte dela do anti- corpo ou da sua variante como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 20.
22. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindica- ção 21, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um polinucleotídeo que codifica uma VH, tendo a sequência de nu- cleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 45, e um polinucleotídeo que codifica uma VL, tendo a sequência de nucleotí- deos apresentada na SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 47; ou (b) um polinucleotídeo que codifica uma VH, tendo a sequência de nu-
cleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 49, e um polinucleotídeo que codifica uma VL, tendo a sequência de nucleotí- deos apresentada na SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 51.
23. Vetor, caracterizado pelo fato de que tem a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 21 ou 22.
24. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 21 ou 22 ou o vetor como definido na reivindicação 23.
25. Método de fabricação do anticorpo ou da variante dele como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracteri- zado pelo fato de que compreende a cultura da célula como definida na reivindicação 24.
26. Célula, caracterizada pelo fato de que tem imunotole- rância induzida com o anticorpo ou a sua variante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20.
27. Célula, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a imunotolerância é induzida por mistura do anticorpo ou da sua variante, uma célula derivada de um paciente e um antígeno que não seja derivado do paciente ou um material que contém o antí- geno.
28. Composição para a preparação de uma célula tendo imunotolerância induzida, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um dos anticorpos ou das suas variantes como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 20.
29. Composição, de acordo com a reivindicação 28, carac- terizada pelo fato de que compreende um anticorpo anti-CD80 antago- nístico, um anticorpo anti-CD86 antagonístico, um anticorpo anti-CD28 antagonístico ou um anticorpo biespecífico antagonístico para CD80 e CDB86, ou uma variante deles, ou qualquer combinação deles.
30. Método para fabricar uma célula para tratar ou prevenir uma doença, distúrbio ou condição causada por um antígeno que não é derivado de um paciente, caracterizado pelo fato de que compreen- de a mistura do anticorpo ou da variante dele como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 20, uma célula derivada do paciente e um antígeno que não seja derivado do paciente ou um material que contém o antígeno.
31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracteriza- do pelo fato de que a doença, o distúrbio ou a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em rejeição de enxerto, alergia, doença autoimune, doença do enxerto contra hospedeiro e rejeição imunológi- ca causada por transplante de uma célula iPS ou uma célula ES e uma célula, tecido ou órgão derivado das referidas células.
32. Método, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, carac- terizado pelo fato de que o material que contém um antígeno é uma célula.
33. Célula, caracterizada pelo fato de que é fabricada pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 32.
34. Célula, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que compreende uma célula T.
35. Agente de terapia celular, caracterizado pelo fato de que compreende uma célula que tem imunotolerância induzida com o anticorpo ou a sua variante como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 20, uma célula fabricada pelo método como definido na reivindicação 30 ou 31 ou a célula como definida na reivindicação 26, 27, 33 ou 34
36. Composição para tratar ou prevenir uma doença, dis- túrbio ou condição causada por um antígeno que não é derivado de um paciente, caracterizada pelo fato de que compreende uma célula que tem imunotolerância induzida com o anticorpo ou a sua variante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, uma célula fabricada pelo método como definido na reivindicação 30 ou 31 ou a célula como definida na reivindicação 26, 27, 33 ou 34.
37. Composição, de acordo com a reivindicação 36, carac- terizada pelo fato de que a doença, o distúrbio ou a condição é seleci- onada a partir do grupo que consiste em rejeição de enxerto, alergia, doença autoimune, doença do enxerto contra hospedeiro e rejeição imunológica causada por transplante de uma célula iPS ou uma célula ES e uma célula, tecido ou órgão derivado das referidas células.
38. Composição, de acordo com a reivindicação 37, carac- terizada pelo fato de que a rejeição é particularizada por um órgão transplantado ser um rim, um fígado, um coração, pele, um pulmão, um pâncreas, um esôfago, um estômago, um intestino delgado, um intestino grosso, um nervo, sangue, uma célula sanguínea, incluindo uma célula do sistema imunológico, um osso, uma cartilagem, um va- so sanguíneo, uma córnea, um globo ocular ou uma medula óssea.
39. Método para tratar ou prevenir uma doença, distúrbio ou condição, causada por um antígeno que não é derivado de um pacien- te, no paciente, caracterizado pelo fato de que compreende adminis- trar ao paciente uma quantidade efetiva de uma célula que tem imu- notolerância induzida com o anticorpo ou a sua variante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, uma célula fabricada pelo método como definido na reivindicação 30 ou 31, ou a célula como de- finida na reivindicação 26, 27, 33 ou 34.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracteriza- do pelo fato de que a doença, o distúrbio ou a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em rejeição de enxerto, alergia, doença autoimune, doença do enxerto contra hospedeiro e rejeição imunológi- ca causada por transplante de uma célula iPS ou uma célula ES e uma célula, tecido ou órgão derivado das referidas células.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracteriza-
do pelo fato de que a rejeição é particularizada por um órgão trans- plantado ser um rim, um fígado, um coração, pele, um pulmão, um pâncreas, um esôfago, um estômago, um intestino delgado, um intes- tino grosso, um nervo, sangue, uma célula sanguínea, incluindo uma célula do sistema imunológico, um osso, uma cartilagem, um vaso sanguíneo, uma córnea, um globo ocular ou uma medula óssea.
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