KR20210025062A - 면역 관용을 유도하는 항체, 유도된 림프구, 또한 유도된 림프구를 이용하는 세포 치료제 치료법 - Google Patents

면역 관용을 유도하는 항체, 유도된 림프구, 또한 유도된 림프구를 이용하는 세포 치료제 치료법 Download PDF

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고이치로 우치다
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가부시키가이샤 준텐 바이오
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Abstract

본 개시는 면역 관용을 유도하는 항체, 유도된 림프구, 또한 유도된 림프구를 이용하는 세포 치료제 치료법을 제공한다. 특히 본 개시는 어떤 세포의 세포 표면에 발현하는 CD80 및/또는 CD86과 다른 세포의 세포 표면에 발현하는 CD28의 상호작용을 저해하는 항체로서, 면역 활성화에 의해 유도되는 사이토카인을 실질적으로 유도하지 않는 항체를 제공한다. 특정의 실시형태에서는 항체의 Fc 부분이 면역 활성화에 의해 유도되는 사이토카인을 실질적으로 생산하지 않는 부분이다.

Description

면역 관용을 유도하는 항체, 유도된 림프구, 또한 유도된 림프구를 이용하는 세포 치료제 치료법
본 개시는 면역 관용에 관한 신규 기술에 관한 것이다. 보다 특정하면 본 개시는 면역 관용을 유도하는 항체, 유도된 림프구, 또한 유도된 림프구를 이용하는 세포 치료제 치료법에 관한 것이다.
간장 이식은 말기 간부전 환자에 대한 최종적인 처치로서 널리 사용되어 왔다. 매년 일본 외에서는 20,000 이상의 증례가 있고, 일본에서는 500을 넘는 증례가 있다.
이식은 말기의 신장, 심장, 간장, 췌장 등의 장기부전에 대해 선택되는 주요 처치 중 하나로서, 최근에 이식 거절 반응의 처치의 현저한 진보에도 불구하고 면역 억제 요법(regimen) 없이는 이식의 대부분은 최종적으로 거절된다. 연속적인 약물 요법에 의존하는 현재의 면역 억제 요법은 약물로는 이식에 대해 명확하게 그것만의 반응뿐만 아니라 모든 면역 반응을 억제하기 때문에 장기 이식 환자에 감염증이나 암에 대한 감수성의 증가를 일으키기 쉽게 한다.
재생 의료도 주목받지만 유도성 다능성 줄기세포(iPS 세포) 등을 이용해도 최종적으로는 자기 유래의 세포가 아닌 한은 면역 거절 반응이 일어날 수 있기 때문에 면역 관용의 기술은 주목받고 있다.
이 면역 관용을 유도하는 기술로서 T세포의 항원 특이적인 불면역 응답(아네르기, anergy)의 유도가 있다. 구체적으로는 항원 제시 세포 상의 CD80/CD86과 미활성화(나이브) T세포 상의 CD28의 상호작용을 저해하는 항체를 장기 이식 환자에 직접 투여하여 생체 내에서 공여자 항원 특이적 아네르기를 유도하는 기술(특허문헌 1)이나 동일한 항체의 존재하에서 수용자 세포와 방사선 조사한 공여자 세포를 공배양에 의해 체외로 공여자 항원 특이적 아네르기 세포를 유도하여 수용자에게 되돌리는 기술이 보고되어 있다(특허문헌 2, 특허문헌 3 및 비특허문헌 1~3).
특허문헌 1: 일본공표특허 2002-504120호 공보 특허문헌 2: 일본공표특허 2007-131598호 공보 특허문헌 3: 일본공표특허 2016-520081호 공보
비특허문헌 1: Satoru Todo et al. Hepatorogy, 64(vol.2), 632-643 (2016) 비특허문헌 2: Teraoka S, Koyama I, Bashuda H, Uchida K, Tonsho M, et al. (2017) J Transplant Res 2(1) p1-8 비특허문헌 3: Bashuda H et al., J. Clin. Invest. 115: 1896-1902 (2005).
본 발명자들은 CD80/CD86과 CD28의 상호작용을 저해하는 어떤 특정의 인간 Fc 영역을 갖는 항체를 이용한 불면역 응답(아네르기)의 유도를 시도한 결과, 대식세포, 호중구, NK(natural killer) 세포와 같은 면역계에 관여하는 세포와 결합함으로써 이들 세포를 활성화하여 면역 반응을 관장하는 인터루킨이나 인터페론(IFN) 등의 액성 인자 방출을 유도하는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 이들 액성 인자의 방출은 면역 관용과는 반대의 바람직하지 않은 면역계의 활성화를 유도하기 때문에 이들 세포에 결합하지 않는 인간 Fc 영역을 갖는 항체를 이용하여 불면역 응답(아네르기)의 유도를 조정함으로써 면역 관용 효과를 개선 또는 면역 관용 효과의 감약을 억제할 수 있는 것을 새로 발견하였다. 이에 의해 본 발명자들은 면역 관용 효과를 개선하거나 또는 면역 관용 효과를 감약시키지 않는 특징을 갖는 구조를 갖는 항체를 제공한다.
따라서, 본 개시는 이하를 제공한다.
(1) 어떤 세포의 세포 표면에 발현하는 CD80 및/또는 CD86과, 다른 세포의 세포 표면에 발현하는 CD28의 상호작용을 저해하는 항체 또는 그 개변체로서, 면역 활성화에 의한 사이토카인의 생산을 실질적으로 유도하지 않는 항체 또는 그 개변체.
(2) 상기 사이토카인이 인터페론 γ를 포함하는, 상기 항목에 기재된 항체 또는 그 개변체.
(3) 키메라 항체인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체.
(4) 상기 항체의 서브클래스가 IgG1인, 상기 항목 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 개변체.
(5) 서열번호 38 또는 42에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 40 또는 44에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 갖는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체.
(6) (a) 서열번호 53에 기재된 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 54에 기재된 아미노산 서열의 CDRH2 및 서열번호 55에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 포함하는 VH, 및 서열번호 56에 기재된 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 57에 기재된 아미노산 서열의 CDRL2 및 서열번호 58에 기재된 CDRL3을 포함하는 VL 또는
(b) 서열번호 59에 기재된 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 60에 기재된 아미노산 서열의 CDRH2 및 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 포함하는 VH, 및 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열의 CDRL2 및 서열번호 64에 기재된 CDRL3을 포함하는 VL을 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체.
(7) (a) 서열번호 46에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VH 및 서열번호 48에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VL 혹은
(b) 서열번호 50에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VH 및 서열번호 52에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VL을 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체.
(8) 상기 항체의 Fc 부분이 면역 활성화에 의한 사이토카인의 생산을 실질적으로 유도하지 않는 부분인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체.
(9) 상기 항체의 서브클래스가 IgG2 또는 IgG4인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체.
(10) 상기 항체의 서브클래스가 IgG4인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체.
(11) 상기 항체의 개변체가 상기 항체의 Fc 부분이 결여되어 있는 개변체인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체.
(12) 상기 항체의 개변체가 Fab 항체, F(ab')2 항체, Fab' 항체, Fv 항체 또는 scFv 항체인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체.
(13) 면역 관용을 유도하는 능력을 갖는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체.
(14) CD80 및/또는 CD86을 발현하는 상기 세포가 항원 제시 세포이며, CD28을 발현하는 상기 다른 세포가 T세포인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체.
(15) 상기 항체 또는 그 개변체는 길항적(antagonistic) 항CD80 항체, 길항적 항CD86 항체, 길항적 항CD28 항체 또는 CD80 및 CD86에 대한 길항적 이중 특이성 항체 혹은 이들의 개변체인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체.
(16) 인간화 항체 또는 인간 항체 혹은 이들의 개변체 중 어느 하나인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체.
(17) 인간 항체의 IgG2 또는 IgG4의 Fc 부분을 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체.
(18) 인간 항체의 IgG4의 Fc 부분을 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체.
(19) (a) 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열의 CDRH2 및 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 포함하는 VH, 및 서열번호 28에 기재된 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열의 CDRL2 및 서열번호 30에 기재된 CDRL3을 포함하는 VL 또는
(b) 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 32에 기재된 아미노산 서열의 CDRH2 및 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 포함하는 VH, 및 서열번호 34에 기재된 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 35에 기재된 아미노산 서열의 CDRL2 및 서열번호 36에 기재된 CDRL3을 포함하는 VL을 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체.
(20) (a) 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VH 및 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VL
(b) 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VH 및 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VL을 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체.
(21) 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체의 아미노산 서열 또는 그 일부를 코딩하는 핵산 분자.
(22) (a) 서열번호 17 혹은 서열번호 45에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는, VH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 19 혹은 서열번호 47에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는, VL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는
(b) 서열번호 21 혹은 서열번호 49에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는, VH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 23 혹은 서열번호 51에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는, VL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자.
(23) 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자를 갖는 벡터.
(24) 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자 혹은 항목 23에 기재된 벡터를 포함하는 세포.
(25) 상기 항목 중 어느 하나의 세포를 배양하는 것을 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체의 제조 방법.
(26) 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체로 면역 관용이 유도된 세포.
(27) 상기 면역 관용은 상기 항체 또는 그 개변체와, 피험체 유래의 세포와, 이 피험체에서 유래하지 않는 항원 또는 이 항원의 함유물을 혼합함으로써 유도되는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 세포.
(28) 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체 중 적어도 하나를 포함하는, 면역 관용이 유도된 세포를 제작하기 위한 조성물.
(29) 길항적 항CD80 항체, 길항적 항CD86 항체, 길항적 항CD28 항체 혹은 CD80 및 CD86에 대한 길항적 이중 특이성 항체 또는 이들의 개변체 혹은 이들의 임의의 조합을 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(30) 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체와, 피험체 유래의 세포와, 이 피험체에서 유래하지 않는 항원 또는 이 항원의 함유물을 혼합하는 단계를 포함하는, 이 피험체에서 유래하지 않는 항원에 의해 발생하는 질환, 장해 또는 상태를 처치 또는 예방하기 위한 세포를 제조하기 위한 방법.
(31) 상기 질환, 장해 또는 상태는 이식 면역 거절 반응, 알레르기, 자기면역 질환, 이식편대숙주병과, iPS 세포 또는 ES 세포 및 이들 세포 유래의 세포, 조직 또는 장기의 이식에 의해 일어나는 면역 거절 반응으로 이루어지는 군에서 선택되는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(32) 상기 항원의 함유물은 세포인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(33) 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법으로 제조되는 세포.
(34) T세포를 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 세포.
(35) 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체로 면역 관용이 유도된 세포, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법에 따라 제조되는 세포, 혹은 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 세포를 포함하는 세포 치료제.
(36) 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체로 면역 관용이 유도된 세포, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법에 따라 제조되는 세포, 혹은 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 세포를 포함하는, 피험체에서 유래하지 않는 항원에 의해 발생하는 질환, 장해 또는 상태를 처치 또는 예방하기 위한 조성물.
(37) 상기 질환, 장해 또는 상태는 이식 면역 거절 반응, 알레르기, 자기면역 질환, 이식편대숙주병, iPS 세포 또는 ES 세포 및 이들 세포 유래의 세포, 조직 또는 장기의 이식에 의해 일어나는 면역 거절 반응으로 이루어지는 군에서 선택되는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(38) 상기 면역 거절은 이식을 받는 장기가 신장, 간장, 심장, 피부, 폐, 췌장, 식도, 위, 소장, 대장, 신경, 혈액, 면역계 세포를 포함하는 혈구 세포, 뼈, 연골, 혈관, 각막, 안구 또는 골수인 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(39) 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체로 면역 관용이 유도된 세포, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법에 따라 제조되는 세포, 혹은 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 세포의 유효량을 피험체에 투여하는 공정을 포함하는, 피험체에서 이 피험체에서 유래하지 않는 항원에 의해 발생하는 질환, 장해 또는 상태를 처치 또는 예방하기 위한 방법.
(40) 상기 질환, 장해 또는 상태는 이식 면역 거절 반응, 알레르기, 자기면역 질환, 이식편대숙주병, iPS 세포 또는 ES 세포 및 이들 세포 유래의 세포, 조직 또는 장기의 이식에 의해 일어나는 면역 거절 반응으로 이루어지는 군에서 선택되는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(41) 상기 면역 거절은 이식을 받는 장기가 신장, 간장, 심장, 피부, 폐, 췌장, 식도, 위, 소장, 대장, 신경, 혈액, 면역계 세포를 포함하는 혈구 세포, 뼈, 연골, 혈관, 각막, 안구 또는 골수인 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(39A) 피험체에서 이 피험체에서 유래하지 않는 항원에 의해 발생하는 질환, 장해 또는 상태를 처치 또는 예방하기 위한 의약을 제조하기 위한, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체로 면역 관용이 유도된 세포, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법에 따라 제조되는 세포, 혹은 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 세포의 사용.
(40A) 상기 질환, 장해 또는 상태는 이식 면역 거절 반응, 알레르기, 자기면역 질환, 이식편대숙주병, iPS 세포 또는 ES 세포 및 이들 세포 유래의 세포, 조직 또는 장기의 이식에 의해 일어나는 면역 거절 반응으로 이루어지는 군에서 선택되는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 사용.
(41A) 상기 면역 거절은 이식을 받는 장기가 신장, 간장, 심장, 피부, 폐, 췌장, 식도, 위, 소장, 대장, 신경, 혈액, 면역계 세포를 포함하는 혈구 세포, 뼈, 연골, 혈관, 각막, 안구 또는 골수인 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 사용.
(39B) 피험체에서 이 피험체에서 유래하지 않는 항원에 의해 발생하는 질환, 장해 또는 상태를 처치 또는 예방하기 위한 의약을 제조하기 위한, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 개변체로 면역 관용이 유도된 세포, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법에 따라 제조되는 세포, 혹은 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 세포.
(40B) 상기 질환, 장해 또는 상태는 이식 면역 거절 반응, 알레르기, 자기면역 질환, 이식편대숙주병, iPS 세포 또는 ES 세포 및 이들 세포 유래의 세포, 조직 또는 장기의 이식에 의해 일어나는 면역 거절 반응으로 이루어지는 군에서 선택되는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 세포.
(41B) 상기 면역 거절은 이식을 받는 장기가 신장, 간장, 심장, 피부, 폐, 췌장, 식도, 위, 소장, 대장, 신경, 혈액, 면역계 세포를 포함하는 혈구 세포, 뼈, 연골, 혈관, 각막, 안구 또는 골수인 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 세포.
본 개시는 이하도 제공한다.
(A1) 어떤 세포의 세포 표면에 발현하는 CD80 및/또는 CD86과, 다른 세포의 세포 표면에 발현하는 CD28의 상호작용을 저해하는 항체로서, 면역 활성화에 의한 사이토카인의 생산을 실질적으로 유도하지 않는 항체.
(A2) 상기 사이토카인이 인터페론 γ를 포함하는, (A1)에 기재된 항체.
(A3) 상기 항체의 Fc 부분이 면역 활성화에 의한 사이토카인의 생산을 실질적으로 유도하지 않는 부분인, (A1) 또는 (A2)에 기재된 항체.
(A4) 상기 항체의 서브클래스가 IgG2 또는 IgG4인, (A1)~(A3) 중 어느 한 항에 기재된 항체.
(A5) 상기 항체의 서브클래스가 IgG4인, (A4)에 기재된 항체.
(A6) 상기 항체가 Fc 부분이 결여되어 있는, (A1) 또는 (A2)에 기재된 항체.
(A7) 상기 항체가 Fab 항체, F(ab')2 항체, Fab' 항체, Fv 항체 또는 scFv 항체인, (A6)에 기재된 항체.
(A8) 면역 관용을 유도하는 능력을 갖는, (A1)~(A7) 중 어느 한 항에 기재된 항체.
(A9) CD80 및/또는 CD86을 발현하는 상기 세포가 항원 제시 세포이며, CD28을 발현하는 상기 다른 세포가 T세포인, (A1)~(A8) 중 어느 한 항에 기재된 항체.
(A10) 상기 항체는 길항적 항CD80 항체, 길항적 항CD86 항체, 길항적 항CD28 항체 또는 CD80 및 CD86에 대한 길항적 이중 특이성 항체인, (A1)~(A9) 중 어느 한 항에 기재된 항체.
(A11) 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체 중 어느 하나인, (A1)~(A10) 중 어느 한 항에 기재된 항체.
(A12) 인간 항체의 IgG2 또는 IgG4의 Fc 부분을 포함하는, (A1)~(A11) 중 어느 한 항에 기재된 항체.
(A13) 인간 항체의 IgG4의 Fc 부분을 포함하는, (A1)~(A12) 중 어느 한 항에 기재된 항체.
(A14) (a) 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열의 CDRH2 및 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 포함하는 VH, 및 서열번호 28에 기재된 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열의 CDRL2 및 서열번호 30에 기재된 CDRL3을 포함하는 VL 또는
(b) 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 32에 기재된 아미노산 서열의 CDRH2 및 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 포함하는 VH, 및 서열번호 34에 기재된 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 35에 기재된 아미노산 서열의 CDRL2 및 서열번호 36에 기재된 CDRL3을 포함하는 VL을 포함하는, (A1)~(A13) 중 어느 한 항에 기재된 항체.
(A15) (a) 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VH 및 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VL
(b) 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VH 및 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VL을 포함하는, (A14)에 기재된 항체.
(A16) (A1)~(A15) 중 어느 한 항에 기재된 항체의 아미노산 서열 또는 그 일부를 코딩하는 핵산 분자.
(A17) (a) 서열번호 17에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는, VH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 19에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는, VL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는
(b) 서열번호 21에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는, VH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 23에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는, VL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는, (A16)에 기재된 핵산 분자.
(A18) (A16) 또는 (A17)에 기재된 핵산 분자를 갖는 벡터.
(A19) (A16) 또는 (A17)에 기재된 핵산 분자 혹은 (A18)에 기재된 벡터를 포함하는 세포.
(A20) (A19)의 세포를 배양하는 것을 포함하는, (A1)~(A15) 중 어느 한 항에 기재된 항체의 제조 방법.
(A21) (A1)~(A15) 중 어느 한 항에 기재된 항체로 면역 관용이 유도된 세포.
(A22) 상기 면역 관용은 상기 항체와, 피험체 유래의 세포와, 이 피험체에서 유래하지 않는 항원 또는 이 항원의 함유물을 혼합함으로써 유도되는, (A21)에 기재된 세포.
(A23) (A1)~(A15) 중 어느 한 항에 기재된 항체 중 적어도 하나를 포함하는, 면역 관용이 유도된 세포를 제작하기 위한 조성물.
(A24) 길항적 항CD80 항체, 길항적 항CD86 항체, 길항적 항CD28 항체 또는 CD80 및 CD86에 대한 길항적 이중 특이성 항체 혹은 이들의 임의의 조합을 포함하는, (A23)에 기재된 조성물.
(A25) (A1)~(A15) 중 어느 한 항에 기재된 항체와, 피험체 유래의 세포와, 이 피험체에서 유래하지 않는 항원 또는 이 항원의 함유물을 혼합하는 단계를 포함하는, 이 피험체에서 유래하지 않는 항원에 의해 발생하는 질환, 장해 또는 상태를 처치 또는 예방하기 위한 세포를 제조하기 위한 방법.
(A26) 상기 질환, 장해 또는 상태는 이식 면역 거절 반응, 알레르기, 자기면역 질환, 이식편대숙주병과, iPS 세포 또는 ES 세포 및 이들 세포 유래의 세포, 조직 또는 장기의 이식에 의해 일어나는 면역 거절 반응으로 이루어지는 군에서 선택되는, (A25)에 기재된 방법.
(A27) 상기 항원의 함유물은 세포인, (A25) 또는 (A26)에 기재된 방법.
(A28) (A25)~(A27) 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조되는 세포.
(A29) T세포를 포함하는, (A28)에 기재된 세포.
(A30) (A1)~(A15) 중 어느 한 항에 기재된 항체로 면역 관용이 유도된 세포, (A25) 혹은 (A26)에 기재된 방법에 따라 제조되는 세포, 혹은 (A21), (A22), (A28) 혹은 (A29)에 기재된 세포를 포함하는 세포 치료제.
(A31) (A1)~(A15) 중 어느 한 항에 기재된 항체로 면역 관용이 유도된 세포, (A25) 혹은 (A26)에 기재된 방법에 따라 제조되는 세포, 혹은 (A21), (A22), (A28) 혹은 (A29)에 기재된 세포를 포함하는, 피험체에서 유래하지 않는 항원에 의해 발생하는 질환, 장해 또는 상태를 처치 또는 예방하기 위한 조성물.
(A32) 상기 질환, 장해 또는 상태는 이식 면역 거절 반응, 알레르기, 자기면역 질환, 이식편대숙주병, iPS 세포 또는 ES 세포 및 이들 세포 유래의 세포, 조직 또는 장기의 이식에 의해 일어나는 면역 거절 반응으로 이루어지는 군에서 선택되는, (A31)에 기재된 조성물.
(A33) 상기 면역 거절은 이식을 받는 장기가 신장, 간장, 심장, 피부, 폐, 췌장, 식도, 위, 소장, 대장, 신경, 혈액, 면역계 세포를 포함하는 혈구 세포, 뼈, 연골, 혈관, 각막, 안구 또는 골수인 것을 특징으로 하는, (A32)에 기재된 조성물.
(A34) (A1)~(A15) 중 어느 한 항에 기재된 항체로 면역 관용이 유도된 세포, (A23) 혹은 (A24)에 기재된 방법에 따라 제조되는 세포, 혹은 (A21), (A22), (A28) 혹은 (A29)에 기재된 세포의 유효량을 피험체에 투여하는 공정을 포함하는, 피험체에서 이 피험체에서 유래하지 않는 항원에 의해 발생하는 질환, 장해 또는 상태를 처치 또는 예방하기 위한 방법.
(A35) 상기 질환, 장해 또는 상태는 이식 면역 거절 반응, 알레르기, 자기면역 질환, 이식편대숙주병, iPS 세포 또는 ES 세포 및 이들 세포 유래의 세포, 조직 또는 장기의 이식에 의해 일어나는 면역 거절 반응으로 이루어지는 군에서 선택되는, (A34)에 기재된 방법.
(A36) 상기 면역 거절은 이식을 받는 장기가 신장, 간장, 심장, 피부, 폐, 췌장, 식도, 위, 소장, 대장, 신경, 혈액, 면역계 세포를 포함하는 혈구 세포, 뼈, 연골, 혈관, 각막, 안구 또는 골수인 것을 특징으로 하는, (A35)에 기재된 방법.
본 개시는 나아가 이하의 발명에도 관한 것이다.
(B1) 인간 Fc 영역을 갖는 항체로서, 세포 표면에 발현하는 CD80 또는 CD86과 다른 세포 표면에 발현하는 CD28의 상호작용을 저해할 수 있고, 또한 인간 PBMC에 의한 사이토카인 생산을 촉진하지 않는 것을 특징으로 하는 항체.
(B2) 항원 제시 세포 표면에 발현하는 CD80 또는 CD86과 T세포 표면에 발현하는 CD28의 상호작용을 저해할 수 있는, (B1)에 기재된 항체.
(B3) 항원 또는 항원을 표면에 갖는 세포와 함께 PBMC에 접촉시킴으로써 그 항원에 대한 면역 관용을 유도할 수 있는, (B1) 또는 (B2)에 기재된 항체.
(B4) 사이토카인이 IFNγ인 것을 특징으로 하는, (B1)~(B3) 중 어느 한 항에 기재된 항체.
(B5) 항CD80 항체 또는 항CD86 항체인, (B1)~(B4) 중 어느 한 항에 기재된 항체.
(B6) 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, (B1)~(B5) 중 어느 한 항에 기재된 항체.
(B7) 단클론(monoclonal) 항체인, (B1)~(B6) 중 어느 한 항에 기재된 항체.
(B8) 서브클래스가 IgG2 또는 IgG4인, (B1)~(B7) 중 어느 한 항에 기재된 항체.
(B8A) 서브클래스가 IgG1인, (B1)~(B7) 중 어느 한 항에 기재된 항체.
(B8B) 서열번호 38, 서열번호 42에서 선택되는 하나의 서열번호에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 갖는, (B8A)에 기재된 항체.
(B8C) 서열번호 38에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 서열번호 40에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 가지거나 또는
서열번호 42에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 서열번호 44에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 갖는, (B8B)에 기재된 항체.
(B8D) 서열번호 55 또는 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 갖는, (B1)~(B7), (B8A)~(B8C) 중 어느 한 항에 기재된 항체.
(B8E) (B8D)에 기재된 항체로서,
(Bi) 서열번호 53에 기재된 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 54에 기재된 아미노산 서열의 CDRH2, 서열번호 55에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 갖는 항체 혹은
(Bii) 서열번호 59에 기재된 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 60에 기재된 아미노산 서열의 CDRH2, 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 갖는 항체.
(B8F) (B8E)의 (Bi)에 기재된 항체로서, 서열번호 56에 기재된 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 57에 기재된 아미노산 서열의 CDRL2, 서열번호 58에 기재된 아미노산 서열의 CDRL3을 갖는 항체 혹은
(B8E)의 (Bii)에 기재된 항체로서, 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열의 CDRL2, 서열번호 64에 기재된 아미노산 서열의 CDRL3을 갖는 항체.
(B8G) 서열번호 46 또는 서열번호 50에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(VH)을 갖는, (B8D)에 기재된 항체.
(B8H) 서열번호 46에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH를 가지며, 또한 서열번호 48에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 가지거나, 또는 서열번호 50에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH를 가지며, 또한 서열번호 52에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL을 갖는, (B8G)에 기재된 항체.
(B8I) 서열번호 38 또는 서열번호 42에서 선택되는 하나의 서열번호에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 갖는, (B8G)에 기재된 항체.
(B8J) 서열번호 38에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 서열번호 40에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 가지거나 또는
서열번호 42에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 서열번호 44에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 갖는, (B8I)에 기재된 항체.
(B9) 서열번호 27 또는 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 갖는, (B1)~(B8) 중 어느 한 항에 기재된 항체.
(B10) (B9)에 기재된 항체로서,
(Bi) 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열의 CDRH2, 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 갖는 항체 혹은
(Bii) 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 32에 기재된 아미노산 서열의 CDRH2, 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 갖는 항체.
(B11) (B10)의 (Bi)에 기재된 항체로서, 서열번호 28에 기재된 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열의 CDRL2, 서열번호 30에 기재된 아미노산 서열의 CDRL3을 갖는 항체 혹은
(B10)의 (Bii)에 기재된 항체로서, 서열번호 34에 기재된 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 35에 기재된 아미노산 서열의 CDRL2, 서열번호 36에 기재된 아미노산 서열의 CDRL3을 갖는 항체.
(B12) 서열번호 18 또는 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(VH)을 갖는, (B9)에 기재된 항체.
(B13) 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH를 가지며, 또한 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 가지거나, 또는 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH를 가지며, 또한 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL을 갖는, (B12)에 기재된 항체.
(B14) 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 10, 서열번호 14에서 선택되는 하나의 서열번호에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 갖는, (B12)에 기재된 항체.
(B15) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 가지거나
서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 가지거나
서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 가지거나 또는
서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 갖는, (B14)에 기재된 항체.
(B16) (B1)~(B15) 중 어느 한 항에 기재된 항체를 함유하는 의료용 조성물.
(B17) 항CD80 항체, 항CD86 항체를 함유하는, (B16)에 기재된 의료용 조성물.
(B18) 면역 관용을 유도하기 위해 이용되는, (B16) 또는 (B17)에 기재된 의료용 조성물.
(B19) 장기 이식을 받는 환자로부터 채취된 세포의 면역 관용을 유도하기 위해 이용되는, (B18)에 기재된 의료용 조성물.
(B20) 이식을 받는 장기가 심장, 신장 또는 간장인 것을 특징으로 하는, (B19) 또는 (B20)에 기재된 의료용 조성물.
(B21) 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환의 환자에 있어서 면역 관용을 유도하기 위해 이용되는, (B18)에 기재된 의료용 조성물.
(B22) (B12)~(B15) 중 어느 한 항에 기재된 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자.
(B23) 서열번호 1, 5, 9, 13에서 선택되는 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 VH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3, 7, 11, 15에서 선택되는 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 VL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는, (B22)에 기재된 핵산 분자.
(B24) (B22) 또는 (B23)에 기재된 핵산 분자를 갖는 벡터.
(B25) (B24)에 기재된 벡터를 갖는 숙주 세포.
(B26) (B25)의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, (B1)~(B15) 중 어느 한 항에 기재된 항체의 제조 방법.
(B27) (B1)~(B15) 중 어느 한 항에 기재된 항체와, 면역 관용을 유도하고자 하는 항원 또는 이 항원을 표면에 갖는 세포와, PBMC를 접촉시키는 것을 포함하는, PBMC의 상기 항원에 대한 면역 관용의 유도 방법.
(B28) ex vivo로 행해지는 것을 특징으로 하는, (B27)에 기재된 유도 방법.
(B29) PBMC가 장기 이식을 받는 환자로부터 채취된 세포인, (B27) 또는 (B28)에 기재된 방법.
(B30) PBMC가 자기면역 질환 또는 알레르기 질환의 환자로부터 채취된 세포인, (B27) 또는 (B28)에 기재된 방법.
(B31) (B27)~(B30) 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 면역 관용이 유도된 PBMC.
(B32) (B30)에 기재된 PBMC를 유효성 성분으로서 함유하는 세포 치료제.
(B33) 장기 이식에서의 거절 반응을 억제하기 위한, (B32)에 기재된 세포 치료제.
(B34) 이식을 받는 장기가 신장, 간장, 심장, 피부, 폐, 췌장, 식도, 위, 소장, 대장, 신경, 혈액, 면역계 세포를 포함하는 혈구 세포, 뼈, 연골, 혈관, 각막, 안구 또는 골수인 것을 특징으로 하는, (B33)에 기재된 세포 치료제.
(B35) 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환을 치료하기 위한, (B32)에 기재된 세포 치료제.
(B36) (B1)~(B15) 중 어느 한 항에 기재된 항체를 장기 이식을 받는 환자에 투여하는 것을 포함하는, 장기 이식에서의 거절 반응의 억제 방법.
(B37) 이식을 받는 장기가 신장, 간장, 심장, 피부, 폐, 췌장, 식도, 위, 소장, 대장, 신경, 혈액, 면역계 세포를 포함하는 혈구 세포, 뼈, 연골, 혈관, 각막, 안구 또는 골수인 것을 특징으로 하는, (B36)에 기재된 방법.
(B37) (B1)~(B15) 중 어느 한 항에 기재된 항체를 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환의 환자에 투여하는 것을 포함하는, 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환의 치료 방법.
(B38) (B32)~(B34) 중 어느 한 항에 기재된 세포 치료제를 장기 이식을 받는 환자에 투여하는 것을 포함하는, 장기 이식에서의 거절 반응의 억제 방법.
(B39) (B32) 또는 (B35)의 세포 치료제를 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환의 환자에 투여하는 것을 포함하는, 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환의 치료 방법.
(B40) 면역 관용이 유도된 PBMC를 환자에 투여하는 것을 더 포함하는, (B27)~(B30) 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(B41) 이식되는 장기에 대한 면역 관용이 유도된 환자 유래의 PBMC를 장기 이식을 받는 환자에 투여하는 것을 포함하는, (B40)에 기재된 방법.
(B42) 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환의 원인이 되는 항원에 대한 면역 관용이 유도된 환자 유래의 PBMC를 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환의 환자에 투여하는 것을 포함하는, (B40)에 기재된 방법.
본 개시에서 상기 하나 또는 복수의 특징은 명시된 조합에 더하여 추가로 조합하여 제공될 수 있는 것이 의도된다. 본 개시의 추가적인 실시형태 및 이점은 필요에 따라 이하의 상세한 설명을 읽고 이해하면 당업자에게 인식된다.
본 개시의 항체는 면역 관용의 유도능을 유지한 채로 IFNγ 생산을 억제한다. 특히 본 개시의 서브클래스 IgG2 또는 IgG4의 항체는 IFNγ를 생산하지 않고 면역 관용을 유도하는 세포를 제조할 수 있다.
도 1은 항인간 CD80 및 항CD86 항체(IgG1) 존재하에서의 혼합 림프구 반응(3H-티미딘 도입)의 결과를 나타낸다. Naive; 공여자 첨가 없음, 항체 첨가 없음, Allo; 공여자 첨가 있음, 항체 첨가 없음. 10, 1, 0, 1은 첨가한 각 항체의 농도(μg/ml)이다. 세로축은 항체 첨가 없음(Allo)을 기준으로 한 3H-티미딘 도입을 나타낸다.
도 2는 항인간 CD80 및 항CD86 항체(IgG1) 존재하에서의 혼합 림프구 반응(IFNγ 생산)의 결과를 나타낸다. 세로축은 배지 중의 농도(pg/ml)를 나타낸다.
도 3은 항인간 CD80 및 항CD86 항체(IgG1) 존재하에서의 혼합 림프구 반응(3H-티미딘 도입)의 결과를 나타낸다. 세로축은 항체 첨가 없음(Allo)을 기준으로 한 3H-티미딘 도입을 나타낸다.
도 4는 항인간 CD80 및 항CD86 항체(IgG1) 존재하에서의 혼합 림프구 반응(IFNγ 생산)의 결과를 나타낸다. 상단: 공여자 자극 있음, 하단: 공여자 자극 없음. *는 50000pg/mL 이상을 나타낸다. 세로축은 배지 중의 농도(pg/ml)를 나타낸다.
도 5는 항CD80 및 항CD86 항체(IgG2, IgG4) 존재하에서의 혼합 림프구 반응(3H-티미딘 도입)의 결과를 나타낸다. 세로축은 항체 첨가 없음(Allo)을 기준으로 한 3H-티미딘 도입을 나타낸다. 10, 3, 1은 첨가한 각 항체의 농도(μg/ml)이다.
도 6은 항CD80 및 항CD86 항체(IgG1, IgG2, IgG4) 존재하에서의 혼합 림프구 반응(IFNγ 생산)의 결과를 나타낸다. 세로축은 배지 중의 농도(pg/ml)를 나타낸다.
도 7은 항CD80 및 항CD86 항체(IgG1, IgG2, IgG4) 존재하에서 얻어진 세포 첨가시의 혼합 림프구 반응(3H-티미딘 도입)의 결과를 나타낸다. 세로축은 항체 첨가 없음(Allo)을 기준으로 한 3H-티미딘 도입을 나타낸다. 1/2, 1/4, 1/8은 나이브 반응 세포에 대한 항CD80 및 항CD86 항체(IgG1, IgG2, IgG4) 존재하에서 얻어진 세포의 혼합 비율이다.
도 8은 키메라 항CD80 항체 및 키메라 항CD86 항체 존재하에서의 혼합 림프구 반응(IFNγ 생산)의 결과를 나타낸다. 세로축은 배지 중의 농도(pg/ml)를 나타낸다.
도 9는 키메라 항CD80 항체 및 키메라 항CD86 항체 존재하에서 얻어진 세포 첨가시의 혼합 림프구 반응(3H-티미딘 도입)의 결과를 나타낸다. 세로축은 항체 첨가 없음(Allo)을 기준으로 한 3H-티미딘 도입을 나타낸다. 1/2, 1/4, 1/8, 1/16은 나이브 응답 세포에 대한 키메라 항CD80 항체 및 키메라 항CD86 항체 존재하에서 얻어진 세포의 혼합 비율이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 특별히 언급하지 않는 한 해당 분야에서 통상 이용되는 의미로 이용된다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 그 밖에 정의되지 않는 한 본 명세서 중에서 사용되는 모든 전문 용어 및 과학 기술 용어는 본 개시가 속한 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 모순되는 경우 본 명세서(정의를 포함하여)가 우선된다.
(용어의 정의)
본 명세서에서 「약」이란 본 명세서에서 사용되는 경우 뒤에 이어지는 수치의 ±10%를 의미한다.
본 명세서에서 「면역 관용」이란 특정의 항원에 대한 특이적 면역 반응을 나타내지 않거나 특이적 면역 반응이 억제된 상태이다. 면역 관용은 면역 세포(특히 T세포)가 특정의 항원에 대한 특이적 면역 반응을 나타내지 않거나 특이적 면역 반응이 억제된 상태와, 인간이 특정의 항원에 대한 특이적 면역 반응을 나타내지 않거나 특이적 면역 반응이 억제된 상태 둘 다 또는 어느 한쪽을 의미해도 된다. 면역 관용이 야기됨으로써 면역 거절 반응에 대한 처치가 가능해지거나 알레르기에 대한 치료가 가능해지기 때문에 주목받고 있다. 본 명세서에서 「아네르기」란 항원 제시 세포로부터 항원이 제시될 때에 공자극이 입력되지 않음으로써 그 다음번에 공자극이 있는 조건으로 자극되어도 반응할 수 없게 된 상태를 의미한다. 본 명세서에서 「면역 관용이 유도된 PBMC(또는 T세포)」와 「아네르기 PBMC(또는 T세포)」는 같은 의미이다.
본 명세서에서 「피험체」란 사육 동물(예를 들어 소, 양, 고양이, 개, 말), 영장류(예를 들어 인간 및 원숭이 등의 비인간 영장류), 토끼 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함한다. 특정의 실시형태에서는 피험체는 인간이다.
본 명세서에서 「면역 활성화」란 면역계 세포(예를 들어 대식세포, 호중구, NK(natural killer) 세포, T세포, B세포 등)에의 자극, 면역계 세포의 증식을 의미한다. 면역계 세포가 활성화됨으로써 사이토카인(예를 들어 INF)의 생산이나 세포 상해 활성이 유도된다.
본 명세서에서 「면역 활성화에 의한 사이토카인의 생산을 실질적으로 유도하지 않는」이란 항원 존재하 또한 본 개시의 항체 비존재하에서 피험체에서 유래하는 세포(예를 들어 대식세포, 호중구, NK(natural killer) 세포, T세포, B세포 등)에 의해 생산되는 사이토카인량의 약 20% 이하의 사이토카인 생산을 초래하는 것을 말한다.
본 명세서에서 넓은 뜻의 「항체」는 항원 상의 특정 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 분자 또는 그 집단을 말한다. 본 명세서에서 넓은 뜻의 「항체」는 전체길이 항체(즉, Fc 부분을 갖는 항체)이어도 되고, Fc 부분이 결여되어 있는 항체이어도 된다. Fc 부분이 결여되어 있는 항체는 목적의 항원에 결합할 수 있으면 되고, 이러한 항체로서는 예를 들어 Fab 항체, F(ab')2 항체, Fab' 항체, Fv 항체, scFv 항체 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 또한, 항체는 항체 수식물 또는 항체 비수식물을 포함한다. 항체 수식물은 항체와 예를 들어 폴리에틸렌글리콜 등의 각종 분자가 결합되어 있어도 된다. 항체 수식물은 항체에 공지의 수법을 이용하여 화학적인 수식을 실시함으로써 얻을 수 있다.
본 명세서에서 좁은 뜻의 「항체」는 항원 상의 특정 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 또는 그 집단을 말하고, 그 개변체를 「항체의 개변체」라고 한다. 본 명세서에서 좁은 뜻의 「항체」는 전체길이 항체(즉, Fc 부분을 갖는 항체)일 수 있고, 본 명세서에서 「항체의 개변체」는 상기 항체의 Fc 부분이 결여되어 있는 개변체일 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 좁은 뜻의 항체는 전체길이 항체라고도 불릴 수 있고, 항체의 개변체는 전체길이 항체의 개변체라고도 불릴 수 있다. Fc 부분이 결여되어 있는 개변체는 목적의 항원에 결합할 수 있으면 되고, 이러한 개변체로서는 예를 들어 Fab 항체, F(ab')2 항체, Fab' 항체, Fv 항체, scFv 항체 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 또한, 항체의 개변체는 항체 수식물 또는 항체 비수식물을 포함한다. 항체 수식물은 항체와 예를 들어 폴리에틸렌글리콜 등의 각종 분자가 결합되어 있어도 된다. 항체 수식물은 항체에 공지의 수법을 이용하여 화학적인 수식을 실시함으로써 얻을 수 있다.
본 개시의 일 실시형태에서 「다클론(polyclonal) 항체」는 예를 들어 항원에 특이적인 다클론 항체의 생산을 유도하기 위해 포유류(예를 들어 래트, 마우스, 토끼, 소, 원숭이 등), 조류 등에 목적의 항원을 포함하는 면역원을 투여함으로써 생성하는 것이 가능하다. 면역원의 투여는 하나 이상의 면역제 및 원하는 경우에는 아쥬반트의 주입을 해도 된다. 아쥬반트는 면역 응답을 증가시키기 위해 사용되는 경우도 있고, 프로인드 아쥬반트(완전 또는 불완전), 미네랄 겔(수산화 알루미늄 등) 또는 계면 활성 물질(리졸레시틴 등) 등을 포함하고 있어도 된다. 면역 프로토콜은 해당 기술 분야에서 공지이며, 선택하는 숙주 생물에 맞추어 면역 응답을 유발하는 임의의 방법에 따라 실시되는 경우가 있다(단백질 실험 핸드북, 요도샤(2003): 86-91.).
본 개시의 일 실시형태에서 「단클론 항체」는 집단을 구성하는 개개의 항체가 소량 자연스럽게 발생하는 것이 가능한 돌연변이를 갖는 항체를 제외하고 실질적으로 단일 에피토프에 대응하는 동일한 항체인 경우를 포함한다. 또는 집단을 구성하는 개개의 항체가 소량 자연스럽게 발생하는 것이 가능한 돌연변이를 갖는 항체를 제외하고 실질적으로 동일한 항체이어도 된다. 단클론 항체는 고도로 특이적이며, 다른 에피토프에 대응하는 다른 항체를 전형적으로 포함하는 및/또는 동일한 에피토프에 대응하는 다른 항체를 전형적으로 포함하는 것과 같은 통상의 다클론 항체와는 다르다. 그 특이성에 더하여 단클론 항체는 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양으로부터 합성할 수 있는 점에서 유용하다. 「단클론」이라는 형용은 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 얻어진다는 특징을 나타내고 있어도 되지만 항체를 무엇인가 특정의 방법으로 생산해야 하는 것을 의미하는 것은 아니다. 예를 들어 단클론 항체는 "Kohler G, Milstein C., Nature. 1975 Aug 7; 256(5517): 495-497."에 게재되어 있는 바와 같은 하이브리도마법과 동일한 방법에 의해 제작해도 된다. 혹은 단클론 항체는 미국특허 제4816567호에 기재되어 있는 바와 같은 재조합법과 동일한 방법에 의해 제작해도 된다. 또는 단클론 항체는 "Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15; 352(6336): 624-628." 또는 "Marks et al., J Mol Biol. 1991 Dec 5; 222(3): 581-597."에 기재되어 있는 바와 같은 기술과 동일한 방법을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리해도 된다. 또는 "단백질 실험 핸드북, 요도샤(2003): 92-96."에 게재되어 있는 방법에 의해 제작해도 된다.
본 개시의 일 실시형태에서 「키메라 항체」는 예를 들어 이종 생물 사이에서 항체의 가변 영역과 항체의 정상 영역을 연결한 것으로, 유전자 재조합 기술에 의해 구축할 수 있다. 마우스-인간 키메라 항체는 예를 들어 "Roguska et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Feb 1; 91(3): 969-973."에 기재된 방법으로 제작할 수 있다. 마우스-인간 키메라 항체를 제작하기 위한 기본적인 방법은 예를 들어 클론화된 cDNA에 존재하는 마우스 리더 서열 및 가변 영역 서열을 포유류 세포의 발현 벡터 중에 이미 존재하는 인간 항체 정상 영역을 코딩하는 서열에 연결한다. 또는 클론화된 cDNA에 존재하는 마우스 리더 서열 및 가변 영역 서열을 인간 항체 정상 영역을 코딩하는 서열에 연결한 후 포유류 세포 발현 벡터에 연결해도 된다. 인간 항체 정상 영역의 단편은 임의의 인간 항체의 H쇄 정상 영역 및 인간 항체의 L쇄 정상 영역의 것으로 할 수 있고, 예를 들어 인간 H쇄의 것에 대해서는 Cγ1, Cγ2, Cγ3 또는 Cγ4를, L쇄의 것에 대해서는 Cλ 또는 Cκ를 각각 들 수 있다.
본 개시의 일 실시형태에서 「인간화 항체」는 예를 들어 비인간종 유래의 하나 이상의 CDR 및 인간 면역글로불린 유래의 프레임 워크 영역(FR), 추가로 인간 면역글로불린 유래의 정상 영역을 가지며, 원하는 항원에 결합하는 항체이다. 항체의 인간화는 해당 기술분야에서 이미 알려진 여러 가지의 수법을 사용하여 실시 가능하다(Almagro et al., Front Biosci. 2008 Jan 1; 13: 1619-1633.). 예를 들어 CDR 그래프팅(Ozaki et al., Blood. 1999 Jun 1; 93(11): 3922-3930.), Re-surfacing(Roguska et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Feb 1; 91(3): 969-973.) 또는 FR 셔플(Damschroder et al., Mol Immunol. 2007 Apr; 44(11): 3049-3060. Epub 2007 Jan 22.) 등을 들 수 있다. 항원 결합을 개변하기 위해(바람직하게는 개선하기 위해) 인간 FR 영역의 아미노산 잔기는 CDR 공여자 항체로부터의 대응하는 잔기로 치환해도 된다. 이 FR 치환은 해당 기술분야에서 주지의 방법에 의해 실시 가능하다(Riechmann et al., Nature. 1988 Mar 24; 332(6162): 323-327.). 예를 들어 CDR과 FR 잔기의 상호작용의 모델링에 의해 항원 결합에 중요한 FR 잔기를 동정(同定)해도 된다. 또는 서열 비교에 의해 특정의 위치에서 이상(異常)한 FR 잔기를 동정해도 된다.
본 개시의 일 실시형태에서 「인간 항체」는 예를 들어 항체를 구성하는 중쇄의 가변 영역 및 정상 영역, 경쇄의 가변 영역 및 정상 영역을 포함하는 영역이 인간 면역글로불린을 코딩하는 유전자에서 유래하는 항체이다. 주요 제작 방법으로서는 인간 항체 제작용 트랜스제닉 마우스법, 파지 디스플레이법 등이 있다. 인간 항체 제작용 트랜스제닉 마우스법에서는 내인성 Ig를 녹아웃한 마우스에 기능적인 인간의 Ig 유전자를 도입하면 마우스 항체 대신에 다양한 항원 결합능을 갖는 인간 항체가 생산된다. 나아가 이 마우스를 면역하면 인간 단클론 항체를 종래의 하이브리도마법으로 얻는 것이 가능하다. 예를 들어 "Lonberg et al., Int Rev Immunol. 1995; 13(1): 65-93."에 기재된 방법으로 제작할 수 있다. 파지 디스플레이법은 전형적으로는 대장균 바이러스의 하나인 M13이나 T7 등의 섬유상 파지의 코트 단백질(g3p, g10p 등)의 N말단측에 파지의 감염성을 잃지 않도록 외래 유전자를 융합 단백질로서 발현시키는 시스템이다. 예를 들어 "Vaughan et al., Nat Biotechnol. 1996 Mar; 14(3): 309-314."에 기재된 방법으로 제작할 수 있다.
본 명세서에서 「개변 서열」이란 아미노산 서열의 경우 원래의 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산 잔기의 개변(치환, 부가 또는 결실)을 갖는 서열을 말하고, 핵산 서열의 경우 프레임 시프트가 발생하지 않는 것과 같은 적어도 하나의 염기의 개변(치환, 부가 또는 결실)을 말한다. 개변 서열은 원래의 서열이 갖는 기능과 유사한 기능을 가지고 있고, 예를 들어 원래의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일하다. 원래의 서열이 항체인 경우는 개변 서열은 CDR 내에 개변을 가지지 않는 것이 바람직하지만, 원래의 항체의 결합 능력 또는 기능을 유지하는 한 하나 또는 복수의 개변을 가져도 되고, 바람직하게는 3개 이하의 개변, 보다 바람직하게는 2개 이하의 개변, 가장 바람직하게는 1개의 개변을 가진다. CDR 내에 개변을 도입하는 경우, 당업자이면 원래의 항체의 결합 능력 또는 기능을 유지하도록 적절한 개변을 선택하는 것이 가능하다.
본 명세서에서 「피험체 유래의 세포」란 본 개시의 조성물이 투여되는 피험체로부터 얻은 세포 또는 이 피험체로부터 얻은 세포에서 유래하는 세포를 말한다. 본 명세서에서 「피험체 유래의 항원」이란 면역 응답을 발생시키는 피험체 자신이 생성하는 항원, 예를 들어 자기면역 질환을 갖는 피험체에서의 자기면역 질환의 원인이 되는 피험체 자신이 생성하는 항원을 말한다. 본 명세서에서 「피험체에서 유래하지 않는 항원」이란 면역 응답을 발생시킬 수 있는 외래의 항원을 말한다. 본 명세서에서 「피험체에서 유래하지 않는 항원의 함유물(antigen-containing material)」은 피험체에서 유래하지 않는 항원을 함유하는 임의의 물질 또는 물질의 집합물을 말하고, 예를 들어 피험체에서 유래하지 않는 항원을 발현하고 있는 세포, 세포 집단, 조직 등을 들 수 있다.
본 명세서에서 「이식 면역 거절 반응」이란 장기, 조직 또는 세포의 이식을 받은 피험체에 있어서 피험체의 면역계가 이식된 장기, 조직 또는 세포에 대해 공격하여 손상 또는 파괴하는 것을 말한다.
본 명세서에서 「알레르기」란 피험체에서 유래하지 않는 항원에 대해 면역 응답이 과잉으로 일어나는 상태를 말한다. 알레르기를 일으키는 피험체에서 유래하지 않는 항원은 알레르겐이라고도 불리며, 예를 들어 진드기 항원, 난백 항원, 우유 항원, 소맥 항원, 땅콩 항원, 대두 항원, 메밀 항원, 참깨 항원, 쌀 항원, 갑각류 항원, 키위 항원, 사과 항원, 바나나 항원, 복숭아 항원, 토마토 항원, 참치 항원, 연어 항원, 고등어 항원, 소고기 항원, 닭고기 항원, 돼지고기 항원, 고양이 각질(皮屑, dander) 항원, 곤충 항원, 꽃가루 항원, 개 각질 항원, 진균 항원, 세균 항원, 라텍스, 합텐 및 금속 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 「자기면역 질환」이란 면역계가 자신의 세포, 조직 또는 장기에 대해 바람직하지 않은 면역 응답을 행하는 임의의 질환을 말한다. 자기면역 질환으로서는 예를 들어 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 염증성 장질환(예를 들어 크론병 또는 궤양성 대장염), 전신성 홍반성낭창(systemic lupus erythematosus), 건선, 강피증, 자기면역성 갑상선 질환, 원형 탈모증, 그레이브스병, 길랭-바레 증후군, 셀리악병, 쇼그렌 증후군, 류마티스열, 위염, 자기면역성 위축성 위염, 자기면역성 간염, 췌도염, 난소염, 정소염, 포도막염, 수정체 기인성 포도막염, 중증근무력증, 원발성 점액수종, 악성 빈혈, 자기면역성 용혈성 빈혈, 애디슨병, 강피증, 굿파스처 증후군, 신장염(예를 들어 사구체신염), 건선, 심상성 천포창, 유천포창, 교감성 안염, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 특발성 백혈구 감소증, 베게너 육아종 및 다발성/피부근염을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 「이식편대숙주병」이란 이식된 장기, 조직 또는 세포가 면역 응답에 의해 이식을 받은 피험체의 세포, 조직 또는 장기를 공격하여 손상 또는 파괴하는 것을 말한다.
본 명세서에서 「iPS 세포 혹은 ES 세포 또는 이들 세포에서 유래하는 세포, 조직 혹은 장기의 이식에 의해 일어나는 면역 거절 반응」이란 iPS 세포 혹은 ES 세포가 갖는 항원, 또는 iPS 세포 혹은 ES 세포에서 유래하는 세포, 조직 혹은 장기가 갖는 항원에 의해 발생하는 면역 거절 반응을 말한다.
(바람직한 실시형태)
이하에 바람직한 실시형태의 설명을 기재하지만 이 실시형태는 본 개시의 예시이며 본 개시의 범위는 이러한 바람직한 실시형태에 한정되지 않는 것이 이해되어야 한다. 또한, 당업자는 이하와 같은 바람직한 실시예를 참고하여 본 개시의 범위 내에 있는 개변, 변경 등을 용이하게 행할 수 있는 것이 이해되어야 한다. 이들 실시형태에 대해 당업자는 적절히 임의의 실시형태를 조합할 수 있다.
본 발명자들은 CD80 및/또는 CD86과 CD28의 상호작용을 저해하는 인간 Fc 영역을 갖는 항체를 이용한 불면역 응답(아네르기)의 유도를 시도한 결과, 대식세포, 호중구, NK(natural killer) 세포와 같은 면역계에 관여하는 세포를 활성화하여 면역 반응을 담당하는 인터루킨이나 인터페론(IFN) 등의 액성 인자 방출을 유도하는 것을 발견하였다. 이들 액성 인자의 방출은 면역 관용과는 반대의 바람직하지 않은 면역계의 활성화를 유도하기 때문에 인간 Fc 영역을 갖는 항체를 이용한 불면역 응답(아네르기)의 유도에는 면역 관용 효과를 감약시킨다는 문제가 존재하는 것을 새로 발견하고, 이 인간 Fc 영역을 조정함으로써 면역 관용 효과를 개선할 수 있는 것을 발견하였다.
구체적으로는 CD80 및/또는 CD86과 CD28의 상호작용을 저해하여 면역 관용을 유도하는 키메라 항체는 재조합-인간 CD80/CD86-Fc 융합 단백을 Balb/c 마우스에 면역 감작 후 그 마우스의 비장으로부터 mRNA를 추출하여 cDNA를 합성, RT-PCR법에 의해 증폭한 유전자를 이용하여 구축한 파지 디스플레이-라이브러리로부터 동정한 CD80/CD86에 친화성이 높은 Fab 항체를 선택한 후 인간 Fc 부분을 유전자 공학적으로 부여하여 제작하였다.
면역 관용 유도에 사용한 항체에 대한 거절 반응을 최소화하기 위해 발명자들은 키메라 항체의 인간화를 Xoma사에 의해 개발된 CDR 그래프팅법에 의해 실시하여 인간화 항체(서브클래스; IgG1)를 제작하였다. 얻어진 인간화 항CD80 항체 및 항CD86 항체(서브클래스; IgG1)를 공여자와 수용자를 상정한 2명의 지원자로부터 채취한 PBMC(말초혈 단핵 세포)에 의한 혼합 림프구 반응에 첨가하고 유도한 세포의 동일한 항원 자극시의 억제 기능을 평가하였다. 구체적으로는 1명의 지원자로부터 PBMC를 채취하여 30Gy 방사선 조사하고 다른 지원자로부터 채취한 PBMC와 인간화 항CD80/CD86 항체의 존재하에서 7일간 공배양하여 공여자 항원 특이적 아네르기 세포를 유도하였다. 이 유도한 세포를 동일한 수용자와 공여자의 혼합 림프구에 일정한 비율로 첨가하여 항원 자극에 따른 세포의 분열 증식 억제능을 트리튬 표지한 티미딘의 도입량으로서 측정하였다. 그 결과, 인간화 항CD80 항체 및 항CD86 항체는 의미 있게 티미딘 도입량을 억제하고, 그 항체를 이용하여 유도한 세포에는 억제 기능을 새로 획득한 것이 확인되었다.
그러나, 7일간 배양 후의 상청에 존재하는 IFNγ량을 측정한 바, 비항원 자극시에도 항체를 첨가하면 IFNγ가 생산되었다. 또한, 방사선을 조사한 PBMC 첨가에 의한 알로 항원 자극시에 통상 생산되어 있는 IFNγ는 항체를 첨가해도 거의 동등량 상청 중에 존재하고 있는 것이 밝혀졌다.
그래서, 본 발명자들은 면역 관용의 유도능을 유지한 채로 IFNγ 생산을 유도하지 않는 항체를 얻기 위해 면밀히 검토한 결과, 인간화 항CD80/CD86 항체의 서브클래스를 IgG2 또는 IgG4로 함으로써 IFNγ를 생산하지 않고 면역 관용을 유도하는 세포를 얻을 수 있는 것을 발견하였다.
(항체)
본 개시의 일 태양에서 본 개시는 어떤 세포의 세포 표면에 발현하는 CD80 및/또는 CD86과 다른 세포의 세포 표면에 발현하는 CD28의 상호작용을 저해하는 항체로서, 면역 활성화에 의한 사이토카인의 생산을 실질적으로 유도하지 않는 항체를 제공한다. 본 개시의 항체는 항CD80 항체 및/또는 항CD86 항체이어도 되고, CD80 및 CD86에 대한 이중 특이성 항체이어도 되며, 항CD28 항체이어도 되고, 혹은 이들의 혼합물이어도 된다. 어느 하나의 실시형태에서 본 개시의 항체의 Fc 부분은 면역 활성화에 의한 사이토카인의 생산을 실질적으로 유도하지 않는 부분일 수 있다. 특정의 실시형태에서는 본 개시의 항체의 서브클래스는 IgG2 또는 IgG4이다. 서브클래스가 IgG2 또는 IgG4인 본 개시의 항체는 놀랍게도 면역계 세포에 의한 사이토카인의 생산을 전혀 유도하지 않았다. 본 개시에서 사용되는 항체는 리셉터를 작동함으로써 바람직하지 않은 작용이 발생할 가능성이 있기 때문에 길항적 항체인 것이 바람직하다.
어느 하나의 실시형태에서 면역 활성화에 의한 사이토카인의 생산을 실질적으로 유도하지 않는 항체는 본 개시의 항체 비존재하에서 피험체에서 유래하는 세포(예를 들어 대식세포, 호중구, NK(natural killer) 세포, T세포, B세포 등)에 의해 생산되는 사이토카인량의 약 20% 이하, 바람직하게는 약 10% 이하, 보다 바람직하게는 약 5% 이하, 가장 바람직하게는 약 0%의 사이토카인 생산을 초래할 수 있다.
본 명세서에서 「길항적(항체)」이란 안타고니스트(항체), 저해(항체) 또는 블로킹(항체) 등과 같은 뜻이며, 대상이 되는 기능 또는 시그널의 기능을 저해하여 생체의 작용을 약하게 하거나 또는 비활성화시키는 기능을 갖는 것(항체의 경우는 항체)을 말한다.
상술한 바와 같이 항체의 서브클래스를 IgG1에서 IgG2 또는 IgG4로 변경함으로써 예상 외로 사이토카인의 생산의 유도가 억제되었다. 이론에 속박되는 것을 바라지 않지만, IgG 서브클래스 사이에서는 Fc 부분을 통한 기능이 다르기 때문에 사이토카인 생산의 유도는 IgG1 항체의 Fc 부분에 기인하고 있다고 생각된다. 따라서, 다른 실시형태에서 본 개시의 항체는 Fc 부분이 결여된 항체이어도 된다. 이러한 항체로서는 예를 들어 Fab 항체, F(ab')2 항체, Fab' 항체, Fv 항체, scFv 항체 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
어느 하나의 실시형태에서 CD80 및/또는 CD86을 발현하는 상기 세포가 항원 제시 세포이며, CD28을 발현하는 상기 다른 세포가 T세포일 수 있다.
본 개시의 다른 국면에서 본 개시의 항체는 세포 표면에 발현하는 CD80 및/또는 CD86과 다른 세포 표면에 발현하는 CD28의 상호작용을 저해할 수 있는 것을 특징으로 한다. 후보 항체가 세포 표면에 발현하는 CD80 및/또는 CD86과 다른 세포 표면에 발현하는 CD28의 상호작용을 저해할 수 있는지 여부는 예를 들어 공면역 침강법에 의해 판정할 수 있다. 구체적으로는 이들 단백질을 결합시킨 후 어느 한쪽의 단백질(bait)에 결합하는 항체를 이용하여 면역 침강시키고, 면역 침강된 다른 한쪽의 단백질(Prey)을 측정한다. 후보 항체를 포함하지 않는 대조군(control)과 비교하여 후보 항체를 첨가한 경우에 면역 침강물 중에 포함되는 Prey가 감소한 경우에는 그 후보 항체는 단백질 사이의 결합을 저해한다고 판정된다. 면역 침강물 중에 포함되는 Prey는 필요에 따라 Prey를 표지화하여 측정할 수 있다. 또한, 풀다운 어세이법을 이용하여 어느 한쪽의 단백질(bait)을 담체에 결합시키고, 후보 항체의 존재하/비존재하에서 다른 한쪽의 단백질(Prey)을 접촉시켜 담체에 결합한 Prey의 양을 비교해도 된다.
바람직하게는 본 개시의 항체는 항원 제시 세포 표면에 발현하는 CD80 및/또는 CD86과 T세포 표면에 발현하는 CD28의 상호작용을 저해할 수 있다. 후보 항체가 항원 제시 세포 표면에 발현하는 CD80 및/또는 CD86과 T세포 표면에 발현하는 CD28의 상호작용을 저해하는지 여부는 CD80 및/또는 CD86을 발현하는 항원 제시 세포와 CD28을 발현하는 T세포를 항원 후보 항체의 존재하에서 접촉시켜 T세포가 활성화되지 않는 경우에는 항원 제시 세포 표면에 발현하는 CD80 및/또는 CD86과 T세포 표면에 발현하는 CD28의 상호작용을 저해한다고 판정할 수 있다.
또한, 본 개시의 항체는 인간 PBMC에 의한 사이토카인 생산을 촉진하지 않는 것을 특징으로 한다. 후보 항체가 인간 PBMC에 의한 사이토카인 생산을 촉진하지 않는지 여부는 후보 항체와 배지 중의 인간 PBMC를 접촉시켜 배지 중에 방출된 사이토카인량을 측정함으로써 판정할 수 있다. 항체 비존재하에서 인간 PBMC에 의해 방출된 사이토카인량과 비교하여 후보 항체의 존재하에서 방출된 사이토카인량이 적은/많은 상기 후보 항체는 인간 PBMC에 의한 사이토카인 생산을 촉진하지 않는다고/촉진한다고 판정된다. 사이토카인으로서는 IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-14, IL-15, IL-17, IL-18 등의 인터루킨; CC, CXC, CX3C, C 등의 케모카인; IFNα, IFNβ, IFNγ 등의 인터페론; TNFα 등의 세포 상해 인자를 들 수 있다. 바람직하게는 염증성 사이토카인이며, 보다 바람직하게는 IFNγ이다. 사이토카인의 측정은 시판의 키트를 이용하여 행할 수 있다. 예를 들어 IFNγ는 Bioligands사 제품 Human IFNγ ELISA MAXTM Deluxe를 이용하여 측정할 수 있다.
바람직하게는 본 개시의 항체는 항원 또는 항원을 표면에 갖는 세포와 함께 PBMC에 접촉시킴으로써 그 항원에 대한 면역 관용을 유도할 수 있다. 후보 항체가 항원 또는 항원을 표면에 갖는 세포와 함께 PBMC에 접촉시킴으로써 그 항원에 대한 면역 관용을 유도할 수 있는지 여부는 후보 항체의 존재하에서 항원 또는 항원을 표면에 갖는 세포와 PBMC를 수일~7일간 접촉시킨 후 3H-티미딘을 첨가하고 3H-티미딘 첨가의 16~20시간 후에 배양액 중의 3H-티미딘 제거 후 PBMC에 의한 3H-티미딘 도입량을 측정함으로써 판정할 수 있다. 후보 항체를 전개하지 않은 컨트롤과 비교하여 후보 항체를 첨가한 경우에 있어서 PBMC에 의한 3H-티미딘 도입량이 적은 경우, 상기 항체는 항원 또는 항원을 표면에 갖는 세포와 함께 PBMC에 접촉시킴으로써 그 항원에 대한 면역 관용을 유도할 수 있다고 판정할 수 있다.
본 명세서에서 「면역 관용」이란 특정의 항원에 대한 특이적 면역 반응을 나타내지 않거나 특이적 면역 반응이 억제된 상태이다. 면역 관용은 면역 세포(특히 T세포)가 특정의 항원에 대한 특이적 면역 반응을 나타내지 않거나 특이적 면역 반응이 억제된 상태와, 인간이 특정의 항원에 대한 특이적 면역 반응을 나타내지 않거나 특이적 면역 반응이 억제된 상태 둘 다 또는 어느 한쪽을 의미해도 된다. 본 명세서에서 「아네르기」란 항원 제시 세포로부터 항원이 제시될 때에 공자극(共刺戟)이 입력되지 않음으로써 그 다음번에 공자극이 있는 조건으로 자극되어도 반응할 수 없게 된 T세포를 의미한다. 본 명세서에서 「면역 관용이 유도된 PBMC(또는 T세포)」와 「아네르기 PBMC(또는 T세포)」는 같은 의미이다.
바람직하게는 본 개시는 항CD80 항체 및 항CD86 항체에 관한 것이다. 본 명세서에서 항CD80 항체 및 항CD86 항체는 각각 CD80 및 CD86과 특이적으로 결합한다. 본 명세서에서 항체가 「특이적으로」 결합한다는 것은 그 항체가 다른 단백질이나 펩티드에 대한 친화성보다 목적의 단백질(CD80 또는 CD86)에 대해 실질적으로 높은 친화성으로 결합하는 것을 의미한다. 여기서, 「실질적으로 높은 친화성으로 결합하는」이란 원하는 측정 장치 또는 방법에 의해 목적으로 하는 특정의 단백질이나 펩티드를 다른 단백질이나 펩티드로부터 구별하여 검출하는 것이 가능할 정도로 높은 친화성을 의미한다. 예를 들어 실질적으로 높은 친화성은 ELISA 또는 EIA에 의해 검출된 강도(예를 들어 형광 강도)로서 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 30배 이상, 약 40배 이상, 약 50배 이상, 약 100배 이상인 것을 의미해도 된다.
본 개시의 항체와 CD80, CD86 또는 CD28의 결합에서의 결합 속도 상수(Ka1)로서는 예를 들어 약 1×104Ms-1 이상, 약 1×105Ms-1 이상, 약 5×105Ms-1 이상을 들 수 있다. 또한, 본 개시의 항체와 CD80, CD86 또는 CD28의 결합에서의 해리 속도 상수(Kd1)로서는 예를 들어 약 1×10-3 이하, 약 1×10-4 이하를 들 수 있다. 본 개시의 항체와 CD80, CD86 또는 CD28의 결합에서의 결합 상수(KD)로서는 예를 들어 약 1×10-8(M) 이하, 약 5×10-8(M) 이하, 약 1×10-9(M) 이하, 약 5×10-9(M) 이하일 수 있다. 본 명세서에서 항체의 결합 속도 상수(Ka1), 해리 속도 상수(Kd1), 결합 상수(KD)는 BIACORE(GE 헬스케어 바이오사이언스 주식회사, BIACORE-X100)를 이용하여 제조자 제공의 매뉴얼에 따라 SA 칩에 비오틴화 CD80, CD86 혹은 CD28 또는 이들을 발현하는 세포를 고정 후 피검 항체를 흘려보내어 결합 속도 상수(Ka1), 해리 속도 상수(Kd1)를 측정하고, bivalent 피팅을 이용하여 결합 상수(KD) 값을 결정할 수 있다.
본 개시의 항체는 다클론 항체이어도 되고 단클론 항체이어도 되지만, 바람직하게는 단클론 항체이다. 본 개시에서 「단클론 항체」는 단일한 항원 결정기와 반응하는, 구조가 균일한 항체이다. 나아가 본 개시의 항체는 비인간 동물의 항체의 아미노산 서열과 인간 유래의 항체의 아미노산 서열을 갖는 항체, 인간 항체를 포함한다. 비인간 동물의 항체로서는 예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 토끼, 개, 원숭이, 양, 염소, 낙타, 닭, 오리 등의 항체를 들 수 있고, 바람직하게는 하이브리도마를 제작할 수 있는 동물의 항체이며, 보다 바람직하게는 마우스, 래트 또는 토끼의 항체이다. 비인간 동물의 항체의 아미노산 서열과 인간 유래의 항체의 아미노산 서열을 갖는 항체로서는 인간형 키메라 항체, 인간화 항체를 들 수 있다. 상기에서 「키메라 항체」란 비인간 동물 유래로서 목적의 항원(CD80, CD86 또는 CD28)과 특이적으로 결합하는 항체의 정상 영역을 인간의 항체와 동일한 정상 영역을 가지도록 유전자 공학적으로 개변한 항체이며, 바람직하게는 인간-마우스-키메라 항체(유럽특허공개공보 EP0125023 참조)이다. 「인간화 항체」란 비인간 동물 유래로서 CD80, CD86 또는 CD28과 특이적으로 결합하는 항체의 H쇄와 L쇄의 상보 인식 영역(CDR) 이외의 1차 구조를 인간의 항체에 대응하는 1차 구조로 유전자 공학적으로 개변한 항체이다. 여기서, CDR이란 Kabat 등("Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E. 등, U.S. Department of Health and Human Services, 1983) 또는 Chothia 등(Chothia & Lesk(1987) J. Mol. Biol., 196: 901-917)의 어떤 정의에 의한 것이어도 된다. 「인간 항체」란 완전히 인간 유래의 항체 유전자의 발현 산물인 인간 항체이며, 예를 들어 인간의 항체 생산에 관여하는 유전자를 도입한 트랜스제닉 동물을 이용하여 제작한 단클론 항체(유럽특허공개공보 EP0546073 참조) 등을 들 수 있다. 예를 들어 본 개시의 항체를 치료, 예방 또는 체내에 투여함으로써 이용하는 진단에 사용하는 경우에는 본 개시의 항체로서 바람직하게는 인간-비인간 동물의 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체이다.
바람직하게는 본 개시의 항체의 면역글로불린 클래스는 IgG이다. 또한, 본 개시의 항체의 서브클래스는 바람직하게는 IgG2 또는 IgG4이다. 더욱 바람직하게는 본 개시의 항체의 서브클래스는 IgG4이다. 혹은 바람직하게는 본 개시의 항체의 서브클래스는 IgG2이다. 또한, 본 개시의 항체는 단일 특이성, 이중 특이성(이중 특이성 항체), 3중 특이성(3중 특이성 항체)(예를 들어 WO1991/003493호), 4중 특이성(4중 특이성 항체), 그 이상의 다중 특이성(다중 항원 특이성)이어도 된다.
일 태양에서 본 개시의 항체는 서열번호 27 또는 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 가진다. 바람직하게는 본 개시의 항체는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열의 CDRH2, 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 가지거나, 혹은 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 32에 기재된 아미노산 서열의 CDRH2, 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 가진다. 보다 바람직하게는 본 개시의 항체는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열의 CDRH2, 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 가지며, 또한 서열번호 28에 기재된 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열의 CDRL2, 서열번호 30에 기재된 아미노산 서열의 CDRL3을 가지거나, 혹은 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 32에 기재된 아미노산 서열의 CDRH2, 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 가지며, 또한 서열번호 34에 기재된 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 35에 기재된 아미노산 서열의 CDRL2, 서열번호 36에 기재된 아미노산 서열의 CDRL3을 가진다.
일 태양에서 본 개시의 항체는 서열번호 38 또는 42에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 40 또는 44에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 경쇄를 갖는 항체 또는 그 개변체일 수 있다. 바람직하게는 본 개시의 항체는 (a) 서열번호 53에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열의 CDRH1, 서열번호 54에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열의 CDRH2 및 서열번호 55에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열의 CDRH3을 포함하는 VH, 및 서열번호 56에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열의 CDRL1, 서열번호 57에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열의 CDRL2 및 서열번호 58에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열의 CDRL3을 포함하는 VL, 혹은 (b) 서열번호 59에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열의 CDRH1, 서열번호 60에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열의 CDRH2 및 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열의 CDRH3을 포함하는 VH, 및 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열의 CDRL1, 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열의 CDRL2 및 서열번호 64에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열의 CDRL3을 포함하는 VL을 포함하는 항체 또는 그 개변체일 수 있다. 특정의 실시형태에서 (a) 서열번호 46에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VH 및 서열번호 48에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VL, 혹은 (b) 서열번호 50에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VH 및 서열번호 52에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 또는 그 개변체일 수 있다. 개변 서열은 CDR 내에 개변(아미노산의 치환, 부가 또는 결실)을 포함하지 않는 것이 바람직하지만, 개변 전의 항체의 결합 능력 및/또는 기능을 유지하는 한 각 CDR 내에 수개(3개 이하, 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하)의 개변을 포함해도 된다. 개변 서열은 바람직하게는 원래의 서열에 대해 적어도 90%의 동일성을 가질 수 있다.
다른 국면에서 본 개시의 항체는 서열번호 18 또는 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH를 갖는 항체에 관한 것이다. 바람직하게는 본 개시의 항체는 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH를 가지며, 또한 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL을 가지거나, 또는 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH를 가지며, 또한 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL을 가진다.
나아가 본 개시는 VH가 서열번호 18 또는 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열과 엄격한 조건하에서 혼성화(hybridize)하는 핵산 서열에 의해 코드된 아미노산 서열을 갖는 항체에 관한 것이다. 바람직하게는 본 개시는 VH가 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열과 엄격한 조건하에서 혼성화하는 핵산 서열에 의해 코드된 아미노산 서열을 가지며, 또한 VL이 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열과 엄격한 조건하에서 혼성화하는 핵산 서열에 의해 코드된 아미노산 서열을 갖는 항체, 혹은 VH가 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열과 엄격한 조건하에서 혼성화하는 핵산 서열에 의해 코드된 아미노산 서열을 가지며, 또한 VL이 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열과 엄격한 조건하에서 혼성화하는 핵산 서열에 의해 코드된 아미노산 서열을 갖는 항체에 관한 것이다. 본 명세서에서 엄격한 조건하에서 혼성화한다는 것은 당업자에게 통상 이용되는 혼성화 조건으로 혼성화하는 것을 의미한다. 예를 들어 Molecular Cloning, a Laboratory Mannual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012) 또는 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Online Library 등에 기재된 방법에 의해 혼성화하는지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어 혼성화의 조건은 6×SSC(0.9M NaCl, 0.09M 구연산삼나트륨) 또는 6×SSPE(3M NaCl, 0.2M NaH2PO4, 20mM EDTA·2Na, pH 7.4) 중 42℃에서 혼성화시키고 그 후 42℃에서 0.5×SSC로 세정하는 조건이어도 된다.
또한, 본 개시는 VH가 서열번호 18 또는 서열번호 22의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함한다. 바람직하게는 본 개시의 항체는 VH가 서열번호 18의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 또한 VL이 서열번호 20의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지거나, 혹은 VH가 서열번호 22의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 가지며, 또한 VL이 서열번호 24의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진다. 아미노산 서열의 동일성은 2종류의 단백질 사이에서 비교 대상으로 하는 아미노산 서열 범위에서의 종류가 동일한 아미노산수의 비율(%)을 의미하고, 예를 들어 BLAST, FASTA 등의 공지의 프로그램을 이용하여 결정할 수 있다. 상술한 동일성으로서는 80% 이상보다 높은 동일성이어도 되고, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성이어도 된다.
상술한 VH가 엄격한 조건하에서 혼성화하는 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 갖는 항체, 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체는 바람직하게는 상술한 CDR 서열을 가진다.
보다 구체적인 예로서 본 개시는 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 10, 서열번호 14에서 선택되는 하나의 서열번호에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 갖는 항체를 포함한다. 바람직하게는 본 개시의 항체는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 가지거나, 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 가지거나, 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 가지거나, 또는 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 가진다.
바람직한 실시형태에서 항체는 (a) 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열의 CDRH2 및 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 포함하는 VH, 및 서열번호 28에 기재된 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열의 CDRL2 및 서열번호 30에 기재된 CDRL3을 포함하는 VL, 또는 (b) 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 32에 기재된 아미노산 서열의 CDRH2 및 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 포함하는 VH, 및 서열번호 34에 기재된 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 35에 기재된 아미노산 서열의 CDRL2 및 서열번호 36에 기재된 CDRL3을 포함하는 VL을 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서 항체는 (a) 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VH 및 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VL, (b) 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VH 및 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VL을 포함할 수 있다. 개변 서열은 CDR 내에 개변(아미노산의 치환, 부가 또는 결실)을 포함하지 않는 것이 바람직하지만, 개변 전의 항체의 결합 능력 및/또는 기능을 유지하는 한, 각 CDR 내에 수개(3개 이하, 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하)의 개변을 포함해도 된다. 개변 서열은 바람직하게는 원래의 서열에 대해 적어도 90%의 동일성을 가질 수 있다.
본 개시의 항체는 CD80, CD86 또는 CD28 단백질 혹은 그 세포외 도메인 혹은 CD80, CD86 또는 CD28을 발현하는 세포를 면역원으로 하여 필요에 따라 면역 부활제(예를 들어 광유 혹은 알루미늄 침전물과 가열사균 혹은 리포다당체, 프로인드의 완전 아쥬반트 또는 프로인드의 불완전 아쥬반트 등)와 함께 면역 반응을 일으키는 비인간 동물, 바람직하게는 과잉 면역에 의해 자기에 대해 면역 반응(자기 항체)을 일으키는 비인간 동물(예를 들어 MRL/lpr 마우스)을 면역함으로써 제작할 수 있다. 면역 동물로서는 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 토끼, 개, 원숭이, 양, 염소, 닭, 오리 등 하이브리도마를 제작하는 것이 가능한 동물이면 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는 마우스 또는 래트이고, 보다 바람직하게는 마우스이며, 가장 바람직하게는 MRL/lpr 마우스이다. 동물에의 면역원의 투여는 예를 들어 1×106개의 세포를 1회 또는 적당한 간격을 두고 수회(통상 1~6주마다 1회의 면역을 합계 2~10회 정도) 피하주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 피내주사, 근육내 주사 또는 족척 주사에 의해 행할 수 있다. 마지막 면역으로부터 1~2주일 후에 면역한 동물의 안와 또는 꼬리정맥(caudal vein)으로부터 채혈을 행하고 그 혈청을 이용하여 항체가의 측정을 행한다. 본 개시의 항체는 충분한 항체가를 나타내는 동물의 혈청으로부터 정제함으로써 얻을 수 있다.
단클론 항체는 상기 방법에 의해 면역한 면역 감작 동물로부터 얻은 항체 생산 세포와 골수종계 세포를 융합함으로써 얻어지는 하이브리도마를 배양함으로써 얻을 수 있다. 이러한 융합 방법으로서는 예를 들어 밀스테인 등의 방법(Galfre, G. & Milstein, C. (1981) Methods Enzymol., 73: 3-46)을 들 수 있다. 사용하는 항체 생산 세포는 상기 방법에 의해 면역하여 혈청이 충분한 항체가를 나타낸 마우스 또는 래트의 비장, 췌장, 림프절, 말초혈로부터 채취할 수 있다. 사용하는 골수종계 세포는 예를 들어 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터, 토끼 또는 인간 등의 포유동물에서 유래하는 세포로서, in vitro로 증식 가능한 세포이면 특별히 한정은 없다. 이러한 세포로서는 예를 들어 P3-X63Ag8(X63)(Nature, 256, 495, 1975), P3/NS1/1-Ag4-1(NS1)(Eur. J. Immunol., 6, 292, 1976), P3X63Ag8U1(P3U1)(Curr. Top. Microbiol. Immunol., 81, 1, 1978), P3X63Ag8.653(653)(J. Immunol., 123, 1548, 1979), Sp2/0-Ag14(Sp2/O)(Nature, 276, 269, 1978), Sp2/O/FO-2(FO-2)(J. Immunol. Methods, 35, 1, 1980), SP2ab 등을 들 수 있고, 바람직하게는 항체 생산 세포와 동종 동물 유래의 세포이며, 보다 바람직하게는 항체 생산 세포와 동일 계통의 동물 유래의 세포이다.
배양 후 배양 상청을 채취하고, CD80, CD86 또는 CD28 단백질 혹은 그 세포외 도메인 혹은 CD80, CD86 또는 CD28을 발현하는 세포를 이용한 ELISA에 의해 CD80, CD86 또는 CD28에 결합하는 클론을 선택한다. 선택된 클론에 대해 한계 희석법을 1~5회 반복함으로써 단일세포화를 행함으로써 단클론 항체를 생산하는 세포를 얻을 수 있다.
혹은 예를 들어 항체 파지 라이브러리를 이용함으로써 CD80, CD86 또는 CD28에 결합하는 항체를 얻을 수 있다(토미즈카 등, Nature Genet., 15, 146-156(1997)). 항체 파지 라이브러리를 이용하는 경우, 예를 들어 CD80, CD86 또는 CD28 단백질 혹은 그 세포외 도메인 혹은 CD80, CD86 또는 CD28을 발현하는 세포를 고상으로 고정화하고 파지 항체 라이브러리를 반응시켜 비결합의 파지를 세정 제거한 후 결합한 파지를 회수함으로써 원하는 클론을 얻을 수 있다(패닝).
혹은 본 명세서에 기재된 아미노산 서열을 참조하여 목적의 항체 또는 그 면역 반응성 단편의 아미노산 서열을 디자인하고 이 디자인된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 조제하여 발현 벡터에 넣고 적당한 숙주 세포에 이러한 벡터를 도입하여 발현시킴으로써 얻은 항체로부터 상술한 방법에 따라 CD80, CD86 또는 CD28에의 특이성이 높은 항체를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다.
본 개시의 항체가 인간형 키메라 항체인 경우, 비인간 동물 단클론 항체의 VHVL을 코딩하는 DNA를 조제하고 이를 인간 면역글로불린의 정상 영역 cDNA와 결합하여 발현 벡터에 넣고 적당한 숙주 세포에 이러한 벡터를 도입하여 발현시킴으로써 얻을 수 있다(Morrison, S. L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, 1984).
본 개시의 항체가 인간화 항체인 경우는 비인간 동물 단클론 항체의 VHVL의 CDR을 코딩하는 아미노산 서열을 인간 항체의 VHVL의 Framework Region(FR)에 이식한 V영역을 코딩하는 DNA를 구축하고, 구축한 DNA를 인간 유래 면역글로불린의 정상 영역 cDNA와 결합하여 발현 벡터에 넣고 적당한 숙주 세포에 이러한 벡터를 도입하여 발현시킴으로써 얻을 수 있다(L. Rieohmann 등, Nature, 332, 323, 1988: Kettleborough, C. A. 등, Protein Eng., 4, 773-783, 1991; Clark M., Immunol. Today., 21, 397-402, 2000 참조). 비인간 동물 단클론 항체의 CDR은 상술한 방법에 의해 얻어진 비인간 동물 단클론 항체의 VHVL을 코딩하는 DNA 서열로부터 예측되는 아미노산 서열과, 이미 알려진 항체의 VHVL의 전체 아미노산 서열을 비교하여 얻을 수 있다. 이미 알려진 항체의 아미노산 서열은 예를 들어 프로테인 데이터 뱅크 등의 데이터베이스에 등록되어 있는 항체의 아미노산 서열로부터 얻을 수 있다. 또한, 인간화 항체의 FR로서는 이식 후의 항체가 본 개시의 효과를 나타내는 것이면 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는 인간화 항체의 가변 영역(이하, 「V영역」이라고 함)이 CDR이 유래하는 비인간 동물 단클론 항체의 V영역과 유사한 입체 구조가 되는 인간 항체의 FR, 또는 사용하는 비인간 동물 단클론 항체의 FR의 아미노산 서열과 상동성이 높은 인간 항체 FR이다. 인간화 항체에서 인간 항체에서 유래하는 FR을 구성하는 아미노산의 일부(특히 입체적으로 CDR과 근접한 위치에 존재하는 아미노산)는 필요에 따라 CDR이 유래하는 비인간 동물 단클론 항체의 FR 서열로 치환되어 있어도 된다(Queen 등, 미국특허 제5585089호 참조). 사용하는 인간화 항체의 V영역을 코딩하는 DNA 서열은 비인간 동물 단클론 항체의 CDR의 아미노산 서열과 인간 항체의 FR의 아미노산 서열을 결합한 아미노산 서열에 대응하는 DNA 서열로서 설계한다. 인간화 항체의 V영역을 코딩하는 DNA는 설계한 DNA 서열을 기초로 당업자 주지의 방법에 의해 제작할 수 있다.
인간 항체는 예를 들어 인간 항체 파지 라이브러리 또는 인간 항체 생산 트랜스제닉 마우스를 이용함으로써 얻을 수 있다(토미즈카 등, Nature Genet., 15, 146-156(1997)). 인간 항체 파지 라이브러리를 이용하는 경우, 예를 들어 CD80, CD86 또는 CD28 단백질 혹은 그 세포외 도메인 혹은 CD80, CD86 또는 CD28을 발현하는 세포를 고상으로 결합시키고 파지 항체 라이브러리를 반응시켜 비결합의 파지를 세정 제거한 후 결합한 파지를 회수함으로써 원하는 클론을 얻을 수 있다(패닝). 인간 항체 생산 트랜스제닉 마우스는 내인성 면역글로불린(Ig) 유전자를 녹아웃한 마우스에 인간 항체의 Ig 유전자를 도입한 마우스이다. 인간 항체 생산 트랜스제닉 마우스를 면역 동물로 하여 상술한 본 개시의 항체 제작 방법에 준하여 항원 단백을 면역함으로써 CD80, CD86 또는 CD28을 특이적으로 인식하는 인간 항체를 얻을 수 있다.
(핵산 분자·벡터·숙주 세포)
다른 국면에서 본 개시는 상술한 본 개시의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 핵산 분자에 관한 것이다. 예를 들어 본 개시의 핵산 분자는 서열번호 17 또는 서열번호 21에 기재된 뉴클레오티드 서열을 VH로서 포함한다. 또한, 다른 국면에서 본 개시의 핵산 분자는 서열번호 19 또는 서열번호 23에 기재된 뉴클레오티드 서열을 VL로서 포함한다. 보다 구체적인 예로서 본 개시의 핵산 분자는 서열번호 1, 5, 9, 13에서 선택되는 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 VH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3, 7, 11, 15에서 선택되는 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 VL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 본 개시의 핵산 분자는 상술한 서열번호와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 핵산 서열을 가지고 있어도 된다. 나아가 본 개시는 상기 핵산 분자를 갖는 벡터를 포함한다. 이러한 벡터로서는 항체의 발현에 이용 가능한 벡터이면 특별히 제한되는 것은 아니고, 적절한 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터 등을 사용하는 숙주에 따라 선택할 수 있다. 다른 국면에서 본 개시는 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포로서는 항체의 발현에 이용 가능한 숙주 세포이면 특별히 제한되는 것은 아니고, 포유류 세포(마우스 세포, 래트 세포, 토끼 세포, 인간 세포 등), 효모, 미생물(대장균 등)을 들 수 있다. 본 개시는 상술한 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 본 개시의 항체의 제조 방법을 포함한다. 배지 배양 방법은 채용하는 숙주 세포에 따라 당업자 주지의 수단으로 적절히 결정할 수 있다.
본 개시의 핵산은 상술한 바로부터 얻어진 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 클로닝하거나 혹은 상술한 바에서 얻어진 항체 또는 그 면역 반응성 단편의 아미노산 서열을 기초로 적절히 핵산 서열을 설계함으로써 얻을 수 있다. 본 개시의 벡터는 얻어진 핵산을 적절히 발현에 적합한 벡터에 넣음으로써 얻을 수 있다. 본 개시의 벡터는 본 개시의 핵산 외에 발현에 필요한 영역(프로모터, 인핸서, 터미네이터 등)을 포함하고 있어도 된다. 또한, 본 개시의 숙주 세포는 본 개시의 벡터를 적절한 세포주(예를 들어 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모, 대장균 등의 미생물)에 도입함으로써 얻을 수 있다.
(조성물)
본 개시의 일 태양에서 본 개시는 본 명세서에 기재된 항체 중 적어도 하나를 포함하는, 면역 관용이 유도된 세포를 제작하기 위한 조성물을 제공한다. 본 개시의 일 실시형태에서는 조성물은 항CD80 항체, 항CD86 항체, 항CD28 항체 또는 CD80 및 CD86에 대한 이중 특이성 항체 혹은 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 면역 관용이 유도된 세포를 예를 들어 장기 이식을 받은 피험체에 투여함으로써 장기 이식에 의한 거절 반응을 저감하는 것이 가능하다. 면역 관용이 유도된 세포는 피험자(수용자) 또는 공여자 유래의 세포 혹은 이들이 혼합된 세포이어도 된다. 본 개시의 조성물은 놀랍게도 사이토카인 생산 세포(예를 들어 대식세포, 호중구, NK(natural killer) 세포)에 의한 사이토카인의 방출을 실질적으로 유도하지 않는다. 사이토카인은 면역 관용을 감약하기 때문에 사이토카인의 방출이 유도되지 않는 것은 유리하다.
다른 국면에서 본 개시는 본 명세서에 기재된 항체를 함유하는 의료용 조성물에 관한 것이다. 일례에서 본 개시의 의료용 조성물은 항CD80 항체, 항CD86 항체, 항CD28 항체 또는 CD80 및 CD86에 대한 이중 특이성 항체를 포함한다. 본 개시의 의료용 조성물은 면역 관용을 유도하기 위해 이용할 수 있다. 본 명세서 전체에서 「면역 관용을 유도하기 위해」란 예를 들어 이식된 장기에 대한 면역 관용을 유도하기 위해, 즉 장기 이식에서의 거절 반응을 억제하기 위해, 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환의 환자에 있어서 면역원이 되는 원인 물질에 대한 과잉의 면역 반응을 억제하여 이들 질환의 증상 완화 또는 치료를 위해 이용하는 경우를 포함한다. 다른 실시형태에서는 본 개시의 의약 조성물은 면역 관용이 유도된 세포를 제작하기 위해 사용된다.
본 명세서에서의 「장기 이식」에 있어서 이식을 받는 「장기」로서는 특별히 제한하는 것은 아니고, 예로서 심장, 신장, 폐, 췌장, 식도, 위, 소장, 대장, 피부, 신경, 혈액, 면역계 세포를 포함하는 혈구 세포, 뼈, 연골, 혈관, 각막, 안구, 골수 또는 간장을 포함한다. 또한, 본 명세서에서 「장기」는 장기 전부나 장기의 덩어리 외에 장기의 일부 또는 장기를 구성하는 세포를 포함한다. 예를 들어 심근 세포나 각막 세포 등도 이식 장기에 포함된다. 또한, 장기 이식이란 타인의 장기를 환자에 이식하는 경우 외에 재생 의료 등에서 타가 유래 줄기세포를 이용하여 제작된 장기를 환자에 이식하는 경우도 포함한다.
본 개시의 항체는 필요에 따라 정제한 후 통상의 방법에 따라 제제화함으로써 의료용 조성물로서 이용할 수 있다. 또한, 본 개시는 면역 관용을 유도하기 위한 의료용 조성물을 제조하기 위한, 본 개시의 항체의 사용을 포함한다. 혹은 본 개시는 본 개시의 항체의 면역 관용을 유도하기 위한 사용을 포함한다. 나아가 본 개시는 본 개시의 항체를 첨가 또는 투여하는 것을 포함하는, 면역 관용을 유도하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어 본 개시는 본 개시의 항체를 장기 이식을 받는 환자에 투여하는 것을 포함하는, 장기 이식에서의 거절 반응의 억제 방법, 본 개시의 항체를 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환의 환자에 투여하는 것을 포함하는, 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환의 치료 방법, 본 개시의 항체를 iPS 세포 혹은 ES 세포 또는 이들 세포 유래의 세포, 조직, 장기 이식을 받는 환자에 투여하는 것을 포함하는, iPS 세포 혹은 ES 세포 또는 이들 세포 유래의(로부터 분화한) 세포, 조직, 장기 이식에서의 거절 반응의 억제 방법을 포함한다.
iPS 세포 또는 ES 세포에서 유래하는(로부터 분화한) 세포, 조직 혹은 장기로서는 예를 들어 신경 세포 또는 조직, 각막 세포 또는 조직, 심근 세포 또는 조직, 간장 또는 조직, 연골 세포 또는 조직, 피부 세포 또는 조직, 신장 또는 조직 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 바람직한 실시형태에서 iPS 세포 또는 ES 세포에서 유래하는(분화한) 세포, 조직 혹은 장기로서는 신경 세포 또는 조직, 심근 세포 또는 조직, 연골 세포 또는 조직 및 피부 세포 또는 조직을 들 수 있다.
본 개시의 의료용 조성물은 환자에 직접 투여함으로써 사용할 수도 있고, 면역 관용을 유도하고자 하는 환자로부터 채취한 PBMC에 면역 관용을 유도하는 목적의 항원과 함께 ex vivo로 접촉시킴으로써 그 항원에 대해 아네르기인 면역 세포를 제작함으로써 사용할 수도 있다.
본 개시의 의료용 조성물을 환자에 직접 투여하는 경우, 경구 또는 비경구의 어떠한 제제를 채용해도 된다. 비경구 투여를 위한 조성물로서는 예를 들어 점안, 주사제, 점비제, 좌제, 첩포제, 연고 등을 들 수 있다. 바람직하게는 주사제이다. 본 개시의 의료용 조성물의 제형은 예를 들어 액제 또는 동결 건조 제제를 들 수 있다. 본 개시의 의료용 조성물을 주사제로서 사용하는 경우, 필요에 따라 프로필렌글리콜, 에틸렌디아민 등의 용해 보조제, 인산염 등의 완충재, 염화나트륨, 글리세린 등의 등장화제, 아황산염 등의 안정제, 페놀 등의 보존제, 리도카인 등의 무통화제 등의 첨가물(「의약품 첨가물 사전」 야쿠지 닛포사, 「Handbook of Pharmaceutical Excipients Fifth Edition」 APhA Publications사 참조)을 더할 수 있다. 또한, 본 개시의 의료용 조성물을 주사제로서 사용하는 경우 보존 용기로서는 앰플, 바이알, 프리필드 시린지, 펜형 주사기용 카트리지, 점적용 백 등을 들 수 있다.
예를 들어 본 개시의 의료용 조성물(치료약 혹은 예방약)은 주사제로서 이용할 수 있고, 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 유리체내 주사제, 점적 주사제 등의 제형을 포함한다. 이러한 주사제는 공지의 방법에 따라 예를 들어 상기 항체 등을 통상 주사제에 이용되는 무균의 수성 혹은 유성액에 용해, 현탁 또는 유화함으로써 조제할 수 있다. 주사용 수성액으로서는 예를 들어 생리식염수, 포도당, 자당, 만니톨, 그 밖의 보조약을 포함하는 등장액 등을 이용할 수 있고, 적당한 용해 보조제, 예를 들어 알코올(예, 에탄올), 폴리알코올(예, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온 계면활성제〔예, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, HCO-50(polyoxyethylene(50mol) adduct of hydrogenated castor oil)〕 등과 병용할 수 있다. 유성액으로서는 예를 들어 참기름, 콩기름 등을 이용할 수 있고, 용해 보조제로서 안식향산 벤질, 벤질알코올 등과 병용할 수 있다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플, 바이알, 시린지에 채워진다. 또한, 본 개시의 항체 또는 그 면역 반응성 단편에 적당한 부형제를 첨가함으로써 동결 건조 제제를 조제하고 필요시 주사용수, 생리식염수 등으로 용해하여 주사액으로 할 수도 있다. 또, 일반적으로 항체 등의 단백질의 경구 투여는 소화기에 의해 분해되기 때문에 곤란하다고 하지만, 항체 단편이나 수식한 항체 단편과 제형의 창의 연구에 의해 경구 투여의 가능성도 있다. 경구 투여의 제제로서는 예를 들어 캡슐제, 정제, 시럽제, 과립제 등을 들 수 있다.
본 개시의 의료용 조성물은 활성 성분의 투여량에 적합한 투약 단위의 제형으로 조제되는 것이 적합하다. 이러한 투약 단위의 제형으로서는 주사제(앰플, 바이알, 프리필드 시린지)가 예시되고, 투약 단위 제형당 통상 5~500mg, 5~100mg, 10~250mg의 본 개시의 항체 또는 그 면역 반응성 단편을 함유하고 있어도 된다.
본 개시의 의료용 조성물의 투여는 국소적이어도 되고 전신적이어도 된다. 투여 방법에는 특별히 제한은 없고 상술한 바와 같이 비경구적 또는 경구적으로 투여된다. 비경구적 투여 경로로서는 안내(眼內), 피하, 복강내, 혈중(정맥내 혹은 동맥내) 또는 척수액에의 주사 또는 점적 등을 들 수 있고, 바람직하게는 혈중에의 투여이다. 본 개시의 의료용 조성물(치료약 혹은 예방약)은 일시적으로 투여해도 되고, 지속적 또는 단속적으로 투여해도 된다. 예를 들어 투여는 1분간~2주간 지속 투여할 수도 있다.
본 개시의 의료용 조성물의 투여량은 원하는 치료 효과 또는 예방 효과가 얻어지는 투여량이면 특별히 한정은 없고 증상, 성별, 연령 등에 따라 적절히 결정할 수 있다. 본 개시의 의료용 조성물의 투여량은 예를 들어 면역 관용 유도의 정도를 지표로서 결정할 수 있다. 예를 들어 본 개시의 의료용 조성물의 유효 성분의 1회량으로서 통상 0.01~20mg/kg 체중 정도, 바람직하게는 0.1~10mg/kg 체중 정도, 더욱 바람직하게는 0.1~5mg/kg 체중 정도를 한 달 1~10회 정도, 바람직하게는 한 달 1~5회 정도 정맥 주사에 의해 투여하는 것이 적합하다. 다른 비경구 투여 경구 투여의 경우도 이에 준하는 양을 투여할 수 있다. 증상이 특히 심한 경우에는 그 증상에 따라 증량 또는 투여 횟수를 증가시켜도 된다.
본 개시의 의료용 조성물을 면역 관용을 유도하고자 하는 환자로부터 채취한 PBMC에 면역 관용을 유도하는 목적의 항원과 함께 ex vivo로 접촉시킴으로써 그 항원에 대해 아네르기인 면역 세포를 제작함으로써 사용하는 경우, 상술한 투여용 조성물에 준하여 액상, 분말상, 태블릿상, 겔상, 과립상 등의 형태로 조제할 수 있다.
(면역 관용 유도 세포)
다른 국면에서 본 명세서에 기재된 항체로 면역 관용이 유도된 세포를 제공한다. 면역 관용은 피험체 유래의 세포와 피험체에서 유래하지 않는 항원 또는 항원의 함유물을 혼합함으로써 유도될 수 있다. 본 개시의 또 다른 국면에서 본 개시는 본 명세서에 기재된 항체와 피험체 유래의 세포와 피험체에서 유래하지 않는 항원 또는 항원의 함유물(예를 들어 세포)을 혼합하는 단계를 포함하는, 피험체에서 유래하지 않는 항원에 의해 발생하는 질환, 장해 또는 상태를 처치 또는 예방하기 위한 세포를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 질환, 장해 또는 상태는 이식 면역 거절 반응, 알레르기, 자기면역 질환, 이식편대숙주병, iPS 세포 또는 ES 세포 및 이들 세포에서 유래하는 세포, 조직 또는 장기의 이식에 의해 일어나는 면역 거절 반응으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.
본 개시가 대상으로 하는 질환 등이 이식 면역 거절 반응인 실시형태에 있어서, 아네르기 세포는 상기 항체와 수용자 유래의 세포(PBMC 또는 비장 세포)와 공여자 유래의 항원 또는 공여자 유래의 항원의 함유물을 혼합함으로써 유도될 수 있다. 공여자 유래의 항원의 함유물은 PBMC, 비장 세포 또는 이식되는 장기 유래의 세포일 수 있다.
본 개시가 대상으로 하는 질환 등이 알레르기인 실시형태에 있어서, 아네르기 세포는 상기 항체와 피험체 유래의 세포(PBMC 또는 비장 세포)와 알레르기를 일으키는 피험체에서 유래하지 않는 항원을 혼합함으로써 유도될 수 있다.
본 개시가 대상으로 하는 질환 등이 자기면역 질환인 실시형태에 있어서, 아네르기 세포는 상기 항체와 피험체 유래의 세포(PBMC 또는 비장 세포)와 자기면역 질환의 원인이 되는 피험체 유래의 항원을 혼합함으로써 유도될 수 있다.
본 개시가 대상으로 하는 질환 등이 이식편대숙주병인 실시형태에 있어서, 아네르기 세포는 상기 항체와 이식편을 제공하는 공여자의 PBMC 또는 비장 세포와 수용자 유래의 항원 또는 이 항원의 함유물을 혼합함으로써 유도될 수 있다. 수용자 유래의 항원의 함유물은 PBMC, 비장 세포 또는 장기가 이식되는 부위의 주변 세포 혹은 이에서 유래하는 세포일 수 있다.
본 개시가 대상으로 하는 질환 등이 iPS 세포 또는 ES 세포 및 이들 세포에서 유래하는 세포, 조직 또는 장기의 이식에 의해 일어나는 면역 거절 반응인 실시형태에 있어서, 아네르기 세포는 상기 항체와 피험체 유래의 세포(PBMC 또는 비장 세포)와 iPS 세포 또는 ES 세포로부터 분화시킨 이식에 이용하는 세포를 혼합함으로써 유도될 수 있다.
이하에 본 개시에 의한 질환 등의 치료예를 나타내지만 이하에 한정되는 것은 아니다.
(알레르기 및 자기면역 질환)
알레르기 및 자기면역 질환에 관해서는 환자의 말초혈로부터 얻은 대식세포를 관례적인 방법에 의해 항원 제시능이 높은 수상세포(대식세포 유래 수상세포)로 분화시켜 방사선(γ선) 조사 후의 이 세포에 알레르기나 자기면역 질환에서의 과잉 반응의 원인이 되는 항원을 제시시키고, 동일한 환자 말초혈로부터 얻은 T세포군과 항CD80 항체 및/또는 항CD86 항체의 존재하에서 1~2주간 공배양하여 알레르기나 자기면역 질환의 원인이 되는 항원에 특이적인 아네르기 세포를 얻는다. 이 아네르기 세포를 환자에 투여함으로써 알레르기나 자기면역 질환의 원인이 되는 항원에 특이적인 면역 관용을 유도하여 알레르기 및 자기면역 질환의 예방 및 치료에 이용한다. 예방적 요법인지 치료인지 나아가 증상의 강약 등의 여러 가지 조건에 의해 투여 횟수는 복수회가 되기도 한다.
(이식편대숙주병)
이식편대숙주병에서는 이식 면역 거절 반응에 대한 치료와는 대조적으로 이식편을 제공하는 공여자의 PBMC 또는 T세포 등의 이식편대숙주병의 원인이 될 수 있는 세포를 방사선(γ선) 조사한 숙주 유래의 PBMC 또는 그 이외의 세포와 항CD80 항체 및/또는 항CD86 항체의 존재하에서 1~2주간 공배양하여 숙주에 특이적인 아네르기 세포를 얻는다. 이 아네르기 세포를 숙주에 투여함으로써 이식편대숙주병의 원인이 되는 이식편에 의한 숙주에의 반응을 억제하여(면역 관용을 유도하여) 이식편대숙주병을 예방 및 치료한다. 예방적 요법인지 치료인지 나아가 이식하는 조직이나 그 크기, 증상의 강약 등의 여러 가지 조건에 의해 투여 횟수는 복수회가 되기도 한다.
(iPS 세포 또는 ES 세포 및 이들 세포에서 유래하는 세포, 조직 또는 장기의 이식에 의해 일어나는 면역 거절 반응)
iPS 세포 또는 ES 세포를 이용한 치료에의 응용에서는 iPS 세포 또는 ES 세포로부터 분화시킨 이식에 이용하는 세포 또는 수상세포에 방사선(γ선)을 조사하고, 이 세포와 이식을 받는 환자의 PBMC 또는 T세포군을 항CD80 항체 및/또는 항CD86 항체의 존재하에서 1~2주간 공배양하여 iPS 세포 또는 ES 세포로부터 분화시킨 세포에 특이적인 아네르기 세포를 얻는다. 이 아네르기 세포를 숙주에 투여함으로써 iPS 세포 또는 ES 세포에서 유래하는 이식한 세포, 조직 및 장기에 특이적인 면역 관용을 유도하여 이들에의 거절 반응을 예방 및 치료한다. 예방적 요법인지 치료인지 나아가 이식하는 조직이나 그 크기, 증상의 강약의 여러 가지 조건에 의해 투여 횟수는 복수회가 되기도 한다.
구체적인 실시형태에서 본 개시는 상기 항체(상기 항체를 함유하는 조성물을 포함함, 이하 동일)와 면역 관용을 유도하고자 하는 항원 또는 이 항원을 표면에 갖는 세포와 PBMC를 접촉시키는 것을 포함하는, 환자의 PBMC의 상기 항원에 대한 아네르기를 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 개시의 면역 관용을 유도하는 방법은 ex vivo로 행해진다. 예를 들어 장기 이식에 있어서 이식을 받는 환자의 이식 장기에 대한 거절 반응을 억제하는 것을 목적으로 하는 경우, PBMC는 장기 이식을 받는 환자로부터 채취된 세포이다. 또한, PBMC가 자기면역 질환 또는 알레르기 질환의 치료 또는 개선을 목적으로 하는 경우, PBMC는 그 환자로부터 채취된 세포이다.
예를 들어 장기 이식의 거절 반응을 억제하기 위한 면역 관용의 유도는 이하의 방법에 의해 행할 수 있다. 장기 이식을 받는 환자(수용자) PBMC와 장기를 제공하는 대상자(공여자) PBMC를 조제하고, 공여자 PBMC에 방사선 30Gy를 조사한다. 수용자 PBMC와 1:1로 혼합하여 본 개시의 항체(바람직하게는 항인간 CD80 항체 및 항인간 CD86 항체의 조합)를 첨가한다. PBMC용 배지 중 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 3~7일 배양함으로써 공여자에 대해 무반응인(anergic) 수용자 PBMC를 조제할 수 있다.
또한, 예를 들어 자기면역 질환 또는 알레르기 질환의 치료 또는 개선을 위한 면역 관용의 유도는 이하의 방법에 의해 행할 수 있다. 환자 PBMC를 조제하고, 자기면역 질환 또는 알레르기 질환의 원인이 되는 항원과 혼합하여 본 개시의 항체(바람직하게는 항인간 CD80 항체 및 항인간 CD86 항체의 조합)를 첨가한다. PBMC용 배지 중 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 3~7일 배양함으로써 상기 항원에 대해 무반응인(anergic) 수용자 PBMC를 조제할 수 있다.
본 개시는 상기 방법에 의해 아네르기가 유도된 세포(예를 들어 PBMC)를 포함한다. 아네르기가 유도된 세포(예를 들어 PBMC)는 환자에 투여함으로써 환자에서의 면역 관용을 유도할 수 있기 때문에 아네르기가 유도된 세포(예를 들어 PBMC)는 세포 치료제로 할 수 있다. 따라서, 본 개시는 상기 방법에 의해 아네르기가 유도된 세포(예를 들어 PBMC)를 유효성 성분으로서 함유하는 세포 치료제, 바람직하게는 이식 장기에 대한 아네르기가 유도된 이식을 받는 환자의 세포(예를 들어 PBMC)를 유효성 성분으로서 함유하는, 장기 이식에서의 거절 반응을 억제하기 위한 세포 치료제, 혹은 과잉으로 면역 반응함으로써 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환의 원인이 되는 항원에 대한 아네르기가 유도된 세포(예를 들어 PBMC)를 유효성 성분으로서 함유하는, 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환을 치료하기 위한 세포 치료제, iPS 세포나 ES 세포나 이들 세포에서 유래하는 세포, 조직 또는 장기의 이식에서의 거절 반응을 억제하기 위한 세포 치료제에 관한 것이다. 이러한 거절 반응으로서는 이식편대숙주병이 예시된다.
본 개시의 세포 치료제는 환자에 투여함으로써 환자에서의 면역 관용을 유도할 수 있다. 예를 들어 본 개시는 이식 장기에 대한 아네르기가 유도된 이식을 받는 환자의 세포(예를 들어 PBMC)를 유효성 성분으로서 함유하는, 장기 이식에서의 거절 반응을 억제하기 위한 세포 치료제를 장기 이식을 받는 환자에 투여하는 것을 포함하는, 장기 이식에서의 거절 반응의 억제 방법을 포함한다. 또한, 본 개시는 과잉으로 면역 반응함으로써 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환의 원인이 되는 항원에 대한 아네르기가 유도된 세포(예를 들어 PBMC)를 유효성 성분으로서 함유하는, 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환을 치료하기 위한 세포 치료제를 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환의 환자에 투여하는 것을 포함하는, 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환의 치료 방법을 포함한다. 또한, 본 개시는 이식하는 iPS 세포 혹은 ES 세포 또는 이들 세포 유래의 세포, 조직 또는 장기에 대해 아네르기가 유도된 이식을 받는 환자의 세포(예를 들어 PBMC)를 유효성 성분으로서 함유하는, iPS 세포나 ES 세포나 이들 세포에서 유래하는 세포, 조직 또는 장기의 이식에서의 거절 반응을 억제하기 위한 세포 치료제를 장기 이식을 받는 환자에 투여하는 것을 포함하는, iPS 세포나 ES 세포나 이들 세포에서 유래하는 세포, 조직 또는 장기의 이식에서의 거절 반응의 억제 방법을 포함한다.
본 개시의 세포 치료제는 혈청 함유/비함유의 인간에 투여 가능한 배지 또는 생리식염수 중에 PBMC를 함유한다. 세포가 접착성인 경우에는 세포 박리가 가능한 베이스재에 담지하여 보존하고, 사용시에 세포를 박리하여 사용할 수 있다. 예를 들어 온도 변화에 따라 세포 박리 가능한 베이스재(RepCell, 셀시드사, 일본) 등을 이용할 수 있다.
본 개시는 상기 항체와 면역 관용을 유도하고자 하는 항원 또는 이 항원을 표면에 갖는 세포와 세포(예를 들어 PBMC)를 접촉시킴으로써 환자의 세포(예를 들어 PBMC)의 상기 항원에 대한 아네르기를 유도하는 것, 아네르기가 유도된 세포(예를 들어 PBMC)를 환자에 투여하는 것을 포함하는, 환자에서의 면역 관용을 유도하는 방법이어도 된다. 예를 들어 본 개시는 공여자 유래 세포와 환자의 세포(예를 들어 PBMC)를 접촉시킴으로써 환자의 세포(예를 들어 PBMC)의 이식 장기에 대한 아네르기를 유도함으로써 이식되는 장기에 대한 면역 관용이 유도된 환자 유래의 세포(예를 들어 PBMC)를 조제하는 것, 조제된 세포(예를 들어 PBMC)를 장기 이식을 받는 환자에 투여하는 것을 포함하는, 장기 이식에서의 거절 반응의 억제 방법을 포함한다. 또한, 본 개시는 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환의 원인이 되는 항원과 환자의 세포(예를 들어 PBMC)를 접촉시킴으로써 환자의 세포(예를 들어 PBMC)의 상기 항원에 대한 아네르기를 유도함으로써 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환의 원인이 되는 항원에 대한 면역 관용이 유도된 환자 유래의 세포(예를 들어 PBMC)를 조제하는 것, 조제된 세포(예를 들어 PBMC)를 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환의 환자에 투여하는 것을 포함하는, 자기면역 질환 또는 알레르기성 질환의 치료 방법 또는 개선 방법이어도 된다. 또한, 본 개시는 iPS 세포 혹은 ES 세포 혹은 이들 세포 유래의 세포, 조직 또는 장기와 환자의 세포(예를 들어 PBMC)를 접촉시킴으로써 환자의 세포(예를 들어 PBMC)의 iPS 세포나 ES 세포 또는 이들 세포 유래의 세포, 조직 또는 장기에 대한 아네르기를 유도함으로써 이식되는 iPS 세포 혹은 ES 세포 또는 이들 세포 유래의 세포, 조직 혹은 장기에 대한 면역 관용이 유도된 환자 유래의 세포(예를 들어 PBMC)를 조제하는 것, 조제된 세포(예를 들어 PBMC)를 iPS 세포 혹은 ES 세포 또는 이들 세포 유래의 세포, 조직 혹은 장기 이식을 받는 환자에 투여하는 것을 포함하는, iPS 세포 혹은 ES 세포 또는 이들 세포 유래의 세포, 조직 혹은 장기의 이식에서의 거절 반응의 억제 방법을 포함한다.
본 명세서에서 세포 치료제(아네르기가 유도된 세포, 예를 들어 PBMC)의 투여는 원하는 치료 효과 또는 예방 효과가 얻어지는 투여량이면 특별히 한정은 없고 증상, 성별, 연령 등에 따라 적절히 결정할 수 있다. 본 개시의 세포 치료제의 투여량은 예를 들어 면역 관용 유도의 정도를 지표로서 결정할 수 있다. 예를 들어 본 개시의 세포 치료제의 아네르기가 유도된 PBMC의 1회량으로서 통상 1.0~3.7×107 세포/kg 체중 정도, 바람직하게는 2.0~5.0×107 세포/kg 체중 정도, 더욱 바람직하게는 3.0~5.0×107 세포/kg 체중 정도를 한 달 1~10회 정도, 바람직하게는 한 달 1~5회 정도 정맥 주사에 의해 투여하는 것이 적합하다. 면역 억제 효과가 보이지 않는 경우에는 그 증상에 따라 증량 또는 투여 횟수를 증가시켜도 된다.
(주기(注記))
본 명세서에서 「또는」은 문장 중에 열거되어 있는 사항의 「적어도 하나 이상」을 채용할 수 있을 때에 사용된다. 「혹은」도 마찬가지이다. 본 명세서에서 「2개의 값의 범위 내」라고 명기한 경우 그 범위에는 2개의 값 자체도 포함한다.
본 명세서에서 인용된 과학 문헌, 특허, 특허출원 등의 참고 문헌은 그 전체가 각각 구체적으로 기재된 것과 동일한 정도로 본 명세서에서 참고로서 원용된다.
이상 본 개시를 이해의 용이를 위해 바람직한 실시형태를 나타내어 설명하였다. 이하에 실시예에 기초하여 본 개시를 설명하지만 상술한 설명 및 이하의 실시예는 예시의 목적으로만 제공되며 본 개시를 한정하는 목적으로 제공한 것은 아니다. 따라서, 본 개시의 범위는 본 명세서에 구체적으로 기재된 실시형태에도 실시예에도 한정되지 않고 청구범위에 의해서만 한정된다.
실시예
이하, 실시예에 기초하여 본 개시를 보다 구체적으로 설명한다. 단, 본 개시는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또, 본원 전체를 통해 인용되는 모든 문헌은 참조에 의해 그대로 본원에 도입된다.
이하에 실시예를 기재한다. 이하의 실시예에서 이용하는 생물의 취급은 쥰텐도 대학이나 감독관청에서 규정되는 기준을 준수하였다. 동물 실험의 실시에 있어서는 「동물의 애호 및 관리에 관한 법률」, 「실험동물의 사육 및 보관과 고통의 경감에 관한 기준」(2006년 환경성 고시 제88호), 「연구기관 등에서의 동물 실험 등의 실시에 관한 기본 지침」(2006년 문부과학성 고시 제71호)에 기초하여 제정된 쥰텐도 대학 동물 실험 등 관리 규칙을 준수하여 행하였다. 실험은 이른바 3R에 기초하여 계획하고 쥰텐도 대학 의학부 실험동물 위원회에 계획서를 제출하여 심의 후 이미 승인, 수리되어 있다. 유전자 조작 마우스의 사용에서는 재조합 DNA 작출 동물을 이용한 실험 계획의 학내 안전 위원회의 심사를 받아 승인을 받았다. 나아가 재조합 DNA 실험에 관해서는 쥰텐도 대학 의학부 DNA 실험 안전 위원회에 계획서를 제출하여 심의 후 이미 승인, 수리되어 있고, 「유전자 재조합 생물 등의 사용 등의 규제에 의한 생물의 다양성 확보에 관한 법률」 등의 관계 규정에 따라 연구를 진행하였다. 인간 말초혈(PBMC)을 이용한 실험에 관해서는 쥰텐도 대학 의학부 윤리 위원회에서 공정한 심의와 정보 공개의 원칙에 기초한 심사를 받아 적절하다는 판단에 의해 승인을 이미 받았다. 검체 제공자로부터 연구 목적·계획·방법에 관한 인폼드 컨센트(Informed Consent)를 얻은 후에 개인정보의 보호를 엄중하게 행하여 익명성을 유지하면서 연구를 진행하였다. 실험을 수행함에 있어서는 쥰텐도 대학 의학부 및 사가미하라 병원의 윤리 위원회가 정하는 윤리 규정과 후생노동성이 정하는 "임상 연구에 관한 지침"을 준수하였다. 시약류는 구체적으로는 실시예 중에 기재한 제품을 사용하였지만 다른 제조사(Sigma-Aldrich, 와코 순약, 나칼라이, R & D Systems, USCN Life Science INC, BD bioscience, BioLegend 등)의 동등품으로도 대용 가능하다.
(실시예 1) 항인간 CD80 및 항CD86 항체(서브클래스 IgG1) 존재하에서의 혼합 림프구 반응(MLR)
(재료 및 방법)
Promo cell사 제품 Lymphocyte separation Media(Cat.No.C-44010)를 이용하여 3명의 지원자(1명을 공여자(공여자 C), 2명을 수용자(수용자 A 및 수용자 B)로 지정)의 인간 말초혈로부터 단핵세포(PBMC)를 분리하고, Biowest사 제품 2% 인간 혈청 AB형(pool)이 들어간 ALyS505N-0 배지(세포 과학 연구소(CSTI) 1020P10)에서 4×106cells/ml가 되도록 조정하였다. 공여자 PBMC에는 방사선(γ선) 30Gy를 조사하였다.
공여자 PBMC와 수용자 PBMC를 1:1의 비율이 되도록 96well plate(Corning사 제품, Cat.No.3799)에 100μL/well씩 4well에 나누어 주입하고(합하여 최종적으로 200μL/well), 여기에 인간화 항인간 CD80 항체(v2(서브클래스 IgG1))와 항인간 CD86 항체(v5(서브클래스 IgG1))의 조합 또는 eBioscience사 제품 마우스 항인간 CD80 항체(Cat.No.16-0809-85)(서브클래스 IgG1)와 마우스 항인간 CD86 항체(Cat.No.16-0869-85)(서브클래스 IgG2)의 조합을 각 항체의 첨가 후 농도가 0.1, 1, 10μg/mL이 되도록 10μl씩 첨가하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터 중에서 배양을 개시하였다. 배양 개시 4일째에 3H-티미딘(10μL)을 첨가하고, 배양 개시 5일째(3H-티미딘 첨가의 16~20시간 후)에 Cell Harvester(Molecular Devices)에 의해 배양 세포를 회수하여 신틸레이션 카운터로 3H-티미딘 도입량을 측정하였다.
IFNγ 생산은 전술한 바와 같은 방법으로 혼합되고 마찬가지로 각 항체가 첨가된 PBMC 혼합물을 48well Plate(Corning사 제품, Cat.No.3548)에 500μL/well로 3well에 나누어 주입하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터 중에서 배양을 개시하였다. 배양 6일째에 상청을 회수하여 회수한 샘플을 10~25배로 희석 후 Bioligands사 제품 Human IFNγ ELISA MAX™ Deluxe, Cat.430104를 이용하여 측정하였다.
(결과)
그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이 인간화 항인간 CD80 항체(v2(서브클래스 IgG1))와 인간화 항인간 CD86 항체(v5(서브클래스 IgG1))의 조합은 eBioscience사 제품 마우스 항인간 CD80 항체와 마우스 항인간 CD86 항체의 조합과 거의 동등하게 3H-티미딘 도입이 적고, 즉 면역 세포의 활성화를 억제하였다. 한편, 도 2에 도시된 바와 같이 IFNγ 생산 평가의 결과, eBioscience사 제품 마우스 항인간 CD80, CD86 항체 존재하에서는 생산이 적은 것에 반해, 인간화 항인간 CD80, CD86 항체(서브클래스 IgG1) 존재하에서는 항체 첨가량에 따른 IFNγ 생산이 보이고, 10μg/mL에서는 항체 비존재하(도 2 Allo) 이상의 생산이 보였다. 이론에 속박되는 것은 바라지 않지만, eBioscience사 제품 항체는 마우스 항체이며 반응성이 낮은 것에 기인하여 IFNγ 생산이 적다고 생각된다.
(실시예 2) 항인간 CD80 및 항CD86 항체(서브클래스 IgG1) 존재하에서의 혼합 림프구 반응(MLR)
(재료 및 방법)
실시예 1과 같은 방법으로 인간화 항인간 CD80 항체(v2(서브클래스 IgG1))와 항인간 CD86 항체(v5 또는 v9(서브클래스 IgG1))의 조합 또는 eBioscience사 제품 마우스 항인간 CD80 항체(Cat.No.16-0809-85)와 마우스 항인간 CD86 항체(Cat.No.16-0869-85)의 조합을 각 항체의 첨가 후 농도가 10μg/mL이 되도록 첨가한 경우의 3H-티미딘 도입을 평가하였다. 또, 3명의 지원자 중 1명을 공여자(공여자 F), 2명을 수용자(수용자 D 및 수용자 E)로 지정하였다.
또한, 인간화 항인간 CD80 항체(v2(서브클래스 IgG1))와 인간화 항인간 CD86 항체(v9(서브클래스 IgG1))의 조합 및 eBioscience사 제품 마우스 항인간 CD80 항체와 항인간 CD86 항체의 조합에 대해 IFNγ 생산에 대해 평가하였다. 인간화 항인간 CD80 항체(v2(서브클래스 IgG1))와 항인간 CD86 항체(v9(서브클래스 IgG1))의 조합에 대해서는 실시예 1의 방법에 더하여 방사선 조사한 공여자 PBMC를 더하지 않은 경우의 IFNγ 생산에 대해서도 평가하였다.
(결과)
그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이 인간화 항인간 CD80 항체와 항인간 CD86 항체의 조합은 마우스 항인간 CD80 항체와 항인간 CD86 항체의 조합보다 3H-티미딘 도입 억제를 나타내었다. 한편, 도 4에 도시된 바와 같이 IFNγ 생산은 실시예 1과 같이 eBioscience사 제품 마우스 항인간 CD80, CD86 항체에서는 생산량은 적었다. 인간화 항인간 CD80, CD86 항체에서는 항체 비존재에서의 공여자 자극시와 동등 또는 그 이상의 생산이 보이고, 나아가 방사선 조사한 공여자 PBMC를 더하지 않은 경우에서도 인간화 항CD80과 항인간 CD86 항체의 첨가시에는 동일한 IFNγ 생산이 보였다.
(실시예 3) 항인간 CD80 및 항CD86 항체(서브클래스 IgG1, IgG2, IgG4) 존재하에서의 혼합 림프구 반응(MLR)
실시예 2에서 방사선 조사한 공여자 PBMC를 더하지 않은 경우에서도 IFNγ 생산이 보였기 때문에 인간화 항인간 CD80 항체와 항인간 CD86 항체의 클래스 스위치를 행하여 이 인간화 항인간 CD80 항체(v2(서브클래스 IgG2 또는 IgG4))와 항인간 CD86 항체(v9(서브클래스 IgG2 또는 IgG4))의 동일한 서브클래스끼리의 조합 및 eBioscience사 제품 마우스 항인간 CD80 항체(품번 16-0809-85)와 항인간 CD86 항체(품번 16-0869-85)의 조합을 각 항체의 첨가 후 농도가 1, 3 또는 10μg/mL이 되도록 첨가한 경우의 3H-티미딘 도입과, 각 항체의 첨가 후 농도가 10μg/mL이 되도록 첨가한 경우의 IFNγ 생산에 대해 평가하였다. 또, 3명의 지원자 중 1명을 공여자(공여자 I), 2명을 수용자(수용자 G 및 수용자 H)로 지정하였다. 구체적인 실험계는 이하와 같이 하였다.
[3H-티미딘 도입(항체 농도 각 1, 3, 10μg/mL)](도 5)
-항체 첨가 없음(Allo), 방사선 조사한 공여자 PBMC 첨가
-eBioscience사 제품 마우스 항인간 CD80 항체, 마우스 항인간 CD86 항체
-인간화 항인간 CD80 항체(v2(IgG2)), 인간화 항인간 CD86 항체(v9(IgG2))
-인간화 항인간 CD80 항체(v2(IgG4)), 인간화 항인간 CD86 항체(v9(IgG4))
[IFNγ 생산(항체 농도 각 10μg/mL)](도 6)
방사선 조사한 공여자 PBMC 첨가 있음(Allo)
-항체 첨가 없음
-eBioscience사 제품 마우스 항인간 CD80 항체, 항인간 CD86 항체
-인간화 항인간 CD80 항체(v2(IgG2)), 인간화 항인간 CD86 항체(v9(IgG2))
-인간화 항인간 CD80 항체(v2(IgG4)), 인간화 항인간 CD86 항체(v9(IgG4))
방사선 조사한 공여자 PBMC 첨가 없음(Naive)
-항체 첨가 없음
-eBioscience사 제품 마우스 CD80 항체, 항CD86 항체
-인간화 항CD80 항체(v2(IgG1)), 인간화 항인간 CD86 항체(v9(IgG1))
-인간화 항CD80 항체(v2(IgG2)), 인간화 항인간 CD86 항체(v9(IgG2))
-인간화 항CD80 항체(v2(IgG4)), 인간화 항인간 CD86 항체(v9(IgG4))
(결과)
그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이 서브클래스 IgG2와 IgG4는 실시예 1 및 2와 같이 3H-티미딘 도입 억제를 나타내었다. 한편, 도 6에 도시된 바와 같이 IFNγ 생산에 대해서는 서브클래스 IgG1에서는 그 생산이 보였지만 놀랍게도 서브클래스 IgG2 및 IgG4에서는 IFNγ가 전혀 생산되지 않았다.
(실시예 4) 항인간 CD80 및 항인간 CD86 항체(서브클래스 IgG1, IgG2, IgG4) 존재하에서 배양하여 얻어진 세포를 첨가한 경우의 혼합 림프구 반응(MLR)
(재료 및 방법)
실시예 1에 기재된 방법으로 인간화 항인간 CD80 항체(v2)와 항인간 CD86 항체(v9)의 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG4의 조합의 존재하에서 14일째까지 배양을 계속하였다. 서브클래스 IgG2의 인간화 항인간 CD80 항체(v2)는 중쇄가 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지고 경쇄가 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진다. 서브클래스 IgG4의 인간화 항인간 CD80 항체(v2)는 중쇄가 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지고 경쇄가 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진다. 서브클래스 IgG2의 항인간 CD86 항체(v9)는 중쇄가 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지고 경쇄가 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진다. 서브클래스 IgG4의 항인간 CD86 항체(v9)는 중쇄가 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어지고 경쇄가 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진다. 배양 후 얻어진 아네르기 세포와 수용자 PBMC(R-PBMC), 방사선을 조사한 공여자 PBMC(D-PBMC)를 이하의 표에 따라 혼합 후 실시예 1에 기재된 방법으로 3H-티미딘 도입량을 평가하였다.
Figure pct00001
(결과)
그 결과, 도 7에 도시된 바와 같이 어떤 서브클래스의 항체 존재하에서 얻어진 세포도 동등한 3H-티미딘 도입을 억제하였다.
(실시예 5) 장기 이식을 받은 환자에서의 면역 관용의 유도
Satoru Todo et al. Hepatorogy, 64(vol.2), 632-643 (2016)에 기재된 방법과 동일한 방법에 의해 시험하였다. 간결하게는 수용자의 비장 또는 말초혈로부터 회수한 림프구와 30Gy로 방사선 조사된 공여자 유래의 림프구와 실시예 4에서 사용한 서브클래스 IgG4의 인간화 항CD80 항체 및 항CD86 항체를 공배양함으로써 공여자 항원에 특이적인 아네르기 T세포를 유도한다. 이 아네르기 T세포를 간장 이식을 받은 수용자에 수술 후 13일째에 투여한다. 그 후 경과를 관찰한다.
(실시예 6) 키메라 항인간 CD80 및 키메라 항인간 CD86 항체(서브클래스 IgG1)
항체의 제작
본 발명자들은 세포 치료에서의 사용을 고려하여 항인간 CD80 항체 및 항인간 CD86 항체의 개량을 시도하였다. 구체적으로는 eBioscience사 제품 마우스 항인간 CD80 항체와 마우스 항인간 CD86 항체를 기초로 하여 각각의 키메라 항체를 제작하였다. 제작한 키메라 항인간 CD80 항체(서브클래스 IgG1)는 중쇄가 서열번호 38의 아미노산 서열로 이루어지고 경쇄가 서열번호 40의 아미노산 서열로 이루어진다. 또한, 제작한 키메라 항인간 CD86 항체(서브클래스 IgG1)는 중쇄가 서열번호 42의 아미노산 서열로 이루어지고 경쇄가 서열번호 44의 아미노산 서열로 이루어진다. 이들을 코딩하는 플라스미드를 외부(TPG Biologics, Inc. 대만)에 위탁하여 CHO 세포로부터 발현시켜 항체를 생산·정제하였다.
키메라 항인간 CD80 및 키메라 항CD86 항체(서브클래스 IgG1) 존재하에서의 혼합 림프구 반응(MLR)
IFNγ 생산
실시예 1에 기재된 방법과 거의 마찬가지로 Promo cell사 제품 Lymphocyte separation Media(Cat.No.C-44010)를 이용하여 2명의 지원자(1명을 공여자, 다른 1명을 수용자로 지정)의 인간 말초혈로부터 단핵세포(PBMC)를 분리하고, Biowest사 제품 2% 인간 혈청 AB형(pool)이 들어간 ALyS505N-0 배지(세포 과학 연구소(CSTI) 1020P10)에서 2×106 세포/ml가 되도록 조정하였다. 공여자 PBMC에는 방사선(γ선) 30Gy를 조사하였다.
하기와 같이 실험계를 구축하였다:
1. 「naive」: 수용자 PBMC 1×106 세포
2. 「allo」: 수용자 PBMC 1×106 세포 및 공여자 PBMC 1×106 세포
3. 「키메라 항CD80」: 수용자 PBMC 1×106 세포 및 키메라 항인간 CD80 항체 4μg
4. 「키메라 항CD86」: 수용자 PBMC 1×106 세포 및 키메라 항인간 CD86 항체 4μg
계 1.~4.를 96well plate(Corning사 제품, Cat.No.3799)의 웰마다 넣고 최종적인 반응 부피를 200μL로 하였다(항체의 최종 농도는 약 20μg/mL). 37℃, 5% CO2 인큐베이터 중에서 배양을 개시하였다. 배양 개시 5일째와 6일째에 상청을 회수하여 회수한 샘플을 20~25배로 희석 후 Bioligands사 제품 Human IFNγ ELISA MAX™ Deluxe, Cat.430104를 이용하여 측정하였다.
결과
도 8에 도시된 바와 같이 키메라 항인간 CD80 항체도 키메라 항인간 CD86 항체도 검출 가능한 IFNγ 생산을 나타내지 않았다.
3H-티미딘 도입량 측정
기본적으로는 실시예 1 및 실시예 4에 기재된 방법에 따라 실험을 행하였다. 수용자 PBMC 및 공여자 PBMC에는 각각 인간 말초혈로부터 신선하게 분리한 것을 사용하거나 또는 -80℃로 동결 보존한 것을 급속 해동하여 사용하였다. 이들 세포는 모두 Biowest사 제품 2% 인간 혈청 AB형(pool)이 들어간 ALyS505N-0 배지(세포 과학 연구소(CSTI) 1020P10)에서 4×106 세포/mL로 조정하였다. 공여자 PBMC에는 20Gy 방사선을 조사하였다. 이들 수용자 PBMC와 공여자 PBMC를 1:1로 혼합하고, 이 혼합물에 키메라 항인간 CD80 항체 및 키메라 항인간 CD86 항체를 각각 최종 농도 10μg/ml이 되도록 첨가하였다. 배양은 6cm~10cm 샬레(배양 부피 6~18mL)에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터 중에서 7일간 행하였다.
배양 개시로부터 7일째에 원심에 의해 배양한 수용자 PBMC를 회수하고 상기의 배지에서 4×106 세포/mL로 조정하였다. 이 배양한 수용자 PBMC에 새로 조제한 조사 완료된 공여자 PBMC를 세포수비 2:1이 되도록 첨가하고, 추가로 키메라 항인간 CD80 항체 및 키메라 항인간 CD86 항체를 각각 최종 농도 5μg/ml이 되도록 첨가하였다. 배양은 상기와 동일한 조건으로 7일간 행하였다(세포 밀도: 4×106 세포/mL).
배양 개시로부터 통산하여 14일째에 원심에 의해 유도 세포를 회수하고, 이하의 비율로 각 세포를 혼합한다:
1. 「naive」: 수용자 PBMC 4×105 세포
2. 「allo」: 수용자 PBMC 4×105 세포 및 공여자 PBMC 4×105 세포
3. 「1:1/2」: 수용자 PBMC 4×105 세포 및 공여자 PBMC 4×105 세포 및 유도 세포 2×105 세포
4. 「1:1/4」: 수용자 PBMC 4×105 세포 및 공여자 PBMC 4×105 세포 및 유도 세포 1×105 세포
5. 「1:1/8」: 수용자 PBMC 4×105 세포 및 공여자 PBMC 4×105 세포 및 유도 세포 5×104 세포
6. 「1:1/16」: 수용자 PBMC 4×105 세포 및 공여자 PBMC 4×105 세포 및 유도 세포 2.5×104 세포
계 1.~6. 각각을 96well plate(Corning사 제품, Cat.No.3799)의 4웰에 나누어 주입하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 공배양하였다. 공배양 개시 4일째에 3H-티미딘(10μl)을 첨가하고, 공배양 개시 5일째(3H-티미딘 첨가의 16~20시간 후)에 배양액 중의 3H-티미딘을 제거하여 3H-티미딘 도입량을 측정하였다.
결과
도 9에 도시된 바와 같이 유도 세포는 용량 의존적으로 3H-티미딘 도입량을 저감시켰다(즉, 면역 세포의 활성화를 억제하였다). 따라서, 키메라 항인간 CD80 항체 및 키메라 항인간 CD86 항체는 아네르기 T세포를 유도할 수 있고, 또한 유해한 IFNγ 생산을 일으키지 않는, 세포 치료에 적합한 항체인 것이 실증되었다.
(주기)
이상과 같이 본 개시의 바람직한 실시형태를 이용하여 본 개시를 예시하였지만, 본 개시는 청구범위에 의해서만 그 범위가 해석되어야 하는 것이 이해된다. 본 명세서에서 인용한 특허, 특허출원 및 다른 문헌은 그 내용 자체가 구체적으로 본 명세서에 기재되어 있는 것과 마찬가지로 그 내용이 본 명세서에 대한 참고로서 원용되어야 하는 것이 이해된다. 본 출원은 일본특허출원 2018-118996(2018년 6월 22일 출원)에 대해 우선권 주장의 이익을 주장하는 것으로, 이 출원의 내용은 본원에서 그 내용이(전부일 수 있음) 참고로서 원용되는 것이 이해된다. 또한, 일본특허출원 2018-119001 및 일본특허출원 2018-1190031(모두 2018년 6월 22일 출원)과 이들에 대해 우선권 주장하는 국제출원의 내용은 그 일부 또는 전문이 본 명세서에서 참고로서 원용된다.
본 개시는 면역 관용의 효과를 개선하거나 또는 면역 관용의 효과를 감약시키지 않는 특징을 갖는 구조를 갖는 항체를 제공한다. 이러한 기술에 기초한 제제 등에 관련되는 산업(제약)에 있어서 이용 가능한 기술이 제공된다.
서열표 프리텍스트
서열번호 1: 항CD80 항체(IgG2) 중쇄 핵산 서열
서열번호 2: 항CD80 항체(IgG2) 중쇄 아미노산 서열
서열번호 3: 항CD80 항체(IgG2) 경쇄 핵산 서열
서열번호 4: 항CD80 항체(IgG2) 경쇄 아미노산 서열
서열번호 5: 항CD80 항체(IgG4) 중쇄 핵산 서열
서열번호 6: 항CD80 항체(IgG4) 중쇄 아미노산 서열
서열번호 7: 항CD80 항체(IgG4) 경쇄 핵산 서열
서열번호 8: 항CD80 항체(IgG4) 경쇄 아미노산 서열
서열번호 9: 항CD86 항체(IgG2) 중쇄 핵산 서열
서열번호 10: 항CD86 항체(IgG2) 중쇄 아미노산 서열
서열번호 11: 항CD86 항체(IgG2) 경쇄 핵산 서열
서열번호 12: 항CD86 항체(IgG2) 경쇄 아미노산 서열
서열번호 13: 항CD86 항체(IgG4) 중쇄 핵산 서열
서열번호 14: 항CD86 항체(IgG4) 중쇄 아미노산 서열
서열번호 15: 항CD86 항체(IgG4) 경쇄 핵산 서열
서열번호 16: 항CD86 항체(IgG4) 경쇄 아미노산 서열
서열번호 17: 항CD80 항체(IgG2) 중쇄 가변 영역 핵산 서열
서열번호 18: 항CD80 항체(IgG2) 중쇄 가변 영역 아미노산 서열
서열번호 19: 항CD80 항체(IgG2) 경쇄 가변 영역 핵산 서열
서열번호 20: 항CD80 항체(IgG2) 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
서열번호 21: 항CD86 항체(IgG2) 중쇄 가변 영역 핵산 서열
서열번호 22: 항CD86 항체(IgG2) 중쇄 가변 영역 아미노산 서열
서열번호 23: 항CD86 항체(IgG2) 경쇄 가변 영역 핵산 서열
서열번호 24: 항CD86 항체(IgG2) 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
서열번호 25: 항CD80 항체(IgG2) CDRH1 아미노산 서열
서열번호 26: 항CD80 항체(IgG2) CDRH2 아미노산 서열
서열번호 27: 항CD80 항체(IgG2) CDRH3 아미노산 서열
서열번호 28: 항CD80 항체(IgG2) CDRL1 아미노산 서열
서열번호 29: 항CD80 항체(IgG2) CDRL2 아미노산 서열
서열번호 30: 항CD80 항체(IgG2) CDRL3 아미노산 서열
서열번호 31: 항CD86 항체(IgG2) CDRH1 아미노산 서열
서열번호 32: 항CD86 항체(IgG2) CDRH2 아미노산 서열
서열번호 33: 항CD86 항체(IgG2) CDRH3 아미노산 서열
서열번호 34: 항CD86 항체(IgG2) CDRL1 아미노산 서열
서열번호 35: 항CD86 항체(IgG2) CDRL2 아미노산 서열
서열번호 36: 항CD86 항체(IgG2) CDRL3 아미노산 서열
서열번호 37: 키메라 항CD80 항체 중쇄 핵산 서열
서열번호 38: 키메라 항CD80 항체 중쇄 아미노산 서열
서열번호 39: 키메라 항CD80 항체 경쇄 핵산 서열
서열번호 40: 키메라 항CD80 항체 경쇄 아미노산 서열
서열번호 41: 키메라 항CD86 항체 중쇄 핵산 서열
서열번호 42: 키메라 항CD86 항체 중쇄 아미노산 서열
서열번호 43: 키메라 항CD86 항체 경쇄 핵산 서열
서열번호 44: 키메라 항CD86 항체 경쇄 아미노산 서열
서열번호 45: 키메라 항CD80 항체 중쇄 가변 영역 핵산 서열
서열번호 46: 키메라 항CD80 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열
서열번호 47: 키메라 항CD80 항체 경쇄 가변 영역 핵산 서열
서열번호 48: 키메라 항CD80 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
서열번호 49: 키메라 항CD86 항체 중쇄 가변 영역 핵산 서열
서열번호 50: 키메라 항CD86 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열
서열번호 51: 키메라 항CD86 항체 경쇄 가변 영역 핵산 서열
서열번호 52: 키메라 항CD86 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
서열번호 53: 키메라 항CD80 항체 CDRH1 아미노산 서열
서열번호 54: 키메라 항CD80 항체 CDRH2 아미노산 서열
서열번호 55: 키메라 항CD80 항체 CDRH3 아미노산 서열
서열번호 56: 키메라 항CD80 항체 CDRL1 아미노산 서열
서열번호 57: 키메라 항CD80 항체 CDRL2 아미노산 서열
서열번호 58: 키메라 항CD80 항체 CDRL3 아미노산 서열
서열번호 59: 키메라 항CD86 항체 CDRH1 아미노산 서열
서열번호 60: 키메라 항CD86 항체 CDRH2 아미노산 서열
서열번호 61: 키메라 항CD86 항체 CDRH3 아미노산 서열
서열번호 62: 키메라 항CD86 항체 CDRL1 아미노산 서열
서열번호 63: 키메라 항CD86 항체 CDRL2 아미노산 서열
서열번호 64: 키메라 항CD86 항체 CDRL3 아미노산 서열
SEQUENCE LISTING <110> JUNTEN BIO Co., Ltd. <120> An antibody inducing immunotolerance, induced lymphocyte, and method of treating by a cellular medicament using the induced lymphocyte <130> JB002PCT <150> JP 2018-118996 <151> 2018-06-22 <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(1347) <400> 1 gag gtg cag ttg gtt gaa tct ggc gga gga ctg gtt cag cct ggc gga 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tct ctg aga ctg tct tgt gcc gcc tct ggc ttc gtg ttc agc tcc gac 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Ser Asp 20 25 30 gat atg tcc tgg gtc cga cag gct cct ggc aaa gga ttg gag tgg gtc 144 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gcc tac atc tct tct ggc ggc gac tac acc tac tat ccc gac acc gtg 192 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 aag ggc aga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc 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Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 3 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> andibody <220> <221> CDS <222> (1)..(645) <400> 3 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tct ctg tct gcc agc ctg ggc 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gac aga atc acc atc acc tgt cac gcc agc cag aac atc aac gtg tgg 96 Asp Arg Ile 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cag ttt acc tac tgg 336 Ala Arg Gln Gly Asp Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Gln Phe Thr Tyr Trp 100 105 110 ggc cag ggc acc ctg gtc aca gtt tct tcc 366 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr His Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Gly Asp Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Gln Phe Thr Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 23 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody variable region <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 23 gac atc cag 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Asp Ile Val Met Ser Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Ala Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Glu 20 25 30 Val Val Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu 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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Leu Tyr Gly Ser Ser Ser Tyr Tyr Val Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 47 <211> 321 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> light chain variable region of chimera anti-CD80 antibody <400> 47 gacatccaga tgacccagtc tccatcctct ctgtctgcca gcctgggcga caccatcacc 60 atcacatgtc acgccagcca gaacatcaac gtgtggctgt cctggtatca gcagaagccc 120 ggcaacatcc ccaagctgct ggtgtacaag gcctccaatc tgcacaccgg cgtgccctct 180 agattctccg gatctggctc tggcaccggc tttaccctga caatcagctc cttgcagccc 240 gaggacattg ccacctacta ctgtcagcag ggccagagct accctctgac ctttggcgct 300 ggcaccaagc tggaactgaa g 321 <210> 48 <211> 107 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> light chain variable region of chimera anti-CD80 antibody <400> 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 49 <211> 366 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> heavy chain variable region of chimera anti-CD86 antibody <400> 49 gaggttcagt tgcagcagtc tggacccgag ctggtcaagc ctggcacctc cgtgaagatg 60 tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc agctacgtga tccactgggt caaagagaag 120 ccaggccagg gccttgagtg gatcggctac atcaacccct accacgacgt gaccaagtac 180 aacgagaagt tcaagggcag agctaccctg acctccgaca agtcctcttc caccgcctac 240 atggaactgt ccagcctgac ctctgaggac tccgccgtgt actactgctc tagacagggc 300 gacccttact ccggcaacta ccagtttacc tactggggcc agggcaccct ggtcacagtt 360 tctgcc 366 <210> 50 <211> 122 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> heavy chain variable region of chimera anti-CD86 antibody <400> 50 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Lys Glu Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr His Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Gln Gly Asp Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Gln Phe Thr Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 51 <211> 321 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> light chain variable region of chimera anti-CD86 antibody <400> 51 gacatcgtga tgtcccagag ccacaagttc atgtccacct ccgtgggcga cagagtgtct 60 atcgcctgca aggcctctca ggacgtgtcc acagaggtcg tgtggttcca gcagaagcct 120 ggccagtctc ctaagctgct gatctactcc gcctcctaca gatacaccgg cgtgcccgat 180 agattcaccg gctctggctc tggcaccgac tttaccttca ccatcagctc cgtgcaggcc 240 gaggatctgg ccgtgtacta ctgtcagcag cactacagca ccccttacac ctttggcgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa g 321 <210> 52 <211> 107 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> light chain variable region of chimera anti-CD86 antibody <400> 52 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Ala Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Glu 20 25 30 Val Val Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDRH1 of chimera anti-CD80 antibody <400> 53 Ser Asp Asp Met Ser 1 5 <210> 54 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDRH2 of chimera anti-CD80 antibody <400> 54 Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 55 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDRH3 of chimera anti-CD80 antibody <400> 55 His Leu Tyr Gly Ser Ser Ser Tyr Tyr Val Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDRL1 of chimera anti-CD80 antibody <400> 56 His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDRL2 of chimera anti-CD80 antibody <400> 57 Lys Ala Ser Asn Leu His Thr 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDRL3 of chimera anti-CD80 antibody <400> 58 Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 59 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDRH1 of chimera anti-CD86 antibody <400> 59 Ser Tyr Val Ile His 1 5 <210> 60 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDRH2 of chimera anti-CD86 antibody <400> 60 Tyr Ile Asn Pro Tyr His Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 61 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDRH3 of chimera anti-CD86 antibody <400> 61 Gln Gly Asp Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Gln Phe Thr Tyr 1 5 10 <210> 62 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDRL1 of chimera anti-CD86 antibody <400> 62 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Glu Val Val 1 5 10 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDRL2 of chimera anti-CD86 antibody <400> 63 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDRL3 of chimera anti-CD86 antibody <400> 64 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr 1 5

Claims (41)

  1. 어떤 세포의 세포 표면에 발현하는 CD80 및/또는 CD86과, 다른 세포의 세포 표면에 발현하는 CD28의 상호작용을 저해하는 항체 또는 그 개변체로서, 면역 활성화에 의한 사이토카인의 생산을 실질적으로 유도하지 않는 항체 또는 그 개변체.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 사이토카인이 인터페론 γ를 포함하는 항체 또는 그 개변체.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    키메라 항체인 항체 또는 그 개변체.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체의 서브클래스가 IgG1인 항체 또는 그 개변체.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 38 또는 42에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 40 또는 44에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 갖는 항체 또는 그 개변체.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열번호 53에 기재된 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 54에 기재된 아미노산 서열의 CDRH2 및 서열번호 55에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 포함하는 VH, 및 서열번호 56에 기재된 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 57에 기재된 아미노산 서열의 CDRL2 및 서열번호 58에 기재된 CDRL3을 포함하는 VL 또는
    (b) 서열번호 59에 기재된 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 60에 기재된 아미노산 서열의 CDRH2 및 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 포함하는 VH, 및 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열의 CDRL2 및 서열번호 64에 기재된 CDRL3을 포함하는 VL을 포함하는 항체 또는 그 개변체.
  7. 청구항 6에 있어서,
    (a) 서열번호 46에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VH 및 서열번호 48에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VL 혹은
    (b) 서열번호 50에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VH 및 서열번호 52에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 또는 그 개변체.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체의 Fc 부분이 면역 활성화에 의한 사이토카인의 생산을 실질적으로 유도하지 않는 부분인 항체 또는 그 개변체.
  9. 청구항 1 내지 청구항 3 및 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체의 서브클래스가 IgG2 또는 IgG4인 항체 또는 그 개변체.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 항체의 서브클래스가 IgG4인 항체 또는 그 개변체.
  11. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체의 개변체가 상기 항체의 Fc 부분이 결여되어 있는 개변체인 항체 또는 그 개변체.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 항체의 개변체가 Fab 항체, F(ab')2 항체, Fab' 항체, Fv 항체 또는 scFv 항체인 항체 또는 그 개변체.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 관용을 유도하는 능력을 갖는 항체 또는 그 개변체.
  14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    CD80 및/또는 CD86을 발현하는 상기 세포가 항원 제시 세포이며, CD28을 발현하는 상기 다른 세포가 T세포인 항체 또는 그 개변체.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 그 개변체는 길항적 항CD80 항체, 길항적 항CD86 항체, 길항적 항CD28 항체 또는 CD80 및 CD86에 대한 길항적 이중 특이성 항체 혹은 이들의 개변체인 항체.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
    인간화 항체 또는 인간 항체 혹은 이들의 개변체 중 어느 하나인 항체 또는 그 개변체.
  17. 청구항 1 내지 청구항 3 및 청구항 8 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 항체의 IgG2 또는 IgG4의 Fc 부분을 포함하는 항체 또는 그 개변체.
  18. 청구항 1 내지 청구항 3 및 청구항 8 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 항체의 IgG4의 Fc 부분을 포함하는 항체 또는 그 개변체.
  19. 청구항 1 내지 청구항 3 및 청구항 8 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열의 CDRH2 및 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 포함하는 VH, 및 서열번호 28에 기재된 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열의 CDRL2 및 서열번호 30에 기재된 CDRL3을 포함하는 VL 또는
    (b) 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 32에 기재된 아미노산 서열의 CDRH2 및 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열의 CDRH3을 포함하는 VH, 및 서열번호 34에 기재된 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 35에 기재된 아미노산 서열의 CDRL2 및 서열번호 36에 기재된 CDRL3을 포함하는 VL을 포함하는 항체 또는 그 개변체.
  20. 청구항 19에 있어서,
    (a) 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VH 및 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VL
    (b) 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VH 및 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열 또는 그 개변 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 또는 그 개변체.
  21. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 개변체의 아미노산 서열 또는 그 일부를 코딩하는 핵산 분자.
  22. 청구항 21에 있어서,
    (a) 서열번호 17 혹은 서열번호 45에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는, VH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 19 혹은 서열번호 47에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는, VL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는
    (b) 서열번호 21 혹은 서열번호 49에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는, VH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 23 혹은 서열번호 51에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는, VL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 핵산 분자.
  23. 청구항 21 또는 청구항 22에 기재된 핵산 분자를 갖는 벡터.
  24. 청구항 21 또는 청구항 22에 기재된 핵산 분자 혹은 청구항 23에 기재된 벡터를 포함하는 세포.
  25. 청구항 24의 세포를 배양하는 것을 포함하는, 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 개변체의 제조 방법.
  26. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 개변체로 면역 관용이 유도된 세포.
  27. 청구항 26에 있어서,
    상기 면역 관용은 상기 항체 또는 그 개변체와, 피험체 유래의 세포와, 이 피험체에서 유래하지 않는 항원 또는 이 항원의 함유물을 혼합함으로써 유도되는 세포.
  28. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 개변체 중 적어도 하나를 포함하는, 면역 관용이 유도된 세포를 제작하기 위한 조성물.
  29. 청구항 28에 있어서,
    길항적 항CD80 항체, 길항적 항CD86 항체, 길항적 항CD28 항체 혹은 CD80 및 CD86에 대한 길항적 이중 특이성 항체 또는 이들의 개변체 혹은 이들의 임의의 조합을 포함하는 조성물.
  30. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 개변체와, 피험체 유래의 세포와, 이 피험체에서 유래하지 않는 항원 또는 이 항원의 함유물을 혼합하는 단계를 포함하는, 이 피험체에서 유래하지 않는 항원에 의해 발생하는 질환, 장해 또는 상태를 처치 또는 예방하기 위한 세포를 제조하기 위한 방법.
  31. 청구항 30에 있어서,
    상기 질환, 장해 또는 상태는 이식 면역 거절 반응, 알레르기, 자기면역 질환, 이식편대숙주병, iPS 세포 또는 ES 세포 및 이들 세포 유래의 세포, 조직 또는 장기의 이식에 의해 일어나는 면역 거절 반응으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  32. 청구항 30 또는 청구항 31에 있어서,
    상기 항원의 함유물은 세포인 방법.
  33. 청구항 30 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조되는 세포.
  34. 청구항 33에 있어서,
    T세포를 포함하는 세포.
  35. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 개변체로 면역 관용이 유도된 세포, 청구항 30 혹은 청구항 31에 기재된 방법에 따라 제조되는 세포, 혹은 청구항 26, 청구항 27, 청구항 33 혹은 청구항 34에 기재된 세포를 포함하는 세포 치료제.
  36. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 개변체로 면역 관용이 유도된 세포, 청구항 30 혹은 청구항 31에 기재된 방법에 따라 제조되는 세포, 혹은 청구항 26, 청구항 27, 청구항 33 혹은 청구항 34에 기재된 세포를 포함하는, 피험체에서 유래하지 않는 항원에 의해 발생하는 질환, 장해 또는 상태를 처치 또는 예방하기 위한 조성물.
  37. 청구항 36에 있어서,
    상기 질환, 장해 또는 상태는 이식 면역 거절 반응, 알레르기, 자기면역 질환, 이식편대숙주병, iPS 세포 또는 ES 세포 및 이들 세포 유래의 세포, 조직 또는 장기의 이식에 의해 일어나는 면역 거절 반응으로 이루어지는 군에서 선택되는 조성물.
  38. 청구항 37에 있어서,
    상기 면역 거절은 이식을 받는 장기가 신장, 간장, 심장, 피부, 폐, 췌장, 식도, 위, 소장, 대장, 신경, 혈액, 면역계 세포를 포함하는 혈구 세포, 뼈, 연골, 혈관, 각막, 안구 또는 골수인 것을 특징으로 하는 조성물.
  39. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 개변체로 면역 관용이 유도된 세포, 청구항 30 혹은 청구항 31에 기재된 방법에 따라 제조되는 세포, 혹은 청구항 26, 청구항 27, 청구항 33 혹은 청구항 34에 기재된 세포의 유효량을 피험체에 투여하는 공정을 포함하는, 피험체에서 이 피험체에서 유래하지 않는 항원에 의해 발생하는 질환, 장해 또는 상태를 처치 또는 예방하기 위한 방법.
  40. 청구항 39에 있어서,
    상기 질환, 장해 또는 상태는 이식 면역 거절 반응, 알레르기, 자기면역 질환, 이식편대숙주병, iPS 세포 또는 ES 세포 및 이들 세포 유래의 세포, 조직 또는 장기의 이식에 의해 일어나는 면역 거절 반응으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  41. 청구항 40에 있어서,
    상기 면역 거절은 이식을 받는 장기가 신장, 간장, 심장, 피부, 폐, 췌장, 식도, 위, 소장, 대장, 신경, 혈액, 면역계 세포를 포함하는 혈구 세포, 뼈, 연골, 혈관, 각막, 안구 또는 골수인 것을 특징으로 하는 방법.
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