ES2536996T3 - Anticuerpos biespecíficos de unión a digoxigenina - Google Patents

Anticuerpos biespecíficos de unión a digoxigenina Download PDF

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Rebecca Croasdale
Simone Dill
Wilma Dormeyer
Guy Georges
Michael Grote
Alexander Haas
Eike Hoffmann
Ludger Markus Ickenstein
Kerstin Jahn-Hofmann
Matthias John
Silke Metz
Olaf Mundigl
Werner Scheuer
Jan Olaf Stracke
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Abstract

Un anticuerpo biespecífico específico contra digoxigenina (DIG) y una proteína diana para su uso en terapia o diagnósticos, en el que un ácido nucleico que se ha conjugado con DIG se administra a una célula diana o tejido, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a DIG que comprende un dominio variable de la cadena pesada seleccionado de SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 3 con las mutaciones S49A, I57A y A60P o SEC ID Nº: 2, y un dominio variable de la cadena ligera seleccionado de SEC ID Nº:5 o SEC ID Nº: 1; y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a una proteína diana.

Description

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E10727425
14-05-2015
Secuencia de aminoácidos del conector peptídico
Referencia
[G4S]5
[G4S]5G
[G4S]5G2
[G4S]6
[GQ4]3
[GQ4]3G
[GQ4]3GN2
K[G4S]3G2N
[LS]2G2
[LS]2PGK
[LS]2PG2
LSPNRGEC
RT[G3S]3G2T
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[SG4]3
[SG4]3G
[SG4]3G2
[SG4]3G2N
[SG4]3G2T
[SG4]3GAS
[SG4]5
[SG4]5G
[SG4]5G2
[SG4]5GAS
[G2S]2GRT[G3S]3GGT
App. Microbiol. Biotechnol. 48 (1997) 487-492
[G3S]3
[G3S]4
El término “conector monocatenario”, como se usa dentro de la invención, indica un péptido con secuencias de aminoácidos, que es preferentemente de origen sintético. Estos conectores de péptido según la invención se usan para ligar un dominio VH y un VL para formar un Fv monocatenario. El conector monocatenario puede comprender una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos enumeradas en la Tabla 2, además de aminoácidos arbitrariamente seleccionados adicionales.
Tabla 2 - Secuencias de aminoácidos del conector monocatenario.
Secuencia de aminoácidos del conector monocatenario
Referencia
A3GSG2[AS]2
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Batra, J.K., et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 15198-15202.
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Secuencia de aminoácidos del conector monocatenario
Referencia
[G4S]3G
[G4S]3G2
[G4S]3G2N
[G4S]3GAS
[G4S]4
[G4S]5
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[SG4]3G2T
[SG4]3GAS
[SG4]5
[SG4]5G
[SG4]5G2
[SG4]5GAS
Debido a sus propiedades químicas y físicas, tales como peso molecular y arquitectura de dominios que incluye modificaciones secundarias, el procesamiento aguas abajo de anticuerpos es muy complicado. Por ejemplo, no solo para fármacos formulados, sino también para productos intermedios en el procesamiento aguas abajo (DSP) de 5 disoluciones concentradas requeridas para lograr bajos volúmenes para la manipulación económica y almacenamiento de aplicaciones. Pero con concentración creciente del anticuerpo puede observarse una tendencia a formar agregados. Estos anticuerpos agregados tienen características alteradas en comparación con el anticuerpo aislado. Ahora se ha encontrado que la agregación de los anticuerpos según la invención puede reducirse por la introducción de enlaces disulfuro entre los dominios pesados y variables de la cadena ligera de los anticuerpos
10 monocatenarios conectados al anticuerpo bivalente monoespecífico parental. Esta estabilidad mejorada no solo es útil durante el proceso de producción, sino también para el almacenamiento de los anticuerpos. El enlace disulfuro entre los dominios variables de los anticuerpos monocatenarios comprendidos en el anticuerpo se selecciona independientemente para cada anticuerpo monocatenario de:
15 i) posición 44 del dominio variable de la cadena pesada a la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera,
ii) posición 105 del dominio variable de la cadena pesada a la posición 43 del dominio variable de la cadena ligera, o
20 iii) posición 101 del dominio variable de la cadena pesada a la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera.
El enlace disulfuro entre los dominios variables de los anticuerpos monocatenarios comprendidos en el anticuerpo 25 está entre la posición 44 del dominio variable de la cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera.
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j) Análisis de FACS de unión de IGF1R, pico gris: H322MAKH60 + anti-His + anti-ratón, pico negro: H322MAKH60 + anti-ratón k) Análisis FACS de unión de DIG
l)- m) Análisis BiaCore de unión de <IGF1R> scFv- His6 - <IGF1R> scFv- His6- <DIG> scFv- CTH 25 nM. 1) estructura esquemática. n) AKH-68/66 10 nM + DIG-ARNip 50 nM + sIGF1R 25 nM m): DIG-ARNip 50 nM + sIGF1R 25 nM + AKH-68/66 10 nM
o) Análisis FACS de unión de IGF1R. Pico único: AKH-68/66 + anti-His + anti-ratón, múltiples picos: AKH68/66 + anti-ratón, anti-His (+ anti-ratón), eje y de isotipo de ratón: % del máx.
p) Análisis FACS de unión de DIG. Pico gris claro: DIG-Cy5, pico gris oscuro: AKH-68/66 + DIG-Cy5, pico negro: eje y de isotipo humano: % del máx.
q)- s) Análisis BiaCore de unión de proteína de fusión de estreptavidina-Dig diana. q) Estructura esquemática, r) AKH-42 10 nM + sIGF1R 25 nM + Biotina-ARNip 50 nM. s): sIGF1R 25 nM + DIG-ARNip 50 nM + Biotina-ARNip 50 nM sobre AKH-42 10 nM
(t) Análisis de FACS de unión de IGF1R. Pico único: AKH-42 + anti-His + anti-ratón, múltiples picos: AKH-42
+ anti-ratón, anti-His (+ anti-ratón), eje y secundario de ratón: % de máx.
u) Análisis de FACS de unión de DIG. Pico único: AKH-42 + anti-His + DIG-Cy5, múltiples picos: DIG-Cy5, células solo.
v)-x) Análisis BiaCore de unión de <HER2> scFv-PExII -<DIG> scFv- His6 25 nM. v) Estructura esquemática, w) análisis BiaCore, x) análisis BiaCore, zoom.
Figura 48: Experimentos de direccionamiento de doxorubicina digoxigenada con anticuerpos biespecíficos <Dig>.
a) y b): Se trataron células MDA-MB-468 (Her2+/-) con doxorubicina (Fig. 48 a)) o doxorubicina digoxigenada (Fig. 48 b)) en las concentraciones indicadas durante 48 horas.
c)- e): Se trataron células H322M (IGF1R+++) (Fig. 48 c)) KPL-4 (Her2+++) (Fig. 48 d)) y MDA-MB-468 (Her2+/-) (Fig. 48 e)) con complejos <Her2>-<Dig>-Dig-Dox o <IGF1R>-<Dig>-Dig-Dox durante 48 h. Se evaluó la viabilidad celular aplicando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter Glo (Promega, Madison, WI).
Figura 49: a) y b) La cromatografía de exclusión por tamaño del complejo de Cy5 digoxigenada/ anticuerpo <Her2>-<Dig> biespecífico indica relación de carga de 2:1 (DIG-Cy5: <Her2>-<Dig>) c) y d) Evaluación de SEC
Figura 50: a) Sistema experimental y zoom en espectros de masas nativos no deconvolucionados para la determinación de vehículo con respecto carga de carga. Unión de Eg5-ARNip-(2x)Dig (panel superior) y Eg5ARNip-(1x)Dig (panel inferior) a <Her2-Dig> b) La espectroscopía de masas nativa indica la carga de 2 o menos cargas por vehículo que elige diana. Aplicando ácidos nucleicos mono-digoxigenados se observa que los vehículos que eligen diana cargados contienen más de una, pero no más de dos cargas por vehículo. La aplicación de ácidos nucleicos bi-digoxigenados produce elevada detección de moléculas con menores relaciones de carga, es decir, la mayoría de los vehículos están cargados con una carga. Esto indica relaciones de carga de una Dig por entidad de unión a Dig.
Figura 51: a) y b) Vehículos para la administración de carga mediada por hapteno a diferentes antígenos de la superficie celular. c) Vehículos que eligen como diana VEGFR2, d) a g): Los experimentos de resonancia de plasmones superficiales muestran retención completa de la especificidad y afinidad de unión del direccionamiento de la superficie celular y módulos de unión a digoxigenina. d) Unión de Her2 y ARNip a <Her2DIG-hu2>, e) Unión de <CD33>-<DIG> a la fusión de CD33-Fc humana (ligando) y unión adicional de DIG-ARNip, f) unión de anticuerpos anti-CD22 a CD22/Fc inmovilizado, g) unión aditiva de DIG-ARNip y LeY-HAS a <LeY>-<DIG>, h) unión de <CDCP1>-<DIG>.
Figura 52: a) y b) Se muestra el resultado de un análisis de FACS de células MCF7 a) tratadas con los complejos DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5 y CD22-DIG/DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5 b) tratadas con los complejos DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5 y LeY-DIG/DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5 (panel inferior). LeY-DIG conduce a una fuerte acumulación de DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5 sobre las células diana. c) Se muestran niveles de ARNm de Eg5/GAPDH de células MCF7 tratadas con DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5, CD22-DIG/DharmaFECT/DIGARNip-Cy5 o LeY-DIG/DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5 para los momentos de tiempo indicados. La iARN es visible en todos los grupos, pero la pegajosidad inespecífica de DharmaFECT afecta la especificidad de LeY-DIG.
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Figura 53: Se muestra el resultado de un análisis FACS de células MCF7 tratadas con concentraciones crecientes de DIG-DPC-ARNip-Cy3 (25, 50, 100, 150 nM, Figura 53 a) o tratadas con concentraciones crecientes del complejo LeY-DIG/DIG-DPC-ARNip-Cy3 (25, 50, 100, 150 nM, Figura 53 b). LeY-DIG conduce a una fuerte acumulación de DIG-DPC-ARNip-Cy3 sobre las células diana. c) Se presentan niveles de ARNm de AhaI/GAPDH de células MCF7 tratadas con concentraciones crecientes de DIG-DPC-AhaI o el complejo CD22DIG/DIG-DPC-AhaI. d) Se muestran niveles de ARNm de AhaI/GAPDH de células MCF7 tratadas con concentraciones crecientes del complejo CD22-DIG/DIG-DPC-AhaI, VEGFR2-DIG/DIG-DPC-AhaI o LeYDIG/DIG-DPC-AhaI. e) Se presentan niveles de ARNm de AhaI/GAPDH de células MCF7 tratadas con concentraciones crecientes de DIG-DPC-AhaI o el complejo CD22-DIG/DIG-DPC-AhaI o LeY-DIG/DIG-DPC-AhaI en comparación con DIG-DPC-GL3 o el complejo CD22-DIG/DIG-DPC-GL3 o LeY-DIG/DIG-DPC-GL3. f) Se representa el factor de especificidad de elección de diana contra el tiempo, que indica que se alcanza la mayor especificidad cuando se tratan células MCF7 durante 4-8 horas con LeY-DIG/DIG-DPC-AhaI.
Figura 54: a) y b): Intervalo de peso molecular de DIG-DPC-ARNip AHAI (Fig. 54 a) y LeY-DIG/DIG-DPC-ARNip AHAI (Fig. 54 b) medido por SEC-MALLS. Curva negra: señal generada por el detector de LS; mientras que la línea gris: peso molecular generado de la señal del detector de LS y de RI; el peso molecular generado es solo una aproximación, debido a que el valor de dn/dc exacto para DIG-DPC-ARNip AHAI no se conoce y se estimó como 0,146, que es el valor de dn/dc para PEG. c) y d): Intervalo de radio hidrodinámico de DIG-DPC-ARNip AHAI (Fig. 54 c) y LeY-DIG/DIG-DPC-ARNip AHAI (Fig. 54 d) medido por SEC-MALLS. Curva negra: señal generada por el detector de LS; línea de puntos: radio hidrodinámico generado de la señal del detector de QELS. La adición de LeY-DIG conduce a la formación de complejos de LeY-DIG y DIG-DPC-ARNip AHAI.
Figura 55: (a) Vehículos para la administración de carga mediada por hapteno que contienen diferentes entidades para la complejación de carga. b) a d) Los experimentos de resonancia de plasmones superficiales muestran la retención de la especificidad y afinidad de unión de elección del direccionamiento de la superficie celular, además de la funcionalidad de módulos de unión a biotina.
Figura 56: (a) Complejos compuestos de anticuerpos biespecíficos <Dig>, ARNip digoxigenados y entidades que ayudan en la transfección que contienen módulos de unión a ARNip. (b) Los ensayos de desplazamiento en gel demuestran la complejación de las entidades que ayudan en la transfección que contienen módulos de unión a ARNip a ARNip digoxigenado y la formación de 'supercomplejos' con entidades de direccionamiento biespecíficas. (c) Reducción específica del ARNm de Aha1 usando la administración dirigida ayudada por módulos de péptido/proteína que se unen a ARNip y poseen funcionalidad de transfección.
Figura 57: Inactivación de ARNm mediada por ARNip en células MCF-7 tras el tratamiento con nanopartículas de ARNip-lípido marcadas con DIG complejadas con anticuerpos biespecíficos <Diana-Dig>. Se determinaron niveles de ARNm de AHAI (con respecto a GAPDH) en células MCF-7 de cáncer de mama que expresan el antígeno LeY, pero no CD22, tras 12 h de incubación con nanopartículas de ARNip-lípido marcadas con DIG preincubadas con anticuerpos biespecíficos <Diana-DIG>. Eje y: concentración relativa de ARNm de AHA1 [%]
Ejemplos
Ejemplo 1: Aislamiento y caracterización de ADNc que codifican los dominios VH y VL de una kappa de IgG1 <Dig> murina del clon de hibridoma de ratón 19-11
Un requisito previo para el diseño, generación, optimización y caracterización de anticuerpos <Dig> recombinantes, fragmentos y proteínas de fusión de anticuerpos es la disponibilidad de proteína e información de secuencia (ADN). Por tanto, esta información tuvo que generarse para los dominios VH y VL del anticuerpo <Dig> murino 'original' del clon de hibridoma 19-11. Las etapas experimentales que necesitaron realizarse posteriormente fueron (i) el aislamiento de ARN de células de hibridoma 19-11 productoras de <Dig>, (ii) conversión de este ARN en ADNc, a continuación en fragmentos de PCR que alojan VH y VL, y (iii) integración de estos fragmentos de PCR en vectores de plásmidos para la propagación en E. coli y determinación de sus secuencias de ADN (y proteína deducida).
Preparación de ARN de células de hibridoma 19-11:
Se preparó ARN a partir de 5x10e6 células de hibridoma que expresan anticuerpo (clon 19-11) aplicando el kit Rneasy (Qiagen). Brevemente, se lavaron las células sedimentadas una vez en PBS y se sedimentaron y posteriormente se resuspendieron para la lisis en 500 µl de tampón RLT (+β-ME). Las células se lisaron completamente pasando a través de un Qiashredder (Qiagen) y a continuación se sometieron al procedimiento de purificación mediado por matriz (ETOH, columnas RNeasy) como se describe en el manual del fabricante. Después de la última etapa de lavado, se recuperó ARN de las columnas en 50 ul de agua libre de RNasa. La concentración de ARN recuperado se determinó cuantificando a A260 y A280 de muestras diluidas 1:20. La integridad (calidad, grado de degradación) de las muestras de ARN aisladas se analizó por electroforesis en gel de ARN desnaturalizante sobre geles de formamida-agarosa (véase el Manual de Maniatis). Ejemplos de estas electroforesis en gel de ARN se muestran en la Figura 1. Las bandas discretas representan los ARN ribosómicos 18s y 28s
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INF7: GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYG (SEC ID Nº. 21)
Pueden aplicarse complejos biespecíficos de péptidos digoxigenados con variantes de anticuerpos <Diana>-<DIG> biespecíficos para dirigir los péptidos específicamente a células que expresan el antígeno diana. Así, los péptidos accederán selectivamente a las células que son reconocidas por antígenos de superficie, la citotoxicidad mediada por péptidos debe potenciarse sobre células que expresan antígeno.
Para la generación de tales complejos de anticuerpo biespecífico para el direccionamiento selectivo, es necesario (i) acoplar digoxigenina mediante conectores adecuados al péptido de un modo que permita que el péptido retenga su actividad; (ii) generar y caracterizar complejos de péptidos digoxigenados con la IgG <Diana>-<Dig> biespecífica. Estos complejos deben formarse de una manera definida (2 péptidos de Dig se unen a 1 IgG <Dig>). (iii) asegurar que estos complejos retengan la actividad del péptido, además de la especificidad y afinidad del anticuerpo que elige diana, para mediar en la elevada actividad biológica mediada por péptidos (específicos) sobre células que expresan el antígeno que elige diana.
Generación de péptidos con cisteína del extremo amino para conjugación de digoxigenina
Se realizaron síntesis de péptidos según protocolos establecidos (FastMoc 0,25 mmoles) en un sintetizador de péptidos automatizado ABI 433A de Applied Biosystems usando química de Fmoc. En ciclos iterativos, las secuencias de péptidos se ensamblaron por acoplamiento secuencial de los aminoácidos de Fmoc correspondientes. En cada etapa de acoplamiento, el grupo Fmoc del extremo N se eliminó por tratamiento de la resina (3 x 2,5 min) con 20 % de piperidina en N-metilpirrolidona. Los acoplamientos se llevaron a cabo empleando aminoácidos protegidos con Fmoc (1 mmol) activados por HBTU/HOBt (1 mmol cada uno) y DIPEA (2 mmoles) en DMF (45-60 min de vórtex). Después de cada etapa de acoplamiento, los grupos amino sin reaccionar se taparon mediante tratamiento con una mezcla de Ac2O (0,5 M), DIPEA (0,125 M) y HOBt (0,015 M) en NMP (10 min de vórtex). Entre cada etapa, la resina se lavó ampliamente con N-metilpirrolidona y DMF. La incorporación de aminoácidos estéricamente impedidos se llevó a cabo en acoplamientos dobles automatizados. Para este fin, la resina se trató dos veces con 1 mmol del bloque de construcción activado sin una etapa de tapado entre los ciclos de acoplamiento. Tras completarse las secuencias diana, se acopló ácido Fmoc-12-amino-4,7,10-trioxadodecanoico (TEG-espaciador) a los péptidos FAM5B y INF7 usando condiciones de acoplamiento de aminoácidos estándar. Posteriormente, se unió Fmoc-Cys(Trt)-OH al extremo amino de todas las secuencias de péptidos (FAM5B y INF7 con espaciador, melitina, FALLv1 y FALLv2 sin espaciador). Después de la desprotección de Fmoc final, la resina de péptido se colocó en una frita de filtración y se trató con una mezcla de ácido trifluoroacético, agua y triisopropilsilano (19 ml: 0,5 ml: 0,5 ml) durante 2,5 h. La disolución de escisión se filtró y los péptidos se precipitaron mediante la adición de éter diisopropílico frío (0 ºC) (300 ml) para suministrar un sólido incoloro, que se lavó repetidamente con éter diisopropílico. El producto en bruto se volvió a disolver en una mezcla de ácido acético/agua, se liofilizó y posteriormente se purificó por HPLC de fase inversa preparativa empleando un gradiente de acetonitrilo/agua que contenía 0,1 % de TFA (columna Merck Cromolith prep RP-18e, 100 x 25 mm).
Acoplamiento de péptidos con cisteína del extremo amino a digoxigenina
A una disolución del péptido modificado con cisteína correspondiente (6-20 mg) en un tampón KPO4 0,1 M (1 ml) se añadió una cantidad equimolar de digoxigenina-3-carboxi-metil-etilamidomaleimida disuelta en 100 µl de DMF. La mezcla de reacción se rodó suavemente durante 2-20 h a temperatura ambiente, se filtró y el compuesto diana se aisló por HPLC de fase inversa preparativa empleando un gradiente de acetonitrilo/agua que contenía 0,1 % de TFA (columna Merck Cromolith prep RP-18e, 100 x 25 mm). Después de la liofilización se obtuvo el conjugado de digoxigenina-péptido como un sólido incoloro.
El peso molecular del péptido melitina es 2949,64, el peso molecular del conjugado de péptido-Dig resultante es 3520,33. El peso molecular del péptido FALLv1 es 4710,59, el peso molecular del conjugado de péptido-Dig resultante es 5384,43. El peso molecular del péptido FALLv2 es 4791,76, el peso molecular del conjugado de péptido-Dig resultante es 5465,59. El peso molecular del péptido Fam5b es 3634,37, el peso molecular del conjugado de péptido-Dig resultante es 5410,47. El peso molecular del péptido INF7 es 2896,25, el peso molecular del conjugado de péptido-Dig resultante es 3466,94. Hasta el momento de la complejación con el anticuerpo, los presentes inventores guardaron el conjugado en alícuotas disueltas en H2O a -20 ºC. La Figura 14 representa esquemáticamente la composición de los complejos de péptido - digoxigenina.
Complejación de péptidos digoxigenados con anticuerpos biespecíficos <Diana>-<Dig> recombinantes
Se usaron anticuerpos biespecíficos <IGF1R>-<Dig> recombinantes y anticuerpos biespecíficos <Her2>-<Dig> como componentes de proteína de la reacción de acoplamiento. La composición y purificación de estas moléculas se ha descrito en el Ejemplo 1.
Para la generación de complejos de péptidos digoxigenados con <IGF1R>-<Dig> y anticuerpos biespecíficos <Her2>-<Dig>, los presentes inventores disolvieron el conjugado (melitina, INF7, FALLv1, FALLv2, Fam5b) de péptido-Dig en H2O a una concentración final de 1 mg/ml. El anticuerpo biespecífico se llevó a una concentración de
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presentes inventores fueron capaces de visualizar ópticamente el direccionamiento y la acumulación de dig-dox complejada con <IGF1R>-<DIG> sobre células. La Figura 22 muestra análisis de IF de células MCF7 que expresan IGF1R con el complejo de IGF1R-DIG y Dig-Dox acumulado sobre la superficie celular. Los resultados de estos estudios indican que dig-dox se administra específicamente a células diana eligiendo como diana restos del anticuerpo biespecífico.
Para analizar adicionalmente si los complejos de <Her2>-<Dig>-Dig-Dox y los complejos de <IGF1R>-<Dig>-Dig-Dox median en el direccionamiento específico de su carga (citotóxica) hacia células que expresan antígeno, los presentes inventores sembraron números definidos de células KPL-4 (Her2+++), H322M (IGF1R+++) y MDA-MB468 (Her2+/-) y dejaron que se unieran a las placas durante la noche. Al día siguiente se trataron con complejos de <Her2>-<Dig>-Dig-Dox o <IGF1R>-<Dig>-Dig-Dox en las concentraciones indicadas durante 48 horas. Entonces, se evaluó la viabilidad celular aplicando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter Glo (Promega, Madison, WI).
Los resultados de estos ensayos (Figuras 20, 21 y 48b) muestran que los complejos de IgG con doxorubicina digoxigenada confieren citotoxicidad a células que expresan antígeno: El valor de CI50 del complejo de Dig-Dox/<Her2>-<Dig> hacia células diana Kpl-4 que expresan Her2 fue 5,9 µM, mientras que para las células MDA-MB468 negativas para diana, el complejo de Dig-Dox y <Her2>-<Dig> no confirieron mucha más citotoxicidad que <Her2>-<Dig> sin ninguna carga. Similarmente, el valor de CI50 del complejo de Dig-Dox/<IGF1R>-<Dig> hacia células diana H322M que expresa IGF1R fue 5,8 µM. Para ambas líneas celulares diana (KPL-4 y H322M) se mostró que el anticuerpo que elige diana cargado con Dig-Dox tuvo una citotoxicidad más fuerte que el anticuerpo no cargado aplicado a las mismas concentraciones. Los presentes inventores llegan a la conclusión de que los derivados de anticuerpos biespecíficos <Diana>-<Dig> pueden administrar específicamente cargas citotóxicas a células que son reconocidas por los módulos que eligen diana.
Las Figuras 48 muestran los resultados de experimentos de direccionamiento adicionales de doxorubicina digoxigenada con anticuerpos biespecíficos <Dig>. Estos experimentos incluyeron una línea celular de tumor de mama adicional MDA-MB-468. Para estos ensayos, los presentes inventores propagaron y sembraron células KPL4, H322M o MDA-MB-468 como se ha descrito anteriormente y las trataron con doxorubicina o doxorubicina digoxigenada en las concentraciones indicadas durante 48 horas. La determinación de la viabilidad celular con el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter Glo (Promega, Madison, WI) (Figura 48a y b) confirmó que la doxorubicina digoxigenada pierde la mayoría de su actividad biológica cuando se incuba sobre células MDA-MB468. Este fenotipo es muy similar al observado para células KPL-4 y H322M (véase anteriormente). El valor de CI50 sobre células MDA-MB-468 fue 17 µM para doxorubicina sin modificar y >1000 µM para doxorubicina digoxigenada. Experimentos adicionales que tratan la posibilidad de administrar doxorubicina digoxigenada complejada con módulos que eligen diana biespecíficos se muestran en la Figura 48 c a e: Se trataron células KPL-4 (Her2+++), H322M (IGF1R+++) y MDA-MB-468 (Her2+/-) con complejos de <Her2>-<Dig>-Dig-Dox o <IGF1R>-<Dig>-Dig-Dox durante 48 h como se ha descrito anteriormente. Después, se evaluó la viabilidad celular aplicando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter Glo (Promega, Madison, WI). Los resultados de estos ensayos confirman que los complejos de IgG con doxorubicina digoxigenada confieren citotoxicidad a células que expresan antígeno. Para ambas líneas celulares diana (KPL-4 y H322M) que expresan tanto her2 como IGF1R se mostró que el anticuerpo que elige diana cargado con Dig-Dox tuvo una citotoxicidad más fuerte que el anticuerpo no cargado aplicado a las mismas concentraciones. A diferencia, para las células MDA-MB-468 negativas para diana, el complejo de Dig-Dox y <Her2>-<Dig> no confirió mucha más citotoxicidad que <Her2>-<Dig> sin ninguna carga. Los presentes inventores llegan a la conclusión de que derivados de anticuerpos biespecíficos de <Diana>-<Dig> pueden administrar específicamente cargas citotóxicas a células que son reconocidas por los módulos que eligen diana.
Ejemplo 9: Generación de complejos definidos de sustratos fluorescentes digoxigenados con <Her2>-<Dig> y <IGF1R>-<Dig> biespecíficos
Pueden aplicarse complejos de sustratos fluorescentes digoxigenados con derivados de anticuerpos biespecíficos que contienen módulos de unión a Dig recombinantes para la obtención de imágenes específica de tejidos o células que llevan el antígeno diana. Estos complejos están compuestos de una IgG <Diana>-<Dig> humanizada que une en sus dos sitios de unión a Dig de alta afinidad dos sustratos digoxigenados (uno en cada sitio) que pueden visualizarse por tecnologías de obtención de imágenes. Es necesario que los compuestos de obtención de imágenes retengan sus propiedades (fluorescencia) a pesar de estar digoxigenados, además de mientras que están complejados con el anticuerpo. También se desea que el sitio de unión diana de la superficie celular del derivado de anticuerpo biespecífico retenga su especificidad y afinidad de unión en presencia de compuestos de Dig complejados.
El compuesto de obtención de imágenes que los presentes inventores han usado como ejemplo para evaluar esta tecnología es Cy5. Cy5 es un sustrato de fluorescencia que es excitado por una longitud de onda entre 575 - 633 nm nM y tras la excitación emite luz en el espectro de infrarrojo cercano a una longitud de onda de 670 nM. Debido a esto, la presencia de Cy5 y Cy5 digoxigenada (= Dig-Cy5) puede evaluarse por microscopía de fluorescencia, además de por tecnologías de obtención de imágenes in vivo. Los complejos biespecíficos de Cy5 digoxigenada con variantes de anticuerpos biespecíficos <Diana>-<DIG> pueden aplicarse para dirigir Cy5 específicamente a células
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Generación de ácidos nucleicos digoxigenados
1.
Síntesis y purificación de oligorribonucleótidos:
Se sintetizaron oligorribonucleótidos según la tecnología de fosforamidito sobre fase sólida empleando un sintetizador ABI 394 (Applied Biosystems) a la escala de 10 µmoles. Las síntesis se realizaron sobre un soporte sólido hecho de vidrio de poro controlado (CPG, 520Ǻ, con una carga de de 75 µmol/g, obtenido de Prime Synthesis, Aston, PA, EE.UU., o 3'-PT-Amino-Mod. C6 CPG, con una carga de 37 µmol/g, de Glen Research, Sterling, Virginia, EE.UU.). Se compraron fosforamiditos de ARN regulares, 2'-O-metilfosforamiditos y 2'-F fosforamiditos, además de reactivos secundarios, de Proligo (Hamburgo, Alemania). Sin ninguna modificación del ciclo de síntesis, el colorante fluorescente de Cy5 se unió al extremo 5' usando el fosforamidito correspondiente (obtenido de GE Healthcare, Múnich, Alemania). Después de la finalización de la síntesis en fase sólida, se llevó a cabo la escisión y desprotección del oligómero unido al soporte. Entonces, los oligómeros en bruto se purificaron por HPLC de intercambio aniónico (AEX) usando una fuente 15Q, SPSC-150, columna de 150 x 8 mm (Bischoff, Leonberg, Alemania) en un sistema AKTA Explorer (GE Healthcare).
2.
Marcado con DIG del ARN modificado con amino
Se disolvió N-hidroxisuccinimida del ácido digoxigenina-3-O-metilcarbonil-ε-aminocaproico (Roche, Basilea, Suiza) en sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Fluka, Buchs, Suiza). Esta disolución se añadió al ARN modificado con amino purificado disuelto en tampón (borato de Na 0,1 M en KCl 0,1 M, pH 8,5). La reacción se controló por HPLC AEX. En caso de reacción cuantitativa, el ARN conjugado se aisló mediante precipitación con NaOAc 3 M, pH=5,2 y etanol (1:32). Si la reacción no fue cuantitativa se realizó una etapa de purificación. En este caso, los oligómeros se purificaron por HPLC AEX usando un DNAPac PA-100 22 x 250 mm (Dionex, Idstein, Alemania) sobre un sistema AKTA Explorer (GE Healthcare). El tampón A fue urea 6 M, NaClO4 10 mM, Tris 20 mM, EDTA 1 mM; pH 7,4, 20 % de ACN, y el tampón B urea 6 M, NaClO4 500 mM, Tris 20 mM, EDTA 1 mM; pH 7,4, 20 % de ACN. Se empleó una velocidad de flujo de 4,5 ml/min (a 60 ºC). Se registraron perfiles de UV a 260, 280 y en el caso de Cy5 a 643 nm. Se empleó un gradiente de 25 % de B a 55 % de B en el plazo de 55 min. Se reunieron fracciones apropiadas y se precipitaron con NaOAc 3 M, pH=5,2 y etanol (1:32). Después de la centrifugación el sedimento se disolvió en agua. La concentración de la disolución se determinó por medición de absorbancia a 260 nm en un fotómetro de UV (Beckman Coulter, Krefeld, Alemania). Hasta la hibridación, las hebras individuales se almacenaron como disoluciones congeladas a -20 ºC.
3.
Hibridación de oligorribonucleótidos para generar ARNip
Se hibridaron hebras complementarias combinando disoluciones de ARN equimolares. La mezcla se liofilizó y se reconstituyó con un volumen apropiado de tampón de hibridación (NaCl 100 mM, fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8) para lograr la concentración deseada. Esta disolución se dispuso en un baño de agua a 95 ºC que se enfrió a TA en el plazo de 3 h.
El peso molecular de los ácidos nucleicos, además de los heterodúplex de ARNip, se enumeran en la Tabla 6. Hasta el momento de la complejación con el anticuerpo, los presentes inventores guardaron los conjugados de ácido nucleico en alícuotas disueltas en NaCl 0,1 M, NaH2PO4 20 mM x H2O/ Na2HPO4 x 2H2O, pH 6,8 a -20 ºC. La Figura 29 representa esquemáticamente la composición de ácidos nucleicos acoplados a digoxigenina.
Complejación de ácidos nucleicos digoxigenados con anticuerpos biespecíficos <Diana-Dig> recombinantes
Se usaron anticuerpos biespecíficos <IGF1R>-<Dig> recombinantes y anticuerpos biespecíficos <Her2>-<Dig> como componentes de proteína de la reacción de acoplamiento. La composición y purificación de estas moléculas se ha descrito en el Ejemplo 1.
Para la generación de complejos de ácidos nucleicos digoxigenados con <IGF1R>-<Dig> y anticuerpos biespecíficos <Her2>-<Dig>, los presentes inventores disolvieron el conjugado de ácido nucleico-Dig en NaCl 0,1 M, NaH2PO4 20 mM x H2O/ Na2HPO4 x 2H2O, pH 6,8, a una concentración final de 100 µM. El anticuerpo biespecífico se llevó a una concentración de 1 mg/ml (5 µM) en histidina 20 mM, NaCl 140 mM, tampón a pH=6,0. Se mezclaron el ácido nucleico y el anticuerpo biespecífico a una relación molar 2:1 (ácido nucleico con respecto a anticuerpo) pipeteando arriba y abajo y se incubaron durante 15 minutos a TA. Entonces, el complejo se usó en ensayos in vitro o aplicaciones in vivo sin modificación adicional. Se llevaron a cabo diluciones del complejo para estos ensayos en Opti-MEM 1 (Invitrogen Madison, WI). El complejo resultante se definió como molécula similar a IgG monomérica, que lleva 2 Dig-ARNip por un derivado de anticuerpo. La composición definida (y relación 2:1 de ácido nucleico con respecto a proteína) de estos complejos biespecíficos se confirmó por cromatografía de exclusión por tamaño y experimentos de carga/competición. Los resultados de este análisis de cromatografía de exclusión por tamaño con módulos que eligen diana biespecífica y ácidos nucleicos fluorescentemente marcados se muestran en la Figura 30: Se reveló elevada carga (señal al tamaño del mayor complejo de proteína) aumentando las señales de fluorescencia hasta una relación de dos ácidos nucleicos por una molécula de proteína. Después, la adición de más ácidos nucleicos marcados no aumenta la señal en la posición de proteína, sino en su lugar en una posición que refleja
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