ES2955074T3

ES2955074T3 - Proteínas que se unen a HER2, NKG2D Y CD16

Info

Publication number: ES2955074T3
Application number: ES18754782T
Authority: ES
Inventors: Gregory Chang; Ann Cheung; William Haney; Bradley Lunde; Bianka Prinz
Original assignee: Dragonfly Therapeutics Inc
Current assignee: Dragonfly Therapeutics Inc
Priority date: 2017-02-20
Filing date: 2018-02-20
Publication date: 2023-11-28
Anticipated expiration: 2038-02-20
Also published as: US11884732B2; CA3054079A1; IL268755A; MX2019009848A; JP2020508997A; EP4273258A3; CA3235295A1; JP2024024048A; KR20190120782A; DK3582806T3; EP3582806A4; KR20240060739A; EP4273258A2; WO2018152518A1; AU2018220736A1; US20200231678A1; FI3582806T3; SG11201907646YA; EP3582806B1; BR112019017197A2

Abstract

Se describen proteínas de unión multiespecíficas que se unen a HER2, el receptor NKG2D y CD 16, así como composiciones farmacéuticas y métodos terapéuticos útiles para el tratamiento del cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas que se unen a HER2, NKG2D Y CD16

Campo de la invención

La invención se refiere a proteínas de unión multiespecífica que se unen al receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2 o ErbB2), al receptor de NKG2D y a CD16.

Antecedentes

El cáncer sigue siendo un problema de salud significativo a pesar de los sustanciales esfuerzos de investigación y los avances científicos notificados en la bibliografía para tratar esta enfermedad. Algunos de los cánceres diagnosticados con más frecuencia incluyen cáncer de próstata, cáncer de mama y cáncer de pulmón. El cáncer de próstata es la forma más frecuente de cáncer en hombres. El cáncer de mama sigue siendo una de las principales causas de muerte en las mujeres. Las opciones de tratamiento actuales para estos cánceres no son eficaces para todos los pacientes y/o pueden tener efectos secundarios adversos sustanciales. Otros tipos de cáncer también siguen siendo difíciles de tratar mediante el uso de las opciones terapéuticas existentes.

Las inmunoterapias contra el cáncer son convenientes porque son muy específicas y pueden facilitar la destrucción de células cancerosas mediante el uso del propio sistema inmunitario del paciente. Las proteínas de fusión tales como los acopladores biespecíficos de células T, son inmunoterapias contra el cáncer descritas en la bibliografía médica que se unen a las células tumorales y a las células T para facilitar la destrucción de las células tumorales. En la bibliografía se han descrito anticuerpos que se unen a ciertos antígenos asociados a tumores y a ciertas células inmunitarias. Ver, por ejemplo, los documentos WO 2016/134371 y WO 2015/095412.

Germain, C. y otros “MHC Class I-related chain a conjugated to antitumor antibodies can sensitize tumor cells to specific lysis by natural killer cells”, en Clinical Cancer Research, American Association for Cancer Research, US, vol 11, núm. 20, 15 de octubre de 2005, páginas 7516-7522: describen la conjugación de MICA-Fc a Fab anti-antígeno asociado a tumores (TAA) contra CEA, HER2 y CD20.

Cho, H-M y otros “Delivery of NKG2D ligand using an anti-HER2 antibody-NKG2D ligand fusion protein results in an enhanced innate and adaptative antitumor response” Cancer Research, vol 70, núm. 24, 14 de diciembre de 2010 páginas 10121-10130 describen la fusión del ligando de NKG2D Rae-1beta a un anticuerpo IgG3 intacto/funcional dirigido contra HER2.

El documento US 2011/044980 (Ghayur T, y otros 24 de febrero de 2011): describe múltiples modalidades de Ig de dominio variable doble (DVD-Ig) contra TAA y NKG2D.

Las células asesinas naturales (NK) son un componente del sistema inmunitario innato y constituyen aproximadamente el 15 % de los linfocitos circulantes. Las células NK infiltran prácticamente todos los tejidos y se caracterizaron originalmente por su capacidad para destruir células tumorales de forma efectiva sin necesidad de sensibilización previa. Las células NK activadas matan a las células diana por medios similares a las células T citotóxicas, es decir, a través de gránulos citolíticos que contienen perforina y granzimas así como también a través de vías de receptores de muerte. Las células NK activadas también secretan citocinas inflamatorias tales como IFN-Y y quimiocinas que promueven el reclutamiento de otros leucocitos en el tejido diana.

Las células NK responden a las señales a través de una variedad de receptores de activación e inhibidores en su superficie. Por ejemplo, cuando las células NK se encuentran con células propias sanas, su actividad se inhibe mediante la activación de los receptores similares a inmunoglobulina (KIR) de células asesinas. Alternativamente, cuando las células NK encuentran células extrañas o células cancerosas, se activan a través de sus receptores de activación (por ejemplo, NKG2D, NCR, DNAM1). Las células NK también son activadas por la región constante de algunas inmunoglobulinas a través de los receptores de CD16 en su superficie. La sensibilidad general de las células NK a la activación depende de la suma de las señales estimuladoras e inhibidoras.

HER2 (ErbB2) es una glucoproteína transmembrana que pertenece a la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico. Es un receptor tirosina cinasa y regula la supervivencia, la proliferación y el crecimiento celular. HER2 desempeña un papel importante en las neoplasias malignas humanas. El gen erbB2 se amplifica o sobreexpresa en aproximadamente el 30 % de los cánceres de mama humanos. Las pacientes con cáncer de mama que sobreexpresa HER2 tienen tasas de supervivencia general sustancialmente más bajas e intervalos sin enfermedad más cortos que las pacientes cuyo cáncer no sobreexpresa HER2. Además, la sobreexpresión de HER2 conduce a un incremento de la metástasis del cáncer de mama. También se sabe que la sobreexpresión de HER2 se produce en muchos otros tipos de cáncer, incluidos cáncer de mama, ovario, esófago, vejiga y gástrico, carcinoma del conducto salival, adenocarcinoma de pulmón y formas agresivas de cáncer uterino, tal como el carcinoma de endometrio seroso.

Resumen

La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas. La invención proporciona proteínas de unión multiespecíficas que se unen a HER2 en una célula cancerosa y al receptor de n Kg2d y al receptor de CD16 en células asesinas naturales. La invención proporciona una proteína de unión multiespecífica que comprende:

(a) un primer sitio de unión al antígeno, que comprende un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera que se une a NKG2D;

(b) un segundo sitio de unión al antígeno, que comprende un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera que se une a HER2; y

(c) un dominio Fc de anticuerpo o una porción de este suficiente para unirse a CD16,

en donde el primer sitio de unión al antígeno, el segundo sitio de unión al antígeno, o cada uno del primer y segundo sitios de unión al antígeno comprende un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera presente en el mismo polipéptido, y

en donde la proteína se configura para su unión a HER2 en una célula cancerosa y su unión a NKG2D en una célula asesina natural (NK) para activar la célula NK y su unión a CD16 en una célula NK para activar la célula NK.

Tales proteínas pueden acoplarse a más de un tipo de receptor de activación de NK y bloquear la unión de ligandos naturales a NKG2D. En ciertas modalidades, las proteínas pueden agonizar las células n K en seres humanos, y en otras especies tales como roedores y macacos cangrejeros. Varios aspectos y modalidades de la invención se describen en más detalle a continuación.

En consecuencia, un aspecto de la invención proporciona una proteína que incorpora un primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D; un segundo sitio de unión al antígeno que se une a HER2; y un dominio Fc de anticuerpo, una porción de este suficiente para unirse a CD16, o un tercer sitio de unión al antígeno que se une a CD16. Los sitios de unión al antígeno pueden incorporar cada uno un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo (por ejemplo, dispuestos como en un anticuerpo, o fusionados entre sí a partir de un scFv, o uno o más de los sitios de unión al antígeno pueden ser un anticuerpo de dominio único, tal como un anticuerpo V^hH como un anticuerpo de camélido o un anticuerpo V^narcomo los encontrados en el pescado cartilaginoso.

El primer sitio de unión al antígeno, que se une a NKG2D, en una modalidad, puede incorporar un dominio variable de la cadena pesada relacionado con la SEQ ID NO:1, tal como al tener una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO:1, y/o incorporar secuencias de aminoácidos idénticas a las secuencias de CDR1 (SEQ ID NO:62), CDR2, (SEQ ID NO.63) y c Dr3 (SEQ ID NO:64) de la SEQ ID NO:1. Alternativamente, el primer sitio de unión al antígeno puede incorporar un dominio variable de la cadena pesada relacionado con la SEQ ID NOO41 y un dominio variable de la cadena ligera relacionado con la SEQ ID NO:42. Por ejemplo, el dominio variable de la cadena pesada del primer sitio de unión al antígeno puede ser al menos 90 % (por ejemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico a la SEQ ID NO:41, y/o incorporar secuencias de aminoácidos idénticas a las secuencias CDR1 (SEQ ID NO:65), CDR2 (SEQ ID NO:66) y CDR3 (SEQ ID NO:67) de la SEQ ID NO:41. De manera similar, el dominio variable de la cadena ligera del segundo sitio de unión al antígeno puede ser al menos 90 % (por ejemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico a la SEQ ID NO:42, y/o incorporar secuencias de aminoácidos idénticas a las secuencias de CDR1 (SEQ ID NO:68), CDR2 (SEQ ID NO:69) y CDR3 (SEQ ID NO:70) de la SEQ ID NO:42. En otras modalidades, el primer sitio de unión al antígeno puede incorporar un dominio variable de la cadena pesada relacionado con la SEQ ID NO:43 y un dominio variable de la cadena ligera relacionado con la SEQ ID NO:44. Por ejemplo, el dominio variable de la cadena pesada del primer sitio de unión al antígeno puede ser al menos 90 % (por ejemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico a la SEQ ID NO:43, y/o incorporar secuencias de aminoácidos idénticas a las secuencias de CDR1 (SEQ ID NO:71), CDR2 (SEQ ID NO:72) y CDR3 (SEQ ID NO:73) de la SEQ ID NO:43. De manera similar, el dominio variable de la cadena ligera del segundo sitio de unión al antígeno puede ser al menos 90 % (por ejemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico a la SEQ ID NO:44, y/o incorporar secuencias de aminoácidos idénticas a las secuencias de CDR1 (SEQ ID NO:74), CDR2 (SEQ ID NO:75) y CDR3 (SEQ ID NO:76) de la SEQ ID NO:44.

Alternativamente, el primer sitio de unión al antígeno puede incorporar un dominio variable de la cadena pesada relacionado con la SEQ ID NO:45 y un dominio variable de la cadena ligera relacionado con la SEQ ID NO:46, tal como tener secuencias de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idénticas a la SEQ ID NO:45 y al menos 90 % (por ejemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idénticas a la SEQ ID NO:46 respectivamente. En otra modalidad, el primer sitio de unión al antígeno puede incorporar un dominio variable de la cadena pesada relacionado con la SEQ ID NO:47 y un dominio variable de la cadena ligera relacionado con la SEQ ID NO:48, tal como al tener secuencias de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idénticas a la SEQ ID NO:47 y al menos 90 % (por ejemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntica la SEQ ID NO:48 respectivamente.

El segundo sitio de unión al antígeno puede incorporar opcionalmente un dominio variable de la cadena pesada relacionado con la SEQ ID NO:49 y un dominio variable de la cadena ligera relacionado con la SEQ ID NO:53. Por ejemplo, el dominio variable de la cadena pesada del segundo sitio de unión al antígeno puede ser al menos 90 % (por ejemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico a la SEQ ID NO:49, y/o incorporar secuencias de aminoácidos idénticas a las secuencias de CDR1 (SEQ ID NO:50), CDR2 (SEQ ID NO:51) y CDR3 (SEQ ID NO:52) de la SEQ ID NO:49. De manera similar, el dominio variable de la cadena ligera del segundo sitio de unión al antígeno puede ser al menos 90 % (por ejemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico a la SEQ ID NO:53 y/o incorporar secuencias de aminoácidos idénticas a las secuencias de CDR1 (SEQ ID NO:54), CDR2 (SEQ ID NO:55) y CDR3 (SEQ ID NO:56) de la SEQ ID NO:53. Alternativamente, el segundo sitio de unión al antígeno puede incorporar un dominio variable de la cadena pesada relacionado con la SEQ ID NO:57 y un dominio variable de la cadena ligera relacionado con la SEQ ID NO:58. Por ejemplo, el dominio variable de la cadena pesada del segundo sitio de unión al antígeno puede ser al menos 90 % (por ejemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico a la SEQ ID NO:57, y/o incorporar secuencias de aminoácidos idénticas a las secuencias de CDR1 (SEQ ID NO:77), CDR2 (SEQ ID NO:78) y CDR3 (SEQ ID NO:79) de la SEQ ID NO:57. De manera similar, el dominio variable de la cadena ligera del segundo sitio de unión al antígeno puede ser al menos 90 % (por ejemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico a la SEQ ID NO:58, y/o incorporar secuencias de aminoácidos idénticas a las secuencias de CDR1 (SEQ ID NO:80), CDR2 (SEQ ID NO.81) y CDR3 (SEQ ID NO:82) de la SEQ ID NO:58. En otra modalidad, el segundo sitio de unión al antígeno puede incorporar un dominio variable de la cadena pesada relacionado con la SEQ ID NO:59 y un dominio variable de la cadena ligera relacionado con la SEQ ID NO:60. Por ejemplo, el dominio variable de la cadena pesada del segundo sitio de unión al antígeno puede ser al menos 90 % (por ejemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico a la SEQ ID NO:59, y/o incorporar secuencias de aminoácidos idénticas a las secuencias de CDR1 (SEQ ID NO:83), CDR2 (SEQ ID NO:84) y CDR3 (SEQ ID NO:85) de la SEQ ID NO:59. De manera similar, el dominio variable de la cadena ligera del segundo sitio de unión al antígeno puede ser al menos 90 % (por ejemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico a la SEQ ID NO:60, y/o incorporar secuencias de aminoácidos idénticas a las secuencias de CDR1 (SEQ ID NO:86), CDR2 (SEQ ID NO:87) y CDR3 (SEQ ID NO:88) de la SEQ ID NO:60. En modalidades descritas pero no reivindicadas, el segundo sitio de unión al antígeno incorpora un dominio variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera presente en el primer sitio de unión al antígeno.

En algunas modalidades, la proteína incorpora una porción de un dominio Fc de anticuerpo suficiente para unirse a CD16, en donde el dominio Fc de anticuerpo comprende dominios bisagra y CH2, y/o secuencias de aminoácidos al menos 90 % idénticas a la secuencia de aminoácidos 234-332 de un anticuerpo IgG humano.

También se proporcionan formulaciones que contienen una de estas proteínas; células que contienen uno o más ácidos nucleicos que expresan estas proteínas, y métodos para potenciar la muerte de las células tumorales mediante el uso de estas proteínas.

Otro aspecto de la invención proporciona una proteína de unión multiespecífica de la presente invención o una formulación de la presente invención para su uso en un método para tratar el cáncer, en donde el método comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de unión multiespecífica o la formulación. Los cánceres ilustrativos para el tratamiento mediante el uso de las proteínas de unión multiespecíficas incluyen, por ejemplo, cáncer de mama, ovario, esófago, vejiga y gástrico, carcinoma del conducto salival, adenocarcinoma de pulmón y formas agresivas de cáncer uterino, tal como el carcinoma de endometrio seroso.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una representación de una proteína de unión multiespecífica que contiene un dominio de unión a NKG2D (brazo derecho), un dominio de unión a antígeno asociado a tumor (brazo izquierdo) y un dominio Fc o una porción de este que se une a CD16.

La Figura 2 es una representación de una proteína de unión multiespecífica que contiene un dominio de unión a NKG2D en un formato scFv (brazo derecho), un dominio de unión a antígeno asociado al tumor (brazo izquierdo) y un dominio Fc o una porción de este que se une a CD16.

La Figura 3 son gráficos de líneas que demuestran la afinidad de unión de los dominios de unión a NKG2D (enumerados como clones) a NKG2D recombinante humano en un ensayo ELISA.

La Figura 4 son gráficos de líneas que demuestran la afinidad de unión de los dominios de unión a NKG2D (enumerados como clones) a NKG2D recombinante de macaco cangrejero en un ensayo ELISA.

La Figura 5 son gráficos de líneas que demuestran la afinidad de unión de los dominios de unión a NKG2D (enumerados como clones) a NKG2D recombinante de ratón en un ensayo ELISA.

La Figura 6 son gráficos de barras que demuestran la unión de dominios de unión a NKG2D (enumerados como clones) a células EL4 que expresan NKG2D humano mediante citometría de flujo que muestra las veces de intensidad de fluorescencia media (MFI) sobre el fondo.

La Figura 7 son gráficos de barras que demuestran la unión de dominios de unión a NKG2D (enumerados como clones) a células EL4 que expresan NKG2D de ratón mediante citometría de flujo que muestra las veces de intensidad de fluorescencia media (MFI) sobre el fondo.

La Figura 8 son gráficos de líneas que demuestran la afinidad de unión específica de los dominios de unión a NKG2D (enumerados como clones) a NKG2D-Fc humano recombinante al competir con el ligando natural LTLBP-6.

La Figura 9 son gráficos de líneas que demuestran la afinidad de unión específica de los dominios de unión a NKG2D (enumerados como clones) a NKG2D-Fc humano recombinante al competir con el de ligando natural MICA.

La Figura 10 son gráficos de líneas que demuestran la afinidad de unión específica de los dominios de unión a NKG2D (enumerados como clones) a NKG2D-Fc recombinante de ratón al competir con el ligando natural Rae-1 delta.

La Figura 11 son gráficos de barras que muestran la activación de NKG2D humano por los dominios de unión a NKG2D (enumerados como clones) al cuantificar el porcentaje de células positivas a TNFα, que expresan proteínas de fusión NKG2D-CD3 zeta humanas.

La Figura 12 son gráficos de barras que muestran la activación de NKG2D de ratón por dominios de unión a NKG2D (enumerados como clones) al cuantificar el porcentaje de células positivas a TNFα, que expresan proteínas de fusión NKG2D-CD3 zeta de ratón.

La Figura 13 son gráficos de barras que muestran la activación de células NK humanas por los dominios de unión a NKG2D (enumerados como clones).

La Figura 14 son gráficos de barras que muestran la activación de células NK humanas por los dominios de unión a NKG2D (enumerados como clones).

La Figura 15 son gráficos de barras que muestran la activación de células NK de ratón por los dominios de unión a NKG2D (enumerados como clones).

La Figura 16 son gráficos de barras que muestran la activación de células NK de ratón por los dominios de unión a NKG2D (enumerados como clones).

La Figura 17 son gráficos de barras que muestran el efecto citotóxico de los dominios de unión a NKG2D (enumerados como clones) en células tumorales.

La Figura 18 son gráficos de barras que muestran la temperatura de fusión de los dominios de unión a NKG2D (enumerados como clones) medidos mediante fluorimetría de barrido diferencial.

La Figura 19 es un gráfico que muestra la activación potenciada de células NK humanas por proteínas de unión multiespecíficas.

La Figura 20 es un gráfico que muestra que las proteínas de unión multiespecíficas indujeron niveles más altos de citotoxicidad hacia las células diana tumorales por las células NK humanas.

La Figura 21 es un gráfico que muestra que las proteínas de unión multiespecíficas indujeron niveles más altos de citotoxicidad hacia las células diana tumorales por las células NK humanas.

La Figura 22 es un gráfico que muestra que las proteínas de unión multiespecíficas indujeron niveles más altos de citotoxicidad hacia las células diana tumorales por las células NK humanas.

La Figura 23 es un gráfico que muestra que las proteínas de unión multiespecíficas indujeron niveles más altos de citotoxicidad hacia las células diana tumorales por las células NK humanas.

La Figura 24 es un gráfico que muestra que las proteínas de unión multiespecíficas indujeron niveles más altos de citotoxicidad hacia las células diana tumorales por las células NK de ratón.

La Figura 25 es un gráfico que muestra que las proteínas de unión multiespecíficas indujeron niveles más altos de citotoxicidad hacia las células diana tumorales por las células NK de ratón.

La Figura 26 es un perfil de unión de las TriNKET que se dirigen a HER2 a NKG2D expresado en células EL4. La Figura 26 representa los mismos dos dominios de unión a NKG2D ahora emparejados con un segundo brazo de direccionamiento de HER2.

La Figura 27A es un perfil de unión de las TriNKET que se dirigen a HER2 a HER2 expresado en células de carcinoma de células renales 786-O humanas; la Figura 27B muestra que el clon de unión a NKG2D C26 que contiene TriNKET se une a células RMA transducidas con HER2 humano; la Figura 27C muestra que el clon de unión a NKG2D F04 que contiene TriNKET se une a células RMA transducidas con HER2 humano.

Las Figuras 28A - 28C son gráficos de barras que demuestran que TriNKET y trastuzumab fueron capaces de activar las células NK humanas primarias en cocultivo con células tumorales humanas positivas a HER2, indicado por un incremento en la desgranulación de CD107a y la producción de citocinas IFN^y. En comparación con el anticuerpo monoclonal trastuzumab, ambas TriNKET mostraron una activación superior de las células NK humanas con una variedad de células cancerosas HER2 humanas. La Figura 28A muestra que las células NK humanas son activadas por TriNKET cuando se cultivan con células SkBr-3. La Figura 28B muestra que las células NK humanas son activadas por TriNKET cuando se cultivan con células Colo201. La Figura 28C muestra que las células NK humanas son activadas por TriNKET cuando se cultivan con células HCC1954.

Las Figuras 29A-29B son gráficos que demuestran que TriNKET proporcionan la mayor ventaja contra los cánceres con medio y bajo contenido de HER2 en comparación con trastuzumab. La Figura 29A muestra la destrucción por células NK humanas activadas de células tumorales SkBr-3 con alto contenido de HER2. La Figura 29B muestra la destrucción por células NK humanas de células tumorales 786-O con bajo contenido de HER2. Las TriNKET proporcionan una mayor ventaja en comparación con trastuzumab contra las células cancerosas con baja expresión de HER2.

Las Figuras 30A-30C son gráficos de barras de activación sinérgica de células NK mediante el uso de CD16 y NKG2D. La Figura 30A demuestra los niveles de CD107a; la Figura 30B demuestra los niveles de IFN^y; la Figura 30C demuestra los niveles de CD107a e IFNy. Los gráficos indican la media (n = 2) ±DE. Los datos son representativos de cinco experimentos independientes mediante el uso de cinco donantes sanos diferentes. La Figura 31 es un gráfico de barras que muestra la activación de células NK mediante el uso de las TriNKET que se dirigen a NKG2D y CD16. Los anticuerpos analizados fueron de isotipos IgG1 humanos. Los gráficos indican la media (n = 2) ± DE.

Las Figuras 32A - 32C son gráficos que demuestran la potenciación por TriNKET de la actividad citotóxica mediante el uso de células NK humanas activadas por IL-2 y en reposo. La Figura 32A muestra el por ciento de lisis específica de células tumorales SkBr-3 por células NK humanas en reposo. La Figura 32B muestra el por ciento de lisis específica de células tumorales SkBr-3 por células NK activadas por IL-2. La Figura 32C muestra el por ciento de lisis específica de células de cáncer de pulmón NCI-H661 por células NK humanas activadas por IL-2.

Las Figuras 33A y 33B son gráficos de barras que muestran que las células B de un donante sano son sensibles a la lisis mediada por TriNKET. Las Figuras 33C y 33D son gráficos de barras que muestran que las células mieloides son resistentes a la lisis mediada por TriNKET.

La Figura 34 son gráficos de líneas de la destrucción de hPBMC mediada por TriNKET de células tumorales SkBr-3 en cocultivos a largo plazo.

La Figura 35 es un gráfico de líneas que muestra que la unión triespecífica en una molécula es importante para la actividad máxima de las células NK.

La Figura 36 es un diagrama de flujo del diseño del estudio de la eficacia subcutánea de SC2.2 sobre RMNS-HER2.

La Figura 37 son gráficos de líneas que muestran que SC2.2 no tiene efecto sobre el crecimiento tumoral subcutáneo de RMAS-HER2.

La Figura 38A muestra que HER2-TriNKET-C26 enlaza hNKG2D-Fc a células RMA-HER2. La Figura 38B muestra que HER2-TriNKET-F04 enlaza hNKG2D-Fc a células RMA-HER2. La línea punteada representa el control de isotipo. La línea continua sin relleno representa un control sin teñir. La línea continua con relleno representa las TriNKET.

La Figura 39 es una representación de una TriNKET en forma de Triomab, que es un anticuerpo trifuncional biespecífico que mantiene una forma similar a IgG. Esta quimera consiste en dos medios anticuerpos, cada uno con una cadena ligera y una cadena pesada, que se originan a partir de dos anticuerpos parentales. La forma de triomab puede ser un constructo heterodimérico que contiene A de anticuerpo de rata y 'A de anticuerpo de ratón.

La Figura 40 es una representación de una TriNKET en la forma de cadena ligera (LC) común de KiH, que implica la tecnología de botones en ojales (KIH). KiH es un heterodímero que contiene 2 Fab de unión a la diana 1 y 2, y un Fc estabilizado por mutaciones de heterodimerización. La TriNKET en el formato de KiH puede ser un constructo heterodimérico con 2 fab que se unen a la diana 1 y a la diana 2, que contiene dos cadenas pesadas diferentes y una cadena ligera común que se empareja con ambas cadenas pesadas.

La Figura 4 l es una representación de una TriNKET en la forma de inmunoglobulina de dominio variable doble (DVD-Ig™), que combina los dominios de unión a diana de dos anticuerpos monoclonales a través de enlazadores flexibles de origen natural, y produce una molécula similar a IgG tetravalente. DVD-Ig™ es un constructo homodimérico donde el dominio variable que se dirige al antígeno 2 se fusiona al extremo N-terminal del dominio variable del antígeno 1 de direccionamiento a Fab. El constructo contiene Fc normal.

La Figura 42 es una representación de una TriNKET en la forma de interfaz de Fab ortogonal (0rto-Fab), que es un constructo heterodimérico que contiene 2 Fab que se unen a la diana 1 y la diana 2 fusionadas a Fc. El emparejamiento LC-HC está garantizado por una interfaz ortogonal. La heterodimerización está garantizada por mutaciones en el Fc.

La Figura 43 es una representación de una TrinKET en el formato de Ig 2 en 1.

La Figura 44 es una representación de una TriNKET en forma de ES, que es un constructo heterodimérico que contiene dos Fab diferentes que se unen a la diana 1 y la diana 2 fusionadas con el Fc. La heterodimerización está garantizada por mutaciones de dirección electrostática en el Fc.

La Figura 45 es una representación de una TriNKET en la forma de intercambio del brazo Fab: anticuerpos que intercambian brazos Fab al intercambiar una cadena pesada y una cadena ligera unida (media molécula) por un par de cadenas pesadas-ligeras de otra molécula, lo que da como resultado anticuerpos biespecíficos. La forma de intercambio del brazo de Fab (cFae) es un heterodímero que contiene 2 Fab que se unen a la diana 1 y 2, y un Fc estabilizado por mutaciones de heterodimerización.

La Figura 46 es una representación de una TriNKET en la forma de cuerpo de SEED, que es un heterodímero que contiene 2 Fab que se unen a la diana 1 y 2, y un Fc estabilizado por mutaciones de heterodimerización. La Figura 47 es una representación de una TriNKET en forma de LuZ-Y, en el que se usa la cremallera de leucina para inducir la heterodimerización de dos HC diferentes. La forma LuZ-Y es un heterodímero que contiene dos scFab diferentes que se unen a la diana 1 y 2, fusionados a Fc. La heterodimerización se garantiza a través de motivos de cremallera de leucina fusionados con el extremo C-terminal de Fc.

La Figura 48 es una representación de una TriNKET en la forma de Cov-X-Cuerpo.

Las Figuras 49A-49B son representaciones de TriNKET en las formas de KÁ-Cuerpo, que son constructos heterodiméricos con dos Fab diferentes fusionados a Fc estabilizados por mutaciones de heterodimerización: El antígeno 1 de direccionamiento a Fab1 contiene LC kappa, mientras que el segundo antígeno 2 de direccionamiento a Fab contiene LC lambda. La Figura 49A es una representación ilustrativa de una forma de un KÁ-Cuerpo; la Figura 49B es una representación ilustrativa de otro KÁ-Cuerpo.

La Figura 50 es un constructo heterodimérico Oasc-Fab que incluye la unión de Fab a la diana 1 y la unión de scFab a la diana 2 fusionada a Fc. La heterodimerización está garantizada por mutaciones en el Fc.

La Figura 51 es un Duetilab, que es un constructo heterodimérico que contiene dos Fab diferentes que se unen a los antígenos 1 y 2, y Fc estabilizado por mutaciones de heterodimerización. Fab 1 y 2 contienen puentes S-S diferenciales que garantizan un emparejamiento correcto de la cadena ligera (LC) y la cadena pesada (HC). La Figura 52 es un CrossmAb, que es un constructo heterodimérico con dos Fab diferentes que se unen a las dianas 1 y 2 fusionados a Fc estabilizados por heterodimerización. Los dominios CL y CH1 y los dominios VH y VL se intercambian, por ejemplo, CH1 se fusiona en línea con VL, mientras que CL se fusiona en línea con VH. La Figura 53 es una Fit-Ig, que es un constructo homodimérico donde la unión de Fab al antígeno 2 se fusiona al extremo N-terminal de HC de Fab que se une al antígeno 1. El constructo contiene Fc de tipo silvestre.

Descripción detallada

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. La invención proporciona proteínas de unión multiespecíficas que se unen a HER2 en una célula cancerosa y al receptor de n Kg2d y al receptor de CD16 en células asesinas naturales para activar la célula asesina natural, composiciones farmacéuticas que comprenden tales proteínas de unión multiespecíficas, y tales proteínas de unión multiespecíficas y composiciones farmacéuticas, para su uso en terapia que incluye para su uso en un método de tratamiento del cáncer. La invención proporciona una proteína de unión multiespecífica que comprende:

Varios aspectos de la invención se exponen más abajo en secciones; sin embargo, los aspectos de la invención descritos en una sección particular no se limitan a ninguna sección particular.

Para facilitar la comprensión de la presente invención, a continuación se definen una serie de términos y frases. Los términos “un” y “uno” como se usa en la presente significan “uno o más” e incluyen el plural a menos que el contexto sea inapropiado. Como se usa en la presente, el término "sitio de unión al antígeno" se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión al antígeno. En los anticuerpos humanos, el sitio de unión al antígeno está formado por residuos de aminoácidos de las regiones variables ("V") en el extremo N-terminal de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres estiramientos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera se denominan "regiones hipervariables" que se interponen entre estiramientos flanqueantes más conservados conocidos como "regiones marco", o "FR". Por lo tanto, el término "FR" se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran naturalmente entre y adyacentes a regiones hipervariables en inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo humano, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada se disponen entre sí en un espacio tridimensional para formar una superficie de unión al antígeno. La superficie de unión al antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se denominan "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". En ciertos animales, tales como camellos y peces cartilaginosos, el sitio de unión al antígeno está formado por una única cadena de anticuerpos que proporciona un “anticuerpo de dominio único”. Los sitios de unión al antígeno pueden existir en un anticuerpo intacto, en un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que retiene la superficie de unión al antígeno, o en un polipéptido recombinante tal como un scFv, mediante el uso de un enlazador peptídico para conectar el dominio variable de la cadena pesada al dominio variable de la cadena ligera en un solo polipéptido.

La expresión “antígeno asociado al tumor” como se usa en la presente descripción significa cualquier antígeno que incluye, pero no se limita a, una proteína, glucoproteína, gangliósido, carbohidrato, lípido que se asocia con el cáncer. Tal antígeno puede expresarse en células malignas o en el microentorno tumoral tal como en vasos sanguíneos asociados al tumor, matriz extracelular, estroma mesenquimatoso o infiltrados inmunitarios.

Como se usa en la presente, los términos “sujeto” y “paciente” se refieren a un organismo a tratar por los métodos y composiciones descritos en la presente descripción. Tales organismos incluyen preferentemente, pero no se limitan a, mamíferos (por ejemplo, murinos, simios, equinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos, y similares), y con mayor preferencia incluyen seres humanos.

Como se usa en la presente descripción, la expresión “cantidad efectiva” se refiere a la cantidad de un compuesto (por ejemplo, un compuesto de la presente invención) suficiente para efectuar resultados beneficiosos o convenientes. Una cantidad efectiva puede administrarse en una o más administraciones, aplicaciones o dosificaciones y no pretende limitarse a una formulación o vía de administración particular. Como se usa en la presente descripción, el término “tratar” incluye cualquier efecto, por ejemplo, disminuir, reducir, modular, mejorar o eliminar, que da como resultado la mejora de la afección, enfermedad, trastorno, y similares, o mejorar un síntoma de este.

Como se usa en la presente, la expresión “composición farmacéutica” se refiere a la combinación de un agente activo con un portador, inerte o activo, lo que hace que la composición sea especialmente adecuada para el uso diagnóstico o terapéutico in vivo o ex vivo.

Como se usa en la presente, la expresión “portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar, tal como una solución salina amortiguada con fosfato, agua, emulsiones (por ejemplo, tal como emulsiones de aceite/agua o agua/aceite), y varios tipos de agentes humectantes. Las composiciones también pueden incluir estabilizadores y conservantes. Para ejemplos de portadores, estabilizadores y adyuvantes, ver, por ejemplo, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975].

Como se usa en la presente, la expresión “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a cualquier sal farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, ácido o base) de un compuesto de la presente invención que, tras la administración a un sujeto, es capaz de proporcionar un compuesto de esta invención o un metabolito activo o residuo de este. Como conocen los expertos en la técnica, las “sales” de los compuestos de la presente invención pueden derivarse de ácidos y bases inorgánicos u orgánicos. Los ácidos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maleico, fosfórico, glicólico, láctico, salicílico, succínico, tolueno-p-sulfónico, tartárico, acético, cítrico, metanosulfónico, etanosulfónico, fórmico, benzoico, malónico, naftaleno-2-sulfónico, bencenosulfónico, y similares. 0tros ácidos, tales como oxálicos, aunque no en sí mismos farmacéuticamente aceptables, pueden emplearse en la preparación de sales útiles como productos intermedios para obtener los compuestos de la invención y sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables.

Las bases ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, hidróxidos de metal alcalino (por ejemplo, sodio), hidróxidos de metal alcalino tierra (por ejemplo, magnesio), amoníaco y compuestos de fórmula NW4+, en donde W es alquilo C1-4, y similares.

Las sales ilustrativas incluyen, pero no se limitan a: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, alcanforato, alcanforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, flucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato, undecanoato, y similares. Otros ejemplos de sales incluyen aniones de los compuestos de la presente invención compuestos con un catión adecuado tal como Na+, NH4+ y NW4+ (en donde W es un grupo alquilo C1-4), y similares.

Para uso terapéutico, se contempla que las sales de los compuestos de la presente invención son farmacéuticamente aceptables. Sin embargo, las sales de ácidos y bases que son no farmacéuticamente aceptables también pueden encontrar uso, por ejemplo, en la preparación o purificación de un compuesto farmacéuticamente aceptable.

A lo largo de la descripción, donde las composiciones se describen como que tienen, incluyen o comprenden componentes específicos, o donde los procesos y métodos se describen como que tienen, incluyen o comprenden etapas específicas, se contempla que, adicionalmente, hay composiciones de la presente invención que consisten esencialmente en, o consisten en, los componentes mencionados, y que hay procesos y métodos de acuerdo con la presente invención que consisten esencialmente en, o consisten en, las etapas de procesamiento mencionadas. Como materia general, las composiciones que especifican un porcentaje son en peso a menos que se especifique de cualquier otra manera. Además, si una variable no va acompañada de una definición, entonces la definición anterior de los controles de variable.

I. Proteínas

La invención proporciona proteínas de unión multiespecíficas que se unen a HER2 en una célula cancerosa y al receptor de NKG2D y al receptor de CD16 en células asesinas naturales para activar la célula asesina natural. Las proteínas de unión multiespecíficas son útiles en las composiciones farmacéuticas y los métodos terapéuticos descritos en la presente descripción. La unión de la proteína de unión multiespecífica al receptor de NKG2D y al receptor de CD16 en las células asesinas naturales potencia la actividad de las células asesinas naturales hacia la destrucción de una célula cancerosa. La unión de la proteína de unión multiespecífica a HER2 en una célula cancerosa acerca a la célula cancerosa a la célula asesina natural, lo que facilita la destrucción directa e indirecta de la célula cancerosa por la célula asesina natural. A continuación se proporciona una descripción adicional de proteínas de unión multiespecíficas ilustrativas.

El primer componente de las proteínas de unión multiespecíficas se une a las células que expresan el receptor de NKG2D, que pueden incluir, pero sin limitarse a, células NK, células T y§ y células T CD8+ ap. Tras la unión a NKG2D, las proteínas de unión multiespecíficas pueden bloquear ligandos naturales, tales como LTLBP6 y MICA, de la unión a NKG2D y activar los receptores de NKG2D.

El segundo componente de las proteínas de unión multiespecíficas se une a células que expresan HER2, que pueden incluir, pero no se limitan a, cáncer de mama, ovario, esofágico, vejiga y gástrico, carcinoma del conducto salival, adenocarcinoma de pulmón y formas agresivas de cáncer uterino, tal como carcinoma de endometrio seroso.

El tercer componente de las proteínas de unión multiespecíficas se une a células que expresan CD16, un receptor Fc en la superficie de los leucocitos que incluye células asesinas naturales, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, mastocitos y células dendríticas foliculares.

Las proteínas de unión multiespecíficas descritas en la presente descripción pueden tomar varios formatos. Por ejemplo, descrito pero no reivindicado, un formato es un anticuerpo heterodimérico multiespecífico que incluye una primera cadena pesada de inmunoglobulina, una primera cadena ligera de inmunoglobulina, una segunda cadena pesada de inmunoglobulina y una segunda cadena ligera de inmunoglobulina (Figura 1). La primera cadena pesada de inmunoglobulina incluye un primer dominio Fc (bisagra-CH2-CH3), un primer dominio variable de la cadena pesada y opcionalmente un primer dominio de la cadena pesada CH1. La primera cadena ligera de inmunoglobulina incluye un primer dominio variable de la cadena ligera y un primer dominio constante de la cadena ligera. La primera cadena ligera de inmunoglobulina, junto con la primera cadena pesada de inmunoglobulina, forma un sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D. La segunda cadena pesada de inmunoglobulina comprende un segundo dominio Fc (bisagra-CH2-CH3), un segundo dominio variable de la cadena pesada y opcionalmente un segundo dominio de la cadena pesada CH1. La segunda cadena ligera de inmunoglobulina incluye un segundo dominio variable de la cadena ligera y un segundo dominio constante de la cadena ligera. La segunda cadena ligera de inmunoglobulina, junto con la segunda cadena pesada de inmunoglobulina, forma un sitio de unión al antígeno que se une a HER2. El primer dominio Fc y el segundo dominio Fc juntos son capaces de unirse a CD16 (Figura 1). Descrito pero no reivindicado, la primera cadena ligera de inmunoglobulina puede ser idéntica a la segunda cadena ligera de inmunoglobulina.

Un formato ilustrativo de la presente invención implica un anticuerpo heterodimérico multiespecífico que incluye una primera cadena pesada de inmunoglobulina, una segunda cadena pesada de inmunoglobulina y una cadena ligera de inmunoglobulina (Figura 2). La primera cadena pesada de inmunoglobulina incluye un primer dominio Fc (bisagra-CH2-CH3) fusionado a través de un enlazador o una bisagra de anticuerpo a un fragmento variable de cadena única (scFv) compuesto por un dominio variable pesado y un dominio variable de la cadena ligera que emparejan y se unen a NKG2D o HER2. La segunda cadena pesada de inmunoglobulina incluye un segundo dominio Fc (bisagra-CH2-CH3), un segundo dominio variable de la cadena pesada y opcionalmente un dominio de la cadena pesada CH1. La cadena ligera de inmunoglobulina incluye un dominio variable de la cadena ligera y un dominio de cadena ligera constante. La segunda cadena pesada de inmunoglobulina se empareja con la cadena ligera de inmunoglobulina y se une a NKG2D o HER2. El primer dominio Fc y el segundo dominio Fc juntos son capaces de unirse a CD16 (Figura 2).

Uno o más motivos de unión adicionales pueden fusionarse con el extremo C-terminal del dominio CH3 de la región constante, opcionalmente mediante una secuencia enlazadora. El sitio de unión al antígeno podría ser una región variable de cadena única o estabilizada por disulfuro (scFv) o podría formar una molécula tetravalente o trivalente.

La proteína de unión multiespecífica puede estar en forma de Triomab, que es un anticuerpo trifuncional biespecífico que mantiene una forma similar a IgG. Esta quimera consiste en dos medios anticuerpos, cada uno con una cadena ligera y una cadena pesada, que se originan a partir de dos anticuerpos parentales.

La proteína de unión multiespecífica puede ser la forma de cadena ligera (LC) común de KiH, que implica la tecnología de botones en ojales (KIH). La KIH implica modificar genéticamente los dominios C^h3 para crear un “botón” o un “ojal” en cada cadena pesada para promover la heterodimerización. El concepto detrás de la tecnología Fc “botones en ojales (KiH)” fue introducir un “botón” en un dominio CH3 (CH3A) mediante la sustitución de un pequeño residuo por uno voluminoso (por ejemplo, T366W^ch3aen la numeración de la UE). Para acomodar el “botón”, se creó una superficie de “ojal” complementaria en el otro dominio CH3 (CH3B) reemplazando los residuos adyacentes más cercanos al botón por otros más pequeños (por ejemplo, T366S/L368AY407_ch3b). La mutación de “ojal” se optimizó mediante el tamizaje de bibliotecas de fagos guiadas estructuradas (Atwell S, Ridgway JB, Wells ^jA, Carter P., Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library, J. Mol. Biol. (1997) 270(1):26-35). Las estructuras cristalinas de rayos X de las variantes de Fc de KiH (Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess C, y otros, Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction. J. Mol. Biol. (2014) 426(9):1947-57; Mimoto F, Kadono S, Katada H, Igawa T, Kamikawa T, Hattori K. Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcgammaRs. Mol. Immunol. (2014) 58(1):132-8) demostró que la heterodimerización está favorecida termodinámicamente por interacciones hidrófobas impulsadas por complementariedad estérica en la interfaz central del dominio inter-CH3, mientras que las interfaces botón-botón y ojal-ojal no favorecen la homodimerización debido al impedimento estérico y la interrupción de las interacciones favorables, respectivamente.

En algunos formatos descritos pero no reivindicados, la proteína de unión multiespecífica está en forma de inmunoglobulina de dominio variable doble (DVD-Ig™), que combina los dominios de unión a diana de dos anticuerpos monoclonales a través de enlazadores flexibles de origen natural y produce una molécula tetravalente similar a IgG.

En algunos formatos descritos pero no reivindicados, la proteína de unión multiespecífica está en forma de interfaz de Fab ortogonal (0rto-Fab). En el enfoque de IgG orto-Fab (Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HL, y otros, Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat. Biotechnol. (2014) 32(2):191—8), el diseño regional basado en estructuras introduce mutaciones complementarias en la interfaz de LC y HC^vh-ch1 en un solo Fab, sin que se realice ningún cambio en el otro Fab.

En algunos formatos descritos pero no reivindicados, la proteína de unión multiespecífica está en el formato de Ig 2 en 1. En algunas modalidades, la proteína de unión multiespecífica tiene la forma ES, que es un constructo heterodimérico que contiene dos Fab diferentes que se unen a la diana 1 y la diana 2 fusionados al Fc. La heterodimerización está garantizada por mutaciones de dirección electrostática en el Fc. En algunas modalidades, la proteína de unión multiespecífica tiene la forma KÁ-Cuerpo, que es un constructo heterodimérico con dos Fab diferentes fusionados a Fc estabilizados por mutaciones de heterodimerización: El antígeno 1 de direccionamiento a Fab1 contiene LC kappa, mientras que el segundo antígeno 2 de direccionamiento a Fab contiene LC lambda. La Figura 49A es una representación ilustrativa de una forma de un KÁ-Cuerpo; la Figura 49B es una representación ilustrativa de otro KÁ-Cuerpo.

En algunos formatos descritos pero no reivindicados, la proteína de unión multiespecífica está en forma de intercambio del brazo Fab (anticuerpos que intercambian brazos Fab al intercambiar una cadena pesada y una cadena ligera unida (media molécula) por un par de cadenas pesadas-ligeras de otra molécula, lo que da como resultado anticuerpos biespecíficos). En algunas modalidades, la proteína de unión multiespecífica está en la forma del cuerpo de SEED. La plataforma de dominio modificado genéticamente de intercambio de hebras (SEED) se diseñó para generar moléculas similares a anticuerpos asimétricas y biespecíficas, una capacidad que expande las aplicaciones terapéuticas de los anticuerpos naturales. Esta plataforma de proteínas modificadas genéticamente se basa en el intercambio de secuencias estructuralmente relacionadas de inmunoglobulina dentro de los dominios CH3 conservados. El diseño SEED permite la generación eficiente de heterodímeros de AG/GA, al tiempo que desfavorece la homodimerización de los dominios CH3 de SEED AG y GA (Muda M. y otros, Protein Eng. Des. Sel. (2011, 24(5):447-54)). En algunas modalidades, la proteína de unión multiespecífica tiene la forma de LuZ-Y, en la que se usa una cremallera de leucina para inducir la heterodimerización de dos HC diferentes. (Wranik, BJ. y otros, J. Biol. Chem. (2012), 287:43331-9).

En algunos formatos descritos pero no reivindicados, la proteína de unión multiespecífica está en la forma de Cov-X-Cuerpo. En los Cov-X-Cuerpo biespecíficos, dos péptidos diferentes se unen mediante el uso de un enlazador de azetidinona ramificado y se fusionan con el anticuerpo del andamio en condiciones leves de una manera específica de sitio. Mientras que las farmacóforos son responsables de las actividades funcionales, el andamio de anticuerpos imparte una larga semivida y una distribución similar a Ig. Los farmacóforos pueden optimizarse químicamente o sustituirse por otros farmacóforos para generar anticuerpos biespecíficos optimizados o únicos. (Doppalapudi VR y otros, PNAS (2010), 107(52);22611-22616).

En algunas modalidades, la proteína de unión multiespecífica tiene una forma heterodimérica de 0asc-Fab que incluye la unión de Fab a la diana 1 y la unión de scFab a la diana 2 fusionada a Fc. La heterodimerización está garantizada por mutaciones en el Fc.

En algunos formatos descritos pero no reivindicados, la proteína de unión multiespecífica tiene una forma de DueMilab, que es un constructo heterodimérico que contiene dos Fab diferentes que se unen a los antígenos 1 y 2, y Fc estabilizado por mutaciones de heterodimerización. Fab 1 y 2 contienen puentes S-S diferenciales que garantizan el emparejamiento correcto de LC y HC.

En algunos formatos descritos pero no reivindicados, la proteína de unión multiespecífica tiene una forma de CrossmAb, que es un constructo heterodimérico con dos Fab diferentes que se unen a las dianas 1 y 2, fusionados a Fc estabilizados por heterodimerización. Los dominios CL y CH1 y los dominios VH y VL se intercambian, por ejemplo, CH1 se fusiona en línea con VL, mientras que CL se fusiona en línea con VH.

En algunos formatos descritos pero no reivindicados, la proteína de unión multiespecífica tiene una forma de Fit-Ig, que es un constructo homodimérico donde la unión de Fab al antígeno 2 se fusiona al extremo N-terminal de HC de Fab que se une al antígeno 1. El constructo contiene Fc de tipo silvestre.

Los formatos adicionales de las proteínas de unión multiespecíficas pueden idearse mediante la combinación de varios formatos de fragmentos de unión a NKG2D y HER2 descritos en la presente descripción.

La Tabla 1 enumera secuencias peptídicas de dominios variables de la cadena pesada y dominios variables de la cadena ligera que, en combinación, pueden unirse a NKG2D.

Alternativamente, un dominio variable de la cadena pesada definido por la SEQ ID NO:45 puede emparejarse con un dominio variable de la cadena ligera definido por la SEQ ID NO:46 para formar un sitio de unión al antígeno que puede unirse a NKG2D, como se ilustra en el documento US 9,273,136.

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGY1HWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGS NKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYW GQGTTVTVSS (SEQ ID NO:45)

QSALTQPASVSGSPGQSITlSCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLrYYDDLLPSG VSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:46)

Alternativamente, un dominio variable de la cadena pesada definido por la SEQ ID NO:47 puede emparejarse con un dominio variable de la cadena ligera definido por la SEQ ID No:48 para formar un sitio de unión al antígeno que puede unirse a NKG2D, como se ilustra en el documento US 7,879,985.

QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGHISYSGSAN

YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIWGQGTMVTVS

S (SEQ ID N 0 47)

E1VLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATG1

PDRFSGSGSGTDFTLT1SRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVE1K (SEQ ID

N 0 48)

La Tabla 2 enumera secuencias peptídicas de dominios variables de la cadena pesada y dominios variables de la cadena ligera que, en combinación, pueden unirse a HER2.

Alternativamente, los nuevos sitios de unión a antígeno que pueden unirse a HER2 pueden identificarse mediante el tamizaje para la unión a la secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID N0:61.

MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQV

v q g n l e l t y l p t n a s l s f l q d iq e v q g y v l ia h n q v r q v p l q r l r iv r g t q l f e d n y

ALAVLDNGDPLNINTTPVTGASPGGLRELQLRSLTE1LKGGVL1QRNPQLCYQDTILW

KDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCAR

CKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMP

NPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCA

RVCYGLGMEFILREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQL

q v f e t l e e it g y l y is a w p d s l p d l s v f q n l o v ir g r il h n g a y s l t l o g l g is w l g l r

SLRELGSGLAL1HHNTHLCFVHI VPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACH

QLCARGF1CWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQ

PQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKTOLSYMPIWKFPDEEGACQ

PCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRROQKIR

K YTMRRLLQETEL VEPLTPSG AM PNQ AQMRILKETELRK VK VLGSG AFGT VYKGIWI

PDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVT

QLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVL

VKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKVVVLVLESILRRRFTHOSDV'WSYG

VTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRP

RFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYL

VPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPSEGA

GSDVFDGDLGMGAAKGLOS1.PTHDPSPI.ORYSEDP I VP1.PSE FDGY V APL ICSPQPE

YVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPGKNGWKDVFAFGGAVENPE

YLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLY YWDQDPPERGAPPSTFKGTP FAENPEYLGLD

VPV (SEQ ID N 0 61)

Dentro del dominio Fc, la unión a CD16 está mediada por la región bisagra y el dominio CH2. Por ejemplo, dentro de la IgG1 humana, la interacción con CD16 se centra principalmente en los residuos de aminoácidos Asp 265 - Glu 269, Asn 297 - Thr 299, Ala 327 - Ile 332, Leu 234 - Ser 239, y el residuo de carbohidrato N-acetil-D-glucosamina en el dominio CH₂(ver, Sondermann y otros, Nature, 406 (6793):267-273). En base a los dominios conocidos, las mutaciones pueden seleccionarse para potenciar o reducir la afinidad de unión a CD16, tal como mediante el uso de bibliotecas mostradas por fagos o bibliotecas de ADNc mostradas por la superficie de levadura, o pueden diseñarse en base a la estructura tridimensional conocida de la interacción.

El ensamblaje de cadenas pesadas de anticuerpos heterodiméricos puede lograrse expresando dos secuencias diferentes de las cadenas pesadas de anticuerpos en la misma célula, lo que puede conducir al ensamblaje de homodímeros de cada cadena pesada de anticuerpo así como también al ensamblaje de heterodímeros. Por ejemplo, pueden producirse mutaciones en el dominio CH3 en base a IgG1 humana e incorporar pares distintos de sustituciones de aminoácidos dentro de un primer polipéptido y un segundo polipéptido que permiten que estas dos cadenas se heterodimericen selectivamente entre sí. Las posiciones de sustituciones de aminoácidos ilustradas a continuación están numeradas de acuerdo con el índice EU como en Kabat.

En una situación, una sustitución de aminoácidos en el primer polipéptido reemplaza el aminoácido original con un aminoácido más grande, seleccionado de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) o triptófano (W), y al menos una sustitución de aminoácido en el segundo polipéptido reemplaza el(los) aminoácido(s) original(es) con un(os) aminoácido(s) más pequeño(s), elegido(s) de alanina (A), serina (S), treonina (T), o valina (V), de manera que la sustitución de aminoácidos más grande (una protuberancia) se ajusta en la superficie de las sustituciones de aminoácidos más pequeñas (una cavidad). Por ejemplo, un polipéptido puede incorporar una sustitución T366W, y el otro puede incorporar tres sustituciones que incluyen T366S, L368A y Y407.

Un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo de la invención puede acoplarse opcionalmente a una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a una región constante de anticuerpo, tal como una región constante de IgG que incluye dominios bisagra, CH2 y CH3 con o sin dominio CH1. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de la región constante es al menos 90 % idéntica a una región constante de anticuerpo humano, tal como una región constante de IgG1 humana, una región constante de IgG2, una región constante de IgG3 o una región constante de IgG4. En algunas otras modalidades, la secuencia de aminoácidos de la región constante es al menos 90 % idéntica a una región constante de anticuerpo de otro mamífero, tal como conejo, perro, gato, ratón o caballo. Se pueden incorporar una o más mutaciones en la región constante en comparación con la región constante de IgG1 humana, por ejemplo en Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 y/o K439. Las sustituciones ilustrativas incluyen, por ejemplo, Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, T350V, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, T394W, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I, Y407, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D y K439E.

En ciertas modalidades, las mutaciones que pueden incorporarse al CH1 de una región constante de IgG1 humana pueden estar en los aminoácidos V125, F126, P127, T135, T139, A140, F170, P171 y/o V173. En ciertas modalidades, las mutaciones que pueden incorporarse al Ck de una región constante de IgG1 humana pueden estar en los aminoácidos E123, F116, S176, V163, S174 y/o T164.

Las sustituciones de aminoácidos pueden seleccionarse de los siguientes conjuntos de sustituciones que se muestran en la Tabla 3.

Alternativamente, las sustituciones de aminoácidos pueden seleccionarse de los siguientes conjuntos de sustituciones que se muestran en la Tabla 4.

Alternativamente, las sustituciones de aminoácidos pueden seleccionarse del siguiente conjunto de sustituciones mostradas en la Tabla 5.

Alternativamente, al menos una sustitución de aminoácidos en cada cadena polipeptídica podría seleccionarse de la Tabla 6.

Alternativamente, al menos una sustitución de aminoácidos puede seleccionarse del siguiente conjunto de sustituciones en la Tabla 7, donde la(s) posición(ciones) indicada(s) en la primera columna de polipéptidos se reemplaza(n) por cualquier aminoácido cargado negativamente conocido, y la(s) posición(ciones) indicada(s) en la segunda columna de polipéptidos se reemplaza(n) por cualquier aminoácido cargado positivamente conocido.

Alternativamente, al menos una sustitución de aminoácidos puede seleccionarse del siguiente conjunto en la Tabla 8, donde la(s) posición(ciones) indicada(s) en la primera columna de polipéptidos se reemplaza(n) por cualquier aminoácido conocido cargado positivamente, y la(s) posición(ciones) indicada(s) en la segunda columna de polipéptidos se reemplaza(n) por cualquier aminoácido conocido cargado negativamente.

Alternativamente, las sustituciones de aminoácidos pueden seleccionarse del siguiente conjunto en la Tabla 9.

Alternativamente, o además, la estabilidad estructural de una proteína heteromúltiple puede incrementarse mediante la introducción de S354C en cualquiera de la primera o segunda cadena polipeptídica, e Y349C en la cadena polipeptídica opuesta, que forma un puente disulfuro artificial dentro de la interfaz de los dos polipéptidos.

Las proteínas multiespecíficas descritas anteriormente pueden fabricarse mediante el uso de la tecnología de ADN recombinante bien conocida por un experto en la técnica. Por ejemplo, una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la primera cadena pesada de inmunoglobulina puede clonarse en un primer vector de expresión; una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda cadena pesada de inmunoglobulina puede clonarse en un segundo vector de expresión; una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de inmunoglobulina puede clonarse en un tercer vector de expresión; el primero, segundo y terceros vectores de expresión puede(n) transfectarse de manera estable juntos en células huésped para producir las proteínas multiméricas.

Para lograr el mayor rendimiento de la proteína multiespecífica, pueden explorarse diferentes relaciones del primer, segundo y tercer vector de expresión para determinar la relación óptima para la transfección en las células huésped. Después de la transfección, los clones únicos pueden aislarse para la generación de bancos celulares mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, tales como dilución limitada, ELISA, FACS, microscopía o Clonepix.

Los clones pueden cultivarse en condiciones adecuadas para el escalado del biorreactor y la expresión mantenida de la proteína multiespecífica. Las proteínas multiespecíficas pueden aislarse y purificarse mediante el uso de métodos conocidos en la técnica que incluyen centrifugación, filtración en profundidad, lisis celular, homogeneización, congelación-descongelación, purificación por afinidad, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de intercambio por interacciones hidrófobas y cromatografía de modo mixto.

II. Características de las proteínas multiespecíficas

En ciertas modalidades, las proteínas de unión multiespecíficas descritas en la presente descripción, que incluyen un dominio de unión a NKG2D y un dominio de unión a HER2, se unen a células que expresan NKG2D humano. En ciertas modalidades, las proteínas de unión multiespecíficas que incluyen un dominio de unión a NKG2D y un dominio de unión a HER2, se unen a HER2 a un nivel comparable al de un anticuerpo monoclonal que tiene el mismo dominio de unión a HER2. Por ejemplo, las proteínas de unión multiespecíficas que incluyen un dominio de unión a NKG2D y un dominio de unión a ^hER2 de Trastuzumab pueden unirse a HER2 expresado en células a un nivel comparable al de Trastuzumab.

Sin embargo, las proteínas de unión multiespecíficas descritas en la presente descripción son más eficaces para reducir el crecimiento tumoral y destruir células cancerosas. Por ejemplo, una proteína de unión multiespecífica de la presente descripción que se dirige a células tumorales/cancerosas que expresan HER2 es más eficaz que SC2.2, una molécula biespecífica de cadena única construida a partir de un scFv derivado de trastuzumab unido a LTLBP-6, un ligando para NKG2D. SC2.2 se une a las células cancerosas HER2+ y a las células NK NKG2D+ simultáneamente. Por lo tanto, se investigó la eficacia de SC2.2 en la reducción del número de células cancerosas HER2+. Los ensayos de activación y citotoxicidad in vitro demostraron que SC2.2 era efectivo para activar y destruir células NK. Sin embargo, SC2.2 no demostró eficacia en el modelo de tumor subcutáneo RMNS-HER2. La eficacia de SC2.2 también se probó in vivo mediante el uso de un modelo murino singénico con sobreexpresión de RMNS-HER2 (Figura 36). En este modelo de ratón, SC2.2 no demostró el control del crecimiento tumoral en comparación con el control de vehículo (Figura 37). Por lo tanto, aunque SC2.2 fue capaz de activar y destruir células NK y se une a células cancerosas HER2+, estas propiedades fueron insuficientes para controlar efectivamente el crecimiento tumoral HER2+.

En ciertas modalidades, las proteínas de unión multiespecíficas descritas en la presente descripción, que incluyen un dominio de unión a NKG2D y un dominio de unión para el antígeno asociado al tumor, activan las células NK humanas primarias al cultivar con células tumorales que expresan el antígeno. La activación de células NK está marcada por el incremento de la desgranulación de CDl07a y la producción de citocinas IFNy. Además, en comparación con un anticuerpo monoclonal que incluye el dominio de unión al antígeno asociado al tumor, las proteínas de unión multiespecíficas muestran una activación superior de las células NK humanas en presencia de células tumorales que expresan el antígeno. Por ejemplo, en comparación con el anticuerpo monoclonal trastuzumab, las proteínas de unión multiespecíficas de la presente descripción que tienen un dominio de unión a HER2, tienen una activación superior de células NK humanas en presencia de células cancerosas que expresan HER2.

En ciertas modalidades, las proteínas de unión multiespecíficas descritas en la presente descripción, que incluyen un dominio de unión a NKG2D y un dominio de unión para un antígeno asociado al tumor, potencian la actividad de las células NK humanas en reposo y activadas por IL-2 en presencia de células tumorales que expresan el antígeno. Las células NK en reposo mostraron menos producción de IFNy de fondo y desgranulación de CD107a que las células NK activadas por IL-2. En ciertas modalidades, las células NK en reposo muestran un mayor cambio en la producción de IFN^yy la desgranulación de CD107a en comparación con células NK activadas por IL-2. En ciertas modalidades, las células NK activadas por IL-2 muestran un mayor porcentaje de células que se convierten en IFNy+; CD107a+ después de la estimulación con TriNKET.

En ciertas modalidades, las proteínas de unión multiespecíficas descritas en la presente descripción, que incluyen un dominio de unión a NKG2D y un dominio de unión para un antígeno asociado al tumor (ejemplos no limitantes de antígenos asociados al tumor que incluyen CD20, BCM^ay HER2), potencian la actividad citotóxica de las células NK humanas en reposo y activadas por IL-2 en presencia de células tumorales que expresan el antígeno. Además, las proteínas de unión multiespecíficas (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica a A40, proteína de unión multiespecífica a A49, proteína de unión multiespecífica a C26, proteína de unión multiespecífica a F04, proteína de unión multiespecífica a F43, proteína de unión multiespecífica a F47, y proteína de unión multiespecífica a E79), que incluyen un dominio de unión para HER2, respuestas de células NK más potentemente directas, activadas y en reposo contra las células tumorales, en comparación con un anticuerpo monoclonal que incluye sitios de unión a HER2. En ciertas modalidades, las proteínas de unión multiespecíficas ofrecen una ventaja contra las células tumorales que expresan medio y bajo contenido de HER2, en comparación con los anticuerpos monoclonales que el sitio de unión a HER2. Por lo tanto, una terapia que incluya proteínas de unión multiespecíficas puede ser superior a una terapia con anticuerpos monoclonales.

En ciertas modalidades, en comparación con los anticuerpos monoclonales, las proteínas de unión multiespecíficas descritas en la presente descripción (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica a A40, proteína de unión multiespecífica a A49, proteína de unión multiespecífica a C26, proteína de unión multiespecífica a F04, proteína de unión multiespecífica a F43, proteína de unión multiespecífica a F47 y proteína de unión multiespecífica a E79), que incluyen un dominio de unión para HER2 son ventajosas en el tratamiento de cánceres con alta expresión de receptor Fc (FcR), o cánceres que residen en un microambiente tumoral con altos niveles de FcR. Los anticuerpos monoclonales ejercen sus efectos sobre el crecimiento tumoral a través de múltiples mecanismos, incluidos ADC^c, CDC, fagocitosis y bloqueo de señales, entre otros. Entre los FcyR, el CD16 tiene la afinidad más baja por el Fc de IgG; el FcyRI (CD64) es el FcR de alta afinidad, que se une aproximadamente 1000 veces más fuertemente al Fc de IgG que al CD16. El CD64 se expresa normalmente en muchos linajes hematopoyéticos tal como el linaje mieloide, y puede expresarse en tumores derivados de estos tipos celulares, tal como la leucemia mieloide aguda (AML). Las células inmunitarias que se infiltran en el tumor, tales como los MDSC y los monocitos, también expresan CD64 y se sabe que se infiltran en el microentorno tumoral. La expresión de CD64 por el tumor o en el microentorno tumoral puede tener un efecto perjudicial en la terapia con anticuerpos monoclonales. La expresión de CD64 en el microentorno tumoral dificulta que estos anticuerpos se acoplen a CD16 en la superficie de células NK, ya que los anticuerpos prefieren unirse al receptor de alta afinidad. Las proteínas de unión multiespecíficas, al dirigirse a dos receptores de activación en la superficie de las células NK, pueden superar el efecto perjudicial de la expresión de CD64 (ya sea en el tumor o en el microentorno tumoral) en la terapia con anticuerpos monoclonales.

Independientemente de la expresión de CD64 en las células tumorales, las proteínas de unión multiespecíficas son capaces de mediar las respuestas de las células NK humanas contra todas las células tumorales, porque el doble direccionamiento de dos receptores de activación en las células NK proporciona una unión específica más fuerte a las células NK.

En algunas modalidades, las proteínas de unión multiespecíficas descritas en la presente descripción (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica a A40, proteína de unión multiespecífica a A49, proteína de unión multiespecífica a C26, proteína de unión multiespecífica a F04, proteína de unión multiespecífica a F43, proteína de unión multiespecífica a F47, y proteína de unión multiespecífica a E79), que incluyen un dominio de unión para HER2 proporcionan un mejor perfil de seguridad a través de la reducción de los efectos secundarios fuera del tumor en la diana. Las células asesinas naturales y las células T CD8 son capaces de lisar directamente las células tumorales, aunque difieren los mecanismos a través de los cuales las células NK y las células T CD8 reconocen lo propio normal de las células tumorales. La actividad de las células NK está regulada por el equilibrio de señales de los receptores de activación (NCR, NKG2D, CD16, etc.) e inhibidores (KIR, NKG2A, etc.). El equilibrio de estas señales activadoras e inhibidoras permite a las células NK determinar las células propias sanas de las células propias estresadas, infectadas viralmente o transformadas. Este mecanismo “incorporado” de autotolerancia ayudará a proteger el tejido sano normal de las respuestas de las células NK. Para ampliar este principio, la autotolerancia de las células NK permitirá que las proteínas de unión multiespecíficas se dirijan a antígenos expresados tanto en lo propio como en el tumor sin efectos secundarios fuera del tumor, o con una ventana terapéutica incrementada. A diferencia de las células asesinas naturales, las células T requieren el reconocimiento de un péptido específico presentado por las moléculas de MHC para las funciones de activación y efectoras. Las células T han sido la diana principal de la inmunoterapia y se han desarrollado muchas estrategias para redirigir las respuestas de las células T contra el tumor. Los biespecíficos de las células T, los inhibidores de los puntos de control y las células CAR-T han sido aprobados por la FDA, pero a menudo sufren toxicidades limitantes de la dosis. Los biespecíficos de las células T y las células CAR-T trabajan alrededor del sistema de reconocimiento de TCR-MHC mediante el uso de dominios de unión para dirigirse a antígenos en la superficie de las células tumorales, y mediante el uso de dominios de señalización modificados genéticamente para transducir las señales de activación en la célula efectora. Aunque son efectivos para provocar una respuesta inmunitaria antitumoral, estos tratamientos frecuentemente van acompañados de síndrome de liberación de citocinas (CRS) y efectos secundarios fuera del tumor en la diana. Las proteínas de unión multiespecíficas son únicas en este contexto, ya que no “anulan” los sistemas naturales de activación e inhibición de las células NK. En su lugar, las proteínas de unión multiespecíficas están diseñadas para balancear y proporcionar señales de activación adicionales a las células NK, al tiempo que mantienen la tolerancia de las NK a lo propio sano.

En algunas modalidades, las proteínas de unión multiespecíficas descritas en la presente descripción que incluyen un dominio de unión a NKG2D (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica a A40, proteína de unión multiespecífica a A49, proteína de unión multiespecífica a C26, proteína de unión multiespecífica a F04, proteína de unión multiespecífica a F43, proteína de unión multiespecífica a F47, y proteína de unión multiespecífica a E79), que incluyen un dominio de unión para HER2 retrasan la progresión del tumor de forma más efectiva que los anticuerpos monoclonales que incluyen el mismo dominio de unión al antígeno tumoral. En algunas modalidades, las proteínas de unión multiespecíficas que incluyen un dominio de unión a NKG2D y un dominio de unión al antígeno tumoral son más efectivas contra las metástasis cancerosas que los anticuerpos monoclonales que incluyen el mismo dominio de unión al antígeno tumoral.

III. Aplicaciones terapéuticas

La invención proporciona una proteína de unión multiespecífica descrita en la presente descripción y/o una composición farmacéutica descrita en la presente descripción para su uso en un método para tratar el cáncer. Los métodos pueden usarse para tratar una variedad de cánceres que expresan HER2 mediante la administración a un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de unión multiespecífica descrita en la presente descripción.

El método terapéutico puede caracterizarse de acuerdo con el cáncer a tratar. Por ejemplo, en ciertas modalidades, el cáncer es cáncer de mama, ovario, esofágico, de vejiga o gástrico, carcinoma del conducto salival, carcinomas del conducto salival, adenocarcinoma de pulmón o formas agresivas de cáncer uterino, tal como carcinoma de endometrio seroso.

En ciertas otras modalidades, el cáncer es cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, leucemia, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer rectal, cáncer renal, cáncer de estómago, cáncer testicular o cáncer de útero. En otras modalidades más, el cáncer es un carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma de células pequeñas, melanoma, neuroblastoma, sarcoma (por ejemplo, un angiosarcoma o condrosarcoma), cáncer de laringe, cáncer de parótida, cáncer de las vías biliares, cáncer de tiroides, melanoma lentiginoso acral, queratosas actínicas, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adenoideo quístico, adenomas, adenosarcoma, carcinoma adenoescamoso, cáncer del canal anal, cáncer anal, cáncer de anorrecto, tumor astrocítico, carcinoma de las glándulas de bartolina, carcinoma basocelular, cáncer biliar, cáncer de huesos, cáncer de médula ósea, cáncer bronquial, carcinoma de las glándulas bronquiales, carcinoides, colangiocarcinoma, condrosarcoma, papiloma/carcinoma del plexo coriodeo, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, carcinoma de células claras, cáncer del tejido conjuntivo, cistadenoma, cáncer del sistema digestivo, cáncer de duodeno, cáncer del sistema endocrino, tumor del seno endodérmico, hiperplasia endometrial, sarcoma estromal endometrial, adenocarcinoma de endometrio, cáncer de células endoteliales, cáncer ependimario, cáncer de células epiteliales, sarcoma de Ewing, cáncer de ojos y órbita, cáncer genital femenino, hiperplasia nodular focal, cáncer de vesícula biliar, cáncer de antro gástrico, cáncer del fondo gástrico, gastrinoma, glioblastoma, glucagonoma, cáncer de corazón, hemangiblastomas, hemangioendotelioma, hemangiomas, adenoma hepático, adenomatosis hepática, cáncer hepatobiliar, carcinoma hepatocelular, enfermedad de Hodgkin, cáncer de íleon, insulinoma, neoplasia intraepitelial, neoplasia de células escamosas interepiteliales, cáncer de los conductos biliares intrahepáticos, carcinoma de células escamosas invasivo, cáncer de yeyuno, cáncer de articulaciones, sarcoma de Kaposi, cáncer pélvico, carcinoma de células grandes, cáncer de intestino grueso, leiomiosarcoma, melanomas léntigo maligno, linfoma, cáncer genital masculino, melanoma maligno, tumores mesoteliales malignos, meduloblastoma, meduloepitelioma, cáncer meníngeo, cáncer mesotelial, carcinoma metastásico, cáncer de boca, carcinoma mucoepidermoide, mieloma múltiple, cáncer muscular, cáncer de las vías nasales, cáncer del sistema nervioso, adenocarcinoma neuroepitelial, melanoma nodular, cáncer de piel no epitelial, linfoma no hodgkiniano, carcinoma de células en avena, cáncer oligodendroglial, cáncer de la cavidad oral, osteosarcoma, adenocarcinoma papilar seroso, cáncer de pene, cáncer de faringe, tumores hipofisarios, plasmocitoma, pseudosarcoma, blastoma pulmonar, cáncer rectal, carcinoma de células renales, cáncer del sistema respiratorio, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma, carcinoma seroso, cáncer de senos paranasales, cáncer de piel, carcinoma de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, cáncer de músculo liso, cáncer de tejidos blandos, tumor secretor de somatostatina, cáncer de columna vertebral, carcinoma de células escamosas, cáncer muscular estriado, cáncer submesotelial, melanoma de extensión superficial, leucemia de células T, cáncer de lengua, carcinoma indiferenciado, cáncer de uréter, cáncer de uretra, cáncer de vejiga urinaria, cáncer del sistema urinario, cáncer de cuello uterino, cáncer de cuerpo uterino, melanoma uveal, cáncer vaginal, carcinoma verrugoso, VIPoma, cáncer de vulva, carcinoma bien diferenciado o tumor de Wilms.

En ciertas modalidades adicionales, el cáncer es linfoma no hodgkiniano, tal como un linfoma de células B o un linfoma de células T. En ciertas modalidades, el linfoma no hodgkiniano es un linfoma de células B, tal como un linfoma de células B grandes difusas, linfoma de células B mediastínicas primarias, linfoma folicular, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de células del manto, linfoma de células B de la zona marginal, linfoma extraganglionar de células B de la zona marginal, linfoma ganglionar de células B de la zona marginal, linfoma esplénico de células B de la zona marginal, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmacítico, leucemia de células pilosas o linfoma primario del sistema nervioso central (SNC). En otras modalidades, el linfoma no hodgkiniano es un linfoma de células T, tal como un linfoma linfoblástico T precursor, linfoma de células T periféricas, linfoma cutáneo de células T, linfoma angioinmunoblástico de células T, linfoma extraganglionar de células T/asesinas naturales, linfoma de células T tipo enteropatía, linfoma subcutáneo de células T similares a panniculitis, linfoma anaplásico de células grandes o linfoma periférico de células T.

El cáncer a tratar puede caracterizarse de acuerdo con la presencia de un antígeno particular expresado en la superficie de la célula cancerosa. En ciertas modalidades, la célula cancerosa puede expresar uno o más de los siguientes además de HER2: CD2, CD19, CD20, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 y PD1.

IV. Terapia combinada

Las proteínas de unión multiespecíficas descritas en la presente descripción pueden usarse en combinación con agentes terapéuticos adicionales para tratar el cáncer.

Los agentes terapéuticos ilustrativos que pueden usarse como parte de una terapia combinada en el tratamiento del cáncer, incluyen, por ejemplo, radiación, mitomicina, tretinona, ribomustina, gemcitabina, vincristina, etopósido, cladribina, mitobronitol, metotrexato, doxorrubicina, carbocona, pentostatina, nitracrina, zinostatina, cetrorelix, letrozol, raltitrexed, daunorrubicina, fadrozol, fotemustina, timalfasina, sobuzoxano, nedaplatino, citarabina, bicalutamida, vinorelbina, vesnarinona, aminoglutetimida, amsacrina, proglumida, acetato de eliptinio, ketanserina, doxifluridina, etretinato, isotretinona, estreptozocina, nimustina, vindesina, flutamida, drogenil, butocina, carmofur, razoxano, sizofilan, carboplatino, mitolactol, tegafur, ifosfamida, prednimustina, picibanil, levamisol, tenipósido, improsulfán, enocitabina, lisurida, oximetolona, tamoxifeno, progesterona, mepitiostano, epitiostanol, formestano, interferón alfa, interferón 2 alfa, interferón beta, interferón gamma, factor estimulante de colonias 1, factor estimulante de colonias 2, denileucina diftitox, interleucina 2, factor liberador de hormona luteinizante y variaciones de los agentes mencionados anteriormente que pueden exhibir unión diferencial a su receptor afín, e incremento o disminución de la semivida en suero.

Una clase adicional de agentes que pueden usarse como parte de una terapia combinada en el tratamiento del cáncer son los inhibidores de puntos de control inmunitarios. Los inhibidores de puntos de control inmunitarios ilustrativos incluyen agentes que inhiben uno o más de (i) antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos 4 (CTLA4), (ii) proteína de muerte celular programada 1 (PD1), (iii) PDL1, (iv) LAG3, (v) B7-H3, (vi) B7-H4 y (vii) TIM3. El inhibidor de CTLA4 ha sido aprobado por la Administración de alimentos y fármacos de los Estados Unidos para el tratamiento del melanoma.

Sin embargo, otros agentes que pueden usarse como parte de una terapia combinada en el tratamiento del cáncer son los agentes de anticuerpos monoclonales que se dirigen a dianas que no son puntos de control (por ejemplo, herceptina) y agentes no citotóxicos (por ejemplo, inhibidores de tirosina cinasa).

Sin embargo, otras categorías de agentes antineoplásicos incluyen: por ejemplo: (i) un inhibidor seleccionado de un inhibidor de ALK, un inhibidor de ATR, un antagonista de A2A, un inhibidor de reparación de la escisión base, un inhibidor de tirosina cinasa Bcr-Abl, un inhibidor de tirosina cinasa de Bruton, un inhibidor CDC7, un inhibidor de CHK1, un inhibidor de cinasa dependiente de ciclina, un inhibidor de ADN-PK, un inhibidor de ADN-PK y mTOR, un inhibidor de DNMT1, un inhibidor de DNMT1 más 2-cloro-desoxiadenosina, un inhibidor de HDAC, un inhibidor de la vía de señalización Hedgehog, un inhibidor de IDO, un inhibidor de JAK, un inhibidor de mTOR, un inhibidor de MEK, un inhibidor de MELK, un inhibidor de MTH1, un inhibidor de PARP, un inhibidor de la fosfoinositida 3-cinasa, un inhibidor de PARP1 y DHODH, un inhibidor del proteasoma, un inhibidor de la topoisomerasa II, un inhibidor de la tirosina cinasa, un inhibidor de VEGFR, y un inhibidor de WEE1; (ii) un agonista de OX40, CD137, CD40, GITR, CD27, HVEM, TNFRSF25 o ICOS; y (iii) una citocina seleccionada de IL-12, IL-15, GM-CSF y G-CSF.

Las proteínas de la invención también pueden usarse como un adyuvante a la eliminación quirúrgica de la lesión primaria.

La cantidad de proteína de unión multiespecífica y agente terapéutico adicional y el momento relativo de administración pueden seleccionarse para lograr un efecto terapéutico combinado deseado. Por ejemplo, cuando se administra una terapia combinada a un paciente que necesita tal administración, los agentes terapéuticos en la combinación, o una composición o composiciones farmacéuticas que comprenden los agentes terapéuticos, pueden administrarse en cualquier orden tal como, por ejemplo, secuencialmente, simultáneamente, juntos, simultáneamente y similares. Además, por ejemplo, una proteína de unión multiespecífica puede administrarse durante un tiempo en que el(los) agente(s) terapéutico(s) adicional(es) ejercen su efecto profiláctico o terapéutico, o viceversa.

V. Composiciones farmacéuticas

La presente descripción también presenta composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína descrita en la presente descripción. La composición puede formularse para su uso en una variedad de sistemas de suministro de fármacos. Uno o más excipientes o portadores fisiológicamente aceptables también pueden incluirse en la composición para una formulación adecuada. Las formulaciones adecuadas para usar en la presente descripción se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Filadelfia, Pa., 17va ed., 1985. Para una breve revisión de los métodos de suministro de fármacos, ver, por ejemplo, Langer (Science 249:1527-1533, 1990).

La formulación intravenosa de suministro de fármacos de la presente descripción puede estar contenida en una bolsa, una pluma o una jeringa. En ciertas modalidades, la bolsa puede conectarse a un canal que comprende un tubo y/o una aguja. En ciertas modalidades, la formulación puede ser una formulación liofilizada o una formulación líquida. En ciertas modalidades, la formulación puede secarse por congelación (liofilizarse) y estar contenida en aproximadamente 12-60 viales. En ciertas modalidades, la formulación puede secarse por congelación y 45 mg de la formulación secada por congelación pueden estar contenidos en un vial. En ciertas modalidades, aproximadamente 40 mg - aproximadamente 100 mg de la formulación secada por congelación pueden estar contenidos en un vial. En ciertas modalidades, la formulación secada por congelación de 12, 27 o 45 viales se combinan para obtener una dosis terapéutica de la proteína en la formulación intravenosa del fármaco. En ciertas modalidades, la formulación puede ser una formulación líquida y almacenarse como aproximadamente 250 mg/vial a aproximadamente 1000 mg/vial. En ciertas modalidades, la formulación puede ser una formulación líquida y almacenarse como aproximadamente 600 mg/vial. En ciertas modalidades, la formulación puede ser una formulación líquida y almacenarse como aproximadamente 250 mg/vial.

Esta presente descripción podría existir en una formulación farmacéutica acuosa líquida que incluye una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína en una solución amortiguada que forma una formulación.

Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales o pueden filtrarse de forma estéril. Las soluciones acuosas resultantes pueden empaquetarse para su uso tal cual, o liofilizarse, la preparación liofilizada se combina con un portador acuoso estéril antes de la administración. El pH de las preparaciones típicamente estará entre 3 y 11, con mayor preferencia entre 5 y 9 o entre 6 y 8, y con la máxima preferencia entre 7 y 8, tal como 7 a 7,5. Las composiciones resultantes en forma sólida pueden empaquetarse en múltiples unidades de dosis única, cada una de las cuales contiene una cantidad fija del agente o agentes mencionados anteriormente. La composición en forma sólida también puede empaquetarse en un recipiente para una cantidad flexible.

En ciertas modalidades, la presente descripción proporciona una formulación con una vida útil prolongada que incluye la proteína de la presente descripción, en combinación con manitol, ácido cítrico monohidratado, citrato de sodio, fosfato disódico dihidratado, dihidrógeno fosfato de sodio dihidratado, cloruro de sodio, polisorbato 80, agua e hidróxido de sodio.

En ciertas modalidades, se prepara una formulación acuosa que incluye la proteína de la presente descripción en una solución amortiguada con pH. El amortiguador puede tener un pH que varía de aproximadamente 4 a aproximadamente 8, por ejemplo, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,0, o de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,5, o puede tener un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,2. Los intervalos intermedios a los pH mencionados anteriormente también pretenden formar parte de esta descripción. Por ejemplo, se pretenden incluir intervalos de valores mediante el uso de una combinación de cualquiera de los valores mencionados anteriormente como límites superior y/o inferior. Los ejemplos de amortiguadores que controlarán el pH dentro de este intervalo incluyen acetato (por ejemplo, acetato de sodio), succinato (tal como succinato de sodio), gluconato, histidina, citrato y otros amortiguadores de ácidos orgánicos.

En ciertas modalidades, la formulación incluye un sistema amortiguador que contiene citrato y fosfato para mantener el pH en un intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 8. En ciertas modalidades, el intervalo de pH puede ser de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,0, o de aproximadamente pH 4,8 a aproximadamente 5,5, o en un intervalo de pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,2. En ciertas modalidades, el sistema amortiguador incluye ácido cítrico monohidratado, citrato de sodio, fosfato de disodio dihidratado y/o dihidrógeno fosfato de sodio dihidratado. En ciertas modalidades, el sistema amortiguador incluye aproximadamente 1,3 mg/ml de ácido cítrico (por ejemplo, 1,305 mg/ml), aproximadamente 0,3 mg/ml de citrato de sodio (por ejemplo, 0,305 mg/ml), aproximadamente 1,5 mg/ml de fosfato de disodio dihidratado (por ejemplo, 1,53 mg/ml), aproximadamente 0,9 mg/ml de dihidrógeno fosfato de sodio dihidratado (por ejemplo, 0,86) y aproximadamente 6,2 mg/ml de cloruro de sodio (por ejemplo, 6,165 mg/ml). En ciertas modalidades, el sistema amortiguador incluye 1-1,5 mg/ml de ácido cítrico, 0,25 a 0,5 mg/ml de citrato de sodio, 1,25 a 1,75 mg/ml de fosfato de disodio dihidratado, 0,7 a 1,1 mg/ml de dihidrógeno fosfato de sodio dihidratado y 6,0 a 6,4 mg/ml de cloruro de sodio. En ciertas modalidades, el pH de la formulación se ajusta con hidróxido de sodio.

Un poliol, que actúa como un tonificador y puede estabilizar el anticuerpo, también puede incluirse en la formulación. El poliol se añade a la formulación en una cantidad que puede variar con respecto a la isotonicidad deseada de la formulación. En ciertas modalidades, la formulación acuosa puede ser isotónica. La cantidad de poliol añadida también puede alterarse con respecto al peso molecular del poliol. Por ejemplo, puede añadirse una cantidad menor de un monosacárido (por ejemplo, manitol), en comparación con un disacárido (tal como trehalosa). En ciertas modalidades, el poliol que puede usarse en la formulación como un agente de tonicidad es manitol. En ciertas modalidades, la concentración de manitol puede ser de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mg/ml. En ciertas modalidades, la concentración de manitol puede ser de aproximadamente 7,5 a 15 mg/ml. En ciertas modalidades, la concentración de manitol puede ser de aproximadamente 10-14 mg/ml. En ciertas modalidades, la concentración de manitol puede ser de aproximadamente 12 mg/ml. En ciertas modalidades, el poliol sorbitol puede incluirse en la formulación.

También puede añadirse un detergente o surfactante a la formulación. Los detergentes ilustrativos incluyen detergentes no iónicos tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbatos 20, 80 etc.) o poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188). La cantidad de detergente añadida es de manera que reduce la agregación del anticuerpo formulado y/o minimiza la formación de partículas en la formulación y/o reduce la adsorción. En ciertas modalidades, la formulación puede incluir un surfactante que es un polisorbato. En ciertas modalidades, la formulación puede contener el detergente polisorbato 80 o Tween 80. Tween 80 es un término usado para describir el monooleato de polioxietileno sorbitán (20) (ver Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4ta edi., 1996). En ciertas modalidades, la formulación puede contener entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml de polisorbato 80, o entre aproximadamente 0,5 mg/ml y aproximadamente 5 mg/ml. En ciertas modalidades, puede añadirse aproximadamente 0,1 % de polisorbato 80 en la formulación.

En modalidades, el producto proteico de la presente descripción se formula como una formulación líquida. La formulación líquida puede presentarse a una concentración de 10 mg/ml en un vial USP / Ph Eur tipo I 50R cerrado con un tapón de goma y sellado con un cierre de sello de reborde de aluminio. El tapón puede estar hecho de elastómero que cumpla con la USP y la Ph. Eur. En ciertas modalidades, los viales pueden llenarse con 61,2 ml de la solución del producto proteico para permitir un volumen extraíble de 60 ml. En ciertas modalidades, la formulación líquida puede diluirse con solución salina al 0,9 %.

En ciertas modalidades, la formulación líquida de la descripción puede prepararse como una solución de concentración de 10 mg/ml en combinación con un azúcar a niveles de estabilización. En ciertas modalidades, la formulación líquida puede prepararse en un portador acuoso. En ciertas modalidades, puede añadirse un estabilizador en una cantidad no mayor que la que puede dar como resultado una viscosidad indeseable o no adecuada para la administración intravenosa. En ciertas modalidades, el azúcar puede ser disacáridos, por ejemplo, sacarosa. En ciertas modalidades, la formulación líquida también puede incluir uno o más de un agente amortiguador, un surfactante y un conservante.

En ciertas modalidades, el pH de la formulación líquida puede establecerse mediante la adición de un ácido y/o base farmacéuticamente aceptables. En ciertas modalidades, el ácido farmacéuticamente aceptable puede ser ácido clorhídrico. En ciertas modalidades, la base puede ser hidróxido de sodio.

Además de la agregación, la desamidación es una variante común de péptidos y proteínas que puede ocurrir durante la fermentación, la recolección/clarificación celular, la purificación, el almacenamiento de sustancias farmacológicas/productos farmacológicos y durante el análisis de muestras. La desamidación es la pérdida de NH3 de una proteína que forma un intermediario de succinimida que puede sufrir hidrólisis. La succinimida intermedia da como resultado una disminución de la masa de 17 dalton del péptido original. La hidrólisis posterior da como resultado un incremento de la masa de 18 dalton. El aislamiento del intermediario de succinimida es difícil debido a la inestabilidad en condiciones acuosas. Como tal, la desamidación es típicamente detectable como 1 incremento de la masa en dalton. La desamidación de una asparagina da como resultado ácido aspártico o isoaspártico. Los parámetros que afectan la tasa de desamidación incluyen pH, temperatura, constante dieléctrica del solvente, resistencia iónica, secuencia primaria, conformación del polipéptido local y estructura terciaria. Los residuos de aminoácidos adyacentes a Asn en la cadena peptídica afectan las tasas de desamidación. Gly y Ser después de una Asn en secuencias de proteínas da como resultado una mayor susceptibilidad a la desamidación.

En ciertas modalidades, la formulación líquida de la presente descripción puede conservarse en condiciones de pH y humedad para evitar la desaminación del producto proteico.

El portador acuoso de interés en la presente descripción es uno que es farmacéuticamente aceptable (seguro y no tóxico para su administración a un ser humano) y es útil para la preparación de una formulación líquida. Los portadores ilustrativos incluyen agua estéril para inyección (SWFI), agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución amortiguada con pH (por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato), solución salina estéril, solución de Ringer o solución de dextrosa.

Un conservante puede añadirse opcionalmente a las formulaciones de la presente descripción para reducir la acción bacteriana. La adición de un conservante puede, por ejemplo, facilitar la producción de una formulación de múltiples usos (dosis múltiples).

Las formulaciones intravenosas (IV) pueden ser la vía de administración preferida en casos particulares, tal como cuando un paciente está en el hospital después del trasplante recibiendo todos los fármacos por vía IV. En ciertas modalidades, la formulación líquida se diluye con solución de cloruro de sodio al 0,9 % antes de la administración. En ciertas modalidades, el producto farmacéutico diluido para inyección es isotónico y adecuado para la administración mediante infusión intravenosa.

En ciertas modalidades, pueden añadirse componentes de sal o amortiguador en una cantidad de 10 mM - 200 mM. Las sales y/o amortiguadores son farmacéuticamente aceptables y se derivan de varios ácidos conocidos (inorgánicos y orgánicos) con metales o aminas “formadores de bases”. En ciertas modalidades, el amortiguador puede ser amortiguador fosfato. En ciertas modalidades, el amortiguador puede ser amortiguadores de glicinato, carbonato, citrato, en cuyo caso, los iones de sodio, potasio o amonio pueden servir como contraión.

Esta presente descripción podría existir en una formulación liofilizada que incluye las proteínas y un lioprotector. El lioprotector puede ser azúcar, por ejemplo, disacáridos. En ciertas modalidades, el lioprotector puede ser sacarosa o maltosa. La formulación liofilizada también puede incluir uno o más de un agente amortiguador, un surfactante, un agente voluminizador y/o un conservante.

La cantidad de sacarosa o maltosa útil para la estabilización del producto farmacéutico liofilizado puede estar en una relación en peso de al menos 1:2 de proteína con respecto a sacarosa o maltosa. En ciertas modalidades, la relación en peso de proteína con respecto a sacarosa o maltosa puede ser de 1:2 a 1:5.

En ciertas modalidades, el pH de la formulación, antes de la liofilización, puede establecerse mediante la adición de un ácido y/o base farmacéuticamente aceptables. En ciertas modalidades el ácido farmacéuticamente aceptable puede ser ácido clorhídrico. En ciertas modalidades, la base farmacéuticamente aceptable puede ser hidróxido de sodio.

Antes de la liofilización, el pH de la solución que contiene la proteína de la presente descripción puede ajustarse de 6 a 8. En ciertas modalidades, el intervalo de pH para el producto farmacéutico liofilizado puede ser de 7 a 8.

En ciertas modalidades, puede añadirse un “agente voluminizador”. Un “agente voluminizador” es un compuesto que añade masa a una mezcla liofilizada y contribuye a la estructura física de la torta liofilizada (por ejemplo, facilita la producción de una torta liofilizada esencialmente uniforme que mantiene una estructura de poro abierto). Los agentes voluminizadores ilustrativos incluyen manitol, glicina, polietilenglicol y sorbitol. Las formulaciones liofilizadas pueden contener tales agentes voluminizadores.

En ciertas modalidades, el producto farmacéutico liofilizado puede estar constituido por un portador acuoso. El portador acuoso de interés en la presente descripción es uno que es farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, seguro y no tóxico para su administración a un ser humano) y es útil para la preparación de una formulación líquida, después de la liofilización. Los diluyentes ilustrativos incluyen agua estéril para inyección (SWFI), agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución amortiguadora de pH (por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato), solución salina estéril, solución de Ringer o solución de dextrosa.

En ciertas modalidades, el producto farmacéutico liofilizado de la presente descripción se reconstituye con agua estéril para inyección, USP (SWFI) o inyección de cloruro de sodio al 0,9 %, USP. Durante la reconstitución, el polvo liofilizado se disuelve en una solución.

En ciertas modalidades, el producto proteico liofilizado de la descripción instantánea se constituye a aproximadamente 4,5 ml de agua para inyección y se diluye con solución salina al 0,9 % (solución de cloruro de sodio).

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden variarse para obtener una cantidad del ingrediente activo que es efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular, sin ser tóxico para el paciente.

La dosis específica puede ser una dosis uniforme para cada paciente, por ejemplo, 50-5000 mg de proteína. Alternativamente, la dosis de un paciente se puede adaptar al peso corporal aproximado o al área superficial del paciente. Otros factores para determinar la dosificación adecuada pueden incluir la enfermedad o afección que se va a tratar o prevenir, la gravedad de la enfermedad, la vía de administración y la edad, el sexo y la afección médica del paciente. Los expertos en la técnica realizan rutinariamente un perfeccionamiento adicional de los cálculos necesarios para determinar la dosificación apropiada para el tratamiento, especialmente a la luz de la información de dosificación y los ensayos descritos en la presente descripción. La dosis también puede determinarse mediante el uso de ensayos conocidos para determinar las dosificaciones usadas junto con los datos de dosis-respuesta apropiados. La dosificación de un paciente individual puede ajustarse a medida que se monitoriza el progreso de la enfermedad. Los niveles sanguíneos del constructo o complejo diana en un paciente pueden medirse para ver si es necesario ajustar la dosis para alcanzar o mantener una concentración efectiva. La farmacogenómica puede usarse para determinar qué constructos y/o complejos diana, y dosificaciones de estos, tienen más probabilidades de ser efectivos para una persona dada (Schmitz y otros, Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001; Steimer y otros, Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001).

En general, las dosificaciones basadas en el peso corporal son de aproximadamente 0,01 |jg a aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal, tal como aproximadamente 0,01 jg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,01 jg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,01 jg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,01 jg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,01 jg a aproximadamente 100 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,01 jg a aproximadamente 50 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,01 jg a aproximadamente 10 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,01 jg a aproximadamente 1 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,01 jg a aproximadamente 0,1 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,1 jg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,1 jg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,1 jg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,1 jg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,1 jg a aproximadamente 100 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,1 jg a aproximadamente 10 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,1 jg a aproximadamente 1 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 jg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 jg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 |jg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 jg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 jg a aproximadamente 100 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 jg a aproximadamente 50 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 jg a aproximadamente 10 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 jg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 jg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 jg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 jg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 jg a aproximadamente 100 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 jg a aproximadamente 50 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 jg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 jg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 jg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 jg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 jg a aproximadamente 100 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 jg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 jg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 jg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 jg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 mg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 mg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 mg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 mg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal.

Las dosis pueden administrarse una o más veces al día, semanalmente, mensualmente o anualmente, o incluso una vez cada 2 a 20 años. Los expertos en la técnica pueden estimar fácilmente las tasas de repetición para la dosificación en base a los tiempos de residencia medidos y las concentraciones del constructo o complejo diana en fluidos o tejidos corporales. La administración de la presente invención puede ser intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intratecal, intracavitaria, por perfusión a través de un catéter o por inyección intralesional directa. Esto puede administrarse una o más veces al día, una o más veces a la semana, una o más veces al mes y una o más veces al año.

La descripción anterior describe múltiples aspectos y modalidades de la invención. La solicitud de patente contempla específicamente todas las combinaciones y permutaciones de los aspectos y modalidades.

Ejemplos

La invención que se describe ahora generalmente, se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen simplemente con fines de ilustración de ciertos aspectos y modalidades de la presente invención, y no pretende limitar la invención.

Ejemplo 1 - Los dominios de unión a NKG2D se unen a NKG2D

Los dominios de unión a NKG2D se unen a NKG2D recombinante purificado

Las secuencias de ácidos nucleicos de los ectodominios NKG2D humanos, de ratón o de macaco cangrejero se fusionaron con secuencias de ácidos nucleicos que codifican los dominios Fc de IgG1 humana y se introdujeron en células de mamíferos para expresarse. Después de la purificación, las proteínas de fusión NKG2D-Fc se adsorbieron en pocillos de microplacas. Después de bloquear los pocillos con albúmina sérica bovina para evitar la unión no específica, los dominios de unión a NKG2D se ajustaron y se añadieron a los pocillos preadsorbidos con proteínas de fusión NKG2D-Fc. La unión de anticuerpos primarios se detectó mediante el uso de un anticuerpo secundario que se conjugó a peroxidasa de rábano picante y reconoce específicamente una cadena ligera kappa humana para evitar la reactividad cruzada de Fc. Se añadió 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), un sustrato para la peroxidasa de rábano picante, a los pocillos para visualizar la señal de unión, cuya absorbancia se midió a 450 nM y se corrigió a 540 nM. Se añadió a cada pocillo un clon de dominio de unión a NKG2D, un control de isotipo o un control positivo (seleccionado de las SEQ ID NO:45-48, o los clones anti-NKG2D de ratón MI-6 y CX-5 disponibles en eBioscience).

El control de isotipo mostró una unión mínima a proteínas NKG2D-Fc recombinantes, mientras que el control positivo se unió más fuerte a los antígenos recombinantes. Los dominios de unión a NKG2D producidos por todos los clones demostraron unirse a las proteínas NKG2D-Fc recombinantes humanas, de ratón y de macaco cangrejero, aunque con diversas afinidades de clon a clon. Generalmente, cada clon anti-NKG2D unido a NKG2D-Fc recombinante humano (Figura 3) y de macaco cangrejero (Figura 4) con afinidad similar, pero con afinidad menor a NKG2D-Fc recombinante de ratón (Figura 5).

Los dominios de unión a NKG2D se unen a células que expresan NKG2D

Las líneas celulares de linfoma de ratón EL4 se modificaron genéticamente para expresar receptores de antígeno quimérico en el dominio de señalización NKG2D - CD3 zeta humanos o de ratón. Se usó un clon de unión a NKG2D, un control de isotipo o un control positivo a una concentración de 100 nM para teñir NKG2D extracelular expresado en las células EL4. La unión de anticuerpos se detectó mediante el uso de anticuerpos secundarios anti-IgG humana conjugados a fluoróforo. Las células se analizaron mediante citometría de flujo, y se calculó las veces sobre el fondo (F0B) mediante el uso de la intensidad de fluorescencia media (MFI) de las células que expresan NKG2D en comparación con las células EL4 parentales.

Dominios de unión a NKG2D producidos por todos los clones unidos a células EL4 que expresan NKG2D humano y de ratón. Los anticuerpos de control positivo (seleccionados de las SEQ ID NO:45-48, o los clones anti-NKG2D de ratón MI-6 y CX-5 disponibles en eBioscience) dieron la mejor señal de unión FOB. La afinidad de unión a NKG2D para cada clon fue similar entre las células que expresan NKG2D humano (Figura 6) y NKG2D de ratón (Figura 7). Ejemplo 2 - Los dominios de unión a NKG2D bloquean la unión del ligando natural a NKG2D

Competencia con LTLBP-6

Las proteínas NKG2D-Fc humanas recombinantes se adsorbieron en los pocillos de una microplaca, y los pocillos se bloquearon con albúmina sérica bovina para reducir la unión no específica. Se añadió una concentración de saturación de LTLBP-6-His-biotina a los pocillos, seguido de la adición de los clones del dominio de unión a NKG2D. Después de una incubación de 2 horas, se lavaron los pocillos y se detectó LTLBP-6-His-biotina que permaneció unida a los pocillos recubiertos con NKG2D-Fc mediante estreptavidina conjugada a peroxidasa de rábano picante y sustrato TMB. La absorbancia se midió a 450 nM y se corrigió a 540 nM. Después de restar el fondo, se calculó la unión específica de los dominios de unión a NKG2D a las proteínas NKG2D-Fc a partir del porcentaje de LTLBP-6-His-biotina que se bloqueó de la unión a las proteínas NKG2D-Fc en los pocillos. El anticuerpo de control positivo (seleccionado de las SEQ ID NO:45-48) y varios dominios de unión a NKG2D bloquearon la unión de LTLBP-6 a NKG2D, mientras que el control de isotipo mostró poca competencia con LTLBP-6 (Figura 8).

Competencia con MICA

Las proteínas MICA-Fc humanas recombinantes se adsorbieron en los pocillos de una microplaca, y los pocillos se bloquearon con albúmina sérica bovina para reducir la unión no específica. Se añadió NKG2D-Fc-biotina a los pocillos seguido de dominios de unión a NKG2D. Después de la incubación y el lavado, se detectó NKG2D-Fcbiotina que permaneció unida a pocillos recubiertos con MICA-Fc mediante el uso de estreptavidina-HRP y sustrato TMB. La absorbancia se midió a 450 nM y se corrigió a 540 nM. Después de restar el fondo, se calculó la unión específica de los dominios de unión a NKG2D a las proteínas NKG2D-Fc a partir del porcentaje de NKG2D-Fcbiotina que se bloqueó de la unión a los pocillos recubiertos con MICA-Fc. El anticuerpo de control positivo (seleccionado de las SEQ ID NO:45-48) y varios dominios de unión a NKG2D bloquearon la unión de MICA a NKG2D, mientras que el control de isotipo mostró poca competencia con MICA (Figura 9).

Competencia con Rae-1 delta

Se adsorbió Rae-1delta-Fc recombinante de ratón (adquirido de R&D Systems) en los pocillos de una microplaca, y los pocillos se bloquearon con albúmina sérica bovina para reducir la unión no específica. Se añadió NKG2D-Fcbiotina de ratón a los pocillos seguido de los dominios de unión a NKG2D. Después de la incubación y el lavado, se detectó NKG2D-Fc-biotina que permaneció unida a pocillos recubiertos con Rae-1delta-Fc mediante el uso de estreptavidina-HRP y sustrato t Mb . La absorbancia se midió a 450 nM y se corrigió a 540 nM. Después de restar el fondo, se calculó la unión específica de los dominios de unión a NKG2D a las proteínas NKG2D-Fc a partir del porcentaje de NKG2D-Fc-biotina que se bloqueó de la unión a los pocillos recubiertos con Rae-1delta-Fc. El control positivo (seleccionado de la SEQ ID NO:45-48, o los clones anti-NKG2D de ratón MI-6 y CX-5 disponibles en eBioscience) y varios clones del dominio de unión a NKG2D bloquearon la unión de Rae-ldelta a NKG2^dde ratón, mientras que el anticuerpo de control de isotipo mostró poca competencia con Rae-ldelta (Figura 10).

Ejemplo 3 - Los clones del dominio de unión a NKG2D activan NKG2D

Las secuencias de ácidos nucleicos de NKG2D humano y de ratón se fusionaron con secuencias de ácidos nucleicos que codifican un dominio de señalización CD3 zeta para obtener constructos del receptor de antígeno quimérico (CAR). Los constructos de NKG2D-CAR se clonaron a continuación en un vector de retrovirus mediante el uso del conjunto Gibson y se transfectaron en células expi293 para la producción de retrovirus. Las células EL4 se infectaron con virus que contenían NKG2D-CAR junto con 8 μg/ml de polibreno. 24 horas después de la infección, los niveles de expresión de NKG2D-CAR en las células EL4 se analizaron mediante citometría de flujo, y se seleccionaron clones que expresaban niveles altos de NKG2D-CAR en la superficie celular.

Para determinar si los dominios de unión a NKG2D activan NKG2D, se adsorbieron en los pocillos de una microplaca y las células NKG2D-CAR EL4 se cultivaron en los pocillos recubiertos con fragmentos de anticuerpo durante 4 horas en presencia de brefeldin-A y monesina. La producción intracelular de TNFα, un indicador de activación de NKG2D, se analizó mediante citometría de flujo. El porcentaje de células positivas para TNFα se normalizó con respecto a las células tratadas con el control positivo. Todos los dominios de unión a NKG2D activaron tanto NKG2D humano (Figura 11) como NKG2D de ratón (Figura 12).

Ejemplo 4 - Los dominios de unión a NKG2D activan las células NK

Células NK humanas primarias

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de capas leucocitarias de sangre periférica humana mediante el uso de centrifugación por gradiente de densidad. Las células NK (CD3- CD56+) se aislaron mediante el uso de selección negativa con perlas magnéticas de PBMC, y la pureza de las células NK aisladas fue típicamente >95 %. A continuación se cultivaron células NK aisladas en medios que contenían 100 ng/ml de IL-2 durante 24-48 horas antes de transferirse a los pocillos de una microplaca en la que se adsorbieron los dominios de unión a NKG2D, y se cultivaron en los medios que contenían anticuerpo anti-CD107a conjugado con fluoróforo, brefeldin-A y monesina. Después del cultivo, las células NK se analizaron mediante citometría de flujo mediante el uso de anticuerpos contra CD3, CD56 e IFN-y conjugados con fluoróforo. La tinción de CD107a e IFN-y se analizó en células CD3- CD56+ para evaluar la activación de células NK. El incremento de las células CDl07a/IFN-Y doble positivas es indicativo de una mejor activación de células NK mediante el acoplamiento de dos receptores de activación en lugar de un receptor. Los dominios de unión a NKG2D y el control positivo (seleccionados de las SEQ ID N0:45-48) mostraron un mayor porcentaje de células NK que se convirtieron en CD107a+ e IFN-Y+ que el control de isotipo (la Figura 13 y la Figura 14 representan datos de dos experimentos independientes, cada uno con el uso de una PBMC de donante diferente para la preparación de células NK).

Células NK de ratón primarias

Se obtuvieron bazos de ratones C57Bl/6 y se trituraron a través de un colador de células de 70 μm para obtener una suspensión de células individuales. Las células se sedimentaron y resuspendieron en amortiguador de lisis ACK (adquirido de Thermo Fisher Scientific #A1049201; cloruro de amonio 155 mM, bicarbonato de potasio 10 mM, EDTA 0,01 mM) para eliminar los eritrocitos. Las células restantes se cultivaron con 100 ng/ml de hlL-2 durante 72 horas antes de cosecharse y prepararse para el aislamiento de células NK. Las células NK (CD3'NK1.1+) se aislaron de las células del bazo mediante el uso de una técnica de agotamiento negativo con perlas magnéticas típicamente con >90 % de pureza. Las células NK purificadas se cultivaron en medios que contenían 100 ng/ml de mIL-15 durante 48 horas antes de transferirse a los pocillos de una microplaca a la que se adsorbieron los dominios de unión a NKG2D, y se cultivaron en los medios que contenían anticuerpo anti-CD107a conjugado con fluoróforo, brefeldin-A y monesina. Tras el cultivo en pocillos recubiertos con el dominio de unión a NKG2D, las células NK se analizaron mediante citometría de flujo mediante el uso de anticuerpos contra CD3, NK1.1 e IFN-y conjugados con fluoróforo. La tinción de CD107a e IFN-^yse analizó en células CD3' NK1.1+ para evaluar la activación de células NK. El incremento de las células CD107a/IFN-Y doble positivas es indicativo de una mejor activación de células NK mediante el acoplamiento de dos receptores de activación en lugar de un receptor. Los dominios de unión a NKG2D y el control positivo (seleccionados de los clones de anti-NKG2D de ratón MI-6 y CX-5 disponibles en eBioscience) mostraron un mayor porcentaje de células NK que se convirtieron en CD107a+ e IFN-Y+ que el control de isotipo (la Figura 15 y la Figura 16 representan datos de dos experimentos independientes, cada uno mediante el uso de un ratón diferente para la preparación de células NK).

Ejemplo 5 - Los dominios de unión a NKG2D permiten la citotoxicidad de las células tumorales diana

Los ensayos de activación de células NK primarias humanas y de ratón demuestran un incremento de los marcadores de citotoxicidad en las células NK después de la incubación con dominios de unión a NKG2D. Para abordar si esto se traduce en un aumento de la lisis de las células tumorales, se utilizó un ensayo basado en células en el que cada dominio de unión a NKG2D se desarrolló en un anticuerpo monoespecífico. La región Fc se usó como un brazo de direccionamiento, mientras que la región Fab (dominio de unión a NKG2D) actuó como otro brazo de direccionamiento para activar las células NK. Las células THP-1, que son de origen humano y expresan altos niveles de receptores Fc, se usaron como una diana tumoral y se usó un kit de citotoxicidad de Perkin Elmer DELFIA. Las células THP-1 se marcaron con reactivo BATDA y se resuspendieron a 105/ml en medios de cultivo. A continuación, las células THP-1 marcadas se combinaron con anticuerpos contra NKG2D y células NK de ratón aisladas en pocillos de una placa de microtitulación a 37 oC durante 3 horas. Después de la incubación, se retiraron 20 μl del sobrenadante del cultivo, se mezclaron con 200 μl de solución de Europio y se incubaron con agitación durante 15 minutos en la oscuridad. La fluorescencia se midió a lo largo del tiempo mediante un lector de placas PheraStar equipado con un módulo de fluorescencia resuelto en el tiempo (excitación 337 nm, emisión 620 nm) y la lisis específica se calculó de acuerdo con las instrucciones del kit.

El control positivo, LTLBP-6, un ligando natural para NKG2D, mostró un incremento de la lisis específica de las células diana THP-1 por las células NK de ratón. Los anticuerpos contra NKG2D también incrementaron la lisis específica de las células diana de THP-1, mientras que el anticuerpo de control de isotipo mostró una lisis específica reducida. La línea punteada indica la lisis específica de las células THP-1 por las células NK de ratón sin añadir anticuerpos (Figura 17).

Ejemplo 6 - Los anticuerpos contra NKG2D muestran una alta termoestabilidad

Las temperaturas de fusión de los dominios de unión a NKG2D se analizaron mediante el uso de fluorimetría de barrido diferencial. Las temperaturas de fusión aparente extrapoladas son altas en relación con los anticuerpos IgG1 típicos (Figura 18).

Ejemplo 7 - Las proteínas de unión multiespecíficas muestran una capacidad potenciada para activar las células NK

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de capas leucocitarias de sangre periférica humana mediante el uso de centrifugación por gradiente de densidad. Las células NK (CD3- CD56+) se aislaron mediante el uso de selección negativa con perlas magnéticas de PBMC, y la pureza de las células NK aisladas fue típicamente >95 %. Las células NK aisladas se cultivaron en medios que contenían 100 ng/ml de IL-2 durante 24-48 horas antes de transferirse a los pocillos de una microplaca en la que se adsorbieron proteínas de unión multiespecíficas y biespecíficas respectivamente, y se cultivaron en los medios que contenían anticuerpo anti-CD107a conjugado con fluoróforo, brefeldin-A y monensina. Después del cultivo, las células NK se analizaron mediante citometría de flujo mediante el uso de anticuerpos contra ^cD3, CD56 e IFN-^yconjugados con fluoróforo. La tinción de CD107a e IFN-^yse analizó en células CD3- CD56+ para evaluar la activación de células NK. El incremento de las células doble positivas CD107a/IFN-Y es indicativo de una mejor activación de células NK. AL2.2 es una proteína de unión multiespecífica que contiene el dominio de unión a HER2 (trastuzumab), el dominio de unión a NKG2D (LTLBP-6) y un dominio Fc de IgG1 humana. Se realizó a través de una reacción de intercambio de brazo-Fab controlada (cFAE) a partir del homodímero de trastuzumab y el homodímero de LTLBP-6-Fc (ver Labrijn y otros, Nature Protocols 9, 2450-2463). SC2.2 es una proteína de cadena única que incluye un scFv derivado de trastuzumab y LTLBP-6 (SEQ ID NO:93).

SEQ ID NO:93

MAAAAIPALLLCLPLLFLLFGWSRARRDDPHSLCYDITV1PKFRPGPRVVCAVQGQVD

EKTFLHYDCGNKTVTPVSPLGKKLNVTMAWKAQNPVLREWDILTEQLLDIQLENY

TPKEPLTLQARMSCEQKAEGHSSGSWQFSIDGQTFLLFDSEKRMWTTVHPGARKMK

EKWENDKDVAMSFHYISMGDCIGWLEDFLMGMDSTLEPSAGAPLAMSSGTTQLRA

TATTLILCCLLIILPCFILPG1

El análisis de la tinción de CD107a e IFN-^yindicó que la IgG de control de isotipo no mostró activación de las células NK, mientras que un mayor porcentaje de células NK se convirtió en CD107a+ e IFN-Y+ después de la estimulación con una proteína de unión multiespecífica en comparación con una proteína biespecífica, lo que demuestra una activación de células NK más fuerte mediante la unión de dos receptores de activación (NKG2D y CD16) en lugar de solo uno (NKG2D) (Figura 19). Se espera que este incremento de la activación de células NK se traduzca en una destrucción de células tumorales más potente.

Ejemplo 8 - Las proteínas de unión multiespecíficas muestran una citotoxicidad potenciada hacia las células tumorales diana

Ensayo de citotoxicidad de células NK humanas primarias

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de capas leucocitarias de sangre periférica humana mediante el uso de centrifugación por gradiente de densidad. Las células NK (CD3- CD56+) se aislaron mediante el uso de selección negativa con perlas magnéticas de PBMC, y la pureza de las células NK aisladas fue típicamente >95 %. A continuación, las células NK se cultivaron durante toda la noche en medios que contenían 100 ng/ml de IL-2 antes de usarse en ensayos de citotoxicidad. Al día siguiente, las células NK se resuspendieron a 5x105/ml en medios de cultivo frescos. Las células de cáncer de mama humano SkBr-3 se marcaron con reactivo BATDA de acuerdo con el kit de citotoxicidad de Perkin Elmer DELFIA y se resuspendieron a 5x104/mL en medios de cultivo. Se realizaron varias diluciones de las proteínas de unión multiespecíficas en medios de cultivo. Las células NK, las células SkBr-3 marcadas y las proteínas de unión multiespecíficas se combinaron en pocillos de una placa de microtitulación y se incubaron a 37 oC durante 3 horas. Después de la incubación, se retiraron 20 μl del sobrenadante del cultivo, se mezclaron con 200 μl de solución de Europio y se incubaron con agitación durante 15 minutos en la oscuridad. La fluorescencia se midió a lo largo del tiempo mediante un lector de placas PheraStar equipado con un módulo de fluorescencia resuelto en el tiempo (excitación 337 nm, emisión 620 nm) y la lisis específica se calculó de acuerdo con las instrucciones del kit. AL0.2 es una proteína de unión multiespecífica que contiene el dominio de unión a HER2 (trastuzumab), el dominio de unión a NKG2D (seleccionado de la SEQ ID N0:1-44)) y un dominio Fc de IgG1 humana. Se elaboró a través de una reacción de intercambio de Fab-brazo controlada (cFAE) a partir del homodímero de trastuzumab y el homodímero de anti-NKG2D. AL0.2si se basa en AL0.2 y contiene una mutación D265A adicional en el dominio Fc que anula la unión a CD16. Trastuzumab-si se basa en trastuzumab y contiene una mutación D265A adicional en el dominio Fc que anula la unión a CD16. AL2.2 es una proteína de unión multiespecífica que contiene el dominio de unión a HER2 (trastuzumab), el dominio de unión a NKG2D (LTLBP-6) y un dominio Fc de IgG1 humana. SC2.2 es una proteína de cadena única que incluye un scFv derivado de trastuzumab y LTLBP-6.

AL0.2 mostró una lisis potenciada de las células diana SkBr-3 por células NK humanas que trastuzumab de una manera dependiente, con un valor de p de 0,0311 en EC50 (Figura 20). AL0.2si (Figura 21) y trastuzumab-si (Figura 22) mostraron reducción tanto en la potencia como en la lisis específica máxima de las células SkBr-3 en comparación con AL0.2, con un valor de p de 0,0002 y 0,0001 en EC50, respectivamente (Figuras 21-22). Además, AL0.2 mostró una lisis potenciada de las células SkBr-3 que AL2.2 de una manera dependiente de la dosis (Figura 23) . La IgG de control de isotipo no mostró ningún incremento en la lisis específica a ninguna de las concentraciones analizadas. Juntos, los datos han demostrado que las proteínas de unión multiespecíficas que se acoplan a 2 receptores de activación en las células NK y un antígeno tumoral, inducen una destrucción más potente de las células tumorales por las células NK humanas en comparación con las proteínas biespecíficas que activan un receptor en las células NK y un antígeno tumoral.

Ensayo de citotoxicidad de células NK de ratón primarias

Se obtuvieron bazos de ratones C57Bl/6 y se trituraron a través de un colador de células de 70 μm para obtener una suspensión de células individuales. Las células se sedimentaron y resuspendieron en amortiguador de lisis ACK (adquirido de Thermo Fisher Scientific #A1049201; cloruro de amonio 155 mM, bicarbonato de potasio 10 mM, EDTA 0,01 mM) para eliminar los eritrocitos. Las células restantes se cultivaron con 100 ng/ml de hlL-2 durante 72 horas antes de cosecharse y prepararse para el aislamiento de células NK. Las células NK (CD3'NK1.1+) se aislaron de las células del bazo mediante el uso de una técnica de agotamiento negativo con perlas magnéticas típicamente con >90 % de pureza. Las células NK purificadas se cultivaron en medios que contenían 100 ng/ml de mIL-15 durante 48 horas antes de resuspenderse en medios de cultivo a 106/ml para ensayos citotóxicos. Las células RMA-HER2-dTomato, una línea celular tumoral de ratón modificada genéticamente para expresar HER2 y dTomato, y su homólogo de control, células RMA que expresaban zsGreen se usaron como dianas. Se resuspendieron a 2x105/ml en medios de cultivo y se sembraron en pocillos de una microplaca en una relación 1:1. Las diluciones de proteínas multiespecíficas se realizaron en medios de cultivo y se añadieron a las células RMA junto con las células NK. Después de la incubación durante toda la noche a 37 oC con 5 % de CO2, el porcentaje de células RMA-HER2-dTomato y RMA-zsGreen se determinó mediante citometría de flujo mediante el uso del indicador fluorescente para identificar los dos tipos de células. Muerte celular diana específica = (1-((% de células RMA-Ca2T-dTomato en el grupo de tratamiento * % de células RMA-zsGreen en el grupo de control)/(% de células RMA-Ca2T-dTomato en el grupo de control * % de células RMA-zsGreen en el grupo de tratamiento))) * 100 %.

AL2.2 es más potente para redirigir las respuestas de las células NK a las dianas tumorales que SC2.2 (Figura 25) y Trastuzumab (Figura 24). La proteína de control mostró poco impacto en la muerte de la diana específica. Estos datos demuestran que las proteínas de unión multiespecíficas que se acoplan a 2 receptores de activación en las células NK y un antígeno tumoral inducen una destrucción más potente de las células tumorales de las células NK de ratón en comparación con las proteínas biespecíficas que se acoplan a un receptor de activación en las células NK y un antígeno tumoral.

Ejemplo 9 - Las proteínas de unión multiespecíficas se unen a NKG2D

Las líneas celulares de linfoma de ratón EL4 se modificaron genéticamente para expresar proteínas humanas de unión triespecífica a NKG2D (TriNKET) que contienen cada una un dominio de unión a NKG2D, un dominio de unión a HER2 y un dominio Fc que se une a CD16 como se muestra en la Figura 1, se probaron para determinar su afinidad por NKG2D extracelular expresado en células EL4. La unión de las proteínas de unión a NKG2D multiespecíficas se detectó mediante el uso de anticuerpos secundarios anti-IgG humana conjugados con fluoróforo. Las células se analizaron mediante citometría de flujo, y se calculó las veces sobre el fondo (FOB) mediante el uso de la intensidad de fluorescencia media (MFI) de las células que expresan NKG2D en comparación con las células EL4 parentales.

Las TriNKET probadas incluyen HER2-TriNKET-C26 (ADI-28226 y un dominio de unión a HER2) y HER2-TriNKET-F04 (ADI-29404 y un dominio de unión a HER2). El dominio de unión a HER2 usado en las moléculas probadas estaba compuesto por un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera de trastuzumab.

Los datos muestran que las TriNKET de direccionamiento a HER2 de la presente descripción se une a NKG2D (Figura 26).

Ejemplo 10 - Las proteínas de unión multiespecíficas se unen al antígeno tumoral humano

Las proteínas de unión triespecífica se unen a HER2

Se usaron líneas celulares cancerosas humanas que expresaban HER2 para evaluar la unión de las TriNKET que se dirigen a HER2 al antígeno asociado al tumor. La línea celular de carcinoma de células renales 786-O expresa niveles bajos de HER2. Las TriNKET y, opcionalmente, el anticuerpo monoclonal parental anti-HER2 (trastuzumab) se incubaron con las células, y la unión se detectó mediante el uso de anticuerpos secundarios anti-IgG humana conjugados con fluoróforo. Las células se analizaron mediante citometría de flujo y se calculó las veces sobre el fondo (F0B) mediante el uso de la intensidad de fluorescencia media (MFI) de TriNKET y Trastuzumab normalizados con respecto a controles de anticuerpos secundarios. HER2-TriNKET-C26 y HER2-TriNKET-F04 muestran niveles comparables de unión a HER2 expresados en células 786-O en comparación con trastuzumab (Figura 27A).

Las células RMA transducidas con HER2 humano se usaron para probar la HER2 humana expresada por célula por las TriNKET que se dirigen a HER2. Las TriNKET se diluyeron a 20 μg/ml y se detectó la unión mediante el uso de un anticuerpo secundario anti-IgG humana conjugado con fluoróforo. Las células se analizaron mediante citometría de flujo, la unión a la HER2 expresada por célula se comparó con poblaciones de células teñidas con isotipo y sin teñir. La Figura 27B y la Figura 27C muestran perfiles de unión de TriNKET que contienen dos dominios de unión a NKG2D distintos (el perfil de unión de C26.2 TriNKET con el sitio de unión a HER2 mostrado en la Figura 27B; el perfil de unión de F04.2 TriNKET con el sitio de unión a HER2 mostrado en la Figura 27C), pero con el mismo dominio de unión a HER. Ambas TriNKET muestran un nivel similar de unión a HER2 de superficie celular en células RMA.

Ejemplo 11 - Las proteínas de unión multiespecíficas activan las células NK

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de capas leucocitarias de sangre periférica humana mediante el uso de centrifugación por gradiente de densidad. Las células NK (CD3- CD56+) se aislaron mediante el uso de selección negativa con perlas magnéticas de PBMC, y la pureza de las células NK aisladas fue típicamente >90 %. Las células NK aisladas se cultivaron en medios que contenían 100 ng/ml de IL-2 para su activación o se dejaron en reposo durante toda la noche sin citocinas. Las células NK activadas por IL-2 se usaron dentro de 24-48 horas después de la activación.

Las células cancerosas humanas que expresan un antígeno tumoral se cosecharon y resuspendieron en medios de cultivo a 2x106/ml. Los anticuerpos monoclonales o TriNKET que se dirigen al antígeno tumoral se diluyeron en medios de cultivo. Las células N^kactivadas se recolectaron, lavaron y resuspendieron a 2x106/mL en medios de cultivo. A continuación, las células cancerosas se mezclaron con anticuerpos monoclonales/TriNKET y células NK activadas en presencia de IL-2. También se añadieron Brefeldin-A y monesina al cultivo mixto para bloquear el transporte de proteínas fuera de la célula para la tinción de citocinas intracelulares. Se añadió anti-CD107a conjugado con fluoróforo al cultivo mixto y el cultivo se incubó durante 4 horas antes de que las muestras se prepararan para el análisis de FACS mediante el uso de anticuerpos contra CD3, CD56 e IFN-y conjugados con fluoróforo. La tinción de CD107a e IFN-y se analizó en células CD3' CD56+ para evaluar la activación de células NK. El incremento de las células CD107a/IFN-Y doble positivas es indicativo de una mejor activación de células NK mediante el acoplamiento de dos receptores de activación en lugar de un receptor.

Las TriNKET median la activación de las células NK humanas cocultivadas con células SkBr-3 que expresan HER2 (Figura 28A), células Colo201 (Figura 28B) y células HCC1954 (Figura 28C) respectivamente como lo indica un incremento de la desgranulación de CD107a y la producción de IFN-y. Las células SkBr-3 y las células HCC1954 tienen altos niveles de expresión de HER2 superficial, y Colo201 tiene una expresión de HER2 media. En comparación con el anticuerpo monoclonal trastuzumab, las TriNKET muestran una activación superior de las células NK humanas en presencia de células cancerosas humanas. Las células NK solas, las células NK más las células SkBr-3 se usan como controles negativos.

Las TriNKET (C26-TriNKET-HER2 y F04-TriNKET-HER2) median la activación de las células NK humanas cocultivadas con células AML Mv4-1l que expresan CD33 mostraron un incremento de la desgranulación de CD107a y la producción de IFN-y. En comparación con el anticuerpo anti-CD33 monoclonal, las TriNKET (C26-TriNKET-HER2 y F04-TriNKET-HER2) mostraron una activación superior de las células NK humanas en presencia de células cancerosas humanas que expresaban HER2 (Figura 28A-28C).

Ejemplo 12 - Las proteínas de unión triespecíficas permiten la citotoxicidad de las células cancerosas diana Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de capas leucocitarias de sangre periférica humana mediante el uso de centrifugación por gradiente de densidad. Las células NK (CD3‘ CD56+) se aislaron mediante el uso de selección negativa con perlas magnéticas de PBMC, y la pureza de las células NK aisladas fue típicamente >90 %. Las células NK aisladas se cultivaron en medios que contenían 100 ng/ml de IL-2 para su activación o se dejaron en reposo durante toda la noche sin citocinas. Las células NK activadas por IL-2 o en reposo se usaron al día siguiente en ensayos de citotoxicidad.

Para probar la capacidad de las células NK humanas para lisar las células cancerosas en presencia de las TriNKET, se usó un ensayo de citotoxicidad no radiactiva cyto Tox 96 de Promega (G1780) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células cancerosas humanas que expresaban un antígeno tumoral se cosecharon, lavaron y resuspendieron en medios de cultivo a 1-2x105/ml. Las células NK en reposo y/o activadas se cosecharon, lavaron y resuspendieron a 105-2,0x106/ml en el mismo medio de cultivo que el de las células cancerosas. En cada pocillo de una placa de 96 pocillos, se mezclaron 50 μl de la suspensión de células cancerosas con 50 μl de suspensión de células NK con o sin TriNKET que se dirigen al antígeno tumoral expresado en las células cancerosas. Después de la incubación a 37 °C con 5 % de CO2 durante 3 horas y 15 minutos, se añadió amortiguador de lisis 10x a los pocillos que contenían solo células cancerosas y a los pocillos que contenían solo medios para la lisis máxima y los controles de reactivos negativos, respectivamente. A continuación, la placa se volvió a colocar en la incubadora durante 45 minutos adicionales para alcanzar un total de 4 horas de incubación. A continuación se sedimentaron las células, y el sobrenadante del cultivo se transfirió a una nueva placa de 96 pocillos y se mezcló con un sustrato para su revelado. La nueva placa se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente y la absorbancia se leyó a 492 nm en un SpectraMax i3x. El porcentaje de lisis específica de las células cancerosas se calculó de la siguiente manera: % de lisis específica = ((lisis experimental - lisis espontánea de células NK solas - lisis espontánea de células cancerosas solas) / (lisis máxima - control de reactivo negativo)) x 100 %.

Las TriNKET potencian la citotoxicidad de las células NK contra dianas con baja expresión superficial en comparación con la actividad citotóxica del trastuzumab, un anticuerpo monoclonal anti-HER2. Las células NK humanas en reposo se mezclaron con células tumorales SkBr con expresión alta de HER2 y células cancerosas 786-O con expresión baja de HER2, y se analizó la capacidad de las TriNKET para potenciar la actividad citotóxica de las células NK humanas en reposo contra las células cancerosas que expresan HER2 de una manera sensible a la dosis. Las líneas punteadas en la Figura 29A y la Figura 29B indican la actividad citotóxica de las células NK en reposo contra las células cancerosas en ausencia de las TriNKET. Como se muestra en la Figura 29B, al mezclar células NK humanas activadas con células 786-0 con expresión baja de HER2 y TriNKET (por ejemplo, CD26-TriNKET y F04-TriNKET, que incluye un dominio de unión para HER2), se observó actividad citotóxica sensible a la dosis de células NK humanas activadas contra las células cancerosas.

Ejemplo 13 - La activación sinérgica de las células NK humanas mediante el entrecruzamiento de NKG2D y CD16

Ensayo de activación de células NK humanas primarias

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron de capas leucocitarias de sangre humana mediante el uso de centrifugación por gradiente de densidad. Las células NK se purificaron a partir de PBMC mediante el uso de perlas magnéticas negativas (StemCell # 17955). Las células N^kfueron >90 % CD3'CD56+ según se determinó mediante citometría de flujo. Las células se expandieron a continuación 48 horas en medios que contenían 100 ng/ml de hIL-2 (Peprotech #200-02) antes de su uso en ensayos de activación. Los anticuerpos se recubrieron en una placa de fondo plano de 96 pocillos a una concentración de 2 μg/ml (anti-CD16, Biolegend # 302013) y 5 μg/ml (anti-NKG2D, R&D #MAB139) en 100 μl de PBS estéril durante toda la noche a 4 °C, seguido de un lavado exhaustivo de los pocillos para eliminar el exceso de anticuerpo. Para la evaluación de la desgranulación, las células NK activadas por IL-2 se resuspendieron a 5*105 células/ml en medios de cultivo suplementados con 100 ng/ml de hIL2 y 1 μg/ml de mAb anti-CD107a conjugado con APC (Biolegend # 328619). A continuación, se añadieron 1*105 células/pocillo en placas recubiertas con anticuerpos. Los inhibidores del transporte de proteínas Brefeldin A (BFA, Biolegend # 420601) y Monensin (Biolegend # 420701) se añadieron a una dilución final de 1:1000 y 1:270 respectivamente. Las células sembradas en placas se incubaron durante 4 horas a 37 °C en 5 % de C02. Para la tinción intracelular de las células NK IFN-y se marcaron con mAb anti-CD3 (Biolegend #300452) y anti-CD56 (Biolegend #318328) y posteriormente se fijaron y permeabilizaron y marcaron con mAb anti-IFN-Y (Biolegend # 506507). Las células N^kse analizaron para determinar la expresión de CD107a e IFN-^ymediante citometría de flujo después de la selección en células CD56+CD3' vivas.

Para investigar la potencia relativa de la combinación de receptores, se realizó el entrecruzamiento de NKG2D o CD16 y el entrecruzamiento de ambos receptores mediante estimulación unida a la placa. Como se muestra en la Figura 30 (Figuras 30A-30C), la estimulación combinada de CD16 y NKG2D dio lugar a niveles muy elevados de CD107a (desgranulación) (Figura 30A) y/o producción de IFN-^y(Figura 30B). Las líneas punteadas representan un efecto aditivo de las estimulaciones individuales de cada receptor.

Los niveles de CD107a y la producción intracelular de IFN-y de células NK activadas por IL-2 se analizaron después de 4 horas de estimulación unida a la placa con anti-CD16, anti-NKG2D o una combinación de ambos anticuerpos monoclonales. Los gráficos indican la media (n = 2) ± DE. La Figura 19A demuestra los niveles de CD107a; la Figura 30B demuestra los niveles de IFNy; la Figura 30C demuestra los niveles de CD107a e IFNy. Los datos mostrados en las Figuras 30A-30C son representativos de cinco experimentos independientes que usan cinco donantes sanos diferentes.

La desgranulación de CD107a y la producción intracelular de IFN-y de células NK activadas por IL-2 se analizaron después de 4 horas de estimulación unida a la placa con trastuzumab, anti-NKG2D o una TriNKET derivada de los dominios de unión de trastuzumab y el anticuerpo anti-NKG2D (Figura 31). En todos los casos, los anticuerpos analizados eran del isotipo IgG1 humano. Los gráficos indican la media (n = 2) ± DE.

Ejemplo 14 - Propiedades de las TriNKET

Evaluación de la unión de TriNKET a NKG2D humano expresado en células

Las células EL4 transducidas con NKG2D humano se usaron para probar la unión a NKG2D humano expresado por células. Las TriNKET se diluyeron a 20 μg/ml y a continuación se diluyeron en serie. Las diluciones de mAb o TriNKET se usaron para teñir las células, y la unión de la TriNKET o mAb se detectó mediante el uso de un anticuerpo secundario anti-IgG humana conjugado con fluoróforo. Las células se analizaron mediante citometría de flujo, la MFI de unión se normalizó a controles de anticuerpos secundarios para obtener los valores de veces sobre el fondo.

Evaluación de la unión de TriNKET a antígenos de cáncer humanos expresados con células

Se usaron líneas celulares cancerosas humanas que expresaban HER2 para evaluar la unión de antígenos tumorales de TriNKET derivadas de diferentes clones de direccionamiento de NKG2D. La línea celular 786-0 de carcinoma de células renales humanas expresa niveles bajos de HER2 y se usó para evaluar la unión de TriNKET a HER2 expresado por células. Las TriNKET se diluyeron a 20 μg/ml y se incubaron con las células respectivas. La unión del TriNKET se detectó mediante el uso de un anticuerpo secundario anti-IgG humana conjugado con fluoróforo. Las células se analizaron mediante citometría de flujo, la MFI de unión para la célula que expresa HER2 se normalizó con respecto a controles de anticuerpos secundarios para obtener los valores de veces sobre el fondo. Determinación de la capacidad de unión de anticuerpos de líneas celulares de cáncer positivo para HER2 humano Se midió la capacidad de unión de anticuerpos (ABC) de líneas celulares de cáncer positivo para HER2 humano. Se usó el kit Quantum Simply Cellular de Bangs Lab (#815) y se siguieron las instrucciones del fabricante para la preparación de perlas marcadas con anticuerpos. Brevemente, cada una de las cuatro poblaciones de perlas se tiñeron con una cantidad saturante de anticuerpo anti-HER2, y las poblaciones celulares también se tiñeron con una cantidad saturante del mismo anticuerpo. Se adquirieron datos de muestras para cada población de perlas, así como también para las poblaciones celulares. La hoja de trabajo QuickCal, suministrada con el kit, se usó para la generación de una curva estándar y la extrapolación de los valores de ABC para cada una de las líneas celulares. Activación de las células NK primarias por las TriNKET

Las PBMC se aislaron de capas leucocitarias de sangre periférica humana mediante el uso de centrifugación por gradiente de densidad. Las PBMC aisladas se lavaron y prepararon para el aislamiento de células NK. Las células NK se aislaron mediante el uso de una técnica de selección negativa con perlas magnéticas; la pureza de las células NK aisladas fue típicamente >90 % de CD3-CD56+. Las células NK aisladas se cultivaron en medios que contenían 100 ng/ml de IL-2 para su activación o se dejaron en reposo durante toda la noche sin citocinas. Las células NK activadas por IL-2 se usaron 24-48 horas después; las células NK en reposo siempre se usaron el día después de la purificación.

Se cosecharon las líneas celulares cancerosas humanas que expresaban una diana de cáncer de interés a partir del cultivo, y las células se ajustaron a 2x106/ml. Los anticuerpos monoclonales o TriNKET dirigidos a la diana del cáncer de interés se diluyeron en medios de cultivo. Las células NK en reposo y/o activadas se cosecharon a partir del cultivo, las células se lavaron y se resuspendieron a 2x106/ml en medios de cultivo. Se añadieron IL-2 y anti-CD107a conjugado con fluoróforo a las células NK para el cultivo de activación. Brefeldin-A y monesina se diluyeron en medios de cultivo para bloquear el transporte de proteínas fuera de la célula para la tinción de citocinas intracelulares. En una placa de 96 pocillos, se añadieron 50 μl de dianas tumorales, mAb/TriNKET, BFNmonensina y células NK para un volumen de cultivo total de 200 μl. La placa se cultivó durante 4 horas antes de preparar las muestras para el análisis FACS.

Después del cultivo de activación de 4 horas, se prepararon células para su análisis mediante citometría de flujo mediante el uso de anticuerpos contra CD3, CD56 e IFNy conjugados con fluoróforo. La tinción de CD107a e IFNy se analizó en poblaciones CD3-CD56+ para evaluar la activación de células NK.

Ensayo de citotoxicidad de células NK humanas primarias

Las PBMC se aislaron de capas leucocitarias de sangre periférica humana mediante el uso de centrifugación por gradiente de densidad. Las PBMC aisladas se lavaron y prepararon para el aislamiento de células NK. Las células NK se aislaron mediante el uso de una técnica de selección negativa con perlas magnéticas, la pureza de las células NK aisladas fue típicamente >90 % de CD3-CD56+. Las células NK aisladas se cultivaron en medios que contenían 100 ng/ml de IL-2 o se dejaron en reposo durante toda la noche sin citocinas. Las células NK activadas por IL-2 o en reposo se usaron al día siguiente en ensayos de citotoxicidad.

Ensayo de liberación de LHD Cyto Tox 96:

La capacidad de las células NK humanas para lisar las células tumorales se midió con o sin la adición de TriNKET mediante el uso del ensayo de citotoxicidad no radiactiva cyto Tox 96 de Promega (G1780). Las líneas celulares cancerosas humanas que expresan una diana de cáncer de interés se cosecharon a partir del cultivo, las células se lavaron con PBS y se resuspendieron en medios de crecimiento a 1-2x105/ml para su uso como células diana. Se añadieron 50 μl de la suspensión de células diana a cada pocillo. Los anticuerpos monoclonales o TriNKET que se dirigen a un antígeno canceroso de interés se diluyeron en medios de cultivo, se añadieron 50 μl de mAb diluido o TriNKET a cada pocillo. Las células NK en reposo y/o activadas se cosecharon a partir del cultivo, las células se lavaron y se resuspendieron a 105-2,0x106/ml en medios de cultivo en dependencia de la relación de E:T deseada. Se añadieron 50 μl de células NK a cada pocillo de la placa para producir un total de 150 μl de volumen de cultivo. La placa se incubó a 37 oC con 5 % de CO2 durante 3 horas y 15 minutos. Después de la incubación, se añadió amortiguador de lisis 10x a los pocillos de las células diana solas, y a los pocillos que contenían solo medios, para lograr los máximos controles de volumen y lisis. A continuación, la placa se volvió a colocar en la incubadora durante 45 minutos adicionales, para realizar hasta un total de 4 horas de incubación antes del desarrollo.

Después de la incubación, la placa se retiró de la incubadora y las células se sedimentaron mediante centrifugación a 200 g durante 5 minutos. Se transfirieron 50 μl de sobrenadante de cultivo a una microplaca limpia y se añadieron 50 μl de solución de sustrato a cada pocillo. La placa se protegió de la luz y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 50 μl de solución de parada a cada pocillo, y la absorbancia se leyó a 492 nm en un SpectraMax i3x. El % de lisis específica se calculó de la siguiente manera: % de lisis específica = ((Liberación experimental - Liberación espontánea del efector - Liberación espontánea de la diana) / (Liberación máxima -Liberación espontánea)) * 100 %.

Ensayo de citotoxicidad DELFIA:

Las líneas celulares cancerosas humanas que expresaban una diana de interés se cosecharon a partir de cultivo, las células se lavaron con PBS y se resuspendieron en medios de crecimiento a 106/ml para su marcaje con el reactivo BATDA (Perkin Elmer AD0116). Se siguieron las instrucciones del fabricante para el marcaje de las células diana. Después de marcar las células se lavaron 3 veces con PBS y se resuspendieron a 0,5-1,0x105/ml en medios de cultivo. Para preparar los pocillos de fondo, se apartó una alícuota de las células marcadas y las células se centrifugaron fuera del medio. Se añadieron cuidadosamente 100 μl del medio a los pocillos por triplicado para evitar alterar las células sedimentadas. Se añadieron 100 μl de células marcadas con BATDA a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Los pocillos se guardaron para la liberación espontánea de las células diana, y los pocillos se prepararon para la lisis máxima de las células diana mediante la adición de Triton-X al 1 %. Los anticuerpos monoclonales o TriNKET contra la diana tumoral de interés se diluyeron en medios de cultivo y se añadieron 50 μl de mAb o TriNKET diluidos a cada pocillo. Las células NK en reposo y/o activadas se cosecharon a partir del cultivo, las células se lavaron y se resuspendieron a 105-2,0x106/ml en medios de cultivo en dependencia de la relación de E:T deseada. Se añadieron 50 μl de células NK a cada pocillo de la placa para producir un total de 200 μl de volumen de cultivo. La placa se incubó a 37 oC con 5 % de CO2 durante 2-3 horas antes de revelar el ensayo.

Después del cultivo durante 2-3 horas, la placa se retiró de la incubadora y las células se sedimentaron mediante centrifugación a 200 g durante 5 minutos. Se transfirieron 20 μl de sobrenadante de cultivo a una microplaca limpia proporcionada por el fabricante, se añadieron 200 μl de solución de europio a temperatura ambiente a cada pocillo. La placa se protegió de la luz y se incubó en un agitador de placas a 250 rpm durante 15 minutos. La placa se leyó con los instrumentos Victor 3 o SpectraMax i3X. El % de lisis específica se calculó de la siguiente manera: % de Lisis específica = ((Liberación experimental - Liberación espontánea) / (Liberación máxima - Liberación espontánea)) * 100 %.

Ensayo de citotoxicidad de PBMC humanas a largo plazo

Las células diana SkBr-3 se marcaron con BacMam 3.0 NucLight Green (#4622) para permitir el rastreo de las células diana. Se siguió el protocolo del fabricante para el marcaje de las células diana SkBr-3. La anexina V roja (Essen Bioscience #4641) se diluyó y preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos monoclonales o TriNKET se diluyeron en medios de cultivo. Se añadieron 50 μl de mAb o TriNKET, anexina V y células NK en reposo a los pocillos de una placa de 96 pocillos que ya contenía células SkBr-3 marcadas; se añadieron 50 μl de medios de cultivo completos para un total de 200 μl de volumen de cultivo.

La recopilación de imágenes se configuró en IncuCyte S3. Las imágenes de los canales de fase, verde y rojo se recopilaron cada hora, con 2 imágenes por pocillo. El análisis de imagen se realizó mediante el uso del software IncuCyte S3. Se crearon máscaras para los canales verde y rojo para contar el número de células tumorales y las células positivas a anexina V, respectivamente. Para calcular el porcentaje de células diana Mv4-11 positivas para anexina V, se usó la siguiente fórmula. % de células SkBr-3 positivas para anexina V = ((recuento de objetos superpuestos) / (recuento de objetos verdes)) * 100 %.

Comparación de una TriNKET que se dirige a células cancerosas HER+ con SC2.2

Un TriNKET que se dirige a HER2 es más efectivo que trastuzumab en reducir el número de células SkBr-3, y solo el 60 % de las células desde el momento cero se dejaron después de 60 horas. Un TriNKET de la presente descripción que se dirige a las células tumorales/cancerosas que expresan HER2 es más efectivo que SC2.2, una molécula biespecífica de cadena única construida a partir de un scFv derivado de trastuzumab unido a LTLBP-6, un ligando para NKG2D. SC2.2 se une a las células cancerosas HER2+ y a las células NK NKG2D+ simultáneamente. Por lo tanto, se investigó la eficacia de SC2.2 en la reducción del número de células cancerosas HER2+. Los ensayos de activación y citotoxicidad in vitro demostraron que SC2.2 era efectivo para activar y destruir células NK. Sin embargo, SC2.2 no demostró eficacia en el modelo de tumor subcutáneo RMAS-HER2. La eficacia de SC2.2 también se probó in vivo mediante el uso de un modelo murino singénico que sobreexpresa RMAS-HER2. En este modelo de ratón, SC2.2 no demostró el control del crecimiento tumoral en comparación con el control con vehículo. Por lo tanto, aunque SC2.2 fue capaz de activar y destruir células NK y se une a células cancerosas HER2+, estas propiedades fueron insuficientes para controlar efectivamente el crecimiento tumoral HER2+.

Evaluación de la semivida en suero de SC2.2 en ratones C57Bl/6

Para determinar la semivida en suero de SC2.2 en ratones C57Bl/6, SC2.2 se marcó con una etiqueta fluorescente para rastrear su concentración in vivo. SC2.2 se marcó con IRDye 800CW (Licor #929-70020). La proteína marcada se inyectó por vía intravenosa en 3 ratones C57Bl/6, se extrajo sangre de cada ratón en los puntos temporales indicados. Después de la extracción, la sangre se centrifugó a 1000 g durante 15 minutos y se recogió suero de cada muestra y se almacenó a 4C hasta que se recogieron todos los puntos temporales.

El suero se analizó por imágenes mediante el uso de un sistema de imágenes infrarrojas Odyssey CLx, la señal fluorescente del canal 800 se cuantificó mediante el uso del software Image J. Las intensidades de imagen se normalizaron hasta el primer punto temporal, y los datos se ajustaron a una ecuación bifásica de descomposición. En este sistema experimental, se calculó que la semivida beta de SC2.2 era de aproximadamente 7 horas.

Análisis in vivo de SC2.2 contra tumores subcutáneos RMAS-HER2

Se diseñó un estudio in vivo de acuerdo con la Figura 37 para probar la eficacia de SC2.2 contra tumores subcutáneos de RMAS-HER2. Se inyectaron por vía subcutánea 106 células RMAS transducidas con HER2 humano en el flanco de 20 ratones C57Bl/6. A partir del día 2 después de la inoculación del tumor, SC2.2 se dosificó diariamente mediante inyección IP. SC2.2 se dosificó a concentraciones altas y bajas junto con un control de vehículo. A partir del día 4 después de la inoculación tumoral, los tumores se midieron los lunes, miércoles y viernes durante todo el estudio. El volumen tumoral se calculó mediante el uso de la siguiente fórmula: Volumen tumoral = Longitud x ancho x altura.

Capacidad de unión de anticuerpos de líneas celulares de cáncer positivo para HER2 humano

La Tabla 10 muestra los resultados de la cuantificación de HER2 superficial. Se identificó que las células SkBr-3 y HCC1954 tenían niveles altos (+++) de HER2 superficial. ZR-75-1 y Colo201 mostraron niveles medios (++) de HER2 superficial y 786-O mostró el nivel más bajo de HER2 (+).

Tabl 1 : AB lín l l r n r iiv r HER2

Las células NK humanas primarias son activadas por TriNKET en cocultivo con líneas de cáncer humano que expresan diferentes niveles de HER2

Las Figuras 28A - 28C muestran que las TriNKET y trastuzumab fueron capaces de activar las células NK humanas primarias en cocultivo con células tumorales humanas positivas para HER2, indicado por un incremento en la desgranulación de CD107a y la producción de citocinas IFN^y. En comparación con el anticuerpo monoclonal trastuzumab, ambos TriNKET (HER2-TriNKET-C26 y HER2-TriNKET-F04) mostraron una activación superior de las células NK humanas con una variedad de células cancerosas HER2 humanas.

La Figura 28A muestra que las células NK humanas son activadas por TriNKET cuando se cultivan con células SkBr-3. La Figura 28B muestra que las células NK humanas son activadas por TriNKET cuando se cultivan con células Colo201. La Figura 28C muestra que las células NK humanas son activadas por TriNKET cuando se cultivan con células HCC1954.

Las TriNKET potencian la citotoxicidad de las células NK humanas en reposo y activadas por IL-2

Las Figuras 32A - 32C muestran la potenciación por TriNKET de la actividad citotóxica mediante el uso de las células NK humanas activadas por IL-2 y en reposo. La Figura 32A muestra el por ciento de lisis específica de células tumorales SkBr-3 por células NK humanas en reposo. La Figura 32B muestra el por ciento de lisis específica de células tumorales SkBr-3 por células NK activadas por IL-2. Las poblaciones de células NK activadas por IL-2 y en reposo proceden del mismo donante. En comparación con trastuzumab, las TriNKET dirigen de forma más potente las respuestas contra las células SkBr-3 por poblaciones de células NK activadas o en reposo. La Figura 32C muestra el por ciento de lisis específica de las células de cáncer de pulmón NCI-H661 que expresan HER2 por las células NK humanas en reposo. Dos TriNKET con diferentes dominios de unión a NKG2D son capaces de inducir una mayor lisis máxima de las células cancerosas HER2+ NCI-H661 en comparación con el anticuerpo monoclonal Trastuzumab.

Las TriNKET potencian la citotoxicidad de las células NK contra dianas con baja expresión superficial

Se investigaron los efectos de las TriNKET contra las células diana con baja expresión superficial de HER2. Las Figuras 29A-29B muestran que las TriNKET proporcionan una mayor ventaja contra los cánceres con contenido medio y bajo de HER2 en comparación con trastuzumab. La Figura 29A muestra la destrucción por células NK humanas activadas de células tumorales SkBr-3 con alto contenido de HER2. La Figura 29B muestra la destrucción por células NK humanas de células tumorales 786-0 con bajo contenido de HER2. Las TriNKET proporcionan una mayor ventaja en comparación con trastuzumab contra las células cancerosas con expresión baja de HER2.

La ventaja de las TriNKET en el tratamiento de cánceres con alta expresión de FcR, o en microentornos tumorales con altos niveles de FcR

El tratamiento con anticuerpos monoclonales ha sido aprobado para el tratamiento de muchos tipos de cáncer, incluidos tumores hematológicos y sólidos. Aunque el uso de anticuerpos monoclonales en el tratamiento del cáncer ha mejorado los resultados de los pacientes, todavía existen limitaciones. Estudios mecánicos han demostrado que los anticuerpos monoclonales ejercen sus efectos sobre el crecimiento tumoral a través de múltiples mecanismos, incluidos ADCC, CDC, fagocitosis y bloqueo de señales, entre otros.

En particular, se cree que ADCC es un mecanismo importante a través del cual los anticuerpos monoclonales ejercen su efecto. ADCC se basa en el acoplamiento de Fc de anticuerpos del F^cyRIII de baja afinidad (CD16) en la superficie de las células asesinas naturales, que median la lisis directa de la célula tumoral. Entre F^cyR, el CD16 tiene la afinidad más baja por Fc de IgG, FcyRi (CD64) es el FcR de alta afinidad y se une aproximadamente 1000 veces más fuerte al Fc de IgG que CD16.

El CD64 se expresa normalmente en muchos linajes hematopoyéticos tal como el linaje mieloide, y puede expresarse en tumores derivados de estos tipos celulares, tal como la leucemia mieloide aguda (AML). Las células inmunitarias que se infiltran en el tumor, tales como los MDSC y los monocitos, también expresan CD64 y se sabe que se infiltran en el microentorno tumoral. La expresión de CD64 por el tumor o en el microentorno tumoral puede tener un efecto perjudicial en la terapia con anticuerpos monoclonales. La expresión de CD64 en el microentorno tumoral dificulta que estos anticuerpos se acoplen a CD16 en la superficie de células NK, ya que los anticuerpos prefieren unirse al receptor de alta afinidad. Al dirigirse a dos receptores de activación en la superficie de las células NK, las TriNKET pueden ser capaces de superar el efecto perjudicial de la expresión de CD64 en el tratamiento con anticuerpos monoclonales.

Muerte de células B mieloides normales y normales en cultivos de PBMC: Las TriNKET proporcionan un mejor perfil de seguridad a través de menos efectos secundarios fuera del tumor en la diana

Las células asesinas naturales y las células T CD8 son capaces de lisar directamente las células tumorales, aunque difieren los mecanismos a través de los cuales las células NK y las células T CD8 reconocen lo propio normal de las células tumorales. La actividad de las células NK está regulada por el equilibrio de señales de los receptores de activación (NCR, NKG2D, CD16, etc.) e inhibidores (KIR, NKG2A, etc.). El equilibrio de estas señales activadoras e inhibidoras permite a las células NK determinar las células propias sanas de las células propias estresadas, infectadas viralmente o transformadas. Este mecanismo “incorporado” de autotolerancia ayudará a proteger el tejido sano normal de las respuestas de las células NK. Para ampliar este principio, la autotolerancia de las células NK permitirá a las TriNKET dirigirse a antígenos expresados tanto en lo propio como en el tumor sin efectos secundarios tumorales, o con una ventana terapéutica incrementada.

A diferencia de las células asesinas naturales, las células T requieren el reconocimiento de un péptido específico presentado por las moléculas de MHC para las funciones de activación y efectoras. Las células T han sido la diana principal de la inmunoterapia y se han desarrollado muchas estrategias para redirigir las respuestas de las células T contra el tumor. Los biespecíficos de las células T, los inhibidores de los puntos de control y las células CAR-T han sido aprobados por la FDA, pero a menudo sufren toxicidades limitantes de la dosis. Los biespecíficos de las células T y las células CAR-T trabajan alrededor del sistema de reconocimiento de TCR-MHC mediante el uso de dominios de unión para dirigirse a antígenos en la superficie de las células tumorales, y mediante el uso de dominios de señalización modificados genéticamente para transducir las señales de activación en la célula efectora. Aunque son efectivos para provocar una respuesta inmunitaria antitumoral, estos tratamientos frecuentemente van acompañados de síndrome de liberación de citocinas (CRS) y efectos secundarios fuera del tumor en la diana. Las TriNKET son únicas en este contexto, ya que no “anulan” los sistemas naturales de activación e inhibición de las células NK. En su lugar, las TriNKET están diseñadas para balancear y proporcionar señales de activación adicionales a las células NK, al tiempo que mantienen la tolerancia de las NK a lo propio sano.

Las PBMC se aislaron de sangre completa mediante centrifugación por gradiente de densidad. Todos los eritrocitos contaminantes se lisaron mediante incubación en amortiguador de lisis ACK. Las PBMC se lavaron 3 veces en PBS y se contaron las PBMC totales. Las PBMC se ajustaron a 106/ml en medios de cultivo celular primario. Se sembraron 1 m de PBMC en pocillos de una placa de 24 pocillos, las TriNKET o mAb indicados se añadieron a los cultivos de PBMC a 10 μg/ml. Las células se cultivaron durante toda la noche a 37 °C con 5 % de CO2. Al día siguiente (24 horas después) se cosecharon las PBMC a partir de cultivo y se prepararon para el análisis de FACS. El porcentaje de células B CD45+; CD19+ y células mieloides CD45+; CD33+; CD11b se analizó en los diferentes grupos de tratamiento.

Las Figuras 33A y 33B muestran que las células B de un donante sano son sensibles a la lisis mediada por TriNKET, las Figuras 33C y 33D muestran que las células mieloides autólogas están protegidas de las respuestas de células NK mediadas por TriNKET y, por lo tanto, son resistentes a la lisis por TriNKET. Las PBMC tratadas con TriNKET que se dirigen a CD20 mostraron una frecuencia reducida de células B CD19+ con la población de linfocitos CD45+ (Figura 33A), pero sin efecto en la población de linfocitos CD45+, CD3-, CD56-(Figura 33B). En estos cultivos, la frecuencia de las células mieloides CD45+, CD33+, CD11b+ (Figura 33C), o la frecuencia de células mieloides CD45+, CD33+, CD11b+ (Figura 33D) no se modificaron.

Las TriNKET median la destrucción por hPBMC de células tumorales SkBr-3 en los cocultivos a largo plazo Ensayo de citotoxicidad de PBMC humana primaria

La Figura 34 muestra la destrucción a largo plazo de células SkBr-3 en cultivo con PBMC humanas. Cuando se cultivan solas, las células SkBr-3 proliferan y casi se duplican en 60 horas. Cuando se añaden PBMC humanas a las células SkBr-3 en cultivo, la tasa de proliferación se ralentiza, y cuando se añade un control de isotipo TriNKET que se dirige a CD33, también se ralentiza la proliferación, pero en menor medida. Cuando los cultivos se tratan con Trastuzumab, SkBr-3 ya no prolifera y, después de 60 horas, solo queda el 80 % de las células desde el momento cero. Dado que las células SkBr-3 son sensibles al bloqueo de la señal de HER2, el efecto sobre el crecimiento celular de SkBr-3 podría estar mediado por el bloqueo de la señal de HER2 o a través de funciones efectoras de Fc tal como ADCC.

Ejemplo 15 - Actividad citotóxica de células NK humanas en reposo mediada por TriNKET, anticuerpos monoclonales o anticuerpos biespecíficos contra células positivas para HER2

Las PBMC se aislaron de capas leucocitarias de sangre periférica humana mediante el uso de centrifugación por gradiente de densidad. Las PBMC aisladas se lavaron y prepararon para el aislamiento de células NK. Las células NK se aislaron mediante el uso de una técnica de selección negativa con perlas magnéticas; la pureza de las células NK aisladas fue típicamente >90 % de CD3-CD56+. Las células NK aisladas se cultivaron en medios que contenían 100 ng/ml de IL-2 o se dejaron en reposo durante toda la noche sin citocinas. Las células NK activadas por IL-2 o en reposo se usaron al día siguiente en ensayos de citotoxicidad.

Ensayo de citotoxicidad DELFIA:

Las líneas celulares de cáncer humano que expresaban una diana de interés se recolectaron a partir del cultivo, las células se lavaron con HBS y se resuspendieron en medios de crecimiento a 106/ml para su marcaje con el reactivo BATDA (Perkin Elmer AD0116). Se siguieron las instrucciones del fabricante para el marcaje de las células diana. Después del marcaje, las células se lavaron 3 veces con HBS y se resuspendieron a 0,5-1,0x105/ml en medios de cultivo. Para preparar los pocillos de fondo, se dejó a un lado una alícuota de las células marcadas y las células se centrifugaron fuera del medio. Se añadieron cuidadosamente 100 μl del medio a los pocillos por triplicado para evitar alterar las células sedimentadas. Se añadieron 100 μl de células marcadas con BATDA a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Los pocillos se guardaron para la liberación espontánea de las células diana, y los pocillos se prepararon para la lisis máxima de las células diana mediante la adición de Triton-X al 1 %. Los anticuerpos monoclonales o las TriNKET contra la diana tumoral de interés se diluyeron en medios de cultivo y se añadieron 50 μl de mAb o TriNKET diluidos a cada pocillo. Las células NK en reposo y/o activadas se cosecharon a partir del cultivo, las células se lavaron y se resuspendieron a 105-2,0x106/ml en medios de cultivo en dependencia de la relación de E:T deseada. Se añadieron 50 μl de células NK a cada pocillo de la placa para producir un volumen de cultivo total de 200 μl. La placa se incubó a 37 °C con 5 % de C02 durante 2-3 horas antes de revelar el ensayo.

Después del cultivo durante 2-3 horas, la placa se retiró de la incubadora y las células se sedimentaron mediante centrifugación a 200 g durante 5 minutos. Se transfirieron 20 μl de sobrenadante de cultivo a una microplaca limpia proporcionada por el fabricante y se añadieron 200 μl de solución de europio a temperatura ambiente a cada pocillo. La placa se protegió de la luz y se incubó en un agitador de placas a 250 rpm durante 15 minutos. La placa se leyó mediante el uso de los instrumentos Víctor 3 o SpectraMax i3X. El % de lisis específica se calculó de la siguiente manera: % de Lisis específica = ((Liberación experimental - Liberación espontánea) / (Liberación máxima -Liberación espontánea)) * 100 %.

La combinación de anticuerpo monoclonal y acoplador de células NK biespecíficas no recapitula la actividad de TriNKET

La Figura 35 muestra la actividad citotóxica de las células NK humanas en reposo mediados por las TriNKET, anticuerpos monoclonales o anticuerpos biespecíficos contra la línea celular Colo-201 positiva para HER2. Una TriNKET (ADI-29404 (F04)) que se dirige a la lisis máxima inducida por HER2 de células Colo-201 por células NK humanas en reposo. La mutación D265A se introdujo en el dominio CH₂de la TriNKET para anular la unión a FcR. La HER2-TriNKET (ADI-29404 (F04))-D265A no ha mediado la lisis de células Colo-201, lo que demuestra la importancia del doble direccionamiento de CD16 y NKG2D en células NK. Para demostrar aún más la importancia del doble direccionamiento en las células NK, se usó el anticuerpo monoclonal Trastuzumab para dirigirse a HER2 y mediar la ADCC por las células NK, Trastuzumab solo fue capaz de incrementar la lisis de las células NK de Colo-201, pero la lisis máxima lograda por Trastuzumab solo fue aproximadamente 4 veces menor en comparación con la TriNKET. Para comprender la importancia de que CD16 y NKG2D se dirijan a la misma molécula, se comparó la actividad de TriNKET (ADI-29404 (F04)) con la actividad de un anticuerpo biespecífico que se dirige a HER2 y NKG2D, combinado con Trastuzumab. Cuando se usó a concentraciones equimolares, la combinación de biespecífica y Trastuzumab no fue capaz de mediar la lisis máxima de las células Colo-201 por las células NK humanas en reposo. El fracaso de la combinación de Trastuzumab biespecífico demuestra la importancia de contener la unión triespecífica de TriNKET en una molécula.

Ejemplo 16 - Ensayo de enlazamiento

Las células RMA transducidas con HER2 humano se usaron para probar la unión simultánea a HER2 y NKG2D por TriNKET que se dirigen a HER2. Las TriNKET se usaron para teñir HER2 superficial a 20 μg/ml. La unión de la TriNKET se detectó a continuación mediante el uso de NKG2D-Fc humano recombinante biotinilado. A continuación se detectó NKG2D-Fc unido mediante el uso de estreptavidina-APC. Las células se analizaron mediante citometría de flujo y el enlazamiento de TriNKET se comparó con poblaciones celulares teñidas con isotipo y sin teñir. La Figura 38A muestra que TriNKET-C26 que incluye un dominio de unión para HER2, enlaza hNKG2D-Fc a células RMA-HER2, y la Figura 38B muestra que TriNKET-F04 que incluye un dominio de unión para HER2, enlaza hNKG2D-Fc a células RMA-HER2.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de unión multiespecífica que comprende:

en donde la proteína de unión multiespecífica se configura para unirse a HER2 en una célula cancerosa y unirse a NKG2D en una célula asesina natural (NK) para activar la célula NK y unirse a CD16 en la célula NK para activar la célula NK.

2. La proteína de unión multiespecífica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer sitio de unión al antígeno se une a NKG2D en seres humanos y primates no humanos.

3. La proteína de unión multiespecífica de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera del primer sitio de unión al antígeno están presentes en el mismo polipéptido.

4. La proteína de unión multiespecífica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera del segundo sitio de unión al antígeno están presentes en el mismo polipéptido.

5. La proteína de unión multiespecífica de acuerdo con la reivindicación 4, que consiste esencialmente en:

(i) una primera cadena pesada de inmunoglobulina que consiste esencialmente en un fragmento variable de cadena única (scFv) fusionado a través de un enlazador o una bisagra de anticuerpo al extremo N-terminal de un primer dominio Fc;

(ii) una segunda cadena pesada de inmunoglobulina que consiste esencialmente en un dominio variable de la cadena pesada y un dominio de la cadena pesada CH1, unido al extremo N-terminal de un segundo dominio Fc; y

(iii) una cadena ligera de inmunoglobulina que consiste esencialmente en un dominio variable de la cadena ligera y un dominio constante de la cadena ligera,

en donde:

(a) el scFv comprende un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera que se emparejan para unirse a NKG2D, y el dominio variable de la cadena pesada de (ii) y el dominio variable de la cadena ligera de (iii) se emparejan para unirse a HER2; o

(b) el scFv comprende un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera que se emparejan para unirse a HER2, y el dominio variable de la cadena pesada de (ii) y el dominio variable de la cadena ligera de (iii) se emparejan para unirse a NKG2D,

y en donde los dominios Fc primero y segundo forman un dímero que se une a CD16.

6. La proteína de unión multiespecífica de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera del scFv se emparejan para unirse a NKG2D, y el dominio variable de la cadena pesada de (ii) y el dominio variable de la cadena ligera de (iii) se emparejan para unirse a HER2.

7. La proteína de unión multiespecífica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera que se emparejan para unirse a NKG2D bloquean un ligando natural de unión a y activación de NKG2D.

8. La proteína de unión multiespecífica de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el ligando natural es LTLBP6 o MICA.

9. La proteína de unión multiespecífica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera que se emparejan para unirse a NKG2D comprenden:

(a) una secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena pesada al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO:1;

(b) una secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena pesada al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO:41 y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena ligera al menos 90 % idéntica a la SeQ ID NO:42;

(c) una secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena pesada al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO:43 y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena ligera al menos 90 % idéntica a la S^eQ ID NO:44;

(d) una secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena pesada al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO:45 y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena ligera al menos 90 % idéntica a la S^eQ ID NO:46;

(e) una secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena pesada al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO:47 y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena ligera al menos 90 % idéntica a la SeQ ID NO:48;

(f) una secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena pesada al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO:94 y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena ligera al menos 90 % idéntica a la S^eQ ID NO:95; o

(g) una secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena pesada al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO:102 y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena ligera al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO:103.

10. La proteína de unión multiespecífica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera que se emparejan para unirse a HER2 comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 50, 51 y 52, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de las SEQ ID NO: 54, 55 y 56, respectivamente,

opcionalmente en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO:49 y el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO:53.

11. La proteína de unión multiespecífica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera que se emparejan para unirse a HER2 comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 77, 78 y 79, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de las SEQ ID NO: 80, 81 y 82, respectivamente,

opcionalmente en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO:57 y el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO:58.

12. La proteína de unión multiespecífica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera que se emparejan para unirse a HER2 comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 83, 84 y 85, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de las SEQ ID NO: 86, 87 y 88, respectivamente,

opcionalmente en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO.59 y el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO:60.

13. La proteína de unión multiespecífica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende dominios bisagra y CH2 de un dominio Fc de anticuerpo, opcionalmente dominios bisagra y CH2 de un anticuerpo IgG1 humano.

14. La proteína de unión multiespecífica de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el dominio Fc comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 234-332 de un anticuerpo IgG1 humano, opcionalmente en donde el dominio Fc comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica al dominio Fc de IgG1 humana y difiere en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en Q347, Y349, T350, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 y K439, numeradas de acuerdo con el índice EU como en Kabat.

15. Una formulación que comprende la proteína de unión multiespecífica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 y un portador farmacéuticamente aceptable.

16. Una célula que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican la proteína de unión multiespecífica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14.

17. La proteína de unión multiespecífica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 o la formulación de acuerdo con la reivindicación 15 para su uso en un método para tratar el cáncer, en donde el método comprende administrar la proteína de unión multiespecífica o la formulación a un paciente.

18. La proteína de unión multiespecífica o la formulación para el uso de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer esofágico, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, carcinoma del conducto salival, adenocarcinoma de pulmón y una forma agresiva de cáncer uterino, opcionalmente en donde la forma agresiva de cáncer uterino es carcinoma seroso de endometrio uterino.