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P Chang Gregory
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Abstract

são descritas proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam a her2, ao receptor nkg2d e cd16, bem como composições farmacêuticas e métodos terapêuticos úteis para o tratamento de câncer.

Description

PROTEÍNAS QUE SE LIGAM A HER2, NKG2D E CD16
REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS [001] Esse pedido reivindica o beneficio do e prioridade para o Pedido de Patente U.S. Provisório N° 62/461.146, depositado em 20 de fevereiro de 2017, cujo conteúdo completo é incorporado por referência nesse relatório descritivo para todas as finalidades.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [002] O presente pedido contém uma Listagem de sequências que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e é incorporada nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade. A referida cópia em ASCII, criada em 16 de fevereiro de 2018, é denominada DFY-008PC_SL.txt e tem 92.807 bytes de tamanho.
CAMPO DA INVENÇÃO [003] A invenção está relacionada às proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2 ou ErbB2), ao receptor NKG2D e CD16.
FUNDAMENTOS [004] O câncer continua a ser um problema de saúde significante, apesar dos esforços de pesquisa e avanços científicos substanciais relatados na literatura para o tratamento dessa doença. Alguns dos cânceres mais frequentemente diagnosticados incluem câncer de próstata, câncer de mama e câncer de pulmão. O câncer da próstata é a forma mais comum de câncer em homens. O câncer de mama permanece uma causa importante de morte em mulheres. As opções de tratamento atuais para esses cânceres não são eficazes para todos os pacientes e/ou podem ter efeitos
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2/112 colaterais adversos substanciais. Outros tipos de câncer também permanecem desafiadores para tratar usando as opções terapêuticas existentes.
[005] As imunoterapias do câncer são desejáveis, pois são altamente especificas e podem facilitar a destruição de células de câncer usando o próprio sistema imune do paciente. Proteinas de fusão como, por exemplo, biespecifico célula T engajadores são imunoterapias para o câncer descritas na literatura que se ligam às células tumorais e células T para facilitar a destruição de células tumorais. Anticorpos que se ligam a certos antigenos tumor-associados e a certas células imunes foram descritos na literatura. Veja, por exemplo, WO 2016/134371 e WO 2015/095412.
[006] Células natural killer (NK) são um componente do sistema imune inato e constituem aproximadamente 15% de linfócitos circulantes. Células NK infiltram praticamente todos os tecidos e foram originalmente caracterizadas por sua habilidade para matar células tumorais eficazmente sem a necessidade de sensibilização prévia. Células NK ativadas matam células-alvo por meios similares aos das células T citotóxicas - ou seja, por meio de grânulos citoliticos que contêm perforina e granzimas, bem como por meio de vias de receptor de morte. Células NK ativadas também secretam citocinas inflamatórias como, por exemplo, IFN-γ e quimiocinas que promovem o recrutamento de outros leucócitos ao tecido-alvo.
[007] As células NK respondem aos sinais por meio de diversos receptores de ativação e inibitórios em sua superficie. Por exemplo, quando células NK encontram células próprias saudáveis, sua atividade é inibida por meio da
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3/112 ativação dos receptores de célula-killer imunoglobulina-like (KIRs). Alternativamente, quando células NK encontram células estranhas ou células de câncer, elas são ativadas por meio de seus receptores de ativação (por exemplo, NKG2D, NCRs, DNAM1). Células NK também são ativadas pela região constante de algumas imunoglobulinas por meio de receptores CD16 em sua superficie. A sensibilidade global de células NK à ativação depende da soma de sinais estimulatórios e inibitórios.
[008] HER2 (ErbB2) é uma glicoproteina transmembrana, que pertence à familia do receptor do fator de crescimento epidérmico. Ela é um receptor tirosina quinase e regula a sobrevida, proliferação e crescimento celulares. HER2 desempenha um papel importante em malignidades humanas. O gene erbB2 está amplificado ou superexpresso em aproximadamente 30% dos cânceres de mama humanos. Pacientes com câncer de mama que superexpressa HER2 possuem taxas de sobrevida global substancialmente menores e intervalos livres de doença mais curtos do que pacientes cujo câncer não superexpressa HER2. Além disso, a superexpressão de HER2 leva ao aumento de metástases do câncer de mama. Sabe-se que a superexpressão de HER2 ocorre em muitos outros tipos de câncer, incluindo cânceres de mama, ovarianos, esofágicos, da bexiga e gástricos, carcinoma do dueto salivar, adenocarcinoma do pulmão e formas agressivas de câncer uterino, por exemplo, carcinoma endometrial seroso uterino.
SUMÁRIO [009] A invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao HER2 em uma célula de câncer e ao receptor NKG2D e receptor CD16 em células natural
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4/112 killer. Essas proteínas podem engajar mais de um tipo de receptor de ativação de NK, e podem bloquear a ligação de ligantes naturais ao NKG2D. Em certas modalidades, as proteínas podem afligir células NK em humanos, e em outras espécies como, por exemplo, roedores e macacos Cynomolgus. Vários aspectos e modalidades da invenção são descritos em mais detalhe abaixo.
[010] Consequentemente, um aspecto da invenção fornece uma proteína que incorpora um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga ao NKG2D; um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga ao HER2; e um domínio Fc de anticorpo, uma porção deste suficiente para se ligar ao CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD16. Cada um dos sítios de ligação ao antígeno pode incorporar um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo e um domínio variável da cadeia leve de anticorpo (por exemplo, dispostos como um anticorpo, ou fundidos juntos para formar um scFv, ou um ou mais dos sítios de ligação ao antígeno podem ser um anticorpo de domínio único, por exemplo, um anticorpo VhH como um anticorpo de camelídeo ou um anticorpo Vnar como aqueles encontrados em peixes cartilaginosos.
[011] O primeiro sítio de ligação ao antígeno, que se liga ao NKG2D, em uma modalidade, pode incorporar um domínio variável da cadeia pesada relacionado ao ID. DE SEQ. N°: 1, por exemplo, tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica ao ID. DE SEQ. N° : 1, e/ou que incorpora sequências de aminoácidos idênticas às sequências da CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 62), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 63) e CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 64) do ID. DE SEQ. N°: 1.
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Alternativamente, o primeiro sitio de ligação ao antigeno pode incorporar um dominio variável da cadeia pesada relacionado ao ID. DE SEQ. N°: 41 e um dominio variável da cadeia leve relacionado ao ID. DE SEQ. N°: 42. Por exemplo, o dominio variável da cadeia pesada do primeiro sitio de ligação ao antigeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 41, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências da CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 65), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 66) e CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 67) do ID. DE SEQ. N°: 41. Similarmente, o dominio variável da cadeia leve do segundo sitio de ligação ao antigeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 42, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências da CDR1 (ID. DE SEQ. N° : 68), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 69) e CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 70) do ID. DE SEQ. N°: 42. Em outras modalidades, o primeiro sitio de ligação ao antigeno pode incorporar um dominio variável da cadeia pesada relacionado ao ID. DE SEQ. N°: 43 e um dominio variável da cadeia leve relacionado ao ID. DE SEQ. N°: 44. Por exemplo, o dominio variável da cadeia pesada do primeiro sitio de ligação ao antigeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 43, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências da CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 71), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 72) e CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 73) do ID. DE SEQ. N°: 43. Similarmente, o dominio variável da cadeia leve do segundo sitio de ligação ao antigeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,
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95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 44, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências da CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 74), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 75) e CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 76) do ID. DE SEQ. N°: 44.
[012] Alternativamente, o primeiro sitio de ligação ao antigeno pode incorporar um dominio variável da cadeia pesada relacionado ao ID. DE SEQ. N°: 45 e um dominio variável da cadeia leve relacionado ao ID. DE SEQ. N°: 46, por exemplo, tendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idênticas ao ID. DE SEQ. N°: 45 e pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idênticas ao ID. DE SEQ. N°: 46, respectivamente. Em outra modalidade, o primeiro sitio de ligação ao antigeno pode incorporar um dominio variável da cadeia pesada relacionado ao ID. DE SEQ. N°: 47 e um dominio variável da cadeia leve relacionado ao ID. DE SEQ. N°: 48, por exemplo, tendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idênticas ao ID. DE SEQ. N°: 47 e pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idênticas ao ID. DE SEQ. N°: 48, respectivamente.
[013] O segundo sitio de ligação ao antigeno pode opcionalmente incorporar um dominio variável da cadeia pesada relacionado ao ID. DE SEQ. N°: 4 9 e um dominio variável da cadeia leve relacionado ao ID. DE SEQ. N°: 53. Por exemplo, o dominio variável da cadeia pesada do segundo sitio de ligação ao antigeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 49, e/ou incorporar
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7/112 sequências de aminoácidos idênticas às sequências da CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 50), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 51) e CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 52) do ID. DE SEQ. N° : 49. Similarmente, o domínio variável da cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 53 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências da CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 54), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 55) e CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 56) do ID. DE SEQ. N°: 53.
[014] Alternativamente, o segundo sítio de ligação ao antígeno pode incorporar um domínio variável da cadeia pesada relacionado ao ID. DE SEQ. N°: 57 e um domínio variável da cadeia leve relacionado ao ID. DE SEQ. N°: 58. Por exemplo, o domínio variável da cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 57, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências da CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 77), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 78) e CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 79) do ID. DE SEQ. N°: 57. Similarmente, o domínio variável da cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 58, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências da CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 80), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 81) e CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 82) do ID. DE SEQ. N°: 58.
[015] Em outra modalidade, o segundo sítio de ligação ao antígeno pode incorporar um domínio variável da cadeia pesada relacionado ao ID. DE SEQ. N°: 59 e um domínio variável da
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8/112 cadeia leve relacionado ao ID. DE SEQ. N°: 60. Por exemplo, o dominio variável da cadeia pesada do segundo sitio de ligação ao antigeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 59, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências da CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 83), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 84) e CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 85) do ID. DE SEQ. N°: 59. Similarmente, o dominio variável da cadeia leve do segundo sitio de ligação ao antigeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 60, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências da CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 86), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 87) e CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 88) do ID. DE SEQ. N°: 60.
[016] Em algumas modalidades, o segundo sitio de ligação ao antigeno incorpora um dominio variável da cadeia leve que possui uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos do dominio variável da cadeia leve presente no primeiro sitio de ligação ao antigeno.
[017] Em algumas modalidades, a proteina incorpora uma porção de um dominio Fc de anticorpo suficiente para se ligar ao CD16, em que o dominio Fc de anticorpo compreende dominios de dobradiça e CH2, e/ou sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas à sequência de aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG humano.
[018] Formulações que contêm uma dessas proteínas; células que contêm um ou mais ácidos nucleicos que expressam essas proteínas, e métodos de aumento de morte da célula tumoral usando essas proteínas, também são fornecidos.
[019] Outro aspecto da invenção envolve um método de
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9/112 tratamento de câncer em um paciente. 0 método compreende a administração a um paciente necessitado de uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteina de ligação multiespecifica descrita nesse relatório descritivo. Cânceres exemplares para tratamento com o uso das proteínas de ligação multiespecíficas incluem, por exemplo, cânceres de mama, ovariano, esofágico, da bexiga e gástrico, carcinoma do dueto salivar, adenocarcinoma do pulmão e formas agressivas de câncer uterino, por exemplo, carcinoma endometrial seroso uterino.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [020] A FIG. 1 é uma representação de uma proteína de ligação multiespecífica que contém um domínio de ligação ao NKG2D (braço direito), um domínio de ligação ao antígeno tumor-associado (braço esquerdo) e um domínio Fc ou uma porção deste que se liga ao CD16.
[021] A FIG. 2 é uma representação de uma proteína de ligação multiespecífica que contém um domínio de ligação ao NKG2D em um formato de scFv (braço direito) , um domínio de ligação ao antígeno tumor-associado (braço esquerdo) e um domínio Fc ou uma porção deste que se liga ao CD16.
[022] A FIG. 3 são gráficos de linhas que demonstram a afinidade de ligação de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) ao NKG2D humano recombinante em um ensaio ELISA.
[023] A FIG. 4 são gráficos de linhas que demonstram a afinidade de ligação de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) ao NKG2D de Cynomolgus recombinante em um ensaio ELISA.
[024] A FIG. 5 são gráficos de linhas que demonstram a
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10/112 afinidade de ligação de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) ao NKG2D de camundongo recombinante em um ensaio ELISA.
[025] A FIG. 6 são gráficos de barras que demonstram a ligação de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) às células EL4 que expressam NKG2D humano por citometria de fluxo que mostra a razão de aumento da intensidade de fluorescência média (MFI) em relação ao nível de base.
[026] A FIG. 7 são gráficos de barras que demonstram a ligação de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) às células EL4 que expressam NKG2D de camundongo por citometria de fluxo que mostra a razão de aumento da intensidade de fluorescência média (MFI) em relação ao nível de base.
[027] A FIG. 8 são gráficos de linhas que demonstram a afinidade de ligação específica de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) ao NKG2D humano recombinanteFc por competição com o ligante natural ULBP-6.
[028] A FIG. 9 são gráficos de linhas que demonstram a afinidade de ligação específica de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) ao NKG2D humano recombinanteFc por competição com o ligante natural MICA.
[029] A FIG. 10 são gráficos de linhas que demonstram a afinidade de ligação específica de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) ao NKG2D de camundongo recombinante-Fc por competição com o ligante natural Rae-1 delta.
[030] A FIG. 11 são gráficos de barras que mostram a ativação de NKG2D humano por domínios de ligação ao NKG2D
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11/112 (listados como clones) por quantificação da percentagem de células TNFa-positivas, que expressam proteínas de fusão NKG2D humano-CD3 zeta.
[031] A FIG. 12 são gráficos de barras que mostram a ativação de NKG2D de camundongo por domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) por quantificação da percentagem de células TNFa-positivas, que expressam proteínas de fusão NKG2D de camundongo-CD3 zeta.
[032] A FIG. 13 são gráficos de barras que mostram a ativação de células NK humanas por domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones).
[033] A FIG. 14 são gráficos de barras que mostram a ativação de células NK humanas por domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones).
[034] A FIG. 15 são gráficos de barras que mostram a ativação de células NK de camundongo por domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones).
[035] A FIG. 16 são gráficos de barras que mostram a ativação de células NK de camundongo por domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones).
[036] A FIG. 17 são gráficos de barras que mostram o efeito citotóxico de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) em células tumorais.
[037] A FIG. 18 são gráficos de barras que mostram a temperatura de fusão de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) medida por fluorimetria de varredura diferencial.
[038] A FIG. 19 é um gráfico que mostra a ativação aumentada de células NK humanas por proteínas de ligação multiespecíficas.
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12/112 [039] A FIG. 20 é um gráfico que mostra que proteínas de ligação multiespecíficas induziram níveis maiores de citotoxicidade contra células tumorais-alvo por células NK humanas.
[040] A FIG. 21 é um gráfico que mostra que proteínas de ligação multiespecíficas induziram níveis maiores de citotoxicidade contra células tumorais-alvo por células NK humanas.
[041] A FIG. 22 é um gráfico que mostra que proteínas de ligação multiespecíficas induziram níveis maiores de citotoxicidade contra células tumorais-alvo por células NK humanas.
[042] A FIG. 23 é um gráfico que mostra que proteínas de ligação multiespecíficas induziram níveis maiores de citotoxicidade contra células tumorais-alvo por células NK humanas.
[043] A FIG. 24 é um gráfico que mostra que proteínas de ligação multiespecíficas induziram níveis maiores de citotoxicidade contra células tumorais-alvo por células NK de camundongo.
[044] A FIG. 25 é um gráfico que mostra que proteínas de ligação multiespecíficas induziram níveis maiores de citotoxicidade contra células tumorais-alvo por células NK de camundongo.
[045] A FIG. 26 é um perfil de ligação de TriNKETs direcionados ao HER2 ao NKG2D expresso em células EL4. A FIG. 26 representa os mesmos dois domínios de ligação ao NKG2D agora pareados com um segundo braço de direcionamento ao HER2.
[046] A FIG. 27A é um perfil de ligação de TriNKETs
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13/112 direcionados ao HER2 ao HER2 expresso em células de carcinoma de célula renal humano 786-0; a FIG. 27B mostra que a ligação ao NKG2D clone C26 que contém TriNKET se liga às células RMA transduzidas com HER2 humano; a FIG. 27C mostra a ligação ao NKG2D clone F04 que contém TriNKET se liga às células RMA transduzidas com HER2 humano.
[047] As FIGS. 28A — 28C são gráficos de barras que demonstram que TriNKETs e trastuzumab foram capazes de ativar células NK humanas primárias em cocultura com células tumorais humanas HER2-positivas, indicado por um aumento em degranulação de CD107a e produção de citocina ΙΕΝγ. Comparados com o anticorpo monoclonal trastuzumab, ambos os TriNKETs exibiram ativação superior de células NK humanas com diversas células de câncer humano HER2. FIG. 28A mostra que células NK humanas são ativadas por TriNKETs quando cultivadas com células SkBr-3. A FIG. 28B mostra que células NK humanas são ativadas por TriNKETs quando cultivadas com células Colo201. A FIG. 28C mostra que células NK humanas são ativadas por TriNKETs quando cultivadas com células HCC1954 .
[048] As FIGS. 29A—29B são gráficos que demonstram que TriNKETs fornecem a maior vantagem contra cânceres com HER2 médio e baixo comparados com trastuzumab. A FIG. 2 9A mostra morte por célula NK humana ativada de células tumorais SkBr3 com HER2 elevado. A FIG. 2 9B mostra morte por célula NK humana de células tumorais 786-0 com HER2 baixo. TriNKETs fornecem uma vantagem maior comparados com trastuzumab contra células de câncer com baixa expressão de HER2.
[049] As FIGS. 30A-30C são gráficos de barras de ativação sinérgica de células NK usando CD16 e NKG2D. A FIG. 30A
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14/112 demonstra os níveis de CD107a; a FIG. 30B demonstra os níveis de IFNy; a FIG. 30C demonstra os níveis de CD107a e IFNy. Os gráficos indicam a média (n = 2) ± DP. Os dados são representativos de cinco experimentos independentes com o uso de cinco doadores saudáveis diferentes.
[050] A FIG. 31 é um gráfico de barras que mostra a ativação de células NK usando TriNKETs que visam NKG2D e CD16. Os anticorpos testados foram de isótipos de IgGl humana. Os gráficos indicam a média (n = 2) ± DP.
[051] As FIGS. 32A - 32C são gráficos que demonstram aumento por TriNKET da atividade citotóxica usando células NK humanas ativadas por IL-2 e em repouso. A FIG. 32A mostra o percentual de lise específica de células tumorais SkBr-3 por células NK humanas em repouso. A FIG. 32B mostra o percentual de lise específica de células tumorais SkBr-3 por células NK humanas ativadas por IL-2 . A FIG. 32C mostra o percentual de lise específica de células de câncer de pulmão NCI-H661 por células NK humanas ativadas por IL-2 .
[052] As FIGS. 33A e 33B são gráficos de barras que mostram células B de um doador saudável são sensíveis à lise mediada por TriNKET. FIGS. 33C e 33D são gráficos de barras que mostram que células mielóides são resistentes à lise mediada por TriNKET.
[053] A FIG. 34 são gráficos de linhas de morte por hPBMCs mediadas por TriNKETs de células tumorais SkBr-3 em coculturas de longo prazo.
[054] A FIG. 35 é um gráfico de linhas que mostra que a ligação triespecífica em uma molécula é importante para atividade máxima de célula NK.
[055] A FIG. 36 é um fluxograma do design de estudo da
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15/112 eficácia de SC2.2 sobre RMA/S-HER2 subcutâneo.
[056] A FIG. 37 são gráficos de linhas que mostram que SC2.2 não possui efeito sobre crescimento do tumor subcutâneo RMA/S-HER2.
[057] A FIG. 38A mostra que HER2-TriNKET-C26 serve de ponte entre hNKG2D-Fc e células RMA-HER2. A FIG. 38B mostra que HER2-TriNKET-F04 serve de ponte entre hNKG2D-Fc e células RMA-HER2. A linha pontilhada representa controle de isótipo. A linha sólida sem preenchimento representa controle não corado. A linha sólida com preenchimento representa os TriNKETs.
[058] A FIG. 39 é uma representação de um TriNKET na forma de Triomab, que é um anticorpo biespecifico, trifuncional, que mantém um formato IgG-like. Essa quimera consiste em duas metades de anticorpos, cada uma com uma cadeia leve e uma cadeia pesada, que se originam de dois anticorpos parentais. A forma de Triomab pode ser uma construção heterodimérica que contém ½ de anticorpo de rato e ½ de anticorpo de camundongo.
[059] A FIG. 40 é uma representação de um TriNKET na forma de Cadeia Leve Comum (LC) de KiH, que envolve a tecnologia knobs-into-holes (KIHs). KiH é um heterodimero que contém 2 Fabs de ligação ao alvo 1 e 2, e um Fc estabilizado por mutações de heterodimerização. TriNKET no formato de KiH pode ser uma construção heterodimérica com 2 Fabs de ligação ao alvo 1 e alvo 2, contendo duas cadeias pesadas diferentes e uma cadeia leve comum que pareia com ambas as cadeias pesadas.
[060] A FIG. 41 é uma representação de um TriNKET na forma de imunoglobulina de dominio variável duplo (DVD
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Ig™) , que combina os domínios de ligação ao alvo de dois anticorpos monoclonais por meio de vinculadores flexíveis de ocorrência natural, e gera uma molécula tetravalente IgGlike. DVD-Ig™ é uma construção homodimérica na qual o domínio variável que visa o antígeno 2 é fundido ao terminal-N do domínio variável de Fab direcionado ao antígeno 1. A Construção contém Fc normal.
[061] A FIG. 42 é uma representação de um TriNKET na forma de interface de Fab Ortogonal (Orto-Fab) , que é uma construção heterodimérica que contém 2 Fabs de ligação ao alvo 1 e alvo 2 fundidos ao Fc. O pareamento LC-HC é assegurado por interface ortogonal. A heterodimerização é assegurada por mutações no Fc.
[062] A FIG. 43 é uma representação de um TrinKET no formato de Ig 2-em-l.
[063] A FIG. 44 é uma representação de um TriNKET na forma de ES, que é uma construção heterodimérica que contém dois Fabs de ligação ao alvo 1 e alvo 2 diferentes fundidos ao Fc. A heterodimerização é assegurada por direção eletrostática mutações no Fc.
[064] A FIG. 45 é uma representação de um TriNKET na forma de Troca de Braço de Fab: anticorpos que trocam braços de Fab por troca de uma cadeia pesada e cadeia leve anexada (meia-molécula) com um par de cadeia pesada-leve de outra molécula, resultando em anticorpos biespecíficos. A forma de Troca de Braço de Fab (cFae) é um heterodímero que contém 2 Fabs de ligação ao alvo 1 e 2, e um Fc estabilizado por mutações de heterodimerização.
[065] A FIG. 46 é uma representação de um TriNKET na forma de Corpo SEED, que é um heterodímero que contém 2 Fabs
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17/112 de ligação ao alvo 1 e 2, e um Fc estabilizado por mutações de heterodimerização.
[066] A FIG. 47 é uma representação de um TriNKET na forma de LuZ-Y, no qual ziper de leucina é usado para induzir heterodimerização de duas HCs diferentes. A forma de LuZ-Y é um heterodimero que contém dois scFabs de ligação ao alvo 1 e 2 diferentes, fundidos ao Fc. A heterodimerização é assegurada por meio de motivos de ziper de leucina fundidos ao terminal-C de FC.
[067] A FIG. 48 é uma representação de um TriNKET na forma de Cov-X-Corpo.
[068] As FIGS. 49A-49B são representações de TriNKETs na forma de KÀ-Corpo, que são construções heterodiméricas com dois Fabs diferentes fundidos ao Fc estabilizado por mutações de heterodimerização: Fabl direcionado ao antigeno 1 contém LC kappa, enquanto o segundo Fab direcionado ao antigeno 2 contém LC lambda. FIG. 4 9A é uma representação exemplar de uma forma de um KÀ-Corpo; FIG. 4 9B é uma representação exemplar de outro κλ-Corpo.
[069] A FIG. 50 é uma construção heterodimérica Oasc-Fab que inclui Fab de ligação ao alvo 1 e scFab de ligação ao alvo 2 fundidos ao Fc. A heterodimerização é assegurada por mutações no Fc.
[070] A FIG. 51 é um DuetMab, que é uma construção heterodimérica que contém dois Fabs de ligação aos antigenos 1 e 2 diferentes, e Fc estabilizado por mutações de heterodimerização. Fab 1 e 2 contêm pontes S-S diferenciais que asseguram o pareamento correto da cadeia leve (LC) e da cadeia pesada (HC).
[071] A FIG. 52 é um CrossmAb, que é uma construção
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18/112 heterodimérica com dois Fabs de ligação aos alvos 1 e 2 diferentes fundidos ao Fc estabilizado por heterodimerização. Dominios CL e CHI e dominios VH e VL são trocados, por exemplo, CHI é fundida alinhada com VL, enquanto CL é fundida alinhada com VH.
[072] A FIG. 53 é um Fit-Ig, que é uma construção homodimérica na qual Fab de ligação ao antigeno 2 é fundido ao terminal-N da HC de Fab que se liga ao antigeno 1. A construção contém Fc do tipo selvagem.
DESCRIÇÃO DETALHADA [073] A invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao HER2 em uma célula de câncer e ao receptor NKG2D e receptor CD16 em células natural killer para ativar a célula natural killer, composições farmacêuticas que compreendem essas proteínas de ligação multiespecíficas, e métodos terapêuticos que utilizam essas proteínas multiespecíficas e composições farmacêuticas, incluindo para o tratamento de câncer. Vários aspectos da invenção são apresentados abaixo em seções; no entanto, aspectos da invenção descritos em uma seção particular não estão limitados a qualquer seção particular.
[074] Para facilitar a compreensão da presente invenção, diversos termos e frases são definidos abaixo.
[075] Os termos um e uma, como usados nesse relatório descritivo, significam um ou mais e incluem o plural, a menos que o contexto seja inadequado. Como usado nesse relatório descritivo, o termo sítio de ligação ao antigeno se refere à parte da molécula de imunoglobulina que participa na ligação ao antigeno. Em anticorpos humanos, o sítio de ligação ao antigeno é formado por resíduos de aminoácidos
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19/112 das regiões variáveis (V) do terminal-N das cadeias pesadas (H) e leves (L) . Três trechos altamente divergentes dentro das regiões V das cadeias pesadas e leves são referidos como regiões hipervariáveis que são interpostos entre trechos de flanqueamento mais conservados conhecidos como regiões framework ou FRs. Dessa forma, o termo FR se refere às sequências de aminoácidos que são encontradas naturalmente entre e adjacentes às regiões hipervariáveis em imunoglobulinas. Em uma molécula de anticorpo humano, as três regiões hipervariáveis de uma cadeia leve e as três regiões hipervariáveis de uma cadeia pesada estão dispostas em relação umas às outras no espaço tridimensional para formar uma superficie de ligação ao antigeno. A superficie de ligação ao antigeno é complementar à superficie tridimensional de um antigeno ligado, e as três regiões hipervariáveis de cada uma das cadeias pesadas e leves são referidas como regiões determinantes de complementaridade ou CDRs. Em certos animais, por exemplo, camelos e peixes cartilaginosos, o sitio de ligação ao antigeno é formado por uma única cadeia de anticorpo, fornecendo um anticorpo de dominio único. Sitios de ligação ao antigeno podem existir em um anticorpo intacto, em um fragmento de ligação ao antigeno de um anticorpo que retém a superficie de ligação ao antigeno, ou em um polipeptideo recombinante como, por exemplo, um scFv, usando um vinculador peptidico para conectar o dominio variável da cadeia pesada ao dominio variável da cadeia leve em um único polipeptideo.
[076] O termo antigeno tumor-associado, como usado nesse relatório descritivo, significa qualquer antigeno incluindo, sem limitação, uma proteina, glicoproteina,
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20/112 gangliosideo, carboidrato, lipideo, que está associado com câncer. Esse antígeno pode ser expresso em células malignas ou no microambiente tumoral como, por exemplo, em vasos sanguíneos associados ao tumor, matriz extracelular, estroma mesenquimal ou infiltrados imunes.
[077] Como usados nesse relatório descritivo, os termos indivíduo e paciente se referem a um organismo a ser tratado pelos métodos e composições descritos nesse relatório descritivo. Esses organismos preferivelmente incluem, sem limitação, mamíferos (por exemplo, murideos, simios, equinos, bovinos, suinos, caninos, felinos e semelhantes) e, mais preferivelmente, incluem humanos.
[078] Como usado nesse relatório descritivo, o termo quantidade eficaz se refere à quantidade de um composto (por exemplo, um composto da presente invenção) suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens e não visa ser limitada a uma formulação ou via de administração particular. Como usado nesse relatório descritivo, o termo tratamento inclui qualquer efeito, por exemplo, diminuição, redução, modulação, melhora ou eliminação, que resulta na melhora da condição, doença, distúrbio e semelhantes, ou na melhora de um sintoma deste.
[079] Como usado nesse relatório descritivo, o termo composição farmacêutica se refere à combinação de um agente ativo com um carreador, inerte ou ativo, tornando a composição especialmente adequada para uso diagnóstico ou terapêutico in vivo ou ex vivo.
[080] Como usado nesse relatório descritivo, o termo
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21/112 carreador farmaceuticamente aceitável se refere a qualquer um dos carreadores farmacêuticos padronizados, por exemplo, uma solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões (como, por exemplo, emulsões óleo/água ou água/óleo), e vários tipos de agentes umidificantes. As composições também podem incluir estabilizantes e conservantes. Por exemplos de carreadores, estabilizantes e adjuvantes, veja, por exemplo, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a Edição, Mack Publ. Co., Easton, PA [1975].
[081] Como usado nesse relatório descritivo, o termo sal farmaceuticamente aceitável se refere a qualquer sal farmaceuticamente aceitável (por exemplo, ácido ou base) de um composto da presente invenção que, após administração a um indivíduo, é capaz de fornecer um composto dessa invenção ou um metabólito ativo ou resíduo deste. Como é conhecido por aqueles habilitados na técnica, sais dos compostos da presente invenção podem ser derivados de ácidos e bases inorgânicos ou orgânicos. Ácidos exemplares incluem, sem limitação, ácido clorídrico, hidrobrômico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maléico, fosfórico, glicólico, lático, salicílico, succínico, tolueno-psulfônico, tartárico, acético, cítrico, metanossulfônico, etanossulfônico, fórmico, benzóico, malônico, naftaleno-2sulfônico, benzenossulfônico e semelhantes. Outros ácidos, por exemplo, oxálico, embora eles próprios não sejam farmaceuticamente aceitáveis, podem ser empregados na preparação de sais úteis como intermediários na obtenção dos compostos da invenção e seus sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveis.
[082] Bases exemplares incluem, sem limitação,
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22/112 hidróxidos de metal alcalino (por exemplo, sódio), hidróxidos de metal alcalino terroso (por exemplo, magnésio) , amônia, e compostos de fórmula NW4+, em que W é Ci-4 alquil e semelhantes.
[083] Sais exemplares incluem, sem imitação: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, benzenossulfonato, bissulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, cloridrato, hidrobrometo, hidroiodeto, 2-hidroxietanossulfonato, lactato, maleato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato, undecanoato e semelhantes. Outros exemplos de sais incluem ânions dos compostos da presente invenção formados com um cátion adequado como, por exemplo, Na+, NÜ4+ e NW4+ (em que W é um grupo C1-4 alquil) e semelhantes.
[084] Para uso terapêutico, os sais dos compostos da presente invenção são contemplados com sendo farmaceuticamente aceitáveis. No entanto, sais de ácidos e bases que não são farmaceuticamente aceitáveis também podem encontrar utilidade, por exemplo, na preparação ou purificação de um composto farmaceuticamente aceitável.
[085] Ao longo da descrição, quando composições são descritas como tendo, incluindo ou compreendendo componentes especificos, ou quando processos e métodos são descritos como tendo, incluindo ou compreendendo etapas especificas, é contemplado que, adicionalmente, há composições da
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23/112 presente invenção que consistem basicamente, ou consistem, nos componentes citados, e que há processos e métodos de acordo com a presente invenção que consistem basicamente, ou consistem, nas etapas de processamento citadas.
[086] Como uma questão geral, composições que especificam uma percentagem são por peso, salvo especificação em contrário. Além disso, se uma variável não é acompanhada por uma definição, então a definição prévia da variável predomina.
I. PROTEÍNAS [087] A invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao HER2 em uma célula de câncer e ao receptor NKG2D e receptor CD16 em células natural killer para ativar a célula natural killer. As proteínas de ligação multiespecíficas são úteis nas composições farmacêuticas e métodos terapêuticos descritos nesse relatório descritivo. A ligação da proteína de ligação multiespecífica ao receptor NKG2D e receptor CD16 em células natural killer aumenta a atividade da célula natural killer em direção à destruição de uma célula de câncer. A ligação da proteína de ligação multiespecífica a HER2 em uma célula de câncer coloca a célula de câncer próxima à célula natural killer, o que facilita a destruição direta e indireta da célula de câncer pela célula natural killer. Descrição adicional de proteínas de ligação multiespecíficas exemplares é fornecida abaixo.
[088] O primeiro componente das proteínas de ligação multiespecíficas se liga às células que expressam o receptor NKG2D, que podem incluir, sem imitação, células NK, células T γδ e células T CD8+ αβ . Mediante ligação ao NKG2D, as proteínas de ligação multiespecíficas podem bloquear
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24/112 ligantes naturais, por exemplo, ULBP6 e MICA, da ligação ao NKG2D e receptores de ativação NKG2D.
[089] O segundo componente das proteínas de ligação multiespecíficas se liga às células que expressam HER2, que podem incluir sem limitação, cânceres de mama, ovariano, esofágico, da bexiga e gástrico, carcinoma do dueto salivar, adenocarcinoma do pulmão e formas agressivas de câncer uterino, por exemplo, carcinoma endometrial seroso uterino.
[090] O terceiro componente para as proteínas de ligação multiespecíficas se liga às células que expressam CD16, um receptor Fc na superfície de leucócitos, incluindo células natural killer, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, mastócitos e células dendríticas foliculares.
[091] As proteínas de ligação multiespecíficas descritas nesse relatório descritivo podem assumir vários formatos. Por exemplo, um formato é um anticorpo multiespecífico, heterodimérico, que inclui uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina, uma primeira cadeia leve de imunoglobulina, uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina e uma segunda cadeia leve de imunoglobulina (FIG. 1) . A primeira cadeia pesada de imunoglobulina inclui um primeiro domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3), um primeiro domínio variável da cadeia pesada e, opcionalmente, um primeiro domínio da cadeia pesada CHI. A primeira cadeia leve de imunoglobulina inclui um primeiro domínio variável da cadeia leve e uma primeira cadeia leve domínio constante. A primeira cadeia leve de imunoglobulina, junto com a primeira cadeia pesada de imunoglobulina, forma um sítio de ligação ao antígeno que se liga ao NKG2D. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina compreende um segundo domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3), um
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25/112 segundo domínio variável da cadeia pesada e opcionalmente um segundo domínio da cadeia pesada CHI. A segunda cadeia leve de imunoglobulina inclui um segundo domínio variável da cadeia leve e uma segunda cadeia leve domínio constante. A segunda cadeia leve de imunoglobulina, junto com a segunda cadeia pesada de imunoglobulina, forma um sítio de ligação ao antígeno que se liga a HER2 . 0 primeiro domínio Fc e segundo domínio Fc juntos são capazes de se ligar ao CD16 (FIG. 1). Em algumas modalidades, a primeira cadeia leve de imunoglobulina pode ser idêntica à segunda cadeia leve de imunoglobulina.
[092] Outro formato exemplar envolve um anticorpo multiespecífico, heterodimérico, que inclui uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina, uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina e uma cadeia leve de imunoglobulina (FIG. 2) . A primeira cadeia pesada de imunoglobulina inclui um primeiro domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3) fundido por meio de um vinculador ou uma dobradiça de anticorpo a um fragmento variável de cadeia única (scFv) composto por um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve que pareiam e se ligam ao NKG2D ou HER2. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina inclui um segundo domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3), um segundo domínio variável da cadeia pesada e, opcionalmente, um domínio da cadeia pesada CHI. A cadeia leve de imunoglobulina inclui um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina pareia com a cadeia leve de imunoglobulina e se liga ao NKG2D ou HER2. O primeiro domínio Fc e o segundo domínio Fc juntos são capazes de se ligar ao CD16 (FIG. 2).
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26/112 [093] Um ou mais motivos de ligação adicionais podem ser fundidos ao terminal-C do dominio CH3 da região constante, opcionalmente por meio de uma sequência vinculadora. Em certas modalidades, o sitio de ligação ao antigeno poderia ser uma cadeia única ou região variável estabilizada por dissulfeto (scFv) ou poderia formar uma molécula tetravalente ou trivalente.
[094] Em algumas modalidades, a proteina de ligação multiespecifica está na forma de Triomab, que é um anticorpo biespecifico, trifuncional, que mantém um formato IgG-like. Essa quimera consiste em duas metades de anticorpos, cada uma com uma cadeia leve e uma cadeia pesada, que se originam de dois anticorpos parentais.
[095] Em algumas modalidades, a proteina de ligação multiespecifica é a forma de Cadeia Leve Comum (LC) KiH, que envolve a tecnologia knobs-into-holes (KIHs). O KIH envolve a modificação por engenharia genética de dominios CH3 para criar uma protuberância ou um orificio em cada cadeia pesada para promover heterodimerização. O conceito por trás da tecnologia de Fc Knobs-into-Holes (KiH) foi introduzir uma protuberância em um dominio CH3 (CH3A) por substituição de um residue pequeno com um volumoso (por exemplo, T366Wch3a na numeração de EU) . Para acomodar a protuberância, uma superficie complementar de orificio foi criada no outro dominio CH3 (CH3B) por substituição dos residues vizinhos mais próximos à protuberância por uns menores (por exemplo, T366S/L368A/Y407Vch3b) . A mutação de orificio foi otimizada por pesquisa guiada-estruturada de biblioteca de fago (Atwell S., Ridgway J.B., Wells J.A., Carter P., Stable Heterodimers from Remodeling the Domain
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Interface of a Homodimer Using a Phage Display Library, J. Mol. Biol. (1997) 270 (1) : 26-35) . As estruturas cristais por raios-X de variantes de Fc KiH (Elliott J.M., Ultsch M,. Lee J., Tong R., Takeda K., Spiess C., e cols., Antiparallel Conformation of Knob and Hole Aglycosylated Half-Antibody Homodimers is Mediated by a CH2-CH3 Hydrophobic Interaction. J. Mol. Biol. (2014) 426 (9) : 1.947-57; Mimoto F., Kadono S., Katada H., Igawa T., Kamikawa T., Hattori K. Crystal Structure of a Novel Asymmetrically Engineered Fc Variant with Improved Affinity for FcgammaRs. Mol. Immunol. (2014) 58 (1): 132-8) demonstraram que a heterodimerização é termodinamicamente favorecida por interações hidrofóbicas dirigidas por complementaridade estérica na interface central interdominio CH3, enquanto as interfaces protuberância-protuberância e as interfaces orificio-orificio não favorecem a homodimerização em consequência de impedimento estérico e ruptura das interações favoráveis, respectivamente.
[096] Em algumas modalidades, a proteina de ligação multiespecifica está na forma de imunoglobulina de dominio variável duplo (DVD-Ig™), que combina os dominios de ligação ao alvo de dois anticorpos monoclonais por meio de vinculadores flexíveis de ocorrência natural, e gera uma molécula tetravalente IgG-like.
[097] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecifica está na forma de interface de Fab Ortogonal (Orto-Fab). Na abordagem de IgG de orto-Fab (Lewis S.M., Wu X., Pustilnik A., Sereno A., Huang F., Rick H.L., e cols., Generation of Bispecific IgG Antibody by StructureBased Design of an Orthogonal Fab Interface. Nat.
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Biotechnol. (2014) 32 (2): 191-8), o design regional baseado em estrutura introduz mutações complementares na interface LC e HCvh-chi em apenas um Fab, não sendo feita nenhuma alteração no outro Fab.
[098] Em algumas modalidades, a proteina de ligação multiespecifica está no formato de Ig 2-em-l. Em algumas modalidades, a proteina de ligação multiespecifica está na forma de ES, que é uma construção heterodimérica que contém dois Fabs diferentes de ligação aos alvos 1 e alvo 2 fundidos ao Fc. A heterodimerização é assegurada por direção eletrostática mutações no Fc. Em algumas modalidades, a proteina de ligação multiespecifica está na forma de kàCorpo, que é uma construção heterodimérica com dois Fabs diferentes fundidos ao Fc estabilizado por mutações de heterodimerização: Fabl direcionado ao antigeno 1 contém LC kappa, enquanto o segundo Fab direcionado ao antigeno 2 contém LC lambda. A FIG. 49A é uma representação exemplar de uma forma de um KÀ-Corpo; a FIG. 4 9B é uma representação exemplar de outro KÀ-Corpo.
[099] Em algumas modalidades, a proteina de ligação multiespecifica está em forma de uma Troca de Braço de Fab (anticorpos que trocam braços de Fab por troca de uma cadeia pesada e cadeia leve anexada (meia-molécula) com um par de cadeia pesada-leve de outra molécula, o que resulta em anticorpos biespecificos). Em algumas modalidades, a proteina de ligação multiespecifica está na forma de Corpo SEED. A plataforma de dominio modificado por engenharia genética por troca de fitas (SEED) foi projetada para gerar moléculas assimétricas e anticorpo biespecifico-like, uma capacidade que expande as aplicações terapêuticas de
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29/112 anticorpos naturais. Essa plataforma de modificação por engenharia genética de proteínas se baseia na troca de sequências de imunoglobulina dentro dos domínios CH3 conservados. 0 design de SEED permite a geração eficiente de heterodímeros de AG/GA, enquanto desfavorece a homodimerização de domínios CH3 SEED AG e GA. (Muda M. e cols., Protein Eng. Des. Sei. (2011, 24 (5): 447-54)). Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de LuZ-Y, na qual um zíper de leucina é usado para induzir heterodimerização de duas HCs diferentes. (Wranik, BJ. e cols., J. Biol. Chem. (2012), 287: 43.331-9).
[100] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de Cov-X-Corpo. Em CovX-Corpos biespecíficos, dois peptídeos diferentes são unidos juntos usando um vinculador de azetidinona ramificado e fundido ao anticorpo de arcabouço sob condições suaves de uma forma sítio-específica. Enquanto os farmacóforos são responsáveis por atividades funcionais, o arcabouço de anticorpo transmite meia-vida longa e distribuição Ig-like. Os farmacóforos podem ser otimizados quimicamente ou substituídos com outros farmacóforos para gerar anticorpos biespecíficos otimizados ou únicos (Doppalapudi V.R. e cols., PNAS (2010), 107 (52); 22.611-22.616).
[101] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está em uma forma heterodimérica Oasc-Fab que inclui Fab de ligação ao alvo 1, e scFab de ligação ao alvo 2 fundidos ao Fc. A heterodimerização é assegurada por mutações no Fc.
[102] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecí fica está em forma de um DuetMab, que é uma
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30/112 construção heterodimérica que contém dois Fabs de ligação aos antigenos 1 e 2 diferentes, e Fc estabilizado por mutações de heterodimerização. Fab 1 e 2 contêm pontes S-S diferenciais que asseguram pareamento de LC e HC correto.
[103] Em algumas modalidades, a proteina de ligação mult iespecif ica está em forma de um CrossmAb, que é uma construção heterodimérica com dois Fabs de ligação aos alvos e 2 diferentes, fundidos ao Fc estabilizado por heterodimerização. Dominios CL e CHI e dominios VH e VL são trocados, por exemplo, CHI é fundida alinhada com VL, enquanto CL é fundida alinhada com VH.
[104] Em algumas modalidades, a proteina de ligação mult iespecif ica está em forma de um Fit-Ig, que é uma construção homodimérica na qual Fab de ligação ao antigeno é fundido ao terminal-N da HC de Fab que se liga ao antigeno 1. A construção contém Fc do tipo selvagem.
[105] Formatos adicionais das proteínas de ligação multiespecificas podem ser planejados por combinação de vários formatos de fragmentos de ligação ao NKG2D e ao HER2 descritos nesse relatório descritivo.
[106] A Tabela 1 lista sequências de peptídeos de domínios variáveis da cadeia pesada e domínios variáveis da cadeia leve que, em combinação, podem se ligar ao NKG2D.
Tabela 1
Clones Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve
ADI—27705 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS DIQMTQSPSTLSASVGDRVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPGK APKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFA
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VTAADTAVYYCARARGPWSFD PWGQGTLVTVSS CDR1 (ID. DE SEQ. N° : 62) - GSFSGYYWS CDR2 (ID. DE SEQ. N° : 63) EIDHSGSTNYNPSLKS CDR3 (ID. DE SEQ. N° : 64) ARARGPWSFDP TYYCQQYNSYPITFGGGTKVE IK (ID. DE SEQ. N°: 2)
ADI-27724 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFD PWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°: 3) EIVLTQSPGTLSLSPGERATL SCRASQSVSSSYLAWYQQKPG QAPRLLIYGASSRATGIPDRF SGSGSGTDFTLTISRLEPEDF AVYYCQQYGSSPITFGGGTKV EIK (ID. DE SEQ. N°: 4)
ADI-27740 (A40) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFD PWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N° :5) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTI TCRASQSIGSWLAWYQQKP GK APKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFA TYYCQQYHSFYTFGGGTKVEI K (ID. DE SEQ. N° :6)
ADI-27741 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFD PWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N° :7) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTI TCRASQSIGSWLAWYQQKP GK APKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFA TYYCQQSNSYYTFGGGTKVEI K (ID. DE SEQ. N° :8)
ADI-27743 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG DIQMTQSPSTLSASVGDRVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPGK
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KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFD PWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N° :9) APKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFA TYYCQQYNSYPTFGGGTKVEI K (ID. DE SEQ. N° :10)
ADI-28153 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAAD TAVYYCARARGP WGF D PWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N° :11) ELQMTQSPSSLSASVGDRVTI TCRTSQSISSYLNWYQQKPGQ PPKLLIYWASTRESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDSA TYYCQQSYDIPYTFGQGTKLE IK (ID. DE SEQ. N° :12)
ADI-28226 (C26) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFD PWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N° :13) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPGK APKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFA TYYCQQYGSFPITFGGGTKVE IK (ID. DE SEQ. N° :14)
ADI-28154 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFD PWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N° :15) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPGK APKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPDDFA TYYCQQSKEVPWTFGQGTKVE IK (ID. DE SEQ. N° :16)
ADI-29399 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFD PWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N° :17) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPGK APKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFA TYYCQQYNSFPTFGGGTKVEI K (ID. DE SEQ. N° :18)
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ADI-29401 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFD PWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N° :19) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTI TCRASQSIGSWLAWYQQKP GK APKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFA TYYCQQYDIYPTFGGGTKVEI K (ID. DE SEQ. N° :20)
ADI-29403 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFD PWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N° :21) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPGK APKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFA TYYCQQYDSYPTFGGGTKVEI K (ID. DE SEQ. N° :22)
ADI-29405 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFD PWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N° :23) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPGK APKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFA TYYCQQYGSFPTFGGGTKVEI K (ID. DE SEQ. N° :24)
ADI-29407 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFD PWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N° :25) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPGK APKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFA TYYCQQYQSFPTFGGGTKVEI K (ID. DE SEQ. N° :26)
ADI-29419 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFD PWGQGTLVTVSS DIQMTQSPSTLSASVGDRVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPGK APKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFA TYYCQQYSSFSTFGGGTKVEI K
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(ID. DE SEQ. N° :27) (ID. DE SEQ. N° :28)
ADI-29421 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFD PWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N° :29) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPGK APKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFA TYYCQQYESYSTFGGGTKVEI K (ID. DE SEQ. N° :30)
ADI-29424 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFD PWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N° :31) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPGK APKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFA TYYCQQYDSFITFGGGTKVEI K (ID. DE SEQ. N° :32)
ADI-29425 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFD PWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N° :33) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPGK APKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFA TYYCQQYQSYPTFGGGTKVEI K (ID. DE SEQ. N° :34)
ADI-29426 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFD PWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N° :35) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTI TCRASQSIGSWLAWYQQKP GK APKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFA TYYCQQYHSFPTFGGGTKVEI K (ID. DE SEQ. N° :36)
ADI-29429 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS DIQMTQSPSTLSASVGDRVTI TCRASQSIGSWLAWYQQKP GK APKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFA
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VTAADTAVYYCARARGPWSFD PWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N° :37) TYYCQQYELYSYTFGGGTKVE IK (ID. DE SEQ. N° :38)
ADI-29447 (F47) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFD PWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N° :39) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPGK APKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFA TYYCQQYDTFITFGGGTKVEI K (ID. DE SEQ. N° :40)
ADI-27727 QVQLVQ S GAEVKKP G S SVKVS CKAS GGTF S SYAISWVRQAP G QGLEWMGGIIPIFGTANYAQK FQGRVTITADESTSTAYMELS SLRSEDTAVYYCARGDSSIRH AYYYYGMDVWGQGTTVTVSS (ID. DE SEQ. N° :41) CDR1 (ID. DE SEQ. N° : 65) GTFSSYAIS CDR2 (ID. DE SEQ. N° : 66) - G11PIF GTANYAQKFQG CDR3 (ID. DE SEQ. N° :67) - ARGD SSIRHAYYYYGMDV DIVMTQSPDSLAVSLGERATI NCKSSQSVLYSSNNKNYLAWY QQKPGQPPKLLIYWASTRESG VPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QAEDVAVYYCQQYYSTPITFG GGTKVEIK (ID. DE SEQ. N° :42) CDR1 (ID. DE SEQ. N° :68) KSSQSVLYSSNNKNYLA CDR2 (ID. DE SEQ. N° : 69) WASTRES CDR3 (ID. DE SEQ. N° :70) QQYYSTPIT
ADI-29443 (F43) QLQLQESGPGLVKPSETLSLT CTVSGGSISSSSYYWGWIRQP PGKGLEWIGSIYYSGSTYYNP SLKSRVTISVDTSKNQFSLKL S SVTAAD TAVYYCARG S D RF H PYFDYWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N° :43) EIVLTQSPATLSLSPGERATL SCRASQSVSRYLAWYQQKPGQ APRLLIYDASNRATGIPARFS GSGSGTDFTLTISSLEPEDFA VYYCQQFDTWPPTFGGGTKVE IK (ID. DE SEQ. N° :44)
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CDR1 (ID. DE SEQ. N° :71) - GSISSSSYYWG CDR2 (ID. DE SEQ. N° :72) - SIYYSGSTYYNPSLKS CDR3 (ID. DE SEQ. N° :73) - ARGSDRFHPYFDY CDR1 (ID. DE SEQ. N° :74) - RASQSVSRYLA CDR2 (ID. DE SEQ. N° :75) - DASNRAT CDR3 (ID. DE SEQ. N° :76) - QQFDTWPPT
ADI-29404 (F04) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLT CAVYGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEIDHSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFD PWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N° :89) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPGK APKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFA TYYCEQYDSYPTFGGGTKVEI K (ID. DE SEQ. N° :90)
ADI-28200 QVQLVQ S GAEVKKP G S SVKVS CKAS GGTF S SYAISWVRQAP G QGLEWMGGIIPIFGTANYAQK FQGRVTITADESTSTAYMELS SLRSEDTAVYYCARRGRKASG SFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS (ID. DE SEQ. N° :91) DIVMTQSPDSLAVSLGERATI NCESSQSLLNSGNQKNYLTWY QQKPGQPPKPLIYWASTRESG VPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QAEDVAVYYCQNDYSYPYTFG QGTKLEIK (ID. DE SEQ. N° :92)
ADI-29379 (E79) QVQLVQ S GAEVKKP GASVKVS CKASGYTFTSYYMHWVRQAPG QGLEWMGIINPSGGSTSYAQK FQGRVTMTRD T S T S TVYME L S SLRSEDTAVYYCARGAPNYGD TTHDYYYMDVWGKGTTVTVSS (ID. DE SEQ. N° :94) CDR1 (ID. DE SEQ. N° :96) - YTFTSYYMH EIVMTQSPATLSVSPGERATL SCRASQSVSSNLAWYQQKPGQ APRLLIYGASTRATGIPARFS GSGSGTEFTLTISSLQSEDFA VYYCQQYDDWPFTFGGGTKVE IK (ID. DE SEQ. N° :95) CDR1 (ID. DE SEQ. N° :99) - RASQSVSSNLA CDR2 (ID. DE SEQ. N° :100) - GASTRAT
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CDR2 (ID. DE SEQ. N° : 97) - IINPSGGSTSYAQKFQG CDR3 (ID. DE SEQ. N° :98) - ARGAPNYGDTTHDYYYMDV CDR3 (ID. DE SEQ. N° :101) - QQYDDWPFT
ADI—27749 (A49) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLS CAASGFTFSSYSMNWVRQAPG KGLEWVSSISSSSSYIYYADS VKGRFTISRDNAKNSLYLQMN SLRAEDTAVYYCARGAPMGAA AGWFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N° :102) CDR1 (ID. DE SEQ. N° :104) - FTFSSYSMN CDR2 (ID. DE SEQ. N° :105) SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 (ID. DE SEQ. N° :106) - ARGAPMGAAAGWFDP DIQMTQSPSSVSASVGDRVTI TCRASQGISSWLAWYQQKPGK APKLLIYAASSLQSGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQGVSFPRTFGGGTKVE IK (ID. DE SEQ. N° :103) CDR1 (ID. DE SEQ. N° :107) - RASQGISSWLA CDR2 (ID. DE SEQ. N° :108) - AASSLQS CDR3 (ID. DE SEQ. N° :109) - QQGVSFPRT
[107] Alternativamente, um domínio variável da cadeia pesada definido pelo ID. DE SEQ. N°: 45 pode ser pareado com um domínio variável da cadeia leve definido pelo ID. DE SEQ. N°: 46 para formar um sítio de ligação ao antígeno que pode se ligar ao NKG2D, como ilustrado em US 9.273.136.
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVT VSS (ID. DE SEQ. N°: 45) QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGV SDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL (ID. DE
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SEQ. N°: 46) [108] Alternativamente, um dominie variável da cadeia pesada definido pelo ID. DE SEQ. N°: 47 pode ser pareado com um dominio variável da cadeia leve definido pelo ID. DE SEQ. N°: 48 para formar um sitio de ligação ao antigeno que pode se ligar ao NKG2D, como ilustrado em US 7.879.985.
QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGHISYSGSANY NPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIWGQGTMVTVSS (ID. DE SEQ. N°: 47)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 48) [109] A Tabela 2 lista sequências de peptideos de dominios variáveis da cadeia pesada e dominios variáveis da cadeia leve que, em combinação, podem se ligar ao HER2.
Tabela 2
Clones Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada Sequência de aminoácidos do dominio variável da cadeia leve
Trastuzumab EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS CAASGFNIKDTYIHWVRQAPG KGLEWVARIYP TNGYTRYAD S VKGRFTISADTSKNTAYLQMN SLRAEDTAVYYCSRWGGDGFY AMDYWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°: 49) CDR1(ID. DE SEQ. N°: 50) - GFNIKDT CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 51) - YPTNGY CDR3 (ID. DE SEQ. N°: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TCRASQDVNTAVAWYQQKPGK APKLLIYSASFLYSGVPSRFS GSRSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQHYTTPPTFGQGTKVE IK (ID. DE SEQ. N°: 53) CDR1(ID. DE SEQ. N°: 54) - QDVNTAVA CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 55) - SASFLYS CDR3 (ID. DE SEQ. N°:
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52) - WGGDGFYAMDY 56) - QQHYTTPPT
Pertuzumab EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS CAASGFTFTDYTMDWVRQAPG KGLEWVADVNPNSGGSIYNQR FKGRFTLSVDRSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYYCARNLGPSFY FDYWGQGTLVTVSSA (ID. DE SEQ. N°: 57) CDR1 (ID. DE SEQ. N° : 77) - GFTFTDY CDR2 (ID. DE SEQ. N° : 78) - NPNSGG CDR3 (ID. DE SEQ. N° : 79) - NLGPSFYFDY DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TCKASQDVSIGVAWYQQKP GK AP KL LIYSASYRYTGVP SRF S GSGSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQYYIYPYTFGQGTKVE IKR (ID. DE SEQ. N°: 58) CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 80) - QDVSIGVA CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 81) - SASYRYT CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 82) - QQYYIYPYT
MGAH22 (US 8.802.093) QVQLQQSGPELVKPGASLKLS CTASGFNIKDTYIHWVKQRPE QGLEWIGRIYPTNGYTRYDPK FQDKATITADTSSNTAYLQVS RLTSEDTAVYYCSRWGGDGFY AMDYWGQGASVTVSSA (ID. DE SEQ. N°: 59) CDR1 (ID. DE SEQ. N° : 83) - GFNIKDT CDR2 (ID. DE SEQ. N° : 84) - YPTNGY CDR3 (ID. DE SEQ. N° : 85) - WGGDGFYAMDY DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSI TCKASQDVNTAVAWYQQKPGH SPKLLIYSASFRYTGVPDRFT GSRSGTDFTFTISSVQAEDLA VYYCQQHYTTPPTFGGGTKVE IKR (ID. DE SEQ. N°: 60) CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 86) - QDVNTAVA CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 87) - SASFRYT CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 88) - QQHYTTPPT
[110] Alternativamente, novos sitios de ligação ao antigeno que podem se ligar ao HER2 podem ser identificados por avaliação da ligação à sequência de aminoácidos definida pelo ID. DE SEQ. N° : 61.
MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQWQGN LELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLD
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NGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNN QLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCC HEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASC VTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVR AVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYIS AWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNT HLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNC SQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHY KDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRAS PLTSIISAWGILLVWLGWFGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPN QAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEI LDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWC MQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVP IKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQP PICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFWIQNEDLGPASPLDST FYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLG LEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLP SETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPGKNGV VKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKG TPTAENPEYLGLDVPV (ID. DE SEQ. N°: 61).
[Ill] Dentro do domínio Fc, a ligação ao CD16 é mediada pela região de dobradiça e pelo domínio CH2. Por exemplo, dentro de IgGl humana, a interação com CD16 é primariamente concentrada nos resíduos de aminoácidos Asp 265 - Glu 269, Asn 297 - Thr 299, Ala 327 - Ile 332, Leu 234 - Ser 239, e resíduo de carboidrato N-acetil-D-glicosamina no domínio CH2 (veja, Sondermann e cols., Nature, 406 (6793): 267-273). Com base nos domínios conhecidos, podem ser selecionadas mutações para aumentar ou reduzir a afinidade de ligação ao CD16, por exemplo, por utilização de bibliotecas exibidas em
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41/112 fago ou bibliotecas de cDNA exibidas na superfície de levedura, ou podem ser projetadas com base na estrutura tridimensional conhecida da interação.
[112] A montagem de cadeias pesadas de anticorpo heterodimérico pode ser obtida por expressão de duas sequências da cadeia pesada de anticorpo diferentes na mesma célula, o que pode levar à montagem de homodímeros de cada cadeia pesada de anticorpo, bem como à montagem de heterodímeros. A promoção da montagem preferencial de heterodímeros pode ser obtida por incorporação de mutações diferentes no domínio CH3 de cada região constante da cadeia pesada de anticorpo, como mostrado em US13/494870, US16/028850, US11/533709, US12/875015, US13/289934, US14/773418, US12/811207, US13/866756, US14/647480 e US14/830336. Por exemplo, podem ser feitas mutações no domínio CH3 com base em IgGl humana e incorporação de pares distintos de substituições de aminoácidos dentro de um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, o que permite que essas duas cadeias heterodimerizem seletivamente entre elas. As posições de substituições de aminoácidos ilustradas abaixo são todas numeradas de acordo com o índice de EU como em Kabat.
[113] Em um cenário, uma substituição de aminoácido no primeiro polipeptídeo substitui o aminoácido original com um aminoácido maior, selecionado de arginina (R), fenilalanina (F) , tirosina (Y) ou triptofano (W) , e pelo menos uma substituição de aminoácido no segundo polipeptídeo substitui o aminoácido (ou aminoácidos) original com um aminoácido (ou aminoácidos) menor, escolhido de alanina (A), serina (S) , treonina (T) ou valina (V) , de modo que a substituição do
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42/112 aminoácido maior (uma protuberância) se ajuste na superfície das substituições de aminoácidos maiores (uma cavidade). Por exemplo, um polipeptídeo pode incorporar uma substituição T366W, e o outro pode incorporar três substituições que incluem T366S, L368A e Y407V.
[114] Um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo da invenção pode opcionalmente ser acoplado a uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma região constante de anticorpo, por exemplo, uma região constante de IgG que inclui domínios de dobradiça, CH2 e CH3 com ou sem domínio CHI. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da região constante é pelo menos 90% idêntica a uma região constante de anticorpo humano, por exemplo, uma região constante de IgGl humana, uma região constante de IgG2, região constante de IgG3 ou região constante de IgG4. Em algumas outras modalidades, a sequência de aminoácidos da região constante é pelo menos 90% idêntica a uma região constante de anticorpo de outro mamífero, por exemplo, coelho, cão, gato, camundongo ou cavalo. Uma ou mais mutações podem ser incorporadas na região constante, comparada com a
região constante de IgGl humana, por exemplo, em Q347, Y349,
L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T36 6, L368, K370,
N390, K392, T3 94, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411
e/ou K439. Substituições exemplares incluem, por exemplo,
Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C,
T350V, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L,
E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D,
T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E,
L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V,
K392F, K392D, K392E, T394F, T394W, D399R, D399K, D399V,
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S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I , Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D e K439E.
[115] Em certas modalidades, mutações que podem ser incorporadas na CHI de uma região constante de IgGl humana podem ser no aminoácido V125, F126, P127, T135, T139, A140, F170, P171 e/ou V173. Em certas modalidades, mutações que podem ser incorporadas na Ck de uma região constante de IgGl humana podem ser no aminoácido E123, F116, S176, V163, S174 e/ou TI 64 .
[116] Poderiam ser selecionadas substituições de aminoácidos dos conjuntos de substituições seguintes mostrados na Tabela 3.
Tabela 3
Primeiro polipeptideo Segundo polipeptideo
Conjunto 1 S364E/F405A Y349K/T394F
Conjunto 2 S364H/D401K Y349T/T411E
Conjunto 3 S364H/T394F Y349T/F405A
Conjunto 4 S364E/T394F Y349K/F405A
Conjunto 5 S364E/T411E Y349K/D401K
Conjunto 6 S364D/T394F Y349K/F405A
Conjunto 7 S364H/F405A Y349T/T394F
Conjunto 8 S364K/E357Q L368D/K370S
Conjunto 9 L368D/K370S S364K
Conjunto 10 L368E/K370S S364K
Conjunto 11 K360E/Q362E D401K
Conjunto 12 L368D/K370S S364K/E357L
Conjunto 13 K370S S364K/E357Q
Conjunto 14 F405L K409R
Conjunto 15 K409R F405L
[117] Alternativamente, substituições de aminoácidos poderiam ser selecionadas dos conjuntos de substituições
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44/112 seguintes mostrados na Tabela 4.
Tabela 4
Primeiro polipeptideo Segundo polipeptideo
Conjunto 1 K4 0 9W D399V/F405T
Conjunto 2 Y349S E357W
Conjunto 3 K360E Q347R
Conjunto 4 K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
Conjunto 5 Q347E/K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
Conjunto 6 Y349S/K409W E357W/D399V/F405T
[118] Alternativamente, substituições de aminoácidos poderiam ser selecionadas do conjunto de substituições seguinte mostrado na Tabela 5.
Tabela 5
Primeiro polipeptideo Segundo polipeptideo
Conjunto 1 T366K/L351K L351D/L368E
Conjunto 2 T366K/L351K L351D/Y349E
Conjunto 3 T366K/L351K L351D/Y349D
Conjunto 4 T366K/L351K L351D/Y349E/L368E
Conjunto 5 T366K/L351K L351D/Y349D/L368E
Conjunto 6 E356K/D399K K392D/K409D
[119] Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácido em cada cadeia polipeptídica poderia ser selecionada da Tabela 6.
Tabela 6
Primeiro polipeptideo Segundo polipeptideo
L351Y, D399R, D399K, S400K, T366V, T366I, T366L, T366M,
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S400R, Y407A, Y407I, Y407V N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F K392D, K392E, K409F, K409W, T411D e T411E
[120] Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácidos poderia ser selecionada do conjunto de substituições seguinte na Tabela 7, em que a posição (ou posições) indicada na coluna do Primeiro polipeptideo é substituida por qualquer aminoácido carregado negativamente conhecido, e a posição (ou posições) indicada na coluna do Segundo polipeptideo é substituida por qualquer aminoácido carregado positivamente conhecido.
Tabela 7
Primeiro polipeptideo Segundo polipeptideo
K392, K370, K409 ou K439 D399, E356 ou E357
[121] Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácidos poderia ser selecionada do conjunto de substituições seguinte na Tabela 8, em que a posição (ou posições) indicada na coluna do Primeiro polipeptideo é substituida por qualquer aminoácido carregado positivamente conhecido, e a posição (ou posições) indicada na coluna do Segundo polipeptideo é substituida por qualquer aminoácido carregado negativamente conhecido.
Tabela 8
Primeiro polipeptideo Segundo polipeptideo
D399, E356 ou E357 K409, K439, K370 ou K392
[122] Alternativamente, substituições de aminoácidos poderiam ser selecionadas do conjunto seguinte na Tabela 9.
Tabela 9
Primeiro polipeptideo Segundo polipeptideo
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T350V, L351Y, F405A e Y407V T350V, T366L, K392L e T394W
[123] Alternativamente, ou em adição, a estabilidade estrutural de uma proteina de heteromultimero pode ser aumentada por introdução de S354C na primeira ou segunda cadeia polipeptidica, e Y349C na cadeia polipeptidica oposta, o que forma uma ponte dissulfeto artificial dentro da interface dos dois polipeptideos.
[124] As proteinas multiespecificas descritas acima podem ser feitas usando tecnologia de DNA recombinante bem conhecida por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, uma primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica a primeira cadeia pesada de imunoglobulina pode ser clonada em um primeiro vetor de expressão; uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica a segunda cadeia pesada de imunoglobulina pode ser clonada em um segundo vetor de expressão; uma terceira sequência de ácidos nucleicos que codifica a cadeia leve de imunoglobulina pode ser clonada em um terceiro vetor de expressão; o primeiro, segundo e terceiro vetores de expressão podem ser transfectados estavelmente juntos em células hospedeiras para produzir as proteinas multiméricas.
[125] Para obter o maior rendimento da proteina multiespecifica, proporções diferentes do primeiro, segundo e terceiro vetores de expressão podem ser exploradas para determinar a proporção ótima para transfecção nas células hospedeiras. Após transfecção, clones únicos podem ser isolados para geração de banco de células usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, diluição limitada, ELISA, FACS, microscopia ou Clonepix.
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47/112 [126] Os clones podem ser cultivados sob condições adequadas para aumento de escala em biorreator e expressão mantida da proteina multiespecifica. As proteínas multiespecificas podem ser isoladas e purificadas usando métodos conhecidos na técnica, incluindo centrifugação, filtração profunda, lise de células, homogeneização, congelamento-descongelamento, afinidade purificação, filtração em gel, cromatografia de troca iônica, cromatografia por troca de interação hidrofóbica e cromatografia de modo misto.
II. Características das proteínas multiespecíficas [127] Em certas modalidades, as proteínas de ligação multiespecificas descritas nesse relatório descritivo, que incluem um domínio de ligação ao NKG2D e um domínio de ligação ao HER2, se ligam às células que expressam NKG2D humano. Em certas modalidades, as proteínas de ligação multiespecificas que incluem um domínio de ligação ao NKG2D e um domínio de ligação ao HER2, se ligam ao HER2 em um nível comparável com aquele de um anticorpo monoclonal que possui o mesmo domínio de ligação ao HER2. Por exemplo, as proteínas de ligação multiespecíficas que incluem um domínio de ligação ao NKG2D e um domínio de ligação ao HER2 de Trastuzumab podem se ligar ao HER2 expresso em células em um nível comparável com aquele de Trastuzumab.
[128] No entanto, as proteínas de ligação multiespecificas descritas nesse relatório descritivo são mais eficazes na redução do crescimento tumoral e morte de células de câncer. Por exemplo, uma proteína de ligação multiespecifica da presente revelação que visa células tumorais/cancerosas que expressam HER2 é mais eficaz do que
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SC2.2 — uma molécula biespecífica de cadeia única construída a partir de um scFv derivado de trastuzumab ligado a ULBP6, um ligante para NKG2D. SC2.2 se liga às células de câncer HER2+ e células NK NKG2D+ simultaneamente. Portanto, a eficácia de SC2.2 na redução do número de células de câncer HER2+ foi investigada. Ensaios de ativação e citotoxicidade in vitro demonstraram que SC2.2 foi eficaz na ativação e morte de células NK. No entanto, SC2.2 não demonstrou eficácia no modelo de tumor subcutâneo RMA/S-HER2. A eficácia de SC2.2 também foi testada in vivo usando um modelo em camundongo singênico que superexpressa RMA/S-HER2 (FIG. 36). Nesse modelo em camundongo, SC2.2 não demonstrou controle do crescimento tumoral, comparado com controle de veículo (FIG. 37). Dessa forma, embora SC2.2 fosse capaz de ativar e matar células NK, e se ligar às células de câncer HER2+, essas propriedades eram insuficientes para controlar eficazmente o crescimento de tumores HER2+.
[129] Em certas modalidades, as proteínas de ligação multiespecíficas descritas nesse relatório descritivo, que incluem um domínio de ligação ao NKG2D e um domínio de ligação para antígeno tumor-associado, ativam células NK humanas primárias quando cultivadas com células tumorais que expressam o antígeno. A ativação de célula NK é marcada pelo aumento na degranulação de CD107a e produção de citocina ΙΕΝγ. Além disso, comparado com um anticorpo monoclonal que inclui o domínio de ligação ao antígeno tumor-associado, as proteínas de ligação multiespecíficas mostram ativação superior de células NK humanas na presença de células tumorais que expressam o antígeno. Por exemplo, comparadas com o anticorpo monoclonal trastuzumab, as proteínas de
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49/112 ligação multiespecíficas da presente revelação possuem um domínio de ligação ao HER2, possuem uma ativação superior de células NK humanas na presença de células de câncer que expressam HER2.
[130] Em certas modalidades, as proteínas de ligação multiespecificas descritas nesse relatório descritivo, que incluem um domínio de ligação ao NKG2D e um domínio de ligação para a antígeno tumor-associado, aumentam a atividade de células NK humanas em repouso e ativadas por IL-2 na presença de células tumorais que expressam o antígeno. Células NK em repouso mostraram menos produção de ΙΕΝγ e degranulação de CD107a no nível de base do que células NK ativadas por IL-2. Em certas modalidades, células NK em repouso exibem uma alteração maior na produção de ΙΕΝγ e degranulação de CD107a, comparadas com células NK ativadas por IL-2. Em certas modalidades, células NK ativadas por IL2 exibem uma percentagem maior de células que se tornam IFNy-l-; CD107a+ após estimulação com TriNKETs.
[131] Em certas modalidades, as proteínas de ligação multiespecificas descritas nesse relatório descritivo, que incluem um domínio de ligação ao NKG2D e um domínio de ligação para a antígeno tumor-associado (exemplos não limitantes de antígenos tumor-associados incluindo CD20, BCMA e HER2), aumentam a atividade citotóxica de células NK humanas em repouso e ativadas por IL-2 na presença de células tumorais que expressam o antígeno. Além disso, as proteínas de ligação multiespecificas (por exemplo, proteína de ligação multiespecífica-A40, proteína de ligação multiespecífica-A49, proteína de ligação multiespecíficaC26, proteína de ligação multiespecífica-F04, proteína de
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50/112 ligação multiespecifica-F43, proteína de ligação multiespecífica-F47 e proteína de ligação multiespecíficaE79), que incluem um domínio de ligação para HER2, dirigem mais potentemente respostas de células NK ativadas e em repouso contra as células tumorais, comparado com um anticorpo monoclonal que inclui sítio de ligação ao HER2. Em certas modalidades, as proteínas de ligação multiespecíficas oferecem vantagens contra células tumorais que expressam de forma média e baixa HER2, comparadas com anticorpos monoclonais que possuem sítio de ligação ao HER2. Portanto, uma terapia que inclui proteínas de ligação multiespecíficas pode ser superior a uma terapia com anticorpo monoclonal.
[132] Em certas modalidades, comparadas com anticorpos monoclonais, as proteínas de ligação multiespecíficas descritas nesse relatório descritivo (por exemplo, proteína de ligação multiespecífica-A40, proteína de ligação multiespecífica-A49, proteína de ligação multiespecíficaC26, proteína de ligação multiespecífica-F04, proteína de ligação multiespecifica-F43, proteína de ligação multiespecífica-F47 e proteína de ligação multiespecíficaE7 9), que incluem um domínio de ligação para HER2 são vantajosas no tratamento de cânceres com expressão alta de receptor FC (FcR) , ou cânceres que residem em um microambiente tumoral com níveis altos de FCR. Anticorpos monoclonais exercem seus efeitos sobre o crescimento tumoral por meio de múltiplos mecanismos, incluindo ADCC, CDC, fagocitose e bloqueio de sinal, entre outros. Entre FcyRs, CD16 tem a menor afinidade para Fc de IgG; FcyRI (CD64) é o FcR de alta afinidade, que se liga cerca de 1.000 vezes mais fortemente ao Fc de IgG do que CD16. CD64 é normalmente
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51/112 expresso em muitas linhagens hematopoiéticas como, por exemplo, a linhagem mielóide, e pode ser expresso em tumores derivados desses tipos de células, por exemplo, leucemia mielóide aguda (AML). Células imunes que infiltram no tumor, tais como MDSCs e monócitos, também expressam CD64 e reconhecidamente infiltram o microambiente tumoral. A expressão de CD64 pelo tumor ou no microambiente tumoral pode ter um efeito prejudicial sobre a terapia com anticorpo monoclonal. A expressão de CD64 no microambiente tumoral torna difícil que esses anticorpos se liguem ao CD16 na superfície de células NK, as os anticorpos preferem se ligar ao receptor de alta afinidade. As proteínas de ligação multiespecíficas, por meio do direcionamento a dois receptores de ativação na superfície de células NK, podem superar o efeito prejudicial da expressão de CD64 (no tumor ou no microambiente tumoral) na terapia com anticorpo monoclonal. Independentemente da expressão de CD64 nas células tumorais, as proteínas de ligação multiespecíficas são capazes de mediar respostas de células NK humanas contra todas as células tumorais, pois o direcionamento duplo a dois receptores de ativação em células NK fornece ligação específica mais forte às células NK.
[133] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação multiespecíficas descritas nesse relatório descritivo (por exemplo, proteína de ligação multiespecífica-A40, proteína de ligação multiespecífica-A49, proteína de ligação multiespecífica-C26, proteína de ligação multiespecíficaF04, proteína de ligação multiespecífica-F43, proteína de ligação multiespecífica-F47 e proteína de ligação multiespecífica-E79) , que incluem um domínio de ligação para
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HER2, fornecem um perfil de segurança melhor por meio de efeitos colaterais no alvo/fora do tumor reduzidos. Células natural killer e células T CD8 são, ambas, capazes de lisar diretamente células tumorais, embora os mecanismos por meio dos quais células NK e células CD8 T reconhecem células próprias normais de células tumorais sejam diferentes. A atividade de células NK é regulada pelo equilíbrio de sinais de receptores de ativação (NCRs, NKG2D, CD16 etc.) e inibitórios (KIRs, NKG2A etc.). 0 equilíbrio desses sinais de ativação e inibitórios permite que as células NK diferenciem células próprias saudáveis de células próprias estressadas, infectadas por vírus ou transformadas. Esse mecanismo embutido de autotolerância irá ajudar a proteger tecido saudável normal de respostas de células NK. Para estender esse princípio, a autotolerância de células NK permitirá a ligação de proteínas de ligação multiespecíficas a antígenos-alvo expressos tanto próprios quanto tumorais sem efeitos colaterais fora do tumor, ou com uma janela terapêutica aumentada. Diferentemente de células natural killer, células T exigem o reconhecimento de um peptídeo específico apresentado por moléculas MHC para ativação e funções efetoras. Células T foram o alvo primário da imunoterapia, e muitas estratégias foram desenvolvidas para redirecionar respostas de célula T contra o tumor. Biespecíficos de célula T, inibidores do ponto de verificação e células CAR-T foram todos aprovados pelo FDA (Food and Drug Administration - agência governamental americana que regula e fiscaliza a fabricação de comestíveis, drogas e cosméticos), mas frequentemente sofrem de toxicidades doselimitantes. Biespecíficos de célula T e células CAR-T
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53/112 funcionam em torno do sistema de reconhecimento TCR-MHC por utilização de dominios de ligação a antigenos-alvo na superfície de células tumorais, e por utilização de domínios de sinalização modificados geneticamente para transduzir os sinais de ativação para a célula efetora. Embora eficazes para provocar uma resposta imune antitumoral, essas terapias são frequentemente associadas à síndrome de liberação de citocina (CRS), e efeitos colaterais no alvo/fora do tumor. As proteínas de ligação multiespecíficas são únicas nesse contexto, na medida em que não irão anular os sistemas naturais de ativação e inibição de células NK. Pelo contrário, as proteínas de ligação multiespecíficas são projetadas para gerenciar o equilíbrio, e fornecer sinais de ativação adicionais às células NK, enquanto mantêm a tolerância de NK aos próprios saudáveis.
[134] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação multiespecíficas descritas nesse relatório descritivo que incluem um domínio de ligação ao NKG2D (por exemplo, proteína de ligação multiespecífica-A40, proteína de ligação multiespecífica-A49, proteína de ligação multiespecíficaC26, proteína de ligação multiespecífica-F04, proteína de ligação multiespecífica-F43, proteína de ligação multiespecífica-F47 e proteína de ligação multiespecíficaE79), que incluem um domínio de ligação para HER2, retardam a progressão do tumor mais eficazmente do que anticorpos monoclonais que incluem o mesmo domínio de ligação ao antígeno tumoral. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação multiespecíficas que incluem um domínio de ligação ao NKG2D e um domínio de ligação ao antígeno tumoral são mais eficazes contra metástases de câncer do que anticorpos
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54/112 monoclonais que incluem o mesmo domínio de ligação ao antígeno tumoral.
III. APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS [135] A invenção fornece métodos para o tratamento de câncer com o uso de uma proteína de ligação multiespecífica descrita nesse relatório descritivo e/ou uma composição farmacêutica descrita nesse relatório descritivo. Os métodos podem ser usados para tratar diversos cânceres que expressam HER2 por administração a um paciente necessitado de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação multiespecífica descrita nesse relatório descritivo.
[136] 0 método terapêutico pode ser caracterizado de acordo com o câncer a ser tratado. Por exemplo, em certas modalidades, o câncer é câncer de mama, ovariano, esofágico, de bexiga ou gástrico, carcinoma do dueto salivar, carcinomas do dueto salivar, adenocarcinoma do pulmão ou formas agressivas de câncer uterino, por exemplo, carcinoma endometrial seroso uterino.
[137] Em algumas outras modalidades, o câncer é câncer cerebral, câncer de mama, câncer cervical, câncer do cólon, câncer colón-retal, câncer endometrial, câncer esofágico, leucemia, câncer de pulmão, câncer do fígado, melanoma, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer retal, câncer renal, câncer do estômago, câncer testicular ou câncer uterino. Ainda em outras modalidades, o câncer é a carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma, carcinoma de pequena célula, melanoma, neuroblastoma, sarcoma (por exemplo, um angiossarcoma ou condrossarcoma), câncer da laringe, câncer da parótida, câncer do trato biliar, câncer da tireóide, melanoma acral lentiginoso, ceratoses actínicas, leucemia
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55/112 linfocitica aguda, leucemia mielóide aguda, carcinoma cistico da adenóide, adenomas, adenossarcoma, carcinoma adenoescamoso, câncer do canal anal, câncer anal, câncer anorretal, tumor astrocitico, carcinoma da glândula de Bartholin, carcinoma de célula basal, câncer biliar, câncer ósseo, câncer da medula óssea, câncer bronquial, carcinoma da glândula bronquial, carcinóide, colangiocarcinoma, condrossarcoma, papiloma/carcinoma do plexo coróide, leucemia linfocitica crônica, leucemia mielóide crônica, carcinoma de célula clara, câncer do tecido conjuntivo, cistadenoma, câncer do sistema digestivo, câncer do duodeno, câncer do sistema endócrino, tumor do seio endodérmico, hiperplasia endometrial, sarcoma endometrial estromal, adenocarcinoma endometrióide, câncer de célula endotelial, câncer ependimal, câncer de célula epitelial, sarcoma de Ewing, câncer dos olhos e órbitas, câncer genital feminino, hiperplasia nodular focal, câncer da vesicula biliar, câncer do antro gástrico, câncer do fundo gástrico, gastrinoma, glioblastoma, glucagonoma, câncer cardiaco, hemangioblastomas, hemangioendotelioma, hemangiomas, adenoma hepático, adenomatose hepática, câncer hepatobiliar, carcinoma hepatocelular, doença de Hodgkin, câncer do ileo, insulinoma, neoplasia intraepitelial, neoplasia de célula escamosa interepitelial, câncer intra-hepático do dueto biliar, carcinoma invasivo de célula escamosa, câncer do jejuno, câncer articular, sarcoma de Kaposi, câncer pélvico, carcinoma de célula grande, câncer do intestino grosso, leiomiossarcoma, melanomas malignos de lentigo, linfoma, câncer genital masculino, melanoma maligno, tumores mesoteliais malignos, meduloblastoma, meduloepitelioma,
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56/112 câncer meníngeo, câncer mesotelial, carcinoma metastático, câncer da boca, carcinoma mucoepidermóide, mieloma múltiplo, câncer muscular, câncer do trato nasal, câncer do sistema nervoso, adenocarcinoma neuroepitelial, melanoma nodular, câncer de pele não epitelial, linfoma não-Hodgkin, carcinoma de células pequenas, câncer oligodendroglial, câncer da cavidade oral, osteossarcoma, adenocarcinoma papilar seroso, câncer do pênis, câncer da faringe, tumores da hipófise, plasmocitoma, pseudossarcoma, blastoma pulmonar, câncer retal, carcinoma de célula renal, câncer do sistema respiratório, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, sarcoma, carcinoma seroso, câncer sinusal, câncer de pele, carcinoma de pequena célula, câncer do intestino delgado, câncer de músculo liso, câncer de tecido mole, tumor secretor de somatostatina, câncer espinhal, carcinoma de célula escamosa, câncer de músculo estriado, câncer submesotelial, melanoma superficial disseminante, leucemia de célula T, câncer da lingua, carcinoma indiferenciado, câncer do ureter, câncer da uretra, câncer da bexiga urinária, câncer do sistema urinário, câncer do cólon uterino, câncer do corpo uterino, melanoma uveal, câncer vaginal, carcinoma
verrucoso, VIPoma, câncer da vulva, carcinoma bem
diferenciado ou tumor de Wilms.
[138] Em algumas outras modalidades, o câncer é linfoma
não-Hodgkin, por exemplo, um linfoma de célula B ou um
linfoma de célula T. Em certas modalidades, o linfoma nãoHodgkin é um linfoma de célula B, por exemplo, um linfoma de célula B grande difuso, linfoma de célula B mediastinal primário, linfoma folicular, linfoma linfocitico pequeno, linfoma de célula do manto, linfoma de célula B da zona
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57/112 marginal, linfoma de célula B da zona marginal extranodal, linfoma de célula B da zona marginal nodal, linfoma de célula B esplênico da zona marginal, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmocitico, leucemia de célula pilosa ou linfoma primário do sistema nervoso central (SNC). Em algumas outras modalidades, o linfoma não-Hodgkin é um linfoma de célula T como, por exemplo, um linfoma linfoblástico de precursor T, linfoma de célula T periférico, linfoma de célula T cutâneo, linfoma de célula T angioimunoblástico, linfoma de célula natural killer/l extranodal, linfoma de célula T do tipo enteropatia, linfoma de célula T paniculite subcutânea-like, linfoma de célula grande anaplásica ou linfoma de célula T periférico.
[139] 0 câncer a ser tratado pode ser caracterizado de acordo com a presença de um antigeno particular expresso na superfície da célula de câncer. Em certas modalidades, a célula de câncer pode expressar um ou mais dos seguintes em adição ao HER2: CD2, CD19, CD20, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 e PD1.
IV. TERAPIA COMBINADA [140] Outro aspecto da invenção fornece terapia combinada. Proteínas de ligação multiespecíficas descritas nesse relatório descritivo podem ser usadas em combinação com agentes terapêuticos adicionais para tratar o câncer.
[141] Agentes terapêuticos exemplares que podem ser usados como parte de uma terapia combinada no tratamento de câncer, inclui, por exemplo, radiação, mitomicina, tretinoína, Ribomustin, gencitabina, vincristina, etoposido,
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58/112 cladribina, mitobronitol, metotrexato, doxorrubicina, carboquona, pentostatina, nitracrina, zinostatina, cetrorelix, letrozol, raltitrexed, daunorrubicina, fadrozol, fotemustina, timalfasina, sobuzoxano, nedaplatina, citarabina, bicalutamida, vinorelbina, vesnarinona, aminoglutetimida, amsacrina, proglumida, acetato de eliptinio, cetanserina, doxifluridina, etretinato, isotretinoina, estreptozocina, nimustina, vindesina, flutamida, drogenil, butocina, carmofur, razoxano, sizofilan, carboplatina, mitolactol, tegafur, ifosfamida, prednimustina, picibanil, levamisol, teniposida, improssulfan, enocitabina, lisurida, oximetolona, tamoxifeno, progesterona, mepitiostano, epitiostanol, formestano, interferon-alfa, interferon-2 alfa, interferonbeta, interferon-gama, fator estimulante de colônia-1, fator estimulante de colônia-2, denileukin diftitox, interleucina2, fator de liberação de hormônio luteinizante e variações dos agentes mencionados anteriormente que possam exibir ligação diferencial ao seu receptor cognato, e meia-vida sérica aumentada ou diminuida.
[142] Uma classe adicional de agentes que podem ser usados como parte de uma terapia combinada no tratamento de câncer consiste nos inibidores do ponto de verificação imune. Inibidores do ponto de verificação imune exemplares incluem agentes que inibem um ou mais de (i) antigeno associado ao linfócito T citotóxico 4 (CTLA4), (ii) proteina de morte celular programada 1 (PD1), (iii) PDL1, (iv) LAG3, (v) B7H3, (vi) B7-H4, e (vii) TIM3. 0 inibidor de CTLA4 ipilimumab foi aprovado pelo FDA para o tratamento de melanoma.
[143] Ainda outros agentes que podem ser usados como
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59/112 parte de uma terapia combinada no tratamento de câncer são agentes de anticorpo monoclonal que visam alvos que não são do ponto de verificação (por exemplo, herceptina) e agentes não citotóxicos (por exemplo, inibidores de tirosinaquinase) .
[144] Ainda outras categorias de agentes anticâncer incluem, por exemplo: (i) um inibidor selecionado de um Inibidor de ALK, um Inibidor de ATR, um Antagonista de A2A, um Inibidor de Reparo de Excisão de Base, um Inibidor de Tirosina-Quinase Bcr-Abl, um Inibidor de Tirosina-Quinase de Bruton, um Inibidor de CDC7, um Inibidor de CHK1, um Inibidor de Quinase Ciclina-Dependente, um Inibidor de DNA-PK, um Inibidor tanto de DNA-PK quanto de mTOR, um Inibidor de DNMT1, um Inibidor de DNMT1 mais 2-cloro-desoxiadenosina, um Inibidor de HDAC, um Inibidor da Via de Sinalização Hedgehog, um Inibidor de IDO, um Inibidor de JAK, um Inibidor de mTOR, um Inibidor de MEK, um Inibidor de MELK, um Inibidor de MTH1, um Inibidor de PARP, um Inibidor de Fosfoinositida 3-Quinase, um Inibidor tanto de PARP1 quanto de DHODH, um Inibidor de Proteossomo, um Inibidor de Topoisomerase-II, um Inibidor de Tirosina-Quinase, um Inibidor de VEGFR e um Inibidor de WEE1; (ii) um agonista de 0X40, CD137, CD40, GITR, CD27, HVEM, TNFRSF25 ou ICOS; e (iii) uma citocina selecionada de IL-12, IL-15, GM-CSF e G-CSF.
[145] As proteinas da invenção também podem ser usadas como um auxiliar à remoção cirúrgica da lesão primária.
[146] A quantidade de proteina de ligação multiespecifica e agente terapêutico adicional e o momento relativo de administração podem ser selecionados a fim de obter um efeito terapêutico combinado desejado. Por exemplo, quando se
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60/112 administra uma terapia combinada a um paciente que necessita dessa administração, os agentes terapêuticos na combinação, ou uma composição ou composições farmacêuticas que compreendem os agentes terapêuticos, podem ser administrados em qualquer ordem como, por exemplo, sequencialmente, concomitantemente, juntos, simultaneamente e semelhantes. Além disso, por exemplo, uma proteina de ligação multiespecifica pode ser administrada durante um tempo quando o agente terapêutico (ou agentes terapêuticos) adicional exerce seu efeito profilático ou terapêutico, ou vice-versa.
V. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS [147] A presente revelação também apresenta composições farmacêuticas que contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteina descrita nesse relatório descritivo. A composição pode ser formulada para uso em diversos sistemas de liberação de fármacos. Um ou mais excipientes ou carreadores fisiologicamente aceitáveis também podem ser incluidos na composição para formulação adequada. Formulações adequadas para uso na presente revelação são encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17a Edição, 1985. Para uma breve revisão de métodos para liberação de fármacos, veja, por exemplo, Langer (Science 249: 1.527-1.533, 1990).
[148] A formulação de liberação farmacológica intravenosa da presente revelação pode estar contida em uma bolsa, uma caneta ou uma seringa. Em certas modalidades, a bolsa pode estar conectada a um canal que compreende um tubo e/ou uma agulha. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação liofilizada ou uma formulação liquida. Em
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61/112 certas modalidades, a formulação pode ser seca por congelamento (liofilizada) e contida em cerca de 12-60 frascos. Em certas modalidades, a formulação pode ser seca por congelamento e 45 mg da formulação liofilizada podem estar contidos em um frasco. Em certas modalidades, os cerca de 40 mg - cerca de 100 mg de formulação liofilizada podem estar contidos em um frasco. Em certas modalidades, formulações liofilizadas de 12, 27 ou 45 frascos são combinadas para obter uma dose terapêutica da proteina na formulação farmacológica intravenosa. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação liquida e armazenada como cerca de 250 mg/frasco até cerca de 1.000 mg/frasco. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação liquida e armazenada como cerca de 600 mg/frasco. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação liquida e armazenada como cerca de 250 mg/frasco.
[149] Essa presente revelação poderia existir em uma formulação farmacêutica aquosa liquida que inclui uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteina em uma solução tamponada que forma uma formulação.
[150] Essas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais, ou podem ser filtradas de forma estéril. As soluções aquosas resultantes podem ser embaladas para uso dessa forma, ou liofilizadas, a preparação liofilizada sendo combinada com um carreador aquoso estéril antes da administração. O pH das preparações tipicamente estará entre 3 e 11, mais preferivelmente entre 5 e 9 ou entre 6 e 8 e, principalmente, entre 7 e 8, por exemplo, 7 a 7,5. As composições em forma sólida resultantes podem ser embaladas em múltiplas unidades de dose única,
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62/112 cada uma contendo uma quantidade fixa do agente ou agentes mencionados acima. A composição em forma sólida também pode ser embalada em um recipiente para uma quantidade flexível.
[151] Em certas modalidades, a presente revelação fornece uma formulação com um prazo de validade estendido, incluindo a proteína da presente revelação, em combinação com manitol, monoidrato de ácido cítrico, citrato de sódio, diidrato de fosfato dissódico, diidrato de diidrogenofosfato de sódio, cloreto de sódio, polissorbato 80, água e hidróxido de sódio.
[152] Em certas modalidades, é preparada uma formulação aquosa que inclui a proteína da presente revelação em uma solução com pH tamponado. O tampão dessa invenção pode ter um pH que varia de cerca de 4 até cerca de 8, por exemplo, de cerca de 4,5 até cerca de 6,0, ou de cerca de 4,8 até cerca de 5,5, ou pode ter um pH de cerca de 5,0 até cerca de
5,2. Faixas intermediárias aos pHs citados acima também visam ser parte dessa revelação. Por exemplo, faixas de valores que utilizam uma combinação de qualquer um dos valores citados acima como limites superiores e/ou inferiores visam ser incluídas. Exemplos de tampões que controlarão o pH dentro dessa faixa incluem acetato (por exemplo, acetato de sódio), succinato (por exemplo, succinato de sódio), gluconato, histidina, citrato e outros tampões de ácido orgânico.
[153] Em certas modalidades, a formulação inclui um sistema-tampão que contém citrato e fosfato para manter o pH em uma faixa de cerca de 4 até cerca de 8. Em certas modalidades a faixa de pH pode ser de cerca de 4,5 até cerca de 6,0, ou de cerca de pH 4,8 até cerca de 5,5, ou em uma faixa de pH de cerca de 5,0 até cerca de 5,2. Em certas
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63/112 modalidades, o sistema-tampão inclui monoidrato de ácido cítrico, citrato de sódio, diidrato de fosfato dissódico e/ou diidrato de diidrogenofosfato de sódio. Em certas modalidades, o sistema-tampão inclui cerca de 1,3 mg/ml de ácido cítrico (por exemplo, 1,305 mg/ml), cerca de 0,3 mg/ml de citrato de sódio (por exemplo, 0,305 mg/ml), cerca de 1,5 mg/ml de diidrato de fosfato dissódico (por exemplo, 1,53 mg/ml), cerca de 0,9 mg/ml de diidrato de diidrogenofosfato de sódio (por exemplo, 0,86) e cerca de 6,2 mg/ml de cloreto de sódio (por exemplo, 6,165 mg/ml). Em certas modalidades, o sistema-tampão inclui 1-1,5 mg/ml de ácido cítrico, 0,25 a 0,5 mg/ml de citrato de sódio, 1,25 até 1,75 mg/ml de diidrato de fosfato dissódico, 0,7 até 1,1 mg/ml de diidrato de diidrogenofosfato de sódio, e 6, 0 até 6,4 mg/ml de cloreto de sódio. Em certas modalidades, o pH da formulação é ajustado com hidróxido de sódio.
[154] Um poliol, que atua como um tonificante e pode estabilizar o anticorpo, também pode ser incluído na formulação. O poliol é adicionado à formulação em uma quantidade que pode variar com relação à isotonicidade desejada da formulação. Em certas modalidades, a formulação aquosa pode ser isotônica. A quantidade de poliol adicionada também pode ser alterada com relação ao peso molecular do poliol. Por exemplo, uma quantidade menor de um monossacarídeo (por exemplo, manitol) pode ser adicionada, comparada com a de um dissacarídeo (por exemplo, trehalose). Em certas modalidades, o poliol que pode ser usado na formulação como um agente de tonicidade é manitol. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser cerca de 5 até cerca de 20 mg/ml. Em certas modalidades, a concentração
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64/112 de manitol pode ser cerca de 7,5 até 15 mg/ml. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser cerca de ΙΟΙ 4 mg/ml. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser cerca de 12 mg/ml. Em certas modalidades, o sorbitol de poliol pode ser incluído na formulação.
[155] Um detergente ou tensoativo também pode ser adicionado à formulação. Detergentes exemplares incluem detergentes não iônicos como, por exemplo, polissorbatos (por exemplo, polissorbatos 20, 80 etc.) ou poloxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188). A quantidade de detergente adicionada é tal que reduz a agregação do anticorpo formulado e/ou minimiza a formação de particulados na formulação e/ou reduz a adsorção. Em certas modalidades, a formulação pode incluir um tensoativo que é um polissorbato. Em certas modalidades, a formulação pode conter o detergente polissorbato 80 ou Tween 80. Tween 80 é um termo usado para descrever polioxietileno (20) sorbitano-monooleato (veja Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4a Edição, 1996). Em certas modalidades, a formulação pode conter entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 10 mg/ml de polissorbato 80, ou entre cerca de 0,5 mg/ml e cerca de 5 mg/ml. Em certas modalidades, cerca de 0,1% de polissorbato 80 pode ser adicionado na formulação.
[156] Em modalidades, o produto de proteína da presente revelação é formulado como uma formulação líquida. A formulação líquida pode ser apresentada em uma concentração de 10 mg/ml em um frasco USP/Ph Eur tipo I 50R fechado com uma tampa de borracha e lacrado com um fechamento de lacre de crimpagem de alumínio. A tampa pode ser feita de elastômero compatível com USP e Ph Eur. Em certas modalidades
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65/112 os frascos podem ser preenchidos com 61,2 ml do produto de proteína solução a fim de permitir um volume extraível de 60 ml. Em certas modalidades, a formulação líquida pode ser diluída com solução salina 0,9%.
[157] Em certas modalidades, a formulação líquida da revelação pode ser preparada como uma solução com concentração de 10 mg/ml em combinação com um açúcar em níveis estabilizantes. Em certas modalidades, a formulação líquida pode ser preparada em um carreador aquoso. Em certas modalidades, um estabilizante pode ser adicionado em uma quantidade que não é maior do que aquela que pode resultar em uma viscosidade indesejável ou inadequada para administração intravenosa. Em certas modalidades, o açúcar pode ser dissacarídeos, por exemplo, sacarose. Em certas modalidades, a formulação líquida também pode incluir um ou mais de um agente de tamponamento, um tensoativo e um conservante.
[158] Em certas modalidades, o pH da formulação líquida pode ser ajustado por adição de um ácido e/ou uma base farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o ácido farmaceuticamente aceitável pode ser ácido clorídrico. Em certas modalidades, a base pode ser hidróxido de sódio.
[159] Além da agregação, a desamidação é uma variante de produto comum de peptídeos e proteínas que pode ocorrer durante a fermentação, coleta/clarificação de células, purificação, armazenamento da substância farmacológica/produto farmacológico e durante análise de amostra. A desamidação é a perda de NH3 de uma proteína formando um intermediário succinimida que pode passar por hidrólise. O intermediário succinimida resulta em uma
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66/112 diminuição de massa de 17 dáltons do peptideo parental. A hidrólise subsequente resulta em um aumento de massa de 18 dáltons. 0 isolamento do intermediário succinimida é difícil em consequência da instabilidade sob condições aquosas. Dessa forma, a desamidação é tipicamente detectável como aumento de massa de 1 dálton. A desamidação de uma asparagina resulta em ácido aspártico ou isoaspártico. Os parâmetros que afetam a taxa de desamidação incluem pH, temperatura, constante dielétrica do solvente, força iônica, sequência primária, conformação local e estrutura terciária do polipeptideo. Os resíduos de aminoácidos adjacentes a Asn na cadeia peptídica afetam as taxas de desamidação. Gly e Ser após uma Asn em sequências de proteína resultam em uma suscetibilidade maior à desamidação.
[160] Em certas modalidades, a formulação líquida da presente revelação pode ser conservada sob condições de pH e umidade para evitar a desaminação do produto de proteína.
[161] O carreador aquoso de interesse nesse relatório descritivo é um que seja farmaceuticamente aceitável (seguro e atóxico para administração a um humano) e seja útil para a preparação de uma formulação líquida. Carreadores ilustrativos incluem água para injeção estéril (SWFI), água para injeção bacteriostática (BWFI), uma solução com pH tamponado (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.
[162] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações nesse relatório descritivo para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso
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67/112 (doses múltiplas).
[163] Formulações intravenosas (IV) podem ser a via de administração preferida em casos particulares, por exemplo, quando um paciente está no hospital após transplante recebendo todos os fármacos por meio da via IV. Em certas modalidades, a formulação liquida é diluida com solução de cloreto de sódio 0,9% antes da administração. Em certas modalidades, o produto farmacológico diluido para injeção é isotônico e adequado para administração por infusão intravenosa.
[164] Em certas modalidades, um sal ou componentes de tamponamento podem ser adicionados em uma quantidade de 10 mM - 200 mM. Os sais e/ou tampões são f armaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos) com metais formadores de base ou aminas. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampão fosfato. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampões glicinato, carbonato, citrato, quando então, ions sódio, potássio ou amônio podem servir como contra-ion.
[165] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações nesse relatório descritivo para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (doses múltiplas).
[166] O carreador aquoso de interesse nesse relatório descritivo é um que seja farmaceuticamente aceitável (seguro e atóxico para administração a um humano) e seja útil para a preparação de uma formulação liquida. Carreadores ilustrativos incluem água para injeção estéril (SWFI), água para injeção bacteriostática (BWFI), uma solução com pH
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68/112 tamponado (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.
[167] Essa presente revelação poderia existir em uma formulação liofilizada que inclui as proteínas e um lioprotetor. 0 lioprotetor pode ser açúcar, por exemplo, dissacarídeos. Em certas modalidades, o lioprotetor pode ser sacarose ou maltose. A formulação liofilizada também pode incluir um ou mais de um agente de tamponamento, um tensoativo, um agente de volume e/ou um conservante.
[168] A quantidade de sacarose ou maltose útil para estabilização do produto farmacológico liofilizado pode estar em uma proporção de peso de pelo menos 1:2 de proteína para sacarose ou maltose. Em certas modalidades, uma proporção de peso de proteína para sacarose ou maltose pode ser de 1:2 até 1:5.
[169] Em certas modalidades, o pH da formulação, antes da liofilização, pode ser ajustado por adição de um ácido e/ou uma base farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o ácido farmaceuticamente aceitável pode ser ácido clorídrico. Em certas modalidades, a base farmaceuticamente aceitável pode ser hidróxido de sódio.
[170] Antes da liofilização, o pH da solução que contém a proteína da presente revelação pode ser ajustado entre 6 a 8. Em certas modalidades, a faixa de pH para o produto farmacológico liofilizado pode ser de 7 a 8.
[171] Em certas modalidades, um sal ou componentes de tamponamento podem ser adicionados em uma quantidade de 10 mM - 200 mM. Os sais e/ou tampões são f armaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos
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69/112 (inorgânicos e orgânicos) com metais formadores de base ou aminas. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampão fosfato. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampões glicinato, carbonato, citrato, quando então, ions sódio, potássio ou amônio podem servir como contra-ion.
[172] Em certas modalidades, pode ser adicionado um agente de volume. Um agente de volume é um composto que acrescenta massa a uma mistura liofilizada e contribui para a estrutura fisica da torta liofilizada (por exemplo, facilita a produção de uma torta liofilizada basicamente uniforme que mantém uma estrutura de poros aberta). Agentes de volume ilustrativos incluem manitol, glicina, polietileno glicol e sorbitol. As formulações liofilizadas da presente invenção podem conter esses agentes de volume.
[173] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações nesse relatório descritivo para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (doses múltiplas).
[174] Em certas modalidades, o produto farmacológico liofilizado pode ser reconstituido com um carreador aquoso. 0 carreador aquoso de interesse nesse relatório descritivo é um que seja farmaceuticamente aceitável (por exemplo, seguro e atóxico para administração a um humano) e seja útil para a preparação de uma formulação liquida, após liofilização. Diluentes ilustrativos incluem água para injeção estéril (SWFI), água para injeção bacteriostática (BWFI), uma solução com pH tamponado (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato) , solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.
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70/112 [175] Em certas modalidades, o produto farmacológico liofilizado da presente revelação é reconstituído com Água para Injeção Estéril, USP (SWFI) ou Injeção de Cloreto de Sódio 0,9%, USP. Durante a reconstituição, o pó liofilizado se dissolve em uma solução.
[176] Em certas modalidades, o produto de proteina liofilizado da presente revelação é reconstituído até cerca de 4,5 ml de água para injeção e diluido com solução salina 0,9% (solução de cloreto de sódio).
[177] Os niveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas dessa invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração particulares, sem serem tóxicas para o paciente.
[178] A dose especifica pode ser uma dose uniforme para cada paciente, por exemplo, 50-5.000 mg de proteina. Alternativamente, a dose de um paciente pode ser adaptada ao peso ou área de superfície corporal aproximada do paciente. Outros fatores na determinação da dosagem apropriada podem incluir a doença ou condição a ser tratada ou evitada, a gravidade da doença, a via de administração, e a idade, sexo e condição médica do paciente. Um refinamento adicional dos cálculos necessários para determinar a dosagem apropriada para o tratamento é rotineiramente feito por aqueles habilitados na técnica, especialmente à luz da informação de dosagem e ensaios revelados nesse relatório descritivo. A dosagem também pode ser determinada por meio do uso de ensaios conhecidos para determinação de dosagens usadas em conjunto com dados de dose-resposta apropriados. A dosagem
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71/112 de um paciente individual pode ser ajustada à medida que o progresso da doença é monitorado. Os niveis sanguíneos da construção ou complexo direcionável em um paciente podem ser medidos para ver se a dosagem precisa ser ajustada para alcançar ou manter uma concentração eficaz. Farmacogenômica pode ser usada para determinar quais construções ou complexos direcionáveis, e dosagens destes, têm a maior probabilidade de serem eficazes para certo indivíduo (Schmitz e cols., Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001; Steimer e cols., Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001) .
[179] Em geral, dosagens com base no peso corporal são de cerca de 0,01 pg até cerca de 100 mg por kg de peso corporal, por exemplo, cerca de 0,01 pg até cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 pg até cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 pg até cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 pg até cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 pg até cerca de 100 pg/kg de
peso corporal, cerca de 0,01 pg até cerca de 50 pg/kg de
peso corporal, cerca de 0,01 pg até cerca de 10 pg/kg de
peso corporal, cerca de 0,01 pg até cerca de 1 pg/kç j de peso
corporal, cerca de 0,01 pg até cerca de 0,1 . pg/kg de peso
corporal, cerca de 0,1 pg até cerca de 100 mg/kg de peso
corporal, cerca de 0,1 pg até cerca de 50 mg/kg de peso
corporal, cerca de 0,1 pg até cerca de 10 mg/kg de peso
corporal, cerca de 0,1 pg até cerca de 1 mg/kg de peso
corporal, cerca de 0,1 pg até cerca de 100 pg/kg de peso
corporal, cerca de 0,1 pg até cerca de 10 pg/kg de peso
corporal, cerca de 0,1 pg até cerca de 1 pg/kg de peso
corporal, cerca de 1 pg até cerca de 100 mg/kg de peso
corporal, cerca de 1 pg até cerca de 50 mg/kg de peso
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72/112 corporal, cerca de 1 pg até cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 pg até cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 pg até cerca de 100 pg/kg de peso corporal, cerca de 1 pg até cerca de 50 pg/kg de peso corporal, cerca de 1 pg até cerca de 10 pg/kg de peso corporal, cerca de 10 pg até cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 pg até cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 pg até cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 pg até cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 pg até cerca de 100 pg/kg de peso corporal, cerca de 10 pg até cerca de 50 pg/kg de
peso corporal, cerca de 50 pg até cerca de 100 mg/kg de peso
corporal, cerca de 50 pg até cerca de 50 mg/kg de peso
corporal, cerca de 50 pg até cerca de 10 mg/kg de peso
corporal, cerca de 50 pg até cerca de 1 mg/kg de peso
corporal, cerca de 50 pg até cerca de 100 pg/kg de peso
corporal, cerca de 100 pg até cerca de 100 mg/kg de peso
corporal, cerca de 100 pg até cerca de 50 mg/kg de peso
corporal, cerca de 100 pg até cerca de 10 mg/kg de peso
corporal, cerca de 10C i pç f até cerca de 1 mg/kg de peso
corporal, cerca de 1 1 ug . até cerca de 100 mg/kg de peso
corporal, cerca de 1 mg até cerca de 50 mg/kg de peso
corporal, cerca de 1 mg até cerca de 10 mg/kg de peso
corporal, cerca de 10 mg até cerca de 100 mg/kg de peso
corporal, cerca de 10 mg até cerca de 50 mg/kg de peso
corporal, cerca de 50 mg até cerca de 100 mg/kg de peso
corporal.
[180] As doses podem ser dadas uma ou mais vezes diariamente, semanalmente, mensalmente ou anualmente, ou até mesmo uma vez a cada 2 a 20 anos. Aqueles habilitados na técnica podem facilmente estimar taxas de repetição para
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73/112 dosagem com base nos tempos de residência e concentrações medidos da construção ou complexo direcionável em líquidos ou tecidos corpóreos. A administração da presente invenção poderia ser intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intrapleural, intratecal, intracavitária, por perfusão através de um cateter ou por injeção intralesional direta. Essa pode ser administrada uma ou mais vezes ao dia, uma ou mais vezes semanalmente, uma ou mais vezes mensalmente e uma ou mais vezes anualmente.
[181] A descrição acima descreve vários aspectos e modalidades da invenção. 0 pedido de patente especificamente contempla todas as combinações e permutações dos aspectos e modalidades.
EXEMPLOS [182] A invenção que está sendo geralmente descrita será mais facilmente compreendida por referência aos exemplos
seguintes, que são incluídos meramente para fins de
ilustração de certos aspectos e modalidades da presente
invenção, e não visam limitar a invenção.
Exemplo 1 - Domínios de ligação ao NKG2D se ligam ao NKG2D Domínios de ligação ao NKG2D se ligam ao NKG2D recombinante purificado [183] As sequências de ácidos nucleicos de ectodomínios de NKG2D humano, de camundongo ou de Cynomolgus foram fundidas com sequências de ácidos nucleicos que codificam Domínios Fc de IgGl humana e introduzidas em células de mamíferos para serem expressas. Após purificação, proteínas de fusão NKG2D-Fc foram adsorvidas aos poços de microplacas. Após bloqueio dos poços com albumina sérica bovina para evitar ligação não específica, domínios de ligação ao NKG2D
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74/112 foram titulados e adicionados aos poços pré-adsorvidos com proteínas de fusão NKG2D-Fc. A ligação ao anticorpo primário foi detectada usando um anticorpo secundário que foi conjugado à peroxidase de raiz-forte e reconhece especificamente uma cadeia leve kappa humana para evitar reatividade cruzada de Fc. 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB), um substrato para peroxidase de raiz-forte, foi adicionada aos poços para visualizar o sinal de ligação, cuja absorbância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Um clone do domínio de ligação ao NKG2D, um controle de isótipo ou um controle positivo (selecionado dos IDS. DE SEQ. Nos: 45-48, ou clones anti-NKG2D de camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis em eBioscience) foi adicionado a cada poço.
[184] O controle de isótipo mostrou ligação mínima às proteínas NKG2D-Fc recombinantes, enquanto o controle positivo foi o que se ligou mais forte aos antígenos recombinantes. Domínios de ligação ao NKG2D produzidos por todos os clones demonstraram ligação através de proteínas NKG2D-Fc recombinantes humanas, de camundongo e de Cynomolgus, embora com afinidades variáveis de clone para clone. Geralmente, cada clone anti-NKG2D se ligou ao NKG2DFc recombinante humano (FIG. 3) e de Cynomolgus (FIG. 4) com afinidade similar, mas com afinidade menor para NKG2D-Fc recombinante de camundongo (FIG. 5).
Domínios de ligação ao NKG2D se ligam às células que expressam NKG2D [185] Linhagens de células de linfoma de camundongo EL4 foram modificadas geneticamente para expressar NKG2D humano ou de camundongo - receptores de antígenos quiméricos de domínio de sinalização de CD3 zeta. Um clone de ligação ao
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NKG2D, um controle de isótipo ou um controle positivo foi usado em uma concentração de 100 nM para corar NKG2D extracelular expresso nas células EL4. A ligação ao anticorpo foi detectada usando anticorpos secundários anti-IgG humana conjugados a fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo, e a razão de aumento em relação ao nivel de base (FOB) foi calculada usando a intensidade de fluorescência média (MFI) de células que expressam NKG2D, comparadas com células EL4 parentais.
[186] Os dominios de ligação ao NKG2D produzidos por todos os clones se ligaram às células EL4 que expressam NKG2D humano e de camundongo. Anticorpos de controle positivo (selecionados do ID. DE SEQ. N°: 45-48, ou clones anti-NKG2D de camundongo MI-6 e CX-5 disponiveis em eBioscience) geraram o melhor sinal de ligação FOB. A afinidade de ligação ao NKG2D para cada clone foi similar entre células que expressam NKG2D humano (FIG. 6) e de camundongo (FIG. 7) NKG2D.
Exemplo 2 - Domínios de ligação ao NKG2D bloqueiam a ligação do ligante natural ao NKG2D
Competição com ULBP-6 [187] Proteínas NKG2D humano-Fc recombinantes foram adsorvidas aos poços de uma microplaca, e os poços foram bloqueados com albumina sérica bovina para reduzir a ligação não específica. Uma concentração saturante de ULBP-6-Hisbiotina foi adicionada aos poços, seguida por adição dos clones do domínio de ligação ao NKG2D. Após uma incubação de 2 horas, os poços foram lavados e ULBP-6-His-biotina que permanecia ligada aos poços revestidos com NKG2D-Fc foi detectada por estreptavidina conjugada à peroxidase de raizforte e substrato TMB. A absorbância foi medida a 450 nM e
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76/112 corrigida a 540 nM. Após subtração do nível de base, a ligação específica de domínios de ligação ao NKG2D às proteínas NKG2D-Fc foi calculada a partir da percentagem de ULBP-6-His-biotina que foi bloqueada da ligação às proteínas NKG2D-Fc nos poços. O anticorpo de controle positivo (selecionado dos IDS. DE SEQ. Nos: 45-48) e vários domínios de ligação ao NKG2D bloquearam a ligação de ULBP-6 ao NKG2D, enquanto o controle de isótipo mostrou pouca competição com ULBP-6 (FIG. 8).
Competição com MICA [188] Proteínas MICA-Fc humanas recombinantes foram adsorvidas aos poços de uma microplaca, e os poços foram bloqueados com albumina sérica bovina para reduzir a ligação não específica. NKG2D-Fc-biotina foi adicionada aos poços, seguida por domínios de ligação ao NKG2D. Após incubação e lavagem, NKG2D-Fc-biotina que permanecia ligada aos poços revestidos com MICA-Fc foi detectada usando estreptavidinaHRP e substrato TMB. A absorbância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Após subtração do nível de base, a ligação específica de domínios de ligação ao NKG2D às proteínas NKG2D-Fc foi calculada a partir da percentagem de NKG2D-Fc-biotina que foi bloqueada da ligação aos poços revestidos com MICA-Fc. O anticorpo de controle positivo (selecionado dos IDS. DE SEQ. Nos: 45-48) e vários domínios de ligação ao NKG2D bloquearam a ligação de MICA ao NKG2D, enquanto o controle de isótipo mostrou pouca competição com MICA (FIG. 9).
Competição com Rae-1 delta [189] Rae-1 delta-Fc recombinante de camundongo (adquirido de R&D Systems) foi adsorvido aos poços de uma
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77/112 microplaca, e os poços foram bloqueados com albumina sérica bovina para reduzir a ligação não especifica. NKG2D de camundongo-Fc-biotina foi adicionada aos poços, seguida por dominios de ligação ao NKG2D. Após incubação e lavagem, NKG2D-Fc-biotina que permanecia ligada aos poços revestidos com Rae-1 delta-Fc foi detectada usando estreptavidina-HRP e substrato TMB. A absorbância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Após subtração do nivel de base, a ligação especifica de dominios de ligação ao NKG2D às proteínas NKG2D-Fc foi calculada a partir da percentagem de NKG2D-Fc-biotina que foi bloqueada da ligação aos poços revestidos com Rae-1 delta-Fc. O controle positivo (selecionado dos IDS. DE SEQ. Nos: 45-48, ou clones antiNKG2D de camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis em eBioscience) e vários clones do domínio de ligação ao NKG2D bloquearam a ligação de Rae-1 delta ao NKG2D de camundongo, enquanto o controle de isótipo anticorpo mostrou pouca competição com Rae-1 delta (FIG. 10).
Exemplo 3 - Clones do domínio de ligação ao NKG2D ativam NKG2D [190] Sequências de ácidos nucleicos de NKG2D humano e de camundongo foram fundidas às sequências de ácidos nucleicos que codificam um domínio de sinalização de CD3 zeta para obter construções de receptor de antígeno quimérico (CAR) . As construções NKG2D-CAR foram então clonadas em um vetor de retrovirus usando montagem de Gibson e transfectadas em células expi293 para produção de retrovirus. Células EL4 foram infectadas com vírus que contêm NKG2D-CAR junto com 8 pg/ml de polibreno. Vinte e quatro horas após infecção, os níveis de expressão de NKG2D-CAR nas células EL4 foram
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78/112 analisados por citometria de fluxo, e clones que expressam niveis altos do NKG2D-CAR na superficie da célula foram selecionados.
[191] Para determinar se dominios de ligação ao NKG2D ativam NKG2D, eles foram adsorvidos aos poços de uma microplaca, e células EL4 NKG2D-CAR foram cultivadas nos poços revestidos com fragmento de anticorpo por 4 horas na presença de brefeldina-A e monensina. Intracelular TNFa produção, um indicador para ativação de NKG2D, foi testada por citometria de fluxo. A percentagem de células TNFapositivas foi normalizada para as células tratadas com o controle positivo. Todos os dominios de ligação ao NKG2D ativaram tanto NKG2D humano (FIG. 11) quanto NKG2D de camundongo (FIG. 12).
Exemplo 4 - Domínios de ligação ao NKG2D ativam células NK
Células NK humanas primárias [192] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de camadas leucoplaquetárias do sangue periférico humano usando centrifugação por gradiente de densidade. Células NK (CD3 CD56+) foram isoladas de PBMCs usando seleção negativa com partículas magnéticas, e a pureza das células NK isoladas foi tipicamente >95%. As células NK isoladas foram então cultivadas em meio contendo 100 ng/ml de IL-2 por 24-48 horas antes de serem transferidas para os poços de uma microplaca à qual os domínios de ligação ao NKG2D foram adsorvidos, e cultivadas nos meios contendo anticorpo anti-CD107a conjugado a fluoróforo, brefeldina-A e monensina. Após cultura, as células NK foram testadas por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados a fluoróforo contra CD3, CD56 e IFN-γ. A coloração de CD107a
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79/112 e IFN-γ foi analisada em células CD3 CD56+ para avaliar a ativação de célula NK. 0 aumento em células duplo-positivas CD107a/IFN-Y é indicativo de melhor ativação de célula NK por meio do engajamento de dois receptores de ativação, ao invés de um receptor. Domínios de ligação ao NKG2D e o controle positivo (selecionado dos IDS. DE SEQ. Nos: 45-48) mostraram uma percentagem maior de células NK que se tornam CD107a+ e IFN-y+ do que o controle de isótipo (FIG. 13 e FIG. 14 representam dados de dois experimentos independentes, cada um utilizando PBMCs de um doador diferente para preparação de células NK).
Células NK primárias de camundongo [193] Baços foram obtidos de camundongos C57B1/6 e esmagados por meio de uma peneira de células de 70 pm para obter suspensão de célula única. As células foram peletizadas e ressuspensas em tampão de lise ACK (adquirido de Thermo Fisher Scientific #A1049201; 155 mM de cloreto de amônio, 10 mM de bicarbonate de potássio, 0,01 mM de EDTA) para remover células sanguíneas vermelhas. As células restantes foram cultivadas com 100 ng/ml de hIL-2 por 72 horas antes de serem coletadas e preparadas para isolamento de células NK. Células NK (CD3 NK1.11) foram então isoladas de células esplênicas usando uma técnica de depleção negativa com partículas magnéticas com tipicamente >90% de pureza. Células NK purificadas foram cultivadas em meio contendo 100 ng/ml de mIL-15 por 48 horas antes de serem transferidas para os poços de uma microplaca à qual os domínios de ligação ao NKG2D foram adsorvidos, e cultivadas nos meios contendo anticorpo anti-CD107a conjugado a fluoróforo, brefeldina-A e monensina. Após cultura em poços revestidos com domínio de
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80/112 ligação ao NKG2D, células NK foram testadas por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados a fluoróforo contra CD3, NK1.1 e IFN-γ. A coloração de CD107a e IFN-γ foi analisada em células CD3 NK1.1+ para avaliar a ativação de célula NK. O aumento em células duplo-positivas CD107a/IFNY é indicativo de melhor ativação de célula NK por meio do engajamento de dois receptores de ativação, ao invés de um receptor. Dominios de ligação ao NKG2D e o controle positivo (selecionado de clones anti-NKG2D de camundongo MI-6 e CX-5 disponiveis em eBioscience) mostraram uma percentagem maior de células NK que se tornam CD107a+ e ΙΕΝ-γ+ do que o controle de isótipo (FIG. 15 e FIG. 16 representam dados de dois experimentos independentes, cada um utilizando um camundongo diferente para preparação de células NK) .
Exemplo 5 - Domínios de ligação ao NKG2D habilitam a citotoxicidade de células tumorais-alvo [194] Ensaios de ativação de célula NK primária humana e de camundongo demonstram marcadores de citotoxicidade aumentados em células NK após incubação com domínios de ligação ao NKG2D. Para verificar se isso se traduz em lise aumentada de células tumorais, foi usado um ensaio à base de células no qual cada domínio de ligação ao NKG2D foi desenvolvido em um anticorpo monoespecífico. A região Fc foi usada como um braço de direcionamento, enquanto a região Fab (domínio de ligação ao NKG2D) atuou como outro braço de direcionamento para ativar células NK. Células THP-1, que são de origem humana e expressam níveis altos de receptores FC, foram usadas como um alvo de tumor e foi usado um Kit de Citotoxicidade Perkin Elmer DELFIA. Células THP-1 foram marcadas com reagente BATDA, e ressuspensas a 105/ml em meio
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81/112 de cultura. Células THP-1 marcadas foram então combinadas com anticorpos para NKG2D e células NK isoladas de camundongo em poços de uma placa de microtitulação a 37°C por 3 horas. Após incubação, 20 μΐ do sobrenadante da cultura foram removidos, misturados com 200 μΐ de solução de Európio e incubados com agitação por 15 minutos no escuro. A fluorescência foi medida ao longo do tempo por uma leitora de placas PheraStar equipada com um módulo de fluorescência tempo-resolvida (Excitação 337 nm, Emissão 620 nm) e a lise especifica foi calculada de acordo com as instruções do kit.
[195] O controle positivo, ULBP-6 - um ligante natural para NKG2D, mostrou lise especifica aumentada de células ΊΉΡ-1-alvo por células NK de camundongo. Anticorpos para NKG2D também aumentaram a lise especifica de células THP-1alvo, enquanto controle de isótipo anticorpo mostrou lise especifica reduzida. A linha pontilhada indica lise especifica de células THP-1 por células NK de camundongo sem anticorpo adicionado (FIG. 17).
Exemplo 6 - Anticorpos para NKG2D exibem termoestabilidade alta [196] As temperaturas de fusão de dominios de ligação ao NKG2D foram testadas usando fluorimetria de varredura diferencial. As temperaturas de fusão aparentes extrapoladas são altas em relação aos anticorpos IgGl tipicos (FIG. 18). Exemplo 7 - Proteínas de ligação multiespecificas exibem habilidade aumentada para ativar células NK [197] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de camadas leucoplaquetárias do sangue periférico humano usando centrifugação por gradiente de densidade. Células NK (CD3 CD56+) foram isoladas de PBMCs
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82/112 usando seleção negativa com partículas magnéticas, e a pureza das células NK isoladas foi tipicamente >95%. As células NK isoladas foram então cultivadas em meio contendo 100 ng/ml de IL-2 por 24-48 horas antes de serem transferidas para os poços de uma microplaca à qual proteínas de ligação multiespecificas e biespecíficas foram adsorvidas, respectivamente, e cultivadas nos meios contendo anticorpo anti-CD107a conjugado a fluoróforo, brefeldina-A e monensina. Após cultura, as células NK foram testadas por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados a fluoróforo contra CD3, CD56 e IFN-γ. A coloração de CD107a e IFN-γ foi analisada em células CD3 CD56+ para avaliar a ativação de célula NK. O aumento em células duplo-positivas CD107a/IFN-Y é indicativo de melhor ativação de célula NK. AL2.2 é uma proteína de ligação multiespecifica que contém domínio de ligação ao HER2 (trastuzumab), domínio de ligação ao NKG2D (ULBP-6) e um domínio Fc de IgGl humana. Ela foi feita por meio de uma reação de troca controlada de braço Fab (cFAE) partindo de homodímero de trastuzumab e homodímero de ULBP-6-Fc (veja Labrijn e cols., Nature Protocols 9r 2.450-2.463). SC2.2 é uma proteína de cadeia única que inclui um scFv derivado de trastuzumab, e ULBP-6 (ID. DE SEQ. N°: 93) .
ID. DE SEQ. N°: 93 MAAAAIPALLLCLPLLFLLFGWSRARRDDPHSLCYDITVIPKFRPGPRWCAVQG QVDEKTFLHYDCGNKTVTPVSPLGKKLNVTMAWKAQNPVLREWDILTEQLLDIQLENY TPKEPLTLQARMSCEQKAEGHSSGSWQFSIDGQTFLLFDSEKRMWTTVHPGARKMKEKW ENDKDVAMSFHYISMGDCIGWLEDFLMGMDSTLEPSAGAPLAMSSGTTQLRATATTLIL CCLLIILPCFILPGI [198] A análise da coloração de CD107a e IFN-γ indicou
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83/112 que o controle de isótipo IgG não mostrou ativação de células NK, enquanto uma percentagem maior de células NK se tornou CD107a+ e IFN-y+ após estimulação com uma proteína de ligação multiespecifica, comparada com uma proteína biespecífica, demonstrando ativação mais forte de célula NK por meio do engajamento de dois receptores de ativação (NKG2D e CD16) ao invés de apenas um (NKG2D) (FIG. 19) . Espera-se que esse aumento na ativação de célula NK se traduza em morte de célula tumoral mais potente.
Exemplo 8 - Proteínas de ligação multiespecíficas exibem citotoxicidade aumentada contra células tumorais-alvo
Ensaio de citotoxicidade de célula NK humana primária [199] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de camadas leucoplaquetárias do sangue periférico humano usando centrifugação por gradiente de densidade. Células NK (CD3 CD56+) foram isoladas de PBMCs usando seleção negativa com partículas magnéticas, e a pureza das células NK isoladas foi tipicamente >95%. Células NK foram então cultivadas de um dia para o outro em meio contendo 100 ng/ml de IL-2 antes de serem usadas em ensaios de citotoxicidade. No dia seguinte, as células NK foram ressuspensas a 5 x 105/ml em meio de cultura frescos. Células de câncer de mama humano, células SkBr-3, foram marcadas com reagente BATDA de acordo com o Kit de Citotoxicidade Perkin Elmer DELFIA e ressuspensas a 5 x 104/ml em meio de cultura. Foram feitas várias diluições das proteínas de ligação multiespecíficas em meio de cultura. Células NK, as células SkBr-3 marcadas e as proteínas de ligação multiespecíficas foram então combinadas em poços de uma placa de microtitulação e incubadas a 37 °C por 3 horas. Após
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84/112 incubação, 20 μΐ do sobrenadante da cultura foram removidos, misturados com 200 μΐ de solução de Európio e incubados com agitação por 15 minutos no escuro. A fluorescência foi medida ao longo do tempo por uma leitora de placas PheraStar equipada com um módulo de fluorescência tempo-resolvida (Excitação 337 nm, Emissão 620 nm) e a lise especifica foi calculada de acordo com as instruções do kit. ALO. 2 é uma proteina de ligação multiespecifica que contém dominio de ligação ao HER2 (trastuzumab), dominio de ligação ao NKG2D (selecionado do ID. DE SEQ. N°: 1-44)) e um dominio Fc de IgGl humana. Ela foi feita por meio de uma reação de troca controlada de braço Fab (cFAE) partindo de homodimero de trastuzumab e homodimero anti-NKG2D. AL0.2si é baseada em ALO. 2 e contém uma mutação D2 65A adicional no dominio Fc, que elimina a ligação a CD16. Trastuzumab-si se baseia em Trastuzumab e contém uma mutação D265A adicional no dominio Fc, que elimina a ligação a CD16. AL2.2 é uma proteina de ligação multiespecifica que contém dominio de ligação ao HER2 (trastuzumab), dominio de ligação ao NKG2D (ULBP-6) e um dominio Fc de IgGl humana. SC2.2 é uma proteina de cadeia única que inclui um scFv derivado de trastuzumab, e ULBP-6.
[200] ALO.2 mostrou lise mais aumentada de células SkBr3-alvo por células NK humanas do que trastuzumab de uma forma dose-dependente, com um valor p de 0,0311 em EC50 (FIG. 20). AL0.2si (FIG. 21) e trastuzumab-si (FIG. 22) mostraram redução tanto na potência quanto na lise especifica máxima de células SkBr-3, comparados com ALO.2, com um valor p de 0,0002 e 0,0001 em EC50, respectivamente (FIGS. 21-22). Além disso, ALO.2 mostrou lise mais aumentada de células SkBr-3 do que AL2.2 de uma forma dose-dependente (FIG. 23). A IgG
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85/112 de controle de isótipo não mostrou aumento na lise específica em qualquer uma das concentrações testadas. Em conjunto, os dados demonstraram que proteínas de ligação multiespecíficas que engajam 2 receptores de ativação em células NK e um antígeno tumoral, induzem morte mais potente de células tumorais por células NK humanas, comparadas com proteínas biespecíficas que engajam um receptor de ativação em células NK e um antígeno tumoral.
Ensaio de citotoxicidade de célula NK primária de camundongo [201] Baços foram obtidos de camundongos C57B1/6 e esmagados por meio de uma peneira de células de 70 pm para obter suspensão de célula única. As células foram peletizadas e ressuspensas em tampão de lise ACK (adquirido de Thermo Fisher Scientific #A1049201; 155 mM de cloreto de amônio, 10 mM de bicarbonate de potássio, 0,01 mM de EDTA) para remover células sanguíneas vermelhas. As células restantes foram cultivadas com 100 ng/ml de hIL-2 por 72 horas antes de serem coletadas e preparadas para isolamento de células NK. Células NK (CD3 NK1.11) foram então isoladas de células esplênicas usando uma técnica de depleção negativa com partículas magnéticas com tipicamente >90% de pureza. Células NK purificadas foram cultivadas em meio contendo 100 ng/ml de mIL-15 por 48 horas antes de serem ressuspensas em meio de cultura a 106/ml para ensaios citotóxicos. RMA-HER2-dTomato, uma linhagem de célula tumoral de camundongo modificada geneticamente para expressar HER2 e dTomato, e sua contraparte de controle, células RMA que expressam zsGreen foram usadas como alvos. Elas foram ressuspensas a 2 x 105/ml em meio de cultura e semeadas em poços de uma microplaca em proporção de 1:1. Foram feitas diluições de proteína
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86/112 multiespecífica em meio de cultura, e adicionadas às células RMA junto com as células NK. Após incubação de um dia para o outro a 37°C com CO2 5%, a percentagem de células RMA-HER2dTomato e RMA-zsGreen foi determinada por citometria de fluxo usando o repórter fluorescente para identificar os dois tipos de células. Morte específica de célula-alvo = (1- ( (% de células RMA-Ca2T-dTomato no grupo de tratamento * % de células RMA-zsGreen no grupo de controle)/ (% de células RMACa2T-dTomato no grupo de controle * % de células RMA-zsGreen no grupo de tratamento))) * 100%.
[202] AL2.2 é mais potente no redirecionamento de respostas de células NK a alvos tumorais do que SC2.2 (FIG. 25) e Trastuzumab (FIG. 24) . Proteína de controle mostrou pouco impacto sobre morte alvo-específica. Esses dados demonstram as proteínas de ligação multiespecíficas que engajam 2 receptores de ativação em células NK e um antígeno tumoral, induzem morte mais potente de células tumorais por células NK de camundongo, comparadas com proteínas biespecíficas que engajam um receptor de ativação em células NK e um antígeno tumoral.
Exemplo 9 - Proteínas de ligação multiespecíficas se ligam ao NKG2D [203] Linhagens de células de linfoma de camundongo EL4 foram modificadas geneticamente para expressar proteínas triespecíficas de ligação ao NKG2D humano (TriNKETs), em que cada um contém um domínio de ligação ao NKG2D, um domínio de ligação ao HER2, e um domínio Fc que se liga ao CD16 como mostrado na FIG. 1, foram testadas quanto à sua afinidade para NKG2D extracelular expresso em células EL4. A ligação das proteínas de ligação multiespecíficas ao NKG2D foi
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87/112 detectada usando anticorpos secundários anti-IgG humana conjugados a fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo, e a razão de aumento em relação ao nivel de base (FOB) foi calculada usando a intensidade de fluorescência média (MFI) de células que expressam NKG2D, comparadas com células EL4 parentais.
[204] Os TriNKETs testados incluem HER2-TriNKET-C26 (ADI-28226 e um domínio de ligação ao HER2) e HER2-TriNKETF04 (ADI-29404 e um domínio de ligação ao HER2). O domínio de ligação ao HER2 usado nas moléculas testadas era composto por um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve de Trastuzumab.
[205] Os dados mostram que os TriNKETs que visam HER2 da presente revelação se ligam ao NKG2D (FIG. 26).
Exemplo 10 - Proteínas de ligação multíespecífícas se ligam ao antígeno tumoral humano
Proteínas de ligação triespecíficas se ligam ao HER2 [206] Linhagens de células de câncer humano que expressam HER2 foram usadas para testar a ligação de TriNKETs que visam HER2 ao antígeno tumor-associado. A Linhagem carcinoma de célula renal de célula 786-0 expressa níveis baixos de HER2. TriNKETs e, opcionalmente, o anticorpo monoclonal anti-HER2 parental (Trastuzumab), foram incubados com as células, e a ligação foi detectada usando anticorpos secundários anti-IgG humana conjugados a fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo, e a razão de aumento em relação ao nível de base (FOB) foi calculada usando a intensidade de fluorescência média (MFI) de TriNKETs e Trastuzumab normalizada para controles de anticorpo secundário. HER2TriNKET-C26 e HER2-TriNKET-F04 mostram níveis comparáveis de
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88/112 ligação ao HER2 expresso em células 786-0, quando comparados com Trastuzumab (FIG. 27A).
[207] Células RMA transduzidas com HER2 humano foram usadas para testar a ligação ao HER2 humano expresso pela célula por TriNKETs que visam HER2. TriNKETs foram diluidos até 20 pg/ml, e ligação foi detectada usando um anticorpo secundário anti-IgG humana conjugado a um fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo, a ligação ao HER2 expresso pela célula foi comparada com populações de células de isótipo coradas e não coradas. A FIG. 27B e a FIG. 27C mostram perfis de ligação de TriNKETs que contêm dois domínios de ligação ao NKG2D distintos (o perfil de ligação de C26.2 TriNKET com sítio de ligação ao HER2 mostrado na FIG. 27B; o perfil de ligação de F04.2 TriNKET com sítio de ligação ao HER2 mostrado na FIG. 27C), mas com o mesmo domínio de ligação ao HER. Ambos os TriNKETs mostram nível similar de ligação ao HER2 na superfície da célula em células RMA.
Exemplo 11 - Proteínas de ligação multiespecíficas ativam células NK [208] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de camadas leucoplaquetárias do sangue periférico humano usando centrifugação por gradiente de densidade. Células NK (CD3 CD56+) foram isoladas de PBMCs usando seleção negativa com partículas magnéticas, e a pureza das células NK isoladas foi tipicamente >90%. Células NK isoladas foram cultivadas em meio contendo 100 ng/ml de IL2 para ativação ou descansaram de um dia para o outro sem citocina. Células NK ativadas por IL-2 foram usadas dentro de 24-48 horas após ativação.
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89/112 [209] Células de câncer humano que expressam um antigeno tumoral foram coletadas e ressuspensas em meio de cultura a 2 x 106/ml. Anticorpos monoclonais ou TriNKETs que visam o antigeno tumoral foram diluidos em meio de cultura. Células NK ativadas foram coletadas, lavadas e ressuspensas a 2 x 106/ml em meio de cultura. Células de câncer foram então misturadas com anticorpos monoclonais/TriNKETs e células NK ativadas na presença de IL-2. Brefeldina-A e monensina também foram adicionadas à cultura misturada para bloquear o transporte de proteina para fora da célula para coloração de citocina intracelular. Anti-CD107a conjugado a fluoróforo foi adicionado à cultura misturada e a cultura foi incubada por 4 horas antes de as amostras terem sido preparadas para FACS análise usando anticorpos conjugados a fluoróforo contra CD3, CD56 e IFN-γ. A coloração de CD107a e IFN-γ foi analisada em células CD3 CD56+ para avaliar a ativação de célula NK. O aumento em células duplo-positivas CD107a/IFNY é indicativo de melhor ativação de célula NK por meio do engajamento de dois receptores de ativação, ao invés de um receptor.
[210] TriNKETs medeiam a ativação de células NK humanas cocultivadas com células SkBr-3 que expressam HER2 (FIG. 28A), células Colo201 (FIG. 28B) e células HCC1954 (FIG. 28C) respectivamente, como indicado por um aumento da degranulação de CD107a e produção de IFN-γ. Células SkBr-3 e células HCC1954 possuem niveis altos de expressão de HER2 de superficie, e Colo201 possui expressão média de HER2. Comparados com o anticorpo monoclonal trastuzumab, TriNKETs exibem ativação superior de células NK humanas na presença de células de câncer humano. Células NK isoladamente, células
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NK mais células SkBr-3 são usadas como controles negativos.
[211] TriNKETs (C26-TriNKET-HER2 e F04-TriNKET-HER2) medeiam a ativação de células NK humanas cocultivadas com células de AML humana que expressam CD33 Mv4-ll mostraram um aumento da degranulação de CD107a e produção de IFN-γ. Comparados com o anticorpo monoclonal anti-CD33, TriNKETs (C26-TriNKET-HER2 e F04-TriNKET-HER2) mostraram ativação superior de células NK humanas na presença de células de câncer humano que expressam HER2 (FIGS. 28A-28C).
Exemplo 12 - Proteínas de ligação tríespecífícas habilitam a citotoxicidade de células de câncer-alvo [212] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de camadas leucoplaquetárias do sangue periférico humano usando centrifugação por gradiente de densidade. Células NK (CD3 CD56+) foram isoladas de PBMCs usando seleção negativa com partículas magnéticas, e a pureza das células NK isoladas foi tipicamente >90%. Células NK isoladas foram cultivadas em meio contendo 100 ng/ml de IL2 para ativação ou descansaram de um dia para o outro sem citocina. Células NK ativadas por IL-2 ou em repouso foram usadas no dia seguinte em ensaios de citotoxicidade.
[213] A fim de testar a habilidade de células NK humanas para lisar células de câncer na presença de TriNKETs, um ensaio de citotoxicidade não radioativo Cyto Tox 96 de Promega (G1780) foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, células de câncer humano que expressam um antígeno tumoral foram coletadas, lavadas e ressuspensas em meio de cultura a 1-2 x 105/ml. Células NK em repouso e/ou ativadas foram coletadas, lavadas e ressuspensas a 105-2,0 x 106/ml no mesmo meio de cultura que
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91/112 aquele das células de câncer. Em cada poço de uma placa de 96 poços, 50 μΐ da suspensão de células de câncer foram misturados com 50 μΐ de suspensão de células NK com ou sem TriNKETs que visam o antigeno tumoral expresso nas células de câncer. Após incubação a 37°C com CO2 5% por 3 horas e 15 minutos, lOx tampão de lise foi adicionado aos poços que contêm apenas células de câncer, e aos poços que contêm apenas meio para os controles de lise máxima e negativos de reagente, respectivamente. A placa foi então colocada de volta na incubadora por mais 45 minutos até alcançar uma incubação total de 4 horas. As células foram então peletizadas, e o sobrenadante da cultura foi transferido para uma nova placa de 96 poços e misturado com um substrato para desenvolvimento. A nova placa foi incubada por 30 minutos em temperatura ambiente, e a absorbância foi lida a 4 92 nm em um SpectraMax i3x. A percentagem de lise especifica das células de câncer foi calculada da seguinte forma: % de lise especifica = ( (lise experimental - lise espontânea de células NK isoladamente - lise espontânea de células de câncer isoladamente) / (Lise máxima - controle de reagente negativo)) x 100%.
[214] TriNKETs aumentam a citotoxicidade de células NK contra alvos com expressão de superfície baixa, comparada com a atividade citotóxica de trastuzumab, um anticorpo monoclonal anti-HER2. Células NK humanas em repouso foram misturadas com células tumorais SkBr que possuem expressão alta de HER2 e células de câncer 786-0 que possuem expressão baixa de HER2, e a habilidade de TriNKETs para aumentar a atividade citotóxica de células NK humanas em repouso contra as células de câncer que expressam HER2 de forma alta e baixa
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92/112 de forma dose-responsiva foi testada. As linhas pontilhadas na FIG. 29A e FIG. 2 9B indicam a atividade citotóxica de células NK em repouso contra as células de câncer na ausência de TriNKETs. Como mostrado na FIG. 2 9B, mediante misturação de células NK humanas ativadas com células 786-0 com expressão baixa de HER2 e TriNKET (por exemplo, CD26-TriNKET e F04-TriNKET, que inclui um dominio de ligação para HER2), foi observada atividade citotóxica dose-responsiva de células NK humanas ativadas contra as células de câncer.
Exemplo 13 - Ativação sinérgica de células NK humanas por reticulação de NKG2D e CD16
Ensaio de ativação de célula NK humana primária [215] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de camadas leucoplaquetárias do sangue periférico humano usando centrifugação por gradiente de densidade. Células NK foram purificadas das PBMCs usando partículas magnéticas negativos (StemCell # 17955). As células NK eram >90% CD3 CD561, como determinado por citometria de fluxo. As células foram então expandidas 48 horas em meio contendo 100 ng/ml de hIL-2 (Peprotech #20002) antes do uso em ensaios de ativação. Anticorpos foram revestidos sobre uma placa de 96 poços de fundo plano em uma concentração de 2 pg/ml (anti-CD16, Biolegend # 302013) e 5 pg/ml (anti-NKG2D, R&D #MAB139) em 100 μΐ de PBS estéril de um dia para o outro a 4°C, seguido por lavagem dos poços cuidadosamente para remover anticorpo em excesso. Para avaliação da degranulação, células NK ativadas por IL-2 foram ressuspensas a 5 x 105 células/ml em meio de cultura suplementado com 100 ng/ml de hIL2 e 1 pg/ml de mAb antiCD107a conjugado a APC (Biolegend # 328619) . Um x 105
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93/112 células/poço foram então adicionadas às placas revestidas com anticorpo. Os inibidores do transporte de proteina Brefeldina A (BFA, Biolegend # 420601) e Monensina (Biolegend # 420701) foram adicionados em uma diluição final de 1:1000 e 1:270, respectivamente. As células plaqueadas foram incubadas por 4 horas a 37°C em CO2 5%. Para coloração intracelular de IFN-γ, células NK foram marcadas com mAb anti-CD3 (Biolegend #300452) e mAb anti-CD56 (Biolegend # 318328) e subsequentemente fixadas e permeabilizadas e marcadas com mAb anti-IFN-γ (Biolegend # 506507). As células NK foram analisadas quanto à expressão de CD107a e IFN-γ por citometria de fluxo após separação de células CD56'CD3 vivas.
[216] Para investigar a potência relativa da combinação de receptores, a reticulação de NKG2D ou CD16 e a correticulação de ambos os receptores por estimulação ligada à placa foram realizadas. Como mostrado na Figura 30 (FIGS. 30A-30C) , a estimulação combinada de CD16 e NKG2D resultou em niveis altamente elevados de CD107a (degranulação) (FIG. 30A) e/ou produção de IFN-γ (FIG. 30B). As linhas pontilhadas representam um efeito aditivo de estimulações individuais de cada receptor.
[217] Os niveis de CD107a e a produção intracelular de IFN-γ de células NK ativadas por IL-2 foram analisados após 4 horas de estimulação ligada à placa com anti-CD16, antiNKG2D ou uma combinação de ambos os anticorpos monoclonais. Os gráficos indicam a média (n = 2) ± DP. A FIG. 19A demonstra os niveis de CD107a; a FIG. 30B demonstra os niveis de IFNy; a FIG. 30C demonstra os niveis de CD107a e IFNy. Os dados mostrados nas FIGS. 30A-30C são representativos de cinco
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94/112 experimentos independentes com o uso de cinco doadores saudáveis diferentes.
[218] A degranulação de CD107a e a produção intracelular de IFN-γ de células NK ativadas por IL-2 foram analisadas após 4 horas de estimulação ligada à placa com trastuzumab, anti-NKG2D, ou um TriNKET derivado dos dominios de ligação de trastuzumab e o anticorpo anti-NKG2D (FIG. 31). Em todos os casos, os anticorpos testados eram do isótipo de IgGl humana. Os gráficos indicam a média (n = 2) ± DP.
Exemplo 14 - Propriedades dos TriNKETs
Avaliação da ligação de TriNKET ao NKG2D humano expresso por células [219] Células EL4 transduzidas com NKG2D humano foram usadas para testar a ligação ao NKG2D humano expresso por célula. TriNKETs foram diluidos até 20 pg/ml, e depois diluidos serialmente. O mAb ou as diluições de TriNKET foram usados para corar células, e a ligação do TriNKET ou mAb foi detectada usando um anticorpo secundário anti-IgG humana conjugado a fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo, a MFI da ligação foi normalizada para controles de anticorpo secundário para obter a variação em relação aos valores no nível de base.
Avaliação da ligação de TriNKET aos antigenos de câncer humano expressos por células [220] Linhagens de células de câncer humano que expressam HER2 foram usadas para avaliar a ligação ao antigeno tumoral de TriNKETs derivados de diferentes clones que visam NKG2D. A linhagem de células de carcinoma de célula renal humano 786-0 expressa níveis baixos de HER2 e foi usada para avaliar a ligação de TriNKET ao HER2 expresso por células. TriNKETs
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95/112 foram diluídos até 20 pg/ml, e foram incubados com as respectivas células. A ligação do TriNKET foi detectada usando um anticorpo secundário anti-IgG humana conjugado a fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo, ligação de MFI às células que expressam HER2 foi normalizada para controles de anticorpo secundário para obter a variação em relação aos valores no nível de base.
Determinação de capacidade de ligação ao anticorpo de linhagens de células de câncer HER2 humano-positivas [221] A capacidade de ligação ao anticorpo (ABC) de linhagens de células de câncer humano HER2-positivos foi medida. Foi usado o kit Quantum Simply Cellular de Bangs Lab (#815) , e as instruções do fabricante foram seguidas para a preparação de partículas marcados com anticorpo. Resumidamente, cada uma das quatro populações de partículas foi corada com uma quantidade saturante de anticorpo antiHER2, e as populações de células também foram coradas com uma quantidade saturante do mesmo anticorpo. Foram adquiridos dados de amostras para cada população de partículas, bem como para as populações de células. Uma planilha QuickCal, fornecida com o kit, foi usada para a geração de uma curva-padrão e extrapolação de ABC valores para cada uma das linhagens de células.
Ativação de células NK primárias por TriNKETs [222] PBMCs foram isoladas de camadas leucoplaquetárias do sangue periférico humano usando centrifugação por gradiente de densidade. PBMCs isoladas foram lavadas e preparadas para isolamento de células NK. Células NK foram isoladas usando uma técnica de seleção negativa com partículas magnéticas; a pureza de células NK isoladas foi
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96/112 tipicamente >90% CD3-CD56+. Células NK isoladas foram cultivadas em meio contendo 100 ng/ml de IL-2 para ativação ou descansaram de um dia para o outro sem citocina. Células NK ativadas por IL-2 foram usadas 24-48 horas mais tarde; células NK em repouso foram sempre usadas no dia seguinte à purificação.
[223] Linhagens de células de câncer humano que expressam um alvo de câncer de interesse foram coletadas da cultura, e células foram ajustadas até 2 x 106/ml. Anticorpos monoclonais ou TriNKETs que visam o alvo de câncer de interesse foram diluidos em meio de cultura. Células NK em repouso e/ou ativadas foram coletadas da cultura, as células foram lavadas e foram ressuspensas a 2 x 106/ml em meio de cultura. IL-2 e anti-CD107a conjugado a fluoróforo foram adicionados às células NK para a cultura de ativação. Brefeldina-A e monensina foram diluidas em meio de cultura para bloquear o transporte de proteina para fora da célula para coloração de citocina intracelular. Em uma placa de 96 poços, 50 μΐ de alvos tumorais, mAbs/TriNKETs, BFA/monensina e células NK foram adicionados para um volume de cultura total de 200 μΐ. A placa foi cultivada por 4 horas antes de as amostras terem sido preparadas para FACS análise.
[224] Após a cultura de ativação de 4 horas, as células foram preparadas para análise por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados a fluoróforo contra CD3, CD56 e ΙΕΝγ. A coloração para CD107a e ΙΕΝγ foi analisada em populações CD3-CD56+ para avaliar a ativação de célula NK.
Ensaio de citotoxicidade de célula NK humana primária [225] PBMCs foram isoladas de camadas leucoplaquetárias do sangue periférico humano usando centrifugação por
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97/112 gradiente de densidade. PBMCs isoladas foram lavadas e preparadas para isolamento de células NK. Células NK foram isoladas usando uma técnica de seleção negativa com particulas magnéticas, a pureza de células NK isoladas foi tipicamente >90% CD3-CD56+. Células NK isoladas foram cultivadas em meio contendo 100 ng/ml de IL-2 ou descansaram de um dia para o outro sem citocina. Células NK ativadas por IL-2 ou em repouso foram usadas no dia seguinte em ensaios de citotoxicidade.
Ensaio de liberação de LHD Cyto Tox 96:
[226] A habilidade de células NK humanas para lisar células tumorais foi medida com ou sem a adição de TriNKETs utilizando o ensaio de citotoxicidade não radioativo Cyto Tox 96 de Promega (G1780) . Linhagens de células de câncer humano que expressam um alvo de câncer de interesse foram coletadas da cultura, as células foram lavadas com PBS, e foram ressuspensas em meio de crescimento a 1-2 x 105/ml para uso como células-alvo. 50 μΐ da suspensão de célula-alvo foram adicionados a cada poço. Anticorpos monoclonais ou TriNKETs que visam um antigeno de câncer de interesse foram diluidos em meio de cultura, 50 μΐ de mAb ou TriNKET diluido foram adicionados a cada poço. Células NK em repouso e/ou ativadas foram coletadas da cultura, as células foram lavadas e foram ressuspensas a 105-2,0 x 106/ml em meio de cultura, dependendo da proporção E:T desejada. 50 μΐ de células NK foram adicionados a cada poço da placa para fazer um total de 150 μΐ de volume de cultura. A placa foi incubada a 37°C com CO2 5% por 3 horas e 15 minutos. Após a incubação, lOx tampão de lise foi adicionado aos poços de células-alvo isoladamente, e aos poços que contêm apenas meio, para lise
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98/112 máxima e controles de volume. A placa foi então colocada de volta na incubadora por mais 45 minutos, para fazer um total de 4 horas de incubação antes do desenvolvimento.
[227] Após incubação, a placa foi removida da incubadora e as células foram peletizadas por centrifugação a 200 g por 5 minutos. 50 μΐ de sobrenadante da cultura foram transferidos para uma microplaca limpa e 50 μΐ de substrato solução foram adicionados a cada poço. A placa foi protegida da luz e incubada por 30 minutos em temperatura ambiente. Cinquenta μΐ de solução de interrupção foram adicionados a cada poço, e a absorbância foi lida a 4 92 nm em um SpectraMax i3x. O % de lise especifica foi calculado da seguinte forma: % de lise especifica = ((Liberação experimental - Liberação espontânea pelo efetor - Liberação espontânea pelo alvo) / (Liberação máxima - Liberação espontânea)) * 100%.
Ensaio de citotoxicidade DELFIA:
[228] Linhagens de células de câncer humano que expressam um alvo de interesse foram coletadas da cultura, as células foram lavadas com PBS, e foram ressuspensas em meio de crescimento a 106/ml para marcação com reagente BATDA (Perkin Elmer AD0116). As instruções do fabricante foram seguidas para marcação das células-alvo. Após marcação, as células foram lavadas 3x com PBS, e foram ressuspensas a 0,5-1,0 x 105/ml em meio de cultura. Para preparar os poços de base, uma alíquota das células marcadas foi colocada de lado, e as células foram centrifugadas para fora do meio. 100 μΐ do meio foram cuidadosamente adicionados aos poços em triplicata para evitar perturbação das células peletizadas. Cem μΐ de células marcadas com BATDA foram adicionados a cada poço da placa de 96 poços. Os poços foram salvos para
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99/112 liberação espontânea por células-alvo, e poços foram preparados para lise máxima de células-alvo por adição de Triton-X 1%. Anticorpos monoclonais ou TriNKETs contra o alvo tumoral de interesse foram diluidos em meio de cultura e 50 μΐ de mAb ou TriNKET diluído foram adicionados a cada poço. Células NK em repouso e/ou ativadas foram coletadas da cultura, as células foram lavadas e foram ressuspensas a 1052,0 x 106/ml em meio de cultura, dependendo da proporção E:T desejada. 50 μΐ de células NK foram adicionados a cada poço da placa para fazer um total de 200 μΐ de volume de cultura. A placa foi incubada a 37°C com CO2 5% por 2-3 horas antes do desenvolvimento do ensaio.
[229] Após cultivo por 2-3 horas, a placa foi removida da incubadora e as células foram peletizadas por centrifugação a 200 g por 5 minutos. 20 μΐ de sobrenadante da cultura foram transferidos para uma microplaca limpa fornecida pelo fabricante, 200 μΐ de solução de európio em temperatura ambiente foram adicionados a cada poço. A placa foi protegida da luz e incubada em uma agitadora de placas a 250 rpm por 15 minutos. A placa foi lida usando instrumentos Victor 3 ou SpectraMax i3X. O % de lise específica foi calculado da seguinte forma: % de lise específica = ( (Liberação experimental - Liberação espontânea) / (Liberação máxima - Liberação espontânea)) * 100% .
Ensaio de citotoxicidade de longo prazo de PBMCs humanas [230] Células SkBr-3-alvo foram marcadas com Verde BacMam 3.0 NucLight (#4622) para permitir o rastreamento das células-alvo. O protocolo do fabricante foi seguido para marcação de células SkBr-3-alvo. Vermelho Anexina V (Essen
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Bioscience #4641) foi diluído e preparado de acordo com as instruções do fabricante. Anticorpos monoclonais ou TriNKETs foram diluídos em meio de cultura. 50 μΐ de mAbs ou TriNKETs, Anexina V, e células NK em repouso foram adicionados aos poços de uma placa de 96 poços que já contém células marcadas SkBr-3; 50 μΐ de meio de cultura completo foram adicionados para um total de 200 μΐ de volume de cultura.
[231] A coleta de imagens foi configurada no IncuCyte S3. Imagens para os canais de fase, verde e vermelho foram coletadas a cada hora, com 2 imagens por poço. A análise das imagens foi feita usando o software IncuCyte S3. Foram criadas máscaras para os canais verdes e vermelhos para contar o número de células tumorais, e anexina V-positive células, respectivamente. Para calcular o % de células Mv411-alvo anexina V-positivas, a seguinte fórmula foi usada. % de células SkBr-3 anexina V-positivas = ((contagem de objeto sobreposto) / (contagem de objeto verde)) * 100%.
Comparação de um TriNKET que visa células de câncer HER+ com SC2.2 [232] Um TriNKET que visa HER2 é mais eficaz do que Trastuzumab na redução do número de células SkBr-3, e somente 60% das células desde o tempo zero restavam após 60 horas. Um TriNKET da presente revelação que visa células tumorais/cancerosas que expressam HER2 é mais eficaz do que SC2.2 — uma molécula biespecífica de cadeia única construída a partir de um scFv derivado de trastuzumab ligado a ULBP6, um ligante para NKG2D. SC2.2 se liga às células de câncer HER2+ e células NK NKG2D+ simultaneamente. Portanto, a eficácia de SC2.2 na redução do número de células de câncer HER2+ foi investigada. Ensaios de ativação e citotoxicidade
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101/112 in vitro demonstraram que SC2.2 foi eficaz na ativação e morte de células NK. No entanto, SC2.2 não demonstrou eficácia no modelo de tumor subcutâneo RMA/S-HER2. A eficácia de SC2.2 também foi testada in vivo usando um modelo em camundongo singênico que superexpressa RMA/S-HER2. Nesse modelo em camundongo, SC2.2 não demonstrou controle do crescimento tumoral, comparado com controle de veículo. Dessa forma, embora SC2.2 fosse capaz de ativar e matar células NK, e se ligar às células de câncer HER2+, essas propriedades eram insuficientes para controlar eficazmente o crescimento de tumores HER2+.
Avaliação da meia-vida sérica de SC2.2 em camundongos C57B1/6 [233] Para determinar a meia-vida sérica de SC2.2 em camundongos C57B1/6, SC2.2 foi marcado com uma etiqueta fluorescente para rastrear sua concentração in vivo. SC2.2 foi marcado com IRDye 800CW (Licor #929-70020) . A proteína marcada foi injetada por via intravenosa em 3 camundongos C57B1/6, foi retirado sangue de cada camundongo nos pontos do tempo indicados. Após a coleta, o sangue foi centrifugado a 1.000 g por 15 minutos e soro foi coletado de cada amostra e armazenado a 4°C até que todos os pontos do tempo fossem coletados.
[234] Foram feitas imagens do soro usando um sistema de imagem infravermelho Odyssey CLx, o sinal fluorescente do canal 800 foi quantificado usando o software Image J. As intensidades das imagens foram normalizadas para o primeiro ponto do tempo, e os dados foram ajustados para uma equação de decaimento bifásico. Nesse sistema experimental, a meiavida beta de SC2.2 foi calculada como sendo em torno de 7 horas.
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Testagem in vivo de SC2.2 contra tumores subcutâneos RMA/SHER2 [235] Foi projetado um estudo in vivo de acordo com a FIG. 37 para testar a eficácia de SC2.2 contra tumores subcutâneos RMA/S-HER2. 106 células RMA/S transduzidas com HER2 humano foram injetadas por via subcutânea no flanco de 20 camundongos C57B1/6. Começando no dia 2 após inoculação do tumor SC2.2, foi dosado diariamente por meio de injeção IP. SC2.2 foi dosado em concentrações altas e baixas, juntamente com um controle de veículo. Começando no dia 4 após inoculação do tumor, os tumores foram medidos Segundafeira, Quarta-feira e Sexta-feira pela duração do estudo. O volume do tumor foi calculado usando a seguinte fórmula: Volume do tumor = Comprimento x largura x altura.
Capacidade de ligação ao anticorpo de linhagens de células de câncer HER2 humano-positivas [236] A Tabela 10 mostra os resultados da quantificação de superfície de HER2. Células SkBr-3 e HCC1954 foram identificadas como tendo níveis altos (+++) de HER2 de superfície. ZR-75-1 e Colo201 mostraram níveis médios (++) de HER2 de superfície, e 786-0 mostrou o menor nível de HER2 ( + ) .
Tabela 10: ABC de linhagens de células de câncer HER2positivas.
Linhagem celular Expressão de HER2 ABC
786-0 Baixa 28.162
Colo201 Média 273.568
ZR-75-1 Média 281.026
SkBr-3 Alta 6.820.532
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HCC1954 Alta 10.569.869
Células NK humanas primárias são ativadas por TriNKETs em cocultura com linhagens de câncer humano que expressam niveis variáveis de HER2 [237] As FIGS. 28A - 28C mostram que TriNKETs e trastuzumab foram capazes de ativar células NK humanas primárias em cocultura com células tumorais humanas HER2positivas, indicado por um aumento em degranulação de CD107a e produção de citocina IFNy. Comparados com o anticorpo monoclonal trastuzumab, ambos os TriNKETs (HER2-TriNKET-C26 e HER2-TriNKET-F04) mostraram ativação superior de células NK humanas com diversas células de câncer humano HER2.
[238] A FIG. 28A mostra que células NK humanas são ativadas por TriNKETs quando cultivadas com células SkBr-3. A FIG. 28B mostra que células NK humanas são ativadas por TriNKETs quando cultivadas com células Colo201. A FIG. 28C mostra que células NK humanas são ativadas por TriNKETs quando cultivadas com células HCC1954.
TriNKETs aumentam a citotoxicidade de células NK humanas em repouso e ativadas por IL-2 [239] As FIGS. 32A - 32C mostram aumento por TriNKET da atividade citotóxica usando células NK humanas ativadas por IL-2 e em repouso. A FIG. 32A mostra o percentual de lise especifica de células tumorais SkBr-3 por células NK humanas em repouso. A FIG. 32B mostra o percentual de lise especifica de células tumorais SkBr-3 por células NK humanas ativadas por IL-2. As populações de células NK ativadas por IL-2 e em repouso vieram do mesmo doador. Comparados com trastuzumab, TriNKETs dirigem mais potentemente respostas contra células SkBr-3 por populações de células NK ativadas ou em repouso.
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A FIG. 32C mostra o percentual de lise específica de células que expressam HER2 de câncer de pulmão NCI-H661 por células NK humanas em repouso. Dois TriNKETs com domínios de ligação ao NKG2D diferentes são capazes de induzir lise máxima maior de células de câncer NCI-H661 HER2+ comparadas com o anticorpo monoclonal Trastuzumab.
TriNKETs aumentam a citotoxicidade de células NK contra alvos com expressão de superfície baixa [240] Os efeitos de TriNKETs contra alvos células com baixa expressão de HER2 de superfície foi investigada. As FIGS. 29A-29B mostram que TriNKETs fornecem uma vantagem maior contra cânceres com HER2 médio e baixo comparados com trastuzumab. A FIG. 2 9A mostra morte por célula NK humana ativada de células tumorais SkBr-3 com HER2 alto. A FIG. 29B mostra morte por célula NK humana de células tumorais 786-0 com HER2 baixo. TriNKETs fornecem uma vantagem maior comparados com trastuzumab contra células de câncer com baixa expressão de HER2.
A vantagem de TriNKETs no tratamento de cânceres com expressão alta de FCR, ou em microambientes tumorais com níveis altos de FCR [241] A terapia com anticorpo monoclonal foi aprovada para o tratamento de muitos tipos de câncer, incluindo tanto tumores hematológicos quanto tumores sólidos. Embora o uso de anticorpos monoclonais no tratamento do câncer tenha melhorado os resultados finais dos pacientes, ainda há limitações. Estudos mecanísticos demonstraram que anticorpos monoclonais exercem seus efeitos sobre o crescimento tumoral por meio de múltiplos mecanismos, incluindo ADCC, CDC, fagocitose e bloqueio de sinal, entre outros.
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105/112 [242] Mais notavelmente, acredita-se que a ADCC seja um mecanismo importante por meio do qual anticorpos monoclonais exercem seu efeito. ADCC se baseia no engajamento de Fc de anticorpo do FcyRIII de baixa afinidade (CD16) na superfície de células natural killer, que medeiam a lise direta da célula tumoral. Entre FcyR, CD16 tem a menor afinidade para Fc de IgG, FcyRI (CD64) é o FcR de alta afinidade, e se liga cerca de 1.000 vezes mais forte ao Fc de IgG do que CD16.
[243] CD64 é normalmente expresso em muitas linhagens hematopoiéticas como, por exemplo, a linhagem mielóide, e pode ser expresso em tumores derivados desses tipos de células, por exemplo, leucemia mielóide aguda (AML). Células imunes que infiltram no tumor, tais como MDSCs e monócitos, também expressam CD64 e reconhecidamente infiltram o microambiente tumoral. A expressão de CD64 pelo tumor ou no microambiente tumoral pode ter um efeito prejudicial sobre a terapia com anticorpo monoclonal. A expressão de CD64 no microambiente tumoral torna difícil que esses anticorpos se liguem ao CD16 na superfície de células NK, na medida em que os anticorpos preferem se ligar ao receptor de alta afinidade. Por meio do direcionamento a dois receptores de ativação na superfície de células NK, TriNKETs podem ser capazes de superar o efeito prejudicial da expressão de CD64 na terapia com anticorpo monoclonal.
Morte de células mielóides normais e células B normais em culturas de PBMC: TriNKETs fornecem um perfil de segurança melhor por meio de menos efeitos colaterais no alvo/fora do tumor [244] Células natural killer e células T CD8 são, ambas, capazes de lisar diretamente células tumorais, embora os
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106/112 mecanismos por meio dos quais células NK e células CD8 T reconhecem células próprias normais de células tumorais sejam diferentes. A atividade de células NK é regulada pelo equilíbrio de sinais de receptores de ativação (NCRs, NKG2D, CD16 etc.) e inibitórios (KIRs, NKG2A etc.). O equilíbrio desses sinais de ativação e inibitórios permite que as células NK diferenciem células próprias saudáveis de células próprias estressadas, infectadas por vírus ou transformadas. Esse mecanismo embutido de autotolerância irá ajudar a proteger tecido saudável normal de respostas de células NK. Para estender esse princípio, a autotolerância de células NK permitirá que TriNKETs visem antígenos expressos tanto próprios quanto tumorais sem efeitos colaterais fora do tumor, ou com uma janela terapêutica aumentada.
[245] Diferentemente de células natural killer, células T exigem o reconhecimento de um peptídeo específico apresentado por moléculas MHC para ativação e funções efetoras. Células T foram o alvo primário da imunoterapia, e muitas estratégias foram desenvolvidas para redirecionar respostas de célula T contra o tumor. Biespecíficos de célula T, inibidores do ponto de verificação e células CAR-T foram todos aprovados pelo FDA, mas frequentemente sofrem de toxicidades dose-limitantes. Biespecíficos de célula T e células CAR-T funcionam em torno do sistema de reconhecimento TCR-MHC por utilização de domínios de ligação a antígenosalvo na superfície de células tumorais, e por utilização de domínios de sinalização modificados geneticamente para transduzir os sinais de ativação para a célula efetora. Embora eficazes para provocar uma resposta imune antitumoral. Essas terapias são frequentemente associadas à
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107/112 síndrome de liberação de citocina (CRS), e efeitos colaterais no alvo/fora do tumor. TriNKETs são únicos nesse contexto, na medida em que não irão anular os sistemas naturais de ativação e inibição de células NK. Pelo contrário, TriNKETs são projetados para gerenciar o equilíbrio, e fornecer sinais de ativação adicionais às células NK, enquanto mantêm a tolerância de NK aos próprios saudáveis.
[246] PBMCs foram isoladas de sangue total por centrifugação por gradiente de densidade. Quaisquer células sanguíneas vermelhas contaminantes foram lisadas por incubação em tampão de lise ACK. PBMCs foram lavadas 3x em PBS, e PBMCs totais foram contadas. PBMCs foram ajustadas até 106/ml em meio de cultura de célula primária. Um ml de PBMCs foram semeadas em poços de uma placa de 24 poços, os TriNKETs ou mAbs indicados foram adicionados às culturas de PBMC a 10 pg/ml. As células foram cultivadas de um dia para o outro a 37°C com CO2 5%. No dia seguinte (24 horas mais tarde), as PBMCs foram coletadas da cultura e preparadas para FACS análise. A percentagem de células B CD45+; células mielóides CD19+ e CD45+; CD33+; CDllb+ foi analisada ao longo de diferentes grupos de tratamento.
[247] As FIGS. 33A e 33B mostram que células B de um doador saudável são sensíveis à lise mediada por TriNKET; as FIGS. 33C e 33D mostram que células mielóides autólogas são protegidas de respostas de células NK mediadas por TriNKET, e, portanto, são resistentes à lise por TriNKET. PBMCs tratadas com TriNKETs que visam CD20 mostraram frequência reduzida de células B CD19+ com a população de linfócitos CD45+ (FIG. 33A), mas sem efeito na população de linfócitos CD45 + , CD3-, CD56- (FIG. 33B) . Nessas culturas, as
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108/112 frequências de células mielóides CD45+, CD33+, CDllb+ (FIG. 33C), ou a frequência de células mielóides CD45+, CD33+, CDllb+ (FIG. 33D) não foram alteradas.
TriNKETs medeiam morte por hPBMC de células tumorais SkBr-3 em coculturas de longo prazo
Ensaio de citotoxicidade de PBMCs humanas primárias [248] A FIG. 34 mostra morte de longo prazo de células SkBr-3 em cultura com PBMCs humanas. Quando cultivadas isoladamente, células SkBr-3 proliferam e quase dobram em 60 horas. Quando PBMCs humanas são adicionadas às células SkBr3 em cultura, a taxa de proliferação fica mais lenta, e quando um controle de TriNKET de isótipo que visa CD33 é adicionado, a proliferação também fica mais lenta, mas em um grau menor. Quando as culturas são tratadas com Trastuzumab, SkBr-3 não proliferam mais e, após 60 horas, somente 80% das células desde o tempo zero restam. As células SkBr-3 são sensiveis ao bloqueio de sinal de HER2, o efeito sobre o crescimento de células SkBr-3 poderia ser mediado por bloqueio de sinal de HER2 ou por meio de funções efetoras de Fc como, por exemplo, ADCC.
Exemplo 15 - Atividade citotóxica de células NK humanas em repouso mediada por TriNKETs, anticorpos monoclonais ou anticorpos biespecificos contra células HER2-positivas [249] PBMCs foram isoladas de camadas leucoplaquetárias do sangue periférico humano usando centrifugação por gradiente de densidade. PBMCs isoladas foram lavadas e preparadas para isolamento de células NK. Células NK foram isoladas usando uma técnica de seleção negativa com particulas magnéticas; a pureza das células NK isoladas foi tipicamente >90% CD3-CD56+. Células NK isoladas foram
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109/112 cultivadas em meio contendo 100 ng/ml de IL-2 ou descansaram de um dia para o outro sem citocina. Células NK ativadas por IL-2 ou em repouso foram usadas no dia seguinte em ensaios de citotoxicidade.
Ensaio de citotoxicidade DELFIA:
[250] Linhagens de células de câncer humano que expressam um alvo de interesse foram coletadas da cultura, as células foram lavadas com HBS, e foram ressuspensas em meio de crescimento a 106/ml para marcação com reagente BATDA (Perkin Elmer AD0116). As instruções do fabricante foram seguidas para marcação das células-alvo. Após marcação, as células foram lavadas 3x com HBS, e foram ressuspensas a 0,5-1,0 x 105/ml em meio de cultura. Para preparar os poços de base, uma alíquota das células marcadas foi colocada de lado, e as células foram centrifugadas para fora do meio. 100 μΐ do meio foram cuidadosamente adicionados aos poços em triplicata para evitar perturbação das células peletizadas. 100 μΐ de células marcadas com BATDA foram adicionados a cada poço da placa de 96 poços. Os poços foram salvos para liberação espontânea por células-alvo, e poços foram preparados para lise máxima de células-alvo por adição de Triton-X 1%. Anticorpos monoclonais ou TriNKETs contra o alvo tumoral de interesse foram diluídos em meio de cultura e 50 μΐ de mAb ou TriNKET diluído foram adicionados a cada poço. Células NK em repouso e/ou ativadas foram coletadas da cultura, as células foram lavadas e foram ressuspensas a 1052,0 x 106/ml em meio de cultura, dependendo da proporção E:T desejada. 50 μΐ de células NK foram adicionados a cada poço da placa para fazer um total de 200 μΐ de volume de cultura. A placa foi incubada a 37°C com CO2 5% por 2-3 horas antes
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110/112 do desenvolvimento do ensaio.
[251] Após cultivo por 2-3 horas, a placa foi removida da incubadora e as células foram peletizadas por centrifugação a 200 g por 5 minutos. Vinte μΐ de sobrenadante da cultura foram transferidos para uma microplaca limpa fornecida pelo fabricante e 200 μΐ de solução de európio em temperatura ambiente foram adicionados a cada poço. A placa foi protegida da luz e incubada em uma agitadora de placas a 250 rpm por 15 minutos. A placa foi lida usando instrumentos Victor 3 ou SpectraMax i3X. O % de lise especifica foi calculado da seguinte forma: % de lise especifica = ((Liberação experimental - Liberação espontânea) / (Liberação máxima - Liberação espontânea)) * 100% .
Combinação de anticorpo monoclonal e engajador de célula NK biespecifico não recapitula atividade de TriNKET [252] A FIG. 35 mostra a atividade citotóxica de células NK humanas em repouso mediada por TriNKETs, anticorpos monoclonais, ou anticorpos biespecificos contra a linhagem de células Colo-201HER2-positivas. Um TriNKET (ADI-29404 (F04)) que visa HER2 induziu lise máxima de células Colo-201 por células NK humanas em repouso. A mutação D265A foi introduzida no dominio CH2 do TriNKET para interromper a ligação ao FcR. O HER2-TriNKET (ADI-29404 (F04))-D265A não mediou a lise de células Colo-201, demonstrando a importância do direcionamento duplo de CD16 e NKG2D em células NK. Para demonstrar ainda mais a importância do direcionamento duplo em células NK, o anticorpo monoclonal Trastuzumab foi usado para visar HER2 e mediar ADCC por células NK. Trastuzumab isoladamente foi incapaz de aumentar lise por células NK de
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111/112 células Colo-201, mas a lise máxima obtida por Trastuzumab isoladamente foi cerca de 4x menor, comparada com o TriNKET. Para compreender a importância de ter direcionamento a CD16 e NKG2D na mesma molécula, a atividade de TriNKET (ADI-29404 (F04)) foi comparada com a atividade de um anticorpo biespecifico que visa HER2 e NKG2D, combinado com Trastuzumab. Quando usada em concentrações equimolares, a combinação de biespecifico e Trastuzumab não foi capaz de mediar lise máxima de células Colo-201 por células NK humanas em repouso. A incapacidade de Trastuzumab + biespecifico combinação demonstra a importância de conter a ligação triespecifica de TriNKETs em uma molécula.
Exemplo 16 - Ensaio de ponte [253] Células RMA transduzidas com HER2 humano foram usadas para testar a ligação simultânea ao HER2 e NKG2D por TriNKETs que visam HER2. Os TriNKETs foram usados para corar HER2 de superfície a 20 pg/ml. A ligação do TriNKET foi então detectada usando NKG2D humano recombinante-Fc biotinilado. A ligação ao NKG2D-Fc foi então detectada usando estreptavidina-APC. As células foram analisadas por citometria de fluxo, e a ponte por TriNKET foi comparada com populações de células de isótipo coradas e não coradas. A FIG. 38A mostra que TriNKET-C26 que inclui um domínio de ligação para HER2 serve de ponte entre hNKG2D-Fc e células RMA-HER2, e a FIG. 38B mostra TriNKET-F04 que inclui um domínio de ligação para HER2, serve de ponte entre hNKG2DFc e células RMA-HER2.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA [254] A revelação completa de cada um dos documentos de patente e artigos científicos citados nesse relatório
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112/112 descritivo é incorporada por referência para todas as finalidades.
EQUIVALENTES [255] A invenção pode ser exemplificada em outras formas especificas, sem se afastar do espirito ou suas caracteristicas essenciais. As modalidades apresentadas anteriormente, portanto, devem ser consideradas em todos os aspectos ilustrativas, e não limitantes, da invenção descrita nesse relatório descritivo. 0 escopo da invenção, dessa forma, é indicado pelas reivindicações em anexo, e não pela descrição apresentada anteriormente, e todas as alterações englobadas pelo significado e amplitude de equivalência das reivindicações visam ser por elas englobadas.

Claims (38)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Proteína caracterizada por compreender:
    (a) um primeiro sítio de ligação ao antigeno que se liga à NKG2D;
    (b) um segundo sítio de ligação ao antigeno que se liga a HER2; e (c) um domínio Fc de anticorpo ou uma porção deste suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antigeno que se liga a CD16.
  2. 2. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antigeno se liga à NKG2D em humanos, primatas não humanos e roedores.
  3. 3. Proteína, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antigeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve.
  4. 4. Proteína, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve estão presentes no mesmo polipeptídeo.
  5. 5. Proteína, de acordo com reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antigeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve.
  6. 6. Proteína, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antigeno estão presentes no mesmo polipeptídeo.
  7. 7. Proteína, de acordo com a reivindicação 5 ou 6,
    Petição 870190080152, de 19/08/2019, pág. 20/29
    2/8 caracterizada pelo fato de que o domínio variável da cadeia leve do primeiro sitio de ligação ao antigeno possui uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos do dominio variável da cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno.
  8. 8. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 1.
  9. 9. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 41 e um domínio variável da cadeia leve pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 42.
  10. 10. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 43 e um domínio variável da cadeia leve pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 44.
  11. 11. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 45 e um domínio variável da cadeia leve pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 46.
  12. 12. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizada pelo fato de que o primeiro
    Petição 870190080152, de 19/08/2019, pág. 21/29
    3/8 sítio de ligação ao antigeno compreende um domínio variável da cadeia pesada pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 47 e um domínio variável da cadeia leve pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 48.
  13. 13. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antigeno compreende um domínio variável da cadeia pesada pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 94 e um domínio variável da cadeia leve pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 95.
  14. 14. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antigeno compreende um domínio variável da cadeia pesada pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 102 e um domínio variável da cadeia leve pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 103.
  15. 15. Proteína, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antigeno é um anticorpo de domínio único.
  16. 16. Proteína, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o anticorpo de domínio único é um fragmento de VhH ou um fragmento de Vnar.
  17. 17. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2 ou 15-16, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antigeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve.
  18. 18. Proteína, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve do segundo sítio
    Petição 870190080152, de 19/08/2019, pág. 22/29
    4/8 de ligação ao antígeno estão presentes no mesmo polipeptídeo.
  19. 19. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 49 e o domínio variável da cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 53.
  20. 20. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que inclui:
    uma sequência da CDR1 da cadeia pesada idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 50;
    uma sequência da CDR2 da cadeia pesada idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 51; e uma sequência da CDR3 da cadeia pesada idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 52.
  21. 21. Proteína, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o domínio variável da cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que inclui:
    uma sequência da CDR1 da cadeia leve idêntica à sequência de aminoácidos do ID . DE SEQ. N° : 54; uma sequência da CDR2 da cadeia leve idêntica à sequência de aminoácidos do ID . DE SEQ. N° : 55; e uma sequência da CDR3 da cadeia leve idêntica à sequência de aminoácidos do ID . DE SEQ. N° : 56.
    Petição 870190080152, de 19/08/2019, pág. 23/29
    5/8
  22. 22. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18, caracterizada pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antigeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 57 e o domínio variável da cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antigeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 58.
  23. 23. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 22, caracterizada pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antigeno compreende uma sequência de aminoácidos que inclui:
    uma sequência da CDR1 da cadeia pesada idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 77;
    uma sequência da CDR2 da cadeia pesada idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 78; e uma sequência da CDR3 da cadeia pesada idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 79.
  24. 24. Proteína, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o domínio variável da cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antigeno compreende uma sequência de aminoácidos que inclui:
    uma sequência da CDR1 da cadeia leve idêntica à sequência de aminoácidos do ID . DE SEQ. N° : 80; uma sequência da CDR2 da cadeia leve idêntica à sequência de aminoácidos do ID . DE SEQ. N° : 81; e uma sequência da CDR3 da cadeia leve idêntica à sequência de aminoácidos do ID . DE SEQ. N° : 82.
  25. 25. Proteína, de acordo com qualquer uma das
    Petição 870190080152, de 19/08/2019, pág. 24/29
    6/8 reivindicações 1-18, caracterizada pelo fato de que o dominio variável da cadeia pesada do segundo sitio de ligação ao antigeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 59 e o dominio variável da cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 60.
  26. 26. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 25, caracterizada pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que inclui:
    uma sequência da CDR1 da cadeia pesada idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 83;
    uma sequência da CDR2 da cadeia pesada idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 84; e uma sequência da CDR3 da cadeia pesada idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 85.
  27. 27. Proteína, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o domínio variável da cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que inclui:
    uma sequência da CDR1 da cadeia leve idêntica à sequência de aminoácidos do ID . DE SEQ. N° : 8 6; uma sequência da CDR2 da cadeia leve idêntica à sequência de aminoácidos do ID . DE SEQ. N° : 87; e uma sequência da CDR3 da cadeia leve idêntica à sequência de aminoácidos do ID . DE SEQ. N° : 88.
  28. 28. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 ou 8-16, caracterizada pelo fato de que
    Petição 870190080152, de 19/08/2019, pág. 25/29
    7/8 o segundo sítio de ligação ao antígeno é um anticorpo de domínio único.
  29. 29. Proteína, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno é um fragmento de VhH ou um fragmento de Vnar.
  30. 30. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a proteína compreende uma porção de um domínio Fc de anticorpo suficiente para se ligar a CD16, em que o domínio Fc de anticorpo compreende domínios de dobradiça e CH2.
  31. 31. Proteína, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o domínio Fc de anticorpo compreende domínios de dobradiça e CH2 de um anticorpo IgGl humana.
  32. 32. Proteína, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizada pelo fato de que o domínio Fc compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgGl humana.
  33. 33. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30-32, caracterizada pelo fato de que o domínio Fc compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica ao domínio Fc de IgGl humana e difere em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em Q347, Y349, T350, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411, K439.
  34. 34. Formulação caracterizada por compreender uma proteína, conforme definida em qualquer uma das reivindicações precedentes, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
    Petição 870190080152, de 19/08/2019, pág. 26/29
    8/8
  35. 35. Célula caracterizada por compreender um ou mais ácidos nucleicos que expressam uma proteína, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-33.
  36. 36. Método caracterizado pelo fato de aumentar diretamente e/ou indiretamente a morte da célula tumoral, o método compreendendo a exposição de um tumor e células natural killer a uma proteína, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-33.
  37. 37. Método de tratamento de câncer caracterizado pelo fato de que o método compreende a administração de uma proteína, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-33, ou uma formulação, conforme definida na reivindicação 34, a um paciente.
  38. 38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em cânceres de mama, ovariano, esofágico, da bexiga e gástrico, carcinoma do dueto salivar, adenocarcinoma do pulmão e formas agressivas de câncer uterino, por exemplo, carcinoma endometrial seroso uterino.
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2018219887A1 (en) * 2017-02-08 2019-08-22 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
CA3235295A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
PE20220278A1 (es) 2018-02-08 2022-02-25 Dragonfly Therapeutics Inc Dominios variables de anticuerpos que se dirigen al receptor nkg2d
SG11202007945UA (en) * 2018-02-20 2020-09-29 Dragonfly Therapeutics Inc Multi-specific binding proteins that bind cd33, nkg2d, and cd16, and methods of use
EA202091977A1 (ru) * 2018-05-28 2021-02-09 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Мультиспецифические связывающие белки, которые связывают cd33, nkg2d и cd16, и способы применения
EA202091888A1 (ru) * 2018-08-08 2020-10-23 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Вариабельные домены антител, нацеленные на рецептор nkg2d
CN113286808A (zh) 2018-10-23 2021-08-20 蜻蜓疗法股份有限公司 异二聚体Fc融合蛋白
PE20221404A1 (es) * 2019-08-30 2022-09-15 Dragonfly Therapeutics Inc Formulaciones farmaceuticas y regimenes de dosificacion para proteinas de union multiespecificas que se unen a her2, nkg2d y cd16 para el tratamiento del cancer
CN116063550A (zh) * 2020-09-02 2023-05-05 南京北恒生物科技有限公司 靶向nk激活性受体的嵌合抗原受体
WO2022258691A1 (en) * 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
WO2024056862A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Avidicure Ip B.V. Multispecific antigen binding proteins for tumor-targeting of nk cells and use thereof

Family Cites Families (274)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0366707A1 (en) 1987-05-06 1990-05-09 OOSTERWIJK, Egbert Monoclonal antibodies to renal cell carcinoma
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
WO1989006544A1 (en) 1988-01-15 1989-07-27 Centocor, Inc. Heteroligating antibodies and therapeutic uses thereof
DE69128253T2 (de) 1990-10-29 1998-06-18 Chiron Corp Bispezifische antikörper, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendungen
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US6036955A (en) 1992-03-05 2000-03-14 The Scripps Research Institute Kits and methods for the specific coagulation of vasculature
ES2193143T3 (es) 1992-03-05 2003-11-01 Univ Texas Uso de inmunoconjugados para la diagnosis y/o terapia de tumores vascularizaos.
US5660827A (en) 1992-03-05 1997-08-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibodies that bind to endoglin
US7381803B1 (en) 1992-03-27 2008-06-03 Pdl Biopharma, Inc. Humanized antibodies against CD3
US6129914A (en) 1992-03-27 2000-10-10 Protein Design Labs, Inc. Bispecific antibody effective to treat B-cell lymphoma and cell line
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
EP0871673B1 (en) 1995-05-03 2006-04-05 Bioenhancementsments Ltd. Bispecific antibodies in which the binding capability is reversibly inhibited by a photocleavable moiety
DE19531346A1 (de) 1995-08-25 1997-02-27 Gsf Forschungszentrum Umwelt Arzneimittel zur Immuntherapie, enthaltend Antikörper, die spezifisch das MHCII-Antigen eines zu behandelnden Patienten erkennen
US7951917B1 (en) 1997-05-02 2011-05-31 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
AU761587B2 (en) 1998-04-21 2003-06-05 Amgen Research (Munich) Gmbh CD19xCD3 specific polypeptides and uses thereof
US6572856B1 (en) 1998-09-10 2003-06-03 The University Of Virginia Patent Foundation Methods for the prevention and treatment of cancer using anti-C3b(i) antibodies
DK1124568T3 (da) 1998-10-21 2008-01-02 Altor Bioscience Corp Polyspecifikke bindingsmolekyler og anvendelser deraf
EP1266014A2 (en) 2000-03-24 2002-12-18 Peter Kufer Multifunctional polypeptides comprising a binding site to an epitope of the nkg2d receptor complex
EP1299419A2 (en) 2000-05-24 2003-04-09 Imclone Systems, Inc. Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production
US20040115198A1 (en) 2001-02-28 2004-06-17 Fred Hutchinson Cancer Research Center Activation of lymphocyte populations expressing NKG2D using anti-NKG2D antibodies and ligand derivatives
US20020193569A1 (en) 2001-06-04 2002-12-19 Idec Pharmaceuticals Corporation Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells
DE10156482A1 (de) 2001-11-12 2003-05-28 Gundram Jung Bispezifisches Antikörper-Molekül
US7202343B2 (en) 2002-08-19 2007-04-10 Abgenix, Inc. Antibodies directed to monocyte chemo-attractant protein-1 (MCP-1) and uses thereof
US7820166B2 (en) 2002-10-11 2010-10-26 Micromet Ag Potent T cell modulating molecules
DE10261223A1 (de) 2002-12-20 2004-07-08 MedInnova Gesellschaft für medizinische Innovationen aus akademischer Forschung mbH Steigerung der Immunantwort durch Substanzen, welche die Funktion von Natürlichen Killerzellen beeinflussen
JP2007523602A (ja) 2003-02-06 2007-08-23 マイクロメット アクツィエン ゲゼルシャフト 持続的なｔ細胞応答方法
US7666417B2 (en) 2003-04-22 2010-02-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions for treating autoimmune diseases or conditions
CN100509850C (zh) 2003-05-31 2009-07-08 麦克罗梅特股份公司 用于治疗b细胞相关疾病的包含双特异性抗cd3、抗cd19抗体构建体的药物组合物
ATE455127T1 (de) 2003-05-31 2010-01-15 Micromet Ag Humane anti-humane cd3-bindungsmoleküle
CN104645327A (zh) 2003-07-24 2015-05-27 依奈特制药公司 使用nk细胞增效化合物提高治疗性抗体功效的方法和组合物
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
DE602004030811D1 (de) 2003-10-16 2011-02-10 Micromet Ag Multispezifische deimmunisierte cd3-bindende moleküle
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
US20110020273A1 (en) 2005-04-06 2011-01-27 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Bispecific Immunocytokine Dock-and-Lock (DNL) Complexes and Therapeutic Use Thereof
MXPA06009253A (es) 2004-02-16 2007-04-18 Micromet Ag Moleculas de enlace menos inmunogenicas.
EP1769000B1 (en) 2004-07-16 2014-12-24 Amgen Research (Munich) GmbH Expression-enhanced polypeptides
ZA200701234B (en) * 2004-07-22 2008-12-31 Genentech Inc HER2 antibody composition
AU2005291039A1 (en) 2004-10-01 2006-04-13 Avidex Ltd. T-cell receptors containing a non-native disulfide interchain bond linked to therapeutic agents
DOP2006000029A (es) 2005-02-07 2006-08-15 Genentech Inc Antibody variants and uses thereof. (variantes de un anticuerpo y usos de las mismas)
US9296816B2 (en) 2005-04-15 2016-03-29 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9284375B2 (en) 2005-04-15 2016-03-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
JP2006316040A (ja) 2005-05-13 2006-11-24 Genentech Inc Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）補助療法
JP2009500346A (ja) 2005-06-29 2009-01-08 ユニバーシティー・オブ・マイアミ 癌処置用の抗体−免疫細胞リガンド融合タンパク質
US20070190063A1 (en) 2005-08-19 2007-08-16 Bahjat Keith S Antibody-mediated enhancement of immune response
PE20071101A1 (es) 2005-08-31 2007-12-21 Amgen Inc Polipeptidos y anticuerpos
JP5686953B2 (ja) 2005-10-11 2015-03-18 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー 交差種特異的（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を含む組成物および該組成物の使用
EP1934260B1 (en) 2005-10-14 2017-05-17 Innate Pharma Compositions and methods for treating proliferative disorders
US20080299137A1 (en) 2005-10-28 2008-12-04 Novo Nordisk A/S Fusion Proteins That Bind Effector Lymphocytes And Target Cells
WO2007097812A2 (en) 2005-11-03 2007-08-30 Genentech, Inc. Therapeutic anti-her2 antibody fusion polypeptides
US20070248607A1 (en) 2005-11-03 2007-10-25 Thomas Spies Negative immunomodulation of immune responses by nkg2d-positive cd4+ cells
EP1976886B1 (en) 2005-12-16 2014-12-17 Amgen Research (Munich) GmbH Means and methods for the treatment of tumorous diseases
EP1820513A1 (en) 2006-02-15 2007-08-22 Trion Pharma Gmbh Destruction of tumor cells expressing low to medium levels of tumor associated target antigens by trifunctional bispecific antibodies
MX2008015524A (es) 2006-06-12 2009-01-13 Trubion Pharmaceuticals Inc Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora.
GB0614780D0 (en) 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
US8192927B2 (en) 2006-09-07 2012-06-05 Crucell Holland B.V. Human bind molecules capable of neutralizing influenza virus h5n1 and uses thereof
EP1900752A1 (en) 2006-09-15 2008-03-19 DOMPE' pha.r.ma s.p.a. Human anti-folate receptor alpha antibodies and antibody fragments for the radioimmunotherapy of ovarian carcinoma
WO2008143954A2 (en) 2007-05-14 2008-11-27 Biogen Idec Ma Inc. Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
EP2014680A1 (en) 2007-07-10 2009-01-14 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Recombinant, single-chain, trivalent tri-specific or bi-specific antibody derivatives
US8119130B2 (en) 2007-07-25 2012-02-21 Medimmune Limited Targeted binding agents directed to KDR and uses thereof—035
EP2185701A4 (en) 2007-08-15 2011-03-02 Amunix Operating Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCING THE PRODUCTION OF RECOMBINANT POLYPEPTIDES
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
MX344415B (es) 2007-09-14 2016-12-15 Adimab Inc Bancos de anticuerpos sinteticos, designados racionalmente y usos para los mismos.
DK2222706T4 (en) 2007-12-14 2016-11-21 Novo Nordisk As Antibodies that bind to NKG2D and its use
MX350962B (es) 2008-01-07 2017-09-27 Amgen Inc Metodo para fabricar moleculas heterodimericas de fragmentos cristalizables de anticuerpo, utilizando efectos electrostaticos de direccion.
BRPI0906498A2 (pt) 2008-01-22 2015-07-14 Biogen Idec Inc Anticorpo ron e seus usos
BRPI0913366A8 (pt) * 2008-06-03 2017-07-11 Abbott Lab Imunoglobulinas de domínio variável duplo e seus usos
US8067339B2 (en) 2008-07-09 2011-11-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Surface display of whole antibodies in eukaryotes
WO2010017103A2 (en) 2008-08-04 2010-02-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic Fully human anti-human nkg2d monoclonal antibodies
EP2352758A2 (en) 2008-09-26 2011-08-10 Wyeth LLC Single chain antibody library design
WO2010054007A1 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Fabrus Llc Combinatorial antibody libraries and uses thereof
US10865233B2 (en) 2008-12-18 2020-12-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. NKG2D-fc for immunotherapy
KR20110104032A (ko) 2008-12-19 2011-09-21 마크로제닉스, 인크. 공유결합형 디아바디 및 이의 용도
CA2757531A1 (en) 2009-04-07 2010-10-14 Roche Glycart Ag Bispecific anti-erbb-3/anti-c-met antibodies
WO2010132697A2 (en) 2009-05-13 2010-11-18 Genzyme Corporation Methods and compositions for treatment
WO2010144295A1 (en) 2009-06-09 2010-12-16 University Of Miami Aptamer-targeted costimulatory ligand aptamer
WO2011003780A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Bi-specific digoxigenin binding antibodies
UY32808A (es) * 2009-07-29 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
KR101679602B1 (ko) 2009-09-11 2016-11-25 다카라 바이오 가부시키가이샤 내추럴킬러 세포의 제조방법
WO2011051307A1 (en) 2009-10-27 2011-05-05 Micromet Ag Dosage regimen for administering a cd19xcd3 bispecific antibody
US8999398B2 (en) 2009-11-06 2015-04-07 Transtarget Inc. Polyclonal bispecific antibody compositions and method of use
EP2332994A1 (en) 2009-12-09 2011-06-15 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Trispecific therapeutics against acute myeloid leukaemia
TW201132353A (en) 2009-12-18 2011-10-01 Amgen Inc WISE binding agents and epitopes
US8658765B2 (en) 2009-12-31 2014-02-25 Avidbiotics Corp. Non-natural MIC proteins
US8796420B2 (en) 2009-12-31 2014-08-05 Avidbiotics Corp. Non-natural MIC proteins
WO2011085178A1 (en) 2010-01-11 2011-07-14 Trustees Of Dartmouth College Monomeric bi-specific fusion protein
US8802091B2 (en) 2010-03-04 2014-08-12 Macrogenics, Inc. Antibodies reactive with B7-H3 and uses thereof
JP5998060B2 (ja) 2010-03-04 2016-09-28 マクロジェニクス，インコーポレーテッド Ｂ７−ｈ３と反応性のある抗体、その免疫学的に活性なフラグメントおよびその使用
TWI653333B (zh) 2010-04-01 2019-03-11 安進研究（慕尼黑）有限責任公司 跨物種專一性之ＰＳＭＡｘＣＤ３雙專一性單鏈抗體
SG10201800757TA (en) 2010-04-20 2018-02-27 Genmab As Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof
CA2797981C (en) 2010-05-14 2019-04-23 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
ES2961381T3 (es) 2010-06-19 2024-03-11 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anticuerpos anti-GD2
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
DE102010039018B4 (de) 2010-08-06 2013-02-28 Technische Universität Dresden Anti-La Antikörper und ihre Anwendung zum Immunotargeting
JP2013537416A (ja) 2010-08-13 2013-10-03 メディミューン リミテッド 変異型Ｆｃ領域を含むモノマーポリペプチド及び使用方法
WO2012025530A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized - fv fragment
UY33578A (es) 2010-08-31 2012-03-30 Sanofi Sa PÉPTIDO O COMPLEJO PEPTÍDICO QUE SE UNE A INTEGRINA a(ALFA) Y MÉTODOS Y USOS QUE IMPLICAN A LOS MISMOS
WO2012032080A1 (en) 2010-09-07 2012-03-15 F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H Stabilised human fc
CN103328511B (zh) 2010-09-10 2016-01-20 埃派斯进有限公司 抗-IL-1β抗体及其使用方法
WO2012061558A2 (en) 2010-11-04 2012-05-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
MX352929B (es) 2010-11-05 2017-12-13 Zymeworks Inc DISEÑO DE ANTICUERPOS HETERODIMÉRICOS ESTABLES CON MUTACIONES EN EL DOMINIO Fc.
CA2817015A1 (en) 2010-11-09 2012-05-18 Altimab Therapeutics, Inc. Protein complexes for antigen binding and methods of use
US20120195900A1 (en) 2010-12-22 2012-08-02 Abbott Laboratories Tri-variable domain binding proteins and uses thereof
CA2827923C (en) 2011-02-25 2021-11-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc.gamma.riib-specific fc antibody
CA2830254C (en) 2011-03-16 2019-09-10 Amgen Inc. Fc variants
EA028804B1 (ru) 2011-03-25 2018-01-31 Гленмарк Фармасьютикалс С.А. Гетеродимерные иммуноглобулины
CN107936121B (zh) 2011-05-16 2022-01-14 埃泰美德(香港)有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
CA2836873C (en) 2011-05-21 2019-10-22 Macrogenics, Inc. Deimmunized serum-binding domains and their use for extending serum half-life
DK2714738T3 (en) 2011-05-24 2019-01-28 Zyngenia Inc MULTIVALENT AND MONOVALENT MULTISPECIFIC COMPLEXES AND THEIR APPLICATIONS
US8852599B2 (en) 2011-05-26 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use
WO2012175613A1 (en) 2011-06-21 2012-12-27 Innate Pharma NKp46-MEDIATED NK CELL TUNING
DE102011118022B4 (de) 2011-06-30 2018-01-18 Gemoab Monoclonals Gmbh Antikörper gegen das Prostata-spezifische Stammzellenantigen und dessen Verwendung
CA2839539C (en) 2011-06-30 2021-06-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Heterodimerized polypeptide
BR112014001573B8 (pt) 2011-07-22 2022-11-08 Affimed Therapeutics Ag Molécula fv ao antígeno multivalente
US10040853B2 (en) 2011-09-09 2018-08-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions involving NKG2D inhibitors and cancer
EP3939996A1 (en) 2011-09-30 2022-01-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
BR112014007353B1 (pt) 2011-09-30 2022-09-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Biblioteca de anticorpos dependentes de concentração de íon
ES2628075T3 (es) 2011-12-19 2017-08-01 Synimmune Gmbh Molécula de anticuerpo biespecífica
MX363819B (es) 2012-02-08 2019-04-03 Igm Biosciences Inc Uniones a cdim y sus usos.
GB201203442D0 (en) 2012-02-28 2012-04-11 Univ Birmingham Immunotherapeutic molecules and uses
US9029510B2 (en) 2012-03-30 2015-05-12 Sorrento Therapeutics, Inc. Fully human antibodies that bind to VEGFR2 and methods of use thereof
LT2838918T (lt) 2012-04-20 2019-09-10 Merus N.V. Būdai ir priemonės heterodimerinių ig-tipo molekulių gamybai
US9163090B2 (en) 2012-05-07 2015-10-20 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies specific for CLL-1
CN107964042B (zh) 2012-05-30 2022-04-19 中外制药株式会社 靶组织特异性抗原结合分子
WO2013187495A1 (ja) 2012-06-14 2013-12-19 中外製薬株式会社 改変されたFc領域を含む抗原結合分子
US10377827B2 (en) 2012-06-21 2019-08-13 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind c-met
CA2871880A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for selection and production of tailor-made highly selective and multi-specific targeting entities containing at least two different binding entities and uses thereof
AU2013289883B2 (en) 2012-07-13 2018-11-01 Zymeworks Bc Inc. Bispecific asymmetric heterodimers comprising anti-CD3 constructs
US20140072581A1 (en) 2012-07-23 2014-03-13 Zymeworks Inc. Immunoglobulin Constructs Comprising Selective Pairing of the Light and Heavy Chains
US20150203591A1 (en) 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
WO2014028560A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
CA2889681C (en) 2012-09-27 2023-04-11 Merus B.V. Bispecific igg antibodies as t cell engagers
JP6571527B2 (ja) 2012-11-21 2019-09-04 ウーハン ワイゼットワイ バイオファルマ カンパニー リミテッドＷｕｈａｎ Ｙｚｙ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． 二重特異性抗体
EA032681B1 (ru) 2012-11-27 2019-07-31 Аджоу Юниверсити Индастри-Академик Кооперейшн Фаундейшн ГЕТЕРОДИМЕР Fc ИММУНОГЛОБУЛИНА, СОДЕРЖАЩИЙ ВАРИАНТ ДОМЕНА CH3 ДЛЯ ОБРАЗОВАНИЯ АНТИТЕЛА ИЛИ ГИБРИДНОГО БЕЛКА С ГЕТЕРОМЕРНЫМ Fc С ВЫСОКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ, СПОСОБ ДЛЯ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
EA201500741A1 (ru) * 2013-01-10 2016-01-29 Генмаб Б.В. ВАРИАНТЫ Fc-ОБЛАСТИ IGG1 ЧЕЛОВЕКА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
KR102211837B1 (ko) 2013-01-14 2021-02-03 젠코어 인코포레이티드 신규한 이형이량체 단백질
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
EP2948475A2 (en) 2013-01-23 2015-12-02 AbbVie Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
EP2953972B1 (en) 2013-02-05 2020-07-08 EngMab Sàrl Method for the selection of antibodies against bcma
RS59992B1 (sr) 2013-02-26 2020-04-30 Roche Glycart Ag Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju t ćelije specifični za cd3 i cea
RU2721707C2 (ru) 2013-03-14 2020-05-21 Макродженикс, Инк. Биспецифичные молекулы, иммунореактивные с иммунными эффекторными клетками, экспрессирующими активирующий рецептор
US10858417B2 (en) * 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP2968545B1 (en) 2013-03-15 2019-03-06 Memorial Sloan Kettering Cancer Center High affinity anti-gd2 antibodies
EP3587448B1 (en) * 2013-03-15 2021-05-19 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2014165818A2 (en) 2013-04-05 2014-10-09 T Cell Therapeutics, Inc. Compositions and methods for preventing and treating prostate cancer
WO2014179363A1 (en) 2013-04-29 2014-11-06 Adimab, Llc Polyspecificity reagents, methods for their preparation and use
CN105408356A (zh) 2013-05-10 2016-03-16 努玛有限公司 双特异性构建体及其用于治疗多种疾病的用途
US10174117B2 (en) 2013-06-11 2019-01-08 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Anti-HER2 single domain antibodies, polypeptides comprising thereof and their use for treating cancer
TW201536810A (zh) 2013-07-15 2015-10-01 Novo Nordisk As 結合尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物之抗體
PT3021869T (pt) 2013-07-16 2020-09-10 Hoffmann La Roche Métodos de tratamento do cancro com antagonistas da ligação ao eixo pd-1 e inibidores do tigit
CN105722859B (zh) 2013-07-25 2021-05-07 西托姆克斯治疗公司 多特异性抗体、多特异性可活化抗体及其使用方法
CN105636982B (zh) 2013-09-16 2020-06-23 健康与环境慕尼黑德国研究中心赫姆霍茨中心（有限责任公司） 用于治疗hbv感染和相关病症的结合免疫效应细胞表面抗原和hbv抗原的双或多特异性多肽
GB2518221A (en) 2013-09-16 2015-03-18 Sergej Michailovic Kiprijanov Tetravalent antigen-binding protein molecule
GB2519786A (en) 2013-10-30 2015-05-06 Sergej Michailovic Kiprijanov Multivalent antigen-binding protein molecules
CN106414500B (zh) 2013-11-07 2020-04-10 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 抗-wt1/hla双特异性抗体
DE102013019352A1 (de) 2013-11-13 2015-09-17 Elke Pogge Von Strandmann Tri-spezifische rekombinante Antikörperderivate zur Behandlung von malignen Erkrankungen durch Aktivierung einer NK-Zell-basierten Immunantwort
WO2015077891A1 (en) 2013-11-27 2015-06-04 Zymeworks Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting her2
CN105814084B (zh) 2013-12-13 2019-09-24 基因泰克公司 抗cd33抗体和免疫缀合物
WO2015095412A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Zhong Wang Bispecific antibody with two single-domain antigen-binding fragments
MX2016006529A (es) 2013-12-20 2016-08-03 Genentech Inc Anticuerpos dobles especificos.
MX2016008098A (es) 2013-12-20 2017-01-11 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecificos del receptor 2 de factor de crecimiento ipidermico himano (her2) y metodo de uso.
WO2015095972A1 (en) 2013-12-23 2015-07-02 The Centre For Drug Research And Development Antibodies comprising c-terminal light chain polypeptide extensions and conjugates and methods of use thereof
JP6706578B2 (ja) 2013-12-30 2020-06-10 エピムアブ バイオセラピューティクス インコーポレイテッド タンデム型Ｆａｂ免疫グロブリン及びその使用
US20160326249A1 (en) 2014-01-15 2016-11-10 Zymeworks Inc. Bi-specific cd3 and cd19 antigen-binding constructs
SG10201906460PA (en) 2014-03-05 2019-09-27 Ucl Business Plc Chimeric Antigen Receptor (Car) With Antigen Binding Domains to the T Cell Receptor Beta Constant Region
RU2016142476A (ru) 2014-03-31 2018-05-07 Дженентек, Инк. Комбинированная терапия, включающая антиангиогенезные агенты и агонисты, связывающие ох40
US20170022291A1 (en) 2014-04-01 2017-01-26 Adimab, Llc Multispecific antibody analogs comprising a common light chain, and methods of their preparation and use
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
IL278350B (en) 2014-04-03 2022-06-01 Igm Biosciences Inc J-chain qualified
EP3129055B1 (en) 2014-04-11 2020-07-01 MedImmune, LLC Bispecific her2 antibodies
EP2930188A1 (en) 2014-04-13 2015-10-14 Affimed Therapeutics AG Trifunctional antigen-binding molecule
EP2942629A1 (en) 2014-05-08 2015-11-11 Universität Würzburg Predictive markers for successful cancer immunotherapy
KR20220025917A (ko) 2014-05-29 2022-03-03 마크로제닉스, 인크. 삼중-특이적 결합 분자 및 그것의 사용 방법
GB201409558D0 (en) 2014-05-29 2014-07-16 Ucb Biopharma Sprl Method
EP3161002A1 (en) 2014-06-27 2017-05-03 Innate Pharma MULTISPECIFIC NKp46 BINDING PROTEINS
CA2952532A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Innate Pharma Multispecific antigen binding proteins
WO2015197582A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Innate Pharma Monomeric multispecific antigen binding proteins
CN107109419B (zh) 2014-07-21 2020-12-22 诺华股份有限公司 使用cd33嵌合抗原受体治疗癌症
CN106999556B (zh) 2014-07-21 2021-07-30 武汉友芝友生物制药有限公司 细胞因子诱导的杀伤细胞的双特异性抗体介导的癌症治疗
US9777073B2 (en) 2014-07-21 2017-10-03 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Construction and application of bispecific antibody EpCAM×CD3
WO2016025880A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Novartis Ag Treatment of cancer using gfr alpha-4 chimeric antigen receptor
EP2985294A1 (en) 2014-08-14 2016-02-17 Deutsches Krebsforschungszentrum Recombinant antibody molecule and its use for target cell restricted T cell activation
JO3663B1 (ar) 2014-08-19 2020-08-27 Merck Sharp & Dohme الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين
EP3186282A1 (en) 2014-08-28 2017-07-05 Academisch Ziekenhuis Leiden h.o.d.n. LUMC Cd94/nkg2a and/or cd94/nkg2b antibody, vaccine combinations
ES2688035T3 (es) 2014-08-29 2018-10-30 Gemoab Monoclonals Gmbh Receptor de antígeno universal que expresa células inmunes para direccionamiento de antígenos múltiples diversos, procedimiento para fabricación del mismo y utilización del mismo para tratamiento de cáncer, infecciones y enfermedades autoinmunes
CA2966397A1 (en) 2014-11-03 2016-05-12 Merck Patent Gmbh Methods for generating bispecific shark variable antibody domains and use thereof
PL3227332T3 (pl) 2014-12-03 2020-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Wielospecyficzne przeciwciała
CA3204990A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Xyphos Biosciences Inc. Insertable variable fragments of antibodies and modified a1-a2 domains of nkg2d ligands
US20160176983A1 (en) 2014-12-17 2016-06-23 Intrexon Corporation Intercalated single-chain variable fragments
BR112017012910A2 (pt) 2014-12-19 2018-02-06 Biotecnol Limited proteína de fusão que compreende três domínios de ligação a 5t4 e cd3
CN107405399B (zh) 2015-01-02 2022-02-08 武田药品工业株式会社 针对血浆激肽释放酶和因子xii的双特异性抗体
JP2018503399A (ja) 2015-01-14 2018-02-08 コンパス セラピューティクス リミテッド ライアビリティ カンパニー 多特異性免疫調節抗原結合構築物
AR100680A1 (es) 2015-01-26 2016-10-26 Macrogenics Inc Anticuerpos anti-dr5 y moléculas que comprenden dominios de unión de dr5 de los mismos
AU2016219785B2 (en) 2015-02-20 2021-10-28 Ohio State Innovation Foundation Bivalent antibody directed against NKG2D and tumor associated antigens
MA41613A (fr) 2015-02-23 2018-01-02 Abbvie Stemcentrx Llc Récepteurs antigéniques chimériques anti-dll3 et procédés d'utilisation desdits récepteurs
WO2016135041A1 (en) 2015-02-26 2016-09-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Fusion proteins and antibodies comprising thereof for promoting apoptosis
WO2016142768A1 (en) 2015-03-10 2016-09-15 Eureka Therapeutics, Inc. Ror2 antibody
US10711054B2 (en) 2015-03-16 2020-07-14 Helmholtz Zentrum München—Deutsches Forschungszentrum fur Gesundheit und umwelt (GmbH) Trispecific binding molecules for treating HBV infection and associated conditions
MX2017012352A (es) 2015-04-03 2018-01-26 Eureka Therapeutics Inc Construccion dirigida a complejos de peptido de alfa-fetoproteina/complejo principal de histocompatibilidad (afp/cph) y usos de los mismos.
SI3280432T1 (sl) 2015-04-06 2021-09-30 Subdomain, Llc De novo vezavna domena, ki vsebuje polipeptide in njene uporabe
CA2981851A1 (en) 2015-04-07 2016-10-13 Alector Llc Anti-sortilin antibodies and methods of use thereof
WO2016166139A1 (en) 2015-04-14 2016-10-20 Eberhard Karls Universität Tübingen Bispecific fusion proteins for enhancing immune responses of lymphocytes against tumor cells
US11155615B2 (en) 2015-05-18 2021-10-26 Eureka Therapeutics, Inc. Anti-ROR1 antibodies
EP3095792A1 (en) 2015-05-19 2016-11-23 Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München T cell receptor with specificity for myeloperoxidase peptide and uses thereof
US20180147257A1 (en) 2015-05-22 2018-05-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Btn3a ectodomain proteins and methods of use
MY188049A (en) 2015-05-29 2021-11-12 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against ox40 and uses thereof
MA53355A (fr) 2015-05-29 2022-03-16 Agenus Inc Anticorps anti-ctla-4 et leurs procédés d'utilisation
JP2018522833A (ja) 2015-06-12 2018-08-16 イミューノメディクス、インコーポレイテッドＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ， Ｉｎｃ． キメラ抗原受容体（ｃａｒ）コンストラクト、及びｃａｒコンストラクトを発現するｔ細胞（ｃａｒ−ｔ）またはｎｋ細胞（ｃａｒ−ｎｋ）による疾患治療
WO2016201389A2 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Alector Llc Anti-cd33 antibodies and methods of use thereof
WO2016207278A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 Innate Pharma Multispecific nk engager proteins
CA2990511A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 Innate Pharma Multispecific antigen binding proteins
MA41669A1 (fr) 2015-07-06 2018-05-31 Ucb Biopharma Sprl Anticorps se liant a tau
US20180194861A1 (en) 2015-07-10 2018-07-12 Abbvie Inc. IgM- or IgE-Modified Binding Proteins and Uses Thereof
EP3322735A4 (en) 2015-07-15 2019-03-13 Zymeworks Inc. BISPECIFIC ANTIGEN-BINDING CONSTRUCTS CONJUGATED TO A MEDICINAL PRODUCT
JP2018523471A (ja) 2015-07-16 2018-08-23 セレラント セラピューティクス インコーポレイテッド システイン置換免疫グロブリン
TW202346349A (zh) 2015-07-31 2023-12-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Dll3及cd3抗體構築體
AU2016322934A1 (en) 2015-09-14 2018-04-12 Compass Therapeutics Llc Compositions and methods for treating cancer via antagonism of the CD155/TIGIT pathway and TGF-beta
CA2992863A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for a costimulatory tnf receptor
CA3003458A1 (en) 2015-10-29 2017-05-04 Alector Llc Anti-siglec-9 antibodies and methods of use thereof
CA3004306A1 (en) 2015-11-04 2017-05-11 Stephen J. Forman Chimeric antigen receptors targeting her2
US10815290B2 (en) 2015-11-10 2020-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center NKG2D decoys
US20180327499A1 (en) 2015-11-13 2018-11-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti- nkg2d single domain antibodies and uses thereof
US11001629B2 (en) 2015-12-28 2021-05-11 Innate Pharma Variable regions for NKp46 binding proteins
MA43874A (fr) 2016-01-13 2018-11-21 Compass Therapeutics Llc Constructions de liaison à l'antigène immunomodulateur multispécifique
WO2017125897A1 (en) 2016-01-21 2017-07-27 Novartis Ag Multispecific molecules targeting cll-1
US20170233472A1 (en) 2016-02-17 2017-08-17 Macrogenics, Inc. ROR1-Binding Molecules, and Methods of Use Thereof
JP2019510812A (ja) 2016-02-26 2019-04-18 イミュネクサス・ピーティーワイ・リミテッド 多重特異性分子
WO2017165464A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
US11549099B2 (en) 2016-03-23 2023-01-10 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
WO2017177337A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Zymeworks Inc. Multi-specific antigen-binding constructs targeting immunotherapeutics
BR112018071105A2 (pt) 2016-04-15 2019-02-26 Macrogenics, Inc. conjugado de droga e anticorpo, molécula de ligação, composição farmacêutica e uso
GB201610044D0 (en) 2016-06-08 2016-07-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
WO2017218707A2 (en) 2016-06-14 2017-12-21 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
CN105906722B (zh) 2016-06-24 2020-02-07 安徽未名细胞治疗有限公司 一种Her2特异性嵌合抗原受体及其应用
US20200048347A1 (en) 2016-09-01 2020-02-13 Immunomab, Inc. Bispecific antibodies
WO2018071777A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 Harpoon Therapeutics, Inc. Innate immune cell trispecific binding proteins and methods of use
US11555076B2 (en) 2016-10-29 2023-01-17 Genentech, Inc. Anti-MIC antibodies and methods of use
CA3044593A1 (en) 2016-11-22 2018-05-31 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
JOP20190134A1 (ar) 2016-12-23 2019-06-02 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لنيوروبيلين وطرق استخدامها
US20200095327A1 (en) 2017-02-08 2020-03-26 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody heavy chain variable domains targeting the nkg2d receptor
AU2018219887A1 (en) * 2017-02-08 2019-08-22 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
MX2019009541A (es) 2017-02-10 2019-12-16 Dragonfly Therapeutics Inc Proteinas que se unen a psma, nkg2d y cd16.
BR112019016424A2 (pt) 2017-02-10 2020-04-07 Dragonfly Therapeutics Inc proteínas de ligação a bcma, nkg2d e cd16
KR20190120775A (ko) 2017-02-20 2019-10-24 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Cd33, nkg2d 및 cd16에 결합하는 단백질
CA3054086A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding cd123, nkg2d and cd16
BR112019017256A2 (pt) 2017-02-20 2020-04-14 Dragonfly Therapeutics Inc proteínas de ligação gd2, nkg2d e cd16
CA3235295A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
KR20200130514A (ko) 2017-02-27 2020-11-18 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Caix, ano1, 메소텔린, trop2, cea, 또는 클라우딘-18.2를 표적화하는 다중특이적 결합 단백질
WO2018201051A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
CN111278455A (zh) 2017-05-23 2020-06-12 蜻蜓疗法股份有限公司 结合nkg2d、cd16和肿瘤相关抗原的蛋白质
CA3064743A1 (en) 2017-05-23 2018-11-29 Dragonfly Therapeutics, Inc. A protein binding nkg2d, cd16 and ror1 or ror2
KR20200010429A (ko) 2017-05-23 2020-01-30 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Nkg2d, cd16 및 종양-연관 항원에 결합하는 단백질
CN111132698A (zh) 2017-07-31 2020-05-08 蜻蜓治疗公司 结合nkg2d、cd16以及flt3的蛋白质
BR112020003050A2 (pt) 2017-08-16 2020-09-01 Dragonfly Therapeutics, Inc. proteínas de ligação a nkg2d, cd16, e egfr, hla-e, ccr4 ou pd-l1
US20200231679A1 (en) 2017-08-23 2020-07-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and a tumor-associated antigen
WO2019051308A1 (en) 2017-09-07 2019-03-14 Dragonfly Therapeutics, Inc. NKG2D, CD16 BINDING PROTEINS AND ANTIGEN ASSOCIATED WITH A TUMOR
EP3681532A4 (en) 2017-09-14 2021-09-01 Dragonfly Therapeutics, Inc. NKG2D, CD1 6 AND TYPE LECTIN LIKE MOLECULE 1 (CLL-1) BINDING PROTEINS
PE20220278A1 (es) 2018-02-08 2022-02-25 Dragonfly Therapeutics Inc Dominios variables de anticuerpos que se dirigen al receptor nkg2d
CA3090236A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Combination therapy of cancer involving multi-specific binding proteins that activate natural killer cells
SG11202007945UA (en) 2018-02-20 2020-09-29 Dragonfly Therapeutics Inc Multi-specific binding proteins that bind cd33, nkg2d, and cd16, and methods of use
TW201945390A (zh) 2018-02-20 2019-12-01 美商蜻蜓醫療公司 靶向cd33之抗體可變域及其用途
WO2019195409A1 (en) 2018-04-03 2019-10-10 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and an antigen associated with tumors, mdscs and/or tams
WO2019217332A1 (en) 2018-05-07 2019-11-14 Dragonfly Therapeutics, Inc. A protein binding nkg2d, cd16 and a tumor-associated antigen
JP2021523913A (ja) 2018-05-16 2021-09-09 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６、及び線維芽細胞活性化タンパク質と結合するタンパク質
EA202091977A1 (ru) 2018-05-28 2021-02-09 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Мультиспецифические связывающие белки, которые связывают cd33, nkg2d и cd16, и способы применения
EA202091888A1 (ru) 2018-08-08 2020-10-23 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Вариабельные домены антител, нацеленные на рецептор nkg2d
CN112789291A (zh) 2018-08-08 2021-05-11 蜻蜓疗法股份有限公司 结合nkg2d、cd16和肿瘤相关抗原的蛋白质
CA3142513A1 (en) 2019-06-25 2020-12-30 Gilead Sciences, Inc. Flt3l-fc fusion proteins and methods of use
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
PE20221404A1 (es) 2019-08-30 2022-09-15 Dragonfly Therapeutics Inc Formulaciones farmaceuticas y regimenes de dosificacion para proteinas de union multiespecificas que se unen a her2, nkg2d y cd16 para el tratamiento del cancer
IL297922A (en) 2020-05-06 2023-01-01 Dragonfly Therapeutics Inc Proteins that bind nkg2d, cd16 and clec12a

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