BR112019017256A2 - proteínas de ligação gd2, nkg2d e cd16 - Google Patents

Abstract

proteínas de ligação multiespecíficas que ligam gd2, o receptor nkg2d e cd16 são descritas, bem como composições farmacêuticas e métodos terapêuticos úteis para o tratamento do câncer.

Description

PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO GD2, NKG2D E CD16

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica o benefício e a prioridade do Pedido de Patente Provisório dos US No. 62/461,143, depositado em 20 de fevereiro de 2017, cujo conteúdo completo é incorporado por referência aqui para todos os fins .

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e é incorporada por referência na sua totalidade. A cópia ASCII, criada em 20 de fevereiro de 2018, é denominada DFY-006WQ_ST25.txt e tem 74.910 bytes de tamanho.

CAMPO DE INVENÇÃO [003] A invenção refere-se às proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao disialogangliosídeo GD2, ao receptor NKG2D e CD 16.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [004] O câncer continua a ser um problema de saúde significativo, apesar dos esforços substanciais de pesquisa e dos avanços científicos relatados na literatura para o tratamento desta doença. Alguns dos cânceres diagnosticados com mais frequência incluem câncer de próstata, câncer de mama e câncer de pulmão. O câncer de próstata é a forma mais comum de câncer nos homens. O câncer de mama continua sendo a principal causa de morte nas mulheres. As opções de tratamento atuais para esses cânceres não são eficazes para todos os pacientes e/ou podem ter efeitos colaterais adversos substanciais. Outros tipos de câncer também

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2/77 permanecem desafiadores para o tratamento, usando as opções terapêuticas existentes.

[005] As imunoterapias contra o câncer são desejáveis, porque são altamente especificas e podem facilitar a destruição de células cancerígenas usando o próprio sistema imunológico do paciente. As proteínas de fusão, como os agentes acoplados de células T biespecíficas, são imunoterapias de câncer, descritas na literatura, que se ligam às células tumorais e células T para facilitar a destruição de células tumorais. Anticorpos que se ligam a certos antígenos associados aos tumores e a certas células imunes foram descritos na literatura. Ver, por exemplo, WO 2016/134371 e WO 2015/095412.

[006] As células naturais assassinas (NK) são um componente do sistema imunológico inato e constituem aproximadamente 15% dos linfócitos circulantes. As células NK se infiltram em praticamente todos os tecidos e foram originalmente caracterizadas por sua capacidade de matar células tumorais efetivamente sem a necessidade de sensibilização prévia. As células NK ativadas matam as células alvo por meios semelhantes às células T citotóxicas - ou seja, por grânulos citolíticos que contêm perforina e granzimas, bem como pelas vias dos receptores de morte. As células NK ativadas também secretam citocinas inflamatórias como IFN-gama e quimiocinas que promovem o recrutamento de outros leucócitos para o tecido alvo.

[007] As células NK respondem aos sinais através de uma variedade de receptores ativadores e inibitórios em sua superfície. Por exemplo, quando as células NK encontram células autônomas saudáveis, sua atividade é inibida pela

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3/77 ativação dos receptores do tipo imunoglobulina (KIRs). Alternativamente, quando as células NK encontram células estranhas ou células cancerígenas, elas são ativadas por meio de seus receptores de ativação (por exemplo, NKG2D, NCRs, DNAM1). As células NK também são ativadas pela região constante de algumas imunoglobulinas através dos receptores CD 16 em sua superfície. A sensibilidade geral das células NK à ativação depende da soma dos sinais estimuladores e inibitórios.

[008] Os gangliosídeos são glicosfingolipídeos contendo ácido siálico que desempenham papéis importantes na transdução de sinal, bem como na adesão e reconhecimento de células. GD2 é um gangliosídeo da série b que requer que as enzimas GD3 sintase e GD2 sintase adicionem unidades de ácido siálico ao seu precursor GM2. A GD2 é altamente expressa em vários tipos de tumores e sua expressão é restrita no tecido normal, tornando-o um potencial alvo antitumoral. Além disso, demonstrou-se que o GD2 aumenta a proliferação e invasão tumoral em uma variedade de tipos de tumor. Quase todos os neuroblastomas expressam abundantemente GD2, estimado em 5 a 10 milhões de moléculas/célula com propriedades imunossupressoras. Outros tumores com alta expressão de GD2 incluem melanoma, retinoblastoma, câncer de pulmão de pequenas células, tumores cerebrais, osteossarcoma, rabdomiossarcoma, sarcoma de Ewing em crianças e adolescentes, além de lipossarcoma, fibrossarcoma, leiomiossarcoma e outros sarcomas de tecidos moles em adultos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [009] A invenção fornece proteínas de ligação

Petição 870190105209, de 17/10/2019, pág. 10/103 ri/ΊΊ mult iespecí ficas que se ligam a GD2 em uma célula cancerígena ou na neovasculatura de câncer e ao receptor NKG2D e receptor CD 16 em células assassinas naturais. Tais proteínas podem envolver mais de um tipo de receptor ativador de NK e podem bloquear a ligação de ligantes naturais ao NKG2D. Em certas modalidades, as proteínas podem agonizar células NK em humanos e em outras espécies, como roedores e macacos cinomolgos. Vários aspectos e modalidades da invenção são descritos em maiores detalhes abaixo.

[0010] Por conseguinte, um aspecto da invenção fornece uma proteína que incorpora um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; um segundo local de ligação ao antígeno que se liga ao GD2; e um domínio Fc do anticorpo, uma porção do mesmo suficiente para ligar CD 16 ou um terceiro local de ligação ao antígeno que se liga a CD 16. Os sítios de ligação ao antígeno podem incorporar cada domínio variável da cadeia pesada do anticorpo e um domínio variável da cadeia leve do anticorpo (por exemplo, dispostos como em um anticorpo ou fundidos em conjunto a partir de scFv) , ou um ou mais dos sítios de ligação ao antígeno podem ser um anticorpo de domínio único, como um anticorpo VhH como um anticorpo camelídeo ou um anticorpo Vnar como os encontrados em peixe cartilaginoso.

[0011] O primeiro local de ligação ao antígeno, que se liga ao NKG2D, em algumas modalidades, pode incorporar um domínio variável da cadeia pesada relacionado à ID. DE SEQ. N°: 1, como por ter uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à ID. DE SEQ. N° : 1 e/ou

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5/77 incorporando sequências de aminoácidos idênticas às sequências CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 62), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 63) e CDR3 (ID. DE SEQ. N° : 64) da ID. DE SEQ. N° : 1. Alternativamente, o primeiro local de ligação ao antígeno pode incorporar um domínio variável da cadeia pesada relacionado à ID. DE SEQ. N° : 41 e um domínio variável da cadeia leve relacionado à ID. DE SEQ. N°: 42. Por exemplo, o domínio variável da cadeia pesada do primeiro local de ligação ao antígeno pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à ID. DE SEQ. N° : 41 e/ou incorpora sequências de aminoácidos idênticas às sequências CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 65), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 66) e CDR3 (ID. DE

SEQ. N° : 67) de ID. DE SEQ. N° : 41. Da mesma forma, o domínio variável da cadeia leve do segundo local de ligação ao antígeno pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à ID. DE SEQ. N°: 42 e/ou incorpora sequências de aminoácidos idênticas às sequências CDR1 (ID. DE SEQ. N° : 68), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 69) e CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 70) de ID. DE SEQ. N° : 42. Em outras modalidades, o primeiro local de ligação ao antígeno pode incorporar um domínio variável da cadeia pesada relacionado à ID. DE SEQ. N°: 43 e um domínio variável da cadeia leve relacionado à ID. DE SEQ. N° : 44. Por exemplo, o domínio variável da cadeia pesada do primeiro local de ligação ao antígeno pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à ID. DE SEQ. N° : 43 e/ou incorpora sequências de aminoácidos idênticas às sequências CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 71), CDR2 (ID. DE SEQ. N°:

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6/ΊΊ

72) e CDR3 (SEQ ID NO : 73) da ID. DE SEQ. N°: 43. Da mesma forma, o domínio variável da cadeia leve do segundo local de ligação ao antigeno pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à ID. DE SEQ. N° : 44 e/ou incorpora sequências de aminoácidos idênticas às sequências CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 74), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 75) e CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 76) de ID. DE SEQ. N°: 44.

[0012] Alternativamente	r O	primeiro	local	de	ligação ao
antigeno pode incorporar	um	dominio	variável	da cadeia
pesada relacionado à ID.	DE	SEQ. N°	: 45	e	um dominio

variável da cadeia leve relacionado à ID. DE SEQ. N° : 4 6, como por ter sequências de aminoácidos pelo menos 90% (por

exemplo,	90%, 91%,	92%, 93%,	94%, 95%	, 96%	, 97%,	98%,	99%
ou 100%)	idênticas	à ID. DE	SEQ. N° :	45 e	pelo	menos	90%
(por exemplo, 90%,	91%, 92%,	93%, 94%,	95%,	96%,	97%,	98%,
99% ou	100%) idênticas	à ID.	DE	SEQ.	N° :	46,

respectivamente. Em outra modalidade, o primeiro local de ligação ao antigeno pode incorporar um dominio variável da cadeia pesada relacionado à ID. DE SEQ. N°: 47 e um dominio

variável	da cadeia leve	relacionado à	ID. :	DE SEQ. N°:	48,
como por	ter sequências	de aminoácidos	pelo	menos 90%	(por
exemplo,	90%, 91%, 92%,	93%,	94%, 95%,	96%	, 97%, 98%,	99%
ou 100%)	idênticas à ID	. DE	SEQ. N° :	47 e	pelo menos	90%
(por exemplo, 90%, 91%,	92%,	93%, 94%,	95%,	96%, 97%,	98%,
99% ou	100%) idênticas	à ID.	DE	SEQ. N°:	48,
respectivamente. Em algumas	modalidades, o	primeiro local

de ligação ao antigeno pode incorporar um dominio variável da cadeia pesada relacionado à ID. DE SEQ. N° : 8 9 e um dominio variável da cadeia leve relacionado à ID. DE SEQ.

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N° : 90, como por ter sequências de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100%) idênticas à ID. DE SEQ. N° : 89 e pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,

97%, 98%, 99% ou 100%) idênticas à ID. DE SEQ. N° : 90, respectivamente. Em algumas modalidades, o primeiro local de ligação ao antigeno pode incorporar um domínio variável da cadeia pesada relacionado à ID. DE SEQ. N° : 91 e um domínio variável da cadeia leve relacionado à ID. DE SEQ. N° : 92, como por ter sequências de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100%) idênticas à ID. DE SEQ. N° : 91 e pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,

97%, 98%, 99% ou 100%) idênticas à ID. DE SEQ. N° : 92, respectivamente.

[0013] O segundo local de ligação ao antigeno pode, opcionalmente, incorporar um domínio variável da cadeia pesada relacionado à ID. DE SEQ. N° : 4 9 e um domínio variável da cadeia leve relacionado à ID. DE SEQ. N° : 53. Por exemplo, o domínio variável da cadeia pesada do segundo local de ligação ao antigeno pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à ID. DE SEQ. N° : 49 e/ou incorpora sequências de aminoácidos idênticas às sequências CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 50), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 51) e CDR3 (ID. DE SEQ. N° : 52) da ID. DE SEQ. N° : 49. Da mesma forma, o domínio variável da cadeia leve do segundo local de ligação ao antigeno pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à ID. DE SEQ. N°: 53 e/ou incorpora sequências de

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8/77 aminoácidos idênticas às sequências CDR1 (ID. DE SEQ. N° : 54), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 55) e CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 56) da ID. DE SEQ. N°: 53.

[0014] Alternativamente, o segundo local de ligação ao antígeno pode incorporar um domínio variável da cadeia pesada relacionado à ID. DE SEQ. N° : 57 e um domínio variável da cadeia leve relacionado à ID. DE SEQ. N° : 58. Por exemplo, o domínio variável da cadeia pesada do segundo local de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico ao ID. DE SEQ. N° : 57 e/ou incorporam sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 77), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 78) e CDR3 (ID. DE SEQ. N° : 79) da ID. DE SEQ. N° : 57. Da mesma forma, o domínio variável da cadeia leve do segundo local de ligação ao antígeno pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à ID. DE SEQ. N°: 58 e/ou incorpora sequências de aminoácidos idênticas às sequências CDR1 (ID. DE SEQ. N° : 80), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 81) e CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 82) da ID. DE SEQ. N°: 58 .

[0015] Em outra modalidade, o segundo local de ligação ao antígeno pode incorporar um domínio variável da cadeia pesada relacionado à ID. DE SEQ. N° : 59 e um domínio variável da cadeia leve relacionado à ID. DE SEQ. N° : 60. Por exemplo, o domínio variável da cadeia pesada do segundo local de ligação ao antígeno pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à ID. DE SEQ. N° : 59 e/ou incorpora sequências de aminoácidos idênticas às sequências CDR1 (ID.

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DE SEQ. N°: 83), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 84) e CDR3 (ID. DE SEQ. N° : 85) da ID. DE SEQ. N° : 59. Da mesma forma, o domínio variável da cadeia leve do segundo local de ligação ao antigeno pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à ID. DE SEQ. N°: 60 e/ou incorpora sequências de aminoácidos idênticas às sequências CDR1 (ID. DE SEQ. N° : 86), CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 87) e CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 88) de ID. DE SEQ. N°: 60.

[0016] Em algumas modalidades, o segundo local de ligação ao antigeno incorpora um domínio variável da cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve presente no primeiro local de ligação ao antigeno.

[0017] Em algumas modalidades, a proteína incorpora uma porção de um domínio Fc do anticorpo suficiente para ligar CD16, em que o domínio Fc do anticorpo compreende domínios de dobradiça e CH2 e/ou sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas à sequência de aminoácidos 234 -332 de um anticorpo IgG humano.

[0018] As formulações contendo uma dessas proteínas; são também fornecidas células contendo um ou mais ácidos nucleicos que expressam essas proteínas e também métodos para aumentar a morte de células tumorais utilizando essas proteínas.

[0019] Outro aspecto da invenção fornece um método de tratamento de câncer em um paciente. O método compreende a administração a um paciente em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação multiespecífica, aqui descrita. Exemplos de câncer para

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10/77 tratamento utilizando as proteínas de ligação multiespecíficas incluem, por exemplo, neuroblastoma, melanoma, retinoblastoma, câncer de pulmão de pequenas células, tumores cerebrais, osteossarcoma, rabdomiossarcoma, sarcoma de Ewing em crianças e adolescentes, bem como lipossarcoma, fibrossarcoma, leiomiossarcoma e outros sarcomas de tecidos moles em adultos .

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0020] A Figura 1 é uma representação de um anticorpo multiespecífico heterodimérico. Cada braço pode representar o domínio de ligação a NKG2D ou o domínio de ligação a GD2. Em algumas modalidades, os domínios de ligação a NKG2D e GD2 podem compartilhar uma cadeia leve comum.

[0021] A Figura 2 é uma representação de um anticorpo multiespecífico heterodimérico. O domínio de ligação NKG2D ou GD2 pode assumir o formato scFv (braço direito).

[0022] A Figura 3 representa gráficos de linhas que demonstram a afinidade de ligação de domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) com NKG2D recombinante humano em um ensaio ELISA.

[0023] A Figura 4 representa gráficos de linhas que demonstram a afinidade de ligação de domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) com NKG2D recombinante de cinomolgos em um ensaio ELISA.

[0024] A Figura 5 representa gráficos de linhas que demonstram a afinidade de ligação de domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) com NKG2D recombinante de camundongo em um ensaio ELISA.

[0025] A Figura 6 representa gráficos de barras que

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11/77 demonstram a ligação de domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) a células EL4 que expressam NKG2D humano por citometria de fluxo, mostrando uma dobra média de intensidade de fluorescência (MFI) sobre o fundo.

[0026] A Figura 7 representa gráficos de barras que demonstram a ligação de domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) a células EL4 que expressam NKG2D de camundongo por citometria de fluxo mostrando a dobra média da intensidade da fluorescência (MFI) sobre o fundo.

[0027] A Figura 8 representa gráficos de linhas que demonstram afinidade de ligação específica dos domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) a NKG2D-Fc humano recombinante, competindo com o ligante natural ULBP-6.

[0028] A Figura 9 representa gráficos de linhas que demonstram afinidade de ligação específica de domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) a NKG2D-Fc humano recombinante, competindo com o ligante natural MICA.

[0029] A Figura 10 representa gráficos de linhas que demonstram afinidade de ligação específica dos domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) a NKG2D-Fc de camundongo recombinante, competindo com o delta Rae-1 do ligante natural.

[0030] A Figura 11 representa gráficos de barras que mostram a ativação de NKG2D humano por domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) quantificando a porcentagem de células positivas para TNF-alfa, que expressam proteínas de fusão zeta NKG2D-CD3 humanas.

[0031] A Figura 12 representa gráficos de barras que mostram a ativação de NKG2D de camundongo por domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) quantificando a

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12/77 porcentagem de células positivas para TNF-alfa, que

expressam	proteínas de fusão zeta de NKG2D-CD3	de
camundongo [0032]	A Figura 13 representa gráficos de barras	que
mostram a	ativação de células NK humanas por domínios	de
ligação a [0033]	NKG2D (listados como clones). A Figura 14 representa gráficos de barras	que
mostram a	ativação de células NK humanas por domínios	de
ligação a [0034]	NKG2D (listados como clones). A Figura 15 representa gráficos de barras	que

mostram a ativação de células NK de camundongo por domínios de ligação a NKG2D (listados como clones).

[0035] A Figura 16 representa gráficos de barras que mostram a ativação de células NK de camundongo por domínios de ligação a NKG2D (listados como clones).

[0036] A Figura 17 representa gráficos de barras que mostram o efeito citotóxico de domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) nas células tumorais.

[0037] A Figura 18 representa gráficos de barras que mostram a temperatura de fusão dos domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) medidos por fluorimetria de varredura diferencial.

[0038] As Figuras 19A-19C representa gráficos de barras da ativação sinérgica de células NK usando ligação CD16 e NKG2D. A Figura 19A demonstra níveis de CD107a; a Figura 19B demonstra níveis de IFNy; a Figura 19C demonstra níveis de CD107a e IFNy. Os gráficos indicam a média (n = 2) ± SD. Os dados são representativos de cinco experimentos independentes usando cinco doadores saudáveis diferentes.

[0039] A Figura 20 é uma representação de um TriNKET na

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13/77 forma Triomab, que é um anticorpo trifuncional e biespecífico que mantém uma forma semelhante a IgG. Essa quimera consiste em dois meios anticorpos, cada um com uma cadeia leve e uma pesada, que se originam de dois anticorpos parentais. A forma de Triomab pode ser uma construção heterodimérica contendo b de anticorpo de rato e b de anticorpo de camundongo.

[0040] A Figura 21 é uma representação de um TriNKET na formade Cadeia Leve Comum KiH (LC), que envolve a tecnologia knobs-into-holes (KIHs). KiH é um heterodímero contendo 2 Fabs que se ligam aos alvos 1 e 2 e um Fc estabilizado por mutações de heterodimerização. O TriNKET no formato KiH pode ser uma construção heterodimérica com 2 fabs que se ligam ao alvo 1 e ao alvo 2, contendo duas cadeias pesadas diferentes e uma cadeia leve comum que emparelha com as duas cadeias pesadas.

[0041] A Figura 22 é uma representação de um TriNKET na forma de domínio de variável dupla de imunoglobulina (DVDIg™) , que combina os domínios de ligação ao alvo de dois anticorpos monoclonais por meio de ligantes flexíveis de ocorrência natural e produz uma molécula tetravalente do tipo IgG. DVD-Ig™ é uma construção homodimérica, em que o antígeno 2 de direcionamento de domínio variável é fundido ao terminal N do domínio variável do antígeno 1 de direcionamento de Fab. A construção contém Fc normal.

[0042] A Figura 23 é uma representação de um TriNKET na forma de interface Fab ortogonal (Ortho-Fab) , que é uma construção heterodimérica que contém 2 Fabs que se ligam ao alvo 1 e ao alvo 2 fundidos a Fc. O emparelhamento LC-HC é assegurado pela interface ortogonal. A heterodimerização é

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14/77 assegurada por mutações no Fc.

[0043] A Figura 24 é uma representação de um TrinKET no formato 2-em-l Ig.

[0044] A Figura 25 é uma representação de um TriNKET na forma ES, que é uma construção heterodimérica contendo dois Fabs diferentes que se ligam ao alvo 1 e ao alvo 2 fundidos ao Fc. A heterodimerização é assegurada por mutações de direção eletrostática no Fc.

[0045] A Figura 26 é uma representação de um TriNKET na forma de uma Troca de Braço Fab: anticorpos que trocam braços Fab trocando uma cadeia pesada e cadeia leve ligada (meia molécula) por um par de cadeia pesada-leve de outra molécula, resultando em anticorpos biespecificos. A forma de Troca de Braço Fab (cFae) é um heterodimero contendo 2 Fabs que se ligam aos alvos 1 e 2 e um Fc estabilizado por mutações de heterodimerização.

[0046] A Figura 27 é uma representação de um TriNKET na forma do corpo SEED, que é um heterodimero contendo 2 Fabs que se ligam aos alvos 1 e 2 e um Fc estabilizado por mutações de heterodimerização.

[0047] A Figura 28 é uma representação de um TriNKET na forma LuZ-Y, na qual o ziper de leucina é usado para induzir a heterodimerização de dois HCs diferentes. A forma LuZ-Y é um heterodimero contendo dois scFabs diferentes que se ligam aos alvos 1 e 2, fundidos a Fc. A heterodimerização é assegurada através de motivos com ziper de leucina fundidos ao terminal C de Fc.

[0048] A Figura 29 é uma representação de um TriNKET na forma Cov-X-Body.

[0049] As Figuras 30A-30B são representações de

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TriNKETs nas formas κλ-Body, que são construções heterodiméricas com dois Fabs diferentes fundidos a Fc estabilizados por mutações na heterodimerização: o antigeno 1 de direcionamento Fabl contém kappa LC, enquanto o antigeno 2 de direcionamento do segundo Fab contém LC lambda. A Figura 30A é uma representação exemplar de uma forma de um corpo κλ; a Figura 30B é uma representação exemplar de outro κλ-Body.

[0050] A Figura 31 é uma construção heterodimérica Oasc-Fab que inclui a ligação de Fab ao alvo 1 e a ligação de scFab ao alvo 2 fundido a Fc. A heterodimerização é assegurada por mutações no Fc.

[0051] A Figura 32 é um DuetMab, que é uma construção heterodimérica contendo dois Fabs diferentes que se ligam aos antigenos 1 e 2, e Fc estabilizado por mutações de heterodimerização. Os Fab 1 e 2 contêm pontes S-S diferenciais que garantem o emparelhamento correto da cadeia leve (LC) e da cadeia pesada (HC).

[0052] A Figura 33 é um CrossmAb, que é uma construção heterodimérica com dois Fabs diferentes que se ligam aos alvos 1 e 2 fundidos a Fc estabilizado por heterodimerização. Os dominios CL e CHI e os dominios VH e VL são alternados, por exemplo, CHI é fundido em linha com VL, enquanto CL é fundido em linha com VH.

[0053] A Figura 34 é um Fit-Ig, que é uma construção homodimérica, em que a ligação de Fab ao antigeno 2 é fundida ao terminal N de HC de Fab que se liga ao antigeno 1. A construção contém Fc de tipo selvagem.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0054] A invenção fornece proteínas de ligação

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16/77 multiespecíficas que ligam um GD2 a uma célula cancerosa ou neovasculatura do câncer e o receptor NKG2D e o receptor CD16 em células assassinas naturais para ativar a célula assassina natural, composições farmacêuticas compreendendo essas proteínas de ligação multiespecíficas, e métodos terapêuticos usando essas proteínas multiespecíficas e composições farmacêuticas, inclusive para o tratamento de câncer. Vários aspectos da invenção são apresentados abaixo nas seções; no entanto, os aspectos da invenção descritos em uma seção específica não devem ser limitados a nenhuma seção específica.

[0055] Para facilitar o entendimento da presente invenção, vários termos e frases são definidos abaixo.

[0056] Os termos um e uma, conforme aqui utilizados, significam um(a) ou mais e incluem o plural, a menos que o contexto seja inadequado. Como aqui utilizado, o termo local de ligação ao antigeno refere-se à parte da molécula de imunoglobulina que participa da ligação ao antigeno. Nos anticorpos humanos, o local de ligação ao antigeno é formado por resíduos de aminoácidos das regiões variáveis (V) do terminal N das cadeias pesada (H) e leve (L). Três trechos altamente divergentes nas regiões V das cadeias pesada e leve são chamados de regiões hipervariáveis que são interpostas entre os trechos de flanqueamento mais conservados, conhecidos como regiões de estrutura ou FRs. Assim, o termo FR refere-se a sequências de aminoácidos que são naturalmente encontradas entre e adjacentes a regiões hipervariáveis nas imunoglobulinas. Em uma molécula de anticorpo humano, as três regiões hipervariáveis de uma

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17/77 cadeia leve e as três regiões hipervariáveis de uma cadeia pesada são dispostas uma em relação à outra no espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação ao antígeno. A superfície de ligação ao antígeno é complementar à superfície tridimensional de um antígeno ligado, e as três regiões hipervariáveis de cada uma das cadeias pesada e leve são chamadas de regiões determinantes da complementaridade ou CDRs. Em certos animais, como camelos e peixes cartilaginosos, o local de ligação ao antígeno é formado por uma única cadeia de anticorpos, fornecendo um anticorpo de domínio único. Os sítios de ligação ao antígeno podem existir em um anticorpo intacto, em um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo retendo a superfície de ligação ao antígeno ou em um polipeptídeo recombinante, como um scFv, usando um ligante peptídico para conectar o domínio variável da cadeia pesada a o domínio variável da cadeia leve em um único polipeptídeo.

[0057] O termo antígeno associado ao tumor, conforme usado aqui, significa qualquer antígeno incluindo, mas não limitado a uma proteína, glicoproteína, gangliosídeo, carboidrato, lipídeo que está associado ao câncer. Esse antígeno pode ser expresso em células malignas ou no tumor microambiente, como vasos sanguíneos associados a tumores, matriz extracelular, estroma mesenquimal ou infiltrados imunes.

[0058] Como aqui utilizado, os termos sujeito e paciente se referem a um organismo a ser tratado pelos métodos e composições aqui descritos. Tais organismos incluem, preferencialmente, mas não estão limitados a,

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18/77 mamíferos (por exemplo, murinos, símios, equinos, bovinos, suínos, caninos, felinos e similares), e, mais preferencialmente, incluem seres humanos.

[0059] Como aqui utilizado, o termo quantidade eficaz refere-se à quantidade de um composto (por exemplo, um composto da presente invenção) suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens e não se destina a ser limitada a uma formulação ou via de administração específica. Como aqui utilizado, o termo tratamento inclui qualquer efeito, por exemplo, diminuir, reduzir, modular, melhorar ou eliminar, que resulta na melhoria da condição, doença,

distúrbio e	similares,	ou na melhora de um	sintoma do
mesmo. [00 60] Como aqui	utilizado, o termo	composição
farmacêutica	refere-se	à combinação de um agente ativo com
um veículo,	inerte	ou ativo, tornando a	composição
especialmente	adequada	para uso diagnóstico ou	terapêutico
in vivo ou ex	vi vo.

[0061] Como aqui utilizado, o termo veículo farmaceuticamente aceitável refere-se a qualquer um dos veículos farmacêuticos padrão, como uma solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões (por exemplo, como emulsões de óleo/água ou água/óleo), e vários tipos de agentes umectantes. As composições também podem incluir estabilizadores e conservantes. Para exemplos de veículos, estabilizadores e adjuvantes, ver, por exemplo, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15^a Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975].

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19/77 [0062] Como aqui utilizado, o termo sal farmaceuticamente aceitável refere-se a qualquer sal farmaceuticamente aceitável (por exemplo, ácido ou base) de um composto da presente invenção que, mediante administração a um indivíduo, é capaz de fornecer um composto desta invenção ou um metabolito ativo ou resíduo do mesmo. Como é do conhecimento dos peritos na matéria, os sais dos compostos da presente invenção podem ser derivados de ácidos e bases inorgânicos ou orgânicos. Exemplos de ácidos incluem, entre outros, cloridrato, bromídrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maleico, fosfórico, glicólico, lático, salicílico, succínico, tolueno-p-sulfônico, tartárico, acético, cítrico, metanossulfônico, etanossulfônico, ácido fórmico, benzóico, malônico, naftaleno-2-sulfônico, benzenossulfônico e similares. Outros ácidos, como oxálico, embora não sejam eles farmaceuticamente aceitáveis, podem ser empregados na preparação de sais úteis como intermediários na obtenção dos compostos da invenção e seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis.

[0063] Bases exemplares incluem, mas não estão limitadas a, hidróxidos de metais alcalinos (por exemplo, sódio), hidróxidos de metais alcalinos terrosos (por exemplo, magnésio) , amônia e compostos de fórmula NW4⁺, em que W é alquil Ci-4 e similar.

[0064] Sais exemplares incluem, mas não estão limitados a: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, benzenossulfonato, bissulfato, butirato, citrato, canforado, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, fumarato,

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20/77 flucoheptanoato, glicerofosfato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, cloridrato, bromidrato, iodidrato, 2hidroxietanossulfonato, lactato, maleato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, oxalato, palmoato, pectinate, persulfate, fenilpropionato, picrate, pivalate, propionate, succinate, tartrate, tiocianato, tosilato, undecanoato e similares. Outros exemplos de sais incluem ânions dos compostos da presente invenção compostos com um cátion adequado como Na⁺, NH4⁺ e NW4⁺ (em que W é um grupo alquil C1-4) e similares.

[0065] Para uso terapêutico, sais dos compostos da presente invenção são contemplados como sendo farmaceuticamente aceitáveis. No entanto, sais de ácidos e bases que são não farmaceuticamente aceitáveis também podem ser úteis, por exemplo, na preparação ou purificação de um composto farmaceuticamente aceitável.

[0066] Ao longo da descrição, onde as composições são descritas como tendo, incluindo ou compreendendo componentes específicos, ou onde processos e métodos são descritos como tendo, incluindo ou compreendendo etapas específicas, é contemplado que, adicionalmente, existem composições da presente invenção que consiste essencialmente em, ou consiste nos componentes citados, e que existem processos e métodos de acordo com a presente invenção que consistem essencialmente em, ou consistem nas etapas de processamento citadas.

[0067] Como uma questão geral, as composições que especificam uma porcentagem são em peso, a menos que especificado de outra forma. Além disso, se uma variável não é acompanhada por uma definição, a definição anterior

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21/77 da variável controla.

I. PROTEÍNAS [0068] A invenção fornece proteínas de ligação mult iespecif icas que se ligam a GD2 em uma célula cancerígena ou no microambiente do câncer e o receptor NKG2D e receptor CD16 em células assassinas naturais para ativar a célula assassina natural. As proteínas de ligação multiespecificas são úteis nas composições farmacêuticas e métodos terapêuticos aqui descritos. A ligação da proteina de ligação multiespecífica ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 na célula natural assassina aumenta a atividade da célula natural assassina em direção à destruição de uma célula cancerígena. A ligação da proteína de ligação multiespecifica a GD2 em uma célula cancerígena aproxima a célula cancerígena da célula assassina natural, o que facilita a destruição direta e indireta da célula cancerosa pela célula assassina natural. A ligação da proteína de ligação multiespecífica a GD2 em uma célula cancerígena aproxima a célula cancerosa da célula assassina natural, o que facilita a destruição direta e indireta da célula cancerosa pela célula assassina natural. Uma descrição adicional de proteínas de ligação multiespecíficas exemplificativas é fornecida abaixo.

[0069] O primeiro componente das proteínas de ligação multiespecificas se liga a células que expressam receptores NKG2D, que podem incluir, mas não estão limitadas a células NK, células T γδ e células T αβ CD8⁺. Após a ligação de NKG2D, as proteínas de ligação multiespecíficas podem bloquear ligantes naturais, como ULBP6 e MICA, da ligação a NKG2D e ativação dos receptores NKG2D.

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22/77 [0070] O segundo componente das proteínas de ligação multiespecificas se liga a células que expressam GD2, que podem incluir, mas não estão limitadas a, melanoma, retinoblastoma, câncer de pulmão de pequenas células, tumores cerebrais, osteossarcoma, rabdomiossarcoma, sarcoma de Ewing em crianças e adolescentes, bem como lipossarcoma, fibrossarcoma, leiomiossarcoma e outros sarcomas de tecidos moles em adultos.

[0071] O terceiro componente para as proteínas de ligação multiespecíficas se liga a células que expressam CD16, um receptor Fc na superfície de leucócitos, incluindo células assassinas naturais, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, mastócitos e células dendríticas foliculares.

[0072] As proteínas de ligação multiespecíficas, aqui descritas, podem assumir vários formatos. Por exemplo, um formato é um anticorpo heterodimérico, multiespecífico, incluindo uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina, uma primeira cadeia leve de imunoglobulina, uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina e uma segunda cadeia leve de imunoglobulina (Figura 1) . A primeira cadeia pesada de imunoglobulina inclui um primeiro domínio Fc (dobradiçaCH2-CH3), um primeiro domínio variável da cadeia pesada e, opcionalmente, um primeiro domínio da cadeia pesada de CHI. A primeira cadeia leve de imunoglobulina inclui um primeiro domínio variável da cadeia leve e um primeiro domínio constante da cadeia leve. A primeira cadeia leve de imunoglobulina, juntamente com a primeira cadeia pesada de imunoglobulina, forma um local de ligação ao antigeno que se liga a NKG2D. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina compreende um segundo domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3), um

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23/77 segundo domínio variável da cadeia pesada e, opcionalmente, um segundo domínio da cadeia pesada da CHI. A segunda cadeia leve de imunoglobulina inclui um segundo domínio variável da cadeia leve e um segundo domínio constante da cadeia leve. A segunda cadeia leve de imunoglobulina, juntamente com a segunda cadeia pesada de imunoglobulina, forma um local de ligação ao antígeno que se liga a GD2. 0 primeiro domínio Fc e o segundo domínio Fc juntos são capazes de se ligar a CD16 (Figura 1). Em algumas modalidades, a primeira cadeia leve de imunoglobulina pode ser idêntica à segunda cadeia leve de imunoglobulina.

[0073] Outro formato exemplar envolve um anticorpo heterodimérico, multiespecífico, incluindo uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina, uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina e uma cadeia leve de imunoglobulina (Figura 2) . A primeira cadeia pesada de imunoglobulina inclui um primeiro domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3) fundido por meio de um ligante ou uma dobradiça de anticorpo a um fragmento variável de cadeia única (scFv) composto por um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve que emparelha e liga NKG2D ou GD2. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina inclui um segundo domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3), um segundo domínio variável da cadeia pesada e, opcionalmente, um domínio da cadeia pesada CHI. A cadeia leve de imunoglobulina inclui um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina emparelhase com a cadeia leve de imunoglobulina e se liga a NKG2D ou GD2. O primeiro domínio Fc e o segundo domínio Fc juntos são capazes de se ligar a CD16 (Figura 2).

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24/77 [0074] Um ou mais motivos de ligação adicionais podem ser fundidos ao terminal C do dominio CH3 da região constante, opcionalmente, através de uma sequência de ligação. Em certas modalidades, o local de ligação ao antigeno pode ser uma região (scFv) variável estabilizada por dissulfeto ou cadeia única ou pode formar uma molécula tetravalente ou trivalente.

[0075] Em algumas modalidades, a proteina de ligação multiespecifica está na forma de Triomab, que é um anticorpo trifuncional e biespecifico que mantém uma forma semelhante a IgG. Essa quimera consiste em dois meios anticorpos, cada um com uma cadeia leve e uma pesada, que se originam de dois anticorpos originais.

[0076] Em algumas modalidades, a proteina de ligação multiespecifica é a forma de cadeia leve comum (LC) de KiH, que envolve a tecnologia knobs-into-holes (KIHs). O KIH envolve a engenharia de dominios CH3 para criar knobs ou hole em cada cadeia pesada para promover a heterodimerização. O conceito por trás da tecnologia Fc Knobs-into-Holes (KiH) era introduzir um knob em um dominio CH3 (CH3A) pela substituição de um pequeno residue por um residue volumoso (por exemplo, T366Wch3a na numeração da EU). Para acomodar o Knob, uma superficie complementar de hole foi criada no outro dominio CH3 (CH3B) substituindo os residues vizinhos mais próximos do Knob por outros menores (por exemplo, T366S/L368A/Y407Vch3b) - A mutação hole foi otimizada pela triagem da biblioteca de fagos guiada por estrutura (Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P., Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library, J.

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Mol. Biol. (1997) 270 (1) :26-35) . Estruturas cristalinas de raios-X das variantes KiH Fc (Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess C, et al., Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction. J. Mol. Biol. (2014) 426 (9) : 1947-57); Mimoto F, Kadono S, Katada H, Igawa T, Kamikawa T, Kamikawa T, Hattori K. Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcgammaRs. Mol. Immunol. (2014) 58(1) : 132-8) demonstrou que a heterodimerização é termodinamicamente favorecida por interações hidrofóbicas impulsionadas pela complementaridade esférica na interface central do domínio inter-CH3, enquanto interfaces knob-knob e interfaces holehole não favorecem a homodimerização devido ao impedimento esférico e à interrupção das interações favoráveis, respectivamente.

[0077] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de imunoglobulina de domínio variável duplo (DVD-Ig™), que combina os domínios de ligação ao alvo de dois anticorpos monoclonais por meio de ligantes flexíveis de ocorrência natural e produz uma molécula similar a IgG tetravalente.

[0078] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de interface Fab ortogonal (Ortho-Fab). Na abordagem orto-Fab IgG (Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HL, et al., Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of na orthogonal Fab interface. Nat. Biotechnol. (2014) 32(2) : 191-8), o projeto regional baseado em estrutura introduz

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26/77 mutações complementares na interface LC e HCvh-chi em apenas um Fab, sem que sejam feitas alterações no outro Fab.

[0079] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está no formato 2-em-l Ig. Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma ES, que é uma construção heterodimérica contendo duas Fabs diferentes que se ligam aos alvos 1 e 2, fundidos ao Fc. A heterodimerização é assegurada por mutações de direção eletrostática no Fc. Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de κλBody, que é uma construção heterodimérica com dois Fabs diferentes fundidos a Fc estabilizados por mutações de heterodimerização: o antigeno 1 de direcionamento Fabl contém LC kappa, enquanto o o antigeno 2 de direcionamento do segundo Fab contém lambda LC. A Figura 30A é uma representação exemplar de uma forma de um corpo kà; Figura 30B é uma representação exemplar de outro κλ-Body.

[0080] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de Troca de Braço Fab (anticorpos que trocam braços Fab pela troca de uma cadeia pesada e cadeia leve ligada (meia molécula) com um par de cadeia leve pesada de outra molécula, que resulta em anticorpos biespecíficos). Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de corpo SEED. A plataforma de domínio de engenharia de troca de cadeia (SEED) foi projetada para gerar moléculas semelhantes a anticorpos assimétricas e biespecíficas, uma capacidade que expande as aplicações terapêuticas de anticorpos naturais. Esta plataforma de engenharia de proteínas baseia-se na troca de sequências estruturalmente

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27/77 relacionadas de imunoglobulina dentro dos dominios CH3 conservados. 0 projeto do SEED permite a geração eficiente de heterodimeros AG/GA, enquanto desfavorece a homodimerização dos dominios AG e GA SEED CH3. (Muda M. et al., Protein Eng. Des. Sei. (2011, 24(5): 447-54)). Em algumas modalidades, a proteina de ligação multiespecifica está na forma LuZ-Y, na qual um ziper de leucina é usado para induzir a heterodimerização de dois HCs diferentes. (Wranik, BJ. et al., J. Biol. Chem. (2012), 287: 43331-9) .

[0081] Em algumas modalidades, a proteina de ligação multiespecifica está na forma Cov-X-Body. Nos corpos CovX biespecificos, dois peptideos diferentes são unidos usando um ligante de azetidinona ramificado e fundidos ao anticorpo do suporte sob condições amenas de uma maneira especifica do local. Enquanto os farmacóforos são responsáveis por atividades funcionais, o suporte de anticorpo confere meia-vida longa e distribuição semelhante a Ig. Os farmacóforos podem ser quimicamente otimizados ou substituidos por outros farmacóforos para gerar anticorpos biespecificos otimizados ou únicos. (Doppalapudi VR et al., PNAS (2010), 107(52); 22611-22616).

[0082] Em algumas modalidades, a proteina de ligação multiespecifica está em uma forma heterodimérica Oasc-Fab que inclui a ligação do Fab ao alvo 1 e a ligação do scFab ao alvo 2 fundido ao Fc. A heterodimerização é assegurada por mutações no Fc.

[0083] Em algumas modalidades, a proteina de ligação multiespecifica está na forma DuetMab, que é uma construção heterodimérica contendo dois Fabs diferentes que se ligam aos antigenos 1 e 2 e Fc estabilizado por mutações de

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28/77 heterodimerização. Os Fab 1 e 2 contêm pontes S-S diferenciais que garantem o emparelhamento correto de LC e HC.

[0084] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de CrossmAb, que é uma construção heterodimérica com dois Fabs diferentes que se ligam aos alvos 1 e 2, fundidos a Fc estabilizado por heterodimerização. Os domínios CL e CHI e os domínios VH e VL são alternados, por exemplo, CHI é fundido em linha com VL, enquanto CL é fundido em linha com VH.

[0085] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma Fit-Ig, que é uma construção homodimérica, em que a ligação do Fab ao antígeno 2 é fundida ao terminal N do HC do Fab que se liga ao antígeno 1. A construção contém Fc do tipo selvagem.

[0086] Formatos adicionais das proteínas de ligação multiespecíficas podem ser projetados combinando vários formatos de fragmentos de ligação a NKG2D e GD2, aqui descritos.

[0087] A Tabela 1 lista sequências peptídicas de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a NKG2D.

Tabela 1
Clones	Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada	Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve
ADI- 27705	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG PWSFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:l)	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT CRASQSISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQYNSYPITFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:2)

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	CDR1 (ID. DE SEQ. N°:62) - GSFSGYYWS CDR2 (ID. DE SEQ. N°:63) EIDHSGSTNYNPSLKS CDR3 (ID. DE SEQ. N°:64) ARARGPWSFDP
ADI- 27724	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG PWSFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:3)	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLS CRASQSVSSSYLAWYQQKPGQA PRLLIYGASSRATGIPDRFSGS GSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY CQQYGSSPITFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:4)
ADI27740 (A40)	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG PWSFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:5)	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT CRASQSIGSWLAWYQQKP GKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQYHSFYTFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:6)
ADI- 27741	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG PWSFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:7)	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT CRASQSIGSWLAWYQQKP GKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQSNSYYTFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:8)
ADI- 27743	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG PWSFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:9)	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT CRASQSISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQYNSYPTFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:10)
ADI- 28153	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG	ELQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CRTSQSISSYLNWYQQKPGQPP KLLIYWASTRESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDSATYYC

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	PWGFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:ll)	QQSYDIPYTFGQGTKLEIK (ID. DE SEQ. N°:12)
ADI28226 (C26)	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG PWSFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:13)	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT CRASQSISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQYGSFPITFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:14)
ADI- 28154	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG PWSFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:15)	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT CRASQSISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPDDFATYYC QQSKEVPWTFGQGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:16)
ADI- 29399	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG PWSFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:17)	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT CRASQSISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQYNSFPTFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:18)
ADI- 29401	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG PWSFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:19)	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT CRASQSIGSWLAWYQQKP GKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQYDIYPTFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:20)
ADI- 29403	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG PWSFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:21)	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT CRASQSISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQYDSYPTFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:22)
ADI- 29405	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG PWSFDPWGQGTLVTVSS	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT CRASQSISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQYGSFPTFGGGTKVEIK

Petição 870190105209, de 17/10/2019, pág. 37/103

31/77

	(ID. DE SEQ. N°:23)	(ID. DE SEQ. N°:24)
ADI- 29407	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG PWSFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:25)	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT CRASQSISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQYQSFPTFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:26)
ADI- 29419	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG PWSFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:27)	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT CRASQSISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQYSSFSTFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:28)
ADI- 29421	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG PWSFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:29)	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT CRASQSISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQYESYSTFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:30)
ADI- 29424	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG PWSFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:31)	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT CRASQSISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQYDSFITFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:32)
ADI- 29425	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG PWSFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:33)	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT CRASQSISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQYQSYPTFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:34)
ADI- 29426	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG PWSFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:35)	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT CRASQSIGSWLAWYQQKP GKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQYHSFPTFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:36)

Petição 870190105209, de 17/10/2019, pág. 38/103

32/77

ADI- 29429	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG PWSFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:37)	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT CRASQSIGSWLAWYQQKP GKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQYELYSYTFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:38)
ADI29447 (F47)	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG PWSFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:39)	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT CRASQSISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQYDTFITFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:40)
ADI- 27727	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS GGTF S SYAISWVRQAP GQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES T S TAYME LSSLRSED TAVYYCARGD SSIRHAYYYYGMDVWGQGTTVTVS S (ID. DE SEQ. N°:41) CDR1 (ID. DE SEQ. N°:65) GTFSSYAIS CDR2 (ID. DE SEQ. N°:66) GIIPIFGTANYAQKFQG CDR3 (ID. DE SEQ. N°:67) ARGD SSIRHAYYYYGMDV	DIVMTQSPDSLAVSLGERATIN CKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQ KPGQPPKLLIYWASTRESGVPD RFSGSGSGTDFTLTISSLQAED VAVYYCQQYYSTPITFGGGTKV EIK (ID. DE SEQ. N°:42) CDR1 (ID. DE SEQ. N°:68) - KSSQSVLYSSNNKNYLA CDR2 (ID. DE SEQ. N°:69) - WASTRES CDR3 (ID. DE SEQ. N°:70) - QQYYSTPIT
ADI29443 (F43)	QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS GGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWI GSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDT SKNQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARG SDRFHPYFDYWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:43)	EIVLTQSPATLSLSPGERATLS CRASQSVSRYLAWYQQKPGQAP RLLIYDASNRATGIPARFSGSG SGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC QQFDTWPPTFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:44)

Petição 870190105209, de 17/10/2019, pág. 39/103

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	CDR1 (ID. DE SEQ. N°:71) GSISSSSYYWG CDR2 (ID. DE SEQ. N°:72) SIYYSGSTYYNPSLKS CDR3 (ID. DE SEQ. N°:73) ARGSDRFHPYFDY	CDR1 (ID. DE SEQ. N°:74) - RASQSVSRYLA CDR2 (ID. DE SEQ. N°:75) - DASNRAT CDR3 (ID. DE SEQ. N°:76) - QQFDTWPPT
ADI29404 (F04)	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY GGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGE IDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQF S LKL S SVTAAD TAVYYCARARG PWSFDPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°:89)	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT CRASQSISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLQPDDFATYYC EQYDSYPTFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:90)
ADI- 28200	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS GGTF S SYAISWVRQAP GQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES T S TAYME LSSLRSED TAVYY CARRG RKASGSFYYYYGMDVWGQGTTVTVS S (ID. DE SEQ. N°:91)	DIVMTQSPDSLAVSLGERATIN CESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQ KPGQPPKPLIYWASTRESGVPD RFSGSGSGTDFTLTISSLQAED VAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKL EIK (ID. DE SEQ. N°:92)

[0088] Alternativamente, um dominio variável da cadeia pesada definido pela ID. DE SEQ. N° : 45 pode ser emparelhado com um dominio variável da cadeia leve definido pela ID. DE SEQ. N°: 46 para formar um local de ligação ao antigeno que pode se ligar a NKG2D, como ilustrado na US 9.273.136.

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDG SNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQG TTVTVSS (ID. DE SEQ. N°:45)

QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLL PSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL

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34/77 (ID. DE SEQ. N°:46) [0089] Alternativamente, um dominio variável da cadeia pesada definido pela ID. DE SEQ. N° : 47 pode ser emparelhado com um dominio variável da cadeia leve definido pela ID. DE SEQ. N°: 48 para formar um local de ligação ao antigeno que pode se ligar a NKG2D, como ilustrado na US 7.879.985.

QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGHISYSGSANY NPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIWGQGTMVTVSS (ID. DE SEQ. N°:47) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°:48) [0090] A Tabela 2 lista sequências peptidicas de dominios variáveis de cadeia pesada e dominios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a GD2.

Tabela 2
Clones	Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada	Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve
Hu3F8 (US 9.315.585)	QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCT VSGFSVTNYGVHWVRQPPGKGLE WLGVIWAGGITNYNSAFMSRLSI SKDNSKSQVFLKMNSLQIDDTAM YYCASRGGHYGYALDYWGQGTSV TVSSA (ID. DE SEQ. N°:49) CDR1 (ID. DE SEQ. N°:50) - GFSVTNY CDR2 (ID. DE SEQ. N° : 51) - WAGGI CDR3 (ID. DE SEQ. N°:52) - RGGHYGYALDY	SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTI TCKASQSVSNDVTWYQQKAGQ SPKLLIYSASNRYSGVPDRFT GSGYGTAFTFTISTVQAEDLA VYFCQQDYSSFGGGTKLEIKR (ID. DE SEQ. N°:53) CDR1(ID. DE SEQ. N°:54) - QSVSNDVT CDR2 (ID. DE SEQ. N°:55) - SASNRYS CDR3 (ID. DE SEQ. N° : 56) - QQDYSS

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Dinutuximab (PMID : 16187086)	EVQLLQSGPELEKPGASVMISCK ASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLE WIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRAT LTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSA VYYCVSGMEYWGQGTSVTVSSA (ID. DE SEQ. N°:57) CDR1 (ID. DE SEQ. N°:77) - GSSFTGY CDR2 (ID. DE SEQ. N°:78) - DPYYGG CDR3 (ID. DE SEQ. N° : 7 9) - GMEY	EIVMTQSPATLSVSPGERATL SCRSSQSLVHRNGNTYLHWYL QKPGQSPKLLIHKVSNRFSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDLGVYFCSQSTHVPPLTFG AGTKLELKR (ID. DE SEQ. N°:58) CDR1 (ID. DE SEQ. N°:80) - QSLVHRNGNTYLH CDR2 (ID. DE SEQ. N°:81) - KVSNRFS CDR3 (ID. DE SEQ. N°:82) - SQSTHVPPLT
EMD 273063 (US 7,432,357)	EVQLVQSGAEVEKPGASVKISCK ASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLE WIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRAT LTVDKSTSTAYMHLKSLRSEDTA VYYCVSGMEYWGQGTSVTVSSA (ID. DE SEQ. N°:59) CDR1 (ID. DE SEQ. N° : 83) - GSSFTGY CDR2 (ID. DE SEQ. N° : 84) - DPYYGG CDR3 (ID. DE SEQ. N° : 85) - GMEY	DWMTQTPLSLPVTPGEPASI SCRSSQSLVHRNGNTYLHWYL QKPGQSPKLLIHKVSNRFSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDLGVYFCSQSTHVPPLTFG AGTKLELKR (ID. DE SEQ. N°:60) CDR1 (ID. DE SEQ. N°:86) - QSLVHRNGNTYLH CDR2 (ID. DE SEQ. N°:87) - KVSNRFS CDR3 (ID. DE SEQ. N°:88) - SQSTHVPPLT

[0091] Como alternativa, novos sítios de ligação ao antigeno que podem se ligar ao GD2 podem ser identificados através da triagem da ligação ao GD2 definido pela seguinte estrutura química: ácido (2R, 4R, 5S, 6S)-2-[3-[ (2S, 3S, 4R, 6S)-6-[(2S, 3R, 4R, 5S, 6R)-5-[(2S, 3R, 4R, 5R, 6R) -3acetamido-4,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)oxan-2-il]oxi-2Petição 870190105209, de 17/10/2019, pág. 42/103

36/77 [ (2R, 3S, 4R, 5R, 6R)-4,5-dihidroxi-2-(hidroximetil)-6[(E)-3-hidroxi-2-(octadecanoilamino)octadec-4-enoxi]oxan-3il]oxi-3-hidroxi-6-(hidroximetil)oxan-4-il]oxi-3-amino-6carboxi-4-hidroxioxan-2-il]-2,3-dihidroxipropoxi]-5-amino4-hidroxi-6-(1,2,3-trihidroxipropil)oxano-2-carboxilico.

[0092] Dentro do domínio Fc, a ligação a CD16 é mediada pela região de dobradiça e pelo domínio CH2. Por exemplo, na IgGl humana, a interação com CD16 é focada, principalmente, nos resíduos de aminoácidos Asp 265 - Glu 269, Asn 297 - Thr 299, Ala 327 - He 332, Leu 234 - Ser 239 e resíduo de carboidrato N-acetil-D -glucosamina no domínio CH2 (ver, Sondermann et al., Nature, 406 (6793): 267-273). Com base nos domínios conhecidos, as mutações podem ser selecionadas para melhorar ou reduzir a afinidade de ligação a CD16, como o uso de bibliotecas exibidas em fagos ou bibliotecas de cDNA exibidas na superfície de leveduras ou podem ser projetadas com base na estrutura tridimensional conhecida da interação.

[0093] A montagem de cadeias pesadas de anticorpos heterodiméricos pode ser realizada expressando duas sequências diferentes de cadeias pesadas de anticorpos na mesma célula, o que pode levar à montagem de homodímeros de cada cadeia pesada de anticorpos, bem como a montagem de heterodímeros. A promoção da montagem preferencial de heterodímeros pode ser realizada incorporando diferentes mutações no domínio CH3 de cada região constante da cadeia pesada de anticorpos, como mostrado nas US13/494870, US16/028850, US11/533709, US12/875015, US13/289934,

US14/773418, US12/811207, US13/866756, US14/647480 e

US14/830336. Por exemplo, as mutações podem ser feitas no

Petição 870190105209, de 17/10/2019, pág. 43/103

37/77 domínio CH3 com base na IgGl humana e incorporando pares distintos de substituições de aminoácidos dentro de um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo que permite que essas duas cadeias heterodimerizem seletivamente uma com a outra. As posições das substituições de aminoácidos ilustradas abaixo são numeradas de acordo com o índice da EU como em Kabat.

[0094] Em um cenário, uma substituição de aminoácidos no primeiro polipeptídeo substitui o aminoácido original por um aminoácido maior, selecionado entre arginina (R) , fenilalanina (F), tirosina (Y) ou triptofano (W) e em pelo menos uma substituição de aminoácidos no segundo polipeptídeo substitui o(s) aminoácido(s) original(is) por um(uns) aminoácido(s) menor(menores), escolhido(s) de alanina (A) , serina (S) , treonina (T) ou valina (V) , como que a substituição maior de aminoácidos (uma protuberância) se encaixa na superfície das substituições menores de aminoácidos (uma cavidade). Por exemplo, um polipeptídeo pode incorporar uma substituição T366W e o outro pode incorporar três substituições, incluindo T366S, L368A e Y407V.

[0095] Um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo da invenção pode opcionalmente ser acoplado a uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma região constante de anticorpo, como uma região constante de IgG incluindo domínios de dobradiça, CH2 e CH3 com ou sem domínio CHI. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da região constante é pelo menos 90% idêntica a uma região constante de anticorpo humano, como uma região constante de IgGl humana, uma região constante de IgG2, uma

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38/77 região constante de IgG2, uma região constante de IgG3 ou uma região constante de IgG4. Em algumas outras modalidades, a sequência de aminoácidos da região constante é pelo menos 90% idêntica a uma região constante de anticorpo de outro mamífero, como coelho, cachorro, gato, camundongo ou cavalo. Uma ou mais mutações podem ser incorporadas na região constante em comparação com a região constante de IgGl humana, por exemplo em Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 e/ou

K43 9 .	Substituições exemplares incluem, por	exemplo,	Q347E,
Q347R,	Y349S,	Y349K,	Y349T,	Y349D,	Y349E,	Y349C,	T350V,
L351K,	L351D,	L351Y,	S354C,	E356K,	E357Q,	E357L,	E357W,
K360E,	K360W,	Q362E,	S364K,	S364E,	S364H,	S364D,	T366V,
T366I,	T366L,	T366M,	T366K,	T366W,	T366S,	L368E,	L368A,
L368D,	K370S,	N390D,	N390E,	K392L,	K392M,	K392V,	K392F,
K392D,	K392E,	T394F,	T394W,	D399R,	D399K,	D399V,	S400K,
S400R,	D401K,	F405A,	F405T,	Y407A,	Y407I ,	Y407V,	K409F,

K409W, K409D, T411D, T411E, K439D e K439E.

[0096] Em certas modalidades, as mutações que podem ser incorporadas no CHI de uma região constante de IgGl humana podem estar no aminoácido V125, F126, P127, T135, T139, A140, F170, P171 e/ou V173. Em certas modalidades, as mutações que podem ser incorporadas na Ck de uma região constante de IgGl humana podem estar no aminoácido E123,

F116, S176, V163, S174 e/ou T164.

[0097] As substituições de aminoácidos podem ser selecionadas a partir dos seguintes conjuntos de substituições mostrados na Tabela 3.

Tabela 3
	Primeiro Polipeptideo	Segundo Polipeptideo

Petição 870190105209, de 17/10/2019, pág. 45/103

39/77

Conjunto 1	S364E/F405A	Y349K/T394F
Conjunto 2	S364H/D401K	Y349T/T411E
Conjunto 3	S364H/T394F	Y349T/F405A
Conjunto 4	S364E/T394F	Y349K/F405A
Conjunto 5	S364E/T411E	Y349K/D401K
Conjunto 6	S364D/T394F	Y349K/F405A
Conjunto 7	S364H/F405A	Y349T/T394F
Conjunto 8	S364K/E357Q	L368D/K370S
Conjunto 9	L368D/K370S	S364K
Conjunto 10	L368E/K370S	S364K
Conjunto 11	K360E/Q362E	D401K
Conjunto 12	L368D/K370S	S364K/E357L
Conjunto 13	K370S	S364K/E357Q
Conjunto 14	F405L	K4 0 9R
Conjunto 15	K409R	F405L

[0098] Alternativamente, as substituições de aminoácidos podem ser selecionadas a partir dos seguintes conjuntos de substituições mostrados na Tabela 4.

Tabela 4
	Primeiro Polipeptideo	Segundo Polipeptideo
Conjunto 1	K4 0 9W	D399V/F405T
Conjunto 2	Y349S	E357W
Conjunto 3	K360E	Q347R
Conjunto 4	K360E/K409W	Q347R/D399V/F405T
Conjunto 5	Q347E/K360E/K409W	Q347R/D399V/F405T
Conjunto 6	Y349S/K409W	E357W/D399V/F405T

[0099] Alternativamente, as substituições de aminoácidos podem ser selecionadas do seguinte conjunto de substituições mostrado na Tabela 5.

Tabela 5
	Primeiro Polipeptideo	Segundo Polipeptideo
Conjunto 1	T366K/L351K	L351D/L368E
Conjunto 2	T366K/L351K	L351D/Y349E
Conjunto 3	T366K/L351K	L351D/Y349D
Conjunto 4	T366K/L351K	L351D/Y349E/L368E
Conjunto 5	T366K/L351K	L351D/Y349D/L368E
Conjunto 6	E356K/D399K	K392D/K409D

[00100] Alternativamente, pelo menos uma substituição

Petição 870190105209, de 17/10/2019, pág. 46/103

40/77 de aminoácidos em cada cadeia polipeptídica pode ser selecionada da Tabela 6.

Tabela 6
Primeiro Polipeptideo	Segundo Polipeptideo
L351Y, D399R, D399K, S400K, S400R, Y407A, Y407I, Y407V	T366V, T366I, T366L, T366M, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F K392D, K392E, K409F, K409W, T411D e T411E

[00101] Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácidos pode ser selecionada a partir do seguinte conjunto de substituições na Tabela 7, onde as posições indicadas na coluna do Primeiro Polipeptideo são substituídas por qualquer aminoácido conhecido com carga negativa, e as posições indicadas na Coluna do Segundo Polipeptideo são substituídas por qualquer aminoácido conhecido com carga positiva.

Tabela 7
Primeiro Polipeptideo	Segundo Polipeptideo
K392, K370, K409, ou K4 3 9	D399, E356, ou E357

[00102] Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácidos pode ser selecionada a partir do seguinte conjunto da Tabela 8, onde as posições indicadas na coluna do Primeiro Polipeptideo são substituídas por qualquer aminoácido conhecido carregado positivamente e as posições indicadas na coluna do Segundo Polipeptideo são substituídas por qualquer aminoácido conhecido carregado negativamente.

Tabela 8
Primeiro Polipeptideo	Segundo Polipeptideo
D399, E356, ou E357	K409, K439, K370, ou K392

[00103] Alternativamente, as substituições de

Petição 870190105209, de 17/10/2019, pág. 47/103

41/77 aminoácidos podem ser selecionadas do seguinte conjunto na Tabela 9.

Tabela 9
Primeiro Polipeptídeo	Segundo Polipeptídeo
T350V, L351Y, F405A, e Y407V	T350V, T366L, K392L, e T394W

[00104] Alternativamente, ou adicionalmente, a estabilidade estrutural de uma proteína heteromultimérica pode ser aumentada através da introdução de S354C na primeira ou segunda cadeia polipeptídica e Y349C na cadeia polipeptídica oposta, que forma uma ponte dissulfeto artificial na interface dos dois polipeptídeos.

[00105] As proteínas multiespecíficas descritas acima podem ser produzidas usando a tecnologia de DNA recombinante bem conhecida por um perito na técnica. Por exemplo, uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica a primeira cadeia pesada de imunoglobulina pode ser clonada em um primeiro vetor de expressão; uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica a segunda cadeia pesada de imunoglobulina pode ser clonada em um segundo vetor de expressão; uma terceira sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve de imunoglobulina pode ser clonada em um terceiro vetor de expressão; o primeiro, segundo e terceiro vetores de expressão podem ser estavelmente transfectados juntos em células hospedeiras para produzir as proteínas multiméricas.

[00106] Para alcançar o maior rendimento da proteína multiespecífica, diferentes razões do primeiro, segundo e terceiro vetores de expressão podem ser exploradas para determinar a razão ideal para a transfecção nas células

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42/77 hospedeiras. Após a transfecção, os clones únicos podem ser isolados para geração de banco de células usando métodos conhecidos na técnica, como diluição limitada, ELISA, FACS, microscopia ou Clonepix.

[00107] Os clones podem ser cultivados em condições adequadas para expansão do bioreator e expressão mantida da proteina multiespecifica. As proteínas multiespecíficas podem ser isoladas e purificadas usando métodos conhecidos na técnica, incluindo centrifugação, filtração em profundidade, lise celular, homogeneização, congelamentodescongelamento, purificação por afinidade, filtração em gel, cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca de interação hidrofóbica e cromatografia em modo misto.

II Características das proteínas multíespecífícas [00108] Em certas modalidades, as proteínas multiespecificas, aqui descritas, que incluem um domínio de ligação a NKG2D e um domínio de ligação a GD2, se ligam a células que expressam NKG2D humano. Em certas modalidades, as proteínas multiespecíficas se ligam ao antigeno associado ao tumor GD2 em um nível comparável ao de um anticorpo monoclonal que possui o mesmo domínio de ligação a GD2. No entanto, as proteínas multiespecificas, aqui descritas, podem ser mais eficazes na redução do crescimento tumoral e na morte de células cancerígenas que expressam GD2 do que os anticorpos monoclonais GD2 correspondentes .

[00109] Em certas modalidades, as proteínas multiespecificas, descritas aqui, que incluem um domínio de ligação a NKG2D e um domínio de ligação a GD2, podem ativar células NK humanas primárias ao cultivar com células

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43/77 tumorais que expressam o antigeno GD2. A ativação das células NK é marcada pelo aumento na degranulação de CD107a e na produção de citocinas IFNy. Além disso, comparadas a um anticorpo monoclonal que inclui o mesmo domínio de ligação a GD2, as proteínas multiespecíficas mostram ativação superior das células NK humanas na presença de células tumorais que expressam o antigeno GD2.

[00110] Em certas modalidades, as proteínas multiespecíficas, aqui descritas, que incluem um domínio de ligação a NKG2D e um domínio de ligação a GD2, podem aumentar a atividade de células NK humanas descansadas e ativadas por IL-2 na presença de células tumorais expressando o antigeno GD2.

[00111] Em certas modalidades, as proteínas multiespecíficas, descritas aqui, que incluem um domínio de ligação a NKG2D e um domínio de ligação a um antigeno associado a um tumor GD2, podem aumentar a atividade citotóxica de células NK humanas descansadas e ativadas por IL-2 na presença de células tumorais que expressam o antigeno GD2. Em certas modalidades, comparadas aos anticorpos monoclonais correspondentes, as proteínas multiespecíficas podem oferecer uma vantagem contra células tumorais que expressam GD2 médio e baixo.

[00112] Em certas modalidades, as proteínas multiespecíficas, aqui descritas, podem ser vantajosas no tratamento de cânceres com alta expressão do receptor Fc (FcR) ou cânceres residentes em um microambiente tumoral com altos níveis de FcR, em comparação com os anticorpos monoclonais GD2 correspondentes. Os anticorpos monoclonais exercem seus efeitos no crescimento tumoral através de

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44/77 múltiplos mecanismos, incluindo ADCC, CDC, fagocitose e bloqueio de sinal, entre outros. Entre os FcyRs, o CD16 possui a menor afinidade pelo IgG Fc; 0 FcyRI (CD64) é o FcR de alta afinidade, que se liga aproximadamente 1000 vezes mais fortemente ao IgG Fc do que CD16. O CD64 é normalmente expresso em muitas linhagens hematopoiéticas, como a linhagem mielóide, e pode ser expresso em tumores derivados desses tipos de células, como leucemia mielóide aguda (AML). As células imunes infiltrando no tumor, como MDSCs e monócitos, também expressam CD64 e são conhecidas por se infiltrar no microambiente do tumor. A expressão de CD64 pelo tumor ou no microambiente do tumor pode ter um efeito prejudicial na terapia com anticorpos monoclonais. A expressão de CD64 no microambiente tumoral dificulta a participação desses anticorpos no CD16 na superficie das células NK, já que os anticorpos preferem ligar o receptor de alta afinidade. As proteínas multiespecificas, através do direcionamento de dois receptores ativadores na superfície das células NK, podem superar o efeito prejudicial da expressão de CD64 (no tumor ou no microambiente do tumor) na terapia de anticorpos monoclonais. Independentemente da expressão de CD64 nas células tumorais, as proteínas multiespecificas são capazes de mediar as respostas das células NK humanas contra todas as células tumorais, porque o direcionamento duplo de dois receptores ativadores nas células NK fornece uma ligação específica mais forte às células NK.

[00113] Em algumas modalidades, as proteínas multiespecificas descritas neste documento podem fornecer um melhor perfil de segurança por meio de efeitos

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45/77 colaterais fora do tumor reduzidos no alvo. As células assassinas naturais e as células T CD8 são capazes de lisar diretamente as células tumorais, embora os mecanismos pelos quais as células NK e as células T CD8 reconhecem normal próprio das células tumorais sejam diferentes. A atividade das células NK é regulada pelo balanço de sinais dos receptores ativadores (NCRs, NKG2D, CD16, etc.) e inibitórios (KIRs, NKG2A, etc.) . 0 equilíbrio desses sinais de ativação e inibição permite que as células NK determinem as autocélulas saudáveis a partir de autocélulas estressadas, infectadas por vírus ou transformadas. Esse mecanismo construído interno de autotolerância ajudará a proteger o tecido saudável normal das respostas das células NK. Para estender esse princípio, a autotolerância das células NK permitirá que o TriNKETs atinja antígenos expressos tanto no próprio como no tumor sem efeitos colaterais fora do tumor ou com uma janela terapêutica aumentada. Ao contrário das células assassinas naturais, as células T requerem o reconhecimento de um peptídeo específico apresentado pelas moléculas do MHC para ativação e funções efetoras. As células T têm sido o alvo principal da imunoterapia, e muitas estratégias foram desenvolvidas para redirecionar as respostas das células T contra o tumor. Biespecíficos de células T, inibidores de ponto de verificação e células CAR-T foram todos aprovados pelo FDA, mas frequentemente sofrem de toxicidades limitantes da dose. As células B específicas e as células CAR-T trabalham em torno do sistema de reconhecimento TCR-MHC usando domínios de ligação para atingir antígenos na superfície das células tumorais e usando domínios de sinalização

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46/77 projetados para transduzir os sinais de ativação na célula efetiva. Embora sejam eficazes na obtenção de uma resposta imune antitumoral, essas terapias costumam estar associadas à síndrome de liberação de citocinas (SRC) e a efeitos colaterais não tumorais no alvo. As proteínas multiespecíficas são únicas nesse contexto, pois não substituem os sistemas naturais de ativação e inibição de células NK. Em vez disso, as proteínas multiespecíficas são projetadas para influenciar o equilíbrio e fornecer sinais de ativação adicionais às células NK, mantendo a tolerância da NK à própria saúde.

[00114] Em algumas modalidades, as proteínas multiespecíficas, aqui descritas, podem atrasar a progressão do tumor de forma mais eficaz do que os anticorpos monoclonais GD2 correspondentes que incluem o mesmo domínio de ligação a GD2. Em algumas modalidades, as proteínas multiespecíficas, aqui descritas, podem ser mais eficazes contra as metástases de câncer do que os anticorpos monoclonais GD2 correspondentes que incluem o mesmo domínio de ligação a GD2.

III APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS [00115] A invenção fornece métodos para o tratamento de câncer usando uma proteína de ligação multiespecífica, aqui descrita, e/ou uma composição farmacêutica, aqui descrita. Os métodos podem ser utilizados para tratar uma variedade de cânceres que expressam GD2, administrando a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação multiespecífica, aqui descrita.

[00116] O método terapêutico pode ser caracterizado de

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47/77 acordo com o câncer a ser tratado. Por exemplo, em certas modalidades, os cânceres são neuroblastoma, melanoma, retinoblastoma, câncer de pulmão de pequenas células, tumores cerebrais, osteossarcoma, rabdomiossarcoma, sarcoma de Ewing em crianças e adolescentes, bem como lipossarcoma, fibrossarcoma, leiomiossarcoma ou outros sarcomas de tecidos moles em adultos.

[00117] Em certas outras modalidades, o câncer é câncer cerebral, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer de esôfago, leucemia, câncer de pulmão, câncer de fígado, melanoma, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer retal, câncer renal, câncer de estômago, câncer testicular ou câncer uterino. Em ainda outras modalidades, o câncer é um carcinoma da célula escamosa, adenocarcinoma, carcinoma de pequenas células, melanoma, neuroblastoma, sarcoma (por exemplo, angiossarcoma ou condrosarcoma), câncer de laringe, câncer de parótida, câncer do trato biliar, câncer de tireóide, melanoma acral lentiginose, queratoses actínicas, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielóide aguda, carcinoma adenoide cístico, adenomas, adenosarcoma, carcinoma adenoescamoso, câncer de canal anal, câncer anal, câncer de anorreto, tumor astrocítico, carcinoma da glândula de bartolina, carcinoma de células basais, câncer biliar, câncer de osso, câncer de medula óssea, câncer brônquico, carcinoma da glândula brônquica, carcinoide, colangiocarcinoma, condossarcoma, papiloma/carcinoma do plexo coróide, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielóide crônica, carcinoma de células claras, câncer de tecido conjuntivo, cistadenoma, câncer do sistema

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48/77 digestivo, câncer do duodeno, câncer do sistema endócrino, tumor do seio endodérmico, hiperplasia endometrial, sarcoma do estroma endometrial, adenocarcinoma endometrioide, câncer de células endoteliais, câncer de células ependimárias, câncer de células epiteliais, sarcoma de Ewing, câncer de olhos e órbita, câncer genital feminino, hiperplasia nodular focal, câncer de vesicula biliar, câncer de antro gástrico, câncer de fundo gástrico, gastrinoma, glioblastoma, glucagonoma, câncer de coração, hemangiblastomas, hemangioendotelioma, hemangiomas, adenoma hepático, adenomatose hepática, câncer hepatobiliar, carcinoma hepatocelular, doença de Hodgkin, câncer de ileo, insulinoma, neoplasia inepepitelial, neoplasia de células escamosas interepiteliais, câncer de duto biliar intrahepático, carcinoma de célula escamosa invasiva, câncer no jejuno, câncer na junta, sarcoma de Kaposi, câncer pélvico, carcinoma de células grandes, câncer de intestino grosso, leiomiossarcoma, melanomas de lentigo maligno, linfoma, câncer genital masculino, melanoma maligno, tumores mesoteliais malignos, meduloblastoma, meduloepitelioma, câncer meningeo, câncer mesotelial, carcinoma metastático, câncer de boca, carcinoma mucoepidermóide, mieloma múltiplo, câncer muscular, câncer do trato nasal, câncer do sistema nervoso, melanoma nodular adenocarcinoma neuroepitelial, câncer de pele não epitelial, linfoma nãoHodgkin, carcinoma de células alveolares, câncer oligodendroglial, câncer de cavidade oral, osteossarcoma, adenocarcinoma seroso papilar, câncer de pênis, câncer de faringe, tumores pituitários, plasmocitoma, pseudosarcoma, blastoma pulmonar, câncer retal, carcinoma de células

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49/77 renais, câncer do sistema respiratório, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, sarcoma, carcinoma seroso, câncer de seio, câncer de pele, carcinoma de pequenas células, câncer de intestino delgado, câncer de músculo liso, câncer de tecidos moles, tumor secretor de somatostatina, câncer de coluna, carcinoma de célula escamosa, câncer de músculo estriado, câncer submesotelial, melanoma de espalhamento superficial, leucemia de células T, câncer de língua, carcinoma indiferenciado, câncer de ureter, câncer de uretra, câncer de bexiga urinária, câncer de sistema urinário, câncer de colo uterino, câncer de corpo uterino, melanoma uveal, câncer vaginal, carcinoma verrucoso,

VI Poma,	câncer de vulva,	carcinoma	bem	diferenciado	ou
tumor de	Wilms .
[00118] Em certas outras modalidades,	o câncer é	um
linfoma	não-Hodgkin, como	um linfoma	de	células B ou	um

linfoma de células T. Em certas modalidades, o linfoma nãoHodgkin é um linfoma de células B, como um linfoma difuso de células B grandes, linfoma primário de células B mediastinais, linfoma folicular, linfoma linfocítico pequeno, linfoma de células do manto, linfoma de células B da zona marginal, linfoma de células B da zona marginal extranodal, linfoma de células B da zona marginal nodal, linfoma de células B da zona marginal esplênica, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmocítico, leucemia de células peludas ou linfoma do sistema nervoso central (SNC). Em certas outras modalidades, o linfoma não-Hodgkin é um linfoma de células T, como um linfoma T-linfoblástico precursor, linfoma de células T periférico, linfoma de células T cutâneo, linfoma de células T angioimunoblástico,

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50/77 linfoma de célula assassina natural extranodal / célula T, linfoma de células T tipo enteropatia, linfoma de células T do tipo paniculite subcutâneo, linfoma anaplásico de células grandes ou linfoma periférico de células T.

[00119] O câncer a ser tratado pode ser caracterizado de acordo com a presença de um antígeno específico expresso na superfície da célula cancerígena. Em certas modalidades, a célula cancerígena pode expressar um ou mais dos seguintes itens além de GD2: CD2, CD19, CD20, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 e PD1.

IV TERAPIA COMBINADA [00120] Outro aspecto da invenção prevê terapia de combinação. As proteínas de ligação multiespecífica, aqui descritas, podem ser usadas em combinação com agentes terapêuticos adicionais para tratar o câncer.

[00121] Agentes terapêuticos exemplares que podem ser usados como parte de uma terapia combinada no tratamento de

câncer incluem, por exemplo, radiação,	mitomicina,
tretinoína,	ribomustin,	gencitabina,	vincristina,
etoposídeo,	cladribina,	mitobronitol,	metotrexato,
doxorrubicina,	carboquona	, pentostatina,	nitracrina,
zinostatina,	cetrorelix,	letrozol, raltitrexede,
daunorubicina,	fadrozol,	fotemustina,	timalfasina,
sobuzoxano,	nedaplatina,	citarabina, bicalutamida,
vinorelbina,	vesnarinona,	aminoglutetrimidina	, ansacrina,
proglumida,	acetato de eliptínio,	cetanserina,
doxifluridina,	etretinato,	isotretinoína, estreptozocina,
nimustina, vindesina, flutamida, drogenil	, butocina,

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51/77 carmofur, razoxano, sizofilan, carboplatina, mitolactol, tegafur, ifosfamida, prednimustina, picibanil, levamisol, teniposideo, improsulfano, enocitabina, lisurida, oximetolona, oximetolona, tamoxifeno, progesterona, mepitiostano, epitiostanol, formestano, interferon-alfa, interferon-2 alfa, interferon-beta, interferon-gama, fator1 estimulador de colônias, fator 2 estimulador de colônias, denileucina diftitox, interleucina-2, fator liberador de hormônio luteinizante e variações dos agentes acima mencionados que podem exibir ligação diferencial ao seu receptor cognato e meia-vida sérica aumentada ou diminuída.

[00122] Uma classe adicional de agentes que podem ser usados como parte de uma terapia combinada no tratamento do câncer são os inibidores do ponto de verificação imune. Inibidores de ponto de verificação imune exemplificativos incluem agentes que inibem um ou mais dos (i) antigeno 4 citotóxico associado a linfócitos T (CTLA4), (ii) proteína de morte celular programada 1 (PD1), (iii) PDL1, (iv) LAG3, (v) B7-H3, (vi) B7-H4 e (vii) TIM3. O inibidor do CTLA4 ipilimumabe foi aprovado pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos para o tratamento de melanoma.

[00123] Ainda outros agentes que podem ser utilizados como parte de uma terapia combinada no tratamento do câncer são agentes de anticorpos monoclonais que têm como alvo alvos que não são pontos de verificação (por exemplo, herceptina) e agentes não citotóxicos (por exemplo, inibidores de tirosina-quinase).

[00124] Ainda outras categorias de agentes anticâncer incluem, por exemplo: (i) um inibidor selecionado de um inibidor de ALK, um inibidor de ATR, um antagonista A2A, um

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52/77 inibidor de reparo de excisão de base, um inibidor de BcrAbl tirosina quinase, um Inibidor de tirosina quinase de Bruton, um inibidor de CDC7, um inibidor de CHK1, um inibidor de quinase dependente de ciclina, um inibidor de DNA-PK, um inibidor de DNA-PK e mTOR, um inibidor de DNMT1, um inibidor de DNMT1, um inibidor de DNMT1 mais 2-clorodesoxiadenosina, um inibidor de HDAC, um inibidor da via de sinalização de Hedgehog, um inibidor IDO, um inibidor JAK, um inibidor mTOR, um inibidor MEK, um inibidor MELK, um inibidor MTH1, um inibidor PARP, um inibidor fosfoinositideo 3-quinase, um inibidor de ambos PARP1 e DHODH, um inibidor de proteassoma, um inibidor de Topoisomerase II, um inibidor de tirosina quinase, um inibidor de VEGFR e um inibidor de WEE1; (ii) um agonista de 0X40, CD137, CD40, GITR, CD27, HVEM, TNFRSF25 ou ICOS; e (iii) uma citocina selecionada a partir de IL-12, IL-15, GM-CSF e G-CSF.

[00125] As proteínas da invenção também podem ser usadas como um complemento para a remoção cirúrgica da lesão primária.

[00126] A quantidade de proteína de ligação multiespecífica e agente terapêutico adicional e o tempo relativo de administração podem ser selecionados para alcançar um efeito terapêutico combinado desejado. Por exemplo, ao administrar uma terapia de combinação a um paciente necessitado de tal administração, os agentes terapêuticos na combinação, ou uma composição ou composições farmacêuticas compreendendo os agentes terapêuticos, podem ser administrados em qualquer ordem, como por exemplo, sequencialmente, simultaneamente, juntos,

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53/77 simultaneamente e similares. Além disso, por exemplo, uma proteína de ligação multiespecífica pode ser administrada durante um tempo em que o(s) agente(s) terapêutico(s) adicional (adicionais) exerce(m) seu efeito profilático ou terapêutico, ou vice-versa.

V. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS [00127] A presente divulgação também apresenta composições farmacêuticas que contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína aqui descrita. A composição pode ser formulada para uso em uma variedade de sistemas de administração de fármacos. Um ou mais excipientes ou veículos fisiologicamente aceitáveis também podem ser incluídos na composição para formulação adequada. As formulações adequadas para uso na presente divulgação são encontradas em Pharmaceutical Sciences, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Filadélfia, Pa., 17th ed., 1985. Para uma breve revisão dos métodos para administração de medicamentos, ver, por exemplo, Langer (Science 249: 1527-1533, 1990).

[00128] A formulação de distribuição de medicamento por via intravenosa da presente divulgação pode estar contida em uma bolsa, uma caneta ou uma seringa. Em certas modalidades, a bolsa pode ser conectada a um canal que compreende um tubo e/ou uma agulha. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação liofilizada ou uma formulação líquida. Em certas modalidades, a formulação pode ser seca por congelamento (liofilizada) e contida em cerca de 12 a 60 frascos. Em certas modalidades, a formulação pode ser liofilizada e 45 mg da formulação seca por congelamento podem estar contidos em um frasco. Em

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54/77 certas modalidades, cerca de 40 mg - cerca de 100 mg da formulação seca por congelamento podem estar contidos em um frasco. Em certas modalidades, a formulação seca por congelamento de 12, 27 ou 45 frascos é combinada para obter uma dose terapêutica da proteina na formulação de fármaco intravenoso. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação liquida e armazenada como cerca de 250 mg/frasco a cerca de 1000 mg/frasco. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação liquida e armazenada como cerca de 600 mg/frasco. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação liquida e armazenada como cerca de 250 mg/frasco.

[00129] Esta presente divulgação pode existir em uma formulação farmacêutica aquosa liquida incluindo uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteina em uma solução tamponada que forma uma formulação.

[00130] Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas convencionais de esterilização ou podem ser filtradas esterilmente. As soluções aquosas resultantes podem ser empacotadas para uso como estão, ou liofilizadas, sendo a preparação liofilizada combinada com um veiculo aquoso estéril antes da administração. O pH das preparações estará tipicamente entre 3 e 11, mais preferencialmente, entre 5 e 9 ou entre 6 e 8, e mais preferencialmente, entre 7 e 8, como 7 a 7,5. As composições resultantes na forma sólida podem ser embaladas em várias unidades de dose única, cada uma contendo uma quantidade fixa do(s) agente(s) acima mencionado(s). A composição na forma sólida também pode ser embalada em um recipiente para uma quantidade flexivel.

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55/77 [00131] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece uma formulação com uma vida útil prolongada, incluindo a proteina da presente divulgação, em combinação com manitol, ácido citrico monohidratado, citrato de sódio, fosfato dissódico dihidratado, dihidrogênio fosfato dihidratado, cloreto de sódio, polissorbato 80, água e hidróxido de sódio.

[00132] Em certas modalidades, uma formulação aquosa é preparada incluindo a proteina da presente divulgação em uma solução tamponada com pH. O tampão desta invenção pode ter um pH variando entre cerca de 4 e cerca de 8, por exemplo, de cerca de 4,5 a cerca de 6,0 ou de cerca de 4,8 a cerca de 5,5 ou pode ter um pH de cerca de 5,0 a cerca de

5,2. Faixas intermediárias aos pHs citados acima também se destinam a fazer parte desta divulgação. Por exemplo, faixas de valores usando uma combinação de qualquer um dos valores citados acima como limites superior e/ou inferior devem ser incluidas. Exemplos de tampões que controlarão o pH dentro dessa faixa incluem acetato (por exemplo, acetato de sódio) , succinato (como succinato de sódio), gluconato, histidina, citrato e outros tampões de ácidos orgânicos.

[00133] Em certas modalidades, a formulação inclui um sistema tampão que contém citrato e fosfato para manter o pH em uma faixa de cerca de 4 a cerca de 8. Em certas modalidades, a faixa de pH pode ser de cerca de 4,5 a cerca de 6,0, ou de cerca de pH 4,8 a cerca de 5,5 ou numa faixa de pH de cerca de 5,0 a cerca de 5,2. Em certas modalidades, o sistema tampão inclui ácido citrico monohidratado, citrato de sódio, fosfato dissódico dihidratado e/ou dihidrogenofosfato de sódio dihidratado.

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Em certas modalidades, o sistema tampão inclui cerca de 1,3 mg/ml de ácido cítrico (por exemplo, 1,305 mg/ml), cerca de 0,3 mg/ml de citrato de sódio (por exemplo, 0,305 mg/ml), cerca de 1,5 mg/ml de fosfato dissódico dihidratado (por exemplo, 1,53 mg/ml), cerca de 0,9 mg/ml de dihidrogenofosfato de sódio dihidratado (por exemplo, 0,86) e cerca de 6,2 mg/ml de cloreto de sódio (por exemplo, 6,165 mg/ml). Em certas modalidades, o sistema tampão inclui 1-1,5 mg/ml de ácido cítrico, 0,25 a 0,5 mg/ml de citrato de sódio, 1,25 a 1,75 mg/ml de fosfato dissódico dihidratado, 0,7 a 1,1 mg/ml de dihidrogenofosfato de sódio dihidratado e 6,0 a 6,4 mg/ml de cloreto de sódio. Em certas modalidades, o pH da formulação é ajustado com hidróxido de sódio.

[00134] Um poliol, que atua como um tonicificante e pode estabilizar o anticorpo, também pode ser incluído na formulação. O poliol é adicionado à formulação numa quantidade que pode variar em relação à isotonicidade desejada da formulação. Em certas modalidades, a formulação aquosa pode ser isotônica. A quantidade de poliol adicionado também pode ser alterada em relação ao peso molecular do poliol. Por exemplo, uma quantidade menor de monossacarídeo (por exemplo, manitol) pode ser adicionada, em comparação com um dissacarídeo (como trealose). Em certas modalidades, o poliol que pode ser utilizado na formulação como um agente de tonicidade é manitol. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser de cerca de 5 a cerca de 20 mg/ml. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser de cerca de 7,5 a 15 mg/ml. Em certas modalidades, a concentração de manitol

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57/77 pode ser de cerca de 10-14 mg/ml. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser de cerca de 12 mg/ml. Em certas modalidades, o poliol sorbitol pode ser incluído na formulação.

[00135] Um detergente ou tensoativo também pode ser adicionado à formulação. Detergentes exemplares incluem detergentes não iônicos, tais como polissorbatos (por exemplo, polissorbatos 20, 80 etc.) ou poloxamer (por exemplo, poloxamer 188) . A quantidade de detergente adicionado é tal que reduz a agregação do anticorpo formulado e/ou minimiza a formação de partículas na formulação e/ou reduz a adsorção. Em certas modalidades, a formulação pode incluir um tensoativo que é um polissorbato. Em certas modalidades, a formulação pode conter o detergente polissorbato 80 ou o Tween 80. Tween 80 é um termo usado para descrever o sorbitanmonooleato polietileno (20) (ver Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4th ed., 1996). Em certas modalidades, a formulação pode conter entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 10 mg/mL de polissorbato 80, ou entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 5 mg/mL. Em certas modalidades, cerca de 0,1% de polissorbato 80 pode ser adicionado à formulação.

[00136] Nas modalidades, o produto proteico da presente divulgação é formulado como uma formulação líquida. A formulação líquida pode ser apresentada com uma concentração de 10 mg/mL em um frasco USP/Ph Eur tipo I 50R fechado com uma rolha de borracha e selado com um fecho de vedação de crimpagem de alumínio. A rolha pode ser feita de elastômero conforme USP e Ph Eur. Em certas modalidades, os

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58/77 frascos podem ser carregados com 61,2 mL da solução de produto proteico, a fim de permitir um volume extraivel de 60 mL. Em certas modalidades, a formulação liquida pode ser diluida com solução salina a 0,9%.

[00137] Em certas modalidades, a formulação liquida da divulgação pode ser preparada como uma solução de concentração de 10 mg/mL em combinação com um açúcar em niveis de estabilização. Em certas modalidades, a formulação liquida pode ser preparada em um veiculo aquoso. Em certas modalidades, um estabilizador pode ser adicionado em uma quantidade não superior à que pode resultar em uma viscosidade indesejável ou inadequada para administração intravenosa. Em certas modalidades, o açúcar pode ser dissacarideos, por exemplo, sacarose. Em certas modalidades, a formulação liquida também pode incluir um ou mais dentre um agente tamponante, um tensoativo e um conservante.

[00138] Em certas modalidades, o pH da formulação liquida pode ser definido por adição de um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o ácido farmaceuticamente aceitável pode ser ácido clorídrico. Em certas modalidades, a base pode ser hidróxido de sódio.

[00139] Além da agregação, a desamidação é uma variante comum de produto de peptídeos e proteínas que pode ocorrer durante a fermentação, clarificação de colheita/célula, purificação, armazenamento de substância farmacêutica/ fármaco e durante a análise de amostras. Desamidação é a perda de NH3 de uma proteína que forma um intermediário succinimida que pode sofrer hidrólise. O intermediário succinimida resulta em uma diminuição de 17 dalton em massa

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59/77 do peptídeo progenitor. A hidrólise subsequente resulta em um aumento de massa de 18 dalton. 0 isolamento do intermediário succinimida é difícil devido à instabilidade sob condições aquosas. Como tal, a desamidação é tipicamente detectável com o aumento da massa de 1 dalton. A desamidação de uma asparagina resulta em ácido aspártico ou isoaspártico. Os parâmetros que afetam a taxa de desamidação incluem pH, temperatura, constante dielétrica do solvente, força iônica, sequência primária, conformação polipeptídica local e estrutura terciária. Os resíduos de aminoácidos adjacentes a Asn na cadeia peptídica afetam as taxas de desamidação. Gly e Ser após um Asn em sequências de proteínas resultam em uma maior suscetibilidade à desamidação.

[00140] Em certas modalidades, a formulação líquida da presente divulgação pode ser preservada sob condições de pH e umidade para impedir a desaminação do produto proteico.

[00141] O veículo aquoso de interesse aqui é aquele que é farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração em humanos) e é útil para a preparação de uma formulação líquida. Os veículos ilustrativos incluem água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada de pH (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.

[00142] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações deste documento para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (doses múltiplas).

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60/77 [00143] As formulações intravenosas (IV) podem ser a via de administração preferida em casos particulares, como quando um paciente está no hospital após o transplante recebendo todos os fármacos pela via IV. Em certas modalidades, a formulação líquida é diluída com solução de cloreto de sódio a 0,9% antes da administração. Em certas modalidades, o fármaco diluído para injeção é isotônico e adequado para administração por infusão intravenosa.

[00144] Em certas modalidades, um sal ou componentes de tampão podem ser adicionados em uma quantidade de 10 mM 200 mM. Os sais e/ou tampões são f armaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos) com metais ou aminas formadores de bases. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampão de fosfato. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampões de glicinato, carbonato, citrato, caso em que ions de sódio, potássio ou amônio podem servir como contra-íon.

[00145] Um conservante pode ser, opcionalmente, adicionado às formulações deste documento para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (doses múltiplas).

[00146] O veículo aquoso de interesse aqui é aquele que é farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração em humanos) e é útil para a preparação de uma formulação líquida. Os veículos ilustrativos incluem água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada de pH (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.

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61/77 [00147] Esta presente divulgação pode existir em uma formulação liofilizada incluindo as proteínas e um lioprotetor. 0 lioprotetor pode ser açúcar, por exemplo, dissacarídeos. Em certas modalidades, o lioprotetor pode ser sacarose ou maltose. A formulação liofilizada também pode incluir um ou mais de um agente tampão, um tensoativo, um agente de volume e/ou um conservante.

[00148] A quantidade de sacarose ou maltose útil para estabilização do fármaco liofilizado pode estar em uma razão em peso de pelo menos 1:2 de proteína para sacarose ou maltose. Em certas modalidades, a razão de proteína para sacarose ou maltose pode ser de 1:2 a 1:5.

[00149] Em certas modalidades, o pH da formulação, antes da liofilização, pode ser definido pela adição de um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o ácido farmaceuticamente aceitável pode ser ácido clorídrico. Em certas modalidades, a base farmaceuticamente aceitável pode ser hidróxido de sódio.

[00150] Antes da liofilização, o pH da solução que contém a proteína da presente divulgação pode ser ajustado entre 6 a 8. Em certas modalidades, a faixa de pH para o fármaco liofilizado pode ser de 7 a 8.

[00151] Em certas modalidades, um sal ou componentes de tampão podem ser adicionados em uma quantidade de 10 mM - 200 mM. Os sais e/ou tampões são f armaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos) com metais ou aminas formadores de bases. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampão de fosfato. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampões de glicinato, carbonato, citrato, caso em que ions

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62/77 de sódio, potássio ou amônio podem servir como contra-ion.

[00152] Em certas modalidades, um agente de volume pode ser adicionado. Um agente de volume é um composto que adiciona massa a uma mistura liofilizada e contribui para a estrutura física do bolo liofilizado (por exemplo, facilita a produção de um bolo liofilizado essencialmente uniforme que mantém uma estrutura de poros abertos). Os agentes de volume ilustrativos incluem manitol, glicina, polietileno glicol e sorbitol. As formulações liofilizadas da presente invenção podem conter tais agentes de volume.

[00153] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações deste documento para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (doses múltiplas).

[00154] Em certas modalidades, o medicamento liofilizado pode ser constituído por um veículo aquoso. O veículo aquoso de interesse aqui é um que é farmaceuticamente aceitável (por exemplo, seguro e não tóxico para administração a um ser humano) e é útil para a preparação de uma formulação líquida, após liofilização. Diluentes ilustrativos incluem água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada de pH (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.

[00155] Em certas modalidades, o medicamento liofilizado da presente divulgação é reconstituído com Água Estéril para Injeção, USP (SWFI) ou Injeção de Cloreto de Sódio a 0,9%, USP. Durante a reconstituição, o pó

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63/77 liofilizado se dissolve em uma solução.

[00156] Em certas modalidades, o produto proteico liofilizado da presente divulgação é constituído para cerca de 4,5 mL de água para injeção e diluído com solução salina a 0,9% (solução de cloreto de sódio).

[00157] Os níveis reais de dosagem dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas desta invenção podem variar de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração específico, sem ser tóxico para o paciente.

[00158] A dose específica pode ser uma dose uniforme para cada paciente, por exemplo, 50-5000 mg de proteína. Alternativamente, a dose de um paciente pode ser adaptada ao peso corporal aproximado ou à área de superfície do paciente. Outros fatores na determinação da dosagem apropriada podem incluir a doença ou condição a ser tratada ou evitada, a gravidade da doença, a via de administração e a idade, sexo e condição médica do paciente. Um refinamento adicional dos cálculos necessários para determinar a dosagem apropriada para o tratamento é feito rotineiramente pelos versados na técnica, especialmente à luz das informações de dosagem e ensaios aqui divulgados. A dosagem também pode ser determinada através do uso de ensaios conhecidos para determinar as dosagens usadas em conjunto com dados de resposta à dose apropriados. A dosagem de um paciente individual pode ser ajustada à medida que o progresso da doença é monitorado. Os níveis sanguíneos da construção ou do complexo alvo em um paciente podem ser medidos para verificar se a dose precisa ser ajustada para

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ÇA/ΊΊ alcançar ou manter uma concentração eficaz. A farmacogenômica pode ser usada para determinar quais construções e/ou complexos direcionáveis e suas dosagens são mais prováveis de serem eficazes para um determinado indivíduo (Schmitz et al., Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001; Steimer et al., Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001) .

[00159] Em geral, as dosagens baseadas no peso corporal variam de cerca de 0,01 pg a cerca de 100 mg por kg de peso corporal, como cerca de 0,01 pg a cerca de 100 mg/kg de

peso corporal, cerca de 0,01	pg a	a cerca de 50 mg/kg	de de	peso peso
corporal,	cerca	de	0,01	pg	cerca	de	10	mg/kg
corporal,	cerca	de	0,01	pg	a	cerca	de	1	mg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	0,01	pg	a	cerca	de	100	pg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	0,01	pg	a	cerca	de	50	pg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	0,01	pg	a	cerca	de	10	pg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	0,01	pg	a	cerca	de	1	pg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	0,01	pg	a	cerca	de	0,1	pg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	0,1	pg	a i	cerca	de	100	mg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	0,1	pg	a	cerca	de	50	mg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	0,1	pg	a	cerca	de	10	mg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	0,1	pg	a	cerca	de	1	mg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	0,1 pg para	cerca	de	100	pg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	0,1	pg	a	cerca	de	10	pg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	0,1	pg	a	cerca	de	1	pg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	1 pg a	cerca de 100	mg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	1 pg a	l cerca	de	50	mg/kg	de	peso
corporal,	um cerca	de 1	pg	a	cerca	de	10	mg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	1 1	ig <	a	cerca	de	1	mg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	1 pg a	cerca de 100	pg/kg	de	peso

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65/77 corporal, cerca de 1 pg a cerca de 50 pg/kg de corpo peso, cerca de 1 pg a cerca de 10 pg/kg de peso corporal, cerca de 10 pg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 pg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 pg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 pg a cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 pg a cerca de 100 pg/kg de peso corporal, cerca de 10 pg a cerca de 50 pg/kg

de peso corporal, cerca	de	50	pg a	cerca de 100	mg/kg de
peso corporal, cerca	de	50	pg	a cerca de 50	mg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	50	pg	a	cerca	de	10	mg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	50	pg	a	cerca	de	1	mg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	50	pg	a	cerca	de	100	pg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	100	pg	a	cerca	de	100	mg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	100	pg	a	cerca	de	50	mg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	100	pg	a	cerca	de	10	mg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	100	pg	a	cerca de	: 1	mg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	1 i	ng t	a cerca	de	100	mg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	1 m g	a	cerca	de	50	mg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	1	mg	a	cerca	de	10	mg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	10	mg	a	cerca	de	100	mg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	10	mg	a	cerca	de	50	mg/kg	de	peso
corporal,	cerca	de	50	mg	a	cerca	de	100	mg/kg	de	peso

corporal.

[00160] As doses podem ser administradas uma ou mais vezes ao dia, semanalmente, mensalmente ou anualmente, ou mesmo uma vez a cada 2 a 20 anos. Pessoas versadas na técnica podem facilmente estimar taxas de repetição para dosagem com base nos tempos de residência medidos e nas concentrações da construção ou complexo alvo em fluidos ou tecidos corporais. A administração da presente invenção

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66/77 pode ser intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intrapleural, intratecal, intracavitária, por perfusão através de um cateter ou por injeção intralesional direta. Isso pode ser administrado uma ou mais vezes por dia, uma ou mais vezes por semana, uma ou mais vezes por mês e uma ou mais vezes por ano.

[00161] A descrição acima descreve vários aspectos e modalidades da invenção. O pedido de patente contempla especificamente todas as combinações e permutações dos aspectos e modalidades.

EXEMPLOS [00162] A invenção agora descrita em geral será mais facilmente compreendida por referência aos exemplos a seguir, que são incluídos apenas para fins de ilustração de certos aspectos e modalidades da presente invenção, e não se destinam a limitar a invenção.

Exemplo 1 - Os domínios de ligação a NKG2D se ligam a NKG2D Os domínios de ligação a NKG2D se ligam a NKG2D recombinante purificado [00163] As sequências de ácidos nucleicos de ectodomínios NKG2D humano, de camundongo ou de cinomolgo foram fundidos com sequências de ácidos nucleicos que codificam domínios IgGl Fc humanos e introduzidos em células de mamíferos para serem expressos. Após purificação, as proteínas de fusão NKG2D-Fc foram adsorvidas nas cavidades das microplacas. Após o bloqueio das cavidades com albumina de soro bovino para impedir a ligação não específica, os domínios de ligação ao NKG2D foram titulados e adicionados às cavidades pré-adsorvidas com proteínas de fusão NKG2D-Fc. A ligação do anticorpo

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67/77 primário foi detectada usando um anticorpo secundário que foi conjugado com peroxidase de rábano silvestre e reconhece especificamente uma cadeia leve kappa humana para evitar a reatividade cruzada de Fc. 3,3',5,5'tetrametilbenzidina (TMB), um substrato para peroxidase de rábano silvestre, foi adicionado às cavidades para visualizar o sinal de ligação, cuja absorvância foi medida em 450 nM e corrigida em 540 nM. Um clone do dominio de ligação a NKG2D, um controle de isotipo ou um controle positivo (selecionado a partir de SEQ ID NOs: 45-48 ou clones de NKG2D anti-camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis na eBioscience) foi adicionado a cada cavidade.

[00164] O controle do isotipo mostrou ligação minima às proteínas NKG2D-Fc recombinantes, enquanto o controle positivo se ligou mais fortemente aos antigenos recombinantes. Os dominios de ligação a NKG2D produzidos por todos os clones demonstraram ligação através das proteínas NKG2D-Fc recombinantes de humanos, camundongos e cinomolgos, embora com afinidades variadas de clone para clone. Geralmente, cada clone anti-NKG2D ligado ao NKG2D-Fc recombinante humano (Figura 3) e ao cinomolgos (Figura 4) com afinidade semelhante, mas com menor afinidade ao camundongo (Figura 5) NKG2D-Fc recombinante.

Os domínios de ligação a NKG2D se ligam a células que expressam NKG2D [00165] As linhas celulares de linfoma de camundongos EL4 foram projetadas para expressar NKG2D humanos ou camundongos - receptores de antigenos quiméricos do domínio de sinalização zeta CD3. Um clone de ligação a NKG2D, um controle de isotipo ou um controle positivo foi usado a uma

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68/77 concentração de 100 nM para manchar NKG2D extracelular expressa nas células EL4. A ligação do anticorpo foi detectada utilizando anticorpos secundários IgG anti-humano conjugados com fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo e a dobra sobre fundo (FOB) foi calculada usando a intensidade média de fluorescência (MFI) das células que expressam NKG2D em comparação com as células EL4 originais.

[00166] Dominios de ligação a NKG2D produzidos por todos os clones ligados a células EL4 que expressam NKG2D humana e de camundongo. Anticorpos de controle positivo (selecionados de ID. DE SEQ. N° : 45-48, ou clones NKG2D anti-camundongo MI-6 e CX-5 disponiveis na eBioscience) deram o melhor sinal de ligação FOB. A afinidade de ligação a NKG2D para cada clone foi semelhante entre células que expressam NKG2D humano (Figura 6) e NKG2D camundongo (Figura 7).

Exemplo 2 - Domínios de ligação a NKG2D bloqueiam a ligação natural de ligantes a NKG2D

Competição com ULBP-6 [00167] As proteínas NKG2D-Fc humanas recombinantes foram adsorvidas nas cavidades de uma microplaca e as cavidades foram bloqueadas com albumina de soro bovino para reduzir a ligação não específica. Uma concentração de saturação de ULBP-6-His-biotina foi adicionada às cavidades, seguida pela adição dos clones do domínio de ligação a NKG2D. Após uma incubação de 2 horas, as cavidades foram lavadas e a ULBP-6-His-biotina que permaneceu ligada às cavidades revestidas com NKG2D-Fc foi detectada por estreptavidina conjugada com peroxidase de

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69/77 rábano silvestre e substrato de TMB. A absorvância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Após subtrair o histórico, a ligação especifica dos dominios de ligação a NKG2D às proteínas NKG2D-FC foi calculada a partir da porcentagem de ULBP-6-His-biotina que foi impedida de se ligar às proteínas NKG2D-Fc nas cavidades. O anticorpo de controle positivo (selecionado de SEQ ID NOs : 45-48) e vários domínios de ligação a NKG2D bloquearam a ligação de ULBP-6 a NKG2D, enquanto o controle de isotipo mostrou pouca competição com ULBP-6 (Figura 8).

[00168] A sequência ULBP-6 é representada pela ID. DE SEQ. N°: 61 MAAAAIPALLLCLPLLFLLFGWSRARRDDPHSLCYDITVIPKFRPGPRWCAVQGQVDEK TFLHYDCGNKTVTPVSPLGKKLNVTMAWKAQNPVLREWDILTEQLLDIQLENYTPKEP LTLQARMSCEQKAEGHSSGSWQFSIDGQTFLLFDSEKRMWTTVHPGARKMKEKWENDKD VAMSFHYISMGDCIGWLEDFLMGMDSTLEPSAGAPLAMSSGTTQLRATATTLILCCLLI ILPCFILPGI

Competição com MICA [00169] As proteínas MICA-Fc humanas recombinantes foram adsorvidas nas cavidades de uma microplaca e as cavidades foram bloqueadas com albumina de soro bovino para reduzir a ligação não específica. Adicionou-se NKG2D-Fcbiotina às cavidades seguidas pelos domínios de ligação a NKG2D. Após incubação e lavagem, a NKG2D-Fc-biotina que permaneceu ligada às cavidades revestidas com MICA-Fc foi detectada usando estreptavidina-HRP e substrato de TMB. A absorvância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Após subtrair os antecedentes, a ligação específica dos domínios de ligação a NKG2D às proteínas NKG2D-Fc foi calculada a partir da porcentagem de NKG2D-Fc-biotina que foi impedida

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70/77 de se ligar às cavidades revestidas com MICA-Fc. O anticorpo de controle positivo (selecionado de SEQ ID NOs: 45-48) e vários domínios de ligação a NKG2D bloquearam a ligação de MICA a NKG2D, enquanto o controle de isotipo mostrou pouca competição com MICA (Figura 9).

Competição com o delta Rae-1 [00170] O camundongo recombinante Rae-ldelta-Fc (adquirido da R&D Systems) foi adsorvido nas cavidades de uma microplaca e as cavidades foram bloqueadas com albumina de soro bovino para reduzir a ligação não específica. Adicionou-se NKG2D-Fc-biotina de camundongo às cavidades seguidas pelos domínios de ligação a NKG2D. Após incubação e lavagem, a NKG2D-Fc-biotina que permaneceu ligada às cavidades revestidas com Rae-ldelta-Fc foi detectada usando estreptavidina-HRP e substrato de TMB. A absorvância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Após subtrair o fundo, a ligação específica dos domínios de ligação a NKG2D às proteínas NKG2D-Fc foi calculada a partir da porcentagem de NKG2D-Fc-biotina que foi impedida de se ligar às cavidades revestidas com Rae-ldelta-Fc. O controle positivo (selecionado a partir dos SEQ ID NOs: 45-48 ou dos clones NKG2D anti-camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis na eBioscience) e vários clones de domínio de ligação a NKG2D bloquearam a ligação Rae-ldelta ao NKG2D de camundongo, enquanto o isotipo o anticorpo de controle mostrou pouca competição com Rae-ldelta (Figura 10) .

Exemplo 3 - Clones de domínio de ligação a NKG2D ativam NKG2D [00171] As sequências de ácido nucleico de NKG2D humano e de camundongo foram fundidas com sequências de ácido

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71/77 nucleico que codificam um domínio de sinalização zeta CD3 para obter construções de receptor de antígeno quimérico (CAR) . As construções NKG2D-CAR foram então clonadas em um vetor de retrovirus usando montagem de Gibson e transfectada em células expi293 para produção de retrovirus. As células EL4 foram infectadas com vírus contendo NKG2D-CAR juntamente com 8 pg/mL de polibeno. 24 horas após a infecção, os níveis de expressão de NKG2D-CAR nas células EL4 foram analisados por citometria de fluxo e foram selecionados clones que expressam altos níveis de NKG2D-CAR na superfície celular.

[00172] Para determinar se os domínios de ligação a NKG2D ativam NKG2D, eles foram adsorvidos nas cavidades de uma microplaca e as células NKG2D-CAR EL4 foram cultivadas nas cavidades revestidas com fragmento de anticorpo por 4 horas na presença de brefeldina-A e monensina. A produção intracelular de TNF-alfa, um indicador para a ativação de NKG2D, foi testada por citometria de fluxo. A porcentagem de células positivas para TNF-alfa foi normalizada para as células tratadas com o controle positivo. Todos os domínios de ligação a NKG2D ativaram NKG2D humano (Figura 11) e NKG2D de camundongo (Figura 12).

Exemplo 4 - Domínios de ligação a NKG2D ativam células NK

Células NK humanas primárias [00173] As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de revestimentos buffy de sangue periférico humano usando centrifugação em gradiente de densidade. As células NK (CD3 CD56¹) foram isoladas usando seleção negativa com esferas magnéticas de PBMCs, e a pureza das células NK isoladas era tipicamente > 95%. As

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72/77 células NK isoladas foram então cultivadas em meio contendo 100 ng/niL de IL-2 por 24-48 horas antes de serem transferidas para as cavidades de uma microplaca, na qual os domínios de ligação a NKG2D foram adsorvidos e cultivados em meio contendo conjugado de fluoróforo anticorpo anti-CD107a, brefeldina-A e monensina. Seguindo a cultura, as células NK foram testadas por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados com fluoróforo contra CD3, CD56 e IFN-gama. A coloração de CD107a e IFN-gama foi analisada em células CD3 CD56¹ para avaliar a ativação das células NK. O aumento nas células duplamente positivas para CD107a/IFN-gama é indicativo de uma melhor ativação das células NK através do envolvimento de dois receptores ativadores em vez de um receptor. Os domínios de ligação a NKG2D e o controle positivo (selecionados de SEQ ID NOs: 45-48) mostraram uma porcentagem maior de células NK se tornando CD107a⁺ e IFN-gama⁺ do que o controle de isotipo (Figura 13 e Figura 14 representam dados de duas experiências independentes, cada uma usando PBMC de um doador diferente para a preparação de células NK).

Células NK primárias do camundongo [00174] Os baços foram obtidos de camundongos C57B1/6 e esmagados através de um filtro de células de 70 pm para obter suspensão de célula única. As células foram sedimentadas e ressuspensas em tampão de lise ACK (adquirido da Thermo Fisher Scientific # A1049201; 155 mM de cloreto de amônio, 10 mM de bicarbonato de potássio, EDTA 0,01 mM) para remover os glóbulos vermelhos. As células restantes foram cultivadas com 100 ng/mL de hIL-2 por 72 horas antes de serem colhidas e preparadas para o

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73/77 isolamento de células NK. As células NK (CD3 NK1.1¹) foram, então, isoladas das células do baço usando uma técnica de depleção negativa com esferas magnéticas com pureza tipicamente > 90%. As células NK purificadas foram cultivadas em meios contendo 100 ng/mL mIL-15 por 48 horas antes de serem transferidos para as cavidades de uma microplaca na qual os dominios de ligação a NKG2D foram adsorvidos e cultivados nos meios contendo anticorpo antiCD107a conjugado com fluoróforo, brefeldina-A e monensina. Seguindo a cultura em cavidades revestidas do dominio de ligação, as células NK foram analisadas por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados com fluoróforo contra CD3, NK1.1 e IFN-gama. A coloração de CD107a e IFN-gama foi analisada em células CD3 NK1.1¹ para avaliar a ativação de células NK. O aumento das células duplamente positivas para CD107a/IFN-gama é indicativo de uma melhor ativação das células NK através do envolvimento de dois receptores ativadores em vez de um receptor. Os dominios de ligação a NKG2D e o controle positivo (selecionados dos clones NKG2D anti-camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis na eBioscience) mostraram uma porcentagem maior de células NK tornando-se CD107a⁺ e IFN-gama⁺ do que o controle de isotipo (Figura 15 e Figura 16 representam dados de duas experiências independentes, cada uma usando um camundongo diferente para a preparação de células NK).

Exemplo 5 - Domínios de ligação a NKG2D permitem citotoxicidade de células tumorais alvo [00175] Os ensaios de ativação de células NK primárias em humanos e camundongos demonstram marcadores de citotoxicidade aumentados em células NK após incubação com

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74/77 domínios de ligação a NKG2D. Para abordar se isso se traduz em aumento da lise de células tumorais, foi utilizado um ensaio baseado em células onde cada domínio de ligação a NKG2D foi desenvolvido em um anticorpo monoespecífico. A região Fc foi usada como um braço de direcionamento, enquanto a região Fab (domínio de ligação a NKG2D) atuou como outro braço de direcionamento para ativar as células NK. As células THP-1, que são de origem humana e expressam altos níveis de receptores Fc, foram usadas como alvo do tumor e foi usado um Kit de Citotoxicidade Perkin Elmer DELFIA. As células THP-1 foram marcadas com reagente BATDA e ressuspensas em 10⁵/mL em meio de cultura. As células THP-1 marcadas foram, então, combinadas com anticorpos NKG2D e células NK de camundongo isoladas em cavidades de uma placa de microtitulação a 37°C por 3 horas. Após a incubação, 20 μΐ do sobrenadante da cultura foram removidos, misturados com 200 μΐ de solução de európio e incubados com agitação por 15 minutos no escuro. A fluorescência foi medida ao longo do tempo por um leitor de placas PheraStar equipado com um módulo de fluorescência resolvido no tempo (Excitação 337 nm, Emissão 620 nm) e a lise específica foi calculada de acordo com as instruções do kit.

[00176] O controle positivo, ULBP-6 - um ligante natural para NKG2D mostrou aumento da lise específica das células alvo THP-1 pelas células NK de camundongo. Os anticorpos NKG2D também aumentaram a lise específica das células alvo THP-1, enquanto o anticorpo de controle do isotipo mostrou lise específica reduzida. A linha pontilhada indica lise específica de células THP-1 por

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75/77 células NK de camundongo sem adição de anticorpo (Figura 17) .

Exemplo 6 - Anticorpos NKG2D mostram alta termoestabilidade [00177] As temperaturas de fusão dos domínios de ligação a NKG2D foram testadas usando fluorimetria de varredura diferencial. As temperaturas de fusão aparentes extrapoladas são altas em relação aos anticorpos IgGl típicos (Figura 18) .

Exemplo 7 - Ativação sinérgica de células NK humanas por reticulação de NKG2D e CD16

Ensaio de ativação de células NK humanas primárias [00178] As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas a partir de revestimentos periféricos de sangue humano, utilizando centrifugação em gradiente de densidade. As células NK foram purificadas a partir de PBMCs usando esferas magnéticas negativas (StemCell # 17955) . As células NK eram > 90% CD3 CD56¹ conforme determinado por citometria de fluxo. As células foram, então, expandidas 48 horas em meios contendo 100 ng/mL de hIL-2 (Peprotech # 200-02) antes do uso em ensaios de ativação. Anticorpos foram revestidos em uma placa de fundo plano de 96 cavidades a uma concentração de 2 pg/ml (anti-CD 16, Biolegend # 302013) e 5 pg/mL (anti-NKG2D, P&D #MAB 139) em PBS estéril de 100 pi durante a noite a 4°C, seguido de lavagem completa das cavidades para remover o excesso de anticorpos. Para a avaliação da degranulação, as células NK ativadas por IL-2 foram ressuspensas em 5xl0⁵ células/ml em meio de cultura suplementado com 100 ng/mL de hIL2 e 1 pg/mL de anti-CD107a mAb conjugado com APC (Biolegend # 328619). As lxlO⁵ de células/cavidade em

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76/77 placas revestidas com anticorpos. Os inibidores de transporte de proteínas Brefeldin A (BFA, Biolegend # 420601) e monensina (Biolegend # 420701) foram adicionados a uma diluição final de 1:1000 e 1:270, respectivamente. As células plaqueadas foram incubadas por 4 horas a 37 °C em 5% de CO2· Para coloração intracelular de IFN-γ, as células NK foram marcadas com mAb anti-CD3 (Biolegend # 300452) e anti-CD56 (Biolegend # 318328) e subsequentemente fixadas e permeabilizadas e marcadas com mAb anti-IFN-γ (Biolegend # 506507). As células NK foram analisadas quanto à expressão de CD 107a e IFN-γ por citometria de fluxo após bloqueio em células vivas CD56OD3 .

[00179] Para investigar a potência relativa da combinação de receptores, a reticulação de NKG2D ou CD16 e a co-reticulação de ambos os receptores por estimulação ligada à placa foi realizada. Como mostrado na Figura 19 (Figuras 19A-19C), a estimulação combinada de CD16 e NKG2D resultou em níveis altamente elevados de CD107a (degranulação) (Figura 19A) e/ou produção de IFN-γ (Figura 19B) . Linhas pontilhadas representam um efeito aditivo de estímulos individuais de cada receptor.

[00180] Os níveis de CD 107a e a produção intracelular de IFN-γ de células NK ativadas por IL-2 foram analisados após 4 horas de estimulação ligada à placa com anti-CD 16, anti-NKG2D ou uma combinação de ambos os anticorpos monoclonais. Os gráficos indicam a média (n = 2) ± SD. A Figura 19A demonstra níveis de CD107a; a Figura 19B demonstra níveis de ΙΕΝγ; a Figura 19C demonstra níveis de CD107a e ΙΕΝγ. Dados mostrados nas Figuras 19A-19C são representativos de cinco experiências independentes usando

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77/77 cinco doadores saudáveis diferentes.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA [00181] Toda a divulgação de cada um dos documentos de patentes e artigos científicos aqui referidos é incorporada por referência para todos os propósitos.

EQUIVALENTES [00182] A invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem se afastar do escopo ou das características essenciais do mesmo. As modalidades anteriores devem, portanto, ser consideradas em todos os aspectos ilustrativas, em vez de limitar a invenção aqui descrita. O escopo da invenção é, portanto, indicado pelas reivindicações anexas, e não pela descrição anterior, e todas as alterações que se enquadram no significado e na faixa de equivalência das reivindicações devem ser adotadas neste.

Claims (34)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Proteína CARACTERIZADA pelo fato de que compreende:

   (a) um primeiro local de ligação ao antigeno que se liga a NKG2D;

   (b) um segundo local de ligação ao antigeno que se liga a GD2; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção dele suficiente para ligar a CD16 ou um terceiro local de ligação ao antigeno que se liga a CD 16.
2. 2. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro local de ligação ao antigeno se liga a NKG2D em humanos, primatas não humanos e roedores.
3. 3. Proteína, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro local de ligação ao antigeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve.
4. 4. Proteína, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve estão presentes no mesmo polipeptideo.
5. 5. Proteína, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo local de ligação ao antigeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve.
6. 6. Proteína, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve do segundo local de ligação ao antigeno estão presentes no mesmo polipeptideo.

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7. 7. Proteína, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio variável da cadeia leve do primeiro local de ligação ao antígeno possui uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve do segundo local de ligação ao antígeno.
8. 8. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro local de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada pelo menos 90% idêntico a ID. DE SEQ. N°: 1.
9. 9. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro local de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada pelo menos 90% idêntico a ID. DE SEQ. N°: 41 e um domínio variável da cadeia leve pelo menos 90% idêntico a ID. DE SEQ. N°: 42.
10. 10. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que lo primeiro local de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada pelo menos 90% idêntico a ID. DE SEQ. N°: 43 e um domínio variável da cadeia leve pelo menos 90% idêntico a ID. DE SEQ. N°: 44.
11. 11. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro local de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada pelo menos 90% idêntico a ID. DE SEQ. N°: 45 e um domínio variável da cadeia leve pelo menos 90% idêntico a ID. DE SEQ. N°: 46.
12. 12. Proteína, de acordo com qualquer uma das

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    3/8 reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro local de ligação ao antigeno compreende um domínio variável da cadeia pesada pelo menos 90% idêntico a ID. DE SEQ. N°: 47 e um domínio variável da cadeia leve pelo menos 90% idêntico a ID. DE SEQ. N°: 48.
13. 13. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro local de ligação ao antigeno compreende um domínio variável da cadeia pesada pelo menos 90% idêntico a ID. DE SEQ. N°: 89 e um domínio variável da cadeia leve pelo menos 90% idêntico a ID. DE SEQ. N°: 90.
14. 14. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro local de ligação ao antigeno compreende um domínio variável da cadeia pesada pelo menos 90% idêntico a ID. DE SEQ. N°: 91 e um domínio variável da cadeia leve pelo menos 90% idêntico a ID. DE SEQ. N°: 92.
15. 15. Proteína, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro local de ligação ao antigeno é um anticorpo de domínio único.
16. 16. Proteína, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADA pelo fato de que o anticorpo de domínio único é um fragmento VhH ou um fragmento Vnar.
17. 17. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 ou 15 a 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo local de ligação ao antigeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve.
18. 18. Proteína, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio variável da cadeia

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    4/8 pesada e o domínio variável da cadeia leve do segundo local de ligação ao antígeno estão presentes no mesmo polipeptídeo.
19. 19. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, CARACTERIZADA pelo fato domínio variável da cadeia pesada do segundo de que o local de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ID. DE SEQ. N° : 49 e o domínio variável da cadeia leve do segundo local de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ID. DE SEQ. N°: 53.
20. 20. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada do segundo local de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos incluindo:

    uma sequência CDR1 da cadeia pesada idêntica a sequência de aminoácidos da ID. DE SEQ. N°: 50;

    uma sequência de CDR2 de cadeia pesada idêntica a sequência de aminoácidos de ID. DE SEQ. N°: 51; e uma sequência CDR3 de cadeia pesada idêntica a sequência de aminoácidos de ID. DE SEQ. N°: 52.
21. 21. Proteína, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio variável da cadeia leve do segundo local de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos incluindo:

    uma sequência CDR1 da cadeia leve idêntica a sequência de aminoácidos da ID. DE SEQ. N°: 54;

    uma sequência CDR2 da cadeia leve idêntica a sequência de aminoácidos de ID. DE SEQ. N°: 55; e

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    5/8 uma sequência CDR3 da cadeia leve idêntica a sequência de aminoácidos da ID. DE SEQ. N°: 56.
22. 22. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada do segundo local de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ID. DE SEQ. N° : 57 e o domínio

    variável da cadeia leve do segundo local de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ID. DE SEQ >. N° : 58. 23 . Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18 ou 22, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada do segundo local de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos incluindo: uma sequência CDR1 da cadeia pesada idêntica a sequência de aminoácidos da ID. DE SEQ. N°: 77; uma sequência CDR2 de cadeia pesada idêntica a sequência de aminoácidos da ID. DE SEQ. N°: 78; e uma sequência CDR3 de cadeia pesada idêntica a sequência de aminoácidos de ID. DE SEQ. N°: 79. 2 4. Proteína, de < acordo com a reivindicação 23,

    CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio variável da cadeia leve do segundo local de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos incluindo:

    uma sequência CDR1 da cadeia leve idêntica a sequência de aminoácidos da ID. DE SEQ. N°: 80;

    uma sequência CDR2 de cadeia leve idêntica a sequência de aminoácidos da ID. DE SEQ. N°: 81; e uma sequência CDR3 da cadeia leve idêntica a sequência

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    6/8 de aminoácidos da ID. DE SEQ. N°: 82.
23. 25. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, CARACTERIZADA pelo fato de que ο dominio variável da cadeia pesada do segundo local de ligação ao antigeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ID. DE SEQ. N° : 59 e o dominio

    variável da cadeia leve do segundo local de ligação ao antigeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ID. DE SEQ >. N° : 60. 26. Proteina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18 ou 25, CARACTERIZADA pelo fato de que o dominio variável da cadeia pesada do segundo local de ligação ao antigeno compreende uma sequência de aminoácidos incluindo: uma sequência CDR1 da cadeia pesada idêntica a sequência de aminoácidos da ID. DE SEQ. N°: 83; uma sequência CDR2 de cadeia pesada idêntica a sequência de aminoácidos de ID. DE SEQ. N°: 84; e uma sequência CDR3 de cadeia pesada idêntica a sequência de aminoácidos de ID. DE SEQ. N°: 85. 2 7. Proteina, de < acordo com a reivindicação 26,

    CARACTERIZADA pelo fato de que o dominio variável da cadeia leve do segundo local de ligação ao antigeno compreende uma sequência de aminoácidos incluindo:

    uma sequência CDR1 da cadeia leve idêntica a sequência de aminoácidos da ID. DE SEQ. N°: 8 6; de uma sequência aminoácidos de CDR2 de cadeia ID. DE SEQ. N°: leve 87; idêntica e a sequência de uma sequência aminoácidos da CDR3 da cadeia ID. DE SEQ. N°: leve 88 . idêntica a sequência

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24. 28. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 8 a 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo local de ligação ao antígeno é um anticorpo de domínio único.
25. 29. Proteína, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo local de ligação ao antígeno é um fragmento VhH ou um fragmento Vnar.
26. 30. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína compreende uma porção de um domínio Fc do anticorpo suficiente para ligar o CD16, em que o domínio Fc do anticorpo compreende dobradiça e domínios CH2.
27. 31. Proteína, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio Fc do anticorpo compreende dobradiça e domínios CH2 de um anticorpo IgGl humano.
28. 32. Proteína, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio Fc compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgGl humano.
29. 33. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 0 a 32, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio Fc compreende a sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica ao domínio Fc da IgGl humana e difere em uma ou mais posições selecionadas no grupo que consiste em

    Q347, Y349, T350, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364 T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405 Y407, K409, T411, K439 .
30. 34. Formulação CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma proteína conforme definida em qualquer uma

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    8/8 das reivindicações anteriores e um veículo farmaceuticamente aceitável.
31. 35. Célula CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um ou mais ácidos nucleicos expressando uma proteína conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 33.
32. 36. Método para melhorar diretamente e/ou indiretamente a morte de células tumorais, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende a exposição de um tumor e células assassinas naturais a uma proteína conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 33.
33. 37. Método de tratamento de câncer, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende administrar uma proteína conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 33 ou uma formulação conforme definida na reivindicação 34 a um paciente.
34. 38. Método, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em neuroblastoma, melanoma, retinoblastoma, câncer de pulmão de pequenas células, tumores cerebrais, osteossarcoma, rabdomiossarcoma, sarcoma de Ewing em crianças e adolescentes, bem como lipossarcoma, fibrossarcoma, leiomiossarcoma e outros sarcomas de tecidos moles em adultos.