TW201536810A - 結合尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物之抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種鑑別尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物(uPA)抗體之方法。本發明亦關於能夠結合uPA且能夠降低或抑制uPA活性之抗體。另外，本發明係關於該等抗體之用途，諸如治療及醫藥用途。

Description

結合尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物之抗體
本發明係關於一種鑑別尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物(urokinase plasminogen activator；uPA)抗體之方法。本發明亦關於能夠結合uPA且能夠抑制或阻斷uPA活性之抗體。此外，本發明係關於該等抗體之用途，諸如治療及醫藥用途。
尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物(uPA)為一種胞外絲胺酸蛋白酶。uPA由如下3個域組成：1)介導uPA與其受體uPAR之結合的生長因子域(growth factor domain；GFD)；2)uPA之描述為與整合素相互作用之丹麥餅域；及3)介導uPA之蛋白分解功能之催化區。uPA之主要蛋白分解功能為將非活性酶原纖維蛋白溶酶原(plasminogen；Plg)轉化為活性絲胺酸蛋白酶纖維蛋白溶酶。uPA以單鏈酶原(sc-uPA)形式產生，其可在Lys158-Ile159(對應於人類sc-uPA之編號)肽鍵處發生內蛋白分解裂解。所得兩條鏈形式之uPA(tc-uPA)由單一二硫橋鍵保持在一起。與tc-uPA相比，sc-uPA之蛋白分解活性最小，但sc-uPA具有一些固有蛋白分解活性。uPA之催化域以兩種結構構形(活性構形及非活性構形)之平衡狀態存在。在sc-uPA中，非活性構形之催化域為主。Lys158-Ile159肽鍵之水解將此等結構構形之間的動態平衡轉至活性形式為主(Jiang等人，Biochem.J.449：161-166,2013)。
在健康有機體中，泌尿及胃腸道外uPA之存在一般限於循環粒細胞及經歷重塑之組織中的某些細胞類型。在疾病期間，亦在發炎病症及癌症病變之位點處發現uPA。動物研究展現uPA在癌症中及在發炎病症(包括關節炎病)中之功能性作用。因此，在治療癌症及發炎疾病(諸如類風濕性關節炎及牛皮癬性關節炎)時需要拮抗uPA。
專利文件US8062637及WO03033009提供uPA在關節炎病中之功能性作用的實驗證據。該等文件進一步描述一種改善個體之發炎疾病之影響的方法，其包含投予該個體拮抗劑(包括特異性結合uPA之抗體)。文件US8062637及WO03033009描述結合uPA之抗體的用途，但該等文件均未描述或提供結合uPA之任何抗體的資料。
專利文獻WO2006050177描述一種鑑別特異於對應於uPA之丹麥餅域的86個胺基酸長之抗原決定基的抗uPA抗體的方法及此等抗體用於治療發炎疾病之潛在用途。WO2006050177專利文獻未描述或提供結合uPA之任何抗體的資料。此外，結合於丹麥餅域之抗體經預測對uPA之蛋白分解功能無影響，因為uPA之蛋白分解特性主要與催化域有關。
專利文獻WO2005048822描述兩種抗uPA抗體ATN-291及ATN-292，其特異性結合於uPA之生長因子域(GFD)(ATN-292)及丹麥餅域(ATN-291)。WO2005048822專利文獻進一步描述此等抗體用於治療癌症或其他疾病之潛在用途。結合於GFD或丹麥餅域之抗體經預測對uPA之蛋白分解功能無影響，因為uPA之蛋白分解特性主要與催化域有關。
專利文獻描述雙特異性抗體，其中兩種特異性中之一者由三種抗uPA抗體UK1-3、UK1-87及UK1-6中之任一者賦予。另一特異性針對血小板表面蛋白，且該專利進一步描述此等雙特異性抗體傳遞活性topically生物物質(在此情況下為uPA)以治療血栓或其他心血管疾病之潛在用途。此三種抗體均不抑制uPA之蛋白分解活性，但可經設計以在血小板沈積位點傳遞或 濃縮uPA。
如上所述，已知結合uPA之抗體；且已設想其在治療發炎疾病中之用途。然而，迄今為止，尚無抗uPA抗體進入臨床試驗。由此，仍需要治療性抗uPA抗體例如以用於患有發炎疾病之患者或患有癌症之患者。
本文揭示具有新穎特徵之抗uPA抗體。此等抗體適用於開發藥劑。該等抗體可對患有癌症或發炎疾病之個體的生活品質具有實質影響。
本發明係關於能夠結合於人類uPA之抗體或其抗原結合片段，其特徵在於其抑制uPA之蛋白分解活性形式的蛋白分解活性且抑制單鏈uPA(sc-uPA)自uPA之蛋白分解非活性形式活化為uPA之蛋白分解活性形式。首次鑑別特異於人類uPA之具有此雙官能性之抑制性單株抗體。此等抗體抑制由(活性)纖維蛋白溶酶活化uPA之酶原形式sc-uPA，且同時該等抗體抑制雙鏈uPA(tc-uPA)對(非活性)酶原纖維蛋白溶酶原之蛋白分解活性。由此，該等抗體抑制sc-uPA與纖維蛋白溶酶原之間的可逆酶原活化環的兩個蛋白分解反應，從而對總蛋白分解級聯反應提供更強抑制。由一組小鼠抗體mU1及mU3說明雙作用性抗體相較於僅抑制tc-uPA之蛋白分解活性的抗體的優點。在基於細胞之分析中及在活體內小鼠模型中，相較於mU3，雙作用性小鼠抗體mU1結合小鼠uPA及抑制小鼠tc-uPA之蛋白分解功能的能力類似，但其功能上抑制小鼠uPA活性之能力較優(Lund等人，J.Biol.Chem.283：32506-32515,2008)。此等抗體特異於小鼠uPA，且因此不能預期結合人類uPA，且因此不適用於本申請案之範疇。其不具有與本發明中所述之抗uPA抗體相同之新穎特徵或藥物開發潛力中之全部。
已公開數種先前技術抗uPA抗體在人類uPA或小鼠uPA上之結合位點(Jiang等人，2013,Biochem J 449,161-166；Kromann-Hansen等人，2013, Biochemistry 52,7114-7126)。描述結合於人類uPA上之新穎抗原決定基的雙作用性抗uPA抗體，且展現此抗體可在包括uPA之所有三大域中之胺基酸的人類uPA多肽中誘導協同構形變化。除新穎抗原決定基以外，此跨域構形變化亦前所未有。
在本發明之一個態樣中，抗體能夠結合於且抑制受體結合uPA與非受體結合uPA。此增加了一個優點，因為uPA之某些蛋白分解功能展現出取決於與uPA受體uPAR之結合，而uPA功能其他蛋白分解功能展現出獨立於uPAR。專利文獻WO03033009A中所揭示之資料說明uPA在小鼠關節炎模型中之作用，其很可能取決於uPAR且亦取決於uPA之蛋白分解活性。因此，能夠抑制受體結合uPA與非受體結合uPA之功能的抗體具有優點，因為可由該等抗體抑制uPA之所有形式，且對於如本文所述之任何既定人類疾病，未知uPA之疾病相關功能取決於與uPAR之結合的程度。鑑別抑制sc-uPA活化且同時能夠以高親和力結合於受體結合uPA之抗體很重要。此此可由抗體mAb-PUK說明，如該文獻中所揭示，該抗體能夠抑制sc-uPA活化，但其結合與uPAR結合之sc-uPA的能力小於非受體結合sc-uPA的1/10(Botkjaer等人，Biochem J.438：39-51,2011)。如實施例14中所展現，MAb-PUK對tc-uPA之活性無影響且不具有與本發明中所述之抗uPA抗體相同之新穎特徵。
在本發明之另一態樣中，抗體能夠結合於且抑制發炎性細胞中內源表現之人類uPA。此現象在以下實施例部分之實施例9中說明，其中本發明抗體抑制原發性人類巨噬細胞中內源表現之uPA。此展現抗體抑制疾病相關細胞類型中所存在之天然形式uPA之能力。尚未知曉已知uPA抗體是否能夠抑制原發性人類巨噬細胞中之uPA(包括內源性uPA)的蛋白分解活性。
在本發明之另一態樣中，抗體能夠結合於且抑制人類uPA且亦能夠結合於且抑制非人類靈長類uPA。此為本發明抗體增加了一個獨特優點，因 為尚未知曉已知uPA抗體是否結合於或抑制來自非人類靈長類(諸如食蟹獼猴(cynomolgus monkey))之uPA，此意謂已知抗體不能在臨床前研究中常用於藥物開發之此等動物中測試。
本發明之抗uPA抗體可用作用於治療患有一或多種自體免疫疾病及/或慢性發炎疾病之個體及/或患有癌症之個體的藥物。因此，本發明亦關於一種治療患有一或多種自體免疫疾病及/或發炎疾病之個體及/或患有癌症之個體的方法。
本發明亦關於一種鑑別抗uPA抗體之方法。此免疫及篩選方法經設計以使得可鑑別本發明之雙作用性抗uPA抗體。鑑別雙作用性抗uPA抗體之方法包含以下步驟：(a)產生抗uPA抗體；(b)自步驟(a)中所產生之抗體鑑別抑制tc-uPA之蛋白分解活性的抗體；(c)自步驟(a)中所產生之抗體鑑別抑制sc-uPA自蛋白分解非活性形式活化為蛋白分解活性形式的抗體；及(d)選擇在步驟(b)與(c)中均具抑制性之抗體。
圖1：展示0266-0000-0010及0266-0000-0015分別與原發性人類巨噬細胞之劑量依賴性結合的流動細胞學分析。
圖2：表示0266-0000-0010及hz0266-0000-0010抗體之VH、VL及CDR胺基酸序列(如實施例13中更詳細描述)。
圖3：經還原(R)及非還原(NR)mAb 0266-0000-0043之SDS-PAGE凝膠(參見實施例16)。
圖4：mAb 0266-0000-0043之SE-HPLC分析(參見實施例16)。
圖5：偶合酶原活化分析之原理(參見實施例16)。
圖6：偶合酶原活化分析中mAb 0266-0000-0010對人類uPA之抑制(參見實施例16)。
圖7：偶合酶原活化分析中mAb 0266-0000-0043對人類uPA之抑制(參見實施例16)。
圖8：偶合酶原活化分析中mAb 0266-0000-0010對獼猴uPA之抑制(參見實施例16)。
圖9：偶合酶原活化分析中mAb 0266-0000-0043對獼猴uPA之抑制(參見實施例16)。
序列之簡要描述
SEQ ID NO：1表示重組人類sc-uPA之胺基酸序列。
SEQ ID NO：2表示重組人類sc-uPA之DNA序列。
SEQ ID NO：3表示野生型獼猴sc-uPA之胺基酸序列。
SEQ ID NO：4表示野生型獼猴sc-uPA之DNA序列。
SEQ ID NO：5表示0266-0000-0015之VH序列。
SEQ ID NO：6表示0266-0000-0015之VL序列。
SEQ ID NO：7表示0266-0000-0010之VH序列。
SEQ ID NO：8表示0266-0000-0010之VL序列。
SEQ ID NO：9表示0266-0000-0010之CDR-H1序列。
SEQ ID NO：7表示0266-0000-0010之CDR-H2序列。
SEQ ID NO：11表示0266-0000-0010之CDR-H3序列。
SEQ ID NO：12表示0266-0000-0010之CDR-L1序列。
SEQ ID NO：13表示0266-0000-0010之CDR-L2序列。
SEQ ID NO：14表示0266-0000-0010之CDR-L3序列。
SEQ ID NO：15表示VH3_21/JH4序列。
SEQ ID NO：16表示V6D_41/JK4序列。
SEQ ID NO：17表示hz0266-0000-0010之VH序列。
SEQ ID NO：18表示0266-0000-0010之VL序列。
SEQ ID NO：19表示0266-0000-0010之重鏈序列。
SEQ ID NO：20表示0266-0000-0010之輕鏈序列。
SEQ ID NO：21表示0266-0000-0043之重鏈序列。
SEQ ID NO：22表示0266-0000-0043之輕鏈序列。
SEQ ID NO：23表示0266-0000-0010之重鏈DNA序列。
SEQ ID NO：24表示mAb 0266-0000-0010之輕鏈DNA序列。
SEQ ID NO：25表示mAb 0266-0000-0043之重鏈DNA序列。
SEQ ID NO：26表示mAb 0266-0000-0043之輕鏈DNA序列。
在一個態樣中，本發明提供能夠結合於人類uPA之抗體或其抗原結合片段，其特徵在於其抑制tc-uPA之蛋白分解活性且抑制sc-uPA自uPA之蛋白分解非活性形式活化為uPA之蛋白分解活性形式。
尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物(uPA)：
uPA為胞外絲胺酸蛋白酶，其含有411個胺基酸(SEQ ID NO：1)(Andreasen等人，Cell Mol.Life Sci.57：25-40,2000；Ulisse等人，Current Cancer Drug Targets,9：32-71,2009)。uPA由如下3個域組成：1)介導uPA與其細胞表面結合受體uPAR之結合的N端類生長因子域(growth factor-like domain；GFD)；2)uPA之描述為與整合素相互作用之丹麥餅域；及3)uPA之介導其蛋白分解活性之C端催化域。uPA以單鏈酶原(sc-uPA)形式產生，其可在Lys158-Ile159(對應於人類sc-uPA之編號)肽鍵處發生內蛋白分解裂解。所得兩條鏈形式之uPA(tc-uPA)由單一二硫橋鍵保持在一起。與tc-uPA相比，sc-uPA之蛋白分解活性最小，但sc-uPA具有一些固有蛋白分解活性。uPA之催化域以兩種結構構形(活性構形及非活性構形)之平衡狀態存在。在sc-uPA中，非活性構形之催化域為主。Lys158-Ile159肽鍵之水解將此等 結構構形之間的動態平衡轉至活性形式為主(Jiang等人，Biochem.J.449：161-166,2013)。uPA之主要蛋白水解功能為將非活性酶原纖維蛋白溶酶原(Plg)轉化為活性絲胺酸蛋白酶纖維蛋白溶酶。纖維蛋白溶酶原為肝臟分泌之酶原，其在血漿中以約2μM存在，且亦在間質空間中以高濃度存在於胞外。纖維蛋白溶酶又為sc-uPA之最有效活化物，從而在sc-uPA與纖維蛋白溶酶原之間形成所謂可逆酶原活化環。sc-uPA與tc-uPA均可以低於奈莫耳之親和力結合於糖基化磷脂醯肌醇(glycosylphosphatidylinositol；GPI)錨定之細胞表面受體uPAR(CD87)，從而造成uPA活性之空間限制。除暫時及空間控制酶活化以外，uPA及纖維蛋白溶酶之活性進一步由其內源抑制劑纖維蛋白溶酶原活化物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1；PAI-1)及α 2-抗纖維蛋白溶酶(α 2-antiplasmin；α 2-AP)平衡。此等絲胺酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor；serpin)與其同源蛋白酶形成不可逆共價複合物。
定義 uPA：
術語尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物及uPA在本文中可互換使用，且包涵可衍生自任何適合有機體之uPA的任何天然存在、內源產生及/或重組形式。舉例而言，uPA可為單鏈酶原形式(sc-uPA)及雙鏈活性形式(tc-uPA)。術語尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物及uPA另外包涵sc-uPA及tc-uPA之所有結構構形，包括催化域之非活性及活性構形。術語尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物及uPA另外包涵uPA之受體結合與非受體結合形式以及任何亞細胞位置中之uPA，包括在細胞表面上發現之uPA或在胞內發現之uPA。術語尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物及uPA另外包涵uPA之任何前驅物形式及uPA之任何降解形式。術語尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物及uPA另外包涵人類uPA或來自另一物種之uPA，諸如哺乳動物uPA，諸如來自如下物種 之uPA：靈長類(例如黑猩猩(chimpanzee)、食蟹獼猴(cynomolgus monkey)或恆河猴(rhesus monkey))；嚙齒動物(諸如小鼠或大鼠)、兔類動物(諸如兔)或偶蹄型動物(諸如母牛、羊、豬或駱駝)。術語尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物及uPA另外包涵以重組方式產生之uPA。其包括「藉由重組基因技術產生(generated by recombinant gene technology)」之任何uPA，包括(但不限於)在哺乳動物細胞系或細菌或酵母中表現之蛋白質。
術語『重組(recombinant)』並不暗示該蛋白質相對於天然存在形式發生改變，因為以重組方式產生之蛋白質會儘可能接近於該蛋白質之天然存在形式。因此，本申請案中所用之術語『重組』適用於蛋白質之野生型以及突變形式。
單鏈uPA(sc-uPA)：
術語單鏈uPA(sc-uPA)在本文中用於指示人類uPA之411個胺基酸之單鏈酶原形式(或前體形式)，其在(人類sc-uPA之)Lys158-Ile159肽鍵處尚未進行蛋白分解裂解。在文獻中sc-uPA可互換地稱為sc-uPA或pro-uPA。術語sc-uPA另外包涵sc-uPA之所有結構構形，包括催化域之非活性及活性構形。術語sc-uPA另外包涵sc-uPA之受體結合形式與非受體結合形式。術語sc-uPA包涵來自所有物種之sc-uPA，包括人類及其他相關物種。
雙鏈uPA(tc-uPA)：
術語雙鏈uPA(tc-uPA)在本文中用於指示人類uPA之雙鏈形式，其在(人類sc-uPA之)Lys158-Ile159肽鍵處已進行蛋白分解裂解。術語tc-uPA另外包涵tc-uPA之所有結構構形，包括催化域之非活性及活性構形。術語tc-uPA另外包涵sc-uPA之受體結合形式與非受體結合形式。術語tc-uPA亦包涵來自所有物種之tc-uPA，包括人類及其他相關物種。
uPA之非活性形式：
術語『uPA之非活性形式(inactive form of uPA)』或『蛋白分解非活性 uPA(proteolytically inactive uPA)』或『非活性uPA(inactive uPA)』在本文中用於指示蛋白分解非活性或蛋白分解活性顯著降低(亦即蛋白分解活性相對於陰性對照降低50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%)之uPA的所有形式。術語『uPA之非活性形式』或『蛋白分解非活性uPA』或『非活性uPA』另外包涵sc-uPA與tc-uPA，其限制條件為uPA之此等形式處於如下狀態，其中其為蛋白分解非活性或蛋白分解活性顯著降低。術語『uPA之非活性形式』或『蛋白分解非活性uPA』或『非活性uPA』另外包涵uPA之所有結構構形，其限制條件為uPA之此等結構構形為蛋白分解非活性或蛋白分解活性顯著降低。術語『uPA之非活性形式』或『蛋白分解非活性uPA』或『非活性uPA』另外包涵uPA之受體結合與非受體結合形式。術語『uPA之非活性形式』或『蛋白分解非活性uPA』或『非活性uPA』另外包涵來自所有物種之uPA，包括人類及其他相關物種。
uPA之活性形式：
術語『uPA之活性形式(active form of uPA)』或『蛋白分解活性uPA(proteolytically active uPA)』或『活性uPA(active uPA)』在本文中用於指示蛋白分解活性且蛋白分解活性未顯著降低之uPA的所有形式。術語『uPA之活性形式』或『蛋白分解活性uPA』或『活性uPA』另外包涵sc-uPA與tc-uPA，其限制條件為uPA之此等形式處於如下狀態，其中其為蛋白分解活性且蛋白分解活性顯著降低(亦即相對於陰性對照蛋白分解活性降低50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%)。術語『uPA之活性形式』或『蛋白分解活性uPA』或『活性uPA』另外包涵uPA之所有結構構形，其限制條件為uPA之此等結構構形為蛋白分解活性且蛋白分解活性顯著降低。術語『uPA之活性形式』或『蛋白分解活性uPA』或『活性uPA』另外包涵uPA之受體結合與非受體結合形式。術語『uPA之活性形式』或『蛋白分解活性uPA』或『活性uPA』另外包涵來自所有物種之uPA，包括人類及其他相 關物種。
雙作用性抗uPA抗體：
本發明抗uPA抗體之一個重要態樣為其雙操作模式，本文稱作「雙作用性(dual-acting)」抗體。本發明抗體抑制人類tc-uPA之蛋白分解活性與人類sc-uPA自人類uPA之蛋白分解非活性形式活化為人類uPA之蛋白分解活性形式。
sc-uPA之活化：
本發明描述抑制sc-uPA自uPA之蛋白分解非活性形式活化為uPA之蛋白分解活性形式的抗體。活化sc-uPA為文獻中尚未完整描述之多步驟過程。下文不應解釋為活化sc-uPA中所涉及之步驟的窮盡描述：活化sc-uPA中所涉及之步驟之一為sc-uPA與另一蛋白酶之間的蛋白質-蛋白質相互作用，其中sc-uPA為受質。該蛋白酶之一非排他性實例為纖維蛋白溶酶。活化sc-uPA中之另一步驟為位於所謂活化環內之(人類sc-uPA之)Lys158與Ile159之間的單一肽鍵內蛋白分解裂解。活化uPA中之另一步驟為向位於催化域內之稱為活化袋的疏水性袋中插入新形成之N端。活化uPA中之另一步驟為催化域結構自特徵為三維結構中有數個可撓性環區之構形變化為結構上更緊湊之構形。四個區段定義為參與絲胺酸蛋白酶(包括sc-uPA)活化後之顯著構形變化。此四個區段稱為活化環、自分解環、氧陰離子穩定環及S1進入框。
本發明所述之結合uPA之抗體可抑制活化sc-uPA中之一或多個步驟，包括尚未知曉或上文未述之步驟。作為一個實例，本發明所述之抗體可藉由阻斷裂解Lys158-Ile159肽鍵所必需之sc-uPA與蛋白酶之間的蛋白質-蛋白質相互作用而抑制sc-uPA活化。作為另一實例，該抗體可藉由結合於或接近於(例如少於10、5、2或1個胺基酸)Lys158-Ile159肽鍵且從而保護此肽鍵免於裂解而抑制sc-uPA活化。作為另一實例，該抗體可藉由抑制向催 化域之疏水性活化袋中插入新形成之N端而抑制uPA活化。作為另一實例，該抗體可藉由抑制自非活性轉變為活性結構構形中所涉及之構形變化而抑制uPA活化。
本說明書實施例部分之實施例8描述一種藉由使用發色uPA受質量測uPA之催化活性來鑑別抑制此sc-uPA活化之抗體的特定方式。
tc-uPA之活性：
本發明描述抑制tc-uPA活性之抗體。在此上下文中，tc-uPA之活性指tc-uPA針對天然及合成受質之蛋白分解活性。該受質之一非排他性實例為纖維蛋白溶酶原。sc-uPA之活性為文獻中尚未完整描述之多步驟過程。下文不應解釋為tc-uPA之蛋白分解活性中所涉及之步驟的窮盡描述。tc-uPA之蛋白分解活性中所涉及之步驟之一為tc-uPA與可充當tc-uPA之受質的蛋白質之間的蛋白質-蛋白質相互作用。tc-uPA之活性的另一需要為接近tc-uPA之催化位點。tc-uPA之活性的另一需要為催化域之結構上緊湊構形之穩定性。認為絲胺酸蛋白酶活化後經歷顯著構形變化之四個區段對於tc-uPA之活性很重要。此四個區段稱為活化環、自分解環、氧陰離子穩定環及S1進入框。tc-uPA之活性的另一需要為釋放結合於tc-uPA之催化位點的受質。
本發明所述之結合uPA之抗體可抑制tc-uPA之活性的一或多個步驟及/或需要，包括尚未知曉或上文未述之步驟及/或需要。作為一實例，本發明所述之抗體可藉由阻斷tc-uPA與可充當tc-uPA之受質的蛋白質之間的蛋白質-蛋白質相互作用而抑制tc-uPA之活性。作為另一實例，該抗體可藉由阻斷接近tc-uPA之催化位點而抑制tc-uPA之活性。作為另一實例，該抗體可藉由誘導tc-uPA之構形變化而抑制tc-uPA之活性，該構形變化使該蛋白酶與在抗體不存在下之tc-uPA(陰性對照)相比活性降低(亦即相對於陰性對照蛋白分解活性降低50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%)或無活性。作為另一實例，該抗體可藉由抑制結合於tc-uPA之催化位點的受質的 釋放而抑制tc-uPA之活性。
先前公開且認可之量測uPA之蛋白分解活性的功能分析包括如Blouse GE等人，J Biol Chem.2009年2月13日；284(7)：4647-57中所述的基於發色及螢光uPA/纖維蛋白溶酶受質之分析。本說明書實施例部分之實施例5、6、7及8描述發色分析之特定應用。
抑制：
如本文所用之術語「抑制(inhibit/inhibition/inhibitory)」指活性或特性之水準相對於對照統計上顯著降低。
本發明抗體抑制tc-uPA之蛋白分解活性。例示性降低為蛋白分解活性相對於陰性對照(例如無抗體對照或同型匹配之不相關抗體對照)降低50至100%，且由此包括至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%。量測蛋白分解活性之廣泛接受之功能分析包括如Blouse GE等人，J Biol Chem.2009年2月13日；284(7)：4647-57中所述的基於發色及螢光uPA/纖維蛋白溶酶受質之分析。本說明書實施例部分之實施例5、6及7描述發色分析之特定應用。在本文中，以在通常合理濃度範圍內之數個不同濃度測試抗uPA抗體以測定抑制水準之IC50值，在抑制性抗體之最高抗體濃度下，其總能達到80%-100%。
在一個具體實例中，本發明抗體抑制tc-uPA之蛋白分解活性。在其他具體實例中，本發明抗體亦抑制sc-uPA之活化。
本發明抗體抑制sc-uPA自uPA之蛋白分解非活性形式活化為uPA之蛋白分解活性形式。例示性降低為活化率相對於陰性對照(例如相對於無抗體對照或同型匹配之不相關抗體對照)降低50至100%，且由此包括至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%。量測活化分率之功能分析包括如Blouse GE等人，J Biol Chem.2009年2月13日；284(7)：4647-57中所述之發色及螢光uPA受質。本說明書實施例部分之實施例8描述一種藉由使用發 色uPA受質量測uPA之催化活性來鑑別抑制此sc-uPA活化之抗體的特定方式。在本文中，以在通常合理濃度範圍內之數個不同濃度測試抗uPA抗體以測定抑制水準之IC50值，在抑制性抗體之最高抗體濃度下，其總能達到95%-100%。
uPA與uPAR之結合：
在一個具體實例中，本發明抗體能夠結合於uPA之受體結合與非受體結合形式。uPA可以低於奈莫耳之親和力結合於uPA受體(uPAR或CD87)。此相互作用主要經由uPA之GFD域介導。天然存在之uPAR以數種形式存在。作為一實例，uPAR可經由糖基化磷脂醯肌醇(glycosylphosphatidylinositol；GPI)錨連接於細胞表面。作為另一實例，已展現可溶uPAR(soluble uPAR；suPAR)之數種形式，包括全長及截短形式。作為另一實例，已展現uPAR之截短形式，包括細胞表面結合形式及可溶形式。uPAR之全長形式(包括uPAR之細胞表面結合之全長形式及可溶全長形式)對uPA具有高親和力。uPAR形式截短形式對uPA具有可變親和力，包括對uPA具有高親和力、低親和力或無明顯親和力。
受體結合uPA：
術語『受體結合uPA(receptor-bound uPA)』及『uPAR結合uPA(uPAR-bound uPA)』在本文中可互換用於指示uPA之結合於uPAR或uPAR之任何變異體形式(包括結合於細胞表面或以可溶形式存在之uPAR)的所有形式。術語受體結合uPA另外包涵sc-uPA與tc-uPA，其限制條件為此等形式結合於uPAR。術語受體結合uPA另外包涵uPA之所有結構構形，其限制條件為此等形式結合於uPAR。術語受體結合uPA另外包涵uPA之所有形式，包括uPA形式活性形式及uPA之非活性形式，其限制條件為此等形式結合於uPAR。術語受體結合uPA另外包涵來自所有物種之uPA，包括人類及其他相關物種，其限制條件為此等形式結合於uPAR。
先前公開且認可之量測uPAR固定之uPA之蛋白分解活性的功能分析包括如Blouse GE等人，J Biol Chem.2009年2月13日；284(7)：4647-57中所述的基於發色及螢光uPA/纖維蛋白溶酶受質之分析。本說明書實施例部分中之實施例6：『偶合酶原活化分析中uPAR受體固定之sc-uPA』描述使用發色纖維蛋白溶酶受質量測uPAR固定之uPA的蛋白分解活性的特定方式。在本文中，抗體即使在uPA結合於uPAR時亦應具有抑制性。
非受體結合uPA：
術語『非受體結合uPA(non-receptor-bound uPA)』在本文中用於指示uPA之不結合於uPAR或uPAR之任何變異體形式(包括結合於細胞表面或以可溶形式存在之uPAR)的所有形式。術語非受體結合uPA另外包涵sc-uPA與tc-uPA，其限制條件為此等形式不結合於uPAR。術語非受體結合uPA另外包涵uPA之所有結構構形，其限制條件為此等形式不結合於uPAR。術語非受體結合uPA另外包涵uPA之所有形式，包括uPA形式活性形式及uPA之非活性形式，其限制條件為此等形式不結合於uPAR。術語非受體結合uPA另外包涵來自所有物種之uPA，包括人類及其他相關物種，其限制條件為此等形式不結合於uPAR。
鑑別抗uPA抗體之方法：
在一個態樣中，本發明提供一種鑑別雙作用性抗uPA抗體之方法。本發明之鑑別抗uPA抗體之方法包含以下步驟：(a)產生抗uPA抗體；(b)自步驟(a)中所產生之抗體鑑別抑制tc-uPA之蛋白分解活性的抗體；(c)自步驟(a)中所產生之抗體鑑別抑制sc-uPA自uPA之蛋白分解非活性形式活化為uPA之蛋白分解活性形式的抗體；及(d)選擇在步驟(b)與(c)中均具抑制性之抗體。
本發明之鑑別雙作用性抗uPA抗體之方法的步驟(a)，亦即產生抗uPA抗體，可根據此項技術中已知之方法進行。舉例而言，抗uPA抗體可在(但 不限於)各種動物宿主中以及使用噬菌體呈現、細菌呈現、酵母呈現、哺乳動物細胞呈現或核糖體或mRNA呈現產生。本說明書實施例部分之實施例3描述在小鼠中產生抗uPA抗體之特定方式。
本發明之鑑別雙作用性抗uPA抗體之方法的步驟(b)，亦即鑑別抑制tc-uPA之蛋白分解活性的抗體，可根據此項技術中已知之方法進行。先前公開且認可之量測uPA之蛋白分解活性的功能分析包括如Blouse GE等人，J Biol Chem.2009年2月13日；284(7)：4647-57中所述的基於發色及螢光uPA/纖維蛋白溶酶受質之分析。本說明書實施例部分之實施例5、6及7描述發色分析之特定應用。
本發明之鑑別雙作用性抗uPA抗體之方法的步驟(c)，亦即鑑別抑制sc-uPA自uPA之蛋白分解非活性形式活化為uPA之蛋白分解活性形式的抗體可根據此項技術中已知之方法進行。先前公開且認可之量測sc-uPA向uPA之活性形式活化的功能分析包括如Blouse GE等人，J Biol Chem.2009年2月13日；284(7)：4647-57中所述的基於發色及螢光uPA/纖維蛋白溶酶受質之分析。本說明書實施例部分之實施例8描述一種藉由使用發色uPA受質量測uPA之催化活性來鑑別抑制此sc-uPA活化之抗體的特定方式。
本發明之鑑別雙作用性抗uPA抗體之方法的步驟(d)，亦即選擇在步驟(b)與(c)中均具抑制性之抗體，藉由選擇抑制sc-uPA活化為uPA之活性活性以及抑制tc-uPA之蛋白分解活性的抗體完成。僅選擇在步驟(b)中抑制蛋白分解活性之至少50%(相對於陰性對照(例如無抗體對照或同型匹配之不相關抗體對照)活化率降低50至100%，且由此包括至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%)且在步驟(c)中抑制活化之至少50%(相對於陰性對照(例如無抗體對照或同型匹配之不相關抗體對照)活化率之例示性降低為50至100%，且由此包括至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%降低)的抗uPA抗體。本說明書實施例部分中之實施例5、6、7 及8描述一種藉由使用uPA或纖維蛋白溶酶之發色受質量測此等酶之催化活性來鑑別抑制sc-uPA活化與uPA之蛋白分解活性的抗體的獨特方式。
在一個具體實例中，本發明之鑑別雙作用性抗uPA抗體之方法進一步包含鑑別即使在uPA結合於uPAR時亦具有抑制性之抗uPA抗體的步驟。先前公開且認可之量測uPAR固定之uPA之蛋白分解活性的功能分析包括如Blouse GE等人，J Biol Chem.2009年2月13日；284(7)：4647-57中所述的基於發色及螢光uPA/纖維蛋白溶酶受質之分析。本說明書實施例部分中之實施例6：『偶合酶原活化分析中uPAR受體固定之sc-uPA』描述使用纖維蛋白溶酶之發色受質量測uPAR固定之uPA的蛋白分解活性的特定方式。在本文中，測試抗體即使在uPA結合於uPAR時抑制uPA之酶活性的能力。
在另一具體實例中，本發明之鑑別雙作用性抗uPA抗體之方法進一步包含抑制內源產生uPA之步驟。在自體免疫或發炎疾病中或在癌症中，免疫細胞可遷移且浸潤至發炎位點。此等細胞可藉由使組織發炎而在該疾病之早期與晚期階段中起重大作用，且uPA可最終使組織重塑而支持疾病進展。在類風濕性關節炎之情況下，巨噬細胞因其內源產生uPA而被認為很關鍵。因此，本說明書中所述之抗uPA抗體應能夠抑制由巨噬細胞產生之uPA。本說明書實施例部分中之實施例9：抑制內源產生uPA之抗體描述一種量測來自M1/M2巨噬細胞之內源產生uPA之蛋白分解活性的特定及獨特方式。
在另一具體實例中，本發明之鑑別雙作用性抗uPA抗體之方法進一步包含鑑別除結合且抑制人類uPA以外亦結合且抑制來自其他物種之uPA的抗體的步驟。顯然宜避免使用替代抗體及使用候選抗體直接用於毒理學研究。先前公開且認可之量測人類uPA之蛋白分解活性的功能分析包括如Blouse GE等人，J Biol Chem.2009年2月13日；284(7)：4647-57中所述的基於發色及螢光uPA/纖維蛋白溶酶受質之分析。本說明書實施例部分之實施例 5描述量測來自食蟹獼猴之uPA的蛋白分解活性的發色分析的替代性用途。
抗體：
術語「抗體(antibody)」在本文中指衍生自生殖系免疫球蛋白序列之蛋白質，該能夠結合於抗原或其部分。術語抗體包括任何類別(或同型)(亦即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及/或IgY)之全長抗體。結合於抗原或其部分之抗體可特異性或排他性結合於該抗原或其部分，或其可結合於有限數目之同源抗原(交叉反應)或其部分。
在本發明之一些具體實例中，抗體能夠結合於且抑制人類uPA且亦能夠結合於且抑制來自另一物種之uPA，諸如其他哺乳動物uPA，諸如來自如下物種之uPA：非人類靈長類(例如黑猩猩、食蟹獼猴或恆河猴)；嚙齒動物(諸如小鼠或大鼠)、兔類動物(諸如兔)或偶蹄型動物(諸如母牛、羊、豬或駱駝)。
在本發明之一特定具體實例中，抗體能夠結合於人類uPA且亦能夠結合於非人類靈長類uPA(例如黑猩猩、食蟹獼猴或恆河猴)。
如本文所用之術語「特異性結合(specifically bind/specific binding)」意謂化合物或抗體排他性或選擇性識別且結合uPA(例如人類uPA)之特定抗原決定基、同功異構物、直系同源物(物種)或變異體。本發明抗體結合於除人類以外之物種(諸如食蟹獼猴)的uPA且因此不為人類uPA特異性結合抗體。
天然全長抗體通常包含至少四條多肽鏈：兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈，其由二硫鍵連接。在一些情形下，天然抗體包含少於四條鏈，如在駱駝中發現的僅重鏈抗體(VHH片段)及在軟骨魚(Chondrichthyes)中發現的IgNAR之情形下。醫藥學上備受關注之一類免疫球蛋白為IgG。在人類中，IgG類別可基於其重鏈恆定區之序列而再分為4個亞類：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。輕鏈可基於其序列組成之不同而分為兩種類型：κ及λ鏈。 IgG分子由經兩個或兩個以上二硫鍵互連之兩條重鏈及各由二硫鍵連接於重鏈之兩條輕鏈構成。IgG重鏈可包含重鏈可變區(VH)及至多三個重鏈恆定(CH)區：CH1、CH2及CH3。輕鏈可包含輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL)。VH及VL區可進一步再分為稱為互補決定區(complementarity determining region；CDR)或高變區(hyper-variable region；HvR)之具有高變性之區域，其穿插有稱為構架區(framework region；FR)之較保守之區域。VH及VL區典型地由三個CDR及四個FR構成，其以如下次序自胺基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之具有高變區之可變域形成能夠與抗原相互作用之[結合]域，而抗體之恆定區可調節免疫球蛋白與如下宿主組織或因子之結合，包括(但不限於)：免疫系統之各種細胞(效應細胞)、Fc受體及經典補體系統之C1複合物的第一組分(C1q)。
本發明抗體可為單株抗體，意謂其表示由單個B細胞或由B細胞純系群表現的一組獨特重鏈及輕鏈可變域序列。本發明抗體可使用熟習此項技術之人士已知之各種方法產生且純化。舉例而言，抗體可由融合瘤細胞產生。抗體可由B細胞擴增產生。抗體或其片段可以重組方式表現於哺乳動物或微生物表現系統中或藉由試管內轉譯獲得。抗體或其片段亦可藉助於例如噬菌體呈現、細菌呈現、酵母呈現、哺乳動物細胞呈現或核糖體或mRNA呈現以重組方式表示為細胞表面結合分子。
本發明抗體可進行分離。術語「經分離抗體(isolated antibody)」指與產生抗體之環境中的其他組分分離及/或自其他組分回收的抗體及/或自產生抗體之環境中所存在之組分的混合物純化的抗體。
在本發明之情形下，抗體之某些抗原結合片段可為適合的，因為已展示抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。術語抗體之「抗原結合片段(antigen-binding fragment)」指抗體之保留結合於抗原(諸如如本文所 述之uPA或另一目標分子)之能力的一或多個片段。抗原結合片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、F(ab)S、Fv(典型地為抗體之單臂的VL及VH域)、單鏈Fv(scFv；參見例如Bird等人，Science 1988；242：42S-426；及Huston等人，PNAS 1988；85：5879-5883)、dsFv、Fd(典型地為VH及CHI域)及dAb(典型地為VH域)片段；VH、VL、VhH及V-NAR域；包含單個VH及單個VL鏈之單價分子；微型抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體及κ體(參見例如Ill等人，Protein Eng 1997；10：949-57)；駱駝IgG；IgNAR；以及一或多個經分離CDR或功能性互補位，其中經分離CDR或抗原結合殘基或多肽可結合或連接在一起以形成功能性抗體片段。各種類型之抗體片段已描述或綜述於例如Holliger及Hudson,Nat Biotechnol 2005；2S：1126-1136；WO2005040219及已公開之美國專利申請案20050238646及20020161201中。此等抗體片段可使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且該等片段可針對以與完整抗體相同之方式應用進行篩選。
抗體之「Fab片段(Fab fragment)」，包括「Fab」及「F(ab')2」片段，藉由使重鏈在連接抗體重鏈之鉸鏈半胱胺酸殘基之N端或C端側的鉸鏈區裂解而衍生自該抗體。「Fab」片段包括輕鏈之可變域及恆定域及重鏈之可變域及第一恆定域(CH1)。「F(ab')2」片段包含一般由其鉸鏈半胱胺酸共價連接之「Fab'」片段對。Fab'藉由使連接F(ab')2中之重鏈的鉸鏈二硫鍵裂解形式上衍生自F(ab')2片段。此項技術中亦已知抗體片段之除二硫鍵以外的其他化學偶合。Fab片段可能以較低親和力保持親本抗體結合於其抗原之能力。F(ab')2片段能夠二價結合，而Fab及Fab'片段可單價結合。一般而言，Fab片段缺乏恆定CH2及CH3域，亦即與Fc受體發生相互作用之Fc部分。由此，Fab片段一般不含效應功能。Fab片段可藉由此項技術中已知之方法藉由使抗體酶促裂解產生，例如使用木瓜蛋白酶獲得Fab或胃蛋白酶獲得F(ab')2，包括Fab、Fab'、F(ab')2之Fab片段可使用熟習此項技術之人士熟知 之技術以重組方式產生。
「Fv」片段為含有完整抗原識別及結合位點之抗體片段，且一般包含本質上可共價結合之一個重鏈可變域及一個輕鏈可變域的二聚物，例如在單鏈可變域片段(scFv)中。在此構型中，各可變域之三個高變區相互作用以在VH-VL二聚物之表面上界定抗原結合位點。六個高變區或其亞組一起賦予抗體抗原結合特異性。然而，甚至僅包含三個特異於抗原之高變區的單個可變域亦可保留識別且結合抗原之能力，但通常親和力低於全部結合位點(Cai及Garen,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93：6280-6285,1996)。舉例而言，僅具有一個重鏈可變域(VHH)之天然存在駱駝抗體可結合抗原(Desmyter等人，J.Biol.Chem.,277：23645-23650,2002；Bond等人，J.Mol.Biol.2003；332：643-655)。
「單鏈Fv」或「sFv」抗體片段包含抗體之VH和VL域，其中此等域存在於單個多肽鏈中。一般而言，Fv多肽進一步在VH與VL域之間包含多肽連接子，其使得scFv能夠形成用於抗原結合之所要結構。關於scFv之綜述，參見Pluckthun,1994,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269-315頁。
術語「雙功能抗體(diabodies)」指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，其中片段包含連接於同一多肽鏈(VH及VL)中之輕鏈可變域(VL)的重鏈可變域(VH)。藉由使用過短以使得同一鏈上之兩個可變域之間不能配對的連接子，迫使可變域與另一鏈之互補域配對，從而產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更全面地描述於例如EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448中。
表述「線性抗體(linear antibodies)」指如Zapata等人，1995,Protein Eng.,8(10)：1057-1062中所述之抗體。簡言之，此等抗體含有串聯Fd區段(VH-CH1-VH-CH1)對，其與互補輕鏈多肽一起形成抗原結合區對。線性抗 體可具有雙特異性或單特異性。
如本文所用之術語「單功能抗體(monobody)」指具有重鏈可變域且無輕鏈可變域之抗原結合分子。單功能抗體可在輕鏈不存在下結合於抗原且典型地具有三個高變區，例如CDR，特指CDRH1、CDRH2及CDRH3。重鏈IgG單功能抗體具有兩個由二硫鍵連接之重鏈抗原結合分子。重鏈可變域包含一或多個高變區，較佳CDRH3或HVL-H3區。
抗體片段可使用習知重組或蛋白質工程改造技術獲得，且該等片段可針對以與完整抗體相同之方式結合於人類uPA或另一功能進行篩選。
本發明抗體片段可藉由截短(例如藉由自多肽之N端及/或C端移除一或多個胺基酸)製備。片段亦可由一或多個內部缺失產生。
本發明抗體可為或可包含mAb 0266-0000-0010或0266-0000-0015抗體或此等抗體之變異體的片段。本發明抗體可為或可包含此等抗體或其變異體中之一者的抗原結合部分。舉例而言，本發明抗體可為此等抗體或其變異體中之一者的Fab片段，或其可為衍生自此等抗體或其變異體中之一者的單鏈抗體。
本發明抗體可為人類抗體或人類化抗體。如本文所用之術語「人類抗體(human antibody)」意欲包括具有如下可變區之抗體，其中構架區之至少一部分及/或CDR區之至少一部分衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列。(舉例而言，人類抗體可具有如下可變區，其中構架區與CDR區均衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列。)另外，若該抗體含有恆定區，則該恆定區亦衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體可包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由試管內隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。
該人類抗體可為人類單株抗體。該人類單株抗體可由融合瘤產生，該融合瘤包括獲自具有包含人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因區段譜系之基因 組的轉殖基因非人類動物(例如轉殖基因小鼠)的B細胞與不朽化細胞的融合物。
人類抗體可自選擇人類生殖系序列時建構之序列文庫分離，進一步用天然及合成序列多樣性多樣化。
人類抗體可藉由試管內免疫人類淋巴細胞，繼而用艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)使淋巴細胞轉型製備。
術語「人類抗體衍生物(human antibody derivative)」指人類抗體之任何經修飾形式，諸如抗體與另一試劑或抗體之共軛物。
如本文所用之術語「人類化抗體(humanised antibody)」指含有衍生自非人類免疫球蛋白之序列(CDR區或其部分)的人類/非人類嵌合抗體。由此，人類化抗體為如下人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中至少來自接受者之高變區的殘基經來自非人類物種(諸如來自小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類)之抗體(供者抗體)的高變區的具有所要特異性、親和力、序列組成及官能性的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之FR殘基經對應非人類殘基置換。該修飾之一實例為引入一或多個所謂反突變，其典型地為衍生自供者抗體之胺基酸殘基。抗體人類化可使用熟習此項技術之人士已知之重組技術(參見例如Antibody Engineering,Methods in Molecular Biology，第248卷，Benny K.C.Lo編)進行。輕鏈與重鏈可變域之適合人類接受者構架可由例如序列或結構同源性鑑別。或者，可例如基於結構、生物物理學及生物化學特性之知識使用固定接受者構架。接受者構架可由生殖系產生或衍生自成熟抗體序列。來自供者抗體之CDR區可藉由CDR移植轉移。移植有CDR之人類化抗體可藉由鑑別再引入(反突變)來自供者抗體之胺基酸殘基對人類化抗體之特性具有有益影響的關鍵構架位置針對例如親和力、官能性及生物物理學特性進一步最佳化。除供者抗體產生之反突變以外，人類化抗體可藉由在CDR或構架區中引入生殖系殘基、消除免 疫原性抗原決定基、定點突變誘發、親和力成熟等來工程改造。
另外，人類化抗體可包含接受者抗體或供者抗體中未發現之殘基。可進行此等修飾以進一步改進抗體效能。一般而言，人類化抗體包含至少一個-典型地兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白之CDR區且其中所有或實質上所有FR殘基為人類免疫球蛋白序列之FR殘基。人類化抗體可視情況亦包含免疫球蛋白恆定區(Fc)、典型地人類免疫球蛋白恆定區之至少一部分。
術語「人類化抗體衍生物」指人類化抗體之任何經修飾形式，諸如抗體與另一試劑或抗體之共軛物。
如本文所用之術語「嵌合抗體(chimeric antibody)」指如下抗體，其輕鏈及重鏈基因典型地自來源於不同物種之免疫球蛋白可變及恆定區基因藉由基因工程改造建構。舉例而言，可將來自小鼠單株抗體之基因的可變區段接合於人類恆定區。
抗體之可結晶區片段(「Fc區(Fc region)」/「Fc域(Fc domain)」)為抗體之N端區，其包含恆定CH2及CH3域。Fc域可與稱為Fc受體之細胞表面受體以及補體系統之一些蛋白質相互作用。Fc區使抗體能夠與免疫系統相互作用。在本發明之一個態樣中，抗體可經工程改造以在Fc區內包括修飾以典型地改變一或多個其功能特性(諸如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合、蛋白質穩定性及/或抗原依賴性細胞毒性)或缺乏該等功能特性。此外，本發明抗體可經化學修飾(例如可將一或多個化學部分連接於抗體)或經修飾以改變其糖基化而再次改變該抗體之一或多個功能特性。IgG1抗體可攜有包含以下突變中之一或多者且可能全部的經修飾Fc域，該等突變分別使對某些Fc受體之親和力降低(L234A、L235E及G237A)及使C1q介導之補體固定減少(A330S及P331S)(殘基根據EU索引編號)。
本發明抗體之同型可為IgG，諸如IgG1，諸如IgG2，諸如IgG4。必要 時，抗體之類別可藉由已知技術「轉換」。舉例而言，原先以IgM分子形式產生之抗體可類別轉換為IgG抗體。類別交換技術亦可用於將一個IgG亞類轉化為另一亞類，例如：將IgG1轉化為IgG2或IgG4；將IgG2轉化為IgG1或IgG4；或將IgG4轉化為IgG1或IgG2。亦可藉由組合來自不同IgG亞類之區域執行抗體工程改造以產生恆定區嵌合分子。
在一個具體實例中，CH1之鉸鏈區經修飾，以使得鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數改變，例如增加或減少。此方法例如進一步描述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。
恆定區可經修飾以使抗體穩定，例如以降低二價抗體分成向中單價VH-VL片段之風險。舉例而言，在lgG4恆定區中，殘基S228(根據EU索引編號之殘基)可突變為脯胺酸(P)殘基以使鉸鏈處之互連重鏈二硫橋形成穩定(參見例如Angal等人，Mol Immunol.199S；30：105-8)。
抗體或其片段亦可關於其互補決定區(；complementarity-determining region；CDR)定義。術語「互補決定區(complementarity-determining region)」或「高變區(hypervariable region)」在用於本文時指抗體之參與抗原結合之胺基酸殘基所位於之區域。在抗體可變域之胺基酸比對中，高變區或CDR區可鑑別為具有最高變化性之區域。可使用資料庫進行CDR鑑別，諸如Kabat資料庫，CDR例如定義為包含輕鏈可變域之胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)及重鏈可變域中之31-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)；(Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版物第91-3242號)。或者CDR可定義為來自「高變環(hypervariable loop)」之彼等殘基(輕鏈可變域中之殘基26-33(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)及重鏈可變域中之26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)；Chothia及Lesk,J.Mol.Biol 1987；196：901-917)。典型地，此區域中胺基酸殘基之編號藉由前述Kabat等人中 所述之方法執行。諸如「Kabat位置(Kabat position)」、「Kabat殘基(Kabat residue)」及「根據Kabat(according to Kabat)」之短語在本文中指用於重鏈可變域或輕鏈可變域之此編號系統。使用Kabat編號系統，肽之實際線性胺基酸序列可含有較少或額外胺基酸對應於可變域之構架(FR)或CDR之縮短序列或其中之插入序列。舉例而言，重鏈可變域可在CDR H2之殘基52後包括胺基酸插入序列(根據Kabat，殘基52a、52b及52c)且在重鏈FR殘基82後包括插入之殘基(根據Kabat，例如殘基82a、82b及82c)。對於既定抗體，可藉由將抗體序列之同源區域與「標準」Kabat編號序列比對確定殘基之編號。
術語「構架區(framework region)」或「FR」殘基指不在如本文所定義之CDR內之VH或VL胺基酸殘基。
本發明抗體可包含來自本文所揭示之一或多種特異性抗體的CDR區，諸如來自抗uPA抗體0266-0000-0010之CDR區(SEQ ID NO：9至14)，或抗uPA抗體0266-0000-0015之VH及VL序列(SEQ ID NO 5-6)，或人類化抗uPA抗體hz0266-0000-0010之VH及VL序列(SEQ ID NO：17及18)，或人類化抗uPA抗體0266-0000-0043之重鏈及輕鏈序列(SEQ ID NO：21及22)。
術語「抗原(antigen)」(Ag)指用於免疫免疫潛能脊椎動物以產生識別Ag之抗體(Ab)的分子實體。在本文中，Ag較為泛指且一般意欲包括由Ab識別之目標分子，由此包括免疫過程或其他過程(例如噬菌體呈現)中所用之用於產生Ab之分子的片段或模擬物。
抗原決定基：
如本文所用之術語「抗原決定基(epitope)」在「抗原結合分子(antigen binding molecule)」(諸如抗體(Ab))與其對應「抗原」(Ag)之間的分子相互作用之情形下定義。術語抗原(Ag)可指用於免疫免疫潛能脊椎動物以產生識別Ag之抗體(Ab)的分子實體。一般而言，「抗原決定基」指Ag 上Ab特異性結合之區域，亦即與Ab實體接觸之區域。實體接觸可經由Ab及Ag分子中之原子的距離標準(例如距離截止值)定義。
「不連續抗原決定基(discontinuous epitope)」為由兩個或兩個以上多肽區域形成的抗原決定基，該等多肽區域在線性肽序列中彼此不相鄰，但在多肽之三維結構中排列形成結構抗原決定基。其他類型之抗原決定基包括：線性肽抗原決定基；構形抗原決定基，其由兩個或兩個以上在抗原之三維結構中彼此臨近而置的非鄰接胺基酸組成；及轉譯後抗原決定基，其由共價連接於抗原之分子結構(諸如碳水化合物基團)整體或部分組成。
既定抗體(Ab)/抗原(Ag)對之抗原決定基可使用多種實驗及計算抗原決定基定位法在不同細節水準下定義且特性化。該等實驗方法包括此項技術中已知之突變誘發、X射線結晶學、核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance；NMR)光譜法及氫氘交換質譜(Hydrogen deuterium eXchange Mass Spectrometry；HX-MS)法。由於各方法依賴於獨特原理，故對抗原決定基之描述與用於測定其之方法密切相關。由此，視所採用之抗原決定基定位法而定，將不同地描述既定Ab/Ag對之抗原決定基。
在其最詳細描述之水準下，Ag與Ab之間的相互作用的抗原決定基可由定義Ag-Ab相互作用中所存在之原子接觸的空間座標以及關於其對結合熱力學之相對貢獻的資訊描述。在不太詳細之描述的水準下，抗原決定基可由定義Ag與Ab之間的原子接觸的空間座標描述。在甚至更不詳細之描述的水準下，抗原決定基可由如特定標準(諸如Ab及Ag中原子之間的距離)所定義其所包含的胺基酸殘基描述。在更不詳細之描述的水準下，Ab-Ag相互作用可經由功能(例如藉由與其他Ab之競爭結合及「分組(bin)」)特性化，但競爭結合不提供關於抗原決定基之任何結構資訊。
在由Ab(例如Fab片段)與其Ag之間的複合物的空間座標定義的X射線產生的晶體結構的情形下，除非另外規定或與上下文矛盾，否則在本 文中，術語抗原決定基特別地定義為如下uPA殘基，其特徵為具有距Ab中之重原子在約3.5至約5.0Å(諸如4Å)之距離內的重原子(亦即非氫原子)。
由於視所用抗原決定基定位法而定，在不同細節水準下獲得抗原決定基之描述及定義，故可類似地在不同細節水準下進行同一Ag上針對不同Ab之抗原決定基的比較。
胺基酸層面上描述的例如由X射線結構確定的抗原決定基在其含有相同胺基酸殘基組時稱為一致的。在抗原決定基共享至少一個胺基酸時，該等抗原決定基稱為重疊的。在抗原決定基不共享胺基酸殘基時，該等抗原決定基稱為各別(獨特)的。
術語「互補位(paratope)」之定義藉由將視角逆轉衍生自以上「抗原決定基」之定義。由此，術語「互補位」指Ab上Ag特異性結合之區域，亦即用於與Ag實體接觸之區域。
在由Ab(諸如Fab片段)與其Ag之間的複合物的空間座標定義的X射線產生的晶體結構的情形下，除非另外規定或與上下文矛盾，否則在本文中，術語互補位特別地定義為如下Ab殘基，其特徵為具有距uPA中之重原子在約4Å(3.5至5.0Å)之距離內的重原子(亦即非氫原子)。
結合區：
術語抗原之結合區指抗原上由如下胺基酸序列界定之區域，其中一或多個抗原結合分子(諸如抗體)結合於該胺基酸序列。因此，結合區包含至少一個抗原決定基，但亦可包含多種抗體之多個抗原決定基，即一致抗原決定基、重疊抗原決定基與可能的各別抗原決定基。結合區可不連續，其由兩個或兩個以上抗原多肽區域形成，該等抗原多肽區域在線性肽序列中彼此不相鄰，但在多肽之三維結構中排列形成結構結合區。結合區亦可為抗原上之線性肽區；或構形結合區，其由兩個或兩個以上在抗原之三維 結構中彼此臨近而置的非鄰接胺基酸組成；及轉譯後結合區，其由共價連接於抗原之分子結構(諸如碳水化合物基團)整體或部分組成。
結合於相同抗原之抗體可關於其同時結合於其共同抗原之能力進行特性化且可進行「競爭結合」/「分組」。在本發明之上下文中，術語「分組」指一種將結合於相同抗原之抗體分組的方法。抗體之「分組」可基於兩種抗體在基於標準技術(諸如表面電漿子共振(surface plasmon resonance；SPR)、ELISA或流動式細胞測量術)之分析中競爭結合至其共同抗原。
抗體之「組」使用參考抗體定義。若第二抗體不能與參考抗體同時結合於抗原，則第二抗體稱為屬於參考抗體之相同「組」。在此情形下，參考抗體與第二抗體競爭性結合抗原之同一部分且編撰為「競爭抗體(competing antibody)」。若第二抗體能夠與參考抗體同時結合於抗原，則第二抗體稱為屬於各別「組」。在此情形下，參考抗體與第二抗體不競爭性結合抗原之同一部分且編撰為「非競爭抗體(non-competing antibody)」。
抗體「分組」不提供關於抗原決定基之直接資訊。競爭抗體，亦即屬於相同「組」之抗體，可具有相同抗原決定基、重疊抗原決定基或甚至各別抗原決定基。若參考抗體結合於抗原上之其抗原決定基佔據第二抗體接觸抗原上之其抗原決定基所要的空間(「位阻(steric hindrance)」)，則為後者之情形。非競爭抗體一般具有各別抗原決定基。
術語「結合親和力(binding affinity)」在本文中用作兩個分子(例如抗體或其片段與抗原)之間的非共價相互作用之強度的量度。術語「結合親和力」用於描述單價相互作用(固有活性)。
兩個分子(例如抗體或其片段與抗原)之間經由單價相互作用發生的結合親和力可藉由測定平衡解離常數(KD)定量。KD又可藉由量測複合物形成及解離之動力學例如藉由SPR法測定。對應於單價複合物之締合及解離的速率常數分別指締合速率常數ka(或kon)及解離速率常數kd(或 koff)。KD經由等式KD=kd/ka與ka及kd相關聯。
遵循上述定義，與不同分子相互作用有關之結合親和力(諸如比較不同抗體對既定抗原之結合親和力)可藉由比較個別抗體/抗原複合物之KD值來比較。
本發明抗體可能夠與另一分子(諸如天然存在之配體或受體或另一抗體)競爭結合至uPA。因此，本發明抗體可能夠以大於亦能夠結合uPA之另一分子的親和力結合uPA。抗體與天然配體/受體競爭結合至抗原之能力可藉由測定及比較所關注之相互作用(諸如抗體與抗原之間的特定相互作用)的KD值與不關注之相互作用的KD值評定。典型地，抗體對於目標之KD為對於另一非目標分子(諸如無關物質或環境中伴有之物質)之KD的1/2、較佳1/5、更佳1/10。更佳地，KD為1/50，諸如1/100或1/200；甚至更佳為1/500，諸如1,000/1或1/10,000。
此解離常數之值可藉由熟知方法直接測定。評估配體(諸如針對目標之抗體)之結合能力的標準分析為此項技術中已知且包括例如ELISA、西方墨點、RIA及流式細胞分析。抗體之結合動力學及結合親和力亦可藉由此項技術中已知之標準分析(諸如SPR)評定。
可進行競爭結合分析，其中將抗體與目標之結合與該目標之另一配體(諸如另一抗體)與目標之結合比較。
本發明抗體可能夠與如下抗體競爭結合至人類uPA(包括sc-uPA及tc-uPA)：抗體0266-0000-0010(亦即抗體或包含mAb 0266-0000-0010之VH序列(SEQ ID NO：7)及mAb 0266-0000-0010之VL序列(SEQ ID NO：8)之其片段)、或mAb 0266-0000-0015(亦即抗體或包含mAb 0266-0000-0015之VH序列(SEQ ID NO：5)及mAb 0266-0000-0015之VL序列(SEQ ID NO：6)之其片段)、或mAb hz0266-0000-0010(亦即抗體或包含mAb hz0266-0000-0010之序列(SEQ ID NO：17)及mAb hz0266-0000-0010之VL序列(SEQ ID NO：18) 之其片段)、或mAb 0266-0000-0043(亦即抗體或包含人類化抗uPA抗體mAb 0266-0000-0043之重鏈及輕鏈序列(SEQ ID NO：21及22)之其片段)。本發明抗體可能夠與如下抗體競爭結合至食蟹獼猴uPA(包括sc-uPA及tc-uPA)：抗體0266-0000-0010(亦即抗體或包含mAb 0266-0000-0010之VH序列(SEQ ID NO：7)及mAb 0266-0000-0010之VL序列(SEQ ID NO：8)之其片段)、或mAb 0266-0000-0015(亦即抗體或包含mAb 0266-0000-0015之VH序列(SEQ ID NO：5)及mAb 0266-0000-0015之VL序列(SEQ ID NO：6)之其片段)、或mAb hz0266-0000-0010(亦即抗體或包含mAb hz0266-0000-0010之VH序列(SEQ ID NO：17)及mAb hz0266-0000-0010之VL序列(SEQ ID NO：18)之其片段)、或mAb 0266-0000-0043(亦即抗體或包含人類化抗uPA抗體mAb 0266-0000-0043之重鏈及輕鏈序列(SEQ ID NO：21及22)之其片段)。
本發明抗體結合於其目標之KD為1×10-7M或1×10-7M以下、1×10-8M或1×10-8M以下、或1×10-9M或1×10-9M以下、或1×10-10M或1×10-10M以下、1×10-11M或1×10-11M以下或1×10-12M或1×10-12M以下。本發明抗體之KD可小於0.8nM，諸如小於0.7nM，諸如小於0.6nM，諸如小於0.5nM，諸如小於0.4nM，諸如小於0.3nM，諸如小於0.2nM，諸如小於0.1nM，諸如小於0.05nM，諸如小於0.025nM，諸如小於0.015nM，諸如為0.015nM與0nM之間。
如此項技術中已知之術語「一致性(identity)」指兩種或兩種以上多肽之序列之間的關係，其藉由比較該等序列測定。在此項技術中，「一致性」亦意謂多肽之間的序列相關性之程度，其藉由兩個或兩個以上胺基酸殘基之串之間的匹配數測定。「一致性」量測進行間隙比對(若存在)之兩個或兩個以上序列之較小者之間的一致匹配的百分比，該等空隙比對藉由特定數學模型或電腦程式(亦即「算法(algorithm)」)處理。相關多肽之一致性 可藉由已知方法容易地計算。該等方法包括(但不限於)以下文獻中所述之方法：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.編，Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.編，Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data，第1部分，Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編，Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.及Devereux,J.編，M.Stockton Press,New York,1991；及Carillo等人，SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)。
測定一致性之較佳方法經設計以在所測試序列之間產生最大匹配。測定一致性之方法描述於可公開獲得之電腦程式中。測定兩個序列之間的一致性的較佳電腦程式方法包括GCG程式包，包括GAP(Devereux等人，Nucl.Acid.Res.12,387(1984)；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)、BLASTP、BLASTN及FASTA(Altschul等人，J.Mol.Biol.215,403-410(1990))。BLASTX程式可由National Center for Information(NCBI)及其他來源(前述BLAST Manual,Altschul等人，NCB/NLM/NIH Bethesda,Md.20894；Altschul等人)公開獲得。熟知Smith Waterman算法亦可用於測定一致性。
舉例而言，使用電腦算法GAP(Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)比對欲測定序列一致性百分比之兩個多肽以最佳地匹配其各別胺基酸(藉由該算法測定之「匹配跨度(matched span)」)。將空隙開放罰分(gap opening penalty，其如下計算：3×平均對角線；「平均對角線(average diagonal)」為所用比較矩陣之對角線的平均值；「對角線(diagonal)」為由特定比較矩陣分配給各完全胺基酸匹配之分值或數值)及空隙擴展罰分(其通常為{{分數(1/10)×空隙開放罰分})以及比較矩陣(諸如PAM 250或BLOSUM 62)與該算法結合使用。該算法亦使用標準比較矩 陣(對於PAM 250比較矩陣，參見Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequence and Structure，第5卷，增刊3(1978)；對於BLOSUM 62比較矩陣，參見Henikoff等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 89,10915-10919(1992))。
肽序列比較之較佳參數包括以下內容：算法：Needleman等人，J.Mol.Biol.48,443-453(1970)；比較矩陣：來自Henikoff等人，PNAS USA 89,10915-10919(1992)之BLOSUM 62；空隙罰分：12，空隙長度罰分：4，類似性臨限值：0。
上述參數適用於GAP程式。前述參數為使用GAP算法進行肽比較之預設參數(以及對於末端空隙之無罰分)。
術語「類似性(similarity)」為相關概念，但相比於「一致性(identity)」，其指包括一致匹配與保守取代匹配之序列關係。若兩個多肽序列具有例如(分數(10/20))一致胺基酸，且其餘部分為非保守取代，則一致性及類似性百分比均為50%。若在相同實施例中，尚存在5個存在保守取代之位置，則一致性百分比為25%且類似性百分比為75%((分數(15/20)))。因此，在存在保守取代之情況下，兩個多肽之間的類似性程度將高於此兩個多肽之間的一致性百分比。
醫藥調配物：
在一個態樣中，本發明提供包含本文所述之本發明分子(諸如抗uPA抗體)的組成物及調配物。舉例而言，本發明提供一種醫藥組成物，其包含一或多種與醫藥學上可接受之載劑一起調配之本發明抗uPA抗體。
因此，本發明之一個目的為提供一種包含以0.25mg/ml至250mg/ml之濃度存在之該抗體的醫藥調配物，且其中該調配物之pH值為2.0至10.0。該調配物可進一步包含一或多種緩衝液系統、防腐劑、張力劑、螯合劑、穩定劑或界面活性劑以及其各種組合。在醫藥組成物中使用防腐劑、等張劑、螯合劑、穩定劑及界面活性劑為熟習此項技術之人士所熟知。可參考 Remington：The Science and of Pharmacy，第19版，1995。
在一個具體實例中，醫藥調配物為水性調配物。該調配物典型地為溶液或懸浮液，但亦可包括膠體、分散液、乳液及多相物質。術語「水性調配物(aqueous formulation)」定義為包含至少50% w/w水之調配物。同樣，術語「水溶液(aqueous solution)」定義為包含至少50% w/w水之溶液，且術語「水性懸浮液(aqueous suspension)」定義為包含至少50% w/w水之懸浮液。
在另一具體實例中，醫藥調配物為經冷凍乾燥調配物，醫師或患者在使用前向其中添加溶劑及/或稀釋劑。
在另一態樣中，醫藥調配物包含該抗體之水溶液及緩衝液，其中抗體以1mg/ml或1mg/ml以上之濃度存在，且其中該調配物之pH值為約2.0至約10.0。
發炎：
本發明中所述之結合uPA之抗體可適用於治療罹患發炎病狀之個體。發炎為組織對多種刺激(包括(但不限於)病原體、受損細胞或刺激物)之複雜生物反應。發炎為有機體之保護反應以移除、中和或隔離有害刺激且引發癒合過程。發炎並非感染之同義詞-感染為外源病原體侵襲有機體，而發炎為免疫系統對病原體之反應。因此，發炎為感染之組分，但感染未必為發炎之組分。
發炎為涉及如下多個組分之事件的級聯，包括脈管系統(例如內皮細胞、外被細胞、平滑肌細胞)、免疫系統細胞(例如T及B淋巴細胞；多形核白血球或粒細胞，諸如單核細胞及嗜中性白血球；樹突狀細胞、巨噬細胞及NK細胞)、細胞產生之可溶性介體(細胞激素、趨化因子)以及目標組織中之固有細胞(例如上皮細胞、滑膜纖維母細胞、神經元細胞)。急性發炎之持續時間短(數小時至數天)且主要涉及組織中之固有細胞、免疫 系統之細胞遷移及體液及血漿蛋白質滲出至發炎位點。此由脈管流動、細胞活化及將免疫系統之細胞自循環吸引至損傷位點中的細胞組分的變化引起。慢性發炎之持續時間長，其中活動性發炎、組織破壞及嘗試修復同時進行。慢性發炎可由持久感染、長期及反覆暴露於毒性劑或由於自體免疫(身體之免疫細胞攻擊其自身組織從而造成損害之現象)引起。
通常，免疫系統能夠區分身體之正常細胞(或「自身」)與外來病原體或異常細胞(「非自身」)。在一些情況下，免疫系統喪失將「自身」識別為正常之能力且不適當地引發針對組織或細胞之反應。此反應來源於對自身喪失耐受性且稱為「自體免疫(autoimmunity)」。由自體免疫引起之病變通常具有嚴重臨床後果且為世界上、尤其發展中國家之重大健康問題之一。該等疾病之實例包括發炎性腸病(inflammatory bowel disease；IBD)、克羅恩氏病(Crohns disease；CD)、潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis；UC)、大腸急躁症、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis；RA)、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus；SLE)、狼瘡性腎炎、I型糖尿病、格雷夫斯病(Grave's disease)、多發性硬化(multiple sclerosis；MS)、自體免疫性心肌炎；川崎病(Kawasaki disease)、冠狀動脈疾病、慢性阻塞性肺病、間質性肺病、自體免疫性甲狀腺炎、硬皮病、全身性硬化症、骨關節炎、異位性皮膚炎、白斑病、移植物抗宿主疾病、休格連氏症候群(Sjogrens's syndrome)、自體免疫性腎炎、古巴士德氏症候群(Goodpasture's syndrome)、慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病、過敏、哮喘及作為急性或慢性發炎之結果的其他自體免疫疾病。
目標生物療法目前可用於治療某些自體免疫疾病及/或癌症。舉例而言，患有癌症之患者可用針對CD20之抗體(抗CD20)治療；患有類風濕性關節炎之患者可用抗CD20、TNF拮抗劑(可溶性TNFR或抗TNF-α)治療；患有牛皮癬之患者可用抗CD11a治療；患有多發性硬化之患者可用 INF-β治療；患有潰瘍性結腸炎之患者可用抗TNF-α治療且患有克羅恩氏病(Crohn's disease)之患者可用抗TNF-α或抗α 4整合素治療。不幸的是，接受用任一此等生物製劑治療之大量患者可能經歷多種副作用，可能無反應及/或可能產生針對治療性藥物之中和抗體。仍需要特異性靶向病變但不會影響健康細胞/組織從而產生較少嚴重副作用的替代性生物藥物。此外，該等替代性生物藥物可長期使用及/或不會造成中和抗體之產生。在一個態樣中，本發明係關於患有自體免疫疾病及慢性發炎性疾病之患者中的此等未滿足之需求。
發炎性腸病：
發炎性腸病(IBD)為可影響口部至肛門之胃腸道的任何部分從而引起多種症狀的疾病。IBD主要引起腹部疼痛、腹瀉(其可能出血)、嘔吐或體重減輕，但亦可引起胃腸道外之併發症，諸如皮膚皮疹、關節炎、眼部發炎、疲勞及注意力不集中。患有IBD之患者可分成兩大類，患有潰瘍性結腸炎(UC)之患者及患有克羅恩氏病(CD)之患者。儘管CD一般涉及回腸及結腸，但其可影響腸之任何區域，但通常為不連續的(疾病之集中區域分散在整個腸內)，UC始終涉及直腸(結腸)且較連續。在CD中，發炎可透壁，引起膿腫、瘺及狹窄，而在UC中，發炎典型地限於黏膜。尚無克羅恩氏病之已知醫藥或手術治癒法，而一些患有UC之患者可藉由手術移除結腸治癒。治療選擇限於控制症狀、維持緩解及預防復發。對於CD，臨床中發炎性腸病之功效可以克羅恩氏病活動性指數(Crohn's Disease Activity Index；CDAI)分值降低之形式量測，該分值基於實驗室測試及生活品質問卷及評分形式分等級。在動物模型中，主要藉由重量以及疾病活動性指數(disease activity index；DAI)增加來量測功效，該疾病活動性指數為大便稠度、重量及大便中之血液的組合。
多發性硬化：
多發性硬化(MS)為中樞神經系統(central nervous system；CNS)之疾病，其以麻木、虛弱、喪失肌肉協調性及具有視覺、語言及膀胱控制之問題為標誌。MS為身體之免疫系統攻擊髓鞘之自體免疫疾病，髓鞘為充當神經絕緣體且輔助神經信號傳輸之物質。MS引起腦白質脫髓鞘，其中此過程有時延伸至灰質中。脫髓鞘為髓鞘缺失，其中髓鞘由脂質及蛋白質構成。當MS中髓鞘受損時，神經纖維傳導出錯或不存在。與此等脫髓鞘之神經纖維有關的身體功能損傷或感覺改變引起MS之症狀。MS存在多個亞組，包括復發性復發緩解型、原發進展型及繼發進展型。呈現此等次型中之一些的小鼠模型可用於測試潛在療法之功效。在小鼠模型中之功效藉由肢體麻痹減少來量測。在患者中之功效藉由經MRI量測之腦中活動性分值降低以及肌肉張力/活動改良來量測。
患有復發緩解型多發性硬化(relapsing-remitting multiple sclerosis；RRMS)之患者的周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell；PBMC)的全基因組表現分析揭示患有RRMS之患者的PBMC中uPA基因(PLAU)之表現相較於健康對照之PBMC顯著增加(Cox等人，Mult Scler 19：1268-74,2013)。在多發性硬化之實驗性自體免疫腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis；EAE)小鼠模型中，用uPA抑制性PAI-1衍生肽處理可降低疾病分值(Gur-Wahnon等人，J Neuroinflammation 10：124,2013)。
牛皮癬：
牛皮癬為T細胞介導之可造成相當大不適之皮膚發炎病症。其為一種當前無治癒方法且影響所有年齡之人群的疾病。儘管患有輕度牛皮癬之個體可通常用表面藥劑控制其疾病，但全世界超過一百萬患者需要紫外光治療或全身性免疫抑制療法。不幸的是，紫外輻射之不便及風險及多種療法之毒性限制其長期使用。此外，患者之牛皮癬通常會復發，且在一些情形下在停止免疫抑制療法後不久即反彈。。最近基於CD4+ T細胞轉移開發之 牛皮癬模型模擬人類牛皮癬之多個方面，且因此可用於鑑別適用於治療牛皮癬之化合物(Davenport等人，Internat.Immunopharmacol 2：653-672,2002)。在此模型中之功效藉由使用評分系統獲得之皮膚病變減少來量測。類似地，在患者中之功效藉由皮膚病變減少來量測。
牛皮癬性關節炎：
牛皮癬性關節炎(PsA)為一類發炎性關節炎，其在患有牛皮癬之患者之一個亞組中發生。在此等患者中，皮膚病變/症狀伴有類似於類風濕性關節炎中所見之關節腫脹。其特徵為具有皮膚炎症之大片突起紅色區域且發生剝落。牛皮癬通常影響肘部及膝部之端部、頭皮、臍、及生殖器區域或肛門之周圍。患有牛皮癬之患者中約10%的關節亦產生相關炎症。
類風濕性關節炎：
類風濕性關節炎(RA)為一種影響幾乎全部身體(即使不是全部)的全身疾病且為關節炎之最常見形式之一。其特徵為關節發炎，從而引起疼痛、僵硬、發熱、發紅及腫脹。此發炎為炎性細胞侵襲關節之結果，且此等炎性細胞釋放可消化骨及軟骨之酶。因此，此發炎可引起嚴重骨及軟骨損害且引起關節退化及嚴重疼痛以及其他生理效應。涉及之關節可喪失其形狀及對準，從而造成疼痛及活動性喪失。
此項技術中已知類風濕性關節炎之數種動物模型。舉例而言，在膠原蛋白誘發之關節炎(collagen-induced arthritis；CIA)模型中，小鼠產生類似於人類類風濕性關節炎之發炎性關節炎。因為CIA與RA具有類似免疫及病理特徵，故此使得其為篩選潛在人類消炎化合物之適合模型。在此模型中之功效藉由關節腫脹減少來量測。在臨床中RA中之功效藉由能夠減少患者之症狀來量測，該功效以關節腫脹、紅血球沈積率、C-活性蛋白水準及血清因子(諸如抗瓜胺酸蛋白質抗體)水準之組合形式量測。
患有RA之患者的血液、滑液及組織中已描述高水準之uPA(Baran等 人，J.Cell Mol.Med.13：3797-3808,2009；Belcher等人，Ann.Rheum.Dis.55：230-236,1996；Busso等人，Ann.Rheum.Dis.56：550-557,1997；Ronday等人，Br.J.Rheumatol.35：416-423,1996)。uPA參與多種小鼠模型中之關節發炎及關節炎疾病。在膠原蛋白誘發之關節炎(CIA)模型(Cook等人，Am.J.Pathol.160：917-926,2002)中、在抗II型膠原蛋白抗體誘發之關節炎(anti-type II collagen antibody-induced arthritis；CAIA)模型(Cook等人，Arthritis Res.Ther.12：R37,2010)中及在K/BxN血清轉移關節炎模型(De Nardo等人，Arthritis Res.Ther.12：R199,2010)中使用uPA基因剔除小鼠來展現uPA在關節發炎中之功能性作用。在CIA模型中，uPA基因剔除小鼠中觀察到之關節炎症狀減少可藉由移植野生型骨髓逆轉，表明來源於免疫細胞之uPA對於疾病進展很關鍵。
血友病性關節病：血友病性關節病為由關節中復發性出血(關節積血)引起的變形性關節炎(deforming arthritis)。其為血友病A及B之常見併發症，但亦可在其他凝血症中見到。復發性關節積血引起滑膜慢性發炎、軟骨降解及骨重塑。受影響之關節的特徵為疼痛、僵硬、發熱、發紅、腫脹及受限制之關節活動。最常影響之關節為膝部、踝部、肘部、肩部及髖部。
血友病性關節病有數種動物模型。一些動物模型經歷自發性關節積血(諸如血友病性狗)，而其他建立模型基於人工誘發關節出血，諸如血友病性小鼠中建立的穿刺誘發之膝部出血模型。此等動物模型可適用於針對藥物候選者藉由阻止關節積血或藉由緩解由關節積血引起之發炎及降解過程對血友病性關節病產生之作用對其進行篩選。
在來自關節積血(包括血友病性小鼠中穿刺誘發之膝部出血)之動物模型中受影響關節之組織及滑液中觀察到uPA水準顯著增加(Nieuwenhuizen等人，Thromb Haemost 110：173-183,2013)。
全身性紅斑狼瘡：
全身性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus；SLE)為一種免疫複合物相關病症，其特徵為針對廣泛自體抗原之持續IgG抗體(諸如抗dsDNA)產生。SLE中疾病之中心介體為針對自身蛋白質/組織之自體抗體的產生及後續免疫介導之發炎的產生。抗體直接或間接調節發炎。儘管不認為T淋巴細胞直接產生疾病，但其為自體抗體產生所必需。SLE之影響為全身的(例如腎臟、肺、肌肉骨胳系統、黏膜皮膚、眼、中樞神經系統、心臟血管系統、胃腸道、骨髓、血液)，而非侷限於特定器官，但在一些情形下，絲球體腎炎(亦即狼瘡性腎炎)可能會侷限於特定器官。多個染色體基因座與該疾病有關且可針對疾病之不同態樣(諸如抗dsDNA抗體及絲球體腎炎)起作用。在人類疾病中及在適當小鼠模型中SLE中之功效藉由能夠治療實體以減少自體抗體(例如抗dsDNA)及/或藉由腎病變減少(提高腎臟功能)從而改良疾病症狀來量測。
癌症：
本發明中所述之結合uPA之抗體可適用於治療患有如下癌症及其他增生性疾病之個體，包括(但不限於)：癌瘤，包括膀胱、乳房、結腸、腎臟、肝臟、肺、卵巢、前列腺、胰腺、胃、子宮頸、甲狀腺及皮膚之癌瘤，包括鱗狀細胞癌；淋巴系之造血腫瘤，包括白血病、急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkins lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)、毛細胞淋巴瘤及伯基特氏淋巴瘤(Burketts lymphoma)及多發性骨髓瘤；骨髓系之造血腫瘤，包括急性及慢性骨髓性白血病、前髓細胞性白血病及骨髓發育不良症候群；源自間葉細胞之腫瘤，包括纖維肉瘤及橫紋肌肉瘤；其他腫瘤，包括黑色素瘤、精原細胞瘤、畸胎癌、神經母細胞瘤及神經膠質瘤；中樞及周邊神經系統之腫瘤，包括星形細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤及神經鞘瘤；源自間葉細胞之腫瘤， 包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤；及其他腫瘤，包括黑色素瘤、著色性乾皮病、角化棘皮瘤、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡癌及畸胎癌。
可根據本發明治療之特定病症包括淋巴系之造血腫瘤，例如T細胞及B細胞腫瘤，包括(但不限於)T細胞病症，諸如T-前淋巴細胞性白血病(T-prolymphocytic leukemia；T-PLL)，包括小細胞及腦狀細胞型；較佳T細胞型之大顆粒淋巴細胞性白血病(large granular lymphocyte leukemia；LGL)；塞紮萊症候群(Sezary syndrome；SS)；成人T細胞白血病淋巴瘤(adult T-cell leukemia lymphoma；ATLL)；T-NHL肝脾淋巴瘤；周邊/胸腺後T細胞淋巴瘤(多形性及免疫母細胞性亞型)；血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤；血管中心性(鼻型)T細胞淋巴瘤；多形性(Ki 1+)大細胞淋巴瘤；腸T細胞淋巴瘤；T-淋巴母細胞性淋巴瘤/白血病(T-lymphoblastic lymphoma/leukaemia；T-Lbly/T-ALL)、多發性骨髓瘤。
其他增生性病症亦可根據本發明治療，包括例如增生、纖維化(尤其肺，以及其他類型之纖維化，諸如腎纖維化)、血管生成、牛皮癬、動脈粥樣硬化及血管平滑肌增生(諸如狹窄或血管成形術後再狹窄)。
仍需要相較於當前療法具有較大功效及/或較不嚴重之副作用的替代性生物藥物。本發明係關於患有癌症之患者(包括患有轉移性(散播性)疾病之患者)中的此等未滿足之需求。
在多種不同癌症形式中已展現uPA之組織及血漿水準增加(Ulisse等人，Current Cancer Drug Targets,9：32-71,2009)。uPA亦參與多種小鼠模型中之癌症及癌轉移。uPA之功能性作用藉由干擾uPA mRNA表現(Yu等人，Cancer Res.50：7623-76331,1990)、藉由使用uPA基因缺乏小鼠(Almholt等人，Int.J.Cancer 113：525-532,2005)及藉由施用中和抗體(Ossowski及Reich,Cell 35：611-619,1983；Kobayashi等人，Thromb.Haemost.71：474-480,1994)或uPA特異性抑制劑(Schweinitz等人，J.Biol.Chem.279：33613-33622,2004；Henneke 等人，Am.J.Respir.Crit Care Med.181：611-619,2010)展現。
治療：
如本文所用之術語「治療(treatment)」指有需要之任何人類或其他動物個體的醫藥療法。該個體預期由醫學或獸醫學從業者進行身體檢查，該醫學或獸醫學從業者給予表明使用該治療對該人類或其他動物個體之健康有益的試驗性或決定性診斷。該治療之時間及目的可在一位個體與另一位個體之間視多種因素而不同，諸如個體健康現狀。由此，該治療可為預防性、緩解性、症狀性及/或治癒性治療。
就本發明而言，預防性、緩解性、症狀性及/或治癒性治療可代表本發明之各別態樣。
作用模式：
本發明抗體可非經腸(諸如靜脈內，諸如肌肉內，諸如皮下)投予。或者，本發明抗體可經由經腸路徑(諸如經口)或經表面投予。本發明抗體可預防性投予。本發明抗體可治療性投予(在需要時)。
非限制性具體實例
本發明藉由以下非限制性具體實例進一步描述：
1.一種能夠結合於人類uPA之單株抗體或其抗原結合片段，其特徵在於其抑制人類tc-uPA之蛋白分解活性且抑制人類sc-uPA自人類uPA之蛋白分解非活性形式活化為人類uPA之蛋白分解活性形式。
2.如具體實例1之單株抗體或其片段，其中該抗體抑制受體結合人類uPA與非受體結合人類uPA。
3.如具體實例1或2之單株抗體或其片段，其中該抗體亦抑制非人類靈長類uPA(諸如食蟹獼猴uPA)之蛋白分解活性。
4.如具體實例1、2或3之抗體或其片段，其中該抗體亦抑制非人類sc-uPA(諸如食蟹獼猴uPA)自該非人類uPA之蛋白分解非活性形式活化為 該非人類uPA之蛋白分解活性形式。
5.如具體實例1至4之抗體或其片段，其中該抗體亦抑制非人類靈長類uPA(諸如食蟹獼猴uPA)之蛋白分解活性，且亦抑制非人類sc-uPA(諸如食蟹獼猴uPA)自該非人類uPA之蛋白分解非活性形式活化為該非人類uPA之蛋白分解活性形式。
6.如具體實例1至5中任一者之抗體或其抗原結合片段，其能夠結合於人類uPA及來自其他物種之uPA，諸如黑猩猩、食蟹獼猴、恆河猴、小鼠、大鼠、兔、母牛、羊、豬或駱駝uPA，其特徵在於其抑制tc-uPA之蛋白分解活性且抑制sc-uPA自uPA之蛋白分解非活性形式活化為uPA之蛋白分解活性形式。
7.如具體實例1至6之抗體或其片段，其中該抗體抑制tc-uPA之蛋白分解活性，其中蛋白分解活性降低50至100%，諸如蛋白分解活性降低至少50%、60%、70%、80%、85%、90或95%。
8.如具體實例1至7之抗體或其片段，其中該抗體抑制sc-uPA自uPA之蛋白分解非活性形式活化為uPA之蛋白分解活性形式，其中活化率降低50至100%，諸如活化率降低至少50%、60%、70%、80%、85%、90或95%。
9.如具體實例1至8之抗體或其抗原結合片段，其能夠結合uPA，其中該抗體之重鏈包含：具有SEQ ID NO：7之胺基酸殘基95(Kabat；順序編號99)至102(Kabat；順序編號108)(DGRDGSWFAY)之CDR3序列，其中此等胺基酸殘基中之一者、兩者或三者可經不同胺基酸取代，尤其其中D95(Kabat；順序編號99)可突變為除D以外之任何胺基酸，及/或G96(Kabat；順序編號100)可突變為除G以外之任何胺基酸，及/或D98(Kabat；順序編號102)可突變為除D以外之任何胺基酸，及/或G99(Kabat；順序編號103)可突變為除G以外之任何胺基酸。
10.如具體實例1至9之抗體或其抗原結合片段，其能夠結合uPA，其中該抗體之重鏈包含：具有SEQ ID NO：7之胺基酸殘基31(Kabat及順序編號)至35(Kabat及順序編號)(SYTMS)之CDR1序列，其中此等胺基酸殘基中之一者可經不同胺基酸殘基取代；及/或具有SEQ ID NO：7之胺基酸50(Kabat及順序編號)至65(Kabat；順序編號66)(TISGGGSHIYYADSVKG)之CDR2序列，其中此等胺基酸中之一者、兩者或三者可經不同胺基酸殘基取代。
11.如具體實例1至10之抗體或其抗原結合片段，其能夠結合uPA，其中該抗體之輕鏈包含：具有SEQ ID NO：8之胺基酸殘基24(Kabat及順序編號)至34(Kabat及順序編號)(RTSQSIGDYLH)之CDR1序列，其中此等胺基酸殘基中之一者、兩者或三者可經不同胺基酸取代；及/或具有SEQ ID NO：8之胺基酸殘基50(Kabat及順序編號)至56(Kabat及順序編號)(YVSQSIS)之CDR2序列，其中此等胺基酸殘基中之一者或兩者可經不同胺基酸取代；及/或具有SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89(Kabat及順序編號)至97(Kabat及順序編號)(QNSHSFPLT)之CDR3序列，其中此等胺基酸殘基中之一者或兩者可經不同胺基酸取代，尤其N90可突變為除N以外之任何胺基酸，及/或S91可突變為除S以外之任何胺基酸。
12.如具體實例1至11之抗體或其抗原結合片段，其能夠結合uPA，其中該抗體之重鏈包含：具有SEQ ID NO：7之胺基酸殘基95(Kabat；順序編號99)至102(Kabat；順序編號108)(DGRDGSWFAY)之CDR3序列，其中D95(Kabat；順序編號99)可突變為除D以外之任何胺基酸，及/或G96(Kabat；順序編號100) 可突變為除G以外之任何胺基酸，及/或D98(Kabat；順序編號102)可突變為除D以外之任何胺基酸，及/或G99(Kabat；順序編號103)可突變為除G以外之任何胺基酸。
13.如具體實例1至12之抗體或其抗原結合片段，其能夠結合uPA，其中該抗體之重鏈包含：具有SEQ ID NO：7之胺基酸殘基31(Kabat及順序編號)至35(Kabat及順序編號)(SYTMS)之CDR1序列；及/或具有SEQ ID NO：7之胺基酸50(Kabat及順序編號)至65(Kabat；順序編號66)(TISGGGSHIYYADSVKG)之CDR2序列。
14.如具體實例1至13之抗體或其抗原結合片段，其能夠結合uPA，其中該抗體之輕鏈包含：具有SEQ ID NO：8之胺基酸殘基24(Kabat及順序編號)至34(Kabat及順序編號)(RTSQSIGDYLH)之CDR1序列；及/或具有SEQ ID NO：8之胺基酸殘基50(Kabat及順序編號)至56(Kabat及順序編號)(YVSQSIS)之CDR2序列；及/或具有SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89(Kabat及順序編號)至97(Kabat及順序編號)(QNSHSFPLT)之CDR3序列，其中N90可突變為除N以外之任何胺基酸，及/或S91可突變為除S以外之任何胺基酸。
15.如具體實例1至14之抗體或其抗原結合片段，其能夠結合uPA，其中該抗體之重鏈包含：具有SEQ ID NO：7之胺基酸殘基31(Kabat及順序編號)至35(Kabat及順序編號)(SYTMS)之CDR1序列；及/或具有SEQ ID NO：7之胺基酸50(Kabat及順序編號)至65(Kabat；順序編號66)(TISGGGSHIYYADSVKG)之CDR2序列；及/或具有SEQ ID NO：7之胺基酸殘基95(Kabat；順序編號99)至102(Kabat； 順序編號108)(DGRDGSWFAY)之CDR3序列，其中D95(Kabat；順序編號99)可突變為除D以外之任何胺基酸，及/或G96(Kabat；順序編號100)可突變為除G以外之任何胺基酸，及/或D98(Kabat；順序編號102)可突變為除D以外之任何胺基酸，及/或G99(Kabat；順序編號103)可突變為除G以外之任何胺基酸；且其中該抗體之輕鏈包含：具有SEQ ID NO 8之胺基酸殘基24(Kabat及順序編號)至34(Kabat及順序編號)(RTSQSIGDYLH)之CDR1序列；及/或具有SEQ ID NO：8之胺基酸殘基50(Kabat及順序編號)至56(Kabat及順序編號)(YVSQSIS)之CDR2序列；及/或具有SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89(Kabat及順序編號)至97(Kabat及順序編號)(QNSHSFPLT)之CDR3序列，其中N90可突變為除N以外之任何胺基酸，及/或S91可突變為除S以外之任何胺基酸。
16.如具體實例1至15之抗體或其抗原結合片段，其能夠結合uPA，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO：18，其中V2(Kabat及順序編號)可突變為I，及/或T22(Kabat及順序編號)可突變為S，及/或V58(Kabat及順序編號)可突變為I，及/或T69(Kabat及順序編號)可突變為S，及/或N90(Kabat及順序編號)可突變為除N以外之任何胺基酸，及/或S91(Kabat及順序編號)可突變為除S以外之任何胺基酸，且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO：17，其中E1(Kabat及順序編號)可突變為D，及/或Q3(Kabat及順序編號)可突變為K，及/或S49(Kabat及順序編號)可突變為A，及/或A93(Kabat；順序編號97)可突變為T，及/或D95(Kabat；順序編號99)可突變為除D以外之任何胺基酸，及/或G96(Kabat；順序編號100)可突變為除G以外之任何胺基酸，及/或D98(Kabat；順序編號102)可突變為除D以外之任何胺基酸，及/或G99(Kabat；順序編號103)可突變為除G以外 之任何胺基酸。
17.如具體實例1至16之抗體或其抗原結合片段，其能夠結合uPA，其中V2(Kabat及順序編號)可突變為I，及/或T22(Kabat及順序編號)可突變為S，及/或V58(Kabat及順序編號)可突變為I，及/或T69(Kabat及順序編號)可突變為S，及/或N90(Kabat及順序編號)可突變為除N以外之任何胺基酸，及/或S91(Kabat及順序編號)可突變為除S以外之任何胺基酸，其與κ恆定部分或其變異體組合，且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO：17，其中E1(Kabat及順序編號)可突變為D，及/或Q3(Kabat及順序編號)可突變為K，及/或S49(Kabat及順序編號)可突變為A，及/或A93(Kabat；順序編號97)可突變為T，及/或D95(Kabat；順序編號99)可突變為除D以外之任何胺基酸，及/或G96(Kabat；順序編號100)可突變為除G以外之任何胺基酸，及/或D98(Kabat；順序編號102)可突變為除D以外之任何胺基酸，及/或G99(Kabat；順序編號103)可突變為除G以外之任何胺基酸，且與IgG1或IgG1或IgG2之變異體或IgG2或IgG4之變異體或IgG4恆定部分之變異體組合。
18.如具體實例1、2或3中任一者之人類化抗體或其抗原結合片段，其中可變重鏈包含SEQ ID NO：17及/或可變輕鏈包含SEQ ID NO：18。
19.如具體實例1、2或3中任一者之抗體或其抗原結合片段，其能夠結合uPA，其中該重鏈包含SEQ ID NO：21及/或該輕鏈包含SEQ ID NO：22。
20.如具體實例1、2或3中任一者之人類化抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈包含：位於胺基酸殘基31-35(順序編號)中之包含SEQ ID NO：9之CDR-H1，及位於胺基酸殘基50-66(順序編號)中之包含SEQ ID NO：10之CDR-H2，及位於胺基酸殘基99-108(順序編號)中之包含SEQ ID NO：11之CDR-H3，且其中該輕鏈包含：位於胺基酸殘基24-34(順序編號)中之包含SEQ ID NO：12之CDR-L1，及位於胺基酸殘基50-56(順序編號)中之 包含SEQ ID NO：13之CDR-L2，及位於胺基酸殘基89-97(順序編號)中之包含SEQ ID NO：14之CDR-L3。
21.如具體實例1、2或3中任一者之抗原或其抗原結合片段，其與具體實例20之抗體競爭結合至人類uPA(SEQ ID NO 1)或食蟹獼猴uPA(SEQ ID NO 3)。
22.如具體實例1至8中任一者之抗體或其片段，其與具體實例10至19之抗體中之任一者競爭結合至人類uPA(SEQ ID NO 1)或食蟹獼猴uPA(SEQ ID NO 3)。
23.如具體實例1、2或3之抗體或其抗原結合片段，其與參考抗體競爭結合至人類uPA(SEQ ID NO 1)或食蟹獼猴uPA(SEQ ID NO 3)，其中該參考抗體包括包含SEQ ID NO：7之可變重鏈及/或包含SEQ ID NO：8之可變輕鏈。
24.如具體實例1、2或3之抗體或其抗原結合片段，其與參考抗體競爭結合至人類uPA(SEQ ID NO 1)或食蟹獼猴uPA(SEQ ID NO 3)，其中該參考抗體包括包含SEQ ID NO：17之可變重鏈及/或包含SEQ ID NO：8之可變輕鏈。
25.如具體實例1至8中任一者之抗體或其抗原結合片段，其與參考抗體競爭結合至人類uPA(SEQ ID NO：1)或食蟹獼猴uPA(SEQ ID NO：3)，該參考抗體包含mAb 0266-0000-0015之VH序列(SEQ ID NO：5)及mAb 0266-0000-0015之VL序列(SEQ ID NO：6)。
26.如具體實例1、2或3之抗體或其抗原結合片段，其結合於人類uPA(SEQ ID NO：1)上之不連續抗原決定基/結合區，其中該不連續抗原決定基/結合區之第一結合部分由SEQ ID NO：1之胺基酸第167號至第175號界定，且該不連續抗原決定基/結合區之第二結合部分由SEQ ID NO：1之胺基酸第218號至第224號界定。
27.如具體實例1、2或3之抗體或其抗原結合片段，其結合於人類uPA(SEQ ID NO：1)上不連續抗原決定基/結合區之該第一結合部分之一或多個胺基酸，其中該不連續抗原決定基/結合區之該第一結合部分由SEQ ID NO：1之胺基酸第167號至第175號界定，且結合於該不連續抗原決定基/結合區之該第二結合部分之一或多個胺基酸，其中該第二結合部分由SEQ ID NO：1之胺基酸第218號至第224號界定。
28.如具體實例1、2或3之抗體或其抗原結合片段，其結合於人類uPA(SEQ ID NO：1)上之不連續抗原決定基/結合區，其中該結合區包含SEQ ID NO 1之一或多個(較佳兩個或兩個以上、較佳三個或三個以上、較佳四個或四個以上、較佳五個或五個以上、較佳六個或六個以上、較佳七個或七個以上、較佳八個或八個以上、較佳所有九個)以下胺基酸：Ile 167、168、Asn 169、Gln 170、Pro 171、Trp 172、Phe 173、Ala 174及Ala 175，及SEQ ID NO：1之一或多個(較佳兩個或兩個以上、較佳三個或三個以上、較佳四個或四個以上、較佳五個或五個以上、較佳六個或六個以上、較佳所有七個)以下胺基酸：Tyr 218、Leu 219、Gly 220、Arg 221、Ser 222、Arg 223及Leu 224。
29.一種抗體或其抗原結合片段，其與具體實例18、19或20之抗體或具體實例23之參考抗體競爭結合至人類uPA(SEQ ID NO：1)上之不連續抗原決定基/結合區，其中該不連續抗原決定基/結合區之第一結合部分由SEQ ID NO：1之胺基酸第167號至第175號界定，且該不連續抗原決定基/結合區之第二結合部分由SEQ ID NO：1之胺基酸第218號至第224號界定。
30.如前述具體實例中任一者之抗體或其片段，其中該抗體選自由以下組成之群：單株抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、人類抗體之抗原結合區、scFv、Fab、F(ab')2、Fv及單鏈抗體。
31.如前述具體實例中任一者之抗體或其片段，其中該抗體或其片段為選自由以下組成之群的抗原結合片段： Fab、F(ab)2、F(ab')2、F(ab)S、Fv、單鏈、dsFv、Fd及dAb片段；VH、VL、VhH及V-NAR域；包含單一VH及單一VL鏈之單價分子；微型抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體及κ抗體；駱駝IgG；IgNAR；以及一或多個經分離CDR或功能性互補位，其中經分離CDR或抗原結合殘基或多肽可結合或連接在一起以形成功能性抗體片段。
32.如前述具體實例中任一者之抗體或其片段，其中該抗體共軛於治療劑。
33.如前述具體實例中任一者之抗體或其片段，其係用作藥物。
34.如前述具體實例中任一者之抗體或其片段，其係用於製造用於治療自體免疫疾病及/或慢性發炎之藥物。
35.如前述具體實例中任一者之抗體或其片段，其係用於治療癌症疾病及/或自體免疫疾病及/或慢性發炎。
36.如具體實例33至35之抗體或其片段，其係用於治療類風濕性關節炎。
37.一種治療自體免疫疾病或慢性發炎疾病之方法，其包含投予有需要之個體如前述具體實例中任一者之抗體或其片段。
38.一種醫藥組成物，其包含一或多種與醫藥學上可接受之載劑一起調配之如具體實例1至37中任一者之抗uPA抗體或其片段。
39.一種抗uPA抗體鑑別方法，其包含以下步驟：(a)產生抗uPA抗體；(b)自步驟(a)中所產生之該等抗體鑑別抑制人類tc-uPA之蛋白分解活性的抗體；(c)自步驟(a)中所產生之該等抗體鑑別抑制人類sc-uPA自人類uPA之蛋白分解非活性形式活化為人類uPA之蛋白分解活性形式的抗體；及(d)選擇在步驟(b)與(c)中均具抑制性之抗體。
40.如具體實例42之方法，其中該方法進一步包含鑑別甚至在人類uPA結合於人類uPAR時亦具有抑制性之抗uPA抗體的步驟。
41.如具體實例42之方法，其中該方法進一步包含鑑別抑制內源產生之人類uPA的抗uPA抗體的步驟。
42.如具體實例42之方法，其中該方法進一步包含鑑別亦結合且抑制來自如下其他物種之uPA的抗uPA抗體的步驟：諸如黑猩猩、食蟹獼猴、恆河猴、小鼠、大鼠、兔、母牛、羊、豬或駱駝uPA。
43.一種產生能夠結合於人類uPA之抗體或其抗原結合片段的方法，其中該抗體根據如具體實例39至42中任一者之鑑別方法鑑別。
實施例 實施例1：產生人類sc-uPA
為表現重組人類sc-uPA(SEQ ID NO：1)，合成全長cDNA序列(SEQ ID NO：2)且藉由標準技術選殖於具有CMV啟動子之哺乳動物表現構築體中。所產生之表現質體表示為pJSV-人類pro-uPA。藉由DNA測序檢驗所有構築體。在人類sc-uPA之cDNA序列(SEQ ID NO 2)中，編碼成熟sc-uPA蛋白之核苷酸序列前面有編碼20個胺基酸之信號肽[MRALLARLLLCVLVVSDSKG]的核苷酸序列。此信號肽不存在於成熟人類sc-uPA蛋白中。
藉由使用293FectinTM轉染試劑(Life Technologies-Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)進行短暫轉染在人胎腎293細胞(HEK293)中表現重組野生型人類sc-uPA蛋白。轉染後72小時採集細胞培養基。
藉由流過模式之Q層析及SP純化製程及另一Superdex75作為拋光步驟來純化重組野生型sc-uPA蛋白。最終蛋白質產物之純度>95%(藉由SDS-PAGE、Bioanalyzer CE及SEC-HPLC評估)且內毒素<1EU/mg(藉由動力學濁度測試評定)。
實施例2：產生獼猴sc-uPA
為表現重組獼猴sc-uPA(SEQ ID NO：3)，合成全長cDNA序列(SEQ ID NO：4)且藉由標準技術選殖於C端具有6×His標記物之表現載體pcDNA3.1+(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。所產生之表現質體表示為pcDNA3.1-cyno pro-uPA-6×His。在獼猴sc-uPA之cDNA序列(SEQ ID NO：4)中，編碼成熟sc-uPA蛋白之核苷酸序列前面有編碼信號肽之核苷酸序列，該信號肽基於人類與獼猴序列之間的同源性預測長度為20個胺基酸[MRALLAHLLLCVLVVSDSKS]。尚未建立獼猴sc-uPA之信號肽的精確一致性。此信號肽不存在於成熟獼猴sc-uPA蛋白中。
藉由使用293FectinTM轉染試劑(Life Technologies-Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)進行短暫轉染在HEK293中表現重組獼猴sc-uPA蛋白，其中培養基(Roche Applied Science,Mannheim Germany)中存在10μg/mL抑肽酶(Petersen HH等人，Eur J Biochem.2001年8月；268(16)：4430-9；Blouse GE等人，J Biol Chem.2009年2月13日；284(7)：4647-57)以阻止活化位點蛋白分解裂解。轉染後72小時採集細胞培養基。
藉由Nickel管柱及接著Superdex_75純化來純化重組獼猴sc-uPA蛋白。在10μg/mL抑肽酶存在下進行Nickel管柱純化。Superdex_75之緩衝液及最終儲存緩衝液為20mM NaAc、150mM NaCl(pH 5.0)(Lin L等人，J Biol Chem.2010年4月2日；285(14)：10982-92)以阻止自發性活化。最終蛋白質產物之純度>90%(藉由SDS-PAGE、Bioanalyzer CE及SEC-HPLC評估)且內毒素<1EU/mg(藉由動力學濁度測試評定)。
實施例3：產生單株抗uPA抗體：
為產生小鼠單株抗體(mAb)，用重組人類sc-uPA(SEQ ID NO：1)使RBF小鼠免疫。
小鼠經皮下免疫。為進行首次免疫，將20μg抗原與完全傅氏佐劑(Freund's adjuvant)混合。在後續免疫中，將不完全傅氏佐劑(incomplete Freund's adjuvant)與相同量之抗原一起使用。末次免疫後10天，藉由ELISA 針對uPA特異性抗體分析小鼠之眼部血液。用含10μg抗原之PBS對具有陽性滴定之小鼠進行靜脈內增強免疫，且在三天後處死。無菌移除脾且分散於單細胞懸浮液中。藉由電融合執行脾細胞與骨髓瘤細胞之融合。使用實施例5中所述之特異性結合分析來選擇分泌特異性抗體之融合瘤。
實施例4：結合於人類sc-uPA之抗體的初次篩選：
用2μg/ml重組人類sc-uPA塗佈免疫培養盤(Maxisorb,Nunc)。將20μg/ml抑肽酶之PBS溶液及融合瘤培養物上清液以1：1體積比添加至培養盤中且在室溫下培育一小時。用特異於鼠抗體之共軛於HRP之多株抗體(polyclonal antibody；pAb)進行偵測。
實施例5：偶合酶原活化分析
uPA將酶原纖維蛋白溶酶原轉化為活性纖維蛋白溶酶。反過來，存在正反饋環，其中纖維蛋白溶酶亦將sc-uPA活化為tc-uPA，從而促進反應動力學。
將來自Blouse等人，2009(Blouse GE等人，J Biol Chem.2009年2月13日；284(7)：4647-57)之此分析調適，且使用其鑑別抑制sc-uPA活化及/或抑制tc-uPA之催化活性的抗uPA抗體。簡言之，在室溫下將10μL含有抗uPA測試抗體之融合瘤培養物上清液與40μL最終濃度為0.625nM之重組人類sc-uPA(SEQ ID NO：1)一起在HBS-B緩衝液(30mM HEPES、135mM NaCl、1mM EDTA、0.1%BSA，pH 7.4)中在微量滴定盤(Perkin Elmer，#6005659)中培育30分鐘。未觀察到上清液對分析動力學存在顯著干擾，從而使得可自粗培養物上清液直接篩選未純化抗體。培育後，將50μL添加至如下混合物中，其含有最終濃度為0.5μM之人類纖維蛋白溶酶原(american diagnostica公司，#400)及最終濃度為0.5mM之稱為S-2251之發色纖維蛋白溶酶受質H-D-Val-Leu-Lys-對硝基苯胺(Chromogenix，#820332)。關於三小時之時程內405nm下之吸光度的拋物線型增加記錄S-2251水解。吸光度用作纖維蛋 白溶酶活性之量度，纖維蛋白溶酶活性為uPA活性之間接量度。引起低或甚至無吸光度之抗體鑑別為功能上抑制人類uPA，且經包括以用於在使用來自食蟹獼猴(cyno)之重組sc-uPA而非人類sc-uPA之此分析之改良型式中進一步測試。所有其他組分及分析步驟與上述相同。選擇能夠功能上抑制cyno uPA之抗體進一步特性化。使用所選抗體之經純化批料測定抑制之IC50值(表9)。
該分析中用來自食蟹獼猴之sc-uPA(SEQ.ID NO：3)測試之0266-000-0010抗體產生0.9nM之IC50值，展示此抗體亦可有效中和來自食蟹獼猴之sc-uPA。
實施例6：偶合酶原活化分析中uPAR受體固定之sc-uPA
人類uPA天然結合於其同源uPA受體(uPAR)。使用如下功能性分析，其測試固定於人類uPAR之人類sc-uPA將人類纖維蛋白溶酶原活化為纖維蛋白溶酶的能力。此使得可選擇不與uPAR競爭結合至uPA且由此能夠功能上抑制受體結合與非受體結合uPA的功能性抗體。簡言之，用HBS-B緩衝液洗滌經展示細胞表面表現uPAR之U937細胞，隨後用甘胺酸緩衝液(3.0)處理三分鐘以去除內源結合之uPA。隨後用HEPES緩衝液(500mM HEPES、100mM NaCl，pH 7.5)中和低pH值。將細胞以10×106個細胞/毫升再懸浮於HBS-B緩衝液中且在室溫下與12.5nM重組人類sc-uPA(SEQ ID NO：1)一起培育一小時。用HBS-B緩衝液洗滌細胞三次以移除非結合之sc-uPA，隨後將25μL(對應於0.25×106個細胞)分配於96孔微量滴定盤(Perkin，#6005659)中之孔中且在室溫下與25μL含有抗uPA測試抗體之融合瘤培養物上清液一起培育30分鐘。培育後，將50μL添加至如下混合物中，其含有最終濃度為0.5μM之人類纖維蛋白溶酶原(american diagnostica公司，#400)及最終濃度為0.5mM之稱為S-2251之發色纖維蛋白溶酶受質H-D-Val-Leu-Lys-對硝基苯胺(Chromogenix，#820332)。關於三小時之時程 內405nm下之吸光度的拋物線型增加即時監測S-2251水解。吸光度用作纖維蛋白溶酶活性之量度，纖維蛋白溶酶活性為結合於uPAR之uPA活性的間接量度。為進行參考，在此分析中，0266-0000-0010與0266-0000-0015以及人類化抗體0266-0000-0043以<0.7nM之IC50值抑制人類uPA(SEQ ID NO：1)之活性。引起低或甚至無吸光度之抗體鑑別為功能上抑制固定於uPAR上之人類uPA，且選用於進一步測試。
實施例7：鑑別抗催化性抗uPA抗體
使用量測tc-uPA催化之纖維蛋白溶酶原向纖維蛋白溶酶之轉化率的分析來判定偶合酶原活化分析中所選之功能上中和抗體(參見實施例5)是否可抑制人類tc-uPA之催化活性。簡言之，在室溫下將10μL含有抗uPA測試抗體之融合瘤培養物上清液與40μL最終濃度為0.6nM之重組人類tc-uPA(R&D Systems，#1310-SE)一起在HBS-B緩衝液(30mM HEPES、135mM NaCl、1mM EDTA、0.1%BSA，pH 7.4)中在微量滴定盤(Perkin Elmer，#6005659)中預培育30分鐘。未觀察到上清液對分析動力學存在顯著干擾，從而使得可自粗培養物上清液直接篩選未純化抗體。培育後，將50μL添加至如下混合物中，其含有最終濃度為0.5μM之人類纖維蛋白溶酶原(american diagnostica公司，#400)及最終濃度為0.5mM之稱為S-2251之發色纖維蛋白溶酶受質H-D-Val-Leu-Lys-對硝基苯胺(Chromogenix，#820332)。關於三小時之時程內405nm下之吸光度的拋物線型增加即時監測S-2251水解。吸光度用作纖維蛋白溶酶活性之量度，纖維蛋白溶酶活性為纖維蛋白溶酶原向纖維蛋白溶酶之轉化中的tc-uPA催化活性的間接量度。選擇能夠中和人類tc-uPA之催化活性的抗體進行進一步篩選。使用所選抗體之經純化批料測定抑制之IC50值(表9)。
實施例8：鑑別抑制sc-uPA自非活性形式活化為活性形式的抗uPA抗體
為判定偶合酶原活化分析中所鑑別之功能上中和抗uPA抗體(參見實施例5)是否能夠抑制人類sc-uPA自uPA之非活性形式活化為活性形式，在活化分析中進一步測試，其中人類sc-uPA由纖維蛋白溶酶自非活性形式活化為活性形式。簡言之，在室溫下將10μL含有抗uPA測試抗體之融合瘤培養物上清液與40μL最終濃度為6.4nM之重組人類sc-uPA(SEQ ID NO：1)一起在HBS-B緩衝液(30mM HEPES、135mM NaCl、1mM EDTA、0.1%BSA，pH 7.4)中在微量滴定盤(Perkin Elmer，#6005659)中預培育30分鐘。培育後，將50μL添加至如下混合物中，其含有最終濃度為5nM之人類纖維蛋白溶酶(Raybiotech公司，#MD-14-0070P)及最終濃度為0.5mM之稱為S-2444之發色uPA受質<Glu-Gly-Arg-對硝基苯胺(Chromogenix，#S-2444)。關於三小時之時程內405nm下之吸光度的拋物線型增加記錄S-2444水解。吸光度用作人類uPA之活性形式的直接量度。
雙作用性抗體之選擇及特性化
將抑制包括受體結合uPA之uPA(參見實施例5及6)且發現具有抗活化(參見實施例8)與抗催化能力(參見實施例7)的抗體定義為雙作用性抗體且選用於進一步特性化。使用所選抗體之經純化批料測定實施例5、7及8中所述之分析中抑制之IC50值(參見表9)。
實施例9：功能上抑制內源產生之uPA的抗體
為評定所選雙作用性抗uPA單株抗體是否能夠功能上抑制內源產生之uPA，建立如下分析，其中可量測人類M1及M2巨噬細胞產生之uPA的活性。簡言之，使巨噬細胞自由人類白血球層分離之單核細胞成熟為M1及M2。將細胞洗滌且再懸浮於RM緩衝液(0.4mM MgSO4、0.5mM MgCl2、0.5mM CaCl2、20mM HEPES、0.01% BSA，pH 7.4)中。向96孔微量滴定盤(Perkin Elmer，#6005659)之每孔添加四十微升(對應於0.5×106個細胞)，且添加10μL經純化抗uPA測試抗體，且在室溫下培育反應物30分鐘。培 育後，將50μL添加至如下混合物中，其含有最終濃度為0.5μM之人類纖維蛋白溶酶原(american diagnostica公司，#400)及最終濃度為0.5mM之稱為S-2251之發色纖維蛋白溶酶受質H-D-Val-Leu-Lys-對硝基苯胺(Chromogenix，#820332)。關於三小時之時程內96孔微量滴定盤中在405nm下之吸光度的拋物線型增加記錄S-2251水解。吸光度用作纖維蛋白溶酶活性之量度，纖維蛋白溶酶活性為來源於巨噬細胞之uPA活性的間接量度。為進行參考，在此分析中使用以1.3nM之IC50值抑制uPA之0266-0000-0010及以<0.7nM之IC50值抑制uPA之0266-0000-0015。重要的是，人類化抗體0266-0000-0043亦能夠以2.1nM之IC50值抑制來源於巨噬細胞之uPA活性。選擇能夠抑制來自M1及M2巨噬細胞之uPA的雙作用性抗體作為治療類風濕性關節炎之候選者，因為認為巨噬細胞在疾病之產生中發揮很大作用。
實施例10：藉由流動式細胞測量術分析的與人類試管內產生之巨噬細胞的結合
材料及方法：自Copenhagen University醫烷之正常健康志願者獲得白血球層。使用人類單核細胞富集Coctail Rosette分離法分離單核細胞。在37℃、5% CO2下在40ng/ml rhM-CSF存在下培養經純化單核細胞6天。在第3天將培養基替換成含有40ng/ml rhM-CSF之新鮮培養基。在第6天，將培養基再次更換為含有rhIFN-γ(50ng/ml)之培養基，且進一步培育細胞隔夜以使細胞分化為M1巨噬細胞。將細胞用10、1或0.1μg/ml抗uPA mAb純系0266-0000-0010(IgG1)或0266-0000-0015(IgG1)染色。使用小鼠IgG1同型對照(10μg/ml)作為陰性對照。使用APC共軛之第二山羊抗小鼠IgG進行偵測。在BD FACS Fortessa(Becton & Dickinson)上執行流動式細胞測量分析。
結果：兩種抗uPA單株抗體純系(0266-0000-0010及0266-0000-0015)均展現可結合於M1巨噬細胞(圖1)。兩種抗體均展示具有類似效能之劑 量依賴性結合，但對於0266-0000-0015記錄略高MFI值，表明略高親和力(表1)。此與藉由Biacore分析產生之親和力資料一致。同型對照抗體(小鼠IgG1)展示僅在10μg/ml下展示低背景染色。
表1展示用兩種不同uPA抗體純系染色之M1巨噬細胞的平均螢光強度(mean fluorescence intensity；MFI)值。
實施例11：測定抗原結合親和力
藉由SPR使用Biacore T200器具(GE Healthcare)量測抗uPA針對人類及獼猴sc-uPA(SEQ ID NO：1及3)之親和力。此等研究使用直接結合程序執行。各別抗體經由自由胺基共價偶合於感測器晶片表面上之羧基甲基化聚葡萄糖膜(CM5/CM4)達300-500共振單位(Resonance Unit；RU)之水準。以各種濃度注射含有sc-uPA之HBS-B(300mM Hepes、135mM NaCl、1mM EDTA及1% BSA，pH 7.4)，繼而為解離階段，其中恆定緩衝液在感測器晶片表面上流動。注射時間為60秒，繼而180秒解離階段。藉由注射兩次短甘胺酸-HCl(pH 1.5)脈衝進行再生。
使用1：1相互作用朗繆爾擬合模型(1：1 interaction Langmuir fitting model)計算相互作用之動力學參數(ka、kd及KD)。
所量測之親和力均在低奈莫耳濃度範圍內。
藉由SPR分析量測人類或獼猴sc-uPA與經固定mAb 0266-0000-0010及0266-0000-0015之間的相互作用的動力學參數。結果展示於表2中。量測締合速率常數(ka)及解離速率常數(kd)。平衡解離常數依KD=kd/ka計算。
實施例12：來自融合瘤之抗uPA mAb VL及VH cDNA的選殖及測序
自分別表現抗體0266-0000-0010及0266-0000-0015之名為m-uPA-1F21A1及m-uPA-1F58A1的兩種不同抗uPA mAb表現融合瘤提取總RNA。使用RNeasy微型套組(Qiagen，目錄號74106)自融合瘤細胞提取RNA，且使用所得RNA之等分試樣作為第一股cDNA合成之模板，該第一股合成遵循製造商對5' RACE之說明使用SMARTer RACE cDNA擴增套組(Clontech，目錄號634923)且使用5' RACE CDS引子A以及SMARTer II A寡核苷酸進行。以下使用通用引子混合物(Universal primer A mix；UPM)以及小鼠LC κ特異性反向引子(5' gga gct ggt ggt ggc atc tca gga cct ttg 3')或以及識別小鼠IgG1序列之反向引子(5' aaaaa tctagaATA GAC AGA TGG GGG TGT CGT TTT GGC 3')對來自該兩種抗uPA融合瘤中之每一者之輕鏈可變域(VL)及重鏈可變域(VH)編碼區cDNA進行PCR擴增。使用普信(phusion)PCR混合物(FinnZymes，目錄號：F-531L)進行PCR反應。使用Zero blunt Topo PCR選殖套組(Invitrogen，目錄號K280040)選殖所得PCR片段且測序。
實施例13：人類化抗uPA抗體
由實施例12中所述之融合瘤1F21A1之選殖獲得0266-0000-0010之序列且表3中列出重鏈及輕鏈之可變部分。在本文中，完整0266-0000-0010VH以SEQ ID NO：7給出且根據Kabat CDR定義之CDR分別以SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：11給出。此外，完整0266-0000-0010VL以SEQ ID NO：8給出且根據Kabat CDR定義之CDR分別以SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14給出。
此實施例中所用之所有編號指Kabat編號方案。
使用MOE(獲自www.chemcomp.com)中之標準技術建立0266-0000-0010之3D模型且將有效CDR區之4.5Å內的所有殘基(VH：31-35B、50-58、95-102；VL：24-34、50-56、89-97)定義為遮蔽殘基。遮蔽殘基對於維持CDR中之結合均可能很重要。
0266-0000-0010之遮蔽殘基包括位置1-4、22、27-37、47-60、69-71、73、78、91-104(重鏈)及1-5、6、22-36、46-58、62、64-71、87-98(輕鏈)。
使用生殖系檢索及手動檢測，VH3_21及JH4鑑別為重鏈之適當人類生殖系組合且相應序列列於表4中，SEQ ID NO：15，且V6D_41及JK4鑑別為輕鏈之適當人類生殖系組合且相應序列列於表4中，SEQ ID NO：16，但其他生殖系亦可使用。
目前可用以下法則進行人類化：
- 在遮蔽殘基外之殘基視為人類殘基。
- 在遮蔽殘基內且在Kabat CDR內之殘基視為鼠殘基。
- 在遮蔽殘基內且在Kabat CDR外具有小鼠/生殖系共同序列之殘基視為共同序列。
- 在遮蔽殘基內且在Kabat CDR外具有小鼠/生殖系不同序列之殘基視為人類殘基，且此等殘基進行潛在反突變。
將0266-0000-0010之有效CDR區移植於生殖系中形成0266-0000-0010之基本人類化構築體，hz0266-0000-0010及其可變部分列於表5中。重鏈以SEQ ID NO：17給出且輕鏈以SEQ ID NO：18給出。
由hz0266-0000-0010序列之分析，根據Kabats定義之CDR如表6中所示且與相應鼠mAb 0266-0000-0010一致。
0266-0000-0010與hz0266-0000-0010之間遮蔽殘基之任何不一致將產生潛在反突變且潛在反突變之清單展示於表7中。
此外，前導序列在輕鏈之位置90-91中含有至少1個潛在去醯胺位點NS且在重鏈之95-96及98-99中含有至少2個潛在isoasp位點。為評估無此等潛在位點之候選者，製備表8中所展示之突變體。
為研究所有潛在人類化mAb，必須產生上述在表7及表8中所列之突變體之所有組合，且基於親和力篩選、表現分析及穩定性研究選擇最終人類化候選者。
實施例14：市售單株抗體之特性化
已報導數種先前技術抗人類uPA單株抗體且其可購得。在用於選擇本申請案中所報導之本發明抗uPA雙作用性單株抗體之分析(參見實施例5、7及8)中測試可獲得之所有抗體。表9中所列之結果展示18種測試抗體中有四種能夠在偶合酶原活化分析(參見實施例5)中與催化分析(參見實施例7)中抑制人類uPA活性，但在sc-uPA活化分析(參見實施例8)中不能。一種抗體能夠在偶合酶原活化分析(參見實施例5)與sc-uPA活化分析(實施例8)中抑制uPA活性。其他九種抗體在任何分析中均不顯著抑制uPA。重要的是，先前技術抗體均不能在所有三個分析(參見實施例5、7及8中之分析)中抑制uPA活性。
(-)表示非抑制性抗體。
實施例15：功能上抑制人類嗜中性白血球粒細胞(PMN)中之內源uPA之抗體
為評定所選雙作用性抗uPA單株抗體是否能夠功能上抑制人類嗜中性白血球中之內源uPA，使用實施例9中所述之分析。
由自願供者團體(Novo Nordisk A/S，Målv)所提供之血液獲得PMN。該程序經Scientific Committees of Region Copenhagen(期刊號H-D-2007-0055)批准。將新抽取之血液收集於含有EDTA之小瓶中。藉由將血液(4份)在室溫下經由Ficoll-Paque PLUS(GE Health Care)梯度(3份)離心30分鐘(400×g)分離血細胞。將含粒細胞層懸浮於含有聚葡萄糖-500(Sigma)之PBS中1小時以移除污染性紅血球。在室溫下離心上清液5分鐘(250×g)且使用0.2% NaCl滲透裂解剩餘紅血球55秒。藉由1.2% NaCl+PBS使溶液等張且在250×g下離心5分鐘，隨後反覆進行滲透溶解。離心後，將PMN 再懸浮於如下反應混合物(Reaction Mixture；RM)中：HBSS：(目錄號14175 Gibco)137mM NaCl、5.3mM KCl、0.33mM Na2HPO4、4mM NaHCO3、0.44mM KH2PO4、補充有0.4mM MgSO4*7H2O之5mM葡萄糖、0.5mM MgCl2、0.5mM CaCl2、20mM HEPES。由Nucleo計數器(Chemometec)測定細胞密度。將測試化合物溶解於RM中。懸浮液含有>95% PMN。
向PMN懸浮液中添加10nM重組人類GM-CSF，因為先前展示其可提高uPA活性。用人類血纖維蛋白原(目錄號F3879-1G，Sigma)塗佈孔。各孔含有0.35-0.5×106個PMN、人類纖維蛋白溶酶原、0.5μM(American diagnostic)、0.5mM發色纖維蛋白溶酶受質H-D-Val-Leu-Lys-對硝基苯胺S-2251(Chromogenix)及抗uPA測試抗體。在37℃下在SpectraMaxPlus(Molecular Devices)上每5分鐘量測405及650nm下之吸光度持續3小時。由吸光度(405-650nm)獲得之曲線為纖維蛋白溶酶活性之量度。對曲線求導且使用最大斜率作為最大uPA活性。
結果展示雙作用性抗體0266-0000-0010以14nM之IC50值抑制uPA且0266-0000-0015以IC50值0.9nM抑制。單作用性0266-0000-0016及0266-0000-0019展示分別為25及約200nM之較低效能。
實施例16：人類化抗人類uPA抗體
抗體之人類化形式具有實質上來自人類免疫球蛋白(稱為接受者免疫球蛋白)之可變構架區及實質上來自鼠抗體(在此情形下，mAb 0266-0000-0010)之CDR。藉由3D模型分析預測對於維持結合親和力及特異性可能很關鍵之反突變。產生抗體0266-0000-0010之人類化形式mAb 0266-0000-0043且藉由SPR及uPA功能偶合發色分析評估。
實驗資料展現0266-0000-0043及0266-0000-0010對人類及獼猴sc-uPA具有類似結合特徵；且對由人類或獼猴uPA達成之纖維蛋白溶酶原活化具有相當抑制作用。mAb 0266-0000-0043及0266-0000-0010之蛋白質序列展示於 表10中。
產生mAb之表現載體
將輕鏈或重鏈之編碼序列插入EcoRI與BamHI位點之間的pJSV002(基於CMV啟動子之表現載體)中。將來自CD33之信號肽(mplllllpllwagala)添加在編碼序列前以促進分泌。
重組mAb表現
藉由使用293fectinTM試劑(Invitrogen，目錄號12347)將編碼各別輕鏈及重鏈之質體DNA以1：1之量比共轉染於FreestyleTM 293 F細胞(Life Technologies，目錄號R79007)中。使經轉染細胞在含有4mM麩醯胺酸(Life Technologies，目錄號25030-024)、1% PLURONIC® F68(Gibco，目錄號24040-032)及青黴素-鏈黴素抗有絲分裂劑(Life Technologies，目錄號10378016)之無血清FreeStyle 293培養基(Gibco，目錄號12338)中以每毫升1×106個細胞生長且在37℃、8% CO2下在震盪下培育5天。轉染後第5天收集上清液且藉由離心使其澄清。
DNA轉染：
●用於轉染之培養物的細胞密度為0.9-2.0×106個細胞/毫升。
●每毫升細胞培養物使用0.5μg輕鏈(LC)載體DNA及0.5重鏈(HC)載體DNA之混合物。
●用Opti-MEM培養基(Gibco)稀釋DNA至30微升培養基/微克DNA，混合且在室溫(23-25℃)下培育5分鐘。
●以1微升/微克DNA之濃度使用293FectinTM(Invitrogen)作為轉染試劑。
●用Opti-MEM培養基(Gibco)30倍稀釋293FectinTM，混合且在室溫(23-25℃)下培育5分鐘。
●混合DNA與293Fectin溶液且使其在室溫(23-25℃)下培育25分鐘。
●隨後向細胞培養物中直接添加DNA-293Fectin混合物。
●將經轉染細胞培養物轉移至在37℃、8% CO2及125rpm下之震盪培育箱中。
●轉染後5天，藉由離心收集細胞培養物上清液，繼而經由0.22μm PES過濾器(Corning)過濾。
●藉由生物層干涉測量術(Biolayer Interferometry)直接在澄清細胞培養物上清液上使用FortéBio Octet系統及蛋白A生物感測器進行抗體產生之定量分析。
純化
藉由離心(15,000rpm×20min，4℃)收集含有分泌之0266-0000-0043的培養物上清液，隨後藉由用0.45μm硝酸纖維素膜過濾使其澄清。將澄清上清液施用於5mL MabSelectSuRe管柱(GE 17-5438-02)，繼而用PBS進行10管柱體積洗滌。隨後用20mM甲酸及100mM精胺酸(pH 3.5)洗提所結合mAb且以2mL洗提份收集於具有200μl 1M Tris HCl(pH 9.0)之玻璃管中。彙集峰洗提份且用Amicon ultra 15離心裝置(30kD MWCO，Millipore)將緩衝液更換為磷酸鹽緩衝生理食鹽水(Phosphate Buffered Saline；PBS)。濃縮後，藉由用NANODROP UV光譜儀量測280nm吸光度測定最終蛋白質濃度。藉由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis；SDS-PAGE)評定蛋白質純度。藉由LAL測試(Charles River)評估內毒素水準。SDS-凝膠設置展示於表12中且所得凝膠展示於圖3中。
SE-HPLC分析
典型地，使用1200系統(Agilent Technologies)在TSKSWxl 3000管柱(Tosoh，部件號08541，300×7.8mm)上分析用於SE-HPLC之50μg蛋白質。除非另外說明，否則緩衝液為16mM Na2HPO4、3mM KH2PO4、247mM NaCl、6mM KCl、5%異丙醇v/v(pH 6.8)且流速為0.5ml/min。SE-HPLC結果概述展示於下表13中，且該等結果展示於圖4中。
藉由SPR量測結合動力學
為與鼠mAb比較，藉由表面電漿子共振(surface plasmon resonance；SPR)量測與重組人類sc-uPA蛋白(SEQ ID NO：1)及獼猴sc-uPA(SEQ ID NO：3)之結合特徵。
在BiacoreTM器具(GE Healthcare)上進行實驗且用BIAcore 4000分析評估軟體分析。分別經由胺偶合將抗人類uPA 0266-0000-0010(SEQ ID NO：19及20)及0266-0000-0043(SEQ ID NO：21及22)以150-600 RU直接固定於CM5感測器晶片(GE Healthcare；目錄號BR-1000-12)之流動池上。用含有1% BSA緩衝液之HBS-N(GE Healthcare目錄BR-1006-70)以3倍稀釋因數在1000-0.13nM範圍內稀釋重組人類sc-uPA及獼猴sc-uPA蛋白。注射重組人類sc-uPA及獼猴sc-uPA蛋白60秒，繼而為600秒解離期。在25℃下且在30μL/min之流速下量測結合曲線。以30μl/min用pH 1.5甘胺酸進行晶片 表面再生25秒。藉由用1：1結合模型擬合進行動力學參數測定。計算動力學參數且陳述於下表14中。
0266-0000-0010(SEQ ID NO：19及20)與0266-0000-0043(SEQ ID NO：21及22)均展示極良好地結合於人類與獼猴sc-uPA。且0266-0000-0010與0266-0000-0043之間的結合動力學特徵類似。
偶合酶原活化分析
活體內，uPA將酶原纖維蛋白溶酶原轉化為活性纖維蛋白溶酶。反過來，存在正反饋環，其中纖維蛋白溶酶亦將sc-uPA(pro-uPA)轉化為tc-uPA(活性uPA)，由此促進反應動力學。此機制可用於藉由偵測使用發色纖維蛋白溶酶受質H-D-Val-Leu-Lys-pNA(S-2251，Chromogenix，目錄號0082033239)產生之纖維蛋白溶酶之量來量測uPA之活性。參見圖5。
可中和uPA介導之纖維蛋白溶酶原活化的抗uPA結合mAb之抑制作用可藉由在sc-uPA及纖維蛋白溶酶原存在下S-2251之水解量測。將sc-uPA(0.25nM)與各種濃度之0266-0000-0010或0266-0000-0043(0-400ng/ml)一起在室溫下在HBS-B中預培育30分鐘。在37℃下添加0.5M纖維蛋白溶酶原(Glu-纖維蛋白溶酶原，Haematologic Technologies公司，目錄號HCPG-0130)及0.5mM纖維蛋白溶酶受質H-D-Val-Leu-Lys-對硝基苯胺(S-2251)起始反應。關於405nm下之吸光度的拋物線型增加監測S-2251水解。
HBS-B緩衝液含有：經過濾30mM Hepes、135mM NaCl、0.1% BSA(pH 7.4)。
偶合酶原活化分析(對於一個樣品)：
●向Eppendorf管中添加HBS-B緩衝液178.51μl。
●用PBS 1000倍稀釋人類sc-uPA樣品且添加5.68μl至Eppendorf管中。
●藉由PBS將抗uPA mAb標準化為1mg/ml且向管中添加21μl。
●藉由渦旋混合且在室溫下培育30分鐘
●培育結束前5分鐘，在新Eppendorf管中藉由渦旋混合1.25μl纖維蛋白溶酶原與3.57μl S-2251。
●向含有HBS-B、sc-uPA及mAb之Eppendorf管中添加4.82μl纖維蛋白溶酶原與S-2251之混合物(總體積210μl)。
●藉由渦旋混合且離心。
●在室溫下每5分鐘(或10分鐘)讀取培養盤在405nm下之吸光度持續4小時。
偶合酶原活化分析之結果展示於圖6-9中。圖6展示人類sc-uPA(hu pro-uPA)上濃度為0、20、50、100μg/ml之mAb 0266-0000-0010(0010)。圖7展示人類sc-uPA(hu pro-uPA)上濃度為0、20、50、100、200、400μg/ml之mAb 0266-0000-0043(0043)。圖8展示獼猴sc-uPA(cyno pro-uPA)上濃度為0、20、50、100μg/ml之mAb 0266-0000-0010(0010)，且圖9展示獼猴sc-uPA(cyno pro-uPA)上濃度為0、20、50、100、200、400μg/ml之mAb 0266-0000-0043(0043)。
SPR與偶合酶原活化分析之結果展現0266-0000-0010及0266-0000-0043對於人類及獼猴sc-uPA具有類似結合特徵；且對由人類及獼猴uPA進行之纖維蛋白溶酶原活化具有相當抑制作用。
實施例17：產生含有1個反突變或4個反突變之人類化抗uPA mAb。
使用編碼人類化抗uPA LC及HC(人類IgG4及人類IgG1同型)之質體作為向質體中引入單一反突變之起點。鑑別VL中之四個候選反突變 (V2I、T22S、V58I及T69S)及VH中之四個反突變(E1D、Q3K、S49A、A93T)且自Eurofins Genomics,Germany購買引入特定VL或VH點突變之正向及反向DNA引子。使用QuikChange Lightning定點突變誘發套組(來自Agilent)、作為模板之LC或HC表現質體、突變特異性正向及反向引子對且使用製造商提供之說明進行定點突變誘發。所得表現質體編碼具有一個反突變之四個不同人類化抗uPA LC及具有一個反突變之八個不同人類化抗uPA HC(4個不同反突變引入IgG4及IgG1中)。藉由每1公升HEk293轉染使用總共1mg DNA(0.5mg LC及0.5mg HC)及1mL 293fectin(Invitrogen，目錄號：12347-019)短暫共轉染HEK293懸浮細胞來表現含有單一反突變之16個不同人類化抗uPA mAb變異體以及VL中具有所有四個反突變或VH中具有所有四個反突變之兩種抗uPA mAb變異體(人類IgG4同型)。典型地，在轉染後培養細胞5-7天，且收集所得細胞培養物上清液且根據基於蛋白A之方法純化。在偶合酶原活化分析(其描述於實施例5及實施例16中)中測試所有18種人類化抗uPA mAb變異體，(16種變異體具有一個反突變且兩種具有四個反突變)。mAb 0266-0000-0043為具有多個推薦反突變之人類化抗體的實例。如實施例16中所展現，在偶合酶原活化分析中mAb 0266-0000-0043有效抑制人類uPA。
實施例18：移除抗人類uPA重鏈上之潛在iso-asp位點
為測試移除0266-0000-0010之重鏈中的潛在2個iso-asp位點「D95G96」及「D98G99」(用粗體標記)之可能性，產生單一突變變異體且藉由Biacore量測其對於人類sc-uPA之結合親和力。
產生單一突變變異體
藉由用QuikChange II XL定點突變誘發套組(Agilent Technologies，目錄號200521)定點突變誘發來引入突變，各突變之密碼子交換如下表16中所列。
突變變異體表現及純化
藉由使用293fectinTM試劑(Invitrogen，目錄號12347)將編碼攜帶單一突變之重鏈的質體DNA與編碼野生型輕鏈之質體DNA一起以1：1之量比共轉染於FreestyleTM 293-F細胞(Life Technologies，目錄號R79007)中。使經轉染細胞在含有4mM麩醯胺酸(Life Technologies，目錄號25030-024)、1% PLURONIC® F68(Gibco，目錄號24040-032)及青黴素-鏈黴素抗有絲分裂劑(Life Technologies，目錄號10378016)之無血清FreeStyle 293培養基(Gibco，目錄號12338)中以每毫升1×106個細胞生長且在37℃、8% CO2下在震盪下培育5天。轉染後第5天收集上清液且藉由離心使其澄清。
DNA轉染：
●用於轉染之培養物的細胞密度為0.9-2.0×106個細胞/毫升。
●每毫升細胞培養物使用0.5μg輕鏈(LC)載體DNA及0.5重鏈(HC)載體DNA之混合物。
●用Opti-MEM培養基(Gibco)稀釋DNA至30μl培養基/微克DNA，混合且在室溫(23-25℃)下培育5分鐘。
●以1微升/微克DNA之濃度使用293FectinTM(Invitrogen)作為轉染 試劑。
●用Opti-MEM培養基(Gibco)30倍稀釋293FectinTM，混合且在室溫(23-25℃)下培育5分鐘。
●混合DNA與293Fectin溶液且使其在室溫(23-25℃)下培育25分鐘。
●隨後向細胞培養物中直接添加DNA-293Fectin混合物。
●將經轉染細胞培養物轉移至在37℃、8% CO2及125rpm下之震盪培育箱中。
●轉染後5天，藉由離心收集細胞培養物上清液，繼而經由0.22μm PES過濾器(Corning)過濾。
●藉由生物層干涉測量術直接在澄清細胞培養物上清液上使用FortéBio Octet系統及蛋白A生物感測器進行抗體產生之定量分析。
藉由離心(15,000rpm×20min，4℃)收集培養物上清液，隨後藉由用0.45μm硝酸纖維素膜過濾使其澄清。將澄清上清液施用於50μl PreDictor MabSelect SuRe 96孔過濾器盤(GE 28-9258-25)。隨後用20mM甲酸及100mM精胺酸(pH 3.5)洗提結合之mAb，且用Amicon ultra 15離心裝置(30kD MWCO，Millipore)將緩衝液更換為磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)。藉由NanoDrop(Thermo Scientific，莫耳吸光度=1.553)量測樣品之濃度。藉由在215nm下SEC-UPLC評估樣品之純度，其範圍在75%與99%之間。
藉由SPR量測結合動力學
藉由表面電漿子共振(SPR)量測對於重組人類sc-uPA蛋白(SEQ ID NO：1)之結合親和力。
在BiacoreTM器具(GE Healthcare)上進行實驗且用BIAcore 4000分析評估軟體分析。分別經由胺偶合將抗人類uPA mAb變異體以150-600 RU直接固定於CM5感測器晶片(GE Healthcare；目錄號BR-1000-12)之流動池上。用含有1% BSA緩衝液之HBS-N(GE Healthcare目錄BR-1006-70)以3倍稀 釋因數在1000-0.13nM範圍內稀釋重組人類sc-uPA。注射重組人類sc-uPA 60秒，繼而為600秒解離期。在25℃下且在30μL/min之流速下量測結合曲線。以30μl/min用pH 1.5甘胺酸進行晶片表面再生25秒。藉由用1：1結合模型擬合進行動力學參數測定。計算動力學參數且陳述於下表17中。
結果展示可由0266-0000-0010-VH_D95V及0266-0000-0010-VH_G96K移除潛在iso-asp位點「D95G96」而不會喪失親和力；且可由0266-0000-0010-VH_G99S移除潛在iso-asp位點「D98G99」而不會喪失親和力。在偶合酶原活化分析中，0266-0000-0010-VH_D95V與0266-0000-0010-VH_G99S均展現保留對人類uPA所誘導之纖維蛋白溶酶原活化的抑制作用。
實施例19：移除輕鏈上之抗人類uPA潛在去醯胺位點
為測試移除0266-0000-0010之輕鏈中的潛在去醯胺位點「N90S91」(用粗體標記)之可能性，產生單一突變變異體且藉由Biacore量測其對於人類sc-uPA之結合親和力。
產生單一突變變異體
藉由用QuikChange II XL定點突變誘發套組(Agilent Technologies，目錄號200521)定點突變誘發來引入突變，各突變之密碼子交換如下所列。
突變變異體表現及純化
藉由使用293fectinTM試劑(Invitrogen，目錄號12347)將編碼攜帶單一突變之輕鏈的質體DNA與編碼野生型重鏈之質體DNA一起以1：1之量比共轉染於FreestyleTM 293-F細胞(Life Technologies，目錄號R79007)中。使經轉染細胞在含有4mM麩醯胺酸(Life Technologies，目錄號25030-024)、1% PLURONIC® F68(Gibco，目錄號24040-032)及青黴素-鏈黴素抗有絲分裂劑(Life Technologies，目錄號10378016)之無血清FreeStyle 293培養基 (Gibco，目錄號12338)中以每毫升1×106個細胞生長且在37℃、8% CO2下在震盪下培育5天。轉染後第5天收集上清液且藉由離心使其澄清。
DNA轉染：
●用於轉染之培養物的細胞密度為0.9-2.0×106個細胞/毫升。
●每毫升細胞培養物使用0.5μg輕鏈(LC)載體DNA及0.5重鏈(HC)載體DNA之混合物。
●用Opti-MEM培養基(Gibco)稀釋DNA至30μl培養基/微克DNA，混合且在室溫(23-25℃)下培育5分鐘。
●以1微升/微克DNA之濃度使用293FectinTM(Invitrogen)作為轉染試劑。
●用Opti-MEM培養基(Gibco)30倍稀釋293FectinTM，混合且在室溫(23-25℃)下培育5分鐘。
●混合DNA與293Fectin溶液且使其在室溫(23-25℃)下培育25分鐘。
●隨後向細胞培養物中直接添加DNA-293Fectin混合物。
●將經轉染細胞培養物轉移至在37℃、8% CO2及125rpm下之震盪培育箱中。
●轉染後5天，藉由離心收集細胞培養物上清液，繼而經由0.22μm PES過濾器(Corning)過濾。
蛋白質純化：
藉由離心(15,000rpm×20min，4℃)收集培養物上清液，隨後藉由用0.45μm硝酸纖維素膜過濾使其澄清。將澄清上清液施用於50μl PreDictor MabSelect SuRe 96孔過濾器盤(GE 28-9258-25)。隨後用20mM甲酸及100mM精胺酸(pH 3.5)洗提結合之mAb，且用Amicon ultra 15離心裝置(30kD MWCO，Millipore)將緩衝液更換為磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)。藉由NanoDrop(Thermo Scientific，莫耳吸光度=1.553)量測樣品之濃度。藉由在 215nm下SEC-UPLC評估樣品之純度，其範圍在75%與99%之間。
藉由SPR量測結合動力學
藉由表面電漿子共振(SPR)量測對於重組人類sc-uPA蛋白(SEQ ID NO：27)之結合親和力。
在BiacoreTM器具(GE Healthcare)上進行實驗且用BIAcore 4000分析評估軟體分析。分別經由胺偶合將抗人類uPA mAb變異體以150-600 RU直接固定於CM5感測器晶片(GE Healthcare；目錄號BR-1000-12)之流動池上。用含有1% BSA緩衝液之HBS-N(GE Healthcare目錄BR-1006-70)以3倍稀釋因數在1000-0.13nM範圍內稀釋重組人類sc-uPA。注射重組人類sc-uPA 60秒，繼而為600秒解離期。在25℃下且在30μL/min之流速下量測結合曲線。以30μl/min用pH 1.5甘胺酸進行晶片表面再生25秒。藉由用1：1結合模型擬合進行動力學參數測定。計算結合親和力且陳述於下表20中。
結論為可由0266-0000-0010-VL_N90E、0266-0000-0010-VL_N90H、0266-0000-0010-VL_N90Q、0266-0000-0010-VL_N90S及0266-0000-0010-VL_N90T移除潛在去醯胺位點「N90S91」而不會喪失對重組人類sc-uPA之親和力。
實施例20.藉由針對人類uPA(SEQ ID NO：1)對mAb 0266-0000-0043進行HDX-MS進行抗原決定基定位 對HDX-MS之介紹
HDX-MS技術利用蛋白質之氫交換(HDX)可由質譜(mass spectrometry；MS)容易地跟蹤。藉由用含氘之水性溶劑替換含氫之水性溶劑，在蛋白質中之既定位點併入氘原子將使質量增加1 Da。此質量增加可藉由質譜分析來自交換反應之中止樣品而隨時間變化進行監測。氘標記資訊可藉由中止條件下之胃蛋白酶消化繼而所得肽之質量增加而侷限於蛋白質之特定區域。
HDX-MS之一個用途為藉由鑑別蛋白質-蛋白質複合物形成後減少之氫交換的區域來探測參與分子相互作用之位點。通常，結合界面藉由由於溶劑之空間排阻所致的氫交換率顯著減少來揭示。結合界面典型地藉由短培育時間(10秒-40秒)期間所觀察的氫交換減少來揭示。當採用更長培育時間時，通常發現結合界面內之氫交換減少會變得穩定。HDX-MS之另一用途為分配分子內之異位變化，其特徵為對於短培育時間(亦即10秒-20秒)氫交換水準無變化，而在長培育時間(40秒及40秒以上)後觀察到氫交換減少。蛋白質-蛋白質複合物形成及藉由複合物形成誘導之異位變化可簡單 地藉由HDX-MS藉由隨時間變化量測各別結合搭配物存在及不存在下任一蛋白質成員中所併入之氘的總量來偵測。HDX-MS技術使用天然組分，亦即目標蛋白及抗體/Fab片段，且在溶液中進行(對於HDX-MS技術之當前綜述，參見Wales及Engen,Mass Spectrom.Rev.25,158(2006))。
材料及方法
所用蛋白質批料為人類uPA(huPA)：人類重組sc-uPA(SEQ ID NO：1)及mAb 0266-0000-0043(SEQ ID NO：21及22).所有蛋白質均在實驗前將緩衝液更換為PBS(pH 7.4)。
在nanoACQUITY UPLC系統上用耦接於Synapt G2質譜儀(Waters公司)之HDX技術(Waters公司)進行HDX實驗。Waters HDX系統含有由LeapShell軟體(Leap Technologies公司/Waters公司)操作之Leap機器人(H/D-x PAL；Waters公司)，其執行起始氘交換反應、反應時間控制、中止反應、注射於UPLC系統上及消化時間控制。Leap機器人配備有兩個分別維持在20℃下以用於緩衝液儲存及HDX反應及維持在2℃下以用於儲存蛋白質及中止溶液的溫度控制組套。Waters HDX系統另外含有在1℃下容納前管柱及分析管柱以及LC管及轉換閥的溫度控制腔室。溫度控制腔室在25℃下容納胃蛋白酶管柱。為進行線內胃蛋白酶消化，使用100μL/min之等度流速(0.1%甲酸：CH3CN95：5)將100μL含有300 pmol人類uPA之中止樣品裝載於置於25℃下之Poroszyme®固定胃蛋白酶濾筒(2.1×30mm(Applied Biosystems))上，且使其在該濾筒上穿過。在VanGuard前管柱BEH C18 1.7μm(2.1×5mm(Waters公司))上捕獲所得肽且去鹽。隨後，轉換閥以使前管柱與分析管柱UPLC-BEH C18 1.7μm(1×100mm(Waters公司))成直線，且使用以40μl/min自nanoAQUITY UPLC系統(Waters公司)傳遞之9分鐘10-50% B之梯度分離肽。移動相由A：0.1%甲酸及B：0.1%甲酸之CH3CN溶液組成。以正離子模式使用Synapt G2質譜儀(Waters公司)獲得ESI MS資料及各 別高能量(MSE)實驗。使用白胺酸-腦啡肽作為鎖定質量([M+H]+離子，在m/z556.2771下)且以連續模式收集資料(對於進一步描述，參見Andersen及Faber,Int.J.Mass Spec.,302,139-148(2011))。
資料分析
在各別實驗中使用標準MSE方法鑑別胃蛋白酶肽，其中肽及片段利用Synapt G2(Waters公司)之離子遷移特性進一步比對。使用ProteinLynx Global Server 2.5版(Waters公司)處理MSE資料。在DynamX 2.0軟體(Waters公司)中處理HDX-MS原始資料文件。DynamX自動進行鎖定質量校正及氘併入測定(亦即氘化肽之質心測定)。另外，手動檢測所有肽以確保軟體進行正確峰及氘化分配。
抗原決定基定位實驗
藉由在mAb 0266-0000-0043存在或不存在下用相應氘化緩衝液(亦即在D2O中製備之PBS，最終96% D2O，pH 7.4(未校正值))16倍稀釋huPA起始醯胺氫/氘交換(HDX)。在20℃下且在含有4μM huPA下及2.4μM mAb不存在或存在下執行所有HDX反應，由此得到1.2倍莫耳過量之mAb結合位點。在範圍為10秒至480秒之適當時間間隔下，藉由添加50μl冰冷中止緩衝液(1.35M參(2-羧基乙基)膦)中止50μl HDX反應物之等分試樣，使最終pH值為2.5(未校正值)。
結果及論述
在抗uPA不存在或存在下監測163個肽(覆蓋huPA之一級序列的93%)的HDX-MS時程達10、20、40、60、120、240及480秒。
所得資料使得抗uPA針對huPA之抗原決定基結合位點分配於分別覆蓋殘基167-175及218-224之兩個線性序列。此展示於表22中，表22展現藉由HDX-MS分析鑑別抗uPA(mAb 0266-0000-0043)對於人類uPA(SEQ ID NO：1)之抗原決定基。氘交換反應後，用胃蛋白酶消化huPA，得到本發明 之胃蛋白酶肽，其經鑑別以展示在至少10秒、20秒及40秒之短培育時間時在抗uPA存在下存在HDX保護。亦存在經鑑別以展示在抗uPA存在下交換不受影響且用於所分配異位區域的胃蛋白酶肽。
另外，HDX-MS研究揭示異位偶合位點之擴展網路，其顯示結合於抗uPA後氘併入降低為覆蓋殘基1-33、67-80、187-215、225-234、243-256、260-274、291-306、322-341、375-389及397-410。此展示於表21(藉由HDX-MS分析鑑別之抗uPA(mAb 0266-0000-0043)對於人類uPA(SEQ ID NO：1)之異位區域)中。氘交換反應後，用胃蛋白酶消化huPA，得到本發明之胃蛋白酶肽，其經鑑別以展示在培育時間長於40秒時在抗uPA存在下存在氫與氘交換(HDX)保護。亦存在經鑑別以展示在抗uPA存在下HDX不受影響且用於所分配異位區域的胃蛋白酶肽。
僅在結合於抗uPA後觀察到氘併入變得降低。由此，該等資料併入自可撓性無配體總體變換為較具剛性抗uPA結合總體的異位群組。
另外，HDX-MS能夠將抗uPA(mAb 0266-0000-0043)對於huPA(SEQ ID NO：1)之抗原決定基結合位點分配給兩個覆蓋殘基167-175及218-224之線性序列。異位群組自可撓性無配體總體變換為較具剛性抗uPA結合總體之提示由結合於抗uPA後氘併入降低為覆蓋殘基1-33、67-80、187-215、225-234、243-256、260-274、291-300、320-341、375-389及402-410提供。
A-EX：抗體結合後存在HDX保護，其表明培育40秒及40秒以上時至少三個時間點的異位區域(>2 SD.)。
N：抗體結合後無HDX保護(<2 SD.)。
實施例21.mAb 0266-0000-0043之作用模式
四個區段已確定為參與絲胺酸蛋白酶活化後之顯著構形變化(Freer等人，1970,Biochemistry 9,1997-2009；Huber & Bode 1978,Acc Chem Res 11,114-122；Jiang等人，2013,Biochem J 449,161-166)。活化環(16-21牛胰凝乳蛋白酶原；159-164人類sc-uPA)，Lys158-Ile159肽鍵裂解後其再定位，從而在Ile159之α-胺基與Asp355之埋入側鏈羧基之間形成內部離子對。
自分解環(142-154牛胰凝乳蛋白酶原；299-311人類sc-uPA)，其藉由Phe298及Gly299與Ile159之直接相互作用使活性酶中之活化環穩定。氧陰離子穩定環(184-194牛胰凝乳蛋白酶原；343-355人類sc-uPA)在活性酶中形成主鏈介導之正電荷袋，其活化經切割肽鍵之羰基且使四面體中間物之帶負電氧陰離子穩定。最後，S1進入框(216-223牛胰凝乳蛋白酶原；377-384人類sc-uPA)形成S1袋，其決定蛋白酶之特異性且與肽受質相互作用而促成受質水解。
mAb-112藉由與自分解環相互作用而使N端自活化袋移位來抑制人類uPA活性(Jiang等人，2013,Biochem J 449,161-166)，而小鼠mU1不能抑制人類uPA而僅抑制小鼠uPA，其係藉由與對應於人類sc-uPA胺基酸殘基Gly183、Val185(小鼠uPA中之Pro)、Thr186(小鼠uPA中之Pro)、Arg223(小鼠uPA中之Lys)、Asn225(小鼠uPA中之Ser)、Asn227(小鼠uPA中之Tyr)、Thr228(小鼠uPA中之Asn)、Gln229(小鼠uPA中之Pro)之殘基相互作用而對自分解環對接及S1袋產生異位抑制且使氧陰離子孔變形達成(Kromann-Hansen等人，2013,Biochemistry 52,7114-7126)；mAb 0266-0000-0043獨特之處在於經由覆蓋Ile167-Ala175及Tyr218-Leu224之抗原決定基抑制人類uPA，其誘導1-33、67-80、187-215、230-234、243-256、260-274、291-306、322-341、375-389及397-410區域之構形發生協同變化，包括(但不限於)再組織自分解環及S1進入框且同時異位抑制uPA活化及活性。經由 Ile167-Ala175及Tyr218-Leu224抗原決定基誘導之構形變化的擴展網路暗示可由以任何受異位影響之位點為目標的mAb誘導等效構形變化。
儘管本文中已說明且描述本發明之某些特徵，但一般技術者現在應能設想諸多修改、替代、變化及等效物。因此，應瞭解，隨附申請專利範圍意欲將所有該等修改及變化覆蓋為屬於本發明之真實精神。
<110> 諾佛 儂迪克股份有限公司 諾佛 儂迪克股份有限公司，諾佛 儂迪克股份有限公司
<120> 結合尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物之抗體
<130> 8692
<160> 26
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 411
<212> PRT
<213> 人類
<400> 1
<210> 2
<211> 1296
<212> DNA
<213> 人類
<400> 2
<210> 3
<211> 411
<212> PRT
<213> 猴
<400> 3
<210> 4
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<212> DNA
<213> 猴
<400> 4
<210> 5
<211> 122
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 5
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<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠
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<211> 119
<212> PRT
<213> 小鼠
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<212> PRT
<213> 小鼠
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<210> 9
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<213> 小鼠
<400> 9
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<211> 17
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<210> 11
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<210> 15
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<213> 重組-小鼠
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<213> 重組-小鼠
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<213> 人類化-人類
<400> 17
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<212> PRT
<213> 人類化-人類
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<212> PRT
<213> 小鼠
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<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 20
<210> 21
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<212> PRT
<213> 人類化-人類
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<210> 22
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<213> 人類化-人類
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<212> DNA
<213> 小鼠
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<212> DNA
<213> 小鼠
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<212> DNA
<213> 人類化-人類
<400> 25
<210> 26
<211> 645
<212> DNA
<213> 人類化-人類
<400> 26

Claims (15)

  1. 一種能夠結合於人類uPA之抗體或其抗原結合片段，其特徵在於其抑制人類tc-uPA之蛋白分解活性且抑制人類sc-uPA自人類uPA之蛋白分解非活性形式活化為人類uPA之蛋白分解活性形式。
  2. 如具體實例1之抗體或其片段，其中該抗體抑制受體結合人類uPA與非受體結合人類uPA兩者。
  3. 如申請專利範圍第1項至第2項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體亦抑制tc-uPA之蛋白分解活性及/或抑制sc-uPA自uPA之蛋白分解非活性形式活化為uPA之蛋白分解活性形式，其中該uPA來自其他物種，諸如黑猩猩(chimpanzee)、食蟹獼猴(cynomolgus monkey)、恆河猴(rhesus monkey)、小鼠、大鼠、兔、母牛、羊、豬或駱駝uPA。
  4. 如申請專利範圍第1項、第2項或第3項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其結合於人類uPA(SEQ ID NO：1)上之不連續抗原決定基/結合區，其中該不連續抗原決定基/結合區之第一結合部分由SEQ ID NO：1之胺基酸第167號至第175號界定，且該不連續抗原決定基/結合區之第二結合部分由SEQ ID NO：1之胺基酸第218號至第224號界定。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之重鏈包含：具有SEQ ID NO：7之胺基酸殘基31(Kabat及順序編號)至35(Kabat及順序編號)(SYTMS)之CDR1序列；及/或具有SEQ ID NO：7之胺基酸50(Kabat及順序編號)至65(Kabat；順序編號66)(TISGGGSHIYYADSVKG)之CDR2序列；及/或具有SEQ ID NO：7之胺基酸殘基95(Kabat；順序編號99)至102(Kabat；順序編號108)(DGRDGSWFAY)之CDR3序列，其中D95(Kabat；順序編號99)可突變為除D以外之任何胺基酸，及/或G96 (Kabat；順序編號100)可突變為除G以外之任何胺基酸，及/或D98(Kabat；順序編號102)可突變為除D以外之任何胺基酸，及/或G99(Kabat；順序編號103)可突變為除G以外之任何胺基酸；
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之輕鏈包含：具有SEQ ID NO：8之胺基酸殘基24(Kabat及順序編號)至34(Kabat及順序編號)(RTSQSIGDYLH)之CDR1序列，及/或具有SEQ ID NO：8之胺基酸殘基50(Kabat及順序編號)至56(Kabat及順序編號)(YVSQSIS)之CDR2序列，及/或具有SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89(Kabat及順序編號)至97(Kabat及順序編號)(QNSHSFPLT)之CDR3序列，其中此等胺基酸殘基中之一者或兩者可經不同胺基酸取代，尤其N90可突變為除N以外之任何胺基酸，及/或S91可突變為除S以外之任何胺基酸。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之重鏈包含：具有SEQ ID NO：7之胺基酸殘基31(Kabat及順序編號)至35(Kabat及順序編號)(SYTMS)之CDR1序列；及具有SEQ ID NO：7之胺基酸50(Kabat及順序編號)至65(Kabat；順序編號66)(TISGGGSHIYYADSVKG)之CDR2序列；及具有SEQ ID NO：7之胺基酸殘基95(Kabat；順序編號99)至102(Kabat；順序編號108)(DGRDGSWFAY)之CDR3序列，且其中該抗體之輕鏈包含：具有SEQ ID NO 8之胺基酸殘基24(Kabat及順序編號)至34(Kabat及順序編號)(RTSQSIGDYLH)之CDR1序列；及具有SEQ ID NO 8之胺基酸殘基50(Kabat及順序編號)至56(Kabat 及順序編號)(YVSQSIS)之CDR2序列；及具有胺基酸殘基89(Kabat及順序編號)至97之CDR3序列。
  8. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之人類化抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈包含：位於胺基酸殘基31-35(順序編號)中之包含SEQ ID NO：9之CDR-H1，及位於胺基酸殘基50-66(順序編號)中之包含SEQ ID NO：10之CDR-H2，及位於胺基酸殘基99-108(順序編號)中之包含SEQ ID NO：11之CDR-H3，且其中該輕鏈包含：位於胺基酸殘基24-34(順序編號)中之包含SEQ ID NO：12之CDR-L1，及位於胺基酸殘基50-56(順序編號)中之包含SEQ ID NO：13之CDR-L2，及位於胺基酸殘基89-97(順序編號)中之包含SEQ ID NO：14之CDR-L3。
  9. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其與如申請專利範圍第8項之人類化抗體競爭結合至人類uPA(SEQ ID NO：1)或食蟹獼猴uPA(SEQ ID NO：3)。
  10. 如申請專利範圍第1項至第4項或第8項至第9項中任一項之人類化抗體或其抗原結合片段，其包括包含SEQ ID NO：21之重鏈及輕鏈SEQ ID NO：22。
  11. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其與參考抗體競爭結合至人類uPA(SEQ ID NO：1)或食蟹獼猴uPA(SEQ ID NO：3)，其中該參考抗體包括包含SEQ ID NO：7之可變重鏈及包含SEQ ID NO：8之可變輕鏈，及/或參考抗體包括包含SEQ ID NO：21之重鏈及輕鏈SEQ ID NO：22。
  12. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體選自由以下組成之群：單株抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、人類抗體之抗原結合區、scFv、Fab、F(ab')2、Fv及單鏈抗體。
  13. 一種用作醫藥品的如前述申請專利範圍中任一項之抗體或其抗原結合 片段，該醫藥品係用於治療諸如類風濕性關節炎之自體免疫疾病及/或慢性發炎。
  14. 一種抗uPA抗體鑑別方法，其包含以下步驟：(a)產生抗uPA抗體；(b)自步驟(a)中所產生之該等抗體鑑別抑制人類tc-uPA之蛋白分解活性的抗體；(c)自步驟(a)中所產生之該等抗體鑑別抑制人類sc-uPA自人類uPA之蛋白分解非活性形式活化為人類uPA之蛋白分解活性形式的抗體；及(d)選擇在步驟(b)與(c)中均具抑制性之抗體。
  15. 一種產生能夠結合於人類uPA之抗體或其抗原結合片段之方法，其中該抗體根據如申請專利範圍第14項之鑑別方法鑑別，且其中所產生之抗體可根據申請專利範圍第11項至第13項中之任一項使用。
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