CN105612183A

CN105612183A - 结合尿激酶纤溶酶原激活物的抗体

Info

Publication number: CN105612183A
Application number: CN201480040491.0A
Authority: CN
Inventors: S.帕德克杰; J.帕斯; G.罗德; K.阿姆霍特; P.A.厄
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2013-07-15
Filing date: 2014-07-15
Publication date: 2016-05-25
Also published as: TW201536810A; EP3022229A1; US9908944B2; WO2015007727A1; JP2016527225A; US20160159924A1

Abstract

本发明涉及鉴定尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)抗体的方法。本发明也涉及能够结合uPA和能够减少或抑制uPA活性的抗体。此外，本发明涉及所述抗体的用途，例如治疗和药学用途。

Description

结合尿激酶纤溶酶原激活物的抗体

发明技术领域

本发明涉及鉴定尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)抗体的方法。本发明也涉及能够结合uPA并能够抑制或阻断uPA活性的抗体。此外，本发明涉及这类抗体的用途，例如治疗和药物用途。

发明背景

尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)是一种胞外丝氨酸蛋白酶。UPA由3个结构域组成：1)生长因子结构域(GFD)，其介导uPA与其受体uPAR结合；2)uPA的三环结构域(kringledomain)，其被描述为与整联蛋白相互作用；和3)催化结构域，其介导uPA的蛋白水解功能。uPA的主要蛋白水解功能是将无活性的酶原纤溶酶原(Plg)转化为有活性的丝氨酸蛋白酶纤溶酶。UPA作为单链酶原(sc-uPA)产生，其在Lys158-Ile159肽键(相对于人sc-uPA的编号)被内蛋白水解性切割(endoproteolyticallycleaved)。所得的双链形式的uPA(tc-uPA)由单一的二硫桥连接在一起。相比tc-uPA，sc-uPA的蛋白水解活性是最小的，但sc-uPA却具有某些固有的蛋白水解活性。uPA的催化结构域以有活性和无活性构象的两种结构构象的平衡状态存在。在sc-uPA中，催化结构域的无活性构象是有利的。Lys158-Ile159肽键的水解改变了这些结构构象之间的动态平衡，以有助于活性形式(Jiang等人,Biochem.J.449：161–166,2013)。

在健康生物体中，尿道和胃肠道外的uPA的存在通常限于循环粒细胞和经历重塑的组织中的某些细胞种类。在疾病期间，也发现uPA在炎性病症和癌症病灶的部位。动物研究已经证明了uPA在癌症和在炎性病症(包括关节炎疾病)中的功能性作用。因此拮抗uPA在癌症和炎性疾病(例如类风湿性关节炎和银屑病性关节炎)的治疗中是合意的。

专利文件US8062637和WO03033009提供了uPA在关节炎疾病中的功能性作用的实验证据。所述文件进一步描述了在受试者中改善炎性疾病的效果的方法，包括将拮抗剂给予受试者，所述拮抗剂包括特异性地结合uPA的抗体。文件US8062637和WO03033009描述了结合uPA的抗体的可能用途，但是这些文件都没有描述或提供结合uPA的任何抗体的数据。

专利文件WO2006050177描述了鉴定抗uPA抗体的方法以及这些抗体在治疗炎性疾病中的潜在用途，所述抗体对对应于uPA的三环结构域的86个氨基酸长度的表位具有特异性。WO2006050177专利文件没有描述或提供结合uPA的任何抗体的数据。此外，预测结合至三环结构域的抗体对uPA的蛋白水解功能无作用，因为uPA的蛋白水解性能主要与催化结构域相关。

专利文件WO2005048822描述了两种抗uPA抗体，ATN-291和ATN-292，其特异性地结合至uPA的生长因子结构域(GFD)(ATN-292)和三环结构域(ATN-291)。WO2005048822专利文件进一步描述了这些抗体对于治疗癌症或其它疾病的潜在用途。预测结合至GFD或三环结构域的抗体对uPA的蛋白水解功能无作用，因为uPA的蛋白水解性质主要与催化结构域相关。

专利文件US5496549描述了双特异性抗体，其中两个特异性之一是被三种抗uPA抗体(UK1-3、UK1-87和UK1-6)中的任一个赋予的。另一特异性针对血小板表面蛋白并且该专利进一步描述了这些双特异性抗体递送活性生物物质(在本案中是uPA)的潜在用途，用于治疗血栓形成或其它心血管疾病。这三种抗体都不抑制uPA的蛋白水解活性，但经设计在血小板沉积部位递送或浓缩uPA。

如上所述，结合uPA的抗体是已知的；和它们在炎性疾病的治疗中的用途已经被设想(envisaged)。然而迄今为止，抗uPA抗体尚未进入临床试验。因此，对于治疗性抗uPA抗体，仍然有未满足的需要，例如用于炎性疾病患者或癌症患者。

本文公开的是具有新的特征的抗uPA抗体。这些抗体适合于药物开发。这样的抗体对患有癌症或炎性疾病的个体的生活质量可能具有重要影响。

发明概述

本发明涉及能够结合至人uPA的抗体或其抗原-结合片段，其特征在于它们抑制uPA的蛋白水解活性形式的蛋白水解活性和抑制单链uPA(sc-uPA)自uPA的蛋白水解无活性形式至uPA的蛋白水解活性形式的激活。首次，鉴定了对于人uPA具有特异性的抑制性单克隆抗体，其具有该双重功能性。这些抗体抑制(活性)纤溶酶所致的uPA的酶原形式sc-uPA激活，和同时所述抗体抑制双链uPA(tc-uPA)朝向(无活性)酶原纤溶酶原的蛋白水解活性。所述抗体因此同时抑制sc-uPA和纤溶酶原之间的相互的酶原激活环的蛋白水解反应，提供更强效的总体蛋白水解级联反应的抑制。相比仅抑制tc-uPA的蛋白水解活性的抗体，双重作用抗体的优势以一组小鼠抗体，mU1和mU3来说明。在基于细胞的测定和在体内小鼠模型中(Lund等人,J.Biol.Chem.283：32506-32515,2008)，相比mU3，双重作用小鼠抗体mU1具有结合小鼠uPA和抑制小鼠tc-uPA蛋白水解功能的类似活性，但具有功能性地抑制小鼠uPA活性的优越能力。这些抗体对小鼠uPA具有特异性，并因此预期不结合人uPA，因此不适用于本申请的范围内。它们与本发明所述的抗uPA抗体不具有所有的相同的新的特征或药物开发的可能性。

已经公布了若干现有技术抗uPA抗体在人uPA或在小鼠uPA上的结合部位(Jiang等人,2013,BiochemJ449,161-166；Kromann-Hansen等人,2013,Biochemistry52,7114-7126)。我们描述了结合至人uPA上的新的表位的双重作用抗uPA抗体，并且证明了该抗体诱导贯穿人uPA多肽的协同构象变化，其涉及uPA的所有三个主要结构域(GFD、三环和催化结构域)中的氨基酸。除了新的表位和新的抑制所述酶的方式外，该跨越结构域的构象变化也是空前的。

本发明的一方面，所述抗体能够结合至和抑制受体-结合的uPA和非-受体-结合的uPA两者。这增加了优势，因为uPA的某些蛋白水解功能被证明依赖于结合至uPA受体uPAR，而uPA的其它蛋白水解功能被证明是独立于uPAR。专利文件WO03033009A中公开的数据说明了uPA在小鼠关节炎模型中的作用，其可能依赖于uPAR并且也依赖于uPA的蛋白水解活性。能够抑制受体-结合的uPA和非-受体-结合的uPA两者的功能的抗体因此具有优势，因为uPA的所有形式都将被这样的抗体抑制，和不知道对于本文所述的任何指定人类疾病，uPA的疾病相关功能依赖于结合至uPAR的程度如何。鉴定抑制sc-uPA激活和同时能够以高亲和力结合至受体-结合的uPA的抗体，这并非是不重要的。抗体mAb-PUK已经证明了这一点，在文献上公开的所述抗体能够抑制sc-uPA激活，但相比非-受体-结合的sc-uPA，结合sc-uPA(其结合至uPAR)的能力减少了>10倍(Botkjaer等人,BiochemJ.438：39-51,2011)。MAb-PUK对tc-uPA活性无作用和与本发明所述的抗uPA抗体不具有相同的新的特征，正如实施例14中所证明的。

本发明的另一方面，所述抗体在炎性细胞中能够结合至和抑制内源表达的人uPA。在以下实施例部分中的实施例9说明了这一点，其中本发明的抗体在原代人巨噬细胞中抑制内源表达的uPA。这证明了抗体抑制天然形式的uPA的能力，所述天然形式存在于疾病相关的细胞类型中。尚不知道已知uPA抗体在原代人巨噬细胞中能够抑制uPA(包括内源uPA)的蛋白水解活性。

本发明的另一方面，所述抗体能够结合至和抑制人uPA并且也能够结合至和抑制非人类灵长类uPA。这增加了本发明的抗体的独特优势，因为尚不知道已知uPA抗体结合至或抑制来自非人灵长类例如食蟹猴的uPA，这表明在常用于开发药物的临床前研究的这些动物中不能测试已知抗体。

本发明的抗uPA抗体可以用作药物，用于治疗患有一种或多种自身免疫性疾病和/或慢性炎性疾病的个体和/或患有癌症的个体。因此，本发明也涉及治疗患有一种或多种自身免疫性疾病和/或炎性疾病的个体和/或患有癌症的个体的方法。

本发明也涉及鉴定抗uPA抗体的方法。已经设计了该免疫和筛选方法，以允许鉴定本发明的双重作用抗uPA抗体。鉴定双重作用抗uPA抗体的方法包括以下步骤：(a)产生抗uPA抗体；(b)自步骤(a)中产生的抗体中鉴定抗体，其抑制tc-uPA的蛋白水解活性；(c)自步骤(a)中产生的抗体中鉴定抗体，其抑制sc-uPA自蛋白水解无活性形式至蛋白水解活性形式的激活；和(d)选择抗体，其在步骤(b)和(c)中都是抑制性的。

附图简述

图1：流式细胞术分析显示Alexa647-缀合的0266-0000-0010和0266-0000-0015分别与原代人巨噬细胞的剂量依赖性结合。

图2：代表0266-0000-0010和hz0266-0000-0010抗体的VH、VL和CDR氨基酸序列(更详细描述见实施例13)。

图3：mAb0266-0000-0043的SDS-PAGE凝胶，还原型(R)和非还原型(NR)(参见实施例16)。

图4：mAb0266-0000-0043的SE-HPLC分析(参见实施例16)。

图5：偶联的酶原激活测定的原理(参见实施例16)。

图6：在偶联的酶原激活测定中的人uPA的mAbrec0266-0000-0010所致的抑制(参见实施例16)。

图7：在偶联的酶原激活测定中的人uPA的mAb0266-0000-0043所致的抑制(参见实施例16)。

图8：在偶联的酶原激活测定中的食蟹猴uPA的mAbrec0266-0000-0010所致的抑制(参见实施例16)。

图9：在偶联的酶原激活测定中的食蟹猴uPA的mAb0266-0000-0043所致的抑制(参见实施例16)。

序列的简述

SEQIDNO：1代表重组人sc-uPA的氨基酸序列。

SEQIDNO：2代表重组人sc-uPA的DNA序列。

SEQIDNO：3代表野生型食蟹猴sc-uPA的氨基酸序列。

SEQIDNO：4代表野生型食蟹猴sc-uPA的DNA序列。

SEQIDNO：5代表0266-0000-0015的VH序列。

SEQIDNO：6代表0266-0000-0015的VL序列。

SEQIDNO：7代表0266-0000-0010的VH序列。

SEQIDNO：8代表0266-0000-0010的VL序列。

SEQIDNO：9代表0266-0000-0010的CDR-H1序列。

SEQIDNO：10代表0266-0000-0010的CDR-H2序列。

SEQIDNO：11代表0266-0000-0010的CDR-H3序列。

SEQIDNO：12代表0266-0000-0010的CDR-L1序列。

SEQIDNO：13代表0266-0000-0010的CDR-L2序列。

SEQIDNO：14代表0266-0000-0010的CDR-L3序列。

SEQIDNO：15代表VH3_21/JH4序列。

SEQIDNO：16代表V6D_41/JK4序列。

SEQIDNO：17代表hz0266-0000-0010的VH序列。

SEQIDNO：18代表hz0266-0000-0010的VL序列。

SEQIDNO：19代表rec0266-0000-0010的重链序列。

SEQIDNO：20代表rec0266-0000-0010的轻链序列。

SEQIDNO：21代表0266-0000-0043的重链序列。

SEQIDNO：22代表0266-0000-0043的轻链序列。

SEQIDNO：23代表rec0266-0000-0010的重链的DNA序列。

SEQIDNO：24代表mAbrec0266-0000-0010的轻链的DNA序列。

SEQIDNO：25代表mAb0266-0000-0043的重链的DNA序列。

SEQIDNO：26代表mAb0266-0000-0043的轻链的DNA序列。

发明详述

一方面，本发明提供能够结合至人uPA的抗体或其抗原-结合片段，其特征在于它们抑制tc-uPA的蛋白水解活性和抑制sc-uPA自uPA的蛋白水解无活性形式至uPA的蛋白水解活性形式的激活。

尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)：

UPA是一种胞外丝氨酸蛋白酶，含有411个氨基酸(SEQIDNO：1)(Andreasen等人,CellMol.LifeSci.57：25-40,2000；Ulisse等人,CurrentCancerDrugTargets,9：32-71,2009)。UPA由3个结构域组成：1)N-末端生长因子-样结构域(GFD)，其介导uPA与其细胞表面-结合的受体uPAR的结合；2)uPA的三环结构域，其被描述为与整联蛋白相互作用；和3)uPA的C-末端催化结构域，其介导其蛋白水解活性。UPA在产生时是单链酶原(sc-uPA)，其在Lys158-Ile159肽键(相对于人sc-uPA的编号)被内蛋白水解性切割。所得的uPA的双链形式(tc-uPA)由单个二硫桥连接在一起。相比tc-uPA，sc-uPA的蛋白水解活性是最小的，但sc-uPA却具有某些固有的蛋白水解活性。uPA的催化结构域以有活性和无活性构象的两种结构构象的平衡状态存在。在sc-uPA中，催化结构域的无活性构象是有利的。Lys158-Ile159肽键的水解改变了这些结构构象之间的动态平衡，以有利于活性形式(Jiang等人,Biochem.J.449：161–166,2013)。uPA的主要蛋白水解功能是将无活性酶原纤溶酶原(Plg)转化为活性丝氨酸蛋白酶纤溶酶。纤溶酶原是肝分泌的酶原，在血浆中存在~2μM，并且也在胞外在细胞间隙中以高浓度存在。反过来，纤溶酶是sc-uPA的最强效激活物，形成sc-uPA和纤溶酶原之间的所谓的相互的酶原激活环。sc-uPA和tc-uPA都可以亚毫微摩尔级亲和力结合至糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定的细胞表面受体uPAR(CD87)，其有助于uPA活性的空间限制。除了时间和空间上控制酶的激活外，uPA和纤溶酶的活性分别由它们的内源抑制剂纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)和α2-抗纤溶酶(α2-AP)而进一步平衡。这些丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpins)与其同源的蛋白酶形成不可逆的共价复合物。

定义

uPA：

术语尿激酶纤溶酶原激活物和uPA在本文中可互换使用，和包括任何天然存在的、内源产生的和/或重组形式的uPA，其可以是衍生自任何合适的生物体。例如，uPA可以是单链酶原形式(sc-uPA)和双链活性形式(tc-uPA)。术语尿激酶纤溶酶原激活物和uPA此外包括sc-uPA和tc-uPA的所有结构构象，包括无活性和有活性构象的催化结构域。术语尿激酶纤溶酶原激活物和uPA此外包括受体-结合的和非-受体-结合的形式的uPA两者、以及任何亚细胞定位的uPA，包括在细胞表面上发现的uPA或在胞内发现的uPA。术语尿激酶纤溶酶原激活物和uPA此外包括uPA的任何前体形式和uPA的任何降解形式。术语尿激酶纤溶酶原激活物和uPA此外包括人uPA或来自另一物种的uPA，例如哺乳动物uPA，例如来自以下的uPA：灵长类(例如黑猩猩、食蟹猴或恒河猴)；啮齿类(例如小鼠或大鼠)、兔类(例如兔)或偶蹄类(例如牛、绵羊、猪或骆驼)。术语尿激酶纤溶酶原激活物和uPA此外包括重组产生的uPA。这包括“经重组基因技术产生的”任何uPA，包括但不限于在哺乳动物细胞系或细菌或酵母菌中表达的蛋白质。

术语“重组”不指相对于天然存在的形式而言已经发生改变的蛋白，因为重组产生的蛋白尽可能地接近蛋白的天然存在形式。本申请中使用的术语“重组”因此适用于野生型以及突变型形式的蛋白。

单链uPA(sc-uPA)：

术语单链uPA(sc-uPA)用于本文，是指单链411个氨基酸酶原形式(或原形式(pro-form))的人uPA，其在(人sc-uPA的)Lys158-Ile159肽键未经历蛋白水解。在文献中Sc-uPA可互换地指sc-uPA或前-uPA。术语sc-uPA此外包括sc-uPA的所有结构构象，包括催化结构域的无活性和有活性的构象。术语sc-uPA此外包括受体-结合的和非-受体-结合的形式的sc-uPA两者。术语sc-uPA包括来自所有物种(包括人和其它相关物种)的sc-uPA。

双链uPA(tc-uPA)：

术语双链uPA(tc-uPA)用于本文，是指双链形式的人uPA，其在(人sc-uPA的)Lys158-Ile159肽键已经经历蛋白水解切割。术语tc-uPA此外包括tc-uPA的所有结构构象，包括催化结构域的无活性和有活性的构象。术语tc-uPA此外包括受体-结合的和非-受体-结合的形式的tc-uPA两者。术语tc-uPA也包括来自所有物种(包括人和其它相关物种)的tc-uPA。

uPA的无活性形式：

术语“uPA的无活性形式”或“蛋白水解无活性uPA”或“无活性uPA”用于本文，是指蛋白水解无活性的或具有显著地减少的蛋白水解活性(即50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%的蛋白水解活性的减少，相比阴性对照)的uPA的所有形式。术语“uPA的无活性形式”或“蛋白水解无活性uPA”或“无活性uPA”此外包括sc-uPA和tc-uPA两者，条件是这些形式的uPA处于这样的状态：其中它们是蛋白水解无活性的或具有显著地减少的蛋白水解活性。术语“uPA的无活性形式”或“蛋白水解无活性uPA”或“无活性uPA”此外包括uPA的所有结构构象，条件是uPA的这些结构构象是蛋白水解无活性的或具有显著地减少的蛋白水解活性。术语“uPA的无活性形式”或“蛋白水解无活性uPA”或“无活性uPA”此外包括受体-结合的和非-受体-结合的形式的uPA两者。术语“uPA的无活性形式”或“蛋白水解无活性uPA”或“无活性uPA”此外包括来自所有物种(包括人和其它相关物种)的uPA。

uPA的活性形式：

术语“uPA的活性形式”或“蛋白水解活性uPA”或“活性uPA”用于本文，是指蛋白水解活性的和不具有显著地减少的蛋白水解活性的uPA的所有形式。术语“uPA的活性形式”或“蛋白水解活性uPA”或“活性uPA”此外包括sc-uPA和tc-uPA两者，条件是这些形式的uPA处于这样的状态：其中它们是蛋白水解活性的和不具有显著地减少的蛋白水解活性(即50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%的蛋白水解活性减少，相对于阴性对照)。术语“uPA的活性形式”或“蛋白水解活性uPA”或“活性uPA”此外包括uPA的所有结构构象，条件是uPA的这些结构构象是蛋白水解活性的和不具有显著地减少的蛋白水解活性。术语“uPA的活性形式”或“蛋白水解活性uPA”或“活性uPA”此外包括受体-结合的和非-受体-结合的形式的uPA两者。术语“uPA的活性形式”或“蛋白水解活性uPA”或“活性uPA”此外包括来自所有物种(包括人和其它相关物种)的uPA。

双重作用抗uPA抗体：

本发明的抗uPA抗体的一个重要方面是它们的双重作用模式，在本文中称为“双重作用”抗体。本发明的抗体同时抑制人tc-uPA蛋白水解活性和人sc-uPA自人uPA的蛋白水解无活性形式至人uPA的蛋白水解活性形式的激活。

sc-uPA激活：

本发明描述了抗体，其抑制sc-uPA自uPA的蛋白水解无活性形式至uPA的蛋白水解活性形式的激活。sc-uPA激活是多步骤过程，其在文献中尚未被完全描述。以下不应被视为sc-uPA激活中所涉及的步骤的详尽描述：sc-uPA激活中所涉及的步骤之一是sc-uPA和另一蛋白酶之间的蛋白-蛋白相互作用，其中sc-uPA是所述酶的底物。这类蛋白酶的一个非详尽的实例是纤溶酶。sc-uPA激活中的另一步骤是(人sc-uPA的)Lys158和Ile159之间的单一肽键的内蛋白水解性切割，该位点位于所谓的激活环内。uPA激活中的另一步骤是新形成的N-端插入疏水性口袋中，该口袋称为激活口袋，位于催化结构域内。uPA激活中的另一步骤是催化结构域中的结构变化，自三维结构中的若干柔性环区的特征构象变为结构更紧凑的构象。在丝氨酸蛋白酶(包括sc-uPA)激活时，4个区段已经被定义为参与重大构象变化。这4个区段被称为激活环、自溶环、氧离子-稳定化环和S1进入框。

结合本发明所述的uPA的抗体可抑制sc-uPA激活中的一个或多个步骤，包括未知的或以上未描述的步骤。作为一个实例，本发明所述的抗体可抑制sc-uPA激活，即通过阻断sc-uPA和切割Lys158-Ile159肽键所需的蛋白酶之间的蛋白-蛋白相互作用。作为另一实例，这样的抗体可以抑制sc-uPA激活，即通过结合至或接近(例如，小于10、5、2或1氨基酸)至Lys158-Ile159肽键和从而保护该肽键以免被切割。作为另一实例，这样的抗体可以抑制uPA的激活，即通过抑制新形成的N-端插入到催化结构域的疏水性激活口袋。作为另一实例，这样的抗体可以抑制uPA的激活，即通过抑制参与自无活性至活性结构构象的转化中的构象变化。

本说明书的实施例部分中的实施例8描述了鉴定抑制这种sc-uPA激活的抗体的一个具体方式，即通过使用显色uPA底物测定uPA的催化活性。

tc-uPA活性：

本发明描述了抗体，其抑制tc-uPA活性。在这种情况下tc-uPA活性是指tc-uPA针对天然和合成底物的蛋白水解活性。这种底物的一个非独占的实例是纤溶酶原。tc-uPA活性是多步骤过程，其在文献中尚未被完全描述。以下不应被视为tc-uPA的蛋白水解活性中所涉及的步骤的详尽描述。涉及tc-uPA的蛋白水解活性的步骤之一是tc-uPA和可以充当tc-uPA的底物的蛋白之间的蛋白-蛋白相互作用。tc-uPA活性的另一需要是进入tc-uPA的催化位点。tc-uPA活性的另一需要是催化结构域的结构紧凑构象的稳定性。在丝氨酸蛋白酶激活时经历重大构象变化的4个区段被认为对tc-uPA活性而言是重要的。这4个区段被称为激活环、自溶环、氧离子-稳定化环和S1进入框。tc-uPA活性的另一需要是结合至tc-uPA的催化位点的底物释放。

结合本发明所述的uPA的抗体可抑制tc-uPA活性的一个或多个步骤和/或需要，包括未知的或以上未描述的步骤和/或需要。作为一个实例，本发明所述的抗体可抑制tc-uPA活性，即通过阻断tc-uPA和可以充当tc-uPA的底物的蛋白之间的蛋白-蛋白相互作用。作为另一实例，这样的抗体可以抑制tc-uPA活性，即通过阻断进入tc-uPA的催化位点。作为另一实例，这样的抗体可以抑制tc-uPA活性，即通过诱导tc-uPA的构象变化，相比在抗体不存在时的tc-uPA(阴性对照)，其赋予蛋白酶较少活性(即50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%的蛋白水解活性减少，相比阴性对照)或无活性。作为另一实例，这样的抗体可以抑制tc-uPA活性，即通过抑制结合至tc-uPA的催化位点的底物的释放。

测定uPA的蛋白水解活性的先前公布的和公认的功能测定包括基于显色和荧光uPA/纤溶酶底物的测定，其描述于BlouseGE,等人JBiolChem.2009Feb13；284(7)：4647-57。本说明书的实施例部分的实施例5、6、7和8，描述了显色测定的具体应用。

抑制(inhibit)/抑制(inhibition)/抑制性的：

本文使用的术语“抑制(inhibit)/抑制(inhibition)/抑制性的”是指相对于对照而言的活性水平或性质上的统计学显著性减少。

本发明的抗体抑制tc-uPA的蛋白水解活性。示例性的减少是50-100%，和因此相比阴性对照，例如省略抗体的对照或同种型-匹配的无关抗体对照，包括至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%的蛋白水解活性的减少。被广泛接受的检测蛋白水解活性的功能测定包括基于显色和荧光uPA/纤溶酶底物的测定，其描述于BlouseGE,等人JBiolChem.2009Feb13；284(7)：4647-57。本说明书的实施例部分的实施例5、6和7，描述了显色测定的具体应用。在此，测定了正常合理浓度范围内的若干不同浓度的抗uPA抗体，以测定抑制水平的IC₅₀值，其总是达到抑制抗体的最高抗体浓度的80%-100%。

在一个实施方案中，本发明的抗体抑制tc-uPA的蛋白水解活性。在其它实施方案中，本发明的抗体还抑制sc-uPA的激活。

本发明的抗体抑制sc-uPA自uPA的蛋白水解无活性形式至uPA的蛋白水解活性形式的激活。示例性的减少是50-100%，和因此相比阴性对照，例如相比省略抗体的对照或同种型-匹配的无关抗体对照，包括至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%的激活率的减少。测定活化部分的功能测定包括显色和荧光uPA底物，其描述于BlouseGE,等人JBiolChem.2009Feb13；284(7)：4647-57。本说明书的实施例部分的实施例8，描述了鉴定抗体的具体方式，所述抗体抑制这种sc-uPA的激活，即通过使用显色uPA底物测定uPA的催化活性。在此，测定了正常合理浓度范围内的若干不同浓度的抗uPA抗体，以测定抑制水平的IC₅₀值，其总是达到抑制抗体的最高抗体浓度的80%-100%。

uPA结合至uPAR：

在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合至受体-结合的和非-受体-结合的形式的uPA两者。uPA可以亚毫微摩尔级亲和力结合至uPA受体(uPAR或CD87)。这种相互作用主要是通过uPA的GFD结构域而介导。天然存在的uPAR存在着若干形式。作为一个实例，uPAR可以经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚连接至细胞表面。作为另一实例，已经显示了若干形式的可溶性uPAR(suPAR)，包括全长和截短形式。作为另一实例，已经显示了截短形式的uPAR，包括细胞表面-结合的形式和可溶性形式。全长形式的uPAR，包括细胞表面-结合的全长形式和可溶性全长形式的uPAR对uPA具有高亲和力。截短形式的uPAR对uPA具有可变的亲和力，包括对uPA的高亲和力、低亲和力、或无显著亲和力。

受体-结合的uPA：

术语“受体-结合的uPA”和“uPAR-结合的uPA”在本文中可互换使用，是指结合至uPAR或至uPAR的任何变体形式的uPA的所有形式，包括结合至细胞表面或以可溶性形式存在的uPAR。术语受体-结合的uPA此外包括sc-uPA和tc-uPA两者，条件是这些形式结合至uPAR。术语受体-结合的uPA此外包括uPA的所有结构构象，条件是这些形式结合至uPAR。术语受体-结合的uPA此外包括uPA的所有形式，包括uPA的活性形式和uPA的无活性形式，条件是这些形式结合至uPAR。术语受体-结合的uPA此外包括来自所有物种(包括人和其它相关物种)的uPA，条件是这些形式结合至uPAR。

测定uPAR-固定化uPA的蛋白水解活性的先前公布的和公认的功能测定包括基于显色和荧光uPA/纤溶酶底物的测定，其描述于BlouseGE,等人JBiolChem.2009Feb13；284(7)：4647-57。本说明书的实施例部分中的实施例6：“在偶联的酶原激活测定中的uPAR受体固定化sc-uPA”描述了测定uPAR-固定化uPA的蛋白水解活性的具体方式，使用显色的纤溶酶底物。在此，抗体应当是抑制性的，甚至当uPA结合至uPAR时。

非-受体-结合的uPA：

术语“非-受体-结合的uPA”用于本文，是指不结合至uPAR或至uPAR的任何变体形式的uPA的所有形式，包括结合至细胞表面或以可溶性形式存在的uPAR。术语非-受体-结合的uPA此外包括sc-uPA和tc-uPA两者，条件是这些形式不结合至uPAR。术语非-受体-结合的uPA此外包括uPA的所有结构构象，条件是这些形式不结合至uPAR。术语非-受体-结合的uPA此外包括uPA的所有形式，包括uPA的活性形式和uPA的无活性形式，条件是这些形式不结合至uPAR。术语非-受体-结合的uPA此外包括来自所有物种(包括人和其它相关物种)的uPA，条件是这些形式不结合至uPAR。

鉴定抗uPA抗体的方法：

一方面，本发明提供鉴定双重作用抗uPA抗体的方法。本发明的鉴定抗uPA抗体的方法包括以下步骤：(a)产生抗uPA抗体；(b)自步骤(a)中产生的抗体中鉴定抗体，其抑制tc-uPA的蛋白水解活性；(c)自步骤(a)中产生的抗体中鉴定抗体，其抑制sc-uPA自uPA的蛋白水解无活性形式至uPA的蛋白水解活性形式的激活；和(d)选择抗体，其在步骤(b)和(c)中都是抑制性的。

本发明的鉴定双重作用抗uPA抗体的方法的步骤(a)，即产生抗uPA抗体，可以根据本领域已知方法来完成。例如，可以产生抗uPA抗体，在但不限于不同动物宿主中以及使用噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物细胞展示或核糖体或mRNA展示。本说明书的实施例部分的实施例3，描述了在小鼠中产生抗uPA抗体的具体方式。

本发明的鉴定双重作用抗uPA抗体的方法的步骤(b)，即鉴定抑制tc-uPA的蛋白水解活性的抗体，可以根据本领域已知方法来完成。测定uPA的蛋白水解活性的先前公布的和公认的功能测定包括基于显色和荧光uPA/纤溶酶底物的测定，其描述于BlouseGE,等人JBiolChem.2009Feb13；284(7)：4647-57。本说明书的实施例部分的实施例5、6和7，描述了显色测定的具体应用。

本发明的鉴定双重作用抗uPA抗体的方法的步骤(c)，即鉴定抑制sc-uPA自uPA的蛋白水解无活性形式至uPA的蛋白水解活性形式的激活的抗体，可以根据本领域已知方法来完成。测定sc-uPA激活至uPA的活性形式的先前公布的和公认的功能测定包括基于显色和荧光uPA/纤溶酶底物的测定，其描述于BlouseGE,等人JBiolChem.2009Feb13；284(7)：4647-57。本说明书的实施例部分的实施例8，描述了鉴定抑制这种sc-uPA激活的抗体的一个具体方式，即通过使用显色uPA底物测定uPA的催化活性。

本发明的鉴定双重作用抗uPA抗体的方法的步骤(d)，即选择在步骤(b)和(c)中都是抑制性的抗体，是通过选择抑制sc-uPA至uPA的活性形式的激活和同时抑制tc-uPA的蛋白水解活性的抗体而完成。仅选择这样的抗uPA抗体：在步骤(b)中，相比阴性对照，例如，省略抗体的对照或同种型-匹配的无关抗体对照，其抑制至少50%的蛋白水解活性(50-100%，和因此包括至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%的激活率的减少；和相比步骤(c)中的激活的阴性对照(例如，省略抗体的对照或同种型-匹配的无关抗体对照)，至少50%(示例性的减少是50-100%，和因此包括至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%的激活率的减少。本说明书的实施例部分中的实施例5、6、7和8，描述了鉴定同时抑制sc-uPA激活和uPA的蛋白水解活性的抗体的独特方式，即通过使用uPA或纤溶酶的显色底物测定这些酶的催化活性。

在一个实施方案中，本发明的鉴定双重作用抗uPA抗体的方法进一步包括鉴定抗uPA抗体的步骤，所述抗体是抑制性的，甚至当uPA结合至uPAR时。测定uPAR-固定化uPA的蛋白水解活性的先前公布的和公认的功能测定包括基于显色和荧光uPA/纤溶酶底物的测定，其描述于BlouseGE,等人JBiolChem.2009Feb13；284(7)：4647-57。本说明书的实施例部分中的实施例6：“在偶联的酶原激活测定中的uPAR受体固定化sc-uPA”描述了使用纤溶酶的显色底物测定uPAR-固定化uPA的蛋白水解活性的具体方式。在此，测试抗体抑制uPA酶活性的能力，甚至当uPA结合至uPAR时。

在另一个实施方案中，本发明的鉴定双重作用抗uPA抗体的方法进一步包括抑制内源衍生的uPA的步骤。在自身免疫或炎性疾病或在癌症中，免疫细胞可以迁移和浸润至炎性部位。这些细胞通过组织炎症而在疾病的早期或晚期都可以起到主要作用，和uPA可以最终导致组织重塑，支持疾病进程。就类风湿性关节炎而言，据信巨噬细胞通过其uPA的内源产生而成为关键。因此，本说明书所述的抗uPA抗体应当能够抑制由巨噬细胞产生的uPA。本说明书的实施例部分中的实施例9：抑制内源衍生的uPA的抗体描述了测定来自M1/M2巨噬细胞的内源衍生的uPA的蛋白水解活性的具体的和特定的方式。

在另一个实施方案中，本发明的鉴定双重作用抗uPA抗体的方法进一步包括鉴定抗体的步骤，所述抗体除了结合和抑制人uPA，也结合和抑制来自其它物种的uPA。明显有利的是避免使用替代抗体和使用候选抗体，直接用于毒理研究。测定人uPA的蛋白水解活性的先前公布的和公认的功能测定包括基于显色和荧光uPA/纤溶酶底物的测定，其描述于BlouseGE,等人JBiolChem.2009Feb13；284(7)：4647-57。本说明书的实施例部分的实施例5，描述了显色测定的替代用途，测定来自食蟹猴的uPA的蛋白水解活性。

抗体：

术语“抗体”在本文中是指衍生自种系免疫球蛋白序列的蛋白，其能够结合至抗原或其部分。术语抗体包括任何类型(或同种型)的全长抗体，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和/或IgY。结合至抗原或其部分的抗体可以特异性地或排他性地结合至该抗原或其部分，或它可以结合至有限数量的同源抗原(交叉反应)、或其部分。

在本发明的一些实施方案中，所述抗体能够结合至和抑制人uPA并且也能够结合至和抑制来自另一物种的uPA，例如其它哺乳动物uPA，例如来自以下的uPA：非人灵长类(例如黑猩猩、食蟹猴或恒河猴)；啮齿类(例如小鼠或大鼠)、兔类(例如兔)或偶蹄类(例如牛、绵羊、猪或骆驼)。

在本发明的具体的实施方案中，所述抗体能够结合至人uPA并且也能够结合至非人灵长类uPA(例如，黑猩猩、食蟹猴或恒河猴)。

本文使用的术语“特异性地结合”和“特异性结合”是指化合物或抗体，其排他性地或选择性地识别和结合uPA(例如人uPA)的特定表位、同种型、直向同源物(物种)或变体。本发明的抗体结合至非人类的其它物种(例如食蟹猴)的uPA并且因此并非是特异性地人uPA结合抗体。

天然全长抗体通常包含至少4条多肽链：2条重(H)链和两条轻(L)链，其通过二硫键连接。在某些情况下，天然抗体包含小于4条链，例如在骆驼科(camelids)中存在的仅有重链的抗体(VHH片段)和在软骨鱼纲中存在的IgNAR的情况下。一类特定药用目的的免疫球蛋白是IgGs。在人类中，根据其重链恒定区的序列，IgG类可以细分为4个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。根据其序列组成的差异，轻链可以分为两类：κ链和λ链。IgG分子由通过两个或更多个二硫键互连的2条重链和各自通过二硫键与重链连接的2条轻链组成。IgG重链可包含重链可变区(VH)和至多3个重链恒定(CH)区：CH1、CH2和CH3。轻链可包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。VH区和VL区可以进一步细分为超变区域，称为互补决定区(CDR)或超变区(HvR)，其中分散着更保守的区域，称为框架区(FR)。VH区和VL区通常由3个CDR和4个FR组成，按照以下顺序从氨基-端至羧基-端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。具有重链和轻链的超变区的可变结构域形成[结合]结构域，其能够与抗原相互作用，而抗体恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括但不限于多种免疫系统的细胞(效应细胞)、Fc受体和经典补体系统的C1复合物的第一组分(C1q)。

本发明的抗体可以是单克隆抗体，其意义是它们代表单个B细胞或B细胞的克隆群所表达的一组独特重链和轻链可变区序列。使用本领域技术人员已知的各种方法，可以产生和纯化本发明的抗体。例如，抗体可以自杂交瘤细胞中产生。抗体可以通过B细胞扩增而产生。抗体或其片段可以是在哺乳动物中或微生物表达系统中重组表达的，或通过体外翻译。抗体或其片段也可以是经重组表达为细胞表面结合分子，通过例如以下方式：噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物细胞展示或核糖体或mRNA展示。

本发明的抗体可以是分离的。术语“分离的抗体”是指已经与产生它的环境中的其它组分分离的和/或从中回收的抗体和/或已经从产生它的环境中存在的组分混合物中纯化的抗体。

抗体的某些抗原-结合片段在本发明的情况下可能是合适的，因为已经证实全长抗体的片段可以进行抗体的抗原-结合功能。术语抗体的“抗原-结合片段”是指保留结合至抗原(例如本文所述的uPA或另一靶分子)的能力的抗体的一个或多个片段。抗原-结合片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、F(ab)S、Fv(典型地抗体的单臂的VL和VH结构域)、单链Fv(scFv；参见例如，Bird等人,Science1988；242：42S-426；和Huston等人PNAS1988；85：5879-5883)、dsFv、Fd(典型地VH和CHI结构域)、和dAb(典型地VH结构域)片段；VH、VL、VhH、和V-NAR结构域；包含单一VH和单一VL链的一价分子；微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体和κ体(参见例如Ill等人.ProteinEng1997；10：949-57)；骆驼IgG；IgNAR；以及一个或多个分离的CDR或功能性互补位，其中分离的CDR或抗原-结合残基或多肽可以缔合或连接在一起以形成功能性抗体片段。不同类型的抗体片段已经被描述和综述于例如，Holliger和Hudson,NatBiotechnol2005；2S：1126-1136；WO2005040219，和公布的美国专利申请20050238646和20020161201。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术而获取，并且可以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的功用。

抗体的“Fab片段”，包括“Fab”和“F(ab’)2”片段，衍生自所述抗体，即通过在连接抗体的重链的铰链半胱氨酸残基的N-末端或C-末端侧上切割铰链区中的重链。“Fab”片段包括轻链的可变和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。“F(ab')2“片段包含一对“Fab'”片段，其通常通过其铰链半胱氨酸共价地连接。Fab'在形式上衍生自F(ab')2片段，即通过切割连接F(ab')2中的重链的铰链二硫键。除了抗体片段的二硫键之外的其它化学偶联也是本领域已知的。Fab片段保留亲本抗体结合至其抗原的能力，但可能具有较低亲和力。F(ab')2片段能够二价地结合，而Fab和Fab’片段可以一价地结合。通常，Fab片段缺乏恒定CH2和CH3结构域，即Fc部分，其中与Fc受体的相互作用将发生。因此，Fab片段通常缺乏效应功能。Fab片段可以通过本领域已知方法产生，通过抗体的酶切割，例如，使用木瓜蛋白酶而获得Fab或胃蛋白酶而获得F(ab')2，Fab片段(包括Fab、Fab'、F(ab')2)可以使用本领域技术人员众所周知的技术经重组产生。

“Fv”片段是含有完整抗原识别和结合位点的抗体片段，并且通常包含一个重链和一个轻链可变结构域缔合的二聚体，其在自然界中可以是共价的，例如在单链可变结构域片段(scFv)中。在该构型中，每个可变结构域的3个超变区相互作用，限定在VH-VL二聚体表面上的抗原-结合位点。共同地，6个超变区或其亚组将抗原结合特异性赋予抗体。然而，甚至仅包含对抗原具有特异性的3个超变区的单一可变结构域可以保留识别和结合抗原的能力，尽管通常以低于完整结合位点的亲和力(Cai&Garen,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93：6280-6285,1996)。例如，天然存在的仅具有重链可变结构域(VHH)的骆驼科抗体可以结合抗原(Desmyter等人,J.Biol.Chem.,277：23645-23650,2002；Bond等人,J.Mol.Biol.2003；332：643-655)。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域以单一多肽链存在的。通常，Fv多肽进一步包括VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成抗原结合所需的结构。有关scFv的综述，参见Pluckthun,1994,载于：ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编著.Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315。

术语“双抗体”是指具有两个抗原-结合位点的小抗体片段，所述片段包含与在同一多肽链(VH和VL)中的轻链可变结构域(VL)相连的重链可变结构域(VH)。通过使用足够短的而不会导致同一条链上的两个可变结构域之间配对的接头，迫使可变结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原-结合位点。双抗体更充分地描述于例如，EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448。

术语“线性抗体”是指如Zapata等人,1995,ProteinEng.,8(10)：1057-1062中描述的抗体。简要地说，这些抗体含有一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补的轻链多肽一起，形成了一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。

本文使用的术语“单抗体(monobody)”是指具有重链可变结构域、而没有轻链可变结构域的抗原结合分子。单抗体在轻链不存在时可以结合至抗原并且典型地具有3个超变区，例如称为CDRH1、CDRH2、和CDRH3的CDR。重链IgG单抗体具有由二硫键连接的2个重链抗原结合分子。重链可变结构域包含一个或多个超变区，优选地CDRH3或HVL-H3区。

抗体片段可以使用常规重组或蛋白质工程技术而获得，并且可以与完整抗体相同的方式筛选所述片段用于结合至人uPA，或另一功能。

本发明的抗体片段可以通过截短的方式制备，例如通过自多肽的N和/或C端末端去除一个或多个氨基酸。片段也可通过一个或多个内部缺失而产生。

本发明的抗体可以是或可包含mAb0266-0000-0010或0266-0000-0015抗体的片段，或这些抗体的变体。本发明的抗体可以是或可包含这些抗体或其变体之一的抗原结合部分。例如，本发明的抗体可以是这些抗体或其变体之一的Fab片段，或它可以是衍生自这些抗体或其变体之一的单链抗体。

本发明的抗体可以是人抗体或人源化抗体。本文使用的术语“人抗体”，意图包括具有可变区的抗体，其中至少部分的框架区和/或至少部分的CDR区衍生自人种系免疫球蛋白序列。(例如，人抗体可以具有可变区，其中框架和CDR区都衍生自人种系免疫球蛋白序列。)此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也衍生自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点-特异性诱变或通过体内的体细胞突变而引入的突变)。

这样的人抗体可以是人单克隆抗体。这样的人单克隆抗体可以由杂交瘤产生，所述杂交瘤包含与永生化细胞融合的得自转基因非人类动物例如转基因小鼠的B细胞(其具有包含人免疫球蛋白重链和轻链基因区段库的基因组)。

人抗体可以分离自序列文库，其建立在人种系序列的选择上，进一步用天然和合成的序列多样性使其多样化。

可以通过人淋巴细胞的体外免疫，接着用Epstein-Barr病毒转化淋巴细胞，制备人抗体。

术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，例如抗体与另一试剂或抗体的缀合物。

本文使用的术语“人源化抗体”是指人/非人类嵌合抗体，其含有衍生自非人类免疫球蛋白的序列(CDR区或其部分)。因此，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中至少来自受体超变区的残基被来自非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)的抗体(供体抗体)的超变区的残基取代，其具有所需的特异性、亲和力、序列组成和功能。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人类残基取代。这样的修饰的实例是引入一个或多个所谓的回复突变，其典型地是来自供体抗体的氨基酸残基。抗体的人源化(Humanisation)可通过使用本领域技术人员已知的重组技术来进行(参见例如AntibodyEngineering,MethodsinMolecularBiology,第248卷,BennyK.C.Lo编辑)。轻链和重链的可变结构域的合适的人受体框架可以通过例如序列或结构同源性而鉴定。或者，可以使用固定的受体框架，例如根据结构、生物物理和生物化学性质的知识。受体框架可以是种系衍生的或衍生自成熟抗体序列。来自供体抗体的CDR区可以通过CDR移植而转移。可以进一步优化CDR移植的人源化抗体的例如亲和力、功能性和生物物理性质，即通过鉴定关键性框架位置，其中来自供体抗体的氨基酸残基的重新引入(回复突变)对人源化抗体的性质具有有益影响。除了供体抗体衍生的回复突变，可以通过在CDR或框架区中引入种系残基，消除免疫原性表位，定点诱变，亲和力成熟等，改造人源化抗体。

此外，人源化抗体可包含在受体抗体或在供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰，以进一步精修抗体表现。一般而言，人源化抗体会包含至少1个–典型地2个–可变结构域，其中所有或几乎所有CDR区对应于非人类免疫球蛋白的那些并且其中所有或几乎所有FR残基是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选地也可包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地人免疫球蛋白的那些。

术语“人源化抗体衍生物”是指人源化抗体的任何修饰形式，例如抗体与另一试剂或抗体的缀合物。

本文使用的术语“嵌合抗体”是指通常通过基因工程自源自不同物种的免疫球蛋白的可变和恒定区基因而构建轻链和重链基因的抗体。例如，可将来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区段连接至人恒定区。

抗体的片段可结晶区(“Fc区”/”Fc结构域”)是抗体的N-末端区，其包含恒定CH2和CH3结构域。Fc结构域可与细胞表面受体(称为Fc受体)、以及补体系统的一些蛋白质相互作用。Fc区使得抗体能够与免疫系统相互作用。本发明的一方面，可以改造抗体，使其包含在Fc区内的修饰，典型地以改变一个或多个其功能性质，例如血清半寿期、补体结合、Fc-受体结合、蛋白稳定性和/或抗原依赖性细胞毒性、或其缺乏，等等。此外，本发明的抗体可以经化学修饰(例如，可将一个或多个化学部分连接至抗体)或可被修饰以改变其糖基化，再次改变抗体的一个或多个功能性质。IgG1抗体可以携带经修饰的Fc结构域，包含以下突变的一个或多个或可能所有，所述突变将分别导致与某些Fc受体的亲和力降低(L234A、L235E和G237A)和导致减少的C1q-介导的补体结合(A330S和P331S)(残基编号按照EU指数)。

本发明的抗体的同种型可以是IgG、例如IgG1、例如IgG2、例如IgG4。如有必要，抗体的类型可以通过已知技术而“转换”。例如，最初产生为IgM分子的抗体可以被类型转换为IgG抗体。类型转换技术也可用于将一种IgG亚类转化为另一种，例如：自IgG1至IgG2或IgG4；自IgG2至IgG1或IgG4；或自IgG4至IgG1或IgG2。也可进行抗体改造，以产生恒定区嵌合分子，即通过将来自不同的IgG亚类的区组合。

在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，使得铰链区中的半胱氨酸残基的数量改变，例如增加或减少。该方法进一步描述于例如美国专利号5,677,425(Bodmer等人)。

可修饰恒定区以稳定抗体，例如减少双价抗体分离为两个一价VH-VL片段的风险。例如，在lgG4恒定区中，残基S228(残基编号按照EU指数)可以突变为脯氨酸(P)残基，以稳定铰链上的重链间二硫桥形成(参见例如Angal等人,MolImmunol.199S；30：105-8)。

抗体或其片段也可按其互补决定区(CDR)来定义。术语“互补决定区”或“超变区”，当用于本文时，是指参与抗原结合的氨基酸残基位于其中的抗体的区域。超变区或CDR可以被鉴定为在抗体可变区的氨基酸比对上具有最高可变性的区域。可使用数据库进行CDR鉴定，例如Kabat数据库，CDR例如被定义为包含轻链可变结构域的氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变结构域的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；(Kabat等人(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版号91-3242)。或者，CDR可以被定义为来自“超变环”的那些残基(轻链可变结构域的残基26-33(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变结构域的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol1987；196：901-917)。典型地，该区的氨基酸残基的编号是通过Kabat等人(同上)所述的方法而进行。术语例如“Kabat位置”、“Kabat残基”和“按照Kabat”在本文中是指用于重链可变结构域或轻链可变结构域的该编号系统。使用Kabat编号系统，肽的实际的线性氨基酸序列可含有较少的或额外的氨基酸，其对应于可变结构域的框架(FR)或CDR的缩短或插入其中。例如，重链可变结构域可包括CDRH2的残基52之后的氨基酸插入(残基52a、52b和52c，按照Kabat)和重链FR残基82之后的插入的残基(例如，残基82a、82b、和82c等，按照Kabat)。对于指定抗体，可以通过比对抗体序列同源区与“标准”Kabat编号的序列，确定残基的Kabat编号。

术语“框架区”或“FR”残基是指那些VH或VL氨基酸残基，其不在如本文中定义的CDR内。

本发明的抗体可包含来自本文公开的一个或多个特定抗体的CDR区，例如，来自抗uPA抗体0266-0000-0010的CDR区(SEQIDNOs：9-14)或抗uPA抗体0266-0000-0015的VH和VL序列(SEQIDNOs5-6)或人源化抗uPA抗体hz0266-0000-0010的VH和VL序列(SEQIDNO：17和18)、或人源化抗uPA抗体0266-0000-0043的重链和轻链序列(SEQIDNO：21和22)。

术语“抗原”(Ag)是指用于免疫具有免疫活性的脊椎动物以产生识别所述Ag的抗体(Ab)的分子实体。在本文中，Ag被更宽泛地命名并且通常意欲包括Ab所识别的靶分子，因此包括用于免疫过程或其它过程(例如噬菌体展示)的分子的片段或模拟物，其用于产生Ab。

表位：

本文使用的术语“表位”在“抗原结合分子”例如抗体(Ab)与其相应的“抗原”(Ag)之间的分子相互作用的情况下定义。术语抗原(Ag)可以指用于免疫具有免疫活性的脊椎动物以产生识别所述Ag的抗体(Ab)的分子实体。通常，“表位”是指Ab特异性地结合的Ag上的区域或区，即与Ab物理接触的区域或区。对于Ab和Ag分子中的原子，物理接触可以通过距离标准而限定(例如，4?的距离截止)。

“不连续表位”是由多肽的在线性肽序列中的彼此不相邻的两个或更多个区域形成的表位，但其以多肽的三维结构而排列，形成结构表位。表位的其它类型包括：线性肽表位、构象表位(其由在抗原三维结构中彼此靠近的两个或更多个非连续氨基酸组成)；和翻译后表位，其全部或部分地由共价连接至抗原的分子结构组成，例如碳水化合物基团。

使用各种实验性的和计算的表位作图方法，指定抗体(Ab)/抗原(Ag)对的表位可以在不同详细水平上限定和表征。实验性方法包括诱变、X射线晶体学、核磁共振(NMR)光谱和氢氘交换质谱(HX-MS)、本领域已知的方法。因为每种方法依赖于独特原理，表位的描述最终与测定方法相关。因此，根据使用的表位作图方法，将不同地描述指定Ab/Ag对的表位。

在其最详细水平，在Ag和Ab之间相互作用的表位可以通过限定在Ag-Ab相互作用中存在的原子接触的空间坐标、以及它们的有关结合热力学的相对贡献的信息进行描述。在较不详细水平，表位可以通过在Ag和Ab之间限定原子接触的空间坐标而描述。在甚至更不详细水平，可以通过其按具体标准(例如Ab和Ag中的原子之间的距离)所定义而包含的氨基酸残基来描述表位。在进一步较不详细水平，Ab-Ag相互作用可以是通过功能而表征，例如通过与其它Ab竞争结合和“框并(binning)”，尽管竞争结合不提供有关表位的任何结构信息。

在Ab例如Fab片段与其Ag之间的复合物的空间坐标所定义的X射线衍生的晶体结构的情况下，术语表位在本文中，除非另有说明或与上下文矛盾，特异性地定义为uPA残基，其特征在于具有重原子(即非氢原子)，与Ab中的重原子距离大约3.5至大约5.0?内，例如4?。

根据表位的描述和定义的事实，取决于使用的表位作图方法，在不同细节水平上获得，然后对于在相同Ag上不同的Ab的表位的比较可以在不同细节水平上类似地进行。

在氨基酸水平上描述的表位(例如，根据X射线结构而定)，如果它们含有相同组的氨基酸残基，则被认为是相同的。如果表位共享至少一个氨基酸，则表位被认为重叠。如果无氨基酸残基被表位共享，则表位被认为是分开的(独特)。

术语“互补位”的定义衍生自以上“表位”的定义，即通过反转视角。因此，术语“互补位”是指Ag特异性地结合在Ab上的区域或区，即藉此它与Ag物理接触。

在Ab例如Fab片段与其Ag之间的复合物的空间坐标所定义的X射线衍生的晶体结构的情况下，术语互补位在本文中，除非另有说明或与上下文矛盾，特异性地定义为Ab残基，其特征在于具有重原子(即非氢原子)，与uPA中的重原子距离大约大约4?(3.5-5.0?)。

结合区：

术语抗原结合区是指抗原上的区域，由氨基酸序列定义，一个或多个抗原结合分子例如抗体与其结合。结合区因此包含至少一个表位，但也可包含多个抗体的多个表位、两个相同表位、重叠表位和可能分开的表位。结合区可以是不连续的，其中由抗原多肽的在线性肽序列中的彼此不相邻的两个或更多个区形成，但其以多肽的三维结构而排列，形成结构结合区。结合区也可以是抗原上的线性肽区、或构象结合区(其由在抗原三维结构中彼此靠近的两个或更多个非连续氨基酸组成)；和翻译后结合区，其或全部或部分地由共价连接至抗原的分子结构组成，例如碳水化合物基团。

结合至相同抗原的抗体可以对于它们同时结合至它们共同抗原的能力来表征并且可以经历“竞争结合”/“框并(binning)”。在本文的上下文中，术语“框并(binning)”是指将结合至相同抗原的抗体分组的方法。抗体的“框并(binning)”可以是根据在测定中两种抗体与它们共同抗原的竞争结合，根据标准技术例如表面等离子体共振(SPR)、ELISA或流式细胞术。

使用参考抗体来定义抗体的“bin”。如果第二抗体不能与参考抗体同时结合至抗原，则第二抗体被认为是属于与参考抗体相同的“bin”。在这种情况下，参考抗体和第二抗体竞争性结合抗原的相同部分并且符合“竞争抗体”。如果第二抗体能够与参考抗体同时结合至抗原，则第二抗体被认为是属于单独的“bin”。在这种情况下，参考抗体和第二抗体不竞争性结合抗原的相同部分并且符合“非竞争抗体”。

抗体“框并(binning)”不提供有关表位的直接信息。竞争抗体，即属于相同“bin”的抗体可具有相同表位、重叠表位或甚至单独表位。后者是这样的情况：当结合至抗原上的其表位的参考抗体占据第二抗体接触抗原上的其表位所需空间时(“空间位阻”)。非竞争抗体通常具有单独表位。

术语“结合亲和力”用于本文，作为两分子(例如抗体或其片段与抗原)之间的非共价相互作用的强度的度量。术语“结合亲和力”用于描述一价相互作用(固有活性)。

通过一价相互作用的两分子(例如抗体或其片段与抗原)之间的结合亲和力，可以通过确定平衡离解常数(KD)而定量测定。反过来，可通过测定复合物形成和离解的动力学来测定KD，例如，通过SPR方法。对应于一价复合物的缔合和离解的速率常数分别称为缔合速率常数ka(或kon)和离解速率常数kd(或koff)。通过等式KD=kd/ka，KD涉及ka和kd。

根据以上定义，与不同分子相互作用相关的结合亲和力，例如不同抗体对指定抗原的结合亲和力的比较，可以通过比较单个抗体/抗原复合物的KD值而比较。

本发明的抗体可以能够与另一分子(例如天然存在的配体或受体或另一抗体)竞争结合至uPA。因此，本发明的抗体可以能够以比也能够结合uPA的另一分子更大的亲和力结合uPA。可以评价抗体与天然配体/受体竞争结合至抗原的能力，即通过测定和比较目标的相互作用例如抗体和抗原之间的特异性相互作用的KD值，与非目标的相互作用的KD值。典型地，抗体对靶的KD将比对其它非靶分子(例如环境中的无关材料或伴随材料)的KD小2倍、优选地5倍、更优选地10倍。更优选地，KD将是小50倍、例如小100倍、或小200倍；甚至更优选地小500倍、例如小1,000倍、或小10,000倍。

可通过众所周知的方法直接测定该离解常数的值。评价配体例如抗体与靶的结合能力的标准测定是本领域已知的，并且包括例如，ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞术分析。抗体的结合动力学和结合亲和力也可以通过本领域已知的标准测定例如SPR来评价。

可以进行竞争结合测定，其中将抗体与靶的结合与该靶的另一配体(例如另一抗体)与靶的结合相比较。

本发明的抗体，可以能够与以下抗体竞争结合至人uPA(包括sc-uPA和tc-uPA)：抗体0266-0000-0010(即抗体或其片段，其包含mAb0266-0000-0010的VH序列(SEQIDNO：7)和mAb0266-0000-0010的VL序列(SEQIDNO：8))、或mAb0266-0000-0015(即抗体或其片段，其包含mAb0266-0000-0015的VH序列(SEQIDNO：5)和mAb0266-0000-0015的VL序列(SEQIDNO：6))或mAbhz0266-0000-0010(即抗体或其片段，其包含mAbhz0266-0000-0010的VH序列(SEQIDNO：17)和mAbhz0266-0000-0010的VL序列(SEQIDNO：18))、或mAb0266-0000-0043(即抗体或其片段，其包含人源化抗uPA抗体mAb0266-0000-0043的重链和轻链序列(SEQIDNO：21和22))。本发明的抗体可以能够与以下竞争结合至食蟹猴uPA(包括sc-uPA和tc-uPA)：抗体0266-0000-0010(即抗体或其片段，其包含mAb0266-0000-0010的VH序列(SEQIDNO：7)和mAb0266-0000-0010的VL序列(SEQIDNO：8))、或mAb0266-0000-0015(即抗体或其片段，其包含mAb0266-0000-0015的VH序列(SEQIDNO：5)和mAb0266-0000-0015的VL序列(SEQIDNO：6))或mAbhz0266-0000-0010(即抗体或其片段，其包含mAbhz0266-0000-0010的VH序列(SEQIDNO：17)和mAbhz0266-0000-0010的VL序列(SEQIDNO：18))、或mAb0266-0000-0043(即抗体或其片段，其包含人源化抗uPA抗体mAb0266-0000-0043的重链和轻链序列(SEQIDNO：21和22))。

本发明的抗体结合至其靶的KD可以为1x10^-7M或更低、1x10^-8M或更低、或1x10^-9M或更低、或1x10^-10M或更低、1x10^-11M或更低、或1x10^-12M或更低。本发明的抗体的KD可以是小于0.8nM、例如小于0.7nM、例如小于0.6nM、例如小于0.5nM、例如小于0.4nM、例如小于0.3nM、例如小于0.2nM、例如小于0.1nM、例如小于0.05nM、例如小于0.025nM、例如小于0.015nM、例如介于0.015nM和0nM之间。

术语“同一性”如本领域已知，是指经比较序列而测定的两个或更多个多肽序列之间的关系。在本领域，“同一性”也指经两个或更多个氨基酸残基串之间的匹配数而测定的多肽间的序列相关程度。“同一性”测定较小的两个或更多序列之间的相同匹配百分率，其中缺口(gap)比对(如果有的话)通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)解决。通过已知方法可以容易地计算相关多肽的同一性。这样的方法包括但不限于以下所述的那些：ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.编著,OxfordUniversityPress,NewYork,1988；Biocomputing：InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.编著,AcademicPress,NewYork,1993；ComputerAnalysisofSequenceData,Part1,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,编著.,HumanaPress,NewJersey,1994；SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje,G.,AcademicPress,1987；SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.和Devereux,J.,编著,M.StocktonPress,NewYork,1991；和Carillo等人,SIAMJ.AppliedMath.48,1073(1988)。

测定同一性的优选的方法被设计用于给出所测序列间的最大匹配。测定同一性的方法描述于公众可得的计算机程序。用于测定两个序列间的同一性的优选的计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等人,Nucl.Acid.Res.12,387(1984)；GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsin,Madison,Wis.)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人,J.Mol.Biol.215,403-410(1990))。BLASTX程序是公众可得的，得自国立生物技术信息中心(NCBI)和其它来源(BLASTManual,Altschul等人NCB/NLM/NIHBethesda,Md.20894；Altschul等人，同上)。众所周知的SmithWaterman算法也可用于测定同一性。

例如，使用计算机算法GAP(GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsin,Madison,Wis.)，将有待测定%序列同一性的两个多肽进行比对，以最佳匹配它们各自的氨基酸(“匹配跨度”，经所述算法所测定)。缺口开放罚分(其计算为3倍平均对角(averagediagonal)；“平均对角”是使用的比较矩阵的对角平均值；“对角”是分配给每个通过特定比较矩阵的完美的氨基酸匹配的得分或数值)和缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)(其通常是缺口开放罚分的1/10)，以及比较矩阵例如PAM250或BLOSUM62与所述算法一起使用。所述算法还使用标准比较矩阵(对于PAM250比较矩阵，参见Dayhoff等人,AtlasofProteinSequenceandStructure,第5卷,supp.3(1978)；对于BLOSUM62比较矩阵，Henikoff等人,Proc.Natl.Acad.SciUSA89,10915-10919(1992))。

肽序列比较的优选的参数包括以下：算法：Needleman等人,J.Mol.Biol.48,443-453(1970)；比较矩阵：BLOSUM62，来自Henikoff等人,PNASUSA89,10915-10919(1992)；缺口罚分：12，缺口长度罚分：4，类似性阈值：0。

GAP程序用于以上参数。使用GAP算法，对于肽比较(末端缺口无罚分)，上述参数是缺省参数。

术语“相似性”是相对概念，但相比“同一性”，是指序列关系，其同时包括相同匹配和保守取代匹配。如果两个多肽序列具有例如，(分数(10/20))相同氨基酸，和剩余部分都是非保守取代，则%同一性和相似性将都是50%。如果，在相同实例中，另有5个位置是保守取代，则%同一性是25%和%相似性是75%((分数(15/20)))。因此，在保守取代的情况下，两个多肽之间的相似性程度会高于这两个多肽间的%同一性。

药物制剂：

一方面，本发明提供包含本发明分子例如本文所述的抗uPA抗体的组合物和制剂。例如，本发明提供药物组合物，其包含与药学上可接受的载体配制在一起的一种或多种本发明的抗uPA抗体。

因此，本发明的一个目标是提供药物制剂，其包含这样的抗体，其浓度为0.25mg/ml至250mg/ml，和其中所述制剂的pH为2.0至10.0。制剂可以进一步包含一种或多种缓冲系统、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂、或表面活性剂、及其不同组合。防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂在药物组合物中的使用是技术人员众所周知的。参考文献可见Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy,第19版,1995。

在一个实施方案中，药物制剂是水性制剂。这样的制剂典型地是溶液剂或混悬剂，但也可以包括胶剂、分散剂、乳剂或多相材料。术语“水性制剂”定义为包含至少50%w/w水的制剂。同样，术语“水性溶液剂”定义为包含至少50%w/w水的溶液剂，术语“水性混悬剂”定义为包含至少50%w/w水的混悬剂。

在另一个实施方案中，药物制剂是冻干制剂，在使用前由医生或患者向其中添加溶剂和/或稀释剂。

又一方面，药物制剂包含这类抗体的水性溶液剂和缓冲剂，其中所述抗体的浓度为1mg/ml或以上，和其中所述制剂的pH为大约2.0至大约10.0。

炎症：

本文所述的结合uPA的抗体可以是适用于治疗患有炎性病症的个体。炎症是组织对各种刺激(包括但不限于病原体、受损细胞或刺激物)的复杂的生物反应。炎症是机体的保护性反应，以去除、中和或隔离有害刺激和起始治愈过程。炎症不是感染的同义词，感染是外源病原体对生物体的侵袭，而炎症是免疫系统对病原体的反应。因此，炎症是感染的组件，而感染不一定是炎症的组件。

炎症是涉及多组分的事件级联，包括脉管系统(例如，内皮细胞、周皮细胞、平滑肌细胞)、免疫系统细胞(例如，T和B淋巴细胞；多形核白细胞或粒细胞，例如单核细胞和嗜中性粒细胞；树突细胞、巨噬细胞和NK细胞)、细胞衍生的可溶性介质(细胞因子、趋化因子)和靶向组织中的居住细胞(例如，上皮细胞、滑膜成纤维细胞、神经元细胞)。急性炎症是短持续时间的(数小时到数天)和主要涉及组织中的居住细胞、免疫系统的细胞迁移和液体和血浆蛋白向炎症部位的渗出。这是由于血管流量、细胞激活和细胞组分的改变，其吸引免疫系统细胞从循环进入损伤部位。慢性炎症是长持续时间的，其中活动性炎症、组织破坏和修复企图是同时进行的。慢性炎症可以由于持续感染、有毒试剂的延长和重复暴露或因自身免疫所致，自身免疫是机体免疫细胞攻击其自身组织而导致损害的现象。

通常，免疫系统能够区分机体的正常细胞(或“自身”)和外源病原体或异常细胞(“非自身”)。在某些情况下，免疫系统丧失了识别“自身”为正常的能力并不适当地引发针对组织或细胞的反应。该反应源于对自身的耐受性的损失并且称为“自身免疫”。起因于自身免疫的病原性通常具有严重临床结果并且是全球重大健康问题之一，尤其是在发达国家。这样的疾病的实例包括炎性肠病(IBD)、克罗恩病(Crohnsdisease，CD)、溃疡性结肠炎(UC)、肠易激综合征、类风湿性关节炎(RA)、银屑病、银屑病性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、I型糖尿病、格雷夫斯病(Grave'sdisease)、多发性硬化(MS)、自身免疫性心肌炎、川崎病、冠状动脉病、慢性阻塞性肺病、间质性肺病、自身免疫甲状腺炎、硬皮病、系统性硬化、骨关节炎、过敏性皮炎、白癜风、移植物抗宿主病、干燥综合征(Sjogrens’ssyndrome)、自身免疫肾炎、古德帕斯特综合征、慢性炎性脱髓鞘多神经病、过敏、哮喘和急性或慢性炎症所致的其它自身免疫性疾病。

靶向生物治疗药目前可用于治疗某些自身免疫性疾病和/或癌症。例如，癌症患者可以用针对CD20的抗体治疗(抗CD20)；类风湿性关节炎患者可以用抗CD20(一种TNF拮抗剂(可溶性TNFR或抗TNF-α))治疗；银屑病患者可以用抗CD11a治疗；多发性硬化患者可以用INF-β治疗；溃疡性结肠炎患者可以用抗TNF-α治疗，克罗恩病患者可以用抗TNF-α或抗α4整联蛋白治疗。遗憾的是，接受这些生物制品的任一种的治疗的大量患者会经历各种副作用，会无法反应，和/或可发展出针对治疗药物的中和抗体。仍然需要替代的生物药物，其特异性地靶向病理，但不影响健康细胞/组织，导致更少和/或更低严重副作用。另外，这样的替代生物药物可长期使用和/或不导致中和抗体的产生。一方面，本发明涉及自身免疫性疾病和慢性炎性疾病患者的这些未满足的需求。

炎性肠病：

炎性肠病(IBD)是可影响从口腔到肛门的胃肠道任何部分的疾病，导致各种各样的症状。IBD主要地引起腹痛、腹泻(其可以是血样)、呕吐、或体重减轻，但也可引起胃肠道外的并发症，例如皮疹、关节炎、眼睛炎症、疲劳和缺乏专注。IBD患者可分为两大类，溃疡性结肠炎(UC)患者和克罗恩病(CD)患者。尽管CD通常包括回肠和结肠，它可以影响肠道任何区，但通常是间断的(疾病的聚集区分散在整个肠道中)，UC通常涉及直肠(结肠)和是更连续的。在CD中，炎症是跨壁的，导致脓肿、瘘管和狭窄，而在UC中，炎症典型地被限制在粘膜。对于克罗恩病没有已知的药物或手术治愈，而一些UC患者可以通过手术切除结肠而治愈。治疗选项局限于控制症状，维持缓解和预防复发。可以在临床上测定炎性肠病的功效为对于CD，克罗恩病活性指数(CDAI)评分下降，其评分量表基于实验室测定和生活质量问卷。在动物模型中，功效主要是通过体重增加和疾病活性指数(DAI)而测量，所述指数是粪便稠度、体重和粪便中的血液的组合。

多发性硬化：

多发性硬化(MS)是中枢神经系统(CNS)疾病，标志是麻木、软弱、肌肉协调丧失以及视力、语言和膀胱控制问题。MS是自身免疫性疾病，其中机体免疫系统攻击髓磷脂，一种充当神经绝缘体并有助于神经信号传递的物质。MS导致脑白质的脱髓鞘作用，其中该过程有时延伸到灰质。脱髓鞘作用是髓磷脂损失，髓磷脂是由脂质和蛋白组成。在MS中，当髓磷脂被破坏时，神经纤维传导是错误的或不存在。与那些脱髓鞘神经纤维相关的受损的机体功能或改变的感觉，产生MS症状。有多个MS亚组，包括复发缓解型、原发进展型和继发进展型。代表一些这些亚类的小鼠模型可用于测试潜在治疗的功效。通过肢体麻痹的减少，测定在小鼠模型中的功效。通过MRI测定的脑中的减少的活性评分和肌张力/运动的改善，测定在患者中的功效。

来自复发-缓解型多发性硬化(RRMS)患者的外周血单核细胞(PBMC)的全基因组表达分析揭示了，相比来自健康对照的PBMC，在RRMS患者的PBMC中uPA基因(PLAU)的表达显著地增加(Cox等人,MultScler19：1268-74,2013)。在实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)多发性硬化的小鼠模型中，用uPA-抑制性PAI-1-衍生的肽的治疗减少了疾病评分(Gur-Wahnon等人,JNeuroinflammation10：124,2013)。

银屑病：

银屑病是T细胞介导的皮肤炎性病症，其可以导致相当大的不适。它是目前无治愈的疾病并且累及所有年龄的人。尽管患有轻度银屑病的个体通常可以用局部试剂控制其疾病，但全球超过一百万患者需要紫外线治疗或系统性免疫抑制治疗。遗憾的是，紫外辐射的不方便和风险和许多治疗的毒性限制了其长期使用。此外，患者通常具有银屑病复发，和在某些情况下停止免疫抑制治疗后短时间就反弹。目前开发的基于CD4+T细胞转移的银屑病模型，模拟人银屑病的许多方面和因此可用于鉴定适用于治疗银屑病的化合物(Davenport等人,Internat.Immunopharmacol2：653-672,2002)。在该模型中的功效通过使用评分系统的皮肤病理减少而测定。同样，在患者中的功效通过皮肤病理减少而测定。

银屑病性关节炎：

银屑病性关节炎(PsA)是一类炎性关节炎，其发生在银屑病患者的子集中。在这些患者中，皮肤病理/症状伴有关节肿胀，类似于在类风湿性关节炎中所见。其特征在于斑块、凸起、皮肤炎症的红色区域并有鳞屑。银屑病通常影响肘头和膝头、头皮、肚脐和生殖区或肛门附近。大约10%的银屑病患者还发展出相关的关节炎症。

类风湿性关节炎：

类风湿性关节炎(RA)是系统性疾病，其影响大部分(如果不是全部)机体并且是最常见的关节炎形式之一。其特征在于关节炎症，其引起疼痛、僵硬、发热、发红和肿胀。这种炎症是炎性细胞侵入关节的结果，并且这些炎性细胞释放酶，其可以消化骨和软骨。结果，这种炎症可以导致严重的骨和软管破坏并导致关节恶化和严重疼痛以及其它病理效果。所涉及的关节可以丧失其形状和排列，导致疼痛和运动损失。

对于本领域已知的类风湿性关节炎，有若干动物模型。例如，在胶原-诱导的关节炎(CIA)模型中，小鼠发展出炎性关节炎，其类似于人类风湿性关节炎。因为CIA与RA共享类似的免疫学和病理学特征，这使其成为筛选潜在人抗炎化合物的合适的模型。在该模型中的功效是通过减少关节肿胀而测定。在临床中在RA中的功效是通过减少患者的症状的能力而测定，将其测量为关节肿胀、红细胞沉降速度、C反应蛋白水平和血清因子水平(例如抗瓜氨酸化蛋白抗体)组合。

在RA患者的血液、滑液和组织中已经描述了增加的uPA水平(Baran等人,J.CellMol.Med.13：3797-3808,2009；Belcher等人,Ann.Rheum.Dis.55：230-236,1996；Busso等人,Ann.Rheum.Dis.56：550-557,1997；Ronday等人,Br.J.Rheumatol.35：416-423,1996)。在大量小鼠模型中UPA涉及关节炎症和关节炎疾病。使用uPA敲除小鼠，在胶原-诱导的关节炎(CIA)模型中(Cook等人,Am.J.Pathol.160：917-926,2002)，在抗II型胶原抗体-诱导的关节炎(CAIA)模型中(Cook等人,ArthritisRes.Ther.12：R37,2010)，和在K/BxN血清转移关节炎模型中(DeNardo等人,ArthritisRes.Ther.12：R199,2010)，证实了uPA在关节炎症中的功能作用。在CIA模型中，在uPA敲除小鼠中观察到的关节炎症状的减少可以通过移植野生型骨髓而逆转，表明衍生自免疫细胞的uPA是疾病进程的关键。

血友病性关节炎：

血友病性关节炎是一种变形关节炎，是由反复出血到关节所致(关节血肿)。它是血友病A和B的常见并发症，但在其它凝血障碍中也可见。复发性关节血肿导致滑膜慢性炎症、软骨降解和骨重塑。受累关节的特征在于疼痛、僵硬、发热、发红、肿胀和受限的关节运动。最常累及的关节是膝、踝、肘、肩和臀。

对于血友病性关节炎，有若干动物模型。一些动物模型经历自发关节血肿，例如血友病狗，而其它已建立的模型是基于关节出血的人工诱导，例如建立在血友病小鼠中的针头-诱导的膝出血模型。通过预防关节血肿或通过减弱关节血肿所致的炎性和降解过程，这些动物模型可以适用于筛选药物候选物对血友病性关节病的疗效。

在血友病小鼠的涉及针头诱导的膝出血的关节血肿动物模型的受累关节的组织和滑液中，观察到了显著地增加的uPA水平(Nieuwenhuizen等人,ThrombHaemost110：173–183,2013)。

系统性红斑狼疮：

系统性红斑狼疮(SLE)是一种免疫复合物相关障碍，特征在于针对普遍存在的自身抗原的慢性IgG抗体产生，例如抗dsDNA。在SLE中的疾病的主要介质是针对自身蛋白/组织的自身抗体的产生和随后的免疫介导的炎症的产生。抗体直接或间接介导炎症。尽管不认为T淋巴细胞直接导致疾病，但它们是自身抗体产生所需的。SLE的作用是系统性的(例如，肾、肺、肌肉骨骼系统、粘膜皮肤、眼、中枢神经系统、心血管系统、胃肠道、骨髓、血)，而非局限于特定器官，尽管肾小球性肾炎可以导致某些情况(即狼疮性肾炎)。多个染色体位点已经与所述疾病相关联并且可以促进疾病的不同方面，例如抗dsDNA抗体和肾小球性肾炎。在人类疾病和在合适的小鼠模型中测定在SLE中的功效，即通过治疗性实体降低自身抗体(例如抗dsDNA)的能力和/或通过减少肾病理学(增强肾功能)，导致疾病症状的改善。

癌症：

本发明所述的结合uPA的抗体可以适用于治疗患有包括但不限于以下的癌症和其它增殖疾病的个体：癌，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌，包括鳞状细胞癌；淋巴谱系的造血系统肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤、和多发性骨髓瘤；骨髓谱系的造血系统肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病、早幼粒细胞性白血病和骨髓增生异常综合征；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其它肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤和胶质瘤；中枢和周围神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤和许旺氏细胞瘤；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；和其它肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡状癌和畸胎癌。

可按照本发明治疗的具体病症包括淋巴谱系的造血系统肿瘤，例如T细胞和B细胞肿瘤，包括但不限于T细胞病症例如T-前淋巴细胞白血病(T-PLL)，包括小细胞和脑状细胞类型；大颗粒性淋巴细胞白血病(LGL)，优选T细胞类型；塞扎里综合征(SS)；成人T细胞白血病淋巴瘤(ATLL)；T-NHL肝脾型淋巴瘤；外周/胸腺后T细胞淋巴瘤(多形和成免疫细胞亚型)；血管成免疫细胞T细胞淋巴瘤；血管中心性(鼻)T细胞淋巴瘤；退行性(Ki1+)大细胞淋巴瘤；肠T细胞淋巴瘤；T-淋巴母细胞；淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、多发性骨髓瘤。

其它增殖病症也可按照本发明治疗，所述病症包括例如增生、纤维化(尤其是肺纤维化，但也包括其它类型的纤维化，例如肾纤维化)、血管生成、银屑病、动脉粥样硬化和血管中的平滑肌增殖，例如血管成形术后的狭窄或再狭窄。

仍然需要替代的生物药物，其相比现有治疗而言具有更大功效和/或更低的严重副作用。本发明涉及在癌症患者包括转移(播散性)疾病患者中的这些未满足的需求。

在多种不同癌症形式中已经显示了增加的uPA的组织和血浆水平(Ulisse等人,CurrentCancerDrugTargets,9：32-71,2009)。在多个小鼠模型中也已经表明UPA涉及癌症和癌症转移。uPA的功能作用通过以下得以证明：通过干扰uPAmRNA表达(Yu等人,CancerRes.50：7623-76331,1990)，通过使用uPA基因缺陷的小鼠(Almholt等人,Int.J.Cancer113：525-532,2005)，和通过应用中和抗体(Ossowski和Reich,Cell35：611-619,1983；Kobayashi等人,Thromb.Haemost.71：474-480,1994)或uPA-特异性抑制剂(Schweinitz等人,J.Biol.Chem.279：33613-33622,2004；Henneke等人,Am.J.Respir.CritCareMed.181：611-619,2010)。

治疗：

术语“治疗”，如本文所述，是指有需要的任何人或其它动物受试者的医学治疗。所述受试者预期已经经历由医生或兽医进行的体检，由医生或兽医已经给出试验性的或确切的诊断，其指示所述治疗的使用对于所述人或其它动物受试者的健康是有益的。所述治疗的时间安排和目的可以因个体不同而异，根据多种因素，例如受试者健康现状。因此，所述治疗可以是预防性的、姑息性的、对症的和/或治愈性的。

对于本发明，预防性的、姑息性的、对症的和/或治愈性的治疗可以代表本发明的单独方面。

作用方式：

本发明的抗体可以经胃肠外，例如静脉内、例如肌内、例如皮下给予。或者，本发明的抗体可以经由非胃肠外途径给予，例如经口或局部给予。本发明的抗体可以是预防性地给予。本发明的抗体可以是治疗性地给予(按需要)。

非限制性实施方案

以下非限制性实施方案进一步描述了本发明：

1.能够结合至人uPA的单克隆抗体或其抗原-结合片段，其特征在于它抑制人tc-uPA的蛋白水解活性和抑制人sc-uPA自人uPA的蛋白水解无活性形式至人uPA的蛋白水解活性的激活。

2.实施方案1的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体抑制受体-结合的人uPA和非-受体-结合的人uPA两者。

3.实施方案1或2中任一项的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体还抑制非人灵长类tc-uPA、例如食蟹猴tc-uPA的蛋白水解活性。

4.实施方案1、2或3中任一项的抗体或其片段，其中所述抗体还抑制非人类sc-uPA例如食蟹猴uPA自非人类uPA的蛋白水解无活性形式至非人类uPA的蛋白水解活性形式的激活。

5.实施方案1-4中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其能够结合至人uPA和来自其它物种的uPA，例如黑猩猩、食蟹猴、恒河猴、小鼠、大鼠、兔、牛、绵羊、猪或骆驼的uPA，特征在于它抑制tc-uPA的蛋白水解活性，和抑制ssc-uPA自uPA的蛋白水解无活性形式至uPA的蛋白水解活性形式的激活。

6.实施方案1-5中任一项的抗体或其片段，其中所述抗体还在原代细胞中抑制内源产生的/天然存在的uPA。

7.实施方案1-6中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体抑制tc-uPA的蛋白水解活性，其蛋白水解活性减少50-100%，例如至少50%、60%、70%、80%、85%、90或95%的蛋白水解活性的减少。

8.实施方案1-7中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体抑制sc-uPA自uPA的蛋白水解无活性形式至uPA的蛋白水解活性形式的激活，其激活率的减少50-100%，例如至少50%、60%、70%、80%、85%、90或95%的激活率的减少。

9.实施方案1-4中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体是双重作用抗uPA抗体，其通过诱导人uPA(SEQIDNO：1)的构象变化而起作用。

10.实施方案9的抗体或其抗原-结合片段，其中所述双重作用抗uPA抗体诱导人uPA(SEQIDNO：1)的氨基酸编号1-33、67-80、187-215、230-234、243-256、260-274、291-306、322-341、375-389和397-410的任一个的构象变化。

11.实施方案9或10的抗体或其抗原-结合片段，其中通过结合至覆盖Ile167-Ala175和Tyr218-Leu224(SEQIDNO：1)的表位，所述双重作用抗uPA抗体诱导人uPA(SEQIDNO：1)的氨基酸编号1-33、67-80、187-215、230-234、243-256、260-274、291-306、322-341、375-389和397-410中的任一个的构象变化。

12.实施方案1-4中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的重链包含：

SEQIDNO：7的氨基酸残基95(Kabat；99sequential)至102(Kabat；108sequential)(DGRDGSWFAY)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1、2或3个可以被不同氨基酸取代，尤其是其中D95(Kabat；99sequential)可以突变为除了D的任何氨基酸，和/或G96(Kabat；100sequential)可以突变为除了G的任何氨基酸，和/或D98(Kabat；102sequential)可以突变为除了D的任何氨基酸，和/或G99(Kabat；103sequential)可以突变为除了G的任何氨基酸。

13.实施方案1-4或12中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的重链包含：

SEQIDNO：7的氨基酸残基31(Kabat和sequential)至35(Kabat和sequential)(SYTMS)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的1个可以被不同氨基酸残基取代。

14.实施方案1-4或12-13中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的重链包含：

SEQIDNO：7的氨基酸50(Kabat和sequential)至65(Kabat；66sequential)(TISGGGSHIYYADSVKG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1、2或3个可以被不同氨基酸残基取代。

15.实施方案1-4或10-14中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的重链包含：

SEQIDNO：7的氨基酸残基95(Kabat；99sequential)至102(Kabat；108sequential)(DGRDGSWFAY)的CDR3序列。

16.实施方案1-4或10-14中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的重链包含：

SEQIDNO：7的氨基酸残基31(Kabat和sequential)至35(Kabat和sequential)(SYTMS)的CDR1序列，和

SEQIDNO：7的氨基酸50(Kabat和sequential)至65(Kabat；66sequential)(TISGGGSHIYYADSVKG)的CDR2序列，和

17.实施方案1-4中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的轻链包含：

SEQIDNO：8的氨基酸残基24(Kabat和sequential)至34(Kabat和sequential)(RTSQSIGDYLH)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的1、2或3个可以被不同的氨基酸取代。

18.实施方案1-4或实施方案17中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的轻链包含：

SEQIDNO：8的氨基酸残基50(Kabat和sequential)至56(Kabat和sequential)(YVSQSIS)的CDR2序列，其中这些氨基酸残基中的1或2个可以被不同的氨基酸取代。

19.实施方案1-4或实施方案17-18中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的轻链包含：

SEQIDNO：8的氨基酸残基89(Kabat和sequential)至97(Kabat和sequential)(QNSHSFPLT)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的1或2个可以被不同的氨基酸取代，尤其是N90可以突变为除了N的任何氨基酸，和/或S91可以突变为除了S的任何氨基酸。

20.实施方案1-4或实施方案17-19中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的轻链包含：

SEQIDNO：8的氨基酸残基24(Kabat和sequential)至34(Kabat和sequential)(RTSQSIGDYLH)的CDR1序列；和

SEQIDNO：8的氨基酸残基50(Kabat和sequential)至56(Kabat和sequential)(YVSQSIS)的CDR2序列；和

SEQIDNO：8的氨基酸残基89(Kabat和sequential)至97(Kabat和sequential)(QNSHSFPLT)的CDR3序列。

21.实施方案1-4或17-19中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的轻链包含：

SEQIDNO：8的氨基酸残基24(Kabat和sequential)至34(Kabat和sequential)(RTSQSIGDYLH)的CDR1序列；和/或

SEQIDNO：8的氨基酸残基50(Kabat和sequential)至56(Kabat和sequential)(YVSQSIS)的CDR2序列；和/或

SEQIDNO：8的氨基酸残基89(Kabat和sequential)至97(Kabat和sequential)(QNSHSFPLT)的CDR3序列，其中N90可以突变为除了N的任何氨基酸，和/或S91可以突变为除了S的任何氨基酸。

22.实施方案1-4或12-14中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的重链包含：

SEQIDNO：7的氨基酸残基31(Kabat和sequential)至35(Kabat和sequential)(SYTMS)的CDR1序列；和/或

SEQIDNO：7的氨基酸50(Kabat和sequential)至65(Kabat；66sequential)(TISGGGSHIYYADSVKG)的CDR2序列；和/或

SEQIDNO：7的氨基酸残基95(Kabat；99sequential)至102(Kabat；108sequential)(DGRDGSWFAY)的CDR3序列，其中D95(Kabat；99sequential)可以突变为除了D的任何氨基酸，和/或G96(Kabat；100sequential)可以突变为除了G的任何氨基酸，和/或D98(Kabat；102sequential)可以突变为除了D的任何氨基酸，和/或G99(Kabat；103sequential)可以突变为除了G的任何氨基酸。

23.实施方案1-4或12-22中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的重链包含：

SEQIDNO：7的氨基酸残基95(Kabat；99sequential)至102(Kabat；108sequential)(DGRDGSWFAY)的CDR3序列，其中D95(Kabat；99sequential)可以突变为除了D的任何氨基酸，和/或G96(Kabat；100sequential)可以突变为除了G的任何氨基酸，和/或D98(Kabat；102sequential)可以突变为除了D的任何氨基酸，和/或G99(Kabat；103sequential)可以突变为除了G的任何氨基酸，

和其中所述抗体的轻链包含：

SEQIDNO：8氨基酸残基50(Kabat和sequential)至56(Kabat和sequential)(YVSQSIS)的CDR2序列；和/或

24.实施方案1-4或12-22中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的重链包含：

SEQIDNO：7的氨基酸残基31(Kabat和sequential)至35(Kabat和sequential)(SYTMS)的CDR1序列；和

SEQIDNO：7的氨基酸50(Kabat和sequential)至65(Kabat；66sequential)(TISGGGSHIYYADSVKG)的CDR2序列；和

SEQIDNO：7的氨基酸残基95(Kabat；99sequential)至102(Kabat；108sequential)(DGRDGSWFAY)的CDR3序列；

和其中所述抗体的轻链包含：

SEQIDNO：8氨基酸残基50(Kabat和sequential)至56(Kabat和sequential)(YVSQSIS)的CDR2序列；和

25.实施方案1-4中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的轻链包含SEQIDNO：18，其中V2(Kabat和sequential)可以突变为I和/或T22(Kabat和sequential)可以突变为S和/或V58(Kabat和sequential)可以突变为I和/或T69(Kabat和sequential)可以突变为S和/或N90(Kabat和sequential)可以突变为除了N的任何氨基酸，和/或S91(Kabat和sequential)可以突变为除了S的任何氨基酸，和所述抗体的重链包含SEQIDNO：17，其中E1(Kabat和sequential)可以突变为D和/或Q3(Kabat和sequential)可以突变为K和/或S49(Kabat和sequential)可以突变为A和/或A93(Kabat；97sequential)可以突变为T和/或D95(Kabat；99sequential)可以突变为除了D的任何氨基酸，和/或G96(Kabat；100sequential)可以突变为除了G的任何氨基酸，和/或D98(Kabat；102sequential)可以突变为除了D的任何氨基酸，和/或G99(Kabat；103sequential)可以突变为除了G的任何氨基酸。

26.实施方案1-4或实施方案25中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的轻链包含SEQIDNO：18，其中V2(Kabat和sequential)可以突变为I和/或T22(Kabat和sequential)可以突变为S和/或V58(Kabat和sequential)可以突变为I和/或T69(Kabat和sequential)可以突变为S和/或N90(Kabat和sequential)可以突变为除了N的任何氨基酸，和/或S91(Kabat和sequential)可以突变为除了S的任何氨基酸，和组合到κ恒定部分或其变体，和所述抗体的重链包含SEQIDNO：17，其中E1(Kabat和sequential)可以突变为D和/或Q3(Kabat和sequential)可以突变为K和/或S49(Kabat和sequential)可以突变为A和/或A93(Kabat；97sequential)可以突变为T和/或D95(Kabat；99sequential)可以突变为除了D的任何氨基酸，和/或G96(Kabat；100sequential)可以突变为除了G的任何氨基酸，和/或D98(Kabat；102sequential)可以突变为除了D的任何氨基酸，和/或G99(Kabat；103sequential)可以突变为除了G的任何氨基酸，和组合到IgG1或IgG1变体或IgG2或IgG2变体或IgG4或IgG4变体恒定部分。

27.实施方案1-4或12-24中任一项的人源化抗体或其抗原-结合片段，其中所述可变重链包含SEQIDNO：17和/或所述可变轻链包含SEQIDNO：18。

28.实施方案1-4或12-24中任一项的人源化抗体或其抗原-结合片段，其能够结合uPA，其中所述重链包含SEQIDNO：21和/或所述轻链包含SEQIDNO：22。

29.实施方案1-4或12-24中任一项的人源化抗体或其抗原-结合片段，其中所述重链包含：

包含SEQIDNO：9的CDR-H1，位于氨基酸残基31-35(Kabat)；和/或

包含SEQIDNO：10的CDR-H2，位于氨基酸残基50-65(Kabat)；和/或

包含SEQIDNO：11的CDR-H3，位于氨基酸残基95-102(Kabat)。

30.实施方案1-4、12-24或29中任一项的人源化抗体或其抗原-结合片段，其中所述轻链包含：

包含SEQIDNO：12的CDR-L1，位于氨基酸残基24-34(Kabat)；和/或

包含SEQIDNO：13的CDR-L2，位于氨基酸残基50-56(Kabat)；和/或

包含SEQIDNO：14的CDR-L3，位于氨基酸残基89-97(Kabat)。

31.实施方案1-4或29-30中任一项的人源化抗体或其抗原-结合片段，其中所述重链包含：

包含SEQIDNO：9的CDR-H1，位于氨基酸残基31-35(Kabat)；和

包含SEQIDNO：10的CDR-H2，位于氨基酸残基50-65(Kabat)；和

包含SEQIDNO：11的CDR-H3，位于氨基酸残基95-102(Kabat)

和其中所述轻链包含：

包含SEQIDNO：12的CDR-L1，位于氨基酸残基24-34(Kabat)；和

包含SEQIDNO：13的CDR-L2，位于氨基酸残基50-56(Kabat)；和

包含SEQIDNO：14的CDR-L3，位于氨基酸残基89-97(Kabat)。

32.实施方案1-11中任一项的抗原或其抗原-结合片段，其与实施方案22的抗体竞争结合至人uPA(SEQIDNO1)或食蟹猴uPA(SEQIDNO3)。

33.实施方案1-11中任一项的抗原或其抗原-结合片段，其与实施方案23的抗体竞争结合至人uPA(SEQIDNO1)或食蟹猴uPA(SEQIDNO3)。

34.实施方案1-11中任一项的抗原或其抗原-结合片段，其与实施方案26的抗体竞争结合至人uPA(SEQIDNO1)或食蟹猴uPA(SEQIDNO3)。

35.实施方案1-11中任一项的抗原或其抗原-结合片段，其与实施方案27的抗体竞争结合至人uPA(SEQIDNO1)或食蟹猴uPA(SEQIDNO3)。

36.实施方案1-11中任一项的抗原或其抗原-结合片段，其与实施方案30的抗体竞争结合至人uPA(SEQIDNO1)或食蟹猴uPA(SEQIDNO3)。

37.实施方案1-11中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其结合至人uPA(SEQIDNO：1)上的不连续表位/结合区，其中所述不连续表位/结合区的第一结合部分被SEQIDNO：1的氨基酸编号167-175所限定，和所述不连续表位/结合区的第二结合部分被SEQIDNO：1的氨基酸编号218-224所限定。

38.实施方案1-11中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其结合至人uPA(SEQIDNO：1)上的不连续表位/结合区的第一结合部分的一个或多个氨基酸，其中所述不连续表位/结合区的第一结合部分被SEQIDNO：1的氨基酸编号167-175所限定；和结合至所述不连续表位/结合区的第二结合部分的一个或多个氨基酸，其中所述第二部分被SEQIDNO：1的氨基酸编号218-224所限定。

39.实施方案1-11中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其结合至人uPA(SEQIDNO：1)上的不连续表位/结合区，其中所述结合区包含一个或多个(优选地两个或更多个、优选地三个或更多个、优选地四个或更多个、优选地五个或更多个、优选地六个或更多个、优选地七个或更多个、优选地八个或更多个、优选地所有九个)SEQIDNO1的以下氨基酸：Ile167、Glu168、Asn169、Gln170、Pro171、Trp172、Phe173、Ala174和Ala175，和一个或多个(优选地两个或更多个、优选地三个或更多个、优选地四个或更多个、优选地五个或更多个、优选地六个或更多个、优选地所有七个)SEQIDNO：1的以下氨基酸：Tyr218、Leu219、Gly220、Arg221、Ser222、Arg223和Leu224。

40.抗体或其抗原-结合片段，其与实施方案23、24、27、28或31的抗体竞争结合至人uPA(SEQIDNO：1)上的不连续表位/结合区，其中所述不连续表位/结合区的第一结合部分被SEQIDNO：1的氨基酸编号167-175所限定，和所述不连续表位/结合区的第二结合部分被SEQIDNO：1的氨基酸编号218-224所限定。

41.前述实施方案中任一项的抗体或其片段，其中所述抗体选自单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体的抗原结合区、scFv、Fab、F(ab')2、Fv、和单链抗体。

42.前述实施方案中任一项的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是选自以下的抗原-结合片段：

Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、F(ab)S、Fv、单链、dsFv、Fd、和dAb片段；VH、VL、VhH、和V-NAR结构域；包含单一VH和单一VL链的一价分子；微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体、和κ体；骆驼IgG；IgNAR；以及一个或多个分离的CDR或功能性互补位，其中所述分离的CDR或抗原-结合残基或多肽可以缔合或连接在一起以形成功能性抗体片段。

43.前述实施方案中任一项的抗体或其片段，其中所述抗体被缀合至治疗药。

44.前述实施方案中任一项的抗体或其片段，用作药物。

45.前述实施方案中任一项的抗体或其片段，用于制备治疗自身免疫性疾病和/或慢性炎症的药物。

46.前述实施方案中任一项的抗体或其片段，用于治疗癌症疾病和/或自身免疫性疾病和/或慢性炎症。

47.实施方案44-46的抗体或其片段，用于治疗类风湿性关节炎。

48.治疗自身免疫性疾病或慢性炎性疾病的方法，其包括将前述实施方案中任一项的抗体或其片段给予有需要的受试者。

49.药物组合物，其包含与药学上可接受的载体配制在一起的实施方案1-48中任一项的一个或多个抗uPA抗体或其片段。

50.鉴定抗uPA抗体的方法，包括以下步骤：(a)产生抗uPA抗体；(b)自步骤(a)中产生的抗体中鉴定抗体，其抑制人tc-uPA的蛋白水解活性；(c)自步骤(a)中产生的抗体中鉴定抗体，其抑制人sc-uPA自人uPA的蛋白水解无活性形式至人uPA的蛋白水解活性形式的激活；和(d)选择抗体，其在步骤(b)和(c)中都是抑制性的。

51.实施方案50的方法，其中所述方法进一步包括鉴定抗uPA抗体的步骤，所述抗体是抑制性的，甚至当人uPA结合至人uPAR时。

52.实施方案50的方法，其中所述方法进一步包括鉴定抗uPA抗体的步骤，所述抗体抑制内源衍生的人uPA。

53.实施方案50的方法，其中所述方法进一步包括鉴定抗uPA抗体的步骤，所述抗体还结合和抑制来自其它物种的uPA，例如黑猩猩、食蟹猴、恒河猴、小鼠、大鼠、兔、牛、绵羊、猪或骆驼的uPA。

54.产生能够结合至人uPA的抗体或其抗原-结合片段的方法，其中按照实施方案50-53中任一项的鉴定方法来鉴定所述抗体。

实施例

实施例1：人sc-uPA的产生

对于重组人sc-uPA(SEQIDNO：1)表达，通过标准技术合成了全长cDNA序列(SEQIDNO：2)并克隆入具有CMV启动子的哺乳动物表达构建体。所产生的表达质粒称为pJSV-人前-uPA。通过DNA测序证实所有构建体。在人sc-uPA的cDNA序列(SEQIDNO2)中，编码成熟sc-uPA蛋白的核苷酸序列的前面是编码20个氨基酸信号肽[MRALLARLLLCVLVVSDSKG]的核苷酸序列。该信号肽在成熟人sc-uPA蛋白中不存在。

使用293Fectin?转染试剂(LifeTechnologies-Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，通过瞬时转染，重组野生型人sc-uPA蛋白在人胚肾293细胞(HEK293)中表达。在转染后72小时收获细胞培养基。

重组野生型sc-uPA蛋白以流过方式和SP纯化工艺通过Q色谱纯化，和额外的Superdex75作为精制步骤。最终蛋白产物的纯度>95%(经SDS-PAGE,BioanalyzerCE和SEC-HPLC评估)和内毒素<1EU/mg(经动态浊度试验而评价)。

实施例2：食蟹猴sc-uPA的产生

对于重组食蟹猴sc-uPA(SEQIDNO：3)的表达，通过标准技术合成了全长cDNA序列(SEQIDNO：4)和克隆入表达载体pcDNA3.1+(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，其在C-端具有6xHis标签。所产生的表达质粒称为pcDNA3.1-食蟹猴前-uPA-6xHis。在食蟹猴sc-uPA的cDNA序列(SEQIDNO：4)中，编码成熟sc-uPA蛋白的核苷酸序列的前面是编码信号肽的核苷酸序列，基于人和食蟹猴序列之间的同源性，其被预测为长度20个氨基酸[MRALLAHLLLCVLVVSDSKS]。食蟹猴sc-uPA信号肽的确切的身份尚未确定。该信号肽在成熟食蟹猴sc-uPA蛋白中不存在。

使用293Fectin?转染试剂(LifeTechnologies-Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，在培养基(RocheAppliedScience,MannheimGermany)中存在10μg/mL抑肽酶下(PetersenHH,等人EurJBiochem.2001Aug；268(16)：4430-9；BlouseGE,等人JBiolChem.2009Feb13；284(7)：4647-57)(以防在激活部位的蛋白水解切割)，通过瞬时转染，重组食蟹猴sc-uPA蛋白在HEK293细胞中表达。在转染后24小时收获细胞培养基。

重组食蟹猴sc-uPA蛋白通过镍柱纯化，接着通过Superdex_75纯化。在10μg/mL抑肽酶存在时进行镍柱纯化。Superdex_75缓冲液和最终的贮存缓冲液是20mMNaAc,150mMNaCl,pH5.0(LinL,等人JBiolChem.2010Apr2；285(14)：10982-92)，以防自发激活。最终蛋白产物的纯度>90%(经SDS-PAGE,BioanalyzerCE和SEC-HPLC评估)和内毒素<1EU/mg(经动态浊度试验而评价)。

实施例3：单克隆抗uPA抗体的产生：

为了产生小鼠单克隆抗体(mAb)，RBF小鼠用重组人sc-uPA(SEQIDNO：1)免疫。

小鼠经皮下免疫。对于首次免疫，将20μg抗原与完全弗氏佐剂混合。在后续免疫中用不完全弗氏佐剂与相同量的抗原。末次免疫后10天，经ELISA分析来自小鼠的眼-血的uPA-特异性抗体。具有阳性效价的小鼠经静脉内增强接种在PBS中的10μg抗原，并在3天后处死。经无菌操作取脾脏并分散成单细胞悬液。通过电融合进行脾细胞和骨髓瘤细胞的融合。使用如实施例5所述的特异性结合测定法，选择分泌特异性抗体的杂交瘤。

实施例4：结合至人sc-uPA的抗体的初步筛选：

免疫板(Maxisorb,Nunc)用2μg/ml重组人sc-uPA包被。将1：1体积比的20μg/ml抑肽酶的PBS和杂交瘤培养上清液，加入板中并在室温孵育1小时。用HRP-缀合的对鼠抗体具有特异性的多克隆抗体(pAb)进行检测。

实施例5：偶联的酶原激活测定

uPA将酶原纤溶酶原转化为活性纤溶酶。反过来，存在正反馈环，其中纤溶酶也将sc-uPA激活为tc-uPA，因此增强了反应动力学。

我们改动了来自Blouse等人2009(BlouseGE,等人JBiolChem.2009Feb13；284(7)：4647-57)的该测定，并将其用于鉴定抑制sc-uPA激活和/或抑制tc-uPA催化活性的抗uPA抗体。简而言之，在微量滴定板(PerkinElmer,#6005659)中在室温下，将含有抗uPA试验抗体的10μL杂交瘤培养上清液与40μL重组人sc-uPA(SEQIDNO：1)孵育30min，其中重组人sc-uPA的终浓度为在HBS-B缓冲液(30mMHEPES,135mMNaCl,1mMEDTA,0.1%BSA,pH7.4)中的0.625nM。未见上清液对测定动力学的显著影响，这允许直接自粗制培养上清液中筛选非纯化的抗体。孵育后，加入50μL混合物，其含有人纤溶酶原(americandiagnosticainc,#400)至终浓度0.5μM和显色的纤溶酶底物H-D-Val-Leu-Lys-对硝基苯胺(Chromogenix,#820332)，其称为S-2251，终浓度0.5mM。记录S-2251水解在405nm处的吸光度在3小时的时间进程内的抛物线型增加。吸光度用于度量纤溶酶活性，其是uPA活性的间接的度量。导致低的或甚至无吸光度的抗体被鉴定为功能性地抑制人uPA，并且使用来自食蟹猴(cyno)的重组sc-uPA替代人sc-uPA，将其包括用于该测定法的改良版本的进一步测试。所有其它组分和测定步骤都与上述的相同。选择能够功能性地抑制cynouPA的抗体，用于进一步表征。所选抗体的纯化批次用于测定抑制的IC₅₀值(表9)。

在测定法中用食蟹猴sc-uPA(SEQ.IDNO：3)测试的0266-000-0010抗体，得到的IC₅₀值为0.9nM，显示该抗体也可有效地中和食蟹猴sc-uPA。

实施例6：在偶联的酶原激活测定法中的uPAR受体固定化sc-uPA

人uPA天然地结合至其同源的uPA受体(uPAR)。使用功能性测定，其中测试了固定在人uPAR上的人sc-uPA将人纤溶酶原激活为纤溶酶的能力。这使得选择功能性抗体成为可能，所述功能性抗体不与uPAR竞争结合至uPA，因此能够功能性地抑制受体-结合的和非-受体-结合的uPA两者。简而言之，显示出在细胞表面表达uPAR的U937细胞，在HBS-B缓冲液中洗涤，然后用甘氨酸缓冲液(pH3.0)处理3min以剥离内源性结合的uPA。然后低pH用HEPES缓冲液(500mMHEPES,100mMNaCl,pH7.5)中和。以10x10⁶细胞/mL，将细胞重悬于HBS-B缓冲液，并与12.5nM重组人sc-uPA(SEQIDNO：1)在室温下孵育1小时。细胞用HBS-B缓冲液洗涤3次以去除未结合的sc-uPA，和然后将25μL，相当于0.25x10⁶细胞，分布在96孔微量滴定板(PerkinElmer,#6005659)的孔中，并与含有抗uPA试验抗体的25μL杂交瘤培养上清液在室温下孵育30min。孵育后，加入50μL混合物，其含有人纤溶酶原(americandiagnosticainc,#400)至终浓度0.5μM和显色的纤溶酶底物H-D-Val-Leu-Lys-对硝基苯胺(Chromogenix,#820332)，其称为S-2251，终浓度0.5mM。实时监测S-2251水解在405nm处的吸光度在3小时的时间进程内的抛物线型增加。吸光度用于度量纤溶酶活性，其是uPA活性的间接的度量，尽管结合至uPAR。在该测定法中，用于参考，0266-0000-0010和0266-0000-0015以及人源化抗体0266-0000-0043都抑制人uPA(SEQIDNO：1)的活性，其IC₅₀值<0.7nM。导致低的或甚至无吸光度的抗体被鉴定为功能性地能够抑制人uPA(尽管固定在uPAR上)，并且选择其用于进一步测试。

实施例7：抗催化抗uPA抗体的鉴定

使用检测tc-uPA-催化的纤溶酶原向纤溶酶的转化的测定法，来确定在偶联的酶原激活测定法(参见实施例5)中选择的功能性地中和抗体是否会抑制人tc-uPA的催化活性。简而言之，在微量滴定板(PerkinElmer,#6005659)中，在室温下，将含有抗uPA试验抗体的10μL杂交瘤培养上清液与40μL重组人tc-uPA(R&DSystems,#1310-SE)预孵育30min，其中重组人tc-uPA的终浓度为在HBS-B缓冲液(30mMHEPES,135mMNaCl,1mMEDTA,0.1%BSA,pH7.4)中的0.6nM。未见上清液对测定动力学的显著影响，这允许直接自粗制培养上清液中筛选非纯化的抗体。孵育后，加入50μL混合物，其含有人纤溶酶原(americandiagnosticainc,#400)至终浓度0.5μM和显色的纤溶酶底物H-D-Val-Leu-Lys-对硝基苯胺(Chromogenix,#820332)，其称为S-2251，终浓度0.5mM。实时监测S-2251水解在405nm处的吸光度在3小时的时间进程内的抛物线型增加。吸光度用于度量纤溶酶活性，其是在纤溶酶原向纤溶酶的转化中的tc-uPA催化活性的间接的度量。选择能够中和人tc-uPA的催化活性的抗体，用于进一步筛选。所选抗体的纯化批次用于测定抑制的IC₅₀值(表9)。

实施例8：抑制sc-uPA自无活性形式至活性形式的激活的抗uPA抗体的鉴定

为了确定在偶联的酶原激活测定法(参见实施例5)中鉴定的功能性地中和抗uPA抗体是否能够抑制人sc-uPA自无活性形式至uPA的活性形式的激活，在激活测定法中进一步测试它们，其中纤溶酶使得人sc-uPA自无活性形式至活性形式激活。简而言之，在微量滴定板(PerkinElmer,#6005659)中在室温下，将含有抗uPA试验抗体的10μL杂交瘤培养上清液与40μL重组人sc-uPA(SEQIDNO：1)孵育30min，其中重组人sc-uPA的终浓度为在HBS-B缓冲液(30mMHEPES,135mMNaCl,1mMEDTA,0.1%BSA,pH7.4)中的6.4nM。孵育后，加入50μL混合物，其含有人纤溶酶(Raybiotech,Inc,#MD-14-0070P)至终浓度5nM和显色的uPA底物<Glu-Gly-Arg-对硝基苯胺(Chromogenix,#S-2444)，其称为S-2444，终浓度0.5mM。记录S-2444水解在405nm处的吸光度在3小时的时间进程内的抛物线型增加。吸光度用于人uPA的活性形式的直接度量。

双重作用抗体的选择和表征

抑制uPA包括受体-结合的uPA(参见实施例5和6)和被发现同时具有抗激活(参见实施例8)和抗催化能力(参见实施例7)的抗体被定义为双重作用，并且选择其用于进一步表征。所选抗体的纯化批次用于确定实施例5、7和8所述的测定法的抑制的IC50值(参见表9)。

实施例9：功能性地抑制内源衍生的uPA的抗体

为了评价所选的双重作用抗uPA单克隆抗体是否能够功能性地抑制内源衍生的uPA，我们建立了测定法，其中可测定人M1和M2巨噬细胞衍生的uPA的活性。简而言之，从分离自人的血沉棕黄层的单核细胞，将巨噬细胞成熟为M1和M2。将细胞洗涤并重悬于RM缓冲液(0.4mMMgSO₄,0.5mMMgCl₂,0.5mMCaCl₂,20mMHEPES,0.01%BSA,pH7.4)中。在96孔微量滴定板(PerkinElmer,#6005659)的每孔中加入40微升，相当于0.5x10⁶细胞，并加入10μL纯化的抗uPA试验抗体，将反应物在室温下孵育30min。孵育后，加入50μL混合物，其含有人纤溶酶原(americandiagnosticainc,#400)至终浓度0.5μM和显色的纤溶酶底物H-D-Val-Leu-Lys-对硝基苯胺(Chromogenix,#820332)，其称为S-2251，终浓度0.5mM。在96孔微量滴定板中，记录S-2251水解在405nm处的吸光度在3小时的时间进程内的抛物线型增加。吸光度用于度量纤溶酶活性，其是衍生自巨噬细胞的uPA活性的间接的度量。在该测定法中，用于参考，0266-0000-0010抑制uPA的IC₅₀为1.3nM，和0266-0000-0015的IC₅₀<0.7nM。重要的是，人源化抗体，0266-0000-0043，也能够抑制衍生自巨噬细胞的uPA活性，其IC₅₀为2.1nM。选择能够抑制来自M1和M2巨噬细胞的uPA的双重作用抗体作为治疗类风湿性关节炎的候选物，因为据信巨噬细胞在该病的发展中起到主要作用。

实施例10：结合至人体外产生的巨噬细胞，经流式细胞术分析

材料与方法：血沉棕黄层得自来自哥本哈根大学医院的正常健康志愿者。使用HumanMonocyteEnrichmentCoctailRosetteSeparation，分离单核细胞。在37℃,5%CO₂，在40ng/mlrhM-CSF存在时，将纯化的单核细胞培养6天。在第三天将培养基更换为含有40ng/mlrhM-CSF的新鲜培养基。在第六天，将培养基再次变为含有rhIFN-γ(50ng/ml)的培养基，和将细胞进一步孵育过夜，以分化细胞至M1巨噬细胞。细胞用10、1或0.1μg/ml抗uPAmAb克隆0266-0000-0010(IgG1)或0266-0000-0015(IgG1)染色。小鼠IgG1同种型对照(10μg/ml)用作阴性对照。第二APC-缀合的山羊-抗小鼠IgG用于检测。在BDFACSFortessa(Becton&Dickinson)上进行流式细胞术分析。

结果：抗uPA单克隆抗体克隆(0266-0000-0010和0266-0000-0015)都表明结合至M1巨噬细胞(图1)。这两种抗体显示出剂量依赖性结合，具有类似效力，尽管对于0266-0000-0015记录到稍高的MFI值，表明稍高的亲和力(表1)。这与Biacore分析所产生的亲和力数据是一致的。10μg/ml的同种型对照抗体(小鼠IgG1)仅显示出低背景染色。

表1.用两个不同克隆的uPAmAb染色的M1巨噬细胞的MFI值

表1显示了用两个不同克隆的uPA抗体染色的M1巨噬细胞的平均荧光强度(MFI)值。

实施例11：抗原结合亲和力的测定

通过SPR，使用BiacoreT200仪器(GEHealthcare)，测定了抗uPAmAb对人和食蟹猴sc-uPA(SEQIDNO：1和3)的亲和力。使用直接结合程序进行这些研究。在传感器芯片表面上经由游离胺基团至羧基甲基化葡聚糖膜(CM5/CM4)将各自的抗体共价地偶联，至300-500共振单位(RU)的水平。以不同浓度，注射在HBS-B(300mMHepes,135mMNaCl,1mMEDTA和1%BSA,pH7,4)中的Sc-uPA，接着是离解期，用恒定的缓冲液流速流过传感器芯片表面。注射时间是60秒，接着是180秒离解。通过注射2个短脉冲的甘氨酸-HClpH1.5进行再生。

使用1：1相互作用朗格谬尔拟合模型计算相互作用的动力学参数(k_a、k_d和K_D)。

测定的亲和力都是在低nM范围。

人或食蟹猴sc-uPA至固定化mAb0266-0000-0010和0266-0000-0015之间的相互作用的动力学参数经SPR分析而测定。结果见表2。测定结合速率常数(ka)和离解速率常数(kd)。计算平衡离解常数为KD=kd/ka。

表2.sc-uPA与两种不同的uPAmAb之间的相互作用的动力学参数。

mAb	分析物	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
					0266-0000-0010	人sc-uPA	3,40E+05	3,45E-04	1,02E-09
0266-0000-0010	食蟹猴sc-uPA	4,73E+05	5,74E-05	1,21E-10
					0266-0000-0015	人sc-uPA	1,03E+06	3,81E-04	3,70E-10
0266-0000-0015	食蟹猴sc-uPA	1,35E+06	7,17E-03	5,32E-09

实施例12：自杂交瘤克隆抗uPAmAbVL和VHcDNA并测序

自表达两种不同的抗uPAmAb的杂交瘤中提取总RNA，所述杂交瘤称为：m-uPA-1F21A1和m-uPA-1F58A1，分别表达抗体0266-0000-0010和0266-0000-0015。使用RNeasyminikit(Qiagen,目录号74106)自杂交瘤细胞中提取RNA，和所得RNA的等分试样用作模板，使用SMARTerRACEcDNA扩增试剂盒(Clontech,目录号634923)按照制造商对于5’RACE的说明书和使用5’RACECDS引物A以及SMARTerIIA寡核苷酸，用于第一条链cDNA合成。将来自两种抗uPA杂交瘤的每一种的轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)编码区cDNA随后使用通用引物A混合物(UPM)以及小鼠LC,κ特异性反向引物(5’ggagctggtggtggcatctcaggacctttg3’)或识别小鼠IgG1序列的反向引物(5’aaaaatctagaATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC3’)一起进行PCR扩增。使用phusionPCR混合物(FinnZymes,目录号：F-531L)进行PCR反应。使用ZerobluntTopoPCR克隆试剂盒(Invitrogen,目录号K280040)克隆所得PCR片段，并测序。

实施例13：抗uPA抗体的人源化模型

0266-0000-0010序列得自杂交瘤1F21A1克隆，如实施例12所述，和重链和轻链的可变部分列于表3。在此，完整0266-0000-0010VH示于SEQIDNO：7和按照KabatCDR定义的CDR分别示于SEQIDNO：9、SEQIDNO：10和SEQIDNO：11。进一步，完整0266-0000-0010VL示于SEQIDNO：8和按照KabatCDR定义的CDR分别示于SEQIDNO：12、SEQIDNO：13和SEQIDNO：14。

本实施例中使用的所有编号是指Kabat编号方案。

表3.0266-0000-0010的序列表

在MOE(可得自www.chemcomp.com)中使用标准技术构建0266-0000-0010的3D模型，和有效CDR区的4.5?内的所有残基(VH：31-35B、50-58、95-102；VL：24-34、50-56、89-97)定义为掩蔽残基。掩蔽残基对于维持CDR中的结合都是潜在重要的。

0266-0000-0010的掩蔽残基包括对于重链而言的位置1-4、22、27-37、47-60、69-71、73、78、91-104和对于轻链而言的1-5、6、22-36、46-58、62、64-71、87-98。

使用种系搜索和人工检查，VH3_21和JH4被鉴定为对于重链而言的合适的人种系组合并且相应序列列于表4，SEQIDNO：15，和V6D_41和JK4被鉴定为对于轻链而言的合适的人种系组合并且相应序列列于表4，SEQIDNO：16，但也可使用其它种系。

表4.对于重链和轻链而言的可变人种系组合序列

现在按照以下法则可以进行人源化：

-按人获得所述掩蔽之外的残基。

-按鼠获得所述掩蔽之内和KabatCDR之内的残基。

-按共有序列获得具有小鼠/种系共性的所述掩蔽之内和KabatCDR之外的残基。

-按人获得具有小鼠/种系差异的所述掩蔽之内和KabatCDR之外的残基，和这些残基经历潜在的回复突变。

将0266-0000-0010的有效CDR区移植入种系，形成0266-0000-0010的基本的人源化构建体hz0266-0000-0010，和其可变部分列于表5。所述重链示于SEQIDNO：17和所述轻链示于SEQIDNO：18。

表5.人源化0266-0000-0010可变重链和轻链序列

根据hz0266-0000-0010序列的分析，按照Kabats定义的CDR示于表6和与相应的鼠mAb0266-0000-0010相同。

表6.hz0266-0000-0010的CDR序列

CDR_H1	SEQ ID NO：9	SYTMS
			CDR_H2	SEQ ID NO：10	TISGGGSHIYYADSVKG
CDR_H3	SEQ ID NO：11	DGRDGSWFAY
			CDR_L1	SEQ ID NO：12	RTSQSIGDYLH
CDR_L2	SEQ ID NO：13	YVSQSIS
			CDR_L3	SEQ ID NO：14	QNSHSFPLT

0266-0000-0010和hz0266-0000-0010之间在掩蔽残基中的任何差异将会产生潜在回复突变，潜在回复突变列表见表7。

表7.潜在回复突变

hz0266-0000-0010VH	E1D, Q3K, S49A, A93T
		hz0266-0000-0010VL	V2I, T22S, V58I, T69S

进一步，前导含有至少1个在轻链的位置90-91的潜在脱酰胺位点NS和2个在重链的95-96和98-99的潜在isoasp位点。为了评价没有这些潜在位点的候选者，制备表8中所示的突变体。

表8.hz0266-0000-0010的潜在突变体

为了调查所有潜在人源化mAb，必须产生以上表7和表8中列举的突变体的所有组合，并且根据亲和力筛选、表达分析和稳定性研究，筛选最终的人源化候选者。

实施例14：市售的单克隆抗体的表征

已经报道了若干先有技术抗人-uPA单克隆抗体并且已有市售。在用于选择本申请中报告的我们的抗uPA双重作用单克隆抗体(参见实施例5、7和8)的测定法中测试了适合我们使用的所有抗体。表9列举的结果显示了18种所测抗体中有4个能够在偶联的酶原激活测定法(参见实施例5)和在催化测定法(参见实施例7)中抑制人uPA活性，但在sc-uPA激活测定法(参见实施例8)中不能。一种抗体能够在偶联的酶原激活测定法(参见实施例5)和sc-uPA激活测定法(实施例8)中抑制uPA活性。其它9种抗体在任何测定法中都不显著地抑制uPA。重要的是，现有技术的抗体在所有3种测定法(参见实施例5、7和8中的测定法)中都不能抑制uPA活性。

表9：在所列实施例中描述的测定法中对于NovoNordisk和现有技术单克隆抗体的IC₅₀值[nM]。

(-)表明非-抑制抗体。

实施例15：在人嗜中性粒细胞(PMN)中，功能性地抑制内源uPA的抗体

为了评价在人嗜中性粒细胞中所选双重作用抗uPA单克隆抗体是否能够功能性地抑制内源uPA，我们使用实施例9所述的测定法。

PMN得自M?l?v的NovoNordiskA/S的志愿者供体提供的血液。程序已经获得哥本哈根地区科学伦理委员会(ScientificEthicalCommitteesofRegionCopenhagen)的批准(流水号H-D-2007-0055)。将新鲜抽取的血液收集入含EDTA的小管。在室温下通过Ficoll-PaquePLUS(GEHealthCare)梯度(3部分)将血液离心30min(400xg)分离血细胞(4部分)。将含有粒细胞的一层悬浮于含有葡聚糖-500(Sigma)的PBS达1h以去除污染的红细胞。在室温下将上清液离心5min(250xg)，所剩红细胞使用0.2%NaCl达55秒经渗透压裂解。通过1.2%NaCl+PBS使溶液成为等渗的和在250xg离心5min，然后重复渗透压裂解。离心后，将PMN重悬于反应混合物(RM)：HBSS：(目录号14175Gibco)137mMNaCl,5.3mMKCl,0.33mMNa₂HPO₄,4mMNaHCO₃,0.44mMKH₂PO₄,5mM葡萄糖，补充有0.4mMMgSO₄*7H₂O,0.5mMMgCl₂,0.5mMCaCl₂,20mMHEPES。通过NucleoCounter(Chemometec)测定细胞密度。将测试化合物溶于RM。悬液含有>95%PMN。

将10nM重组人GM-CSF加入PMN悬液，因为我们先前证明这能增加uPA活性。各孔用人纤维蛋白原(目录号F3879-1G,Sigma)包被。各孔含有0.35-0.510⁶PMN、人纤溶酶原、0.5μM(Americandiagnostic)、0.5mM显色的纤溶酶底物H-D-Val-Leu-Lys-对硝基苯胺S-2251(Chromogenix)和抗uPA试验抗体。在37℃，在SpectraMaxPlus(MolecularDevices)上测定在405和650nm处的吸光度，每5分钟一次，共3小时。源自吸光度(405–650nm)的曲线是纤溶酶活性的度量。曲线是可区分的，最大斜率用作最大uPA活性。

结果显示双重作用抗体0266-0000-0010抑制uPA，其IC₅₀为14nM，和0266-0000-0015的IC₅₀为0.9nM。单一作用0266-0000-0016和0266-0000-0019表现出较低的效力，其IC₅₀分别为25和~200nM。

实施例16：抗人uPA抗体的人源化

抗体的人源化形式具有基本上来自人免疫球蛋白(称为受体免疫球蛋白)的可变框架区和基本上来自鼠抗体的CDR，在本例中，是mAb0266-0000-0010(SEQIDNO：7和8)。通过3D模型分析，预测了可能对维持结合亲和力和特异性是关键的回复突变。产生了抗体0266-0000-0010的人源化形式，mAb0266-0000-0043，并使用偶联的酶原激活测定法，用显色底物，通过SPR和uPA功能性测定法对其进行了评价。

实验数据表明mAb0266-0000-0043和重组产生形式的mAb0266-0000-0010(rec0266-0000-0010)对人和食蟹猴sc-uPA具有类似的结合特性；和对人或食蟹猴uPA所致的纤溶酶原激活的相当的抑制效应。mAb0266-0000-0043和rec0266-0000-0010的蛋白序列见表10。为了克隆目的，SEQIDNO20的VL至CL转变中的序列，携带RTVAA序列基序，即衍生自人κ序列的两个残基“TV”，替代完整鼠RADAAκ序列。

表10.mAb0266-0000-0043和rec0266-0000-0010的氨基酸序列

对于mAb的表达载体的产生

将轻链或重链的编码序列插入pJSV002(一种基于CMV启动子的表达载体)，介于EcoRI和BamHI位点之间。在编码序列之前加入来自CD33的信号肽(mplllllpllwagala)，以促进分泌。

表11.mAb0266-0000-0043和rec0266-0000-0010的DNA序列

重组mAb表达

通过使用293fectin^TM试剂(Invitrogen,目录号12347)，以1：1的量比率，将编码各自的轻链和重链的质粒DNA共转染入Freestyle?293-F细胞(LifeTechnologies,目录号R79007)。以1×10⁶细胞/ml，将已转染的细胞培养于无血清的FreeStyle293培养基(Gibco,目录号12338)中，所述培养基含有4mM谷氨酰胺(LifeTechnologies,目录号25030-024)、1%PLURONIC?F68(Gibco,目录号24040-032)和青霉素-链霉素抗生素(LifeTechnologies,目录号10378016)，并在37℃,8%CO₂振荡孵育5天。在转染后5天收集上清液并通过离心澄清。

DNA转染：

·转染所用的培养物的细胞密度是0.9-2.0x10⁶细胞/ml。

·每ml细胞培养物使用0.5μg轻链(LC)载体DNA和0.5μg重链(HC)载体DNA的混合物。

·将DNA稀释于Opti-MEM培养基(Gibco)中，至30μl培养基/μgDNA，混合并在室温下(23-25℃)孵育5min。

·293Fectin?(Invitrogen)用作转染试剂，浓度为1μl/μgDNA。

·将293Fectin?在Opti-MEM培养基(Gibco)中稀释30倍，混合并在室温下(23-25℃)孵育5min。

·将DNA和293Fectin溶液混合并在室温下(23-25℃)放置孵育25min。

·然后将DNA-293Fectin混合物直接加入细胞培养物。

·在37℃,8%CO2和125rpm，将已转染的细胞培养物移至振荡培养箱。

·转染后5天，通过离心收获细胞培养上清液，接着通过0.22μmPES滤器(Corning)过滤。

·使用FortéBioOctet系统和蛋白A生物传感器，通过Biolayer干涉法，直接对澄清的细胞培养上清液进行抗体产生的定量分析。

纯化

通过离心(15,000rpm×20min,4℃)收获含有分泌的0266-0000-0043的培养上清液，然后通过用0.45μm硝酸纤维素膜过滤而澄清。将澄清的上清液施加到5mLMabSelectSuRe柱(GE17-5438-02)，接着通过10倍柱体积的PBS洗涤。然后结合的mAb用20mM甲酸和100mM精氨酸pH3.5洗脱，并以2mL的部分收集到含有200ul1MTris-HClpH9.0的玻璃管中。将峰值部分汇合并用Amiconultra15离心装置(30kDMWCO,Millipore)将缓冲液交换为磷酸缓冲盐水(PBS)。浓缩后，通过用NANODROPUV分光光度计，测定280nm处的吸光度，测定最终蛋白浓度。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS–PAGE)评价蛋白纯度。通过LAL试验(CharlesRiver)评价内毒素水平。SDS-PAGE凝胶的设定见表12，所得凝胶见图3。

表12.SDS-PAGE凝胶设定

SE-HPLC分析

典型地，对于SE-HPLC，在TSKSWxl3000柱(Tosoh,Part#08541,300x7.8mm)上使用1200HPLC系统(AgilentTechnologies)分析50μg蛋白。缓冲液是16mMNa2HPO4,3mMKH2PO4,247mMNaCl,6mMKCl,5%异丙醇v/vpH6.8，流速0.5ml/min，除非另有说明。SE-HPLC结果概述见下表13，结果见图4。

表13.SE-HPLC结果概述

#	时间	面积	高度	宽度	对称	面积%
							1	15.13	80.50	1.50	0.81	0.88	0.99
2	17.38	8043.80	251.20	0.53	0.89	98.71
							3	18.87	25.10	0.82	0.51	0.00	0.31

通过SPR测量结合动力学

为了与鼠mAb比较，通过表面等离子体共振(SPR)测定与重组人sc-uPA蛋白(SEQIDNO：1)和食蟹猴sc-uPA(SEQIDNO：3)的结合特性。

在Biacore^TM仪器(GEHealthcare)上进行实验，并用BIAcore4000评价软件来分析。将抗人uPArec0266-0000-0010(SEQIDNO：19和20)和0266-0000-0043(SEQIDNO：21和22)以150-600RU分别经由胺偶联，直接固定在CM5传感器芯片的流动池(GEHealthcare；目录号BR-1000-12)。将重组人sc-uPA和食蟹猴sc-uPA蛋白质稀释于含1%BSA缓冲液的HBS-N(GEHealthcare目录号BR-1006-70)中，稀释因子3x，范围1000-0.13nM。注射重组人sc-uPA和食蟹猴sc-uPA蛋白达60s，接着是600s离解期。在25℃，以30μL/min流速，测定结合曲线。用pH1.5甘氨酸以30μl/min进行芯片表面再生达25s。通过用1：1结合模型拟合进行动力学参数的测定。计算动力学参数并示于下表14。

rec0266-0000-0010(SEQIDNO：19和20)和0266-0000-0043(SEQIDNO：21和22)都显示出与人和食蟹猴sc-uPA两者的非常好的结合。并且rec0266-0000-0010和0266-0000-0043之间的结合动力学特性是类似的。

表14.rec0266-0000-0010和0266-0000-0043对重组人sc-uPA和重组食蟹猴sc-uPA的结合动力学参数。

偶联的酶原激活测定

在体内，uPA将酶原纤溶酶原转化为活性纤溶酶。反过来，存在正反馈环，其中纤溶酶也将sc-uPA(前-uPA)转化为tc-uPA(活性uPA)，因此增强了反应动力学。该机制可用于通过使用显色的纤溶酶底物H-D-Val-Leu-Lys-pNA(S-2251,Chromogenix,目录号0082033239)监测所产生的纤溶酶的量，测定uPA活性。参见图5。

可以中和uPA介导的纤溶酶原激活的抗uPA结合mAb的抑制效应，可以通过在sc-uPA和纤溶酶原存在下的S-2251的水解而测定。将Sc-uPA(0.25nM)与在HBS-B中的不同浓度的rec0266-0000-0010或0266-0000-0043(0–400ng/ml)在室温下预孵育30min。加入0.5M纤溶酶原(Glu-Plasminogen,HaematologicTechnologies,Inc,目录号HCPG-0130)和0.5mM纤溶酶底物H-D-Val-Leu-Lys-对硝基苯胺(S-2251)，在37℃引发反应。监测S-2251水解在405nm处的吸光度的抛物线型增加。

HBS-B缓冲液含有：30mMHepes,135mMNaCl,1mMEDTA,0.1%BSA,pH7.4,经过滤。

偶联的酶原激活测定(对于一个样品)：

·将HBS-B缓冲液178.51μl加入微量离心管。

·人sc-uPA样品用PBS稀释1000倍，将5.68μl加入微量离心管。

·用PBS将抗uPAmAb标准化至1mg/ml，将21μl加入管中。

·涡旋混合，在室温下孵育30min。

·孵育结束前5min，将1.25μl纤溶酶原和3.57μlS-2251在一个新的微量离心管中经涡旋混合。

·将纤溶酶原和S-2251的4.82μl混合物加入含有HBS-B、sc-uPA和mAb的微量离心管中(总体积210μl)。

·涡旋混合并离心。

·在室温下读板，ABS405,每隔5min(或10min)，共4小时。

偶联的酶原激活测定法的结果见图6-9。图6显示了浓度为0、20、50、100μg/ml的mAbrec0266-0000-0010(0010)对人sc-uPA(人前-uPA)。图7显示了浓度为0、20、50、100、200、400μg/ml的mAb0266-0000-0043(0043)对人sc-uPA(人前-uPA)。图8显示了浓度为0、20、50、100μg/ml的mAbrec0266-0000-0010(0010)对食蟹猴sc-uPA(食蟹猴前-uPA)和图9显示了浓度为0、20、50、100、200、400μg/ml的mAb0266-0000-0043(0043)对食蟹猴sc-uPA(食蟹猴前-uPA)。

来自SPR和偶联的酶原激活测定法的结果表明，rec0266-0000-0010和0266-0000-0043与人和食蟹猴sc-uPA具有类似的结合特性；和对人或食蟹猴uPA所致的纤溶酶原激活具有相当的抑制效应。

实施例17：含有1个回复突变或4个回复突变的人源化抗uPAmAb的产生

编码人源化抗uPALC和HC(人IgG4和人IgG1同种型)的质粒用作将单一回复突变引入质粒的起点。鉴定了在VL中的4个候选回复突变(V2I、T22S、V58I和T69S)和在VH中的4个(E1D、Q3K、S49A、A93T)，引入特定VL或VH点突变的正向和反向DNA引物购自EurofinsGenomics,Germany。使用来自Agilent的QuikChangeLightning定点诱变试剂盒，LC或HC表达质粒作为模板，突变-特异性正向和反向引物对，并使用制造商提供的说明书，进行了定点诱变。所得表达质粒编码具有1个回复突变的4种不同的人源化抗uPALC和具有1个回复突变的8种不同的人源化抗uPAHC(4个不同的回复突变引入IgG4和引入IgG1)。通过HEK293悬液细胞的瞬时共转染，使用总共1mgDNA(0.5mgLC和0.5mgHC)和1mL293fectin(Invitrogen,目录号：12347-019)每1LHEk293转染，表达了具有1个单一的回复突变的16种不同的人源化抗uPAmAb变体以及在VL中具有所有4个回复突变或在VH中具有所有4个回复突变的2种抗uPAmAb变体(人IgG4同种型)。转染后将细胞典型地培养5-7天和收获所得细胞培养上清液并按照基于蛋白-A的方法来纯化。将18种人源化抗uPAmAb变体(具有1个回复突变的16种变体和具有4个回复突变的2种)都在偶联的酶原激活测定法中进行测试，所述测定法描述于实施例5和实施例16。mAb0266-0000-0043是人源化抗体的实例，其具有大量的提出的回复突变。mAb0266-0000-0043在偶联的酶原激活测定法中有效地抑制人uPA，正如实施例16所示。

实施例18：在重链上的抗人uPA潜在iso-asp位点的去除

为了试验去除rec0266-0000-0010的重链中潜在的2个iso-asp位点”D95G96”和”D98G99”(标为黑体字)的可能性，产生单一突变变体并通过Biacore测定其与人sc-uPA的结合亲和性。

表15.在rec0266-0000-0010重链(SEQIDNO：19)上的潜在iso-asp位点：

单一突变变体的产生

通过定点诱变，使用QuikChangeIIXL定点诱变试剂盒(AgilentTechnologies,目录号200521)，引入突变，每一突变的密码子交换列于下表16。

表16.突变密码子交换

突变	自	至
			D95A	GAC	GCC
D95R	GAC	AGA
			D95E	GAC	GAA
D95G	GAC	GGC
			D95H	GAC	CAT
D95I	GAC	ATC
			D95L	GAC	CTG
D95K	GAC	AAA
			D95F	GAC	TTT
D95P	GAC	CCC
			D95S	GAC	AGC
D95T	GAC	ACC
			D95Y	GAC	TAT
D95V	GAC	GTG
			G96A	GGC	GCC
G96R	GGC	AGA
			G96N	GGC	AAC
G96E	GGC	GAA
			G96H	GGC	CAT
G96I	GGC	ATC
			G96L	GGC	CTG
G96K	GGC	AAA
			G96F	GGC	TTT46 -->
G96P	GGC	CCC
			G96S	GGC	AGC
G96T	GGC	ACC
			G96Y	GGC	TAT
G96V	GGC	GTG
			D98A	GAC	GCC
D98R	GAC	AGA
			D98E	GAC	GAA
D98G	GAC	GGC
			D98H	GAC	CAT
D98I	GAC	ATC
			D98L	GAC	CTG
D98K	GAC	AAA
			D98F	GAC	TTT
D98P	GAC	CCC
			D98S	GAC	AGC
D98T	GAC	ACC
			D98Y	GAC	TAT
D98V	GAC	GTG
			G99A	GGC	GCC
G99R	GGC	AGA
			G99N	GGC	AAC
G99E	GGC	GAA
			G99H	GGC	CAT
G99I	GGC	ATC
			G99L	GGC	CTG
G99K	GGC	AAA
			G99F	GGC	TTT
G99P	GGC	CCC
			G99S	GGC	AGC
G99T	GGC	ACC
			G99Y	GGC	TAT
G99V	GGC	GTG

突变体变体表达和纯化

通过使用293fectin^TM试剂(Invitrogen,目录号12347)，以1：1的量比率，将编码含有单一突变的重链的质粒DNA与野生型轻链的质粒DNA共转染入Freestyle?293-F细胞(LifeTechnologies,目录号R79007)。以1×10⁶细胞/ml，将已转染的细胞培养于无血清的FreeStyle293培养基(Gibco,目录号12338)中，所述培养基含有4mM谷氨酰胺(LifeTechnologies,目录号25030-024)、1%PLURONIC?F68(Gibco,目录号24040-032)和青霉素-链霉素抗生素(LifeTechnologies,目录号10378016)，并在37℃,8%CO₂振荡孵育5天。在转染后第5天收集上清液并通过离心澄清。

DNA转染：

·转染所用的培养物的细胞密度是0.9-2.0x106细胞/ml。

·293Fectin?(Invitrogen)用作转染试剂，浓度为1μl/μgDNA。

·将DNA和293Fectin溶液混合并在室温下(23-25℃)孵育25min。

·然后将DNA-293Fectin混合物直接加入细胞培养物。

·通过Biolayer干涉法，使用FortéBioOctet系统和蛋白A生物传感器，直接对澄清的细胞培养上清液进行抗体产生的定量分析。

通过离心(15,000rpm×20min,4℃)收获培养上清液，然后通过用0.45μm硝酸纤维素膜过滤而澄清。将澄清的上清液施加到50μlPreDictorMabSelectSuRe,96孔过滤板(GE28-9258-25)。然后结合的mAb用20mM甲酸和100mM精氨酸pH3.5洗脱，用Amiconultra15离心装置(30kDMWCO,Millipore)将缓冲液交换为磷酸缓冲盐水(PBS)。通过NanoDrop(ThermoScientific,摩尔吸光度=1.553)测定样品浓度。通过SEC-UPLC在215nm处评价样品纯度，范围介于75%和99%之间。

通过SPR测量结合动力学

通过表面等离子体共振(SPR)测定与重组人sc-uPA蛋白(SEQIDNO：1)的结合亲和力。

在Biacore^TM仪器(GEHealthcare)上进行实验，并用BIAcore4000评价软件来分析。将抗人uPAmAb变体以150-600RU分别经由胺偶联，直接固定在CM5传感器芯片的流动池(GEHealthcare；目录号BR-1000-12)。将重组人sc-uPA稀释于含1%BSA缓冲液的HBS-N(GEHealthcare目录号BR-1006-70)中，稀释因子3x，范围1000-0.13nM。注射重组人sc-uPA达60s，接着是600s离解期。在25℃，以30μL/min流速，测定结合曲线。以30μl/min用pH1.5甘氨酸进行芯片表面再生达25s。通过与1：1结合模型拟合进行动力学参数的测定。计算结合亲和力并示于下表17。

表17.不同的rec0266-0000-0010突变体的结合亲和力

突变体	Biacore KD (M)
		rec0266-0000-0010	4.7E-10
rec0266-0000-0010-VH_D95A	2.6E-09
		rec0266-0000-0010-VH_D95E	2.0E-09
rec0266-0000-0010-VH_D95F	1.2E-0848 -->
		rec0266-0000-0010-VH_D95G	1.2E-08
rec0266-0000-0010-VH_D95H	6.5E-09
		rec0266-0000-0010-VH_D95I	1.4E-09
rec0266-0000-0010-VH_D95K	1.2E-08
		rec0266-0000-0010-VH_D95L	4.7E-09
rec0266-0000-0010-VH_D95P	2.7E-09
		rec0266-0000-0010-VH_D95R	1.3E-09
rec0266-0000-0010-VH_D95S	4.0E-09
		rec0266-0000-0010-VH_D95T	1.5E-09
rec0266-0000-0010-VH_D95V	8.0E-10
		rec0266-0000-0010-VH_D95Y	5.0E-09
rec0266-0000-0010-VH_G96A	1.5E-09
		rec0266-0000-0010-VH_G96E	2.3E-09
rec0266-0000-0010-VH_G96F	7.2E-09
		rec0266-0000-0010-VH_G96H	5.8E-09
rec0266-0000-0010-VH_G96I	1.8E-09
		rec0266-0000-0010-VH_G96K	9.5E-10
rec0266-0000-0010-VH_G96L	1.9E-09
		rec0266-0000-0010-VH_G96N	2.1E-08
rec0266-0000-0010-VH_G96P	2.1E-09
		rec0266-0000-0010-VH_G96R	3.0E-09
rec0266-0000-0010-VH_G96S	1.3E-09
		rec0266-0000-0010-VH_G96T	3.0E-09
rec0266-0000-0010-VH_G96V	2.1E-09
		rec0266-0000-0010-VH_G96Y	1.3E-08
rec0266-0000-0010-VH_D98A	9.5E-10
		rec0266-0000-0010-VH_D98E	4.9E-09
rec0266-0000-0010-VH_D98F	1.5E-09
		rec0266-0000-0010-VH_D98G	2.4E-09
rec0266-0000-0010-VH_D98H	1.7E-09
		rec0266-0000-0010-VH_D98I	2.0E-09
rec0266-0000-0010-VH_D98K	2.0E-09
		rec0266-0000-0010-VH_D98L	2.0E-09
rec0266-0000-0010-VH_D98P	9.8E-10
		rec0266-0000-0010-VH_D98R	1.1E-09
rec0266-0000-0010-VH_D98S	1.4E-08
		rec0266-0000-0010-VH_D98T	2.2E-09
rec0266-0000-0010-VH_D98V	2.1E-09
		rec0266-0000-0010-VH_D98Y	1.8E-0949 -->
rec0266-0000-0010-VH_G99A	2.4E-09
		rec0266-0000-0010-VH_G99E	1.4E-09
rec0266-0000-0010-VH_G99F	1.7E-09
		rec0266-0000-0010-VH_G99H	2.7E-08
rec0266-0000-0010-VH_G99I	4.6E-09
		rec0266-0000-0010-VH_G99K	4.8E-09
rec0266-0000-0010-VH_G99L	2.1E-09
		rec0266-0000-0010-VH_G99N	1.8E-08
rec0266-0000-0010-VH_G99P	2.5E-09
		rec0266-0000-0010-VH_G99R	1.5E-08
rec0266-0000-0010-VH_G99S	4.1E-10
		rec0266-0000-0010-VH_G99T	5.4E-09
rec0266-0000-0010-VH_G99V	2.5E-09
		rec0266-0000-0010-VH_G99Y	1.8E-09

结果表明潜在iso-asp位点”D95G96”可以被去除，而不损失rec0266-0000-0010-VH_D95V和rec0266-0000-0010-VH_G96K的亲和力；和潜在iso-asp位点”D98G99”可以被去除，而不损失rec0266-0000-0010-VH_G99S的亲和力。表明在偶联的酶原激活测定法中，rec0266-0000-0010-VH_D95V和rec0266-0000-0010-VH_G99S两者都保留了对人uPA诱导的纤溶酶原激活的抑制效应。

实施例19：在轻链上的抗人uPA潜在脱酰胺位点的去除

为了试验去除rec0266-0000-0010的轻链中的潜在脱酰胺位点”N90S91”(标为黑体字)的可能性，产生单一突变变体并通过Biacore测定其与人sc-uPA的结合亲和性。

表18.在rec0266-0000-0010轻链(SEQIDNO：20)上的潜在脱酰胺位点

单一突变变体的产生

通过定点诱变，使用QuikChangeIIXL定点诱变试剂盒(AgilentTechnologies,目录号200521)，引入突变，每一突变的密码子交换列于以下。

表19.突变密码子交换

突变	自	至
			N90A	AAC	GCC
N90R	AAC	AGA
			N90Q	AAC	CAA
N90E	AAC	GAA50 -->
			N90G	AAC	GGC
N90H	AAC	CAT
			N90I	AAC	ATC
N90L	AAC	CTG
			N90K	AAC	AAA
N90F	AAC	TTT
			N90P	AAC	CCC
N90S	AAC	AGC
			N90T	AAC	ACC
N90Y	AAC	TAT
			N90V	AAC	GTG
S91A	AGC	GCC
			S91R	AGC	AGA
S91D	AGC	GAT
			S91Q	AGC	CAA
S91E	AGC	GAA
			S91H	AGC	CAT
S91I	AGC	ATC
			S91L	AGC	CTG
S91K	AGC	AAA
			S91F	AGC	TTT
S91P	AGC	CCC
			S91T	AGC	ACC
S91Y	AGC	TAT
			S91V	AGC	GTG

突变体变体表达和纯化

通过使用293fectin^TM试剂(Invitrogen,目录号12347)，以1：1的量比率，将编码含有单一突变的轻链的质粒DNA与野生型重链的质粒DNA共转染入Freestyle?293-F细胞(LifeTechnologies,目录号R79007)。以1×10⁶细胞/ml，将已转染的细胞培养于无血清的FreeStyle293培养基(Gibco,目录号12338)中，所述培养基含有4mM谷氨酰胺(LifeTechnologies,目录号25030-024)、1%PLURONIC?F68(Gibco,目录号24040-032)和青霉素-链霉素抗生素(LifeTechnologies,目录号10378016)，并在37℃,8%CO₂振荡孵育5天。在转染后第5天收集上清液并通过离心澄清。

DNA转染：

·转染所用的培养物的细胞密度是0.9-2.0x106细胞/ml。

·293Fectin?(Invitrogen)用作转染试剂，浓度为1μl/μgDNA。

·将DNA和293Fectin溶液混合并在室温下(23-25℃)孵育25min。

·然后将DNA-293Fectin混合物直接加入细胞培养物。

蛋白纯化：

通过离心(15,000rpm×20min,4℃)收获培养上清液，然后通过用0.45μm硝酸纤维素膜过滤而澄清。将澄清的上清液施加到50μlPreDictorMabSelectSuRe,96孔过滤板(GE28-9258-25)。然后结合的mAb用20mM甲酸和100mM精氨酸pH3.5洗脱，并用Amiconultra15离心装置(30kDMWCO,Millipore)将缓冲液交换为磷酸缓冲盐水(PBS)。通过NanoDrop(ThermoScientific,摩尔吸光度=1.553)测定样品浓度。通过SEC-UPLC在215nm处评价样品纯度，范围介于75%和99%之间。

通过SPR测量结合动力学

通过表面等离子体共振(SPR)测定与重组人sc-uPA蛋白(SEQIDNO：27)的结合亲和力。

在Biacore^TM仪器(GEHealthcare)上进行实验，并用BIAcore4000评价软件来分析。将抗人uPAmAb变体以150-600RU分别经由胺偶联，直接固定在CM5传感器芯片的流动池(GEHealthcare；目录号BR-1000-12)。将重组人sc-uPA稀释于含1%BSA缓冲液的HBS-N(GEHealthcare目录号BR-1006-70)中，稀释因子3x，范围1000-0.13nM。注射重组人sc-uPA达60s，接着是600s离解期。在25℃，以30μL/min流速，测定结合曲线。以30μl/min用pH1.5甘氨酸进行芯片表面再生达25s。通过与1：1结合模型拟合进行动力学参数的测定。计算结合亲和力并示于下表20。

表20.不同的rec0266-0000-0010突变体的结合亲和力

突变体	Biacore KD (M)
		rec0266-0000-0010	4.7E-10
rec0266-0000-0010-VL_N90E	4.3E-10
		rec0266-0000-0010-VL_N90F	7.9E-10
rec0266-0000-0010-VL_N90G	6.8E-10
		rec0266-0000-0010-VL_N90H	4.0E-10
rec0266-0000-0010-VL_N90I	6.2E-10
		rec0266-0000-0010-VL_N90K	1.1E-09
rec0266-0000-0010-VL_N90L	6.1E-10
		rec0266-0000-0010-VL_N90P	6.2E-10
rec0266-0000-0010-VL_N90Q	3.2E-10
		rec0266-0000-0010-VL_N90R	1.9E-09
rec0266-0000-0010-VL_N90S	3.8E-1052 -->
		rec0266-0000-0010-VL_N90T	4.8E-10
rec0266-0000-0010-VL_N90V	5.8E-10
		rec0266-0000-0010-VL_N90Y	8.0E-10
rec0266-0000-0010-VL_S91A	1.3E-09
		rec0266-0000-0010-VL_S91D	2.1E-09
rec0266-0000-0010-VL_S91E	1.0E-08
		rec0266-0000-0010-VL_S91F	1.1E-08
rec0266-0000-0010-VL_S91H	5.3E-09
		rec0266-0000-0010-VL_S91I	2.9E-09
rec0266-0000-0010-VL_S91K	3.2E-09
		rec0266-0000-0010-VL_S91L	5.7E-09
rec0266-0000-0010-VL_S91P	2.0E-09
		rec0266-0000-0010-VL_S91Q	2.2E-09
rec0266-0000-0010-VL_S91R	3.1E-09
		rec0266-0000-0010-VL_S91T	8.8E-10
rec0266-0000-0010-VL_S91V	1.2E-08
		rec0266-0000-0010-VL_S91Y	3.6E-09

结论是潜在脱酰胺位点”N90S91”可以被去除，而不损失rec0266-0000-0010-VL_N90E、rec0266-0000-0010-VL_N90H、rec0266-0000-0010-VL_N90Q、rec0266-0000-0010-VL_N90S和rec0266-0000-0010-VL_N90T对重组人sc-uPA的亲和力。

实施例20.通过mAb0266-0000-0043对人uPA(SEQIDNO：1)的HDX-MS的表位作图

HDX-MS介绍

HDX-MS技术利用蛋白氢交换(HDX)可以容易地被质谱(MS)追踪。通过将含氢的水性溶剂替换为含氘的水性溶剂，在蛋白的指定位置掺入氘原子，将导致1Da质量的增加。可通过质谱分析来自交换反应的已猝灭的样品，根据时间变化监测该质量的增加。可通过在猝灭条件下的胃蛋白酶消化，接着是所得肽的质量增加，将氘标记信息定位于蛋白的特定区。

HDX-MS的一个用途是通过鉴定在蛋白-蛋白复合物形成时减少的氢交换的区域，探测涉及分子相互作用的位点。通常，通过溶剂的空间排阻所致的氢交换率的显著下降揭示结合界面。典型地通过在短孵育时间期间(10秒-40秒)所见的氢交换的减少揭示结合界面。当使用较长孵育时间时，通常在结合界面内发现氢交换的减少至平稳水平。HDX-MS的另一用途是在分子内指派变构变化，其表征为在短孵育时间(即10秒-20秒)氢交换水平无变化，而在长孵育时间(40s和更长)后可见氢交换减少。可通过HDX-MS，在有和没有各自的结合配偶体的存在时简单地通过测定掺入任一蛋白成员的氘的总量随时间的变化，测定蛋白-蛋白复合物形成和复合物形成所诱导的变构改变。HDX-MS技术使用天然组分，即靶蛋白和抗体/Fab片段，并在溶液中进行(有关HDX-MS技术的近期综述，参见Wales和Engen,MassSpectrom.Rev.25,158(2006))。

材料与方法

使用的蛋白批次是人uPA(huPA)：人重组sc-uPA(SEQIDNO：1)和mAb0266-0000-0043(SEQIDNO：21和22)。在实验前，将所有蛋白的缓冲液都交换为PBSpH7.4。

在nanoACQUITYUPLC系统上，用偶联到SynaptG2质谱仪(WatersInc.)的HDX技术(WatersInc.)进行HDX实验。WatersHDX系统含有由LeapShell软件(LeapTechnologiesInc/WatersInc.)操纵的Leap机器人(H/D-xPAL；WatersInc.)，其进行氘交换反应的启动，反应时间控制，猝灭反应，注射到UPLC系统和消化时间控制。Leap机器人装备有两个温度控制堆栈，分别维持在20℃用于缓冲液贮存和HDX反应，和维持在2℃用于蛋白和猝灭溶液的贮存。WatersHDX系统此外含有温度控制室，将前置柱和分析用柱和LC管和转换阀保持在1℃。温度控制室将胃蛋白酶柱保持在25℃。对于在线胃蛋白酶消化，加载含有300pmol人uPA的100μL已猝灭的样品并使用等度流速100μL/min(0.1%甲酸：CH₃CN95：5)通过放在25℃的Poroszyme?固定化PepsinCartridge(2.1×30mm(AppliedBiosystems))。捕获所得肽并在VanGuard前置柱BEHC181.7μm(2.1×5mm(WatersInc.))上脱盐。随后，将阀门转换以将前置柱与分析用柱UPLC-BEHC181.7μm(1×100mm(WatersInc.))连线，并使用从nanoAQUITYUPLC系统(WatersInc.)中以40μl/min递送的10-50%B的9min梯度分离肽。流动相包括A：0.1%甲酸和B：含0.1%甲酸的CH₃CN。使用SynaptG2质谱仪(WatersInc.)以阳离子模式获得ESIMS数据和单独的升高能量(MS^E)实验。亮氨酸-脑啡肽用作锁定质量(lockmass)([M+H]⁺离子在m/z556.2771)和以连续模式采集数据(有关进一步描述，参见Andersen和Faber,Int.J.MassSpec.,302,139–148(2011))。

数据分析

在单独的实验中，使用标准MS^E方法鉴定消化性肽，在所述方法中，使用SynaptG2(WatersInc.)的离子迁移特性将肽和片段进一步比对。使用ProteinLynxGlobalServer2.5版(WatersInc.)处理MS^E数据。在DynamX2.0软件(WatersInc.)中处理HDX-MS原始数据文件。DynamX自动地进行锁定质量校正和氘掺入测定，即氘化肽的图心测定。此外，手动检查所有肽以确保准确的峰和通过软件产生的氘化分配。

表位作图实验

通过在mAb0266-0000-0043存在或不存在时，通过16倍稀释huPA到相应的氘化缓冲液(即，在D₂O中制备的PBS，96%D₂O最终,pH7.4(未校正值))，开始酰胺氢/氘交换(HDX)。在2.4μMmAb存在或不存在时，所有HDX反应都在20℃进行并含有4μMhuPA，因此得到1.2倍摩尔过量的mAb结合位点。在范围为10秒至480秒的合适的时间间隔，50μl等分试样的HDX反应物通过加入50μl冰冷猝灭缓冲液(1.35M三(2-羧基乙基)膦)而猝灭，得到最终pH2.5(未校正值)。

结果与讨论

在抗uPA存在或不存在时，监测163种肽的HDX-MS时间进程达10、20、40、60、120、240和480秒，所述肽覆盖huPA的一级序列的93%。

得到的数据允许将抗uPA与huPA的表位结合位点分配到两个线性序列中，所述序列分别覆盖残基167-175和218-224。这示于表22，显示通过抗uPA(mAb0266-0000-0043)至人uPA(SEQIDNO：1)的HDX-MS分析的表位鉴定。氘交换反应后，用胃蛋白酶消化huPA，得到现有消化性肽，其在抗uPA存在时在至少10秒、20秒和40秒的短孵育时间被鉴定以显示HDX保护作用。同样给出了消化性肽，其经鉴定显示出在抗uPA存在时未受影响的交换和有助于分配的变构区。

此外，HDX-MS研究揭示了变构偶联位点的延伸网络，其表现出在结合至抗uPA时降低的氘掺入，覆盖残基1-33、67-80、187-215、225-234、243-256、260-274、291-306、322-341、375-389和397-410。这示于表21，通过抗uPA(mAb0266-0000-0043)至人uPA(SEQIDNO：1)的HDX-MS分析鉴定的变构区。氘交换反应后，用胃蛋白酶消化huPA，得到现有消化性肽，其在抗uPA存在时在长于40秒的孵育时间被鉴定以显示氢到氘交换(HDX)保护作用。同样给出了消化性肽，其经鉴定显示出在抗uPA存在时未受影响的HDX和有助于分配的变构区。

仅在结合至抗uPA时观察到氘掺入的变化降低。因此数据包括从柔韧的无配体(unliganded)总体(ensemble)到更刚性的抗uPA结合总体的变构群体迁移。

此外，HDX-MS使抗uPA(mAb0266-0000-0043)至huPA(SEQIDNO：1)至两个线性序列(覆盖残基167-175和218-224)的表位结合位点的分配成为可能。当结合至抗uPA(覆盖残基1-33、67-80、187-215、225-234、243-256、260-274、291-300、320-341、375-389和402-410)时，从柔韧的无配体(unliganded)总体(ensemble)到更刚性的抗uPA结合总体的变构群体迁移的提示，是由降低的氘掺入提供的。

表21：通过抗uPA(mAb0266-0000-0043)至人uPA(SEQIDNO：1)的HDX-MS分析而鉴定的变构区

开始	结束	序列	氘特性*
				1	12	SNELHQVPSNCD	A-EX
1	13	SNELHQVPSNCDC	A-EX
				12	24	DCLNGGTCVSNKY	A-EX
13	24	CLNGGTCVSNKY	A-EX
				16	31	GGTCVSNKYFSNIHWC	A-EX
18	32	TCVSNKYFSNIHWCN	A-EX
				25	33	FSNIHWCNC	A-EX
65	77	DTMGRPCLPWNSA	A-EX
				65	80	DTMGRPCLPWNSATVL	A-EX
67	77	MGRPCLPWNSA	A-EX
				67	80	MGRPCLPWNSATVL	A-EX
71	86	CLPWNSATVLQQTYHA	A-EX
				78	93	TVLQQTYHAHRSDALQ	A-EX
79	93	VLQQTYHAHRSDALQ	A-EX
				187	193	YVCGGSL	A-EX
194	205	SPCWVISATHC	A-EX
				194	206	SPCWVISATHCF	A-EX
199	205	ISATHC	A-EX
				206	215	FIDYPKKEDY	A-EX
225	234	NSNTQGEMKF	A-EX
				229	240	QGEMKFEVENLI	A-EX55 -->
235	241	EVENLIL	N
				243	256	KDYSADTLAHHNDI	A-EX
260	274	KIRSKEGRCAQPSRT	A-EX
				261	274	IRSKEGRCAQPSRT	A-EX
275	290	IQTICLPSMYNDPQFG	N
				277	283	TICLPSM	N
291	306	TSCEITGFGKENSTDY	A-EX
				301	315	ENSTDYLYPEQLKMT	N
320	330	ISHRECQQPHY	A-EX
				320	334	ISHRECQQPHYYGSE	A-EX
322	334	HRECQQPHYYGSE	A-EX
				335	341	VTTKMLC	A-EX
375	382	SWGRGCAL	A-EX
				375	389	SWGRGCALKDKPGVY	A-EX
380	389	CALKDKPGVY	A-EX
				390	401	TRVSHFLPWIRS	A-EX
397	410	PWIRSHTKEENGLA	A-EX
				400	408	RSHTKEENG	A-EX

A-EX：在抗体结合时的HDX保护作用指示在40s和更长孵育时至少3个时间点的变构区(>2SD.)。

N：在抗体结合时无HDX保护作用(<2SD.)。

表22：通过抗uPA(mAb0266-0000-0043)至人uPA(SEQIDNO：1)的HDX-MS分析而鉴定的表位

开始	结束	序列	氘水平*
				157	164	FKIIGGEF	E-EX
158	164	KIIGGEF	E-EX
				165	173	TTIENQPWF	E-EX
165	175	TTIENQPWFAA	E-EX
				177	186	YRRHRGGSVT	N
216	224	IVYLGRSRL	E-EX
				217	223	VYLGRSR	E-EX
217	224	VYLGRSRL	E-EX

实施例21.mAb0266-0000-0043的作用方式

已经定义了4个区段涉及在丝氨酸蛋白酶激活时显著的构象变化(Freer等人,1970,Biochemistry9,1997-2009；Huber&Bode1978,AccChemRes11,114-122；Jiang等人,2013,BiochemJ449,161-166)。激活环(16-21牛胰凝乳蛋白酶原；159-164人sc-uPA)，其在Lys158-Ile159肽键切割后复位，导致在Ile159的α-氨基和Asp355的埋入的侧链羧基之间形成内部离子对。

自溶环(142-154牛胰凝乳蛋白酶原；299-311人sc-uPA)，通过自Phe298和Gly299至Ile159的直接相互作用，稳定活性酶中的激活环。氧离子-稳定环(184-194牛胰凝乳蛋白酶原；343-355人sc-uPA)形成在活性酶中的骨架介导的正电口袋，其激活易切割的肽键的羰基并稳定四面体中间体的带负电的氧离子。最终，S1进入框(216-223牛胰凝乳蛋白酶原；377-384人sc-uPA)形成S1口袋，其决定蛋白酶的特异性并与肽底物相互作用，促进底物水解。

尽管mAb-112通过与自溶环的相互作用抑制人uPA活性，导致自激活口袋的N-端置换(Jiang等人,2013,BiochemJ449,161-166)并且小鼠mU1不能抑制人uPA，但通过与对应于人sc-uPA氨基酸残基Gly183、Val185(Pro在小鼠uPA中)、Thr186(Pro在小鼠uPA中)、Arg223(Lys在小鼠uPA中)、Asn225(Ser在小鼠uPA中)、Asn227(Tyr在小鼠uPA中)、Thr228(Asn在小鼠uPA中),Gln229(Pro在小鼠uPA中)的残基的相互作用，仅小鼠uPA导致自溶环对接的变构抑制和S1口袋和氧离子穴变形(Kromann-Hansen等人,2013,Biochemistry52,7114-7126)；通过覆盖Ile167–Ala175和Tyr218-Leu224的表位，通过抑制人uPA，mAb0266-0000-0043是独特的，其诱导1-33、67-80、187-215、230-234、243-256、260-274、291-306、322-341、375-389和397-410区的构象的协同变化，其包括但不限于自溶环和S1进入框的重组，以及伴随的uPA激活和活性的变构抑制。通过Ile167–Ala175和Tyr218-Leu224表位诱导的构象变化的延伸网络，表明相当的构象变化可以通过任何变构影响位点的mAb靶向来诱导。

尽管在本文中已经说明和描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将想到许多修改、取代、改动和等同方案。因此，应理解，所附权利要求书意图覆盖所有这样的修改和改动，其落入本发明的真实的精神在内。

Claims

1.能够结合至人uPA的抗体或其抗原-结合片段，其特征在于它抑制人tc-uPA的蛋白水解活性和抑制人sc-uPA自人uPA的蛋白水解无活性形式至人uPA的蛋白水解活性形式的激活。

2.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体抑制受体-结合的人uPA和非-受体-结合的人uPA两者。

3.权利要求1-2中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体还抑制tc-uPA的蛋白水解活性和/或抑制sc-uPA自uPA的蛋白水解无活性形式至uPA的蛋白水解活性形式的激活，其中uPA是来自其它物种，例如黑猩猩、食蟹猴、恒河猴、小鼠、大鼠、兔、牛、绵羊、猪或骆驼的uPA。

4.权利要求1、2或3的抗体或其抗原-结合片段，其结合至人uPA(SEQIDNO：1)上的不连续表位/结合区，其中所述不连续表位/结合区的第一结合部分被SEQIDNO：1的氨基酸编号167-175所限定，和所述不连续表位/结合区的第二结合部分被SEQIDNO：1的氨基酸编号218-224所限定。

5.权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的重链包含：

6.权利要求1-5中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的轻链包含：

7.权利要求1-6中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的重链包含：

SEQIDNO：7的氨基酸残基95(Kabat；99sequential)至102(Kabat；108sequential)(DGRDGSWFAY)的CDR3序列；和其中所述抗体的轻链包含：

8.权利要求1-4中任一项的人源化抗体或其抗原-结合片段，其中所述重链包含：

包含SEQIDNO：9的CDR-H1，位于氨基酸残基31-35(Kabat)；和

包含SEQIDNO：10的CDR-H2，位于氨基酸残基50-65(Kabat)；和

包含SEQIDNO：11的CDR-H3，位于氨基酸残基95-102(Kabat)

和其中所述轻链包含：

包含SEQIDNO：12的CDR-L1，位于氨基酸残基24-34(Kabat)；和

包含SEQIDNO：13的CDR-L2，位于氨基酸残基50-56(Kabat)；和

包含SEQIDNO：14的CDR-L3，位于氨基酸残基89-97(Kabat)。

9.权利要求1-4或8中任一项的人源化抗体或其抗原-结合片段，其包含含有SEQIDNO：21的重链和含有SEQIDNO：22的轻链。

10.权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其与权利要求8或9的人源化抗体，或权利要求7的抗体竞争结合至人uPA(SEQIDNO：1)或食蟹猴uPA(SEQIDNO：3)。

11.权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其与参考抗体竞争结合至人uPA(SEQIDNO：1)或食蟹猴uPA(SEQIDNO：3)，其中所述参考抗体包含含有SEQIDNO：7的可变重链和含有SEQIDNO：8的可变轻链，和/或包含含有SEQIDNO：21的重链和含有SEQIDNO：22的轻链的参考抗体。

12.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体选自单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体的抗原结合区、scFv、Fab、F(ab')2、Fv和单链抗体。

13.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原-结合片段，用作治疗自身免疫性疾病和/或慢性炎症、例如类风湿性关节炎的药物。

14.鉴定抗uPA抗体的方法，包括以下步骤：(a)产生抗uPA抗体；(b)自步骤(a)中产生的抗体中鉴定抗体，其抑制人tc-uPA的蛋白水解活性；(c)自步骤(a)中产生的抗体中鉴定抗体，其抑制人sc-uPA自人uPA的蛋白水解无活性形式至人uPA的蛋白水解活性形式的激活；和(d)选择抗体，其在步骤(b)和(c)中都是抑制性的。

15.产生能够结合至人uPA的抗体或其抗原-结合片段的方法，其中所述抗体按照权利要求14的鉴定方法而鉴定，和其中所产生的所述抗体可按照权利要求13来使用。