KR20120102125A - Ｇｐｖｉ에 대한 신규한 길항제 항체 및 그의 ｆａｂ 단편 및 그의 용도 - Google Patents

Ｇｐｖｉ에 대한 신규한 길항제 항체 및 그의 ｆａｂ 단편 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

FR2009/113 PCT 특허 출원. 발명의 명칭: GPVI에 대한 신규한 길항제 항체 및 그의 Fab 단편 및 그의 용도. 사노피-아벤티스. 요약: 본 발명은 인간 혈소판 막 단백질인 당단백질 VI (GPVI)에 특이적으로 결합하는 신규한 항체, 및 그의 1가 단편 또는 유도체를 개시한다. 본 발명의 항체는 GPVI 고갈 표현형을 유도할 수 있는 하이브리도마 클론 390으로부터의 항체, 및 그의 단편 항체이다. 이러한 항체 및 Fab 단편은 콜라겐 결합을 차단할 수 있고, 이를 통해 콜라겐에 의한 혈소판 활성화를 방지할 수 있다. 본 발명은 또한 개시된 항체 및 Fab 단편 제조를 위한 하이브리도마 클론 및 발현 플라스미드에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 혈전증 및 다른 혈관 질환의 치료를 위한 연구용, 진단용 및 면역요법용 작용제의 제조를 위한 1가 항체 단편의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 C-말단 단부에 분자를 보유하는 Fab, 이뿐 아니라, 상기와 같이 변형된 Fab를 사용함으로써 항체에 의한 Fab의 인식을 방지하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 항-GPVI Fab 사용시 혈소판 활성화를 방지하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＧＰＶＩ에 대한 신규한 길항제 항체 및 그의 ＦＡＢ 단편 및 그의 용도{NOVEL ANTAGONIST ANTIBODIES AND THEIR FAB FRAGMENTS AGAINST GPVI AND USES THEREOF}
본 발명은 인간 혈소판 막 단백질인 당단백질 VI (GPVI)에 특이적으로 결합하는 신규한 항체, 및 그의 1가 단편 또는 유도체를 개시한다. 본 발명의 항체는 하이브리도마 클론 390으로부터의 항체, 및 하이브리도마 클론 390으로부터의 항체에 의해 인식되는 입체형태적 에피토프와 유사한 에피토프에 결합하는 항체이다. 이러한 항체 및 Fab 단편은 콜라겐 결합을 차단할 수 있고, 이를 통해 콜라겐에 의한 혈소판 활성화를 방지할 수 있다. 본 발명은 또한 개시된 항체 및 Fab 단편 제조를 위한 하이브리도마 클론 및 발현 플라스미드에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 혈전증 및 다른 혈관 질환 치료를 위한 연구용, 진단용 및 면역요법용 작용제의 제조를 위한 1가 항체 단편의 용도에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 환자 특이적인 항-Fab 항체 유도성 수용체 클러스터링을 통해 수용체 활성화를 방지하는 방법에 관한 것이다.
혈소판 기능은 동맥 혈전증 및 심혈관 질환의 발병에 있어 근본적으로 중요하다. 요즘 심혈관 질환을 앓는 환자를 항-혈소판 약물로 치료하는 것은 당연한 일이다. 임상적으로 성공을 거둔 각종의 항-혈소판 요법이 이용될 수 있음에도 불구하고, 충족되지 못한 바, 새로운 치료법이 여전히 크게 요구되고 있다. 이러한 부족은 주로 현재 이용가능한 약물의 효능에 한계가 있기 때문에, 특히 약물 효능-안전성 (출혈)의 상관관계와 관련하여 한계가 있기 때문에 유발된다. 현재 사용되고 있는 약물이 표적하지 못하는 기전인, 혈소판 활성화 및 부착의 조기 이벤트 간섭이 효능-안전성 마진을 개선시키는 데 있어서 관심을 끄는 접근법이 될 것이다. 콜라겐 수용체인 당단백질 (GPVI)이 이러한 혈소판 활성화의 조기 이벤트에서 가장 중요하며, 따라서, 이러한 기전을 간섭하는 데 있어 주된 표적이 된다 (문헌 [Nieswandt B and Watson SP, Blood. 2003 Jul 15;102(2):449-61]). 마우스 및 인간으로부터 유래된 혈소판을 이용하여 여러 가지로 시험관내 및 생체내 시스템에서의 GPVI의 항-혈소판 및 항혈전 효과가 기술된 바 있다. 혈소판에 GPVI가 부족하면, 내피하 기질의 가장 중요한 혈전 형성 성분 중 하나인 콜라겐에 무반응하게 된다 (문헌 [Lockyer S. et al., Thromb Res. 2006;118(3):371-80]). 또한, 마우스 연구를 통해, GPVI가 고갈되면 자연 출혈에 대한 감수성을 증가시키지 않으면서 손상된 혈관벽에서의 동맥 혈전 형성이 효과적으로 억제된다는 것이 밝혀졌다. 이러한 데이터 모두는 GPVI가 동맥 혈전증을 치료하는 데 있어 효과적이고 안전한 표적임을 나타낸다는 것을 제안한다. 혈전 형성 개시에 있어 GPVI의 중요한 역할은 상기 수용체의 억제가 동맥 혈전증 증후군에서 유익할 수 있다는 것을 나타낸다. GPVI 억제를 위해 임상적으로 의미있는 전략법은 예를 들어, 항체와 같은 생물요법 단백질을 사용한다. GPVI와 그의 리간드인 콜라겐의 상호작용이 확장된 단백질 표면을 포함하는 것으로 보여지는 바, 더욱더 억제성 GPVI-결합 단백질을 사용하여 단백질-단백질 상호작용을 성공적으로 간섭할 수 있는 가능성은 다른 전략법에 비해 더 크다. 여러 동물 모델에서 항체 및 Fab 단편에 의해 GPVI 기능을 억제하는 것에 관한 개념이 생체내에서 입증되었다.
GPVI 활성을 억제시키는 임상적으로 효과적인 억제제에 대해서는 여전히 요구되고 있다.
GPVI는 오직 혈소판 및 거대핵세포에서만 전적으로 발현되는 주요 콜라겐 수용체이다. 콜라겐에 결합하게 되면 수용체 클러스터링이 유도되고, 이어서 혈소판 활성화가 이루어진다. 이는 혈전 형성에서 개시 이벤트 중 하나이다. 현 항-혈소판 약물은 상기 과정에서 후기 이벤트를 표적화함으로써 혈전 형성을 간섭한다. 이러한 약물의 심각한 부작용은 장기간 지속되는 출혈인데, 이는 그의 사용을 제한한다. 혈전 형성에서 조기 이벤트 (예를 들어, GPVI)를 표적화하는 것이 출혈이라는 부담에는 어떤 중요한 영향도 미치지 않으면서 고도의 항혈전성을 띨 수 있다는 것을 입증하는 데에는 여러가지 방식이 있다. 콜라겐과 GPVI 사이의 상호작용은 중화 모노클로날 항체 (mAb)에 의해 성공적으로 억제될 수 있다. 그러나, mAb는 2가 분자이기 때문에, GPVI-수용체 클러스터링과, 이를 통해 활성화를 유도할 수 있다. 이를 회피하기 위해, 1가 항체 단편, 예를 들어, Fab 단편이 개발되었다.
불행하게도, 상기 1가 항-GPVI Fab 단편에 관한 상세한 안전성 프로파일링을 통해 환자 특이적인 방식으로 혈소판 활성화가 여전히 유도될 수 있는 잠재능이 있는 것으로 밝혀졌다. 허혈성 이벤트 치료용의 안전한 치료제를 제공하기 위해서는 개발된 Fab 분자의 상기와 같은 활성적 잠재능은 제거되어야 했다. 현재까지는 이러한 문제들이 해소되지 못했다.
발명의 개요
제1 측면에서, 본 발명은 인간 GPVI 뿐만 아니라, 영장류 GPVI에 특이적으로 결합하는 (클론 390으로부터의 것인) 신규한 모노클로날 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 클론 390으로부터의 항-GPVI mAb의 가변 도메인 서열로부터 유래된 재조합 Fab 단편에 관한 것이다. 이러한 항-GPVI 항체 및 Fab 단편은 인간 GPVI 단백질의 D1 및 D2 도메인 중의 특이적인 입체형태적 에피토프를 인식한다.
항-GPVI mAb 및 Fab 단편 둘 모두는 콜라겐이 GPVI에 결합하는 것을 억제시킬 수 있다. 항-GPVI Fab 단편은 그의 인간 GPVI에 대한 친화도를 개선시키기 위한 목적으로 인간화되고 조작된 것이다. 인간화된 변이체의 생물물리학적 특징이 기술되어 있다.
콜라겐을 억제시키는 것 이외에도, 항-GPVI Fab 단편은 인간 혈소판 풍부 혈장 및 인간 전혈 둘 모두에서 콜라겐에 의해 유도되는 혈소판 응집을 억제시킬 수 있다. 이러한 Fab 단편은 또한 콜라겐으로 코팅된 표면 상의 유동하 혈전 형성을 억제시킬 수 있다.
따라서, 인간에서 항체에 의해 GPVI를 억제시키는 것은 매력적인 항혈전 전략인 것으로 보여진다.
놀랍게도, 본 발명의 항-GPVI Fab는 GPVI 고갈 표현형을 유도한다. 따라서, GPVI 고갈 표현형을 유도할 수 있는 항-GPVI Fab 단편은 본 발명의 또 다른 목적을 구성한다.
본 발명은 또한 분자를 부가하여 Fab의 C-말단 단부를 차폐시키는 것으로 이루어진, 기존 항체에 의한 Fab 단편 인식을 방지하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 분자를 부가하여 Fab의 C-말단 단부를 차폐시키는 것으로 이루어진, Fab의 C-말단 단부에 대해 지시되는 신규의 항체에 의한 Fab 단편 인식을 방지하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 Fab의 C-말단 단부가 분자 부가에 의해 차폐되는 것인, 항-GPVI Fab 사용시 혈소판 활성화를 방지하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 C-말단 단부에 분자를 보유하는 Fab 단편이다.
본 발명의 항-GPVI 및 Fab 단편의 DNA 및 단백질 서열 뿐만 아니라, 이의 발현을 위한 벡터 또한 제공한다.
본 발명의 항혈전제는 혈전성 또는 혈관 질환 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 제약상 유효량의 본 발명의 GPVI 특이적인 모노클로날 항체 단편을 적절한 부형제와 함께 포함하는 항혈전 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 항체는 환자가 항혈전성 치료를 필요로하는 위험에 있다고 진단하는 데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 항-GPVI 항체 또는 그의 단편을 포함하는 진단용 키트를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 GPVI 항체, 항체 단편 및 차폐된 항체 Fab 단편의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 상세한 설명
제1 측면에서, 본 발명은 인간 GPVI에 특이적으로 결합하는 신규한 모노클로날 항체 및 그의 단편, 특히, 하이브리도마 클론 390으로부터의 항-GPVI mAb를 제공한다. 본 발명의 항체는 GPVI의 활성을 전체적으로 또는 부분적으로 길항시킨다.
본 발명의 제2 측면에서, 본 발명자들은 Fab의 중쇄 (HC)의 C-말단 단부에 펩티드를 부가하는 것이 일부 환자에서는 기존 항-Fab 항체에 의한 Fab 분자의 인식을 막고, 이를 통해 혈소판 활성화 및 관련된 부작용을 방지하는 차폐 효과가 있다는 것을 입증하였다.
본원에서 사용되는 바, "하이브리도마 클론 390으로부터의 모노클로날 항체" 또는 "클론 390으로부터의 모노클로날 항체"는 특히 본 출원에 기술된 바와 같이, 서열 6 및 서열 8로 정의되는 항체 뿐만 아니라, 상기 분자의 인간화된 항체, Fab 단편 및 인간화된 Fab 단편 또는 임의의 개선된 버전을 비롯한, 그의 유도체를 의미한다.
"항체"라는 용어는 본원에서 가장 광범위한 의미로 사용되며, 이는 구체적으로 임의의 이소형, 예를 들어, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE의 모노클로날 항체 (전장의 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이성 항체, 키메라 항체, 및 항원 결합 단편을 포함한다. 특이적 항원에 대해 반응성을 보이는 항체는 파지에서 또는 유사 벡터에서 재조합 항체 라이브러리 선별과 같은 재조합 방법에 의해, 또는 항원 또는 항원을 코딩하는 핵산으로 동물을 면역화시킴으로써 생성될 수 있다.
전형적인 IgG 항체는 이황화 결합에 의해 결합되어 있는 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄로 구성된다. 각 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 함유한다. 각 가변 영역은 "상보성 결정 영역" ("CDR") 또는 "초가변 영역"이라 명명되는 3개의 세그먼트를 함유하는데, 이는 주로 항원의 에피토프에의 결합을 담당한다. 이는 보통 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 지칭되며, N-말단에서부터 순서대로 번호매김된 것이다. 가변 영역 중 더욱 고도로 보존된 부분은 "프레임워크 영역"이라 명명된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체, 및 항체 Fab 단편을 비롯한 그의 단편은 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22 및 서열 23으로 정의되는 6개의 CDR을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체, 및 항체 Fab 단편을 비롯한 그의 단편은 서열 18, 서열 19, 서열 38, 서열 21, 서열 39 및 서열 23으로 정의되는 6개의 CDR을 포함한다. 또 다른 특정 측면에서,본 발명의 항체 Fab 단편은
(a) 서열 18, 서열 19, 및 서열 20 (또는 서열 38)으로 정의되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 (HCVR)의 상보성 결정 영역 (CDR); 및
(b) 서열 21, 서열 22 (또는 서열 39), 및 서열 23으로 정의되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역 (LCVR)의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하며;
여기서, 각 CDR의 적어도 2개의 아미노산 잔기는 GPVI 에피토프 잔기와의 접촉을 직접적으로 파괴시키지 않으면서 또 다른 아미노산 잔기로 변경될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "GPVI 에피토프 잔기와의 접촉을 직접적으로 파괴시킨다"라는 것은, 본원에서 제공하는 실시예의 결정 구조에 기술되어 있는 것으로 GPVI 에피토프 잔기와 접촉하고 있는 항체 아미노산 잔기를 변경시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "VH"는 Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' 또는 F(ab')2 단편의 중쇄를 비롯한, 항체의 이뮤노글로불린 중쇄의 가변 영역을 의미한다. "VL"이라는 언급은 Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' 또는 F(ab')2 단편의 경쇄를 비롯한, 항체의 이뮤노글로불린 경쇄의 가변 영역을 의미한다.
"폴리클로날 항체"는 하나 이상의 다른, 비-동일 항체 중에서 또는 그의 존재하에서 생산된 항체이다. 일반적으로, 폴리클로날 항체는 수개의 다른 B-림프구를 생산하는 비-동일 항체의 존재하에 B-림프구로부터 생산된 것이다. 보통, 폴리클로날 항체는 면역화된 동물로부터 직접 수득된다.
본원에서 사용되는 바, "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질성인 항체 군집으로부터 수득되는 항체인데, 즉, 상기 군집을 형성하는 항체는 최소량으로 존재할 수 있는 가능성을 지닌 천연 발생 돌연변이를 제외하면 본질적으로 동일한 항체이다. 이러한 항체는 단일 에피토프에 대해 유도되며, 따라서, 고도로 특이적이다.
본원에서 사용되는 바, 항체의 "항원 결합부," 항체의 "항원 결합 단편" 등의 용어는 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 천연 발생, 효소적으로 수득가능한, 합성, 또는 유전자 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원 결합 단편은 임의의 적합한 표준 기법, 예를 들어, 단백질 분해적 분해 또는 항체의 가변 및 임의로는 불변 도메인을 코딩하는 DNA의 조작 및 발현을 비롯한 재조합 유전공학 기법의 사용을 통해 예를 들어, 전체 항체 분자로부터 유도된 것일 수 있다. 항원 결합 단편의 비제한적인 예로는 (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일 쇄 Fv (scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기 (예를 들어, 단리된 상보성 결정 영역 (CDR))로 이루어진 최소 인식 단위를 포함한다. 다른 조작된 분자, 예를 들어, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 미니바디 또한 본원에서 사용되는 바와 같은 "항원 결합 단편"이라는 표현에 포함된다.
본원에서 사용되는 바, "Fab 단편"이라는 용어는 항체의 경쇄 (LC) + 중쇄 (HC) 일부에 상응한다. Fab 분자는 IgG 분자의 단백질 분해적 절단에 의해 생성되거나, 재조합 분자의 발현을 통해 제조된다. 보통은 중쇄의 불변 도메인 부분 (Fc 부분)이 제거된 것이다.
본원에서 사용되는 바, "차폐된 Fab 단편" 또는 "차폐된 Fab"라는 용어는 항체의 경쇄 (LC) + 중쇄 (HC) 일부를 함유하며, 여기서, HC의 C-말단은 펩티드에 의해 연장됨에 따라 환자에서의 기존 항체에 의한 Fab 인식을 차폐시키는 것인 Fab 단편에 상응한다.
본 발명의 항체는 오직 세포외 D1 및 D2 도메인만을 포함하는 인간 재조합 GPVI 단백질을 사용하여 마우스 면역화 기법을 통해 하이브리도마를 생성함으로써 수득하였다. 면역화를 위해 사용된 단백질의 서열은 서열 3 및 서열 4에 상응한다.
먼저, 수득한 mAb를 인간 GPVI 단백질을 인식할 수 있는 능력에 대해서 뿐만 아니라, 콜라겐의 인간 GPVI 단백질에의 결합을 차단시킬 수 있고, 고친화도로 GPVI 단백질에 결합할 수 있는 그의 능력에 대해 선별한다.
항체는 (도 2에 제시된 바와 같이) 영장류 GPVI에 대해서는 교차 반응성을 보이는 반면, 뮤린, 래트, 개, 돼지, 또는 토끼 GPVI에 대해서는 어떤 교차 반응성도 보이지 않는다.
선별된 mAb는 (표 1에 제시된 바와 같이) pM 단위 정도의 친화도로 인간 GPVI 단백질에 결합할 수 있고, (도 1a에 제시된 바와 같이) 10 ㎍/mL 미만의 IC50 값으로 콜라겐의 인간 GPVI 단백질에의 결합을 차단할 수 있다. 이러한 항체는 또한 (도 1b에 제시된 바와 같이) 콜라겐의 비-인간 영장류 GPVI에의 결합도 차단할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 클론 390으로부터의 항-GPVI mAb의 가변 도메인 서열로부터 유도된 재조합 Fab 단편에 관한 것이다. Fab 단편은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 단백질분해적 Fab 단편은 피신(Ficin) 절단에 의해 수득할 수 있거나, 또는 재조합 Fab 단편은 (예를 들어, 실시예 3B에 기술되어 있는 바와 같이) 필요한 서열을 발현 벡터로 클로닝하여 제조할 수 있다. 항-GPVI mAb와 같이, Fab 단편은 콜라겐의 GPVI에의 결합을 억제시킬 수 있다.
Fab 단편을 GPVI와 함께 공-결정화시키고, X선 결정화법에 의해 분석함으로써 GPVI 단백질 상의 Fab에 의해 인식되는 에피토프를 결정한다. 이러한 분석을 통해 인간 GPVI의 세포외 도메인 중의 D1 및 D2 도메인 둘 모두를 포함하는 입체형태적 에피토프를 정의할 수 있었다. 에피토프에 사용된 번호매김 체계는 20개 잔기의 신호 서열이 제거된 GPVI에 상응하고, 도 16 및 서열 32에 제시된 바와 같다.
본 발명의 한 측면에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 GPVI의 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합하고, Ser 43, Arg 67 및 Asp 81을 포함하는 인간 GPVI 잔기에 접촉한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 Pro4, Lys7, Glu40, Lys41, Leu42, Ser44, Ser45, Arg46, Arg65, Trp76, Leu78, Pro79, Ser80, Gln82, Ser165, 및 Arg166으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 GPVI 잔기와 추가로 접촉한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 Pro4, Lys7, Glu40, Lys41, Leu42, Ser44, Ser45, Arg46, Arg65, Trp76, Leu78, Pro79, Ser80, Gln82, Ser165, 및 Arg166으로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상의 GPVI 잔기와 추가로 접촉한다.
본원에서 사용되는 바, "접촉 잔기"라는 것은 소프트웨어 프로그램, 예를 들어, CCP4 소프트웨어 패키지의 NCONT 또는 등가의 소프트웨어 프로그램를 사용함으로써 GPVI에 대한 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편과 GPVI 항원 사이의 결정 구조로 측정된 바, GPVI 항원 잔기까지의 거리 또는 그 반대의 경우의 거리가 4.5 Å 미만인 잔기로 정의된다.
한 실시양태에서, 항체 Fab 단편은 인간 GPVI의 입체형태적 에피토프에 결합하고, Ser 43, Arg 67 및 Asp 81을 포함하는 인간 GPVI 잔기와 접촉한다.
또 다른 실시양태에서, 항체 Fab 단편은 인간 GPVI의 입체형태적 에피토프에 결합하고,
Pro4, Lys7, Glu40, Lys41, Leu42, Ser43, Ser44, Ser45, Arg46, Arg65, Arg67, Trp76, Leu78, Pro79, Ser80, Asp81, Gln82, Ser165, Arg166을 포함하는 인간 GPVI 잔기와 접촉한다.
Fab 단편이 클론 390으로부터의 항-GPVI mAb의 가변 도메인 서열을 함유하는 바, 본 발명의 mAb는 동일한 입체형태적 에피토프를 인식한다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 GPVI 단백질의 세포외 D1 및 D2 도메인에 포함된 입체형태적 에피토프를 인식하는 Fab 단편을 포함하는 항-GPVI 항체를 제공한다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 아미노산:
Glu40, Lys41, Leu42, Ser43, Ser44, Ser45, Arg46을 포함하는 입체형태적 에피토프를 인식하는 모노클로날 항-GPVI 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 아미노산:
Trp76, Leu78, Pro79, Ser80, Asp81, Gln82를 포함하는 입체형태적 에피토프를 인식하는 항-GPVI 항체를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 항-GPVI 항체는 하기 아미노산:
Glu40, Lys41, Leu42, Ser43, Ser44, Ser45, Arg46, Trp76, Leu78, Pro79, Ser80, Asp81, Gln82를 포함하는 입체형태적 에피토프를 인식한다.
또 다른 실시양태에서, 항-GPVI 항체는 하기 아미노산:
Pro4, Lys7, Glu40, Lys41, Leu42, Ser43, Ser44, Ser45, Arg46, Arg65, Arg67, Trp76, Leu78, Pro79, Ser80, Asp81, Gln82, Ser165, Arg166을 포함하는 입체형태적 에피토프를 인식한다.
또 다른 실시양태에서, 항-GPVI 항체는 하기 아미노산:
Pro4, Lys7, Glu40, Lys41, Leu42, Ser43, Ser44, Ser45, Arg46, Arg65, Arg67, Trp76, Leu78, Pro79, Ser80, Asp81, Gln82, Ser165, Arg166을 포함하는 입체형태적 에피토프를 인식한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체 Fab 단편은 주로 인간 GPVI의 D1 도메인을 수반한다.
본 발명의 항체는 (i) 서열 6의 HC 및 서열 8의 LC를 포함하는 항체의 인간 GPVI에의 결합을 경쟁적으로 억제시키고, (ii) 생물물리학적 방법, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 (문헌 [Karlsson R, Larsson A. (2004), J. Mol. Biol. 248, 389-415]에 기술된 바와 같은 비아코어(Biacore))에 의해 측정된 바, 서열 6의 HC 및 서열 8의 LC를 포함하는 항체에 의해 인식되는 입체형태적 에피토프와 유사한 에피토프, 또는 상기 입체형태적 에피토프의 일부에 적어도 10 nM (KD ≤ 10-8 M)의 친화도로 결합하는 것인 모노클로날 항-GPVI 항체로서 정의될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "KD"라는 용어는 특정 항체/항원 상호작용의 해리 상수로서 정의된다.
인간 GPVI 단백질과, 본 발명의 항체 및 Fab 사이의 상호작용을 반영하는 KD는 [10-7; 10-10] 간격에 포함되어 있다. 인간 GPVI에 특이적인 항체는 KD = 10-7 M, 바람직하게 KD = 10-8 M, 더욱 바람직하게 KD = 10-9 M을 나타낸다. 친화도가 가장 큰 항체는 KD = 10-10 M 이하, 예를 들어, 10-11 M 또는 10-12 M을 가질 수 있다. "특이적으로 결합한다"라는 용어 등은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 GPVI 항원과 함께 생리학적 조건하에서 상대적으로 안정적인 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적인 결합은 1 x 10-6 M 이하의 해리 상수를 특징으로 할 수 있다. 2개의 분자가 특이적으로 결합하는지 여부를 측정하는 방법은 당업계에 주지되어 있고, 그 방법으로는 예를 들어, 실시예 2 및 3에 기술되어 있는 것과 같은 평형 투석, 표면 플라즈몬 공명 등을 포함한다. 예를 들어, 본 발명과 관련하여 사용되는 바, 인간 GPVI에 "특이적으로 결합하는" 항체로는 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 검정으로 측정된 바, 약 1,000 nM 미만, 약 500 nM 미만, 약 300 nM 미만, 약 200 nM 미만, 약 100 nM 미만, 약 90 nM 미만, 약 80 nM 미만, 약 70 nM 미만, 약 60 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 40 nM 미만, 약 30 nM 미만, 약 20 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 4 nM 미만, 약 3 nM 미만, 약 2 nM 미만, 약 1 nM 미만 또는 약 0.5 nM 미만인 KD로 인간 GPVI 또는 그의 일부에 결합하는 항체를 포함한다.
"에피토프"는 항체가 결합하는 항원 상의 부위이다. 항원이 중합체, 예를 들어, 단백질 또는 다당류인 경우, 에피토프는 항원 중합체의 폴딩에 의해 매우 근접하게 위치하도록 놓여진 인접 잔기에 의해, 또는 비-인접 잔기에 의해 형성될 수 있다. 단백질에서, 인접 잔기에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에의 노출시에도 유지되며, 이는 "선형 에피토프"로서 알려져 있는 반면, 비-인접 잔기에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 상기와 같은 노출시에는 상실되고, "입체형태적 에피토프"로 알려져 있다.
본원에서 사용되는 바, "유사한 에피토프"라는 용어는 결정학적 분석에 의해 클론 390으로부터 유래된 항체와 인간 GPVI 단백질의 세포외 도메인 사이의 상호작용에 물리적으로 관여하는 것으로 기술된 아미노산과 동일한 영역에 위치하는 아미노산 세트에 관한 것이다. 유사한 에피토프는 수개의 차이, 예를 들어, 참고 에피토프 인근에 최대 5개까지의 아미노산 차이를 포함할 수 있다. 유사한 에피토프는 또한 에피토프를 형성하는 것으로 확인된 아미노산, 즉, GPVI 단백질과 상호작용하는 아미노산 중에 하나 이상의 변형을 나타낼 수 있다. 참조 에피토프의 일부로서 확인된 하나 이상의 아미노산은 존재하지 않을 수 있고, 유사한 에피토프를 형성하기 위해 하나 이상의 추가의 아미노산 잔기가 존재할 수 있다. 예를 들어, 하이브리도마 클론 390으로부터의 항체와 비교하여 항체의 특징에는 영향을 미치지 않으면서 최대 5개까지의 아미노산이 변경될 수 있다. 따라서, 한 특이적인 항체에 대한 에피토프가 위치하는 영역은 잠재적으로 추가의 상호작용을 할 수 있는 아미노산 일부를 포함한다. 이러한 관점에서, 유사한 에피토프란 참조 항체와의 결합에 대해 경쟁하는 영역으로서 정의될 수 있다. 중화 항체가 상기 영역에 결합하게 되면, 수용체의 하나 이상의 세포 신호 경로(들)는 억제되어 표적화된 수용체 또는 보다 일반적으로는 효과적인 단백질의 하나 이상의 생물학적 기능(들)이 특이적으로 손상된다.
본원에서 사용되는 바, "중화" 또는 "차단" 항체란, 해당 항체의 GPVI에의 결합이 (i) GPVI와 콜라겐 사이의 상호작용을 간섭하고/거나, (ii) 및/또는 (iv) GPVI의 적어도 하나의 생물학적 기능을 억제시키는 것인 항체를 의미하는 것으로 한다. GPVI 중화 또는 차단 항체에 의해 억제되었다는 것이 적절한 검정을 통해 검출될 수 있는 한, 그러한 억제가 완전할 필요는 없다. GPVI 억제를 검출하는 에시적인 검정은 본원에 기술되어 있다.
특이적인 생물학적 활성과 연관된 단백질내 국소 영역의 존재는 예를 들어, 특허 US 6,448,380에 설명되어 있다.
클론 390으로부터 유래된 항체와 유사한 에피토프를 인식하는 항체는 포획 항원으로서 GPVI-Fc 융합 단백질을 사용하여 경쟁적 ELISA 검정에 의해 선별될 수 있다. GPVI-Fc 융합 단백질로 코팅된 플레이트를 클론 390으로부터 유래된 하이브리도마 상청액 또는 항체 또는 항원 결합 단편과 인큐베이션한다. (임의의 표준 기법에 의해 표지된) 상이한 항-GPVI 항체가 에피토프 차단된 GPVI에 결합하지 못하였다는 것은 유사한 에피토프의 인식을 시사하는 것이다. GPVI가 고정되어 있고, 클론 390으로부터 유래된 항체 (단편)가 에피토프 차단을 위해 사용되는 경쟁적 비아코어 검정에 의해 등가의 선별 전략을 추구할 수 있다. 현재 다른 GPVI 결합 항체 후보물질인 에피토프가 차단된 GPVI에의 결합에 대해 분석되고 있다. 따라서, 본 발명의 항체에 의해 인식되는 에피토프와 유사한 에피토프를 인식하는 항체를 선별하고, X선 분석을 사용하여 공-결정 구조 분석에 의해 특징을 규명할 수 있다.
본 발명은 또한 인간화 및 조작된 항-GPVI 항체 및 그의 단편에 관한 것이다.
본 발명과 관련하여, 항-GPVI Fab 단편은 앞서 WO2009/032661에 기술된 방법을 사용하여 인간화된 것이지만, 당업계에 공지된 임의의 인간화 방법이 사용될 수 있다.
Fab와 GPVI의 결정학적 복합체에 대한 분석에 기초하여, 인간화를 위해 및 Fab의 인간 GPVI에의 친화도 개선을 목적으로 하는 두 목표를 위해 수개의 돌연변이가 도입되었다.
그 결과, LC에 대해 3개의 변이체, 및 HC에 대해 5개의 변이체가 생성되었다. 이러한 Fab 변이체는 각각 LC (VL) 및 HC (VH)에 대해 하기 표 6 및 표 7에 요약되어 있다.
모든 가능한 조합들 중, 본 발명은 특히 하기 조합에 관한 것이다:
각각 서열 15 및 서열 10에 상응하는 VL1과 VH1의 조합
각각 서열 15 및 서열 11에 상응하는 VL1과 VH2의 조합
각각 서열 15 및 서열 12에 상응하는 VL1과 VH3의 조합
각각 서열 15 및 서열 13에 상응하는 VL1과 VH4의 조합
각각 서열 15 및 서열 14에 상응하는 VL1과 VH5의 조합
각각 서열 16 및 서열 11에 상응하는 VL2와 VH2의 조합
각각 서열 17 및 서열 11에 상응하는 VL3와 VH2의 조합
각각 서열 17 및 서열 13에 상응하는 VL3와 VH4의 조합.
바람직한 실시양태에서, 항-GPVI Fab의 인간화된 변이체는 서열 12와 서열 15에 상응하는 VH3과 VL1의 회합이다.
본 발명의 한 측면에서, 항-GPVI 항체의 VH는 기존 항체에 의한 인식으로부터 항체를 차폐시키기 위해 태그 또는 아미노산 연장부 (펩티드)를 부가함으로써 추가로 변형될 수 있다. 6개 이상의 히스티딘 잔기, 특히, (His)6, 또는 (His)7, 또는 (His)8, 또는 GlyGlyGlyGlySer 또는 (GlyGlyGlyGlySer)2와 같은 단위로 된 서열이 중쇄의 C-말단에 부가될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "조작된 Fab 단편"이란 c-말단에 중쇄 펩티드 연장부를 포함하도록 유전자 조작된 Fab 단편을 의미한다. 연장부를 통해 이전 c-말단은 가려지고, Fab 단편의 인식 및 그의 기존 항-Fab 항체에의 결합은 방지된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 인간화된 중쇄 (HC) 아미노산 서열 및 인간화된 경쇄 (LC) 아미노산 서열 및 c-말단 연장부의 조합을 포함하는 조작된 Fab 단편이 제공된다. 조작된 Fab 단편은 추가로
(a) LCVR (서열 15) 및 HCVR (서열 10)
(b) LCVR (서열 15) 및 HCVR (서열 11)
(c) LCVR (서열 15) 및 HCVR (서열 12)
(d) LCVR (서열 15) 및 HCVR (서열 13)
(e) LCVR (서열 15) 및 HCVR (서열 14)
(f) LCVR (서열 16) 및 HCVR (서열 11);
(g) LCVR (서열 17) 및 HCVR (서열 11); 및
(h) LCVR (서열 17) 및 HCVR (서열 13)
으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (HCVR) 아미노산 서열 및 경쇄 가변 영역 (LCVR) 아미노산 서열의 조합을 추가로 포함하며,
여기서, c-말단 연장부는 서열 35; 서열 36; 및 서열 37로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 6의 HC 및 서열 8의 LC를 포함하는 모노클로날 항체, 또는 이들 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함하되, 상기 모노클로날 항체와 동일한 활성을 보유하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
더욱 특정의 실시양태에서, 본 발명의 항체 Fab 단편은 (a) 서열 6으로 정의되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 8로 정의되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-GPVI 항체 및 Fab를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 항-GPVI 항체의 HC 및/또는 LC를 코딩한다. 바람직한 실시양태에서, 단일 핵산은 항-GPVI 항체의 HC를 코딩하고, 또 다른 핵산 분자는 항-GPVI 항체의 LC를 코딩한다.
특정 실시양태에서, 하이브리도마 390으로부터의 항체로부터의 HC 및 LC의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 각각 서열 5 및 서열 7, 또는 이들 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 가지되, 상기 모노클로날 항체와 동일한 활성을 보유하는 서열에 상응한다.
서열 6, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 및 서열 17로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 가지되, 상기 모노클로날 항체와 동일한 활성을 보유하는 서열 또한 본 발명의 일부가 된다.
본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 한 실시양태에서, 벡터는 항-GPVI 항체의 HC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 항-GPVI 항체의 LC를 코딩한다. 본 발명은 또한 융합 단백질, 변형된 항체, 항체 단편, 및 그의 프로브를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 벡터는 서열 5 또는 서열 7의 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 6, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 및 서열 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드, 또는 이들 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 가지되, 상기 모노클로날 항체와 동일한 활성을 보유하는 서열을 포함한다.
본 발명의 항-GPVI 항체 또는 Fab의 HC, HC의 단편 및/또는 LC를 발현시키기 위해, 상기 HC 및/또는 LC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 상기 유전자가 전사 및 번역 서열에 작동적으로 연결되도록 발현 벡터 내로 삽입시킨다. 발현 벡터로는 플라스미드, YAC, 코스미드, 레트로바이러스, EBV 유래이 에피솜, 및 상기 중쇄 및/또는 경쇄를 확실히 발현시키는 데 있어 편리한 것으로 숙련가에게 알려져 있는 다른 벡터들 모두를 포함한다. HC/또는 HC 단편 및 LC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 상이한 벡터로 또는 동일한 벡터로 클로닝될 수 있다는 것을 숙련가는 이해할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 동일한 벡터로 클로닝된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 상기 분자를 포함하는 벡터는 적합한 포유동물 또는 미생물 숙주 세포를 형질전환하는 데 사용될 수 있다. 형질전환은 폴리뉴클레오티드를 숙주의 세포 내로 도입시키는 임의의 공지 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 방법은 당업자에게 주지되어 있으며, 그러한 방법으로는 덱스트란-매개 형질전환, 인산칼슘 침전, 폴리브렌-매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 폴리뉴클레오티드의 리포솜 내로의 캡슐화, 바이오리스틱 주입 및 DNA의 핵산 내로의 직접적인 미세주입을 포함한다.
본 발명의 인간화 및 조작된 변이체는 전체적으로 GPVI 경로 활성을 길항시키는 기능이 있다. 특히, 이들은 콜라겐의 GPVI에의 결합을 억제시킬 수 있다. 이는 또한 인간 혈소판 풍부 혈장 및 인간 전혈 둘 모두에서 콜라겐에 의해 유도되는 혈소판 응집을 억제시킬 수 있다. 추가로, 이들은 또한 콜라겐으로 코팅된 표면상의 유동하 혈전 형성을 억제시킬 수 있다.
본 발명의 항-GPVI Fab 단편의 GPVI에의 결합은 혈소판 표면상의 GPVI 고갈 표현형의 발생을 통해 특징화된다. 이는 신규한 예상 밖의 항-GPVI Fab 단편에 대한 작용 기전이다. 본원에 기술된 Fab 단편의 이와 같은 독특한 특징은 상기 분자에 의해 표적화되는 신규의 에피토프에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "GPVI 고갈 표현형"이란, 항체 또는 항원 결합 단편이 혈소판 표면상의 GPVI 수용체 분자에 결합하였을 때, 이것이 혈소판 상의 GPVI 경로의 활성화를 방지함으로써 일어나는 결과인 세포 상태를 의미한다. 이러한 GPVI 고갈 표현형은 (i) GPVI 수용체가 세포 표면으로부터 제거되거나, 또는 그로부터 고갈되거나, 또는 (ii) 항체 또는 항원 결합 단편이 비가역적인 방식으로 GPVI 수용체 분자에 결합함으로써 수용체의 억제가 세포 수명 기간 동안 유지되는 것인, 2가지 상이한 기전에 의존할 수 있다. 상기 두 상황에서의 표현형은 오직 혈소판이 재생되는 경우에만 복귀하게 될 것이다.
이러한 항-GPVI Fab 단편이 GPVI 고갈 표현형을 유도한다는 사실은 효능면에 있어서 하기와 같은 2가지 이점을 나타낸다:
i) 수용체 발산이 기전의 적어도 일부가 되는 경우, 이러한 과정은 일반적으로 Fab의 GPVI에의 결합과는 독립적이다. 이는 Fab에 의한 세포 표면 GPVI의 점유율 (예를 들어, 30%)이 발산을 유도할 경우, 발산 과정은 Fab에 의해 점유되는 GPVI 수용체를 30%로 제한하지 않고, 유리 GPVI로도 확장될 것이라는 것을 의미한다. 이는 현저히 더 적은 Fab로도 (고갈에 의해) GPVI를 100% 차단시킬 수 있다는 것을 암시한다.
ii) 억제 효과는 장기간 동안 효과를 발휘한다: Fab 단편의 혈장 반감기는 대략 1-2시간으로 매우 짧은 것으로 알려져 있으며, 이는 장기간 동안 지속적으로 표적을 억제시켜야 하는 경우인 수개의 적응증에 대해서는 문제가 될 수 있다. 수용체의 고갈 또는 비-가역적 점유에 관한 기술된 바와 같은 기전에 따라, (약력학적 특성에 기초한) 효과의 지속 기간은 Fab의 약동학적 특성과는 분리될 것이다. 이는 일단 고갈 또는 비-가역적 억제가 유도되면, 혈소판은 영향을 받은 수용체를 치환시킬 수 없기 때문이다. 이어서, 수용체는 혈소판의 수명 기간 동안 부재 상태로 유지되거나, 이용불능인 상태로 유지된다. 이는 혈소판의 반감기 (인간 혈소판의 경우, 10일)에 따라 작용 지속 기간은 수일까지 연장된다는 것에 상응한다.
이러한 특성들 모두 본 발명의 Fab가 혈전성 질환 및 혈관 질환에 대해 적합한 후보 물질이라는 것을 입증한다.
항체 기반의 생물학적 성질에 있어 중요한 표적 부류는 모노클로날 항체에 의해 고특이성으로 차단될 수 있는 막 수용체이다. IgG 포맷의 전장 항체는 그의 Fv 부분을 통해 그의 표적에 결합하고, 추가로는 또한 차단한다. Fc 부분은 이들 분자에 항체 유래 세포 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 이끄는 기능을 부가한다. 이러한 활성은 대개 특히 종양학 적용에서 mAb 작용 모드 (MoA)의 중요한 부분이다. 그러나, 다른 적용 분야에서 ADCC/CDC 활성은 최소화되어야 하거나, 또는 필요없을 수 있다. 따라서, Fc 부분이 없는 항체 단편들 다수, 예를 들어, Fab 분자가 바람직할 수 있다.
1가 항체 단편을 개발하고자 하는 또 다른 이유는 표적 생물학으로부터 도출된다. 다수의 막 수용체는 수용체 클러스터링 (예를 들어, GPVI) 이후에 신호 전달을 개시한다. 그러한 수용체가 차단되어야 한다면, 1가 항체 단편이 최상의 천연 포맷이다.
다수의 임상 적용을 위해서는 항체 단편, 예를 들어, Fab 단편이 전체 항체보다도 더욱더 적합한 포맷이다. 이러한 이점은 전체 항체와 Fab 단편을 구별짓는 그의 여러가지 독특한 특징들, 특히 하기와 같은 특징에 의존한다:
- 1가: 분자의 교차-결합이 제거되어야 한다면 요구됨
- Fc 도메인의 부재: Fc-기능이 필요없거나, 비바람직하다면 요구됨
- 저분자량: 약동학적 및 약력학적 거동 뿐만 아니라, 조직 분포를 결정짐.
환자에게 투여된 후 항체 Fab 단편의 이와 같은 바람직한 특성을 유지시키기 위해서는 Fab 단편과 비-표적 분자의 상호작용은 회피되어야 한다.
앞서 언급한 바와 같이, Fab 단편은 IgG 분자의 중쇄의 불변 도메인 (Fc 부분)을 결실시킴으로써 수득된다. 불행하게도, Fc를 제거하면 신규한 C-말단 (또는 C-말단) 펩티드, 즉, 네오에피토프가 노출된다. 인간에서의 Fab 단편의 C-말단 단부와 특이적으로 상호작용할 수 있는 구체적인 단백질 부류가 보고된 바 있으며, 이는 항체 단편, 예를 들어, Fab에 대한 기존 항체로서 확인되었다 (문헌 [Kormeier et al. (1968) J. Immunol. 100(3);612-21]; [Persselin and Stevens (1985) J. Clin. Invest. 76; 723-30])). 이러한 기존 항체는 어린 시절에 형성되며, 환자에 따라 다르다. 신규한 치료제로서의 모노클로날 항체 및 항체 단편 개발에 있어 기존 항-Fab 항체의 존재는 상기 언급한 이유에서 치료상의 Fab 분자의 사용을 제한하고 복잡하게 만든다.
추가로, 앞서 기술된 바와 같이 (문헌 [Christopoulos C, et al., 1994]) Fab의 C-말단 단부가 항체 생성을 위해서는 바람직한 에피토프이다. 그러나, 심지어 환자가 C-말단에 대한 기존 항체를 가지고 있지 않거나, 또는 소량으로 가지는 경우에도, 이러한 에피토프에 대해 유도되는 새로운 항체 발생은 치료제 Fab 투여 이후에도 관찰될 수 있으며, 이는 기존 항체의 경우에서 기술된 것과 동일한 한계에 이르게 한다.
사실상, Fab C-말단 에피토프에 대한 기존 또는 새로운 항체에 의해서 치료 Fab 분자가 결합하게 되면, 분자의 약동학적 및 약력학적 거동에 변화가 생기고 (예를 들어, 1가에서 2가 분자로의 변화에 기초하여 억제 대신 수용체 활성화가 일어나고), (예를 들어, 그의 효과기 기능 모두를 가진 항체 Fc 부분을 부가하는) 새로운 복합체 및 기능이 형성되고, 조직 분포의 결과일 수도 있는, 복합체 크기에 변화가 생긴다. 따라서, 이러한 현상은 회피되어야 하는 유의한 안전성 및 효능 위험을 나타낸다.
그러한 한계를 피하기 위해서는, 현재 항-GPVI Fab 분자에 대해 기술된 바와 같이, Fab의 C-말단 종단부에 분자를 부가함으로써 항-Fab 항체에 의해 인식되는 네오에피토프를 차폐시킬 수 있다. 이러한 원리는 모든 치료 항체 단편 개발에 있어 필수적이며, 이 경우 표적 생물학이 2가 분자의 사용을 저지함에 따라 (예를 들어, 클러스터링을 통해 수용체 활성화가 이루어지는 경우), 이에 1가 분자 사용이 엄격하게 요구된다.
따라서, 치료법이 모든 환자에게 가장 안전하도록 하게 하면서, 환자 특이적인 약동학적 및 약력학적 변동성을 회피하기 위해서는 Fab 단편에 대한 기존의, 또는 새로 생성된 항체에 의해 인식될 수 있는 C-말단 단부에서 생성된 Fab 특이적 네오에피토프를 차폐시킬 수 있도록 Fab 분자가 변형되어야 한다.
본 발명은 C-말단에 분자가 부가된 Fab 단편에 관한 것이다. 이러한 분자는 에피토프를 차폐시킬 수는 있지만, Fab의 표적에의 결합은 간섭하지 않는 펩티드, 또는 임의의 다른 종류의 분자일 수 있다.
특정 실시양태에서, Fab 단편의 네오에피토프를 차폐시킬 수 있는 상기 분자는 1 내지 100개의 아미노산, 1 내지 50개의 아미노산, 1 내지 20개의 아미노산, 1 내지 15개의 아미노산 또는 1 내지 10개의 아미노산을 포함할 수 있는 펩티드이다.
예를 들어, His-태그, G4S 또는 (G4S)2 스트레치 펩티드가 적절한 분자를 구성할 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 그의 중쇄의 C-말단 단부에 분자를 보유하는 Fab에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 그의 C-말단 단부에 분자를 보유하는 Fab 단편은 GPVI를 특이적으로 인식한다. 바람직한 실시양태에서, 상기와 같은 Fab 단편은 앞서 기술된 것들 중에서 선택된다.
특정 실시양태에서, Fab 중쇄 서열은 서열 29 또는 서열 30 또는 서열 31을 포함하는 서열에 상응한다.
또 다른 실시양태에서, Fab 중쇄 서열은 서열 29 또는 서열 30 또는 서열 31로 이루어진 서열에 상응한다.
본 발명은 또한 분자를 부가함으로써 C-말단 종단부를 차폐시키는 것으로 구성된, C-말단 단부에 대해 유도되는 기존 항체 또는 새로운 항체에 의해 Fab 단편이 인식되지 못하도록 방지하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 이러한 분자를 통해 Fab-항체 복합체의 원치않는 발생을 방지할 수 있다.
본 발명은 또한 분자를 부가함으로써 Fab의 C-말단 단부를 차폐시키는 것으로 구성된, 항-GPVI Fab가 사용될 때의 혈소판 활성화를 방지하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
a. Fab의 C-말단 단부에 분자를 부가하는 단계,
b. 박테리아, 효모, 또는 포유동물 세포주를 비롯한, 적절한 시스템에서 변형된 Fab를 생산하는 단계,
c. 변형된 Fab를 정제하는 단계
를 포함하는, 그의 C-말단 단부에 분자를 보유하는 변형된 Fab를 제조하는 방법에 관한 것이다.
생산된 Fab를 적절한 용액 중에서 추가로 제제화시킬 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 특정의 임상적 적응증, 예를 들어, 급성 관상 동맥 증후군, 경피적 관상 동맥 중재술, 허혈성 뇌졸중, 경동맥 협착증 또는 말초 동맥 폐쇄성 질환의 치료에서 혈전성 사건을 예방하기 위한, 항-GPVI 항체, 특히, 본 명세서에 기술된 바와 같은 Fab 단편의 용도로 이루어진다. 추가로, 재협착증 및 아테롬성동맥경화증 예방을 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-GPVI 항체, 및 특히 Fab 단편과 적절한 부형제를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 혈전성 질환 및 혈관 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 항체는 GPVI 발현의 변화를 진단하는 데 사용될 수 있다. 혈소판 표면상의 GPVI의 발현의 변화 뿐만 아니라, 혈장 중 가용성 GPVI (GPVI의 절단된 세포외 도메인)의 존재 및 농도의 변화는 병태생리학적 상태, 예를 들어, 급성 관상동맥 증후군, 일과성 허혈 발작 또는 뇌졸중과 깊은 연관성이 있을 수 있다고 기술된 바 있다 (문헌 [Bigalke B, et al., Eur J Neurol., 2009 Jul 21; Bigalke B. et al., Semin Thromb Hemost. 2007 Mar;33(2): 179-84]).
따라서, 이러한 파라미터의 측정값은 항혈전성 치료를 필요로 하고, 특히 항-GPVI 치료에 영향을 받을 가능성이 큰 상기 언급한 바와 같은 상태의 위험이 있는 환자를 확인하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 항체 및 항체 단편은 진단 도구로서 사용될 수 있고, 혈소판 표면상 뿐만 아니라, 혈장 샘플 중의 GPVI의 존재 및 정량적 변화를 측정하는 진단용 키트의 일부가 될 수 있다.
항체 및 그의 단편은 항혈전성 치료가 유익할 수 있는 위험에 있는 환자를 진단하는 데 사용될 수 있다.
환자에서 GPVI 변화를 진단하는 상기 방법은 (i) 상기 환자의 혈소판 또는 혈장 샘플을 본 발명에 따른 항체 또는 그의 Fab 단편과 접촉시키는 단계, (ii) 상기 항체 또는 Fab의, 상기 샘플 중에 존재하는 세포에의 결합을 측정하는 단계, 및 (iii) 단계 (ii)에서 측정된 결합을, 정상의 참조 대상체 또는 표준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 포함하는, 인간 GPVI 발현 변화를 검출하기 위한 진단용 키트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 키트는 ELISA 검정 키트로서 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 환자는 본 발명의 차폐된 Fab 또는 다른 항체의 투여 이전에 항-Fab 항체의 존재에 대해 스크리닝된다.
본 발명은 또한
a. 본 발명의 하나의 HC 또는 HC 단편 및 하나의 LC를 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 세포를 배양하는 단계,
b. 배양 배지에서 발현된 항체 또는 Fab를 정제하는 단계,
c. 간편한 형태로 항체를 제제화하는 단계
를 포함하는, 본 발명의 항-GPVI 항체 또는 Fab 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 항체를 발현시키기 위해 이뮤노글로불린을 생산할 수 있는 임의의 발현 세포주가 사용될 수 있다. 포유동물로부터 유래된 발현 세포주 뿐만 아니라, 임의의 다른 발현 시스템, 예를 들어, 효모 세포 (문헌 [A. H. Horwitz, et al., PNAS. 1988 Nov; 85(22): 8678-82]) 또는 박테리아 세포 ([Chiba Y, Jigami Y. Curr Opin Chem Biol. 2007 Dec; 11 (6): 670-6])도 사용될 수 있다.
예를 들어, 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 항체를 정제할 수 있다.
항체의 제제화는 상기 항체의 의도된 용도에 따라 달라진다.
그 용도에 따라, 예를 들어, 제약상 용도, 수의학상 또는 진단학상 용도에 따라, 항체는 동결건조되거나, 또는 그렇지 않을 수 있고, 적절한 용액 중에 용해될 수 있다.
이러한 일반적인 설명 뿐만 아니라, 하기 상세히 기술되는 설명은 단지 예시적인 것으로 설명하기 위한 것이라는 것에 주의하여야 하며, 본 발명을 제한하지 않아야 한다. 본 명세서에 포함된 도면은 본 발명의 원리를 설명하기 위한 의도에서 본 발명의 여러 실시양태를 도시하는 것이다.
도 1: 경쟁 ELISA에 의한 콜라겐 결합 억제. (a) hGPVI-Fc 및 (b) 마카카(Maccaca) GPVI-Fc에 대한 용량-의존성 (IC50).
도 2: 인간 및 영장류 GPVI에 대한 선별된 하이브리도마 mAb에 대해 수행된 ELISA에 의한 교차-반응성 분석.
도 3: 하이브리도마 클론 390으로부터의 IgG의 피신 절단에 의해 생산된 Fab.
도 4: 항-GPVI Fab 단편 (VL1과 VH3의 조합)에 의한 콜라겐 유도성 혈소판 응집의 억제.
도 5: Fab와 인간 GPVI 단백질의 세포외 도메인 사이의 상호작용을 보여주는 결정학적 데이터. (A) GPVI 단백질의 D2 도메인과 Fab 사이의 상호작용. (B) GPVI 단백질의 D1 도메인과 Fab 사이의 상호작용. (C) GPVI 단백질의 D1-D2 도메인과 Fab 사이의 상호작용.
도 6: 콜라겐 유도성 전혈 응집에서 항-GPVI Fab 단편의 억제 활성에 대한 IC50 곡선의 일례.
도 7: 항-GPVI Fab 단편에 의한 유동하 혈전 형성의 억제에 관한 일례.
도 8: 항-GPVI Fab는 농도 의존적 방식으로 GPVI 표면 발현을 감소시킨다.
도 9: 항-GPVI Fab는 시간 의존적 방식으로 유의한 GPVI 고갈을 일으킨다.
도 10: 항-GPVI Fab가 생체외 전혈 혈소판 응집에 미치는 효과 (효능제: 1 ㎍/ml). a - 1 mg/kg IV 볼루스 투여 후. b - 3 mg/kg IV 볼루스 투여 후.
도 11: 전혈 혈소판 응집 검정에서 항-GPVI Fab의 시험관내 활성 (효능제: 1 ㎍/ml).
도 12: 항-GPVI Fab의 IV 볼루스 투여가 혈소판 계수에 미치는 효과. a - 3 ml/kg의 PBS 비히클 투여 후 (대조군). b - 0.01 mg/kg의 항-GPVI Fab 투여 후. c - 0.1 mg/kg의 항-GPVI Fab 투여 후. d - 1 mg/kg의 항-GPVI Fab 투여 후. e - 3 mg/kg의 항-GPVI Fab 투여 후.
도 13: 항-GPVI Fab의 iv 투여 후, 혈소판 상의 GPVI 수용체 발현에 관한 FACS 분석. 수직선을 통해 좌측의 GPVI 음성 혈소판과, 우측의 GPVI 양성 혈소판이 구분된다. a - 투여 이전. b - 투여 후 24 h. c - 투여 후 48 h. d - 투여 후 72 h. e - 투여 후 150 h.
도 14: 항-GPVI Fab가 혈소판 활성화에 미치는 효과. 대조군 패널에서, 콘불신 첨가. 패널 A에서, IgG 고갈 이후 Fab 첨가. 패널 B에서, 변형된 Fab 첨가.
도 15: A - Fab 대조군; B - Fab-His-태그; C - FabGly4Ser 및 Fab-(Gly4Ser)2
도 16: (서열 32에 상응하는) 20개 잔기의 신호 서열이 제거된 GPVI. 굵게 표시된 잔기는 항체 CDR과 접촉하는 입체형태적 에피토프를 나타낸다.
실시예
실시예 1: GPVI의 재조합 세포외 D1 및 D2 도메인의 생성
A - hGPVI - hFc 융합 발현 플라스미드 ( hGPVI - hFc )의 구축
PCR 주형으로서 인간 cDNA 함유 플라스미드를 사용하여, 인간 이뮤노글로불린 IgG의 힌지 영역, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 237개의 아미노산 잔기 중쇄 불변 영역을 코딩하는 DNA 단편을 증폭시켰다.
PCR 주형으로서 인간 게놈 DNA를 사용하여, 205개의 아미노산 잔기 인간 GPVI D1 및 D2 세포외 도메인을 코딩하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 이러한 인간 GPVI D1 및 D2 단편은 신호 서열을 포함하고, 야생형 단백질 (NP_057447/Q9HCN6)에서 아미노산 M1 내지 T205에 상응한다. 결찰 PCR에 의해서, 인간 GPVI D1 및 D2를 코딩하는, 생성된 증폭, 절단 및 정제된 PCR 생성물을 인간 Fc 영역과 조합시키고, EcoRI 및 NotI 부위를 사용하여 주입 방법에 의해 바큘로바이러스 발현 벡터 pVL1393 내로 결찰시켰다. 생성된 GPVI-Fc ORF를 서열 1로서 및 그의 상응하는 단백질 서열을 서열 2로서 목록에 열거하였다.
B - GPVI - tev - his 발현 플라스미드 ( GPVI - tev - his )의 구축
PCR 주형으로서 앞서 기술된 GPVI-Fc 함유 플라스미드를 사용하여, 야생형 단백질 (스위스프로트(Swissprot): Q9HCN6)에서 아미노산 M1 내지 T205에 상응하는 신호 서열을 포함하는 인간 GPVI D1 및 D2 세포외 도메인을 증폭시켰다. 역방향 프라이머는 tev 절단 인식 서열을 코딩하는 DNA, 및 구축물의 C-말단의 His-태그를 나타내는 7개 히스티딘 잔기를 함유하였다. 생성된 증폭된 PCR 단편을 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI + NotI로 절단하고, 이를 바큘로바이러스 발현 벡터 pVL1393 내로 결찰시켰다. 생성된 ORF를 서열 3으로서 및 그의 상응하는 단백질 서열을 서열 4로서 목록에 열거하였다.
C - hGPVI - hFc 및 GPVI - tev - his 단백질의 발현 및 정제
SF900 II 무혈청 현탁 배양액 (인비트로젠(Invitrogen)) 중에서 성장된 SF9 세포를 발현 플라스미드 및 플래시백(FlashBac) 바큘로바이러스 DNA (옥스포드 익스프레션 테크놀로지스(Oxford Expression Technologies))로 함께 공동-형질감염시켰다. 셀펙틴(Cellfectin) 형질감염 시약 (인비트로젠)을 사용하여 형질감염을 수행하였다. 5 h 경과 후, 5%의 총 소 태아 혈청을 형질감염된 배양물에 첨가하였다. 세포를 5일 동안 28℃에서 배양하였다. 재조합 바이러스를 함유하는 배양 상청액은 5% 소 태아 혈청을 함유하는 SF900 II 현탁 배양물 중에서의 보다 대규모의 바이러스 증폭을 위해 사용되었다.
단백질 발현을 위해, 엑셀(ExCell) 405 (SAFC)에서 성장하는 하이파이브(HighFive) (인비트로젠) 세포에 적당량의 바이러스 스톡으로 형질도입하고, 27℃에서 72 h 동안 성장시켰다. 수거한 후, 여과하여 (0.22 ㎛) 세포 배양 상청액을 정화시켰다.
정제하기 위해, Fc-융합 GPVI 단백질 변이체를 단백질 A 매트릭스 (지이 헬쓰케어(GE Healthcare)) 상에서 포획하고, pH 이동에 의해 용리시켰다. 슈퍼덱스(Superdex) 200 (지이 헬쓰케어)을 사용하여 SEC에 의해 단백질을 연마하고, 최종의 한외여과 농축 단계를 거친 후, 단백질을 ELISA 및 추가 검정에 사용하였다.
정제하기 위해, IMAC 매트릭스 (히스트랩(HisTrap), 지이 헬쓰케어) 상에서 상청액으로부터 직접 His-태깅된 GPVI 단백질 변이체를 포획하고, 이미다졸 구배에 의해 용리시켰다. 슈퍼덱스 75 (지이 헬쓰케어)를 사용하여 SEC에 의해 단백질을 연마하고 한외여과시킨 후, 지정된 실험에 단백질을 사용하였다.
실시예 2: 기능적 항-GPVI mAb의 생성 및 선별
A - 항- GPVI mAb 의 생성
문헌 [Kilpatrick et al. (1997. Hybridoma 16: 381389)]에 기술된 바와 같은 RIMMS 방법을 사용하여 GPVI 특이적 항체를 생성하였다.
14일의 과정 동안 3-4일의 간격을 두고 정제된 가용성 his-태깅된 GPVI 단백질 (실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 것)을 사용하여 6-8주령된 암컷 BALB/c 마우스 (S082342; 찰스 리버 랩스(Charles River Labs: 메인주 바 하버))를 각각 4회에 걸쳐 면역화시켰다.
0일째 1차 면역화를 위해, 마우스 등을 따라 배액 림프절에 가까운 6군데 부위에 티터맥스(Titermax)의 애주번트 (티에르맥스 골드 애주번트(TierMax Gold Adjuvan); 시그마 #T2684) 중에 유화된 5 ㎍의 항원을 피하로 투여하였다. 복부를 따라 병치되는 6군데 부위에 RIBI의 애주번트 (시그마 애주번트 시스템(Sigma Adjuvant system); 시그마 #S6322) 중에 유화된 또 다른 5 ㎍의 항원을 투여하였다. 4, 7, 및 11일째에 유사한 방식으로 부스터 면역화를 수행하였다.
최종 주사 후 4일째, 마우스를 희생시켰다. 무균 방식으로 양쪽 슬와, 천서혜, 액와 및 아가미 림프절을 단리시키고, 신선한 RPMI 배지로 세척하였다. 림프절로부터 림프구를 유리시키고, 생성된 단일 세포 현탁액을 RPMI 배지로 2회에 걸쳐 세척한 후, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 P3X63-AG8.653 골수종 세포와 융합시켰다. 융합 후, 세포 혼합물을 37℃ 인큐베이터에서 16-24시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 세포 조제물을 선택 반-고체 배지로 옮기고, 100 mm 페트리 플레이트에 무균 방식으로 플레이팅하고, 37℃에서 인큐베이션하였다.
선별 개시 후 10일째, 하이브리도마 성장에 대해 플레이트를 조사하고, 가시적 콜로니를 선별하고, 200 ㎕의 성장 배지를 함유하는 96-웰 플레이트에 배치시켰다. 96-웰 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 2 내지 4일 동안 보관하였다.
B - 인간 GPVI 단백질을 인식하는 mAb 스크리닝
포획 항원으로서 GPVI-Fc 융합 단백질 (실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 것)을 사용하여 ELISA에 의해 항-GPVI IgG 생산에 대한 1차 스크리닝을 수행하였다. 플레이트를 GPVI-Fc 융합 단백질로 코팅하고, 하이브리도마 상청액을 플레이트에 첨가하고, 양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 토끼 항-마우스 IgG (시그마; #A9044)를 사용하여 검출하였다. TMB-H2O2 완충제를 첨가하여 항체 결합을 가시화하고, 450 nm 파장에서 판독하였다.
96-웰 플레이트로부터 선별된 367개의 하이브리도마 중, 129개의 하이브리도마는 항-인간 GPVI 항체 생산에 대해 양성이었고, 111개는 세포 증식 후에 확인되었다.
C - 콜라겐의 인간 GPVI 에의 결합을 차단시킬 수 있는 항- GPVI mAb 의 능력
콜라겐의 인간 GPVI-Fc 융합 단백질에의 결합을 차단시킬 수 있는 그의 능력에 관해 경쟁 ELISA 결합 검정으로 모든 인간 GPVI-특이적 mAb의 기능적 특성을 특징화하는 2차 스크리닝을 수행하였다. 맞춤형의, 콜라겐으로 코팅된 96-웰 플레이트 (피어스(Pierce))를 사용하였다. 사전 인큐베이션된 인간 GPVI-Fc 융합 단백질 혼합물과 하이브리도마 상청액을 플레이트에 첨가하고, 양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 염소 항-인간 IgG-Fc (시그마; #A0170)를 사용하여 콜라겐-인간 GPVI-Fc 복합체를 검출하였다. TMB-H2O2 완충제를 첨가하여 항체 결합을 가시화하고, 450 nm 파장에서 판독하였다. 100개의 GPVI-결합 하이브리도마 중, 22개의 하이브리도마가 GPVI-Fc의 콜라겐에의 결합을 차단시켰다 (역치: 90% 억제율). 인간 GPVI에 대해 사전 선별된 mAb의 차단 특성은 도 1a에 제시된 바와 같은 경쟁 ELISA 검정을 사용하여 확인한 바 용량-의존성인 것으로 밝혀졌다.
마우스 IgG 이소타입 분석용 키트 (세로테크(SEROTEC); #MMT1)를 사용하여 측정된 바, 모든 길항제 mAb의 이소타입은 IgG1 카파인 것으로 분석되었다 (데이터는 제시하지 않음).
D - 항- GPVI mAb 의 결합 특성
표면 플라즈몬 공명 (비아코어 2000(BIAcore 2000))에 의해 최종 스크리닝을 수행하여 GPVI 차단 항체의 결합 특성을 평가하였다. 본 분석에서, 본 발명자들은 인간 GPVI 단백질과, CM 칩에 공유적으로 연결된 항-Fc 항체에 고정된 항-인간 GPVI mAb와의 상호작용을 평가하였다. 문헌 [Canziani et al., 2004. Anal. Biochem. 325: 301-307]에 기술된 프로토콜을 사용하여 개별 mAb의 결합 동력학을 수행하였다.
모든 차단 mAb는 인간 GPVI에 대해 나노몰 (나노몰 이하) 범위의 친화도를 보였다 (표 1). 표적 친화도에 기초하여, 추가 개발을 위해 하이브리도마 클론 390으로부터의 항체를 선별하였다.
Figure pct00001
E - 영장류 GPVI 단백질과의 항- GPVI mAb 의 교차-반응성 특성
영장류 GPVI-Fc 단백질에 결합할 수 있는 그의 능력에 대해 표 1에 열거된 GPVI-특이 mAb를 ELISA에 의해 평가하였다. 플레이트를 영장류 GPVI-Fc 융합 단백질로 코팅하고, 항-hGPVI mAb를 플레이트에 첨가하고, 양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 토끼 항-마우스 IgG (시그마; #A9044)를 사용하여 검출하였다. TMB-H2O2 완충제를 첨가하여 항체 결합을 가시화하고, 450 nm 파장에서 판독하였다. 반-고체 배지 중에서 성장시켜 미리 선별된 하이브리도마를 클로닝시켰다. 페트리 플레이트에 125개의 세포/mL로 시딩하고, 유의한 성장을 보이는 클론을 GPVI 결합, GPVI 차단 활성 및 영장류 GPVI와의 교차 반응성에 대해 스크리닝하였다. 도 1b 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 모든 mAb는 영장류 GPVI와 교차 반응성을 보였다.
영장류 (마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis) 또는 시노몰구스) GPVI의 세포외 도메인에 대해 사용된 서열은 서열 27 및 서열 28로 기술되어 있다.
F - 항- GPVI mAb 의 중쇄 및 경쇄 서열 결정
하기와 같이 모노클로날 항체의 가변 도메인을 코딩하는 cDNA를 수득하였다: 퀴아젠(Qiagen)으로부터 입수한 올리고텍스(Oligotex) 키트를 사용하여 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 추출하였다. 진 레이서(Gene Racer) 키트 (인비트로젠), 55℃의 트랜스크립타제 슈퍼스크립트(Superscript) III (인비트로젠) 및 하기 표 2에 기술된 프라이머 (RACEMOG1 또는 CKFOR)를 사용하여 RACE 방법에 의해 RT-PCR을 수행함으로써 상응하는 cDNA를 증폭시켰다. 55℃의 폴리머라제 퓨전(Phusion) (핀자임즈(Finnzymes)), 및 하기 표 2에도 또한 기술된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 cDNA 단편을 증폭시켰다.
RT-PCR 및 PCR에 사용된 프라이머
프라이머 서열 번호
5'-진레이서 프라이머 서열 24
RACEMOG1: 3'-뮤린 힌지 뮤린 내부의 프라이머 서열 25
CKFOR: 3'-뮤린 Ck 뮤린 내부의 프라이머 서열 26
이. 콜라이(E. coli)에서 증폭시킨 pGEM-T 이지(Easy) 플라스미드 (프로메가(Promega)) 또는 pCR4-토포 플라스미드 (인비트로젠) 내로 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역을 코딩하는 증폭된 단편을 클로닝하였다. 이어서, 클로닝된 cDNA의 양쪽 스트랜드의 서열을 모두 분석하였다.
플라스미드 코딩 서열로부터 단백질 서열을 번역시키고, 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)의 질량을 계산하였다 (표 3). 수득한 값은 상응하는 하이브리도마의 배양물로부터 정제된 mAb 조제물로부터 수득한 질량 분광측정법 데이터와 완전히 일치하였다 (표 3 참조). 특히, 항-GPVI 항체 390의 중쇄의 가변 영역 중 N-글리코실화 부위 (NST)가 점유되어 있는 것이 확인되었다. HC 및 LC의 아미노산 서열은 하기와 같이 서열 목록에 기록되어 있다: 서열 5 및 서열 6은 클론 390으로부터의 항-GPVI mAb의 HC에 상응하고, 서열 7 및 서열 8은 항-GPVI mAb 클론 390으로부터의 LC에 상응한다.
하이브리도마로부터의 항-GPVI mAb에 관해 수행된 질량 분광측정법에 의한 분석
항-GPVI mAb 쇄 LC/MS에 의한 질량 (Da) 인 실리코 질량 값 (Da)
390
 LC 23,417 23,414
HC 51,127 49,586(G0)*
* 추가의 고만노스 N-글리칸과 상용성임. 질량 49,586 Da은 탈글리코실화 이후의 LC/MS 분석에 의해 확인된 것이다.
G - 항- GPVI mAb 의 CDR 서열 결정
카바트(KABAT) 명명법을 사용하여 단백질 서열로부터 CDR 영역의 서열을 도출해 내었다.
HC의 경우, CDR1은 서열 18에 상응하고, CDR2는 서열 19에 상응하고, CDR3은 서열 20에 상응한다.
LC의 경우, CDR1은 서열 21에 상응하고, CDR2는 서열 22에 상응하고, CDR3은 서열 23에 상응한다.
실시예 3: 항-GPVI mAb 및 그의 Fab 단편의 제조 및 생물물리학적 특성
A - 항- GPVI IgG 또는 그의 단백질 분해적 Fab 단편에 의한 재조합 GPVI 에의 콜라겐 결합의 억제
콜라겐으로 코팅된 384 웰 플레이트 (피어스)를 2 h 동안 3% BSA로 차단하였다. IgG 또는 피신 절단에 의해 생성된 그의 상응하는 Fab 단편의 농도를 증가시키면서 (0.3 - 20 ㎍/ml), 이를 재조합 GPVI (GPVI의 세포외 도메인의 Fc-융합 단백질; 3 ㎍/ml)와 함께 30 min 동안 인큐베이션하였다. GPVI-IgG 혼합물을 콜라겐으로 코팅된 플레이트에 첨가하고, RT에서 1 h 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 384 웰 플레이트를 5회에 걸쳐 세척하고 (DELFIA 세척 완충제, 퍼킨 엘머), Eu-표지된 항-인간 IgG (100 ng/ml 퍼킨 엘머)를 첨가하였다. 실온에서 1 h 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 다시 5회에 걸쳐 세척하고, 증강용 용액 (퍼킨 엘머)을 첨가하고, 10 min 동안 인큐베이션하였다. 테칸 울트라(Tecan Ultra) 판독기를 사용하여 360/612 nm에서 형광을 검출하였다. 도 3은 전형적인 판독값을 나타낸 것이다. 표 4는 2개의 독립된 실험으로부터 얻은 GPVI에의 콜라겐 결합 억제에 관한 IC50 계산치 (㎍/ml)를 나타내는 것이다.
2개의 독립된 실험으로부터 얻은 GPVI에의 콜라겐 결합 억제에 관한 IC50 계산치 (㎍/ml)
하이브리도마
클론 ID
 IgG Fab (피신 절단)
시험 1 시험 2 시험 1 시험 2
390 5.6 5.0 1.3 1.1
B - 재조합 Fab 단편 생산
1. 항- GPVI Fab 의 재조합 생산을 위한 발현 플라스미드 구축
각각 문헌 [Young L. and Dong Q. (Nucl. Acids Res. (2004), 32(7), e59)]에 기술된 바와 같은 중첩 연장 PCR (OE-PCR)의 변형된 프로토콜을 사용하거나, 유전자 합성법 (진아트(Geneart))에 의해 항-인간 GPVI 항체의 가변 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 뉴클레오티드 서열로 역번역시키고, 발생시켰다. 인비트로젠 TOPO 클로닝 키트를 사용하여 pCR 블런트 II TOPO 벡터 내로 PCR 생성물을 클로닝하고, M13 전방향 및 M13 역방향 프라이머를 사용하여 서열 분석하였다. 각각, 각자의 가변 중쇄를 IGHG1의 CH1 도메인 (진뱅크 수탁 번호 Q569F4)에 융합시키고, 가변 경쇄를 불변 카파 쇄 (IGKC, 진뱅크 수탁 번호 Q502W4)에 융합시켰다. 이들 단편을 NheI 및 HindIII으로 분해하고, 각각을 문헌 [Durocher et al. (2002), Nucl. Acids Res. 30(2), E9]에 기술된 pTT 벡터의 유사체인 에피솜 발현 벡터 pXL의 NheI/HindIII 부위로 결찰시켜 키메라 및 인간화된 항-GPVI Fab의 일시적 포유동물 발현을 위한 플라스미드를 생성하였다. 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 플라스미드를 이. 콜라이 NEB 10-베타 (DH10B 유도체)에서 증식시켰다. 퀴아젠 엔도프리 플라스미드 메가 키트(Qiagen EndoFree Plasmid Mega Kit)를 사용하여 이. 콜라이로부터 형질감염에 사용되는 플라스미드를 제조하였다.
2. 재조합 항- GPVI Fab 단편의 일시적 발현 및 정제
푸진(Fugene) (로슈(Roche)) 형질감염 시약을 사용하여 프리스타일 배지(Freestyle Medium) (인비트로젠)에서 성장한 Hek 293-FS 세포를 명시된 LC 및 HC 플라스미드로 형질감염시켰다. 7일 후, 원심분리하여 세포를 제거하고, 10% Vol/Vol 1 M 트리스(Tris) HCl (pH 8.0)을 첨가하고, 상청액을 0.22 ㎛ 필터상에 통과시켜 입자를 제거하였다. 카파셀렉트(KappaSelect) 매트릭스 (지이 헬쓰케어)를 사용하여 Fab 단백질을 포획시키고, pH 이동을 통해 용리시켰다. 단백질 함유 분획을 풀링하고, PD-10 또는 세파덱스(Sephadex) 칼럼을 사용하여 탈염시켰다. 농축되고 멸균 여과된 (0.22 ㎛) 단백질 용액을 1 mg/ml로 조정하고, 사용시까지 4℃에서 보관하였다.
C - 재조합 Fab 의 생물물리학적 특징화
비아코어 3000 (지이 헬쓰케어)에서의 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용하여, 정제된 항체 단편의 동력학적 특징을 상세히 규명하였다. 리간드로서 항-GPVI Fab를, 및 분석물로서 인간 GPVI를 사용하여 직접 결합 검정을 수행하였다. 전형적으로, 아민 반응성 커플링에 의해 500 RU의 항-GPVI Fab를 연구 등급의 CM5 칩 상에 고정화시켜 결합된 GPVI 분자에 대해 200 RU의 Rmax를 얻었다. 30 ㎕/min의 유량으로 전형적으로는 HBS-EP (10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20) 중 0.8 내지 208 nM 사이의 농도 범위에 걸쳐 결합 동력학을 측정하였다. 10 mM 글리신 (pH 2.0)을 사용하여 칩 표면을 재생시켰다. 동력학적 파라미터를 분석하고, Fab가 고정되어 있지 않은 유동 세포를 참조로서 사용하여 비아이밸류에이션(BIAevaluation) 프로그램 패키지 (버전 4.1)로 계산하였다. 물질 전달이 있는 1:1 결합 모델을 곡선 데이터의 전체 피트에 적용하였다.
글리코실화된 클론 390으로부터 유래된 바의 원래의 서열에 존재하는 추가의 글리코실화 모티프 (Fab 390-G)의 기능상의 결과를 조사하기 위해, 아미노산 치환에 의해 보존된 글리코실화 모티프를 제거하였다 (Fab 390-nG). 이러한 목적을 위해, 클론 390에 기초한 2개의 중쇄 단편을 구축하였다: 첫번째 것은 어떤 변형도 없는 것으로서 서열 9에 상응하고, 두번째 것은 서열 9의 60번 위치에 점돌연변이 N→Q를 가졌다.
글리코실화는 이종성이 매우 클 수 있고, 당단백질 이종성을 초래할 수 있는 것으로 알려져 있다: 가능한 한 상기와 같은 이종성의 근원은 피해야 한다.
본 경우, 하기 표 5에 제시된 바와 같이, 추가의 글리칸 제거는 GPVI에 대한 결합 친화도에 어떤 영향을 미치지 못했다. 따라서, 추가 실험을 위해 비-글리코실화된 Fab 390-nG 구축물을 선택하였다.
Figure pct00002
D - 항- GPVI Fab 와 GPVI 의 공-결정화 및 X선 결정화법에 의해 수행된, 항-GPVI mAb 에 의해 인식되는 에피토프 결정
에피토프의 특징화를 위해, 공-결정화 전략을 적용시켰다. (HEK293 세포에서 발현된) Fab 390-nG와 인간 당단백질 VI (인간 GPVI의 세포외 도메인 (Met1-Thr205), 곤충 세포 하이파이브에서 발현)를 동일 몰비로 인큐베이션시켜 두 단백질 사이의 복합체가 형성되도록 만들었다. 트립신으로 복합체를 분해하고, 겔 여과에 의해 다시 정제하고, 농축시키고, 결정화 스크리닝시켰다. 100 nl의 단백질 용액 (20 mM 트리스 (pH 8.0), 150 mM NaCl 중 6.5 mg/ml의 Fab-항원 복합체)과 0.1 M 비스트리스 (pH 5.5), 25% PEG3350 및 0.2 M 아세트산암모늄을 함유하는 100 nl의 저장액을 혼합하고, 밀봉된 좌적 증기 확산 결정화 플레이트 중에서 4℃에서 200 ㎕ 저장액에 대한 단백질 소적을 인큐베이션시켜 회절성이 큰 결정을 수득하였다. 동결보호를 위해 25% 에틸렌 글리콜로 보충된 저장액을 사용하여 액체 질소 중에서 하나의 결정을 급속 냉동시켰다. 유러피안 신크로트론 라디에이션 퍼실러티(European Synchrotron Radiation Facility: 프랑스 그레노블)에서 빔라인 ID14-4의 결정학적 데이터를 수집하였다. Fab 390-nG에 대한 모델로서 pdb-엔트리 1 FDL의 Fab 단편, 및 GPVI에 대한 모델로서 인간 혈소판 당단백질 VI, pdb-엔트리 2GI7의 결정 구조의 한 단량체를 사용하는 분자 치환법에 의해 구조를 해명하였다. 정밀 구조의 해상도 및 최종 R-인자는 1.72 Å, R-인자 17.2% 및 R-프리 19.9%였다. GPVI-결합 에피토프는 Fab 390-nG의, 하기 항원 hGPVI의 잔기와의 상호작용 (거리가 4.5 Å 미만인 것으로 정의된다)을 특징으로 하는 입체형태적 에피토프이다:
Pro4, Lys7, Glu40, Lys41, Leu42, Ser43, Ser44, Ser45, Arg46, Arg65, Arg67, Trp76, Leu78, Pro79, Ser80, Asp81, Gln82, Ser165, Arg166.
이들 잔기는 D1 도메인 (최대 아미노산 84까지)에 속하거나, 또는 D2 도메인의 일부 (아미노산 94 내지 176)를 구성하고, 따라서 이는 입체형태적 에피토프를 나타낸다. GPVI 에피토프 잔기에 대한 번호매김 체계는 도 16 및 서열 32에 제시된 바와 같이, 신호 서열이 제거된 단백질에 상응한다. 클론 390으로부터의 Fab 항-GPVI와 GPVI의 세포외 D1-D2 도메인 사이의 상호작용은 도 5에 도시되어 있다.
GPVI 에피토프 잔기와 접촉하는 항체 잔기는 하기 표 6 내지 표 11에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 바, "접촉 잔기"라는 것은 GPVI에 대한 항체와 GPVI 항원 사이의 결정 구조로 측정된 바, GPVI 항원 잔기까지의 거리 또는 그 반대의 경우의 거리가 4.5 Å 미만인 항체 잔기로 정의하였다. 거리는 소프트웨어 프로그램, 예를 들어, CCP4 소프트웨어 패키지의 NCONT를 사용하여 측정하였다.
X선 구조는 돌연변이될 수는 있지만, GPVI에의 결합에는 어떤 영향도 주지 않아야 하는 CDR로부터의 잔기를 강조하여 나타낸다.
하기 설명에서, CDR로부터의 잔기는 GPVI에의 결합은 파괴시키지 않으면서, 명시된 바와 같이 변형될 수 있다. 또한, CDR에서의 돌연변이가 GPVI에의 결합을 보존하는 CDR로부터의 잔기의 입체형태 및 배향에는 어떤 영향도 주지 않아야 한다는 것을 이해하여야 한다. 잔기 번호매김은 일련의 방식으로 순차적으로 이루어진 것이며, 문헌 [Al-Lazikani ((1997) J. Mol. Biol. 273, 927-948)]에서 사용된 것과 같은 카바트(Kabbat) 협약을 따르지는 않는다. "X"는 "임의의 잔기"를 나타내는 반면, "-"는 해당 위치에서는 어떤 변형도 일어나지 않아야 한다는 것을 나타내는 것이다.
서열 18로 정의된 CDRH1 서열은 10개 잔기 범위에 이른다. 하기 표 6에 제시된 바와 같이, CDRH1 잔기 10개 중 6개, 또는 60%가 GPVI와 접촉하지 않았다. 항체 잔기와 접촉하는 GPVI 잔기는 모두 세린 잔기였다.
Figure pct00003
CDRH2 서열은 서열 19로 정의되고, 16개의 항체 잔기 범위에 이른다. 하기 표 7에 제시된 바와 같이, CDRH2 잔기 16개 중 9개, 또는 56%가 GPVI와 접촉하지 않았다. 트립토판 52는 7개의 상이한 GPVI 항원 잔기와 접촉하는 것으로 밝혀졌다. GPVI의 아르기닌 46이 5개의 상이한 CDRH2 잔기와 접촉하는 것으로 밝혀졌다.
Figure pct00004
CDRH3 서열은 서열 20으로 정의되고, 5개의 항체 잔기 범위에 이른다. 사용되는 소프트웨어에 따라서 CDR 서열의 정의가 조금씩 차이가 있을 수 있다는 사실에 기초하여, CDRH3은 추가로 한 잔기를 포함할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, CDRH3은 6개의 항체 잔기 범위에 이르는 서열 38로도 정의될 수 있다. 하기 표 8에 제시된 바와 같이, CDRH3 잔기 6개 중 2개, 또는 33%가 GPVI와 접촉하지 않았다. 아르기닌 65가 3개의 상이한 GPVI 항원 잔기와 접촉하는 것으로 밝혀졌다. GPVI의 3개의 상이한 아르기닌 잔기가 CDRH3 잔기와 접촉하였다.
Figure pct00005
CDRL1 서열은 서열 21로 정의되고, 11개의 항체 잔기 범위에 이른다. 하기 표 9에 제시된 바와 같이, CDRL1 잔기 11개 중 7개, 또는 64%가 GPVI와 접촉하지 않았다. 티로신 32가 5개의 상이한 GPVI 항원 잔기와 접촉하는 것으로 밝혀졌다.
Figure pct00006
CDRL2 서열은 서열 22로 정의되고, 7개의 항체 잔기 범위에 이른다. 사용되는 소프트웨어에 따라서 CDR 서열의 정의가 조금씩 차이가 있을 수 있다는 사실에 기초하여, CDRL2는 추가로 한 잔기를 포함할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, CDRL2는 8개의 항체 잔기 범위에 이르는 서열 39로도 정의될 수 있다. 하기 표 10에 제시된 바와 같이, CDRL2 잔기 8개 중 6개, 또는 75%가 GPVI와 접촉하지 않았다. 상기 CDR은 GPVI의 D1 및 D2 도메인 둘 모두에 존재하는 잔기와 접촉하였다. 티로신 50은 D1 중의 asp 81 및 gln 82와 접촉하는 반면, 프롤린 56은 GPVI D2 도메인의 arg 166 및 ser 165와 접촉하였다.
Figure pct00007
CDRL3 서열은 서열 23으로 정의되고, 8개의 항체 잔기 범위에 이른다. 하기 표 11에 제시된 바와 같이, CDRL3 잔기 8개 중 5개, 또는 63%가 GPVI와 접촉하지 않았다.
Figure pct00008
항체 잔기와 상호작용하는 GPVI 잔기 간의 접촉에 관한 요약에 따르면, ser 43은 8개와 접촉하고, ser 44는 7개와 접촉하고, arg 46은 4개와 접촉하고, arg 67은 4개와 접촉하고, arg 65는 3개와 접촉하고, asp 81은 3개와 접촉하고, Arg 166은 2개와 접촉하는 것으로 밝혀졌다. 대부분의 GPVI 잔기는 경쇄 또는 중쇄 중 어느 하나를 선호하지만, R67 및 R166은 둘 모두와 접촉을 한다.
E - 항- GPVI Fab 의 Fv 도메인의 인간화
특허 출원 WO 2009/032661에 기술된 인간화 프로토콜을 사용하여 Fab 390-nG 클론을 인간화시켰다. 추가로, Fab 390-nG 및 인간 GPVI 사이의 결정학적 복합체에 관한 분석을 통해 인간화 캠페인하에 Fab 390-nG의 인간 GPVI에의 친화도를 개선시키기거나, 또는 적어도 그를 보유하도록 하는 목적으로 하는 수개의 돌연변이를 형성하였다.
Fab 390-nG의 VL & VH 서열을 단백질 데이터 뱅크 (PDB: Protein Data Bank, 2007년 8월판)에 대해서 블라스팅하였다. PDB 구조 1L7I를 사용하여 경쇄의 상동성 모델을 구축하였다. PDB 구조 1YY8 및 1ZA6, 둘 모두를 사용하여 중쇄의 상동성 모델을 구축하였다. 특이적으로 1ZA6 구조를 사용하여 CDR3 서브영역을 모델링하고, 중쇄의 나머지 부분에 대해서는 1YY8 구조를 사용하였다. 생성된 VL 및 VH 모델을 사용하여 가변 도메인의 상동성 모델을 구축한 후, 이어서 분자 오퍼레이팅 환경 (MOE: Molecular Operating Environment)에서 실행되는 표준 방법을 사용하여 에너지를 최소화시켰다. MOE는 케미컬 컴퓨팅 그룹(Chemical Computing group)이 배포한 컴퓨터 지원 약물 디자인용 소프트웨어이다. 이어서, T-세포 수용체와 상호작용할 수 있는 가능성이 좀 더 크고, 면역 반응의 활성화를 담당하는, 가요성이 가장 큰 잔기를 확인하기 위해, 최소화된 Fab 390-nG 모델에 대해 몰레큘러 다이나믹스(Molecular Dynamics) 시뮬레이션을 수행하였다. 시뮬레이션은 캘리포니아 대학이 배포한 앰버(AMBER) 소프트웨어를 사용하여 진행하였다. 최종적으로 57개의 아미노산이 Fab 390-nG에서 가요성인 것으로 확인되었다. 이어서, 20 ns (10 x 2 ns) 동안 가요성이 가장 큰 60개의 Fab 390-nG 아미노산 (CDR+5Å 영역 제외)의 움직임을 49개의 인간 배선 상동성 모델 중의 상응하는 가요성 아미노산 모델의 움직임과 비교하였는데, 이들 각각에 대해 10 x 2 ns MD 시뮬레이션을 진행하였다. 가장 일반적인 7개의 인간 배선 경쇄 (vκ1, vκ2, vκ3, vκ4, vλ1, vλ2, vλ3) 및 가장 일반적인 7개의 인간 배선 중쇄 (vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6)를 체계적으로 조합하여 49개의 인간 배선 모델을 구축하였다. Fab 390-nG 서열의 가요성 아미노산과 비교하였을 때, vκ1-vh6 인간 배선 서열은 그의 가요성 아미노산의 4D 유사도는 84%인 것으로 나타났는 바; 이에, vκ1-vh6 배선 서열을 사용하여 Fab 390-nG 서열을 인간화시켜 가요성 아미노산에 중점을 두었다. Fab 390-nG 및 vκ1-vh6 아미노산 간의 쌍별 아미노산 회합을 위해, 두 상응하는 상동성 모델의 알파 탄소의 최적의 3D 중첩에 기초하여 두 서열을 정렬하였다. 일부 경우에서 하기 모티프가 잠재적으로 문제가 되는 서열 모티프인 것으로 간주되었다: Asp-Pro (산에 불안정한 결합), Asn-X-Ser/Thr (글리코실화, X = Pro를 제외한 임의의 아미노산), Asp-Gly/Ser/Thr (가요성 구역에서의 숙신이미드/이소-asp 형성), Asn-Gly/His/Ser/Ala/Cys (탈아미드화 부위에 노출), Met (노출 구역에서의 산화). 생성된 조작된 서열을, 합리적인 추정이 이루어졌다는 확신을 제공하는 유니프로트KB(UniProtKB)/스위스-프로트(Swiss-Prot) 데이터베이스에 대한 서열 유사성에 대해서 블라스팅하였다. 추가로, 어떤 서열도 이뮨 에피토프 데이터베이스 및 애널리시스 리소스(Immune Epitope Database and Analysis Resource) (IEDB 데이터베이스)에 열거된 임의의 공지된 B- 또는 T-세포 에피토프를 함유하지 않았다.
중쇄의 경우, 5가지 버전 (Fab 390-nG VH1, VH2, VH3, VH4, VH5) 및 경쇄의 경우, 3가지 버전 (VL1, VL2, VL3)이 제안되었다. 버전들 모두 항-GPVI Fab 390-nG 구축물의 서열로부터 유래된 것이었다. 비-인간화된 Fab 390-nG에 대한 출발 서열은 VH의 경우, 서열 33이고, VL의 경우는 서열 34였다. L1 버전은 4개의 돌연변이를 포함하였다. L2 버전은 인간 GPVI에의 결합을 잠재적으로 개선시키는 추가의 한 돌연변이 (N93H)를 포함하였다. L3 버전은 L1로부터 유래된 것이며, 이는 인간 GPVI에의 결합을 잠재적으로 개선시키는 추가의 돌연변이 (N93L)를 포함하였다.
버전 H1은 앞서 기술된 방법에 따라 발견된 바, 가장 유사한 인간 중쇄 배선 서열인 VH6으로부터 유래된 5개의 인간화 돌연변이를 포함하였다. 버전 H2는 4개의 인간화 돌연변이를 포함하였고, H1로부터 유래된 것이면서 73번 위치의 아미노산 (Asn73)에서는 돌연변이화가 이루어지지 않았는데, 이는 Fab 390-nG와 인간 GPVI 간의 결정학적 복합체에서 관찰된 바, 강력한 친화도에 있어 중요한 것으로 밝혀진 바 있다. 버전 H3은 인간 중쇄 배선 서열 VH3으로부터 유래된 5개의 인간화 돌연변이를 포함하였다. VH3은 앞서 기술된 방법에 따라, Fab 390-nG의 VH 쇄와 유사하고, 73번 위치에는 아스파라긴 (Asn) 잔기를 포함하는 것으로 밝혀졌다. H4 버전은 H2로부터 유래된 것이며, 인간 GPVI에의 결합을 잠재적으로 개선시키는 추가의 한 돌연변이 (G31Y)를 포함하였다. H5 버전은 H2로부터 유래된 것이며, 인간 GPVI에의 결합을 잠재적으로 개선시키는 추가의 한 돌연변이 (Y103E)를 포함하였다.
조작된 항체 생성을 위해 VL 및 VH 변이체의 8가지 조합이 권장되었다: VL1과 VH1의 조합, VL1과 VH2의 조합, VL1과 VH3의 조합, VL2와 VH2의 조합, VL3과 VH2의 조합, VL1과 VH4의 조합, VL1과 VH5의 조합 및 VL3과 VH5의 조합. 하기 표 12 및 표 13에 제시된 바와 같이, 본 출원의 상세한 설명 섹션에 기재된 방법론을 사용하여 Fab 390-nG의 조작된 VL 및 VH 변이체 내에서 아미노산 변화를 일으켰다. 좌측의 칼럼은 뮤린 Fab 390-nG에서의 원래의 아미노산 및 그의 위치를 나타낸다.
가변 도메인을 조작하는 것 이외에도, 태그 또는 아미노산 연장부를 부가함으로써 항체 및 그의 단편을 추가로 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 6개 이상의 히스티딘 잔기로 구성된 서열, 특히, (His)6, 또는 (His)7, 또는 (His)8을 중쇄의 C-말단에 첨가할 수 있거나, 아미노산, 예를 들어, GlyGlyGlyGlySer 또는 (GlyGlyGlyGlySer)2 단위를 부가함으로써 말단의 서열을 연장시킬 수 있다. 유사하게, 항체 및 그의 단편의 프레임워크를 IgG1 백본으로부터 또 다른 IgG 백본, 예를 들어, IgG4로 변경할 수 있다.
Figure pct00009
Figure pct00010
F - 인간화된 변이체의 생물물리학적 특징화
비아코어 3000 (지이 헬쓰케어)에서의 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용하여 정제된 항체 단편의 동력학적 특징을 상세히 규명하였다. 고정화된 인간 GPVI를 사용하는 검정을 사용하였다. 전형적으로, 아민 반응성 커플링에 의해 300 RU의 GPVI를 연구 등급의 CM5 칩 상에 고정화시켜 결합된 항체 단편에 대해 200 RU의 Rmax를 얻었다. 30 ㎕/min의 유량으로 HBS-EP (10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20) 중 3.2 내지 112 nM 사이의 농도 범위에 걸쳐 결합 동력학을 측정하였다. 10 mM 글리신 (pH 2.0)을 사용하여 칩 표면을 재생시켰다. 동력학적 파라미터를 분석하고, GPVI가 고정되어 있지 않은 유동 세포를 참조로서 사용하여 비아이밸류에이션 프로그램 패키지 (버전 4.1)로 계산하였다. 물질 전달이 있는 1:1 결합 모델을 3-56 nM의 분석물 농도의 Fab 단편에 상응하는 곡선 데이터의 전체 피트에 적용하였다.
인간화 캠페인으로부터의 항-GPVI 항체 단편의 결합 동력학은 하기 표 14에 제시되어 있다. 본 실시예에서 데이터 측정에 사용된 비아코어 검정은 고정화된 결합 파트너에 있어 상이하며 (GPVI 대 mAb/Fab 단편), 이로써 표 5에 보고된 바와는 상이한 비아코어 친화도를 초래한다는 것에 주의한다.
Figure pct00011
실시예 4: 항- GPVI Fab 단편에 의한 콜라겐 결합 및 혈소판 응집의 억제. A. 재조합 항- GPVI Fab 단편에 의한 재조합 GPVI 의 콜라겐에의 결합 억제
콜라겐으로 코팅된 384 웰 플레이트 (피어스)를 2 h 동안 3% BSA로 차단하였다. 항-GPVI Fab 단편의 농도를 증가시키면서 (0.3 - 20 ㎍/ml), 이를 재조합 GPVI (GPVI의 세포외 도메인 및 인간 IgG의 Fc 부분의 융합 단백질; 3 ㎍/ml)와 함께 인큐베이션하였다. GPVI-Fab 혼합물을 콜라겐으로 코팅된 플레이트에 첨가하고, RT에서 1 h 동안 인큐베이션하였다. 384 웰 플레이트를 5회에 걸쳐 세척하고 (DELFIA 세척 완충제, 퍼킨 엘머), Eu-표지된 항-인간 IgG (100 ng/ml 퍼킨 엘머)를 첨가하였다. 실온에서 1 h 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 다시 5회에 걸쳐 세척하고, 증강용 용액 (퍼킨 엘머)을 첨가하고, 10 min 동안 인큐베이션하였다. 테칸 울트라 판독기를 사용하여 360/612 nm에서 형광을 검출하였다. 재조합적으로 생산된 항-GPVI Fab 단편이 GPVI 콜라겐 결합에 미치는 억제 효과에 관한 일례가 하기 표 15에 제시되어 있다.
Figure pct00012
B. 재조합 항- GPVI Fab 단편 (인간 혈소판 풍부 혈장)에 의한 콜라겐 유도성 혈소판 응집 억제
혈소판 풍부 혈장 (PRP)을 위해, ACD-A를 함유하는 시린지 내로 혈액을 최종 농도 10%로 수집하였다. 제동없이 실온에서 20 min 동안 200 x g로 원심분리한 후, 상청액 (PRP)을 분리하였다. 10 min 동안 1,500 x g로 원심분리하여 남은 혈액으로부터 혈소판 부족 혈장 (PPP)을 분리하였다. PPP로 희석시켜 PRP의 혈소판 계수가 3.0 x 108개의 세포/ml가 되도록 설정하였다. 최종 농도가 0.15 - 20 ㎍/ml인 Fab 단편을 사용하고, 이를 37℃에서 5 min 동안 PRP와 함께 인큐베이션하였다. 이후, 1-1.5 ㎍/ml 농도로 콜라겐을 첨가하고, 96-웰 플레이트 판독기 (96-웰 플레이트 응집)를 사용하거나, 또는 본(Born) 응집측정기 (고전적 응집)에 의해 광 투과를 측정함으로써 응집 반응을 모니터링하였다. 응집 반응을 20 min 동안 모니터링하였다. 하기 표 16에 제시된 바와 같이, 조사된 Fab 단편들은 모두 농도 의존적 방식으로 콜라겐 유도성 혈소판 응집을 억제시킬 수 있었다.
Figure pct00013
C. 항- GPVI Fab 단편에 의한 콜라겐 유도성 혈소판 응집 억제 (인간 전혈 )
본 실험을 위해, 20 ㎍/ml 히루딘을 사용하여 혈액을 항응고처리하고, 즉시 사용하였다. 측정하기 전, NaCl로 전혈을 1:1로 희석시켰다. Fab 단편은 최종 농도 0.15 - 20 ㎍/ml로 사용하고, 37℃에서 5 min 동안 혈액과 함께 인큐베이션하였다. 이후, 1 ㎍/ml 농도로 콜라겐을 첨가하고, 멀티플레이트(Multiplate)? 분석기를 사용하여 임피던스를 측정함으로써 응집 반응을 모니터링하였다. 반응을 6 min 동안 모니터링하였다. 제조업체의 설명서에 따라 응집 곡선하 면적 (AUC)에 의해 응집 반응을 정량하였다. 도 6에 제시된 바와 같이, 조사된 Fab 단편은 농도 의존적 방식으로 콜라겐 유도성 혈소판 응집을 억제시킬 수 있었다.
D. 항- GPVI Fab 단편에 의한 유동하 혈전 형성 억제
본 실험을 위해, 20 ㎍/ml 히루딘을 사용하여 혈액을 항응고처리하고, 즉시 사용하였다. 내경이 1 x 0.1 mm인 직사각형 모양의 모세관 유리 마이크로슬라이드 (캠랩(Camlab: 영국 캠브리지))를 100 ㎍/ml 홈(Horm) 콜라겐으로 밤새 코팅하고, 실온에서 1 h 동안 이를 열-불활성화된 0.5% 지방산 무함유 BSA로 차단하였다. 혈액 혈소판을 2 μM DiOC6(3)으로 형광 표지하고, 37℃에서 5 min 동안 Fab 단편으로 처리하였다. 콜라겐으로 코팅된 커버슬립을 통해 2,000s-1로 2분 동안 관류를 수행하였다. 혈액 관류 후, 같은 전단 속도로 5 min 동안 마이크로슬라이드를 통해 타이로드(Tyrode) 완충제 1을 관류시켰다. 혈소판 (혈전) 표면 범위를 측정함으로써 혈전 형성을 정량하였다. 이러한 목적을 위해, 모세관 중앙부의 상이한 구역으로부터 10개의 최종 형광 영상을 기록하였다. 추가로, 위상차 및 DIC 사진을 기록하였다. 영상 기록 및 분석은 흑백 CCD 카메라 (쿨스냅 cf(CoolSnap cf), 로퍼스 사이언티픽 게엠베하(Ropers Scientific GmbH)/포토메트릭스(Photometries: 오토브룬))에 연결된 이미지프로(ImagePro) 플러스 영상화 소프트웨어 (미디어시(Mediacy: 미국 실버 스프링))를 사용하여 수행하였다. 도 7A-E는 항-GPVI Fab 단편에 의한, 유동하 혈전 형성 억제에 관한 예를 나타낸다.
E. 동맥 혈전증을 앓는 마우스 모델에서 항- GPVI Fab 단편의 효과
본 생체내 연구를 위해, GPVI 수용체에 대해 인간화된 마우스를 사용하였다. 광화학적으로 경동맥 폐색을 유도하여 혈관 외벽에는 어떠한 영향도 주지 않으면서 혈관 내부에 혈관 내피 손상을 일으켰다. 이러한 기법에 의해, 적색 염료인 로즈 벤갈을 전신 투여하고, 녹색 레이저 광을 이용하여 경동맥의 내피에 조사함으로써 "내외 전도" 손상을 일으켰다. 항-GPVI Fab 단편을 경정맥 카테터를 통해 정맥내 볼루스로서 10 mg/kg으로 투여하였다. 15 min 동안의 인큐베이션 기간이 경과한 후, 유동 프로브로부터 원위부에 있는 경동맥에서부터 12 cm 떨어진 곳에 레이저 광원을 배치시키고, 레이저 조사를 개시하였다. 90 min의 관찰 기간 동안 혈류를 연속하여 모니터링하였다. 측정된 혈전증 파라미터는 혈관 손상 후 동맥이 완전히 폐색되는 데까지 걸리는 소요 기간 (폐색까지의 소요 기간, TTO) 및 혈류 곡선하 면적 (AUC)이었다.
혈전증 평가를 위해, 하기의 측정된 두 파라미터를 사용하였다: a) 폐색까지의 소요 기간 (TTO) 및 b) 혈류 곡선하 면적. 혈전성 유발에서부터 혈관 폐색까지의 소요 기간 (TTO)은 대조군의 경우에는 33 min인데 비해, 항-GPVI Fab 단편의 경우는 78 min인 바, 2.4배 증가를 산출하였다 (표 17). 상기 혈류 곡선하 면적은 대조군과 비교였을 때 항-GPVI Fab 단편 처리군에서 2.3배 증가하였다 (표 18). 10 mg/kg의 항-GPVI Fab 단편을 정맥내 볼루스 투여한 결과, 인간화된 GPVI 마우스에서 광화학적으로 유도된 동맥 혈전증 모델에서 유의한 항혈전 효과가 있었다.
Figure pct00014
Figure pct00015
F. 항- GPVI Fab 단편에 의해 유도되는 혈소판 표면으로부터의 GPVI 고갈
본 실험을 위해, 20 ㎍/ml 히루딘을 사용하여 혈액을 항응고처리하고, 즉시 사용하였다. 항-GPVI Fab 단편은 명시된 농도대로 사용하였다. 혈액 또는 혈소판 풍부 혈장 (PRP) 샘플을 Fab 단편과 함께 각각 5 min, 15 min, 1 h 및 2 h 동안 인큐베이션하였다. 이후, 파라포름알데히드를 사용하여 샘플을 고정시키고, GPVI 수용체 발현을 측정하였다. 형광 표지된 상이한 항-GPVI 항체를 사용하여 혈소판 표면 상의 GPVI 밀도를 측정하고, 유동 세포측정기 (BD LSR II)에서 측정하였다. 대조군으로서, 앞서 이러한 항체는 조사되는 Fab 단편과는 독립적으로 (및 그의 존재하에서) GPVI에 결합할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
도 8에 제시된 바와 같이, 항-GPVI Fab는 농도 의존적 방식으로 GPVI 표면 발현을 감소시켰다. 10 ㎍/ml 및 2 ㎍/ml의 항-GPVI Fab를 5 min 동안 노출시켰을 때 이미 유의한 GPVI 고갈이 유발되었다는 것이 추가 실험을 통해 나타났다 (도 9). 또한, 보다 저농도의 항-GPVI Fab는, 비록 시간 과정에 지연이 있기는 하지만, GPVI 표면 밀도를 감소시킬 수 있었다.
이러한 결과는 항-GPVI Fab가 혈소판 표면에서의 GPVI 고갈을 유도한다는 사실을 지지한다.
G. 동시 혈액학적 성질 평가를 이용한, 시노몰구스 원숭이 (마카카 파스시쿨라리스)에서 항-GPVI Fab가 콜라겐 유도성 전혈 응집에 미치는 시험관내 및 생체외 효과.
1. 동물에 대한 상세한 설명 및 용량 요법 :
수의청에 등록되어 있고, 지역 동물 복지 규제에 따라 AAALAC (실험 동물 관리 평가 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care))-인가받은 시설에서 동물 연구를 수행하였다. 본 연구에서 사용된 종/계통은 시노몰구스 원숭이 (마카카 파스시쿨라리스)였다. 본 연구에서는 오직 암컷 원숭이만을 사용하였다. 각 용량군당 동물 2마리씩 연구하였다. 연구 용량은 포스페이트 완충 염수 (PBS) 비히클 대조군, 0.01, 0.1, 1, 및 3 mg/kg의 항-GPVI Fab를 포함하였으며, 이들 모두 2 ml/kg IV 볼루스로 투여되었다. 포함된 원숭이의 체중 범위는 3.52 내지 7.34 kg 사이였다. 1 mg/kg 용량군에 사용된 동물들 중 하나 (원숭이 D)는 투여 이전 샘플에서는 어떤 혈소판 응집 반응도 나타내지 않았다. 따라서, 시간 경과에 따른 개체내의 응집 반응의 상대적인 변화 (투여 이전과의 비교에 따른 응집 감소율(%))의 계산은 불가능하였는 바, 데이터는 제공하지 않는다.
2. 혈액학적 성질 및 혈장 제조를 위한 혈액 샘플링 및 프로세싱
약물 또는 비히클 투여 이전 및 이후 (투여 이전, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72, 149.5시간)의 다양한 시간 간격에서, 바늘 천공 후 건강하고 의식이 있는 단일 사육된 시노몰구스 원숭이의 전주 정맥으로부터 전혈을 혈액 샘플링 후 3.13% 시트르산나트륨을 함유하는 튜브 (에이펠판고(Eifelfango: 독일 바트 노이에나 아바일러)) 내로 튜브 총 부피의 1/10로 수집하였다. PBS 비히클 처리군의 경우, 샘플링 스케줄에는 약간의 차이가 있었고, 하기 시점에 샘플링하였다: 투여 이전, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 126시간. 혈소판 계수에 특히 중점을 두고 전혈 세포 계수를 측정하여 자동 혈액학적 분석기 실 베트 abc(Scil Vet abc) (실 애니멀 케어 컴퍼니 게엠베하(Scil animal care Company GmbH: 독일 비엔하임)를 사용하여 혈액학상의 생리학적 상태를 모니터링하였다. 각 시점에 전혈 응집 검정 후 남은 혈액 샘플을 혈장 제조를 위해 원심분리하였다. 혈장 제조를 위해 혈액을 15 min 동안 5,000 U/min으로 원심분리하고, 상청액을 별도의 튜브에 수집하고, 추후 시점에 항-GPVI Fab의 혈장 수준 분석을 위해 -20℃에서 냉동시켰다.
3. 전혈 혈소판 응집 측정
멀티플레이트? 혈소판 기능 분석기 (다이나바이트 인포르마티온쉬스테메 게엠베하(Dynabyte Informationssysteme GmbH: 독일 뮌헨)를 사용하여 전혈 혈소판 응집 검정을 수행하였다. 사용된 효능제는 최종 농도 1 ㎍/ml의 말 I형 콜라겐 (홈 콜라겐, 나미코메드(Nycomed: 독일 뮌헨))이었다. 제조사의 설명서에 따라 분석을 수행하고, 전혈 응집의 억제율(%)은 투여 이전의 각각의 개별 전혈 응집 반응에 상대적인 값으로 계산되었다. 간단히 기술하면, 카트리지에 297 ㎕의 CaCl2를 사전에 미리 로딩시키고, 297 ㎕의 전혈을 첨가하였다. 5분 동안 평형화시킨 후, 6 ㎕의 효능제 콜라겐을 100배 농도로 첨가하고, 측정을 시작하였다. 7 min 동안 기록하고, 시간 경과 (min)에 따라 곡선하 면적 (AUC, 임의 단위)으로 결과를 표시하였다. 시간 경과에 따른, 투여 이전 값과의 비교에 의한 AUC의 상대적인 변화는 혈소판 응집 억제율(%)로 계산하였고, 그래프로 플롯팅시켰다.
동일한 집단 중 다른 원숭이로부터 유래된 별도의 혈액 샘플 세트를 사용하여 시험관내 용량-반응 측정을 수행함으로써 항-GPVI Fab에 대한 시험관내 IC50을 측정하였다. 이에, 혈액 샘플을 생체외 측정에 대해 상기 기술된 것과 동일한 방식으로 처리하였다. 간략하면, 상이한 농도의 항-GPVI Fab (30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01 ㎍/ml)를 멀티플레이트? 분석기의 테스트 셀 중 CaCl2/전혈 혼합물에 첨가하고, 5분 동안 인큐베이션하였다. 효능제 콜라겐을 1 ㎍/ml로 첨가한 후, 측정을 개시하고, 7 min 동안 AUC를 기록하였다. 각 용량-반응을 플롯팅함으로써 인하우스 통계 소프트웨어 도구 (스피드(Speed) 2.0 LTS)를 사용하여 IC50을 계산하였다.
4. GPVI 수용체 표면 발현 측정
약물 또는 비히클 투여 이전 및 이후의 다양한 시간 간격에서, 바늘 천공 후 건강하고 의식이 있는 단일 사육된 시노몰구스 원숭이의 전주 정맥으로부터 전혈을 혈액 샘플링 후 3.13% 시트르산나트륨을 함유하는 튜브 내로 튜브 총 부피의 1/10로 수집하고, 즉시 사용하였다. 5% 파라포름알데히드를 사용하여 샘플을 고정시키고, GPVI 수용체 발현을 측정하였다. 형광 표지된 상이한 항-GPVI 항체를 사용하여 혈소판 표면 상의 GPVI 밀도를 측정하고, 유동 세포측정기에서 측정하였다. 대조군으로서, 앞서 이러한 항체는 조사되는 Fab 단편과는 독립적으로 (및 그의 존재하에서) GPVI에 결합할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
5. 전혈 혈소판 응집에 대한 결과
각각의 용량 요법을 비교하기 위해, 각 개별 동물에서의 투여 이전 값에 대해 상대적인 전혈 혈소판 응집 억제율(%)을 계산하였다. PBS 비히클군은 IV 볼루스 투여 후 6시간째에 혈소판 응집을 최대 67%까지 억제시키는 것으로 드러났다 (데이터는 제시하지 않음). 따라서, 적어도 2번에 걸쳐 연속되는 시점에서 혈소판 응집이 적어도 80% 억제된 것을 생리학상 관련이 있는 것으로 간주하였다. 2가지 저용량의 항-GPVI Fab (0.01 및 0.1 mg/kg 항-GPVI Fab)를 시험하였을 때, 이 둘 모두는 전혈 응집에 있어 어떤 관련된 억제도 보이지 않았다. 1 mg/kg에서는 투여 후 1시간째에 이미 93% 혈소판 억제에 도달하였고, 최대 24시간째까지 80% 초과에 머물렀다 (도 10a에서 2 h째에 효과가 약간 감소한 것은 제외). 이어서, 혈소판 억제 기능은 시간이 경과함에 따라 감소하였다. 3 mg/kg에서 혈소판 응집 억제는 처음 24시간의 관찰 기간 동안 80% 초과의 값으로 안정적이었고, 69% 내지 77% 사이의 값으로 72시간째까지 지속되었다 (도 10b). 시험된 고용량군 모두에서, 혈소판 기능은 전반적으로 최종 시점에서 회복되었다 (149.5 hrs, 도 10a 및 b). 이러한 데이터에 기초하여, IV 볼루스 투여 후 0.5시간째의 ED50을 추정하였고, 이는 시험된 항-GPVI Fab에 대해 0.5 mg/kg인 것으로 드러났다.
본 실험을 통해, 항-GPVI Fab는 콜라겐 (1 ㎍/ml)을 사용하여 비히클과 비교하였을 때, 용량 의존적 방식으로 생체외 전혈 혈소판 응집을 억제시킨다는 것이 입증되었다.
별도의 실험 세트에서, 항-GPVI Fab의 시험관내 활성을 측정하였다. 계산된 IC50은 0.81 ㎍/ml [0.51; 1.28 ㎍/ml] CV=21.6%인 것으로 드러났다 (도 11).
6. 혈액학적 성질 평가
실험 시간이 경과되는 동안 혈액학상의 생리학적 상태를 모니터링하기 위해, 특히 혈소판 계수에 중점을 두고 전혈 세포 계수를 측정하였다. 투여 이전의 평균 혈소판 계수는 PBS 비히클 중에서 428 x 103/㎕, 0.01 mg/kg 항-GPVI Fab에서 369 x 103/㎕, 0.1 mg/kg 항-GPVI Fab에서 235 x 103/㎕, 1 mg/kg 항-GPVI Fab에서 357 x 103/㎕, 및 3 mg/kg 항-GPVI Fab에서 312 x 103/㎕였다 (도 12 a-e). 실험 과정이 진행되는 동안, 실질적으로 혈소판 계수에는 변함이 없었고 (즉, 100 x 103/㎕ 미만의 값), PBS 비히클군에서 126시간째에 하기 혈소판 계수가 측정되었다: 358 x 103/㎕ (도 12 a). 모든 항-GPVI Fab 처리군에서, 149.5시간째에 측정된 혈소판 계수는 하기 값인 것으로 드러났다: 0.01 mg/kg 항-GPVI Fab에서 411 x 103/㎕, 0.1 mg/kg 항-GPVI Fab에서 329 x 103/㎕, 1 mg/kg 항-GPVI Fab에서 321 x 103/㎕, 및 3 mg/kg 항-GPVI Fab에서 320 x 103/㎕ (도 12 b-e). 실험 과정이 진행되는 동안, 측정된 다른 모든 혈액학적 파라미터, 적혈구 용적률, 적혈구 계수, 및 헤모글로빈에는 실질적으로 변함이 없었다 (데이터는 제시하지 않음).
이러한 데이터는 GPVI Fab가 혈액학상의 생리학적 상태에는 어떠한 영향도 미치지 않는다는 것을 입증한다.
7. GPVI 수용체 발현
도 13에 제시된 바와 같이, 항-GPVI Fab의 iv 투여 이전에는 모든 혈소판이 GPVI 발현에 대해 양성이었다 (투여 이전). 약물 투여 후 채취된 혈액에서는 혈소판 표면 상에서 GPVI에 대한 어떤 특이적인 신호도 관찰할 수 없었다 (24 h). 약물 투여 후 48 h째를 시작으로, 새로운 혈소판 군집이 발생하기 시작하였으며, 이는 GPVI 양성을 띠었다. 약물 투여 후 150 h째, 혈소판 모두 GPVI 수용체 발현에 대해 다시 양성을 띠었다.
본 실험을 통해 GPVI-Fab가 혈소판 상의 GPVI 수용체 고갈을 유도하고, 이러한 효과는 가역적이었다는 것을 확인하였다.
실시예 5: 자가항체에 의한 인식에 의해 이루어지는 Fab 단편 특성 변형
A - 공여 혈장 중 활성적 성분 측정
항-GPVI Fab의 활성적 효과에 있어 혈장 중에 존재하는 IgG의 중요도를 조사하기 위해 51개의 상이한 혈액 샘플을 시험하였다. 단백질 A를 사용하여 활성적인 것으로 확인된 샘플에서 IgG를 고갈시켰다.
본 실험을 위해, 20 ㎍/ml 히루딘을 사용하여 혈액을 항응고처리하고, 혈장 제조 (혈액 샘플을 10 min 동안 1,600 g로 원심분리)에 즉시 사용하였다. 이후, 단백질 A를 사용하여 4℃에서 2 h 동안 혈장에서 IgG를 고갈시켰다. 원심분리에 의해 단백질 A를 제거하고, 혈소판을 최종 농도 2 x 10E8/ml로 첨가하였다. 항-GPVI - Fab 단편을 20 ㎍/ml로 사용하였다. 혈장 샘플을 Fab 단편 또는 콘불신 (또는 "cvx," GPVI 특이적 효능제)과 함께 15 min 동안 인큐베이션한 후, (활성화된 GPIIbIIIa에 대해 특이적인 것으로서, 혈소판 활성화 마커인) FITC 표지된 Pac-1 항체로 30 min 동안 염색하였다. 이후, 샘플을 파라포름알데히드르를 사용하여 고정시키고, 혈소판의 Pac-1 표지를 유동 세포측정기 (BD LSR II)에서 측정하였다.
도 14에서 알 수 있는 바와 같이, 대조군 패널에 있어 단백질 A로 혈장을 처리하여도 GPVI 특이적 효능제 콘불신 (cvx)에 의한 혈소판 활성화에는 어떤 영향도 없었다. 그러나, 도 14, 패널 A에서는 IgG 고갈 후 Fab의 활성적 효과가 현저히 감소한 것으로 나타났으며, 이는 사전 형성된 IgG가 이러한 반응에 있어 필수적 성분이라는 것을 제안한다.
B - 변형된 항- GPVI Fab 단편 노출기에 따른 혈소판 활성화 마커의 발현 측정
Fab를 통한 혈소판 활성화의 활성화에 대한 혈장 IgG의 역할을 추가로 조사하기 위해, 그의 중쇄 및 경쇄 (HC 및 LC) 서열은 동일하지만, 중쇄 상의 그의 C-말단 변형에 있어서는 차이를 보이는 상이한 Fab 단편을 사용하였다.
사용된 4가지 상이한 분자는 하기에 기술되어 있고, 도 15에 도시되어 있다.
Fab: HC 상에 어떤 추가의 C-말단 아미노산도 포함하지 않는 대조군 분자 (도 15a).
Fab-His-태그: HC 상에, 천연 발생 서열 + C-말단 His-태그에 상응하는 HisHisHisHisHis 펩티드 서열 (서열 35)을 가진다 (도 15b).
Fab-Gly4Ser: HC 상에, 천연 발생 서열 + C-말단 Gly4Ser-태그에 상응하는 GlyGlyGlyGlySer 펩티드 서열 (서열 36)을 가진다 (도 15c).
Fab-(Gly4Ser)2: HC 상에, 천연 발생 서열 + C-말단 (Gly4Ser)2-태그에 상응하는 GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer 펩티드 서열 (서열 36)을 가진다 (도 15c).
도 14, 패널 B에 도시된 바와 같이, 변형된 Fab는 심지어 IgG 고갈이 없는 경우에도 어떤 활성적 효과도 유도하지 못했으며, 이는 변형된 Fab는 사전에 형성된 IgG에 의해서는 인식되지 못한다는 것을 시사한다.
본 실험을 위해, 20 ㎍/ml 히루딘을 사용하여 혈액을 항응고처리하고, 즉시 사용하였다. 항-GPVI Fab 단편을 20 ㎍/ml로 사용하였다. 혈액 샘플 (1-51)을 Fab 단편과 함께 15 min 동안 인큐베이션한 후, (활성화된 GPIIbIIIa에 대해 특이적인 것으로서, 혈소판 활성화 마커인) FITC 표지된 Pac-1 항체로 30 min 동안 염색하였다. 이후, 샘플을 파라포름알데히드르를 사용하여 고정시키고, 혈소판의 Pac-1 표지를 유동 세포측정기 (BD LSR II)에서 측정하였다.
51개의 상이한 혈액 샘플에 대해 4가지 Fab 포맷의 활성적 잠재능을 시험하였다. 어떤 오버행도 없는 Fab는 Pac-1 결합에 있어 유의한 증가를 유도하였다 (23개의 샘플 중 5배 초과인 것으로 정의된다 (이는 42%에 상응한다)). 극명하게 대조적으로, 하기 표 19에서 알 수 있는 바와 같이, Fab-His-태그 및 Fab-Gly4Ser은 오직 1 샘플에 대해서만 활성을 보인 반면, HC의 C-말단에서 변형된 Fab는 상기 시험에서 훨씬 더 작은 활성을 나타내었고, Fab-(Gly4Ser)2 (가장 긴 C-말단 연장부)는 역치보다 큰 활성을 띠지는 않았다. 이러한 차별화된 활성적 패턴은 또한 활성화가 최소로 이루어진 경우에도 반영된다 (기준에 비해 2-5배). 이러한 결과는, 상기 검정에서 Fab 단편의 활성적 잠재능이 항원 결합 CDR 서열에 의해서는 측정 불가능하지만, HC 쇄의 C-말단 변형에 의해 활성이 현저히 감소하였는 바, 상기 잠재능은 HC C-말단에 존재한다는 것을 시사한다. 따라서, 이러한 결과는 Fab의 C-말단 단부가 환자의 혈액 중에 이미 존재하고 있는 IgG에 의해 인식되었고, 이것이 혈소판 활성화를 유도한다는 것을 제안한다.
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
SEQUENCE LISTING <110> SANOFI-AVENTIS <120> Novel antagonist antibodies and their Fab fragments against GPVI and uses thereof <130> FR2009-113-PCT <160> 39 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1337 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1329) <400> 1 atg tct cca tcc ccg acc gcc ctc ttc tgt ctt ggg ctg tgt ctg ggg 48 Met Ser Pro Ser Pro Thr Ala Leu Phe Cys Leu Gly Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 cgt gtg cca gcg cag agt gga ccg ctc ccc aag ccc tcc ctc cag gct 96 Arg Val Pro Ala Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala 20 25 30 ctg ccc agc tcc ctg gtg ccc ctg gag aag cca gtg acc ctc cgg tgc 144 Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys 35 40 45 cag gga cct ccg ggc gtg gac ctg tac cgc ctg gag aag ctg agt tcc 192 Gln Gly Pro Pro Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser 50 55 60 agc agg tac cag gat cag gca gtc ctc ttc atc ccg gcc atg aag aga 240 Ser Arg Tyr Gln Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg 65 70 75 80 agt ctg gct gga cgc tac cgc tgc tcc tac cag aac gga agc ctc tgg 288 Ser Leu Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp 85 90 95 tcc ctg ccc agc gac cag ctg gag ctc gtt gcc acg gga gtt ttt gcc 336 Ser Leu Pro Ser Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala 100 105 110 aaa ccc tcg ctc tca gcc cag ccc ggc ccg gcg gtg tcg tca gga ggg 384 Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 gac gta acc cta cag tgt cag act cgg tat ggc ttt gac caa ttt gct 432 Asp Val Thr Leu Gln Cys Gln Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala 130 135 140 ctg tac aag gaa ggg gac cct gcg ccc tac aag aat ccc gag aga tgg 480 Leu Tyr Lys Glu Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp 145 150 155 160 tac cgg gct agt ttc ccc atc atc acg gtg acc gcc gcc cac agc gga 528 Tyr Arg Ala Ser Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly 165 170 175 acc tac cga tgc tac agc ttc tcc agc agg gac cca tac ctg tgg tcg 576 Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Phe Ser Ser Arg Asp Pro Tyr Leu Trp Ser 180 185 190 gcc ccc agc 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cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 960 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 1008 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag 1056 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 340 345 350 ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 1104 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag ggc aat ggg cag ccg gag aac 1152 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Gly Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 1200 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 1248 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 1296 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga gcggccgc 1337 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 2 <211> 442 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Pro Ser Pro Thr Ala Leu Phe Cys Leu Gly Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 Arg Val Pro Ala Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala 20 25 30 Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys 35 40 45 Gln Gly Pro Pro Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser 50 55 60 Ser Arg Tyr Gln Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg 65 70 75 80 Ser Leu Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp 85 90 95 Ser Leu Pro Ser Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala 100 105 110 Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Asp Val Thr Leu Gln Cys Gln Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala 130 135 140 Leu Tyr Lys Glu Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp 145 150 155 160 Tyr Arg Ala Ser Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly 165 170 175 Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Phe Ser Ser Arg Asp Pro Tyr Leu Trp Ser 180 185 190 Ala Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Thr Asp Pro Ile 195 200 205 Pro Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 340 345 350 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Gly Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 3 <211> 679 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(672) <400> 3 atg tct cca tcc ccg acc gcc ctc ttc tgt ctt ggg ctg tgt ctg ggg 48 Met Ser Pro Ser Pro Thr Ala Leu Phe Cys Leu Gly Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 cgt gtg cca gcg cag agt gga ccg ctc ccc aag ccc tcc ctc cag gct 96 Arg Val Pro Ala Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala 20 25 30 ctg ccc agc tcc ctg gtg ccc ctg gag aag cca gtg acc ctc cgg tgc 144 Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys 35 40 45 cag gga cct ccg ggc gtg gac ctg tac cgc ctg gag aag ctg agt tcc 192 Gln Gly Pro Pro Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser 50 55 60 agc agg tac cag gat cag gca gtc ctc ttc atc ccg gcc atg aag aga 240 Ser Arg Tyr Gln Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg 65 70 75 80 agt ctg gct gga cgc tac cgc tgc tcc tac cag aac gga agc ctc tgg 288 Ser Leu Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp 85 90 95 tcc ctg ccc agc gac cag ctg gag ctc gtt gcc acg gga gtt ttt gcc 336 Ser Leu Pro Ser Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala 100 105 110 aaa ccc tcg ctc tca gcc cag ccc ggc ccg gcg gtg tcg tca gga ggg 384 Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 gac gta acc cta cag tgt cag act cgg tat ggc ttt gac caa ttt gct 432 Asp Val Thr Leu Gln Cys Gln Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala 130 135 140 ctg tac aag gaa ggg gac cct gcg ccc tac aag aat ccc gag aga tgg 480 Leu Tyr Lys Glu Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp 145 150 155 160 tac cgg gct agt ttc ccc atc atc acg gtg acc gcc 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Gln Asn Gly Ser Leu Trp 85 90 95 Ser Leu Pro Ser Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala 100 105 110 Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Asp Val Thr Leu Gln Cys Gln Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala 130 135 140 Leu Tyr Lys Glu Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp 145 150 155 160 Tyr Arg Ala Ser Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly 165 170 175 Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Phe Ser Ser Arg Asp Pro Tyr Leu Trp Ser 180 185 190 Ala Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Thr Glu Asn Leu 195 200 205 Tyr Phe Gln Gly Lys Asp His His His His His His His Gly Asp 210 215 220 <210> 5 <211> 1374 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(1374) <400> 5 atg gct gtc ctg gca tta ctc ttc tgc ctg gta aca ttc cca agc tgt 48 Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys 1 5 10 15 atc ctt tcc cag gtg cag ctg aag gag tca gga cct ggc ctg gtg gcg 96 Ile Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala 20 25 30 ccc tca cag agc ctg tcc atc aca tgc acc gtc tca ggg ttc tca tta 144 Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 acc ggc tat ggt gta aac tgg gtt cgc cag cct cca gga aag ggt ctg 192 Thr Gly Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 gag tgg ctg gga atg ata tgg ggt gat gga agc aca gac tat aat tca 240 Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser 65 70 75 80 act ctc aaa tcc aga ctg agc atc agc aag gac aac tcc aag agc caa 288 Thr Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln 85 90 95 gtt ttc tta aaa atg aac agt ctg caa act gat gac aca gcc agg tac 336 Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr 100 105 110 tac tgt gcc aga gat ctt cct atg gac tac tgg ggt caa gga acc tca 384 Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 115 120 125 gtc acc gtc tcc tca gcc aaa acg aca ccc cca tct gtc tat cca ctg 432 Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu 130 135 140 gcc cct gga tct gct gcc caa act aac tcc atg gtg acc ctg gga tgc 480 Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys 145 150 155 160 ctg gtc aag ggc tat ttc cct gag cca gtg aca gtg acc tgg aac tct 528 Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser 165 170 175 gga tcc ctg tcc agc ggt gtg cac acc ttc cca gct gtc ctg cag tct 576 Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 180 185 190 gac ctc tac act ctg agc agc tca gtg act gtc ccc tcc agc acc tgg 624 Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp 195 200 205 ccc agc gag acc gtc acc tgc aac gtt gcc cac ccg gcc agc agc acc 672 Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr 210 215 220 aag gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat tgt ggt tgt aag cct tgc 720 Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys 225 230 235 240 ata tgt aca gtc cca gaa gta tca tct gtc ttc atc ttc ccc cca aag 768 Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 245 250 255 ccc aag gat gtg ctc acc att act ctg act cct aag gtc acg tgt gtt 816 Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val 260 265 270 gtg gta gac atc agc aag gat gat ccc gag gtc cag ttc agc tgg ttt 864 Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe 275 280 285 gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag acg caa ccc cgg gag gag 912 Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu 290 295 300 cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctt ccc atc atg cac 960 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His 305 310 315 320 cag gac tgg ctc aat ggc aag gag ttc aaa tgc agg gtc aac agt gca 1008 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala 325 330 335 gct ttc cct gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa acc aaa ggc aga 1056 Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg 340 345 350 ccg aag gct cca cag gtg tac acc att cca cct ccc aag gag cag atg 1104 Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met 355 360 365 gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg ata aca gac ttc ttc cct 1152 Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro 370 375 380 gaa gac att act gtg gag tgg cag tgg aat ggg cag cca gcg gag aac 1200 Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn 385 390 395 400 tac aag aac act cag ccc atc atg gac aca gat ggc tct tac ttc gtc 1248 Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val 405 410 415 tac agc aag ctc aat gtg cag aag agc aac tgg gag gca gga aat act 1296 Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr 420 425 430 ttc acc tgc tct gtg tta cat gag ggc ctg cac aac cac cat act gag 1344 Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu 435 440 445 aag agc ctc tcc cac tct cct ggt aag tga 1374 Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 6 <211> 457 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys 1 5 10 15 Ile Leu 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Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu 435 440 445 Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 7 <211> 702 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(702) <400> 7 atg aga ccg tct att cag ttc ctg ggg ctc ttg ttg ttc tgg ctt cat 48 Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 1 5 10 15 ggt gct cag tgt gac atc cag atg aca cag tct cca tcc tca ctg tct 96 Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 gca tct ctg gga ggc aaa gtc acc atc act tgt aag gca agc caa gac 144 Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 att aac aag tat att gct tgg tac caa cac aag cct gga aaa ggt cct 192 Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro 50 55 60 agc ctg ctc ata cat tac aca tct act tta cag cca ggc atc cca tca 240 Ser Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 agg ttc agt gga agt ggg tct ggg aga gat tat tcc ttc agc atc agc 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser 85 90 95 aac ctg gag cct gaa gat att gca act tat tat tgt cta cag tat gct 336 Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala 100 105 110 aat ctt ctg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gag atc aaa cgg gct 384 Asn Leu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 115 120 125 gat gct gca cca act gta tcc atc ttc cca cca tcc agt gag cag tta 432 Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu 130 135 140 aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg aac aac ttc tac ccc 480 Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 aaa gac atc aat gtc aag tgg aag att gat ggc agt gaa cga caa aat 528 Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn 165 170 175 ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac agc aaa gac agc acc tac 576 Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 agc atg agc agc acc ctc acg ttg acc aag gac gag tat gaa cga cat 624 Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr 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<210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Leu Gln Tyr Ala Asn Leu Leu Thr 1 5 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 5'-GeneRacer <400> 24 cgactggagc acgaggacac tga 23 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer RACEMOG1-3' <400> 25 tatgcaaggc ttacaaccac a 21 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer CKFOR-3' <400> 26 ctcattcctg ttgaagctct tgac 24 <210> 27 <211> 615 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <220> <221> CDS <222> (1)..(615) <400> 27 atg tct cca tcc ccg acc gcc ctc ttc tgt ctt ggg ctg tgt ctg ggg 48 Met Ser Pro Ser Pro Thr Ala Leu Phe Cys Leu Gly Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 cgt gtg cca gcg cag agt gga ccg ctc ccc aag ccc tcc ctc cag gct 96 Arg Val Pro Ala Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala 20 25 30 ctg ccc agc tcc ctg gtg ccc ctg gag aag cca gtg acc ctc cgg tgc 144 Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys 35 40 45 cag gga cct ccg ggc gtg gac ctg tac cgc ctg gag aag ctg agt tcc 192 Gln Gly Pro Pro Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser 50 55 60 agc agg tac cag gat cag gca gtc ctc ttc atc ccg gcc atg aag aga 240 Ser Arg Tyr Gln Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg 65 70 75 80 agt ctg gct gga cgc tac cgc tgc tcc tac cag aac gga agc ctc tgg 288 Ser Leu Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp 85 90 95 tcc ccg ccc agc gac cag ctg gag ctc gtt gcc acg gga gtt ttt gcc 336 Ser Pro Pro Ser Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala 100 105 110 aaa ccc tcg ctc tca gcc cag ccc ggc ccg gcg gtg tcg tca gga ggg 384 Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 gac gta acc cta cag tgt cag act cgg tat ggc ttt gac caa ttt gct 432 Asp Val Thr Leu Gln Cys Gln Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala 130 135 140 ctg tac aag gaa ggg gac cct gcg ccc tac aag aat ccc gag aga tgg 480 Leu Tyr Lys Glu Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp 145 150 155 160 tac cgg gct agt ttc ccc atc atc acg gtg acc gcc gcc cac agc gga 528 Tyr Arg Ala Ser Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly 165 170 175 acc tac cga tgc tac agc ttc tcc agc ggg gac cca tac ctg tgg tca 576 Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Phe Ser Ser Gly Asp Pro Tyr Leu Trp Ser 180 185 190 gcc ccc agc gac ccc ctg gag ctt atg gtc aca gga acc 615 Ala Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Met Val Thr Gly Thr 195 200 205 <210> 28 <211> 205 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 28 Met Ser Pro Ser Pro Thr Ala Leu Phe Cys Leu Gly Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 Arg Val Pro Ala Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala 20 25 30 Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys 35 40 45 Gln Gly Pro Pro Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser 50 55 60 Ser Arg Tyr Gln Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg 65 70 75 80 Ser Leu Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp 85 90 95 Ser Pro Pro Ser Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala 100 105 110 Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Asp Val Thr Leu Gln Cys Gln Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala 130 135 140 Leu Tyr Lys Glu Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp 145 150 155 160 Tyr Arg Ala Ser Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly 165 170 175 Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Phe Ser Ser Gly Asp Pro Tyr Leu Trp Ser 180 185 190 Ala Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Met Val Thr Gly Thr 195 200 205 <210> 29 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mouse-human hybrid sequence <400> 29 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Gln Ser Thr Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Arg Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Leu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Ser Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 115 120 125 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 130 135 140 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 145 150 155 160 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 180 185 190 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 195 200 205 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr His His 210 215 220 His His His His 225 <210> 30 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mouse-human hybrid sequence <400> 30 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Gln Ser Thr Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Arg Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Leu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Ser Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 115 120 125 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 130 135 140 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 145 150 155 160 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 180 185 190 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 195 200 205 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Gly 210 215 220 Gly Gly Ser 225 <210> 31 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mouse-human hybrid sequence <400> 31 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Gln Ser Thr Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Arg Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Leu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Ser Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 115 120 125 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 130 135 140 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 145 150 155 160 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 180 185 190 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 195 200 205 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Gly 210 215 220 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 225 230 <210> 32 <211> 319 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala Leu Pro Ser Ser 1 5 10 15 Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Pro Pro 20 25 30 Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser Ser Arg Tyr Gln 35 40 45 Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg Ser Leu Ala Gly 50 55 60 Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp Ser Leu Pro Ser 65 70 75 80 Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala Lys Pro Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly Asp Val Thr Leu 100 105 110 Gln Cys Gln Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala Leu Tyr Lys Glu 115 120 125 Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp Tyr Arg Ala Ser 130 135 140 Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly Thr Tyr Arg Cys 145 150 155 160 Tyr Ser Phe Ser Ser Arg Asp Pro Tyr Leu Trp Ser Ala Pro Ser Asp 165 170 175 Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Thr Ser Val Thr Pro Ser Arg Leu 180 185 190 Pro Thr Glu Pro Pro Ser Ser Val Ala Glu Phe Ser Glu Ala Thr Ala 195 200 205 Glu Leu Thr Val Ser Phe Thr Asn Lys Val Phe Thr Thr Glu Thr Ser 210 215 220 Arg Ser Ile Thr Thr Ser Pro Lys Glu Ser Asp Ser Pro Ala Gly Pro 225 230 235 240 Ala Arg Gln Tyr Tyr Thr Lys Gly Asn Leu Val Arg Ile Cys Leu Gly 245 250 255 Ala Val Ile Leu Ile Ile Leu Ala Gly Phe Leu Ala Glu Asp Trp His 260 265 270 Ser Arg Arg Lys Arg Leu Arg His Arg Gly Arg Ala Val Gln Arg Pro 275 280 285 Leu Pro Pro Leu Pro Pro Leu Pro Gln Thr Arg Lys Ser His Gly Gly 290 295 300 Gln Asp Gly Gly Arg Gln Asp Val His Ser Arg Gly Leu Cys Ser 305 310 315 <210> 33 <211> 226 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Gln Ser Thr Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Leu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 115 120 125 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 130 135 140 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 145 150 155 160 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 180 185 190 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 195 200 205 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Ala Ala Ala His His His His 210 215 220 His His 225 <210> 34 <211> 213 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Ser Leu Leu Ile 35 40 45 His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Asn Leu Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mouse-human hybrid sequence <400> 35 His His His His His 1 5 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mouse-human hybrid sequence <400> 36 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mouse-human hybrid sequence <400> 37 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 38 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 Asp Leu Pro Met Asp Tyr 1 5 <210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 39 Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly 1 5

Claims (15)

  1. 인간 GPVI에 특이적으로 결합하고, GPVI 고갈 표현형을 유도하는 항체 Fab 단편.
  2. 제1항에 있어서, 인간 GPVI의 입체형태적 에피토프에 결합하고, Ser 43, Arg 67 및 Asp 81을 포함하는 인간 GPVI 잔기에 접촉하는 항체 Fab 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Fab 단편이
    (a) 서열 18, 서열 19, 및 서열 20에 의해 정의되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 (HCVR)의 상보성 결정 영역 (CDR); 및
    (b) 서열 21, 서열 22, 및 서열 23에 의해 정의되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역 (LCVR)의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하며;
    여기서, 각 CDR의 적어도 2개의 아미노산 잔기는 GPVI 에피토프 잔기와의 접촉을 직접적으로 파괴시키지 않으면서 또 다른 아미노산 잔기로 변경될 수 있는 것인, 항체 Fab 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 6의 중쇄 및 서열 8의 경쇄, 또는 항체 Fab 단편 결합 특이성이 유지되는 한, 상기의 서열들에 대해 적어도 80%의 동일성을 가지는 서열을 포함하는 항체 Fab 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화된 것인 항체 Fab 단편.
  6. 제5항에 있어서, 인간화된 Fab 단편이
    (a) LCVR (서열 15) 및 HCVR (서열 10);
    (b) LCVR (서열 15) 및 HCVR (서열 11);
    (c) LCVR (서열 15) 및 HCVR (서열 12);
    (d) LCVR (서열 15) 및 HCVR (서열 13);
    (e) LCVR (서열 15) 및 HCVR (서열 14);
    (f) LCVR (서열 16) 및 HCVR (서열 11);
    (g) LCVR (서열 17) 및 HCVR (서열 11); 및
    (h) LCVR (서열 17) 및 HCVR (서열 13)
    으로 이루어진 군으로부터 선택된, 경쇄 가변 영역 (LCVR) 아미노산 서열과 중쇄 가변 영역 (HCVR) 아미노산 서열의 조합을 포함하는 것인, 항체 Fab 단편.
  7. 인간화된 중쇄 (HC) 아미노산 서열 및 인간화된 경쇄 (LC) 아미노산 서열의 조합을 포함하며, 여기서 인간화된 중쇄가 추가의 아미노산 잔기를 포함하는 c-말단 연장부를 추가로 포함하고, 여기서 c-말단 연장부가 항-Fab 항체에 의한 인식을 방지하는 것인 조작된 Fab 단편.
  8. 제7항에 있어서, c-말단 연장부가 서열 35, 서열 36 및 서열 37로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조작된 Fab 단편.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, Fab 단편이 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인 조작된 Fab 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에서 정의된 항체 Fab 단편, 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  11. 서열 6, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 및 서열 17, 또는 폴리펩티드가 그의 결합 특이성을 보유하는 한, 상기의 서열들에 대해 적어도 80%의 동일성을 가지는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  12. a. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에서 정의된 항체 Fab 단편을 발현하는 세포주를 배양하는 단계,
    b. 배양 배지에서 발현된 Fab 단편을 정제하는 단계,
    c. 편리한 형태로 Fab 단편을 제제화하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에서 정의된 항체 Fab 단편을 제조하는 방법.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 혈전성 질환 및 혈관 질환을 예방 또는 치료하는 데 사용하기 위한 항체 Fab 단편.
  14. 분자를 부가하여 항체 Fab 단편의 c-말단 단부를 차폐시키는 것으로 이루어진, 기존 항체에 의한 항체 Fab 단편의 인식을 방지하는 방법.
  15. 분자를 부가하여 항체 Fab 단편의 c-말단 단부를 차폐시키는 것으로 이루어진, 항-GPVI Fab 사용시 혈소판 활성화를 방지하는 방법.

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