CN103396492A - 抗人血小板胶原蛋白受体的人源性单克隆抗体片段及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，也涉及生物制药技术。具体涉及一种抗人血小板胶原蛋白受体“糖蛋白－6”（或GPVI）的人源性单克隆抗体片段及其在医药中的应用。其抗体片段是人源性的，它含有多肽氨基酸序列，包括3个重链可变区HV序列和3个轻链可变区LV序列，由其重组合成的抗体片段scFv或其它多肽能作为胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的阻断剂在制备治疗或预防血栓性心脑血管疾病药物中应用，用于制备成具有抗胶原蛋白来激活血小板的抗血栓药物，或者用于制备检测血浆内是否存在游离的“糖蛋白－6”的检测试剂等。所述药物的制备省去了十分复杂的人源化改造过程。

Description

抗人血小板胶原蛋白受体的人源性单克隆抗体片段及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，也涉及生物制药技术。具体涉及一种抗人血小板胶原蛋白受体“糖蛋白－6”（Glycoprotein VI或GPVI）的人源性单克隆抗体片段及其在医药中的应用。

背景技术

血小板在血管受损处的粘附和激活聚集，最终会导致血栓形成和出血停止，能够避免失血过度。这是正常人的生理保护机制之一。但是，在血管有病变的情况下，由血小板激活导致形成的血栓会阻塞血管，造成下游组织的缺血甚至坏死，发生心肌梗死或脑卒等。因此，抗血栓治疗在医学上有非常广泛的应用。例如用于由血管内皮损伤造成的血栓形成的预防，如冠脉扩张术中用药、心脏瓣膜置换术前和术中的用药，或者指导心肌梗死或脑栓塞引起的卒中后的溶栓疗法用药等。

通常，血小板的激活聚集过程分为两个阶段。早期是它与一些激活因子特异结合的阶段，晚期时血小板内会产生一系列的连锁反应，从而导致共同通路的激活并形成不可逆血栓。目前，医学临床上使用的针对抗血小板激活因子的药物有很多，但其存在的问题也很多。例如阿斯匹林虽能够抑制血栓环素TXA₂的形成，但效果太慢；Clopidogrel用于抑制血小板上的ADP受体，效果不能尽如人意；抗TXA₂受体药会引起低血压的副作用；抗凝血酶肽不仅能够抗血栓形成，同时也抗血凝，这使其无法在医学临床中得到应用。有一种针对血小板激活晚期共同信号传递通路的阻断药物REOPRO（一种抗血小板GPIIbIIIa单克隆嵌合抗体），它阻断血栓形成的效果较好，但它不能区分正常生理止血和病理情况下的血栓形成，因此在临床使用中很容易造成意想不到的内出血。尽管如此，在许多临床治疗中还不得不用它，尤其是进行冠脉扩张术时，因为现有技术中还没有更好的药物替代。

胶原蛋白与其在血小板表面的受体－胶原蛋白受体结合，是激活血小板最强的底物。胶原蛋白受体其中之一“糖蛋白－6”只表达在血小板表面。当血管内皮受到损伤后，就会暴露出内皮下的胶原蛋白。血管内皮损伤和剥脱导致血管基底膜暴露的常见原因包括冠状动脉、颈动脉和颅动脉粥样硬化斑块的溃破等。被暴露的胶原蛋白能通过与其受体结合激活血小板并导致血栓生成（clotting），形成阻断血流的局面，最终造成心肌缺血（心绞痛和心肌梗死）和脑血液循环障碍（脑卒中）等严重疾病。在抗TXA₂受体、抗ADP受体和抗凝血酶受体等药不能满足临床使用需求下，对抗血小板胶原蛋白受体抗体研究成为当今抗血小板药物的研究热点。

胶原蛋白具有分子大、凝聚后结构复杂的特征，小分子化学药物不能阻断它与其受体的结合和由此导致的血小板的激活和血栓形成。而单克隆抗体，由于与靶点亲和力强和特异性高、且由于分子量大而可起到有效的阻断作用，再加上人源化后不太容易引起中和性抗体的产生和造成副作用，因此被公认为是阻断胶原蛋白受体“糖蛋白－6”最佳的选择和被首先开发的对象。人们首先是对血小板胶原蛋白受体“糖蛋白－6”进行分子克隆，以此可以用来作为免疫靶点和下一步的单克隆抗体的筛选。经过多年的努力，现今，几家试验室已经研究得到了多个有阻断效应的单克隆抗体(Matsumoto et al.Thrombosis Res.119:319-329,2007。Masberg et al.JEM197:41-49,2002。Lecutet al.J Throm Haemosta1:2653-2662,2003。Moroi et al Throm Haemosta89:996-1004,2003。Chen et al JBC277:3011-3019,2002)。这些单克隆抗体不仅在多肽氨基酸的序列和亲和力不同，在胶原蛋白受体“糖蛋白－6”上结合（抗原上的识别）的位点也不一样。有两家试验室还获得了胶原蛋白受体“糖蛋白－6”基因敲除的小鼠（Kato etal.Blood102:1701-1707,2003。Lockyer et al.Thrombosis Res.,118:371-380，2006）。无论是用单克隆抗体还是基因敲除的小鼠，体外（包括人和动物）和动物（包括猴子）体内的试验，都证实了胶原蛋白受体“糖蛋白－6”是很好抗血栓药物的靶点：既有效但又不引起出血时间延长（不同于REOPRO）；而且还证实单克隆抗体是有效的胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的阻断剂。因此，通过阻断胶原蛋白受体“糖蛋白－6”而具有抗胶原蛋白来激活血小板的单克隆抗体有望成为具有广泛临床应用价值的抗血栓药。

现有技术中，产生单克隆抗体的方法是：先将抗原（如表达人胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的细胞株或纯化的重组人胶原蛋白受体“糖蛋白－6”）注入小鼠体内进行免疫；然后从其脾脏提取出B淋巴细胞与浆细胞瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞（hybridoma）；筛选后再从生存的杂交瘤单细胞珠中筛选出能分泌抗胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的单株，最后通过对血小板激活的功能分析实验或用表达重组人胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的细胞，找出对胶原蛋白受体“糖蛋白－6”有阻断作用和高亲合力的单克隆抗体和产生此抗体的杂交瘤细胞株。由于完整的抗胶原蛋白受体“糖蛋白－6”抗体或F（ab）₂片段会激活血小板（可能是因为这些双价的抗体或片段会将两个胶原蛋白受体“糖蛋白－6”带到一起而激活血小板），因此在临床应用中只能用Fab（单价的）来发展成阻断性药物。事实上，应用到临床前，还需要将这鼠源性单抗进行人源化改造，以使其蛋白序列尽量接近人源性抗体，最大可能地减少病人身体对注入的外源性蛋白药物引起的免疫中合反应。因此需要将单抗的核苷酸序列先从杂交瘤细胞中克隆出来，人源化后，再用重组蛋白表达的技术和哺乳细胞生产出来，最终经纯化和灭病毒后方可用于病人的治疗。整个过程所需应用的技术十分复杂，且制备成本高。

1987年，日本的Minoru Okuma教授从他的一个患有血小板减少性紫癜病人的血清中分离出有抗血小板功能的抗体（多克隆）（Sugiyama et al.,Blood69:1712-201987。Moroi et al.,J.Clin.Invest.84:1440-45，1989。Ryo et al.,Am.J.Hematol.39:25-31，1992。Arai et al.,Brit.J.Haematol.89:124-130，1995)。利用此抗体，多家试验室不仅检测和证实了血小板膜上的62kDa的蛋白就是胶原蛋白受体“糖蛋白－6”，也证实了血小板在胶原蛋白表面的附着和胶原蛋白诱导的激活也可以被此抗体阻断（Nakamura et al.J.Biol.Chem.273:4338-4344，1998)。因为这个多克隆抗体是从一病人血清中得到的，数量有限，也无法进行工业化生产，但这些研究结果明确提示，抗胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的抗体可成为阻断胶原蛋白激活血小板的药物，而可用于预防血栓的形成。

发明内容

本发明的目的在于，避开现有技术中均需使用小鼠和筛选杂交瘤细胞的程序，提供一种直接利用正常人血液的血小板（表面带有胶原蛋白受体“糖蛋白－6”）作为抗原，通过输血引发受血方（先天性缺乏胶原蛋白受体“糖蛋白－6”）产生人源性抗人血小板胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的单克隆抗体，进而获得单抗的基因序列和由此制备出有阻断效应的重组的单链可变区片段（scFv）或其它形式的多肽片段，及其作为治疗和预防血栓性心脑血管疾病的药物和诊断试剂的应用。

本发明的目的通过以下方式实现。

本发明的抗人血小板胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的人源性单克隆抗体片段，其特征在于，该抗体片段是人源性的，它含有多肽氨基酸序列，包括3个重链可变区HV序列（序列编号＃1－＃3）和3个轻链可变区LV序列（序列编号＃4－＃6），所述多肽氨基酸多肽序列是：

HV1：GYIMS（序列编号＃1）

HV2：WIYTGYGNIKYNQKPQG（序列编号＃2）

HV3：SEDGYFRYFDA（序列编号＃3）

LV1：RASGGIHSYLI（序列编号＃4）

LV2：NAEIVQD（序列编号＃5）

LV3：NHFWTLPFT（序列编号＃6）

所述可变区的多肽氨基酸，能够利用蛋白重组技术进行重组表达，得到的蛋白或多肽（如scFv或Fab））中含有多肽氨基酸序列＃1－＃6全部或其中一个或几个；或者是其中含有80％以上的多肽氨基酸序列＃1-＃6，其余20%以内部分由同等氨基酸碱基置换。

本发明的抗人血小板胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的人源性单克隆抗体片段，在制备治疗或预防血栓性心脑血管疾病药物中的应用，其特征在于，所述制备治疗或预防血栓性心脑血管疾病药物是指制备成具有抗胶原蛋白来激活血小板的抗血栓药物，或者用于制备检测血浆内是否存在游离的胶原蛋白受体“糖蛋白－6”片段的检测试剂。所述应用时对上述可变区的多肽氨基酸序列的单克隆抗体片段进行重组表达，得到的蛋白或多肽（如scFv或Fab））中含有上述多肽氨基酸序列＃1－＃6全部或其中一个或几个；或者是其中含有80％以上的上述多肽氨基酸序列＃1-＃6，其余20%以内部分由同等氨基酸碱基置换。所述治疗或预防血栓性心脑血管疾病药物的药用机理是作为胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的阻断剂，阻断胶原蛋白与人的胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的结合，对胶原蛋白引起的人的PRP和全血的血小板激活有抑制作用，以及抑制人血小板在胶原蛋白表面的附着。

本发明的抗人血小板胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的人源性单克隆抗体片段可以通过以下方法制备得到：

（1）用患有血小板减少性紫癜（由血小板胶原蛋白受体“糖蛋白－6”缺乏引起）病人的血（在输入正常人血后）作为来源，分离出对血小板有亲和性的有核白细胞（Blymphocyte），即分离出病人表达抗胶原蛋白受体“糖蛋白－6”抗体的B淋巴细胞。

（2）利用单细胞反转录－多聚酶连锁放大反应（RT－PCR）与人免疫球蛋白IgG的重链和轻链的特异性引物配合，克隆出抗胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的单克隆抗体的可变区片段的序列。

（3）利用蛋白重组技术，以单链的形式（如scFv）或其它形式（如Fab），在哺乳类细胞（如CHO细胞）内表达、分泌和纯化。将克隆到的基因片段以下列方式进行连接起来。Kozak（GCCACC）序列加在蛋白合成起始信号ATG前，将单克隆抗体赫赛丁（Herceptin）的分泌信号序列（GAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGCAGCACCGGC）加在轻链可变区之前，轻链和重链可变区之间加上一16个Ser和Gly组成的肽链（SGGGGSGGGSGGGSGG），重链可变区后加8个组氨酸用于重组蛋白scFv的纯化，在最后加上蛋白合成中止信号TAA。将整个片段放入带有CMV启动子的表达载体质粒后，传染CHO细胞并进行筛选，最后收集上清。

（4）纯化后，经功能筛选后找到有阻断人胶原蛋白受体“糖蛋白－6”与胶原蛋白相结合的scFv和确认可变区的氨基酸序列。

以下是对使用本发明的上述方法制备得到的人源性单克隆抗人血小板胶原蛋白受体“糖蛋白－6”抗体的片段进行各项功能检测的结果。

1.人血小板聚集抑制试验：

富含血小板血浆（platelets－rich plasma，PRP）用来做胶原蛋白、二磷酸腺苷（ADP）、U46619（血栓环素TXA₂受体激活剂）、花生四烯酸（ararchidonic acid）激发的聚集试验。洗过的血小板(washed platelets)用于凝血酶（thrombin）激活的聚集试验。没有抗体抑制剂存在的对照作为100％。试验结果表明，由上述可变区重组得到的抗体片段scFv选择性的抑制由胶原蛋白引起的血小板聚集，而且其抑制作用与抗体片段的浓度成正比。

2.人血小板对胶原蛋白覆盖表面的粘附抑制试验：

用没有抗体抑制剂存在的对照作为100％。试验结果表明，此抗体片段scFv选择性的抑制由胶原蛋白引起的血小板附着，而且其抑制作用与抗体片段的浓度成正比。

3.胶原蛋白激发的人全血血小板聚集抑制试验：

用没有抗体抑制剂存在的对照作为100％。试验结果表明，此抗体片段scFv选择性的抑制由胶原蛋白引起的血小板聚集，而且其抑制作用与抗体片段的浓度成正比。

从以上多项实验证实，本发明获得的抗人血小板胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的人源性单克隆抗体片段scFv与现有制药技术中得到的Fab相比有类似的亲合性。它对胶原蛋白引起的人的PRP和全血的血小板激活有抑制作用，而对二磷酸腺苷（ADP）、U46619、花生四烯酸（ararchidonic acid）等激活剂毫无作用。同时本发明获得的抗人血小板胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的人源性单克隆抗体片段scFv能够抑制人血小板在胶原蛋白表面的附着，因此，它能够被用于制备多种抗血栓药。例如，用于治疗和预防血栓性心脑血管疾病的药物，或者是用于预防、减少和治疗心脑缺血后再灌造成的疾病损伤的药物，或者是用于血栓性心脑血管疾病的诊断试剂。

本发明的抗人血小板胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的人源性单克隆抗体片段（#1至#6氨基酸序列），由于其抗原直接取与人体本身，而且在其制备过程中，省去了十分复杂的人源化改造过程，这大大减低了制备成本，也缩短了其制备时间。

由于本发明的抗人血小板胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的人源性单克隆抗体片段scFv只识别人的血小板胶原蛋白受体“糖蛋白－6”，而不与其它动物的血小板胶原蛋白受体“糖蛋白－6”结合，因此就此单抗片段的阻断效应不能用动物做体内试验，只能通过离体人的血小板聚集和附着试验来验证，结果见后。

以下通过具体实施方式作进一步描述。

具体实施方式

1.用正常人的血小板作为胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的抗原来源（免疫原），用血小板减少性紫癜病人（缺乏血小板胶原蛋白受体“糖蛋白－6”）作为免疫受体，制备得到病人表达抗GPVI抗体的B淋巴细胞，并由此提取核苷酸：

（1）筛选病人：与医院血液病科室合作，对患有血小板减少性紫癜的病人在征得病人本人和家属同意后，选用枸橼酸钠作为抗凝剂抽血15毫升，通过低速离心获得上清（富含血小板血浆，具体方法可参照Sun,B et al..J..CardiovascularPharmacol..40:557--585，2002）。取400微升所得上清放到血小板聚集仪上37摄氏度预热，再用10或20微摩尔（μM）二磷酸腺苷（ADP）确证此病人的血小板可以在搅拌（每分钟1千转）状态下发生聚集。然后加入马跟腱的一型纤维化的胶原蛋白（1到2微克／毫升）来诱发血小板发生聚集。没有反应的病人，进一步确认是否有过输血史。接下来筛查病人血内是否有自身抗胶原蛋白受体“糖蛋白－6”抗体。所用的方法也是用血小板聚集，因为完整的抗胶原蛋白受体“糖蛋白－6”抗体或F（ab）2片段可通过受体交联而引发血小板激活。将病人的血清（200微升）加入到预热的正常人（对胶原蛋白发生聚集反应的）的富含血小板血浆内。观察在一小时内是否引起血小板聚集。利用此方法筛查到血小板对胶原蛋白无反应的病人。利用富含血小板血浆（platelets－rich

plasma，PRP）做胶原蛋白、二磷酸腺苷（ADP）、U46619、花生四烯酸（ararchidonicacid）激发的聚集试验，检测结果见见表1。由该表可以看出该病人的血小板对胶原蛋白的刺激无反应，但对其它激活剂反应正常。病人的血清可以引起轻度的他人的血小板激活和聚集（因为病人曾有输血史，由此产生了抗胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的自身抗体）。进一步用病人的血小板进行蛋白凝胶电泳加以分离和检测（Western blotting），证实病人的血小板上完全不表达胶原蛋白受体“糖蛋白－6”（即没有62kDa的蛋白带）。

表1病人PRP血小板聚集实验数据表

激活剂	血小板聚集率(占透光的%)	试验次数
			1μg/mL胶原蛋白	1	3
10μM二磷酸腺苷	75	3
			3μM U46619	85	3
花生四烯酸	78	3

（2）分离病人表达抗胶原蛋白受体“糖蛋白－6”抗体的B淋巴细胞：经病人同意，对其输入正常人（即血小板上表达胶原蛋白受体“糖蛋白－6”）的血液200毫升。一周后抽取该病人50毫升血，离心后将血浆和红细胞交界面的白细胞收留，用磷酸缓冲生理盐水（pH 7.4）清洗并再次离心后，将离下的细胞悬浮在5毫升磷酸缓冲生理盐水中。同时，将盖玻片（20毫米x20毫米）用70％酒精和蒸馏水清洗、烘干。将300毫升正常人的富含血小板血浆均匀滴在此玻璃盖片上，在室温下孵育一小时，让血小板附着。用磷酸缓冲生理盐水冲洗后，放入特制的罐流室（其制作方法见参考文献Sun B,et al.J.Physiol.1996,495:65-82）的底部，然后夹紧密封。与罐流泵连接后，开始用磷酸缓冲生理盐水排除气泡，然后换成上述准备的白细胞悬浮液开始缓慢罐流（流速约每分0.1毫升）；再用2毫升的磷酸缓冲生理盐水以同样的速度加以冲洗。最后，将取出的盖玻片轻轻浸到磷酸缓冲生理盐水内并立即拿出。最后将附着的细胞（即该病人的B淋巴细胞）吹打后收集在0.5毫升的磷酸缓冲生理盐水中，然后分装到96孔的PCR板上。离心后将细胞溶解和提取核苷酸（total RNA）。

2．用RT－PCR放大和克隆抗体cDNA的重链和轻链可变区：

用Invitrogen的反转录试剂盒和oligo dT加入上述提取到的核苷酸，首先合成获得cDNA。根据人的IgG的cDNA的保守区的核苷酸序列，设计出针对重链和轻链Fab的两对degenerate引物。采用Invitrogen的单细胞RT－PCR试剂盒，然后经过两轮45圈的PCR放大，将最终产物克隆到Invitrogen的TA克隆载体质粒内。转染细菌后，先用TA克隆载体质粒上克隆位点两边的引物和colony－PCR筛选出有片段插入的转染菌株。小规模提纯含有克隆片段的质粒后对预料到的大小的片段做DNA测序和分析。经过三轮的筛选，最后得到了所述的重链可变区和轻链可变区的序列。

3．利用蛋白重组技术，制备人源性单克隆抗人血小板胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的抗体片段scFv：

将克隆到的基因片段以下列方式进行连接起来。Kozak（GCCACC）序列加在蛋白合成起始信号ATG前，将单克隆抗体赫赛丁（Herceptin）的分泌信号序列（GAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGCAGCACCGGC）加在轻链可变区之前，轻链和重链可变区之间加上一16个Ser和Gly组成的肽链（SGGGGSGGGSGGGSGG），重链可变区后加8个组氨酸用于重组蛋白scFv表达后的纯化，在最后加上蛋白合成中止信号TAA。先将上面的序列进行核苷酸序列优化，然后用化学合成的方法合成全部的序列。将此完整的序列用分子生物学的方法插入到表达载体质粒CMV启动子的下游。转染CHO细胞后收集细胞的培养上清。由此用Nick亲合柱纯化出重组的有功能的单抗片段scFv。

4．对所得产品进行功能检测：

抗体片段的阻断GPVI的功能用富含血小板血浆（PRP）和全血的血小板聚集试验进行检测。另外，用洗过的血小板在胶原蛋白表面附着试验进一步验证其阻断的效应。富含血小板血浆（PRP）血小板聚集试验：在征得献血者同意后，选用枸橼酸钠作为抗凝剂抽血30毫升。通过低速离心获得上清（富含血小板血浆，具体方法可参照文献Sun,B et al.J.Cardiovascular Pharmacol..40:557--585，2002）。然后取400微升放到血小板聚集仪上37摄氏度预热两分钟。首先用马跟腱的一型胶原蛋白（1到2维克／毫升）来诱发血小板发生聚集，确证此病人的血小板可以在搅拌（每分钟1千转）状态下发生聚集，并用此聚集的程度（透光度）作为无抑制剂作用的基线。其它的试验，先将抗体片段与PRP孵育两分钟后，再加入胶原蛋白进行刺激。对于有抑制作用的抗体片段，进一步用10微摩尔（μM）二磷酸腺苷（ADP）、3微摩尔U46619和400微摩尔花生四烯酸检测抗体片段是否有抑制作用。此抗体scFv片段的检测结果见表2，由表2可以看出，此单抗片段scFv选择性的抑制由胶原蛋白引起的血小板聚集，而且其抑制作用与抗体片段的浓度成正比。但对其它激活剂引起的血小板聚集无任何作用。

表2PRP血小板聚集实验

激活剂(抗糖蛋白-6scFv浓度)	血小板聚集率(占对照的%)	标准偏差	试验次数
				1μg/mL胶原蛋白(0.1ug/mL)	92.3	5.8	3
1μg/mL胶原蛋白(0.3ug/mL)	75.5	4.5	3
				1μg/mL胶原蛋白(1ug/mL)	45.6	4.2	3
1μg/mL胶原蛋白(3ug.mL)	27.3	3.6	3
				1μg/mL胶原蛋白(10ug/mL)	9.3	2.7	3
10μM二磷酸腺苷(10ug/mL)	101.1	10.3	3
				3μM U46619(10ug/mL)	99.4	3.5	3
400μM AA(10ug/mL)	100.2	4.3	3

全血血小板聚集试验：在征得献血者同意后，选用肝素作为抗凝剂抽血10毫升。取500微升血和500微升Tyrode-HEPES缓冲液放到专用聚集测试管内，然后放血小板聚集仪上37摄氏度预热5分钟。首先用马的一型胶原蛋白（1到2维克／毫升）来诱发血小板发生聚集，确证此病人的血小板可以在搅拌（每分钟1千转）状态下发生聚集（电阻增大），并用此聚集的程度作为无抑制剂作用的基线。其它的试验，先将抗体片段与PRP孵育两分钟后，再加入胶原蛋白进行刺激。对于有抑制作用的抗体片段，进一步用3微摩尔（μM）U46619检测抗体片段是否有抑制作用。其中，该抗体的检测结果见表3，由表3可以看出：此单抗片段scFv选择性的抑制由胶原蛋白引起的血小板聚集，而且其抑制作用与抗体片段的浓度成正比。但对其它激活剂U46619引起的血小板聚集无任何作用。

血小板附着试验(本试验的详细步骤可参阅文献Tandon,NN et al.Br.J.Haematol.89:124-130，1995)：在征得献血者同意后，选用枸橼酸钠作为抗凝剂抽血30毫升。通过低速离心获得上清（富含血小板血浆）。然后收取PRP到一15毫升的离心管内准备洗过的血小板。加入前列腺素E1（0.8微克／4毫升PRP）和枸橼酸缓冲液（pH6.0，100微升／5毫升PRP）后，离心2400转／分共20分钟。将离下的血小板用枸橼酸缓冲液冲洗一遍后，最后混悬在1毫升Tyrode－HEPES缓冲液内。试验前一天，将96孔板用每孔100微升胶原蛋白（1维克／毫升）孵育在4摄氏度过夜。经Tyrode－HEPES缓冲液洗过后，加上血小板悬浮液（4x10⁸／毫升），同时或事先加上抗体片段或等量缓冲液作为无抑制剂对照。一小时后，将没有附着的血小板洗掉后，将附着的血小板用Triton－X100溶解。最后用显色反应来检测血小板释放出的LDH，以此来定量附着的血小板和计算出抗体片段的抑制效应。该抗体的检测结果见表4，由表4可以看出：此单抗片段scFv选择性的抑制由胶原蛋白引起的血小板附着，而且其抑制作用与抗体片段的浓度成正比。但非特异性的抗体对胶原蛋白引起的血小板附着无任何抑制作用。

表3全血血小板聚集试验数据表

激活剂(抗糖蛋白-6scFv浓度)	血小板聚集率(占对照的%)	标准偏差	试验次数
				1μg/mL胶原蛋白(1μg/mL)	56.7	4.2	3
1μg/mL胶原蛋白(10μg/mL)	13.5	2.7	3
				3μM U46619(10μg/mL)	100.4	5.9	3

表4血小板附着试验数据表

阻断剂	血小板附着率(占对照的%)	标准偏差	试验次数
				抗糖蛋白-6scFv(O.1μg/mL)	18.4	4.5	3
抗糖蛋白-6scFv(0.3μg/mL)	12.3	5.5	3
				抗糖蛋白-6scFv(1μg/mL)	5.3	2.1	3
抗糖蛋白-6scFv(3μg/mL)	2.2	2.4	3
				抗糖蛋白-6scFv(10μg/mL)	0.3	1.8	3
非特异性IgG(10μg/mL)	98.3	6.8	3

Claims (5)

1.抗人血小板胶原蛋白受体“糖蛋白-6”的人源性单克隆抗体片段，其特征在于，该抗体片段是人源性的，它含有多肽氨基酸序列，包括3个重链可变区HV序列和3个轻链可变区LV序列，所述多肽氨基酸多肽序列是：

HV1：GYIMS               序列编号＃1

HV2：WIYTGYGNIKYNQKPQG   序列编号＃2

HV3：SEDGYFRYFDA         序列编号＃3

LV1：RASGGIHSYLI         序列编号＃4

LV2：NAEIVQD             序列编号＃5

LV3：NHFWTLPFT           序列编号＃6。

2.如权利要求1所述的抗人血小板胶原蛋白受体“糖蛋白-6”的人源性单克隆抗体片段，其特征在于，所述可变区的多肽氨基酸，能够利用蛋白重组技术进行重组表达，得到的蛋白或多肽中含有多肽氨基酸序列＃1－＃6全部或其中一个或几个；或者是其中含有80％以上的多肽氨基酸序列＃1-＃6，其余20%以内部分由同等氨基酸碱基置换。

3.如权利要求1的抗人血小板胶原蛋白受体“糖蛋白-6”的人源性单克隆抗体片段在制备治疗或预防血栓性心脑血管疾病药物中的应用，其特征在于，所述制备治疗或预防血栓性心脑血管疾病药物是指制备成具有抗胶原蛋白来激活血小板的抗血栓药物，或者用于制备检测血浆内是否存在游离的胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的检测试剂。

4.如权利要求2所述的抗人血小板胶原蛋白受体“糖蛋白-6”的人源性单克隆抗体片段在制备治疗或预防血栓性心脑血管疾病药物中的应用，其特征在于，所述应用时对具有可变区的多肽氨基酸序列的单克隆抗体片段进行重组表达，得到的蛋白或多肽中含有上述多肽氨基酸序列＃1至＃6全部或其中一个或几个。

5.如权利要求2所述的抗人血小板胶原蛋白受体“糖蛋白-6”的人源性单克隆抗体片段在制备治疗或预防血栓性心脑血管疾病药物中的应用，其特征在于，所述应用时对具有可变区的多肽氨基酸序列的单克隆抗体片段进行重组表达，得到的蛋白或多肽中含有80％以上的多肽氨基酸序列＃1-＃6全部或其中一个或几个，其余20%以内部分由同等氨基酸碱基置换。