JPH02500085A - 血小板の粘着を阻害するペプチド及び抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血小板の粘着を阻害するペプチド及び抗体（説明） （関連出願） 本出願は、１９８７年７月８日に出願された出願番号第０７０．９５３号の部分 継続出願である。

（技術分野） 本発明は、血小板関連ＧＰｎｂ−ｍａがフィブリノーゲンに結合する際の抗原決 定基を形成するＧＰＩｌｂ重鎖（Ｈ鎖）（ｈＧＰｎｂ）の一部の構造遺伝子をコ ードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ及び組換えＤＮＡ分子に関するものである。ま た、本発明は、ｈｃｐｎｂの潜在的決定基であるポリペプチドアナログ及びこの ポリペプチドアナログと免疫反応する抗体に関するものである。

（背景） 一般的に、細胞粘着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）は、細胞表面レセプターによる特異的 粘着タンパク質の認識と関係している０本発明に特に興味のもたれる一群の細胞 表面レセプターは、インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）である。

ハインズ（Ｈｙｎｅｓ）　（セル（Ｃｅｌｌ）　、１８，５４９−５５４（１９ ８７））によれば、インテグリンは、細胞外マトリクス糖タンパク質、補体及び 他の細胞と相互作用を起こす機能的及び構造的に関連した一群のレセプターであ る。インテグリンは、発生学的発生、止血、血栓症、傷害治癒、免疫及び非免疫 防御メカニズム、及び腫瘍遺伝子トランスホーメーションを含む、多くの生理学 的に重要なプロセスにおける、細胞−マトリクス及び細胞−細胞粘着に関与して いる。２つのヒトの遺伝病、グラスマン・トロンバスセニア及び白血球粘着欠損 症は、インテグリン類のいくつかを冒している。

構造的に、インテグリンは、アルファ及びベータサブユニットが非共有的に会合 したヘテロニ量体的複合体である。インテグリン類の中には、同様のベータサブ ユニットが存在することによって、関連づけられるグループがあり、また、各グ ループの中のメンバーは、独特のアルファサブユニットによって区別される。

例えば、アルファ及びベータサブユニットからなる非共有性、Ｃａ″″依存へテ ロニ量体である。ジェニングス（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）等、ジャーナル・オプ・バ イオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、）　２５７．１０４５８−１０４６６　（１９８２）、アルファ・サ ブユニット、ＧＰＴｌｂは約１２０キロダルトン（ＫＤａ　）の相対分子量を有 する重鎮（ｈＧＰＩＩｂ）及びジスルフィド結合でこれと結合している約２０Ｋ Ｄａの軽鎖（１（１，Ｐ　ＩＩ　ｂ）からなる、ベータサブユニット、ＧＰｍａ は約１００ＫＤａの一本鎖ポリペプチドである。フィリフプス（Ｐｈｉｌｌｉｐ ｓ）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｗ、）　２５２　、２１２１−２１２６　（１９７７）、免疫学的に、 ＣＰＩｌｂ−ｍａと関連する細胞表面分子は、多くの細胞型で同定されてきてい る。チアガラジャン（丁ｈａｇａｒａｊａｎ）等（ジャーナル・オフ゛・クリニ カル、インベスチゲーション（Ｊ、　Ｃｈｅｗ、Ｉｎｖｅｓｔ、）　７５．８９ ６−９０１（１９８５）、ブロー（Ｐｌｏ＠）等、プロシーディング・イン・ナ ショナル・アカデミ−・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 。

Ｓｅｔ、）　ＵＳＡ、　８３．６００２−６００６　（１９８６）及びフィン゛ ンジエラＩレド（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）等、ジャーナｌし・オフ゛・バイオロ ジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）　２６０．１０８９３ −１０８９６　（１９８５）参照。

ＧＰＩＩｂ−１［Ｉａは、フィプリトゲン【ベネント（Ｂｅｎｎｅｔｔ）等、プ ロシーディング・イン・ナシヨナル・アカデミ−・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、）　ＵＳＡ％　８０．２４１７−２４２ １　（１９８３））、フィブロネクチン〔ギンスベルグ（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ）等 、ジャーナル・オブ・クリニカル、インベスチゲーション（Ｊ、　Ｃｈｅｗ、　 Ｉｎｖｅｓｔ、）１上、６１９−６２４　（１９８３）　）及びホン・イルブラ ンド因子〔ルゲリ　（ｌｌｕｇｇｅｒｉ）等、プロシーディング・イン・ナショ ナル・アカデミ−・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｅｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ、Ｌ主、６０３８−６０４１（１９８２））などのＲＧ Ｄ含有タンパク質との相互作用を通して血小板機能に寄与しており、従って、一 般的血小板粘着タンパク質レセプターの一成分である（ピテラ（Ｐｙｔｅｒａ） 等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３土、１５５９−１５６２　（１９８６ ）及びプロー　（Ｐｌｏｗ）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト リー　Ｕ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｍ、）　２５９．５３８８−５３９１　（１ ９８４）。

最近、ＣＰＩｌｂ−１１１ａは、同様のベータサブユニット及びトリペプチドア ミノ酸残基配列Ａｒｇ−Ｇ１４ｙ　−Ａｓｐ　（−文字記号を用いるとＲＧＤ） を認識する機能的性質をもつ、いくつかの粘着レセプターのうちの１つであると いう証拠が示された。ピテラ（Ｐｙｔｅｒａ）等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ ）　２３よ、１５５９−１５６２（１９８６）及びルオスラティ（Ｒｕｏｓｌａ ｈｔｉ）等、セル（Ｃｅ１１）、王土、５１７−５１８　（１９８６）、ＣＰＩ ｌｂ−ｍａに加えて、関連するレセプターのグループには、オステオザルコーマ から単離したヒドロネクチンレセプター（ＶｎＲ）及びフィブロネクチンレセプ ター（ＦｎＲ）が含まれる（ピテラ（Ｐｙｔｅｒａ）等、セル（Ｃｅｌｌ）　、 土工、１９１−１９８　（１９８５）、ピテラ（Ｐｙｔｅｒａ）等、プロシーデ ィング・イン・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、）　ＵＳＡ％　８２．５７６６−５７７０　（１ ９８５）及びサンチェス・マドリフト（Ｓａｎｃｈｅｓ−Ｍａｄｒ　ｉｄ）等、 ジャーナル・オブ・ニススベリメンタル・メディシン（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ 、）　１５８．１７８５−１８０３　（１９８３））。

これらタンパク質の同様の機能的、構造的及び抗原的性質は、ＧＰＩＩｂ−Ｉ［ ［ａ及びＶｎＲが、′サイトアトへシン”という名前が提唱された粘着レセプタ ーグループのメンバーであることを示している。プロー（Ｐｌｏｗ）等、プロシ ーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、）ＵＳＡ、８２．６００２−６００６　（１９８ ６）。サイトアトへジングループでは、独特のアルファサブユニットが共通もし くは非常に類似しているベータサブユニットと結合しており、機能的に区別しう るレセプターとなる。ギンスバーグ（Ｇｉｎｓｂｓｒｇ）等、ジャーナル・オブ ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、口ｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　）　２６２．５４３７−５４４０　（１９８７）。

ヘテロニ量体粘着レセプターの少なくとも２つの他のグループが同定されており 、それらの場合、１つの共通ベータサブユニットは、独特のアルファ・サブユニ ットのいくつかと結合している。

１つのグループは、白血球で見られるもので、白血球粘着群と呼ばれ、ＬＦＡ− １、Ｍａｃ−１、Ｐ　１５０．９５が含まれる。サンチェス・マドリッド＜Ｓａ ｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒ　ｉｄ）等、ジャーナル・オブ・ニススベリメンタル・メ ディシン（Ｊ、ＩＥＸＰ、　Ｍｅｄ、）　１５８．１７８５−１８０３　（１９ ８３）７ｉびスブリンガー（Ｓｐｒ　ｉｎｇｅｒ）等、（シバ・ファウンド・シ ンポジウム（Ｃｉｂａ、　Ｆｏｕｎｄ、　Ｓｙｍｐ、）　１１８．１０２−１２ ６　（１９８Ｇ）。その他のものはより広く分布しており、ＶＬＡ族と呼ばれて いる（ヘムシー（Ｉｌｅｍｌｅｒ）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ ミストリー（Ｊ、Ｄｉａｌ、　Ｃｈｅｍ、）２６２．３３００−３３０９　（１ ９８７））。チキンのＶＬＡ族のベータサブユニット〔ヘムシー（ｌｌｅｍｌｅ ｒ）等、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅ＋ｗ、）　２６２．３３００−３３０９　（１９８７）がクローン化さ れ、配列決定され、“インテグリン”と命名された（タムクン（Ｔａｍｋｕｎ） 等、セル（Ｃｅｌｌ）　、４６．２７１−２８２　（１９８６））、チキン・イ ンテグリンの配列はＧＰｍａのもの〔フィンツジエラルド（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌ ｄ）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｗ、）　２６２．３９３６−３９３９　（１９８７））及び白血球粘着 族のベータサブユニットのベータサブユニットのもの〔キシモト（Ｋｉｓｈｉｓ ＋ｏｔｏ）等、セル（Ｃｅｌｌ）土工、６８１−６９０　（１９８７））と同様 である。さらに、いくつかのアルファサブユニットの部分配列も類憤性を示して いる。ギンスベーグ（ｇｉｎｓｂｅｒｇ）等、ジャーナル・オプ・バイオロジカ ル・ケミストリ　−（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、）　２　６　２　、５４３７− ５４４０　（１９８７）　；スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）等、プロシーディング・イ ン・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｅｉ、）　ＵＳＡ。

８２．８６１４−８６９８　（１９８６）及びシャ口（Ｃｈａｒｏ）等、プロシ ーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、）　ＵＳＡ、　８３．８３５１−８３５６　 （１９８６）。

粘着レセプターとしてのそれらの機能に基本的なＧＰｎｂ−ｍａ又はその他のサ イトアトへシン上の部位は、現在でも不明である。いくつかの観察は、ＣＰＩｌ ｂ−１［［ａ上の機能的に重要な部位は、モノクローナル抗体ＰＭ　Ｉ　−１で 決定されるエピトープ付近にあることを示している。この抗体は、ＧＰＩｌｂの 重鎮に結合し〔シャトル（Ｓｈａｄｌｅ）等、ジャーナル・オブ・セルラー・バ イオロジー（Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、）　９９．２０５６−２０６０　（ １９８４）、いくつかの独特な機能活性に関連するＧＰＩ［ｂの領域を限定する 。

第１に、ＰＭＩ−１は、洗浄した血小板のコラーゲンへの粘着を阻害する。シャ トル（Ｓｈａｄｌｅ）等、ジャーナル・オブ・セルラー・バイオロジー（Ｊ、　 Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、）　９９．２０５６−２０６０（１９８４）。第２に、 本領域の表面での配向は、カルシウム又はマグネシウムのミルモル濃度（ｍＭ） がＰＭＩ−１エピトープの発現を抑制することから、二価カチオンにより制御さ れる。゛ギンスバーグ（Ｇ　ｉｎｓｂｅｒｇ）等、ジャーナル・オブ・クリニカ ル・インベスチゲーション（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、ＩｎｖｅｓＬ、）７８．１１０３ −１１１１（１９８６）。第３に、この部位の構造の異常な二価カチオン制御は 、機能的にトロンバスセニック状態と関連している。ギンスバーグ（Ｇ　ｉｎｓ ｂｅｒｇ）等、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスチゲーション（Ｊ、　 Ｃｌ１ｎ、　ＩｎｖｅｓＬ、）　７８．１１０３−１１１１（１９８６）。第４ に、１００ミリモル濃度までのアデノシンニリン酸（ＡＤＰ＞又はエピネフリン 、ミリリットル当り１ユニツトのトロンビン、又は、ミリリットル当り５０マイ クログラムのウシ皮膚コラーゲンによる血小板の刺激は、実質的に、血小板に対 するＰＭＩ−１抗体の結合を、バックグランド以上に増加させることはなかった 。

（本発明の概要） 現在、特異的にリガンドを結合した細胞表面レセプターは、リガンド誘導抗体結 合部位（ＬＩＢＳ）の存在により、非占有レセプターと区別できることが分って いる。すなわち、細胞表面レセプターが特異的にリガンドと結合したとき、発現 するが、非占有レセプター又は、非結合領域リガンドのいずれかによっても発現 されない一部の抗原決定基が発見されている。

従って、ある態様において、本発明は、特異的に結合した細胞表面レセプター及 びリガンドを含む、レセプター−リガンド複合体によって発現された、リガンド 誘導結合部位と免疫反応するモノクローナル抗体を作る方法を考案しており、こ の方法には、（ａ）　ホ乳類をこの複合体で免疫化すること：（ハ）免疫化した ホ乳類から抗体産生細胞を取り出し、この細胞のサスペンションを作ること： （Ｃ）　、：、の細胞をトランスホーミング剤で処理して、トランスホームした 抗体産生細胞を生成すること；（社）非トランスホーメーション細胞は生存でき ない組織培養培地で制限希釈することにより、ステップ（Ｃ）で処理した細胞を クローニングし、クローン化トランスホーマントを作ること；（ｅ）　レセプタ ー　ＩＪガント複合体と免疫反応するが、いずれも非結合型の細胞表面レセプタ ー又はリガンドとは免疫反応しない分泌抗体分子の存否について、該クローン化 トランスホーマントの組織培養培地の評価を行うこと； （０分泌抗体分子を生産するクローン化トランスホーマントを選択し、組織培養 培地中で生育させること；及び（ｇＪ　選択され、かつクローン化されたトラン スホーマントの培養培地から、分泌抗体分子を収穫すること、が含まれる。

別の態様において、本発明は、特異的に結合した細胞表面レセプター及びリガン ドを含むレセプター−リガンド複合体によって発現される、リガンド誘導結合部 位と免疫反応するモノクローナル抗体を生成する方法を考案しており、その方法 には、（ａ）　マウスを該複合体で免疫化すること；（ハ）該マウスから肺臓を 取り出し、この牌細胞のサスペンションを作ること； （Ｃ）　融合プロモーターの存在下、この牌細胞とマウスのミエローマ細胞と融 合し、抗体分泌ハイブリドーマを生成すること；（ｄ）　分離したウェル中、未 融合ミエローマ細胞を生育させない培地で希釈し、この融合細胞を培養すること ：（ｅ）　レセプター　ＩＪガント複合体と免疫反応するが、非結合型の細胞表 面レセプターもしくはリガンドとは免疫反応しない、分泌抗体分子の存在につい て、ハイブリドーマを含む各ウェル中の上清を評価すること： （ｎ　抗体分子を分泌するハイブリドーマを選択し、これをクローニングするこ と；及び （（至）上記クローンの上清から、抗体分子を収穫することが含まれる。

さらに、特異的に結合した表面レセプター及びリガンドを含む、レセプター−リ ガンド複合体により発現される、リガンド誘導結合部位と免疫反応するモノクロ ーナル抗体を生成する方法を考案しており、その方法には、 （ａ）　マウスを該複合体で免疫化すること；ら）　該マウスから肺臓を取り出 し、この牌細胞のサスペンションを作ること； （Ｃ）　融合プロモーターの存在下、この牌細胞とマウスのミエローマ細胞と融 合し、抗体分布ハイブリドーマを生産すること；（ｄ）　分離したウェル中、未 融合ミエローマ細胞は生育できない培地で希釈し、この融合細胞を培養すること ：（ｅ）　細胞表面レセプター−リガンド複合体とは免疫反応するが、非結合型 の細胞表面レセプター又はリガンドと免疫反応しない分泌抗体分子の存在につい て、ハイブリドーマを含む各ウェル中の上清を評価すること； （Ｏこの抗体分子を分泌するハイブリドーマを選択し、クローニングすること； （換　このクローンを、マウス腹腔内に移すこと、そして、（社）望ましい抗体 を含む、マウスの腹水又は血清を収穫すること； が含まれる。

また、特異的に結合した細胞表面レセプター及びリガンドを含む、レセプター− リガンド複合体の存在を、インビボで検出する方法を考案しており、その方法に は、 （ａ）　生理学的に許容される希釈剤及びレセプター−リガンド複合体と免疫反 応するが、非結合型の細胞表面レセプター又はリガンドとは免疫反応しない、イ ンビボの指示手段を結合した抗体分子を含む、効果量のモノクローナル抗体組成 物を被検者に静脈注射する、 ら）　インビボで抗体分子がレセプター−リガンド複合体と免疫反応し、免疫反 応産物を形成するのに十分な、予め決めた時間、その被投与者を維持する、 （ｅ）　ステップ（ｂ）で形成して免疫反応産物の存在及びそれによる被検者中 の複合体の存在を検定する、 以上のステップが含まれている。

また、さらに、血液サンプル中の、特異的に結合した細胞表面レセプター及びリ ガンドを含む、レセプター−リガンド複合体の存在を検定する方法を考案してお り、その方法には（ａ）　血液サンプルを、該レセプター−リガンド複合体とは 免疫反応するが、いずれも非結合型の細胞表面レセプター又は、リガンドとは免 疫反応しない抗体分子を含むモノクローナル抗体組成物と混合することにより免 疫反応混合物を作る：（ハ）抗体分子が、サンプル中に存在するレセプター−リ ガンド複合体と免疫反応し、かつ免疫反応産物を形成するのに十分な時間、この 混合物を維持する； （ｅ）　ステップ（１））で形成した免疫反応産物の存在を検出し、かつそれに よりサンプル中の複合体の存在を検出する、以上のステップが含まれる。

別の態様において、本発明は、ＧＰｎｂ−ｍａ−リガンド複合体を発現する血小 板の存在について、血小板を含む血液サンプルを検定する方法を考案しており、 その方法には、（ａ）　血液サンプルを、ハイブリドーマＰＭＩ−１又はＰＭＩ −２によって生産されたＣＰＩｌｂ−ｍａ抗体分子を含む、効果量のモノクロー ナル抗体組成物と混合することにより、免疫反応混合物を作る； （ｂ）　該抗体がサンプル中に存在するフィブリノーゲン結合血小板と免疫反応 し、免疫反応産物を生成するのに十分な時間、この混合物を維持する； （ｅ）　ステップへ）で生成した免疫反応産物の存在を検出する、以上のステッ プが含まれる。

また、インビボで血栓の存在を検定する、（ａｌ　生理学的に許容される希釈剤 及びハイブリドーマＰＭＩ−１又はＰＭＩ−２から生産される、インビボ指示手 段と結合した抗ＧＰＩｌｂ−ｍａ抗体分子を含む、効果量のモノクローナル抗体 組成物を被検者に静脈注射する； （ｂ）　抗体分子がインビボでフィブリノーゲン結合血小板と免疫反応し、かつ 、免疫反応産物が生成されるのに十分な、予め決められた時間、被投与者を維持 する； （Ｃ）　ステップ（ｂｌで生成した免疫反応産物の存在を検出する、以上ｉａ） 〜（ｅ）のステップを含む方法が考案されている。

特異的に結合した細胞表面レセプター及びリガンドを含む血液中のレセプター− リガンド複合体の存在を検定する、キット型の診断システムも考案されており、 そのシステムには、ｌａｌ　少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量の、該 レセプター−リガンド複合体と免疫反応するが、非結合形の細胞表面レセプター もしくはりガントとは免疫反応しない抗体分子を含むモノクローナル抗体組成物 を含有するパンケージ、が含まれている。

特異的に結合した細胞表面レセプター及びリガンドを含む細胞レセプター−リガ ンド複合体の存在を、インビボで検出するための、キット型の診断システムが考 案されており、そのシステムには、 （ａ）　少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量の、該レセプター−リガン ド複合体とは免疫反応するが、非結合型の細胞表面レセプターもしくはリガンド とは免疫反応しない、インビボ指示手段と結合した抗体を含むモノクローナル抗 体組成物を含むパフケージ、 が含まれている。

ＧＰＵｂ−■ａミーリガンド合体を発現する血小板の存在について、血液サンプ ルを検定するための、キット型の診断システムが考案されており、そのシステム には、（ａ）　少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量の、ハイブリドーマ ＰＭＩ−１又はＰＭＩ−２から生産された抗ＧＰＩＩｂ−ｍａの抗体分子を含む パフケージ、 が含まれている。

インビボで血栓の存゛在を検定するための、キット型の診断システムも考案され ており、それには、 （ａ）　少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量の、ハイプリドーマＰＭＩ −１又はＰＭＩ−２から生産される、インビボの指示手段と結合した、抗ＧＰＩ Ｉｂ−ｎｌａ抗体分子を含むパッケージが含まれている。

さらに、現在、血小板ＧＰｎｂ−ｍａ−リガンド複合体は、ハイブリドーマＰＭ ｌ−１及びＰＭＩ−２によって生産される抗体分子によって認識される、２個の 潜在的抗原決定基型ＬＩＢＳを発現することが分っている。さらに、モノクロー ナル抗体ＰＭＩ−１により認識される潜在的決定基を真似ることができるポリペ プチドがインビボで、潜在的決定基を形成しているＧＰＩｌｂタンパク質の一部 をコードするＤＮＡ配列から誘導されている。

従って、本発明は、第１図に示される、残基約５０番から約１４０番のアミノ酸 残基配列を有するＧＰＩＩｂタンパク質の一部をコードする構造遺伝子を定義し ている配列を含むせいぜい約１２０００個のヌクレオチド塩基対を含むＤＮＡ断 片を考案している。

別の態様においては、第１図における残基約５０番から約１４５番までの、アミ ノ酸残基配列を有する、Ｇ　Ｐ　Ｉｌ　ｂタンパク質の一部をコードする構造遺 伝子を定義しているＤＮＡ断片と機能的に結合したベクターを含む組換えＤＮＡ 分子も考案している。

さらに、せいぜい約５０アミノ酸残基を含み、かつ、式％式％ で表わされるアミノ酸残基配列を含む、ｈＧＰＩｌｂ潜在的決定基ポリペプチド アナログも考案している。

また、ファブリノーゲン結合血小板と免疫反応する抗体分子を生産する、ＰＭＩ −１及びＰＭＩ’−２と命名されたハイブリドーマも考案している。

ファブリノーゲン結合血小板と免疫反応する、バイプリドーマＰＭＩ−１により 生産される抗体分子を含む、モノクローナル抗体組成物を考案している。

（図面の簡単な説明） 第１図は、ＧＰｎｂの前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡのヌクレオ チド配列及び相当するアミノ酸残基配列を示しており、そこでのヌクレオチド配 列は、塩基１番から１１０４番まで連続して表わされている様に、−文字ヌクレ オチド塩基コードを用いて左から右に、５′末端から３′末端の方向で示されて いる。アミノ酸残基配列は、アミノ末端の残基１番（Ｒ）から、カルボキシ末端 の残基２２７番（Ｓ）まで連続して示されているように、−文字アミノ酸残基コ ードを用い、左から右へ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向で表わされてい る。

読み枠は、ヌクレオチド配列の下の誘導されるアミノ酸配列の位置で示されてお り、各アミノ酸残基を示す一文字は対応するコドンの第１塩基の下に位置してい る。

ｐ１２９−１４５と命名されるポリペプチド及びｐＨ４−１５６と命名されるポ リペプチドに対応するアミノ酸残基配列の、ｃｐｎｂ前駆体タンパク質中の位置 は、各々、大小のボックスで示した。ｐ１９−３４及びｐ　５３−６５と命名さ れたポリペプチドの位置は各々、二重又は一本の下線で示されている。ＧＰＩＩ ｂの軽鎖に対し、提唱されているアミノ末端のアミノ酸残基配列は、点線で示し 、矢印は、ＧＰＩ［ｂの重鎖及び軽鎖を作る潜在的切断部位を示している。

第２図は、血小板に結合する抗体ＰＭＩ−１に関するポリペプチドｐ１２９−１ ４５の影響を示すグラフである。血小板に、５１濃度となるようＥＤＴＡを混ぜ 、ｈＧＰＩｌｂ上のＰＭＩ−１，ｍピトーブを十分に露出させる。その後、この 血小板を０〜１００マイクロモル濃度（μＭ）の範囲の種々の濃度のポリペプチ ドｐ１２９−１４９及び１２５１ラベル化ＰＭＩ−１抗体と、例９で説明するよ うに混合した。血小板に結合した１２５１ラベル化ＰＭＩ−１の割合を、検定物 に加えたポリペプチド濃度に対してプロットした。

第３図は、例１０で説明されるように測定された刺激を受けたファブリノーゲン 結合血小板上のＰＭＩ−１エピトープの露出を示したものである。

（１）刺激なし、（２）５μＭ　ＡＤＩ’による刺激又は（３）５０μＭエペネ フリンによる刺激、条件下、ファブリノーゲン結合血小板と免疫反応する１２Ｊ ラベル化ＰＭＩ−１量を測定し、５ｍＭ　ｌ０ＴＡ存在下、非刺激血小板と免疫 学的に結合する”’Ｉ−ＰＭＩ−１量に対する割合として発現した。

第４図は、例１１で説明されるような、血小板凝集に関する、ポリペプチドｐ１ ２９−１４５及びｐ１４４−１５６の影響を示したレコーダの写しである。時間 （分）に対する透過率をリニアー・プロットで示してあり、１００パーセント透 過は最高の血小板凝集を示している。パネルＡは、タイロード（Ｔｙｒｏｄｅ’ 　ｓ）バッファ中の富血小板血漿（ＰＲＰ）のコントロール溶液（破線）及びさ らに、１ｍＭポリペプチドｐ１２９−１４５を含むＰＲＰ　（実線）の透過率を 描いである。パネルＢは、コントロール溶液（破線）及びさらに１ｍＭポリペプ チドｐ１４４−１５６を含むＩ）　ＲＰ（実線）の透過率を描いである。

第５図は、血小板ＧＰＩＩｂ−１ｉｒａによる、２個の別々のリガンド誘導結合 部位の発現を示すグラフである。各Ｌ　Ｉ　Ｂ　Ｓは、アミノ酸残基配列ＲＧＤ Ｓを有するポリペプチド型のりガントとの特異的結合による誘導により、ＧＰＩ Ｉｂ−ｍａリガンド（ＧＰＩＩｂ−ポリペプチド）複合体を形成する０種々のポ リペプチド濃度によるＬＩＢＳ発現率は例１３Ａで説明されているように測定し た。

（発明の詳細な説明） のちのである、標準的ポリペプチド命名法に従かい（ジャーナル・オプ・バイオ ロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）　２４３　。

３５５７−５９　（１９６９）、アミノ酸残基の略号は、下記の対応表に示した 。

対　応　表 記　号　アミノ酸 Ｆ　Ｐｈｅ　フェニルアラニン Ｍ　Ｍ　ｅ　ｔ　メチオニン Ｓ　Ｓｅｒ　セリン １　１１ｅ　イソロイシン Ｌ　Ｌｅｕ　ロイシン Ｔ　Ｔｈｒ　スレオニン Ｖ　Ｖａｌ　バリン Ｐ　Ｐｒｏ　プロリン Ｋ　Ｌｙｓ　リジン ＨＩｔｓ　ヒスチジン Ｑ　Ｇｌｎ　グルタミン Ｅ　Ｇｌｕ　グルタミン酸 Ｗ　Ｔｒｐ　トリプトファン ＲＡｒｇ　アルギニン Ｄ　Ａｓｐ　アスパラギン酸 Ｎ　Ａｓｎ　アスパラギン ＣＣｙｓ　システィン ここでは、全てのアミノ酸残基配列が左から右にアミノ末端からカルボキシ末端 の、伝統的に用いられている方向の式で表わされていることに注意しなければな らない、さらに、アミノ酸残基配列の始めと終りのダッシュは、ポリペプチド鎖 中の１つ以上で全部で約５０残基までの配列につながる結合を示していることに も注意しなければならない。

ポリペプチド及びペプチド；ポリペプチド及びペプチドはここでは同等に用いら れている語で、隣り合うα−アミノ基とカルボキシル基の間のペプチド結合によ り互いに連結しているせいぜい約５０個の連続するアミノ酸残基を示している。

タンパク質；ここで用いられているタンパク質という語は、ポリペプチドのよう に互いに連結している連続した５０個以上のアミノ酸残基を示している。

ヌクレオシド及びヌクレオチド；糖部分（ペントース）、リン酸、及び窒素へテ ロ環塩基からなる、ＤＮＡ及びＲＮＡの単量体ユニット。この塩基は、グリコシ ド炭素（ペントースの１′炭素）を介して糖部分に結合しており、この塩基と糖 との組合せてヌクレオシドという、このヌクレオシドが、そのペントースの３′ 位又は５′位に結合したリン酸基を含むとき、これをヌクレオチドと呼ぶ。

塩基対（ｂｐ）　；二本鎖ＤＮＡ分子中のアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、また はシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の水素結合の組合せ。

レセプター：ここで用いているレセプター及びレセプタータンパク質とは他の分 子に特異的に結合する生物学的に活性なタンパク質性分子を示している。

リガンド及び同種リガンド：リガンドとは、特別なレセプタータンパク質と特異 的相互作用によって結合する構造部分を含む分子を意味する。

リガンド誘導結合部位（ＬＩＢＳ）；ＬＩＢＳとは、細胞表面レセプター−リガ ンド複合体によっては発現されるが、非占有レセプター又は未結合リガンドによ っては発現されないネオ抗原決定基のことである。ＬＩＢＳは、“構造的”なも のと“配列的”なものがある、ＬＩＢＳは、リガンド結合により誘導されるレセ プターの特異的修正の結果、すなわち１潜在的抗原決定基゛であり、またこれは 、レセプター−リガンド接触部位でのレセプターとりガントアミノ酸残基の組合 せによって形成される。

潜在的抗原決定基ジ同種（特異的）リガンドとの結合により、レセプタータンパ ク質の構造又は膜表面配位方向の変化によって生じたネオ抗原決定基を意味する 。ここで述べているレセプタータンパク質は、通常、このレセプターが特異的に リガンドと結合しないかぎり、潜在的抗原決定基を発現しない。

Ｂ、ＤＮＡ断片 生物において、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸残基配列は直接、このタ ンパク質をコードする構造遺伝子のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と遺伝子コード を介して直接対応している。従って、構造遺伝子は、それがコードするアミノ酸 残基配列、すなわちタンパク質又はポリペプチドで定義することができる。

遺伝子コードでよく知られており重要な性質は、その縮退である。すなわち、タ ンパク質を作る全んどのアミノ酸について、１つ以上のコードヌクレオチドトリ プレット（コドン）が、１つのアミノ酸残基をコード、もしくは指定している。

それゆえ、特別のアミノ酸残基配列を、多種のヌクレオチド配列がコードしうる 。

このようなヌクレオチド配列は、全ての生物において、同じアミノ酸残基配列の 生産を起こすことから、機能的には等価と考えることができる。場合によっては 、プリン又はピリミジンのメチル化体も、ヌクレオチド配列中に組込まれている こともある。しかし、これらメチル化は、コード関係になんら影響を与えること はない。

本発明のＤＮＡ断片には、ｃｐｎｂ関連アミノ酸残基配列、すなわちｃｐｍｂ関 連タンパク質を含むタンパク質をコードする構造遺伝子が含まれる。ＧＰＩ［ｂ 関連アミノ酸残基配列は、第１図の約５０番から約２２７番で示される、アミノ 酸残基配列の１部と相同的、好ましくは同一の、少な（とも約１０残基の配列で ある。

本発明のＤＮＡ断片には、第１図の残基約５０番から約１４５番で示されるアミ ノ酸残基配列をコードするＤＮＡ配列が含まれる。別の態様においては、第１図 の残基約５０番から約２２７番で示されているアミノ酸残基配列をコードするＤ ＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を考案している。また、第１図の残基約１４６番から 約２２７番で示されているアミノ酸残基配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮ Ａ断片も考案している０本発明のＤＮＡ断片は、第１図の残基約１番から約２２ ７番で示されるアミノ酸残基配列をコードしていることが望ましい、ＤＮＡ配列 は、上述のアミノ酸残基配列中のアミノ酸残基をコードするコドンが連続して存 在する、すなわちＤＮＡ配列がイントロンを含まないことが望ましい。

基本的に第１図の塩基約１４８番から約４３５番で示されるヌクレオチド配列か らなるＤＮＡ断片も、本発明の１態様を構成している。基本的に、第１図の塩基 約１４８番がら約４３５番で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片は、 本発明の別の態様を構成している。基本的に本発明のＤＮＡ断片が第１図の塩基 約１番から約１１０４番で示されるヌクレオチド配列からなることが好ましい。

ｃｐｎｂ関連アミノ酸残基配列をコードする本発明のＤＮＡ断片は、化学的技術 、例えばマチュウシ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）等（ジャーナル・オブ・アメリカン ・ケミカル・ソサイアティ（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ。

Ｓｏｃ、）　１０３．３１８５　（１９８１））のホスホトリエステル法によっ て容易に合成することができる。もちろん、コード配列を化学的に合成すること によって、天然のアミノ酸残基配列をコードするものを適当な塩基に置換するこ とによって、望ましい修正を容易に行うこ牛ができる。しかし、第１図に示した ものと全く相同的な配列を含むＤＮＡ分子であることが望ましい。

さらに、基本的に、ｃｐｎｂ関連タンパク質をコードする構造遺伝子からなるＤ ＮＡ断片は、これらの遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子から得ることができる０例 えば、プラスミド型組換えＤＮＡＮＡ分子Ｌ−４１は、第１図に示したＤＮＡ配 列を含み、従って、第１図の残基１番から２２７番で示されるアミノ酸残基をコ ードしている。ＨＥＬ−４１でトランスホームした大腸菌（Ｅ。

ｃｏ　１　ｆ）培養物を、ブダペスト条約要請事項に従がい、１９８７年７月７ 日、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（２０８５２ 、ＭＤ州、ロックビル、バークローン・ドライブ、１２３０１）に登録し、受理 番号６７４５６号を割当てられた。

ｃｐｎｂ関連アミノ酸残基配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を、従 来法に従がい、上記登録のプラスミド由来の適当な制限断片を機能的に結合（ラ イゲーション）することＬこより作ることができる。

典型的に、このようにして作った本発明のＤＮＡ分子は、粘着末端、すなわち、 この分子の二本鎖部分を越えて伸びる“突出した”一本鎖部分を有している。本 発明のＤＮＡ分子上の粘着末端が存在することは好ましいことである。

また、上記ＤＮＡ断片と等価なリボ核酸（ＲＮＡ）も本発明で考案されている。

Ｃ１組換えＤＮＡ分子 本発明の組換えＤＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ断片にベクターを機能的に結合す ることにより作ることができる。

ここで用いられるように、”ベクター”という語句は、細胞中で自己増殖可能な りＮＡ分子を意味し、別のＤＮＡ断片を機能的に結合することにより、その付随 する断片の複製をもたらすことができるものである。ＧＰＩＩｂ関連アミノ酸残 基配列を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を司るベクターを、ここで は“発現ベクター”と呼ぶ、従って、組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）は、天然で は、通常−緒に発見されることはない、少なくとも２つのヌクレオチド配列を含 むハイブリットＤＮＡ分子である。

本発明のＤＮＡ断片が機能的に結合するベクターの選択は、この分野でよく知ら れているように、望ましい機能的性質、例えばタンパク質の発現及びトランスホ ームされる宿主細胞に直接依存し、これらは、組換えＤＮＡ分子を構築する分野 において本質的な制限となっている。しかし、本発明で考案されているベクター は、機能的に結合されたＤＮＡ断片中に含まれるＧＰＩＩｂ関連アミノ酸残基配 列を有するタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも複製、そして好ましくは 発現も司ることができる。

好ましい態様において、本発明で考案されたベクターは、原核性レプリコン、す なわち、バクテリア宿主細胞のような原核性宿主細胞において、染色体外で組換 えＤＮＡ分子を自己複製及び維持を司ることができる能力を有するＤＮＡ配列を 含んでいる。このようなレプリコンは当分野ではよく知られているものである。

さらに、原核性レプリコンを含む、これらの態様は、それでトランスホームした バクテリア宿主に薬剤耐性を付与する遺伝子も含んでいる。典型的なバクテリア の薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン又はテトラサイクリン耐性を付与するもので ある。

原核性レプリコンを含む、これらベクターは、大腸菌のようなバクテリア宿主細 胞をトランスホームすることで、ＧＰＩＩｂ関連アミノ酸残基配列をコードする 遺伝子の発現（転写及び翻訳）を司る原核性プロモーターも含む、プロモーター とは、ＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写を可能とするＤＮＡ配列によって形成 される発現コントロール要素である。バクテリア宿主に適合するプロモーター配 列は一般的に、本発明のＤＮＡ断片の挿入のための、簡便な制限部位を含むプラ スミドベクター中に提供されている。

このようなベクタープラスミドの典型例には、バイオ・ラド・ラボラトリ−（Ｃ Ａ州、リッチモンド）から市販されているＰｕＯ２、ＰｕＯ９、ｐＢＲ３２２及 びｐＢＲ３２９、及びファルマシア（ＮＪ州、ピスカタウェイ）から市販されて いるｐＰＬ及びＰＫＫ２２３がある。

真核性細胞好ましくはを推動物細胞に適合する発現ベクターは、本発明の組換え ＤＮＡ分子を生成するのに用いることができる。

真核性細胞発現ベクターは、当分野でよく知られており、また、いくつかの販売 元から市販されている。典型的に、このようなベクターは、望ましいＤＮＡ断片 の挿入するために便利な制限部位を含むものが提供されている。このようなベク ターの典型例には、ｐＳＶＬ及びｐＫＳＶ−１０（７ｙルマシ７）　、ｐＢＰＶ −１／ｐＭＬ２ｄ　（インターナショナルバイオテクノロジーズ）及びｐＴＤＴ Ｉ　（ＡＴＣＣ，＃３１２５５）がある。

好ましい態様において、本発明のｍ換えＤＮＡ分子を構築するのに使用される真 核細胞発現ベクターは、真核細胞中で効果的な選択マーカー、好ましくは、薬剤 耐性選択マーカーを含んでいる。

好ましい薬剤耐性マーカーは発現によりネオマイシン耐性となる遺伝子、すなわ ち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である。サウザー ン（Ｓｏｕ　ｔｈｅｒｎ　）等、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・ア プライド・ジエネティクスＤ。

Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、）上、３２７−３４１　（１９８２）。

本発明のｒＤＮＡを生成するのにレトロウィルス発現ベクターを用いることも考 案している。ここで用いているように“レトロウィルス発現ベクター”という語 句は、レトロウィルス・ゲノムのロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）由来 のプロモーター配列を含むＤＮＡ分子を意味する。

好ましい態様における、典型的な発現ベクターは、好ましくは、真核細胞中で複 製不能なレトロウィルス発現ベクターである。レトロウィルスベクターの構築を 使用例がソーツ（Ｓｏｒｇｅ）等（モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロ ジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、）土、１７３０−３７　（１９８４） によって報告されている。

相補的粘着末端を介して、ベクターにＤＮＡを機能的に結合する多くの方法が開 発されてきている０例えば、相補的ホモポリマー鎖を、挿入するＤＮＡ断片及び ベクターＤＮＡに付加することができる。それから、この相補的ホモポリマー末 端間の水素結合により、このベクター及びＤＮＡ断片を結合し組換えＤＮＡ分子 を生成する。

１つ以上の制限部位を含む合成リンカ−は、ＤＮＡ断片とベクターを結合する別 法を提供する。先に説明したように、エンドヌクレアーゼによる制限消化により 生じたＤＮＡ断片を３’　−５’エクソヌクレアーゼ活性により、突出する３′ 一本鎖末端を除去し、また重合活性により、窪んだ３′末端を充填する酵素であ る、バタテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ又は、大腸菌ＤＮＡポリメラー ゼＩで処理する。それゆえ、これら活性の組合せは、平滑末端ＤＮＡ断片を生ず る。それから、この平滑末端断片をバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ等の 平滑末端ＤＮＡ分子のライゲーションを触媒しうる酵素の存在下、大過剰のリン カ−分子とインキュベーションする。このようにしてできた反応産物は、その末 端に重合リンカ−配列をもつＤＮＡ断片である。これらＤＮＡ断片を適当な制限 酵素で切断し、このＤＮＡ断片の末端に適合する末端を生ずる酵素で切断した発 現ベクターにライゲーションする。

多くの制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカ−は、ＣＮ州、ニュヘブン のインターナショナル・バイオチクノロシーズ社を含む多くの業者から市販され ている。

本発明は、上述の組換えＤＮＡ分子と等価なＲＮＡも考案している。

Ｄ、）ランスホームした細胞及び培養 また、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子でトランスホームした宿主にも関連 している。宿主細胞は原核性のことも、真核性のこともある。バクテリア細胞が 原核性宿主細胞であることが好ましく、また典型的には、ＭＤ州、ペセスダ、ベ セスダ州−４、ラボラドリース社から市販されている大腸菌ＤＨ５株のような大 腸菌株である。好ましい真核性宿主細胞には、イースト及び好ましくは、マウス 、ラット、サル又はヒトの繊維芽細胞系列由来のもの等のを椎細胞などホ乳類細 胞が含まれる。好ましい真核性宿主細胞には、ＣＣＬ６１のようなＡＴＣＣから 入手できるチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びＣＲＬ１６５８の ようなＡＴＣＣから入手できるＮ　Ｉ　Ｈスイスマウス胎児細胞ＮＩＨ／３Ｔ３ が含まれる。

好ましいトランスホーム化細胞系列とは、組換えＤＮ八へ子ＩＩＥＬ−４１を含 む大腸菌であり、その培養物ば、１９８７年７月７日、ＭＤ州、ロックビル、ア メリカン・ティシュ・カルチャー・コレクション＜ＡＴＣＣ）に登録され、受理 番号６７４５６が割当てられた。

本発明の組換えＤＮＡ分子による、適当な宿主細胞のトランスホーメーションは 、典型的には、使用するベクターのタイプに依存する、従来法によって行なわれ る。原核性宿主細胞のトランスホーメーションに関しては、例えば、コーエン（ Ｃｏｈｅｎ）等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ イエンス　（Ｐｒｏｃ、Ｎａ１ｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、６　９　、 ２　１　１　０　（１９７２）　、及ヒマニアチス（ＭａｎｉａＬｉｓ）　等、 モレキュラー・クローニング、ラボラトリ−マニュアル、コールドスプリングハ ーバ−ラボラトリ−、コールドスプリングハーバ−１ＮＹ州、＜１９８２）参照 。

ｒＤＮＡを含むレトロウィルスベクターによるを推動物細胞のトランスホーメー ションに関しては、例えば、ソーダ（Ｓｏｒｇｅ）等、モレキュラー−アンド・ セルラーバイオロジー（Ｍｏｌ、　Ｃｅ１ｌ。

（Ｗｉｇｌｅｒ）等、プロシーディンゲス・イン・ナショナル・アカデミ−・オ ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　）　Ｕ　Ｓ　 Ａ　。

７６．１３７３−７６　（１９７９）参照。

うまくトランスホームした細胞、すなわち、本発明の組換えＤＮＡ分子を含む細 胞は、従来法により同定することができる。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入に より生じた細胞をクローン化し、モノクローナルコロニーを作ることができる。

これらのコロニー由来の細胞を収穫し、溶解してから、そのＤＮＡ含有物につい て、サウザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）　（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ イオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．１３ｉｏ１．）９影、５０３　（１９７５））及び ベレント（Ｂｅｒｅｎｔ）等（バイオテクノロジー（ＢｉｏＬｅｃｈ）、３，２ ０８（１９８５））によって報告されているような方法を用い、「ＤＮＡの有無 を試験した。

ｒＤＮＡの存在の直接的検定に加えて、ｒＤＮＡがＧＰｎｂ関連タンパク質を発 現できる場合、トランスホーメーションは、従来の免疫学的方法で確めることが できる。例えば、発現ベクターでうまくトランスホームした細胞は、ＧＰｎｂ抗 原性を示すタンパク質を生産する。トランスホームされた細胞サンプルを収穫し 、本発明のハイブリドーマによって生産されるような、抗原に特異的な抗体を用 いて、ＧＰＩＩ関連タンパク質を検定した。

このように、トランスホームした宿主細胞自身に加え、本発明は、栄養培地中の 、これら細胞培養物、好ましくはモノクローナルな（クローン的に均一な）培養 物、又は、モノクローナルな培養物由来の培養物も考案している。またこの培養 物は、ｃｐｎｂ抗原性を示していることが好ましい。

トランスホームした宿主細胞を培養するために有用な栄養培地は当分野でよ（知 られているものであり、いくつかの販売業者から市販されている。宿主細胞がホ 乳類細胞である態様の場合、“無血清”培地を用いることが好ましい。

Ｅ、Ｃ，ＰＩＩｂ関連タンパク質の生産方法本発明のもう１つの特徴に、ｃｐｎ ｂ抗原性を示すタンパク質の生産方法がある。ｃｐｎｂ抗原性を示すタンパク質 は、天然のｃｐｎｂで誘導される抗体と免疫反応するタンパク質である。ＧＰｎ ｂ抗原性を示すタンパク質は、抗原として、及び抗体を生じさせるものとして有 用であり、それらの各々は、本発明の診断システム及び診断方法に用いることが できる。

本方法には、ｃｐｎｂ関連アミノ酸残基配列をコードする遺伝子を遺伝子を発現 できる本発明の組換えＤＮＡ分子でトランスホームした、宿主細胞、好ましくは ヒトの細胞を含有する栄養培地を含む培養の開始を伴う、この培養を、そのトラ ンスホームした細胞がＧＰｎｂ関連アミノ酸残基配列を含むタンパク質を発現す るのに十分時間維持する。その後発現したタンパク質を培養物から回収する。

培養物から発現したタンパク質を回収する方法は、当分野ではよく知られている ものであり、従来の生化学的技術を用いた培養物のタンパク質含有成分の分画が 含まれる９例えば、タンパク質を分画するのによ（知られている、ゲル口過、ゲ ルクロマトグラフィー、限外口過、電気泳動法、イオン交換、アフィニティーク ロマトグラフィー等の方法が培養物中に存在する発現タンパク質を単離するのに 用いることができる。さらに、免疫親和性、免疫吸着等の免疫学的方法も従来の 方法を用いて行なわれる。

せいぜい約５０個のアミノ酸残基までの、以後特別に列挙する配列に付加する、 本発明のポリペプチド中に存在するアミノ酸は、以後議論されているようなポリ ペプチドの基本的かつ新規な特性に実質的に影響を与えない残基である。このよ うな付加残基は、通常、列挙したポリペプチドの一端又は両端に付加しており、 列挙したポリペプチド配列の反復及び部分的反復も含むことがある。

Ｆ、ポリペプチド 本発明のポリペプチドは、せいぜい約５０個、より通常には約３５個以下、そし て、好ましくは、約２５個以下のアミノ酸残基配を含み、少なくとも、約１０個 の残基を含む、さらに、本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸残基配列及び新 しい機能性を特徴としている。

１、Ｍ；ＰＩ［ｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログ広く言うと、本発明の１態 様は、ＲＤＧ結合結合細胞粘着タンパクチルファサブユニットの重鎮により発現 される潜在的抗原決定基を真似るアミノ酸残基配列を含むポリペプチドを考案し ている。潜在的決定基ポリペプチドアナログのアミノ酸残基配列は、サイトアト へシンのアルファサブユニットの重鎮の約１５個のカルボキシ末端アミノ酸残基 の配列に対応している。

好ましいサイトアトへシンのアルファサブユニット重鎮潜在的決定基ポリペプチ ドアナログは、ｈｃｐｎｂがフィブリノーゲンと結合した時に形成される、ｈｃ ｐｎｂ滑在的決定在的決定基る。

好ましい態様において、ｈｃｐｎｂ？ａ在的決定基ポリペプチドアナログは、第 １図のアミノ酸残基１３７〜１４５番を表わす、次のアミノ酸残基配列、 −ＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ　− を少なくともも含んでいる。

さらに、ｈｃｐｎｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログは、少なくとも、第１図 のアミノ酸残基配列１２９〜１４５番を表わしている、次のアミノ酸残基配列、 −ＰＳＰＳＰＩＨＰＡＨＩ（ＫＲＤＲＲＱ−を含むことが好ましい。

ｈＧＰＩＩｂｉｆ在的決定基アナログには、第１表に示されるアミノ酸残基配列 を含むことが望ましい。

第１表 名　称　アミノ酸残基配列 ｐ１３６−１４５　ＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱｐ１３３−１４５　ＰＩ）ＩＰＡＨＨ ＫＲＤＲＲＱｐ１３１−１４Ｓ　ＰＳＰＩＨＰＡＨＨＸＲＤＲＲＱｐ１２９−１ ４Ｓ　ＰＳＰＳＰＩＨＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱａ、各ポリペプチドの名称は、第１ 図において、含有されるアミノ酸残基配列を表わしている。

第１表に示したポリペプチドは、さらに、ｈｃｐｎｂがＧＰＩＩｂ〜ｍａ／フィ ブリノーゲン複合体として存在するとき、以下に延べるように、ＰＭＩ−１抗体 分子とｈｃ；ＰＩＩｂとの結合を中和する（競合的に阻害する）能力により特徴 づけられた。

ここで用いる語“複合体”は、抗体−抗原又はレセプター−リガンド反応のよう な特異的結合反応産物を意味する０代表的複合体には、免疫反応産物、ＧＰＩＩ ｂ−ｍａ−フィブリノーゲン結合反応産物及びサイトアドヘシンーリガンド結合 反応産物がある。

好ましい態様において、ｈａｐｎｂ潜在的決定基アナログは、さらに、フィブリ ノーゲン結合血小板の凝集を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる。フ ィブリノーゲン結合血小板凝集を阻害しうる代表的ｈＧＰＩ［ｂ潜在的決定基ア ナログは、ポリペプチドｐ１２９−１４５がある。

本発明のｈｃｐｎｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログは、フィブリノーゲン結 合血小板凝集を競合的に阻害し、そして、または、以下に延べるように、ｈＧＰ ＩＩｂがＧＰＩＩｂ−ｍａ／フィブリノーゲン複合体として存在する時、ＰＭＩ −１抗体分子のｈｃｐｕｂへの結合を競合的に阻害する限り、ｈｃｐｎｂのアミ ノ酸残基配列と同一である必要はないことが理解されなければならない、それゆ え、ｈｃｐｎｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログは、保存的であれ、非保存的 であれ、挿入、欠失及び置換のような種種の変化を受けることが可能で、そのよ うな変化はその使用に隙し、ある利点を提供することもある。

保存的置換とは、１つのアミノ酸が別の、生物学的に同様な残基に置き換るもの である。保存的置換の代表例には、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオ ニンなどの疎水性残基の間の置換又は、アルギニンとリジン、グルタミン酸とア スパラギン酸、グルタミンとアスパラギンなとの極性残基の間の置換などが含ま れる。“保存的置換”という語句もそのようなポリペプチドが必要とされる結合 活性を示すなら、未置換の元のアミノ酸の代りに置換したアミノ酸を使用するこ とも含まれる。

本発明のポリペプチドが、１つ以上の保存的又は非保存的置換が起っているため 、ｈｃｐｎｂの配列と同一ではない配列を存しているとき、本発明のポリペプチ ドが簡便にラベル又は固体マトリクス又は抗原性キャリヤーに固定できるように 、“リンカ−“を提供する目的でその末端に付加的残基が付加される場合を除い て、通常多くとも約２０％、より普通には、多くて１０％のアミノ酸残基が置換 される０本発明のポリペプチドに使用できるラベル、固体マトリクス及びキャリ ヤーは以下に説明する。

通常、アミノ酸残基リンカ−は、少なくとも１残基で、４０残基以上のこともあ るが、普通には１個乃至１０個の残基からなる。

リンカ−に用いる典型的アミノ酸残基は、チロシン、システィン、リジン、グル タミン酸及びアスパラギン酸などである。さらに、本発明のポリペプチド配列は 、例えばアセチル化などの末１ＮＨｚアシル化又は例えばアンモニア、メチルア ミンその他の、チオクリコール酸アミデージョン、末端カルボキシアミデージョ ンによる修飾を受けることによる天然の配列と異なるものであることもありうる 。

リンカ−を介してキャリヤーに結合し、当分野でキャリヤー−ハブテン結合体と して知られているものを形成する場合、本発明のｈｃｐｎｂ潜在的決定基ポリペ プチドアナログは、ｈＧＰＩＩｂが血小板会合ＧＰＩ［ｂ−Ｉ［Ｉａ／フィブリ ノーゲン複合体として存在するとき、ｈｃｐｎｂと免疫反応する抗体を誘導する ことができる。免疫学的交叉反応性に関する確立された原則からみて、本発明は 、ポリペプチドｐ１２９−１４９の抗原的関連変異体を考案している。′抗原的 関連変異体”とは、ポリペプチドｐ１２９−１４５の少なくとも６個のアミノ酸 残基配列部分を含み、かつ、ｈｃｐｎｂが、血小板会合ＧＰＩＩｂ−１［［ａ／ フィブリノーゲン複合体として存在するとき、ｐ１２９−１４５及びｈｃｐｎｂ と免疫反応する抗体分子を誘導することができるポリペプチドのことである。

２、　１ＧＰＩ［ｂポリペプチド 別の態様において、本発明は、第１図のアミノ酸残基１４４〜１５６番で示され る次のアミノ酸残基配列−ＲＱＩＦＬＰＥｒ’ＥＱＰＳＲ− を少なくとも含んでいるＩＧＰＩＩｂポリペプチドを考案している。

さらに、ＩＧＰｎｂポリペプチドは、Ｉ　Ｇ　））　ＩＩ　ｂとは免疫反応する がｈＧＰＩｌｂとは免疫反応しない抗体分子を誘導することができる特徴を有す る。ｐ１４４−１５６と命名される、好ましいＩＧＰＩＩｂポリペプチドは、次 の式 ％式％ で表わされるアミノ酸残基配列を有している。

本発明のｈＧＰｎｂ及びＩＧＰＩ［ｂポリペプチドの両方とも当分野でよく知ら れている技術で合成することができる。使用できる技術の秀れた概要が、Ｊ、Ｍ 、スチワード（Ｓｔｅｗａｒｄ）及びｊ。

Ｄ６　ヤング（“固相ペプチド合成”、Ｗ、　Ｉ−１，フリーマン社、サンフラ ンシスコ、１９６９）及びｊ、メイエンホーフ７−　（Ｍｅｉｅｎ−ｈｏｆｅｒ ）　（“ホルモンタンパク質及びペプチド、２巻、４６頁、アカデミツクブレス 版にニーヨーク）、１９８３年）によって固相法について、及びＥ、シコローダ −（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ）及びに、タブケ（Ｋｕｂｋｅ　）　（“ペプチド”　１ 巻、アカデミツクブレス版にニーヨーク＞、１９６５年）によって、古典的溶液 合成について、まとめられている。

Ｇ、接種物 別の態様において、本発明のポリペプチドもしくは、その抗原的関連変異体を、 薬学的に許容しつる水性希釈組成物中で用いて、その効果的投与したとき、ｈＧ ＰＩｌｂと免疫反応する抗体を誘導できる接種物を作った。

種々の文法型の“接種物”という語は、Ｇｌ”’Ｉｔ　ｂの重鎮又は軽鎖に対す る抗体の調製に用いられる活性成分として、本発明のポリペプチドを含む組成物 を示して用いている。

ポリペプチドを抗体の誘導に用いる時、このポリペプチドは単独、又は結合体と して、キャリヤーに結合して、又は、ポリペプチドポリマーとして使用されるこ とを理解すべきであるが、発現の簡便性のため、本発明の種々の態様においては 、集約的に“ポリペプチド”又は、その種々の文法型のものを、その意味・で用 いている。

約３５残基以下のアミノ酸を含むポリペプチドは、すでに延べてきたように、抗 体の産生を誘導する目的には、キャリヤーに結合したペプチドを使用することが 好ましい。

すでに延べてきたように、１個以上の付加的アミノ酸残基をポリペプチドのアミ ノ及びカルボキシ末端に付加して、そのポリペプチドのキャリヤーへの結合を助 けることができる。ポリペプチドのアミノ及びカルボキシ末端へ（＝Ｊ加したシ スティン残基は、ジスルフィド結合を介した結合体を作る上で特に有用なもので あることが分っている。しかし、結合体を作るための、当分野でよく知られてい る他の方法も、使用するこ２ができる。代表的付加結合操作には、グルタルアル デヒドのようなジアルデヒド、ミカエル付加の使用（クリプスタイン（Ｋｌ　１ ｐｓＬｅｉｎ）等、ジャーナル・オブ・インフェクシャスデシーズ（Ｊ、　Ｉｎ ｆｅｃｔ６ロｉＳ、）１４７．３１８−３２６　（１９８３）もしくは、水溶性 カルボジイミドを使用して、キャリヤーへのアミド結合を生成するような、カル ボジイミド技術の使用が含まれる。タンパク質結合体もしくは、活性化官能基を 介しての結合のレヴユーについては、オーラメアス（八ｕｒａｍｅａｓ）等のス カンジナビアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｓｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、　）　８　、袖１．７．７〜２３　（１９７８）を参照せよ。

有用なキャリヤーは当分野ではよく知られており、一般にタンパク質それ自体で ある。これらキャリヤーの代表例には、キーホールリンペット・ヘモシアニン（ ＫＬＨ）　、エデスチン、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）もし くは、ヒト血清アルブミン（Ｈ３Ａ）などのアルブミン、ヒツジ赤血球（ＳＲＢ Ｃ）のような赤血球、テタナス、トキソイド、コレラトキソイド及びポリ（Ｄ− リジン：Ｄ−グルタミン酸）などのポリアミノ酸などがある。

キャリヤーの選択は、その接種物の最終的使用により依存し、本発明に特に関係 しない事項に基づいている０例えば接種を受ける動物において、不都合な反応が 起こらないキャリヤーを選択すべきである。

本接種物には、典型的には、キャリヤーに結合した結合体として、効果的な免疫 原的量の、本発明のポリペプチドが含まれている。他の事項の中で、単位投与当 りのポリペプチドもしくはタンパク質の効果量は、接種を受ける動物種、その動 物の体重及び選択された接種管理に依存し、このことは、当分野でよ（知られて いることである。典型的に、接種物は、接種当り約１０マイクログラムから約５ ００ミリグラムのポリペプチド又はタンパク質濃度、好ましくは、投与当り、約 ５０マイクログラムから約５０ミリグラムのポリペプチドもしくは、タンパク質 を含んでいる。

本発明の接種物に使われる限り、“単位投与”という語句は、動物への単一投与 に適した物理的に分離した単位を意味し、各単位は必要とする希釈剤、すなわち 、キャリヤーもしくは、ビヒクルと合せて、望ましい免疫原的効果を産むと計算 された、予め決められた量の活性物質を含んでいる０本発明の接種物の新しい単 位投与に対する明細は、（ａ）活性物質の特性及び遂行される特別の免疫学的効 果、及び（ロ）動物において、免疫学的に使用するための、このような活性物質 の副台技術に本質的な制限、によって記述され、直接これらに依存しており、そ れらは、ここに詳述されていると同時に本発明の特徴となっている。

典型的に、接種物は、水、食塩水、又は、リン酸緩衝液のような生理学的に許容 される希釈剤又はビヒクル中にポリペプチド結合体を分散して、水性組成物を作 ることにより、乾燥した固体ポリペプチド結合体から調製される。このような希 釈剤は、当分野でよく知られているものであり、例えば、レミントン（Ｒｅｍｉ ｎｇｔｏｎ）の薬学、第１６編、マッグ・パブリッシング社、イーストン、ＰＡ 州（１９８０）、１４６５−１４６７頁で議論されている。

また、接種物は、希釈剤の一部として、アジュバントも含むことがある。完全フ ロイント・アジュバント（ＣＦＡ）　、不完全フロイント・アジュバント（ＩＦ Ａ）及びミョウバンのようなアジュバントは、当分野でよく知られた物質であり 、いくつかの販売業者より、市販されている。

Ｈ９抗体及び抗体組成物 １、　抗体組成物 ここで用いられている、種々の文法型の“抗体”という語は、イムノグロブリン 分子及び免疫学的に活性なイムノグロブリン分子の一部、すなわち、抗体結合部 位もしくは、パラトープを含む分子を意味している０代表的抗体分子には、本来 のイムノグロブリン分子、実質的な、本来のイムノグロブリン分子及び当分野で Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ　（ａｂ’）ｚ及びＦ　（Ｖ）として知られている領域を 含む、パラトープを含む、イムノグロブリン分子の一部が含まれる。

“抗体結合部位”とは、特異的に抗原と結合する（免疫反応する）重鎮及び軽鎖 の可変及び超可変領域を含む抗体分子の構造領域のことである０種々の文法型の “免疫反応”という語は、抗原決定基含有分子及び全抗体分子もしくはその一部 のような抗体結合部位を含む分子の間の結合を意味する。

“抗原決定基”とは、抗体結合部位によって、免疫学的に結合をうける抗原の実 質的構造領域を意味する。また、この語句は、“エピトープ”と互換的に使用さ れる。

本発明の抗体組成物は、ａ）ｈＧＰＩ［ｂ又はＩＣ，ＰＩ［ｂ及びｂ）本発明の 少なくとも１つの特別なポリペプチドと免疫反応する抗体分子を含むことを特徴 とする。好ましい態様において、本発明の抗体組成物は、ｃｐｎｂと免疫反応す ることができる１種以上のバラトープを含んでいる。

例えば、血小板会合ＧＰＩＩｂ−ｍａ／フィブリノーゲン複合体及びｈｃｐｎｂ 滑在的決定在的決定基ポリペプチドアナログ応するが、そのアミノ酸残基配列を 第２表に示した。ポリペプチドｐ５３−６４と、実質的に免疫反応を起こさない 抗体分子を含む本発明の抗体組成物は、フィブリノーゲン結合血小板と、フィブ リノーゲンと結合重ていない血小板とを区別することができる。したがって、好 ましい抗体組成物は、ａ）それが血小板会合ＧＰＩＩｂ−ｍａ／フィブリノーゲ ン複合体として存在するときの、ｈＧＰＩＩｂ、及びｂ）ポリペプチドｐ１２９ −１４５、と免疫反応し、かつ、実質的に、ポリペプチドＰ５３−６４との免疫 反応を起こさない抗体分子を含むものである。

典型的に本発明の抗体組成物は、本発明の接種物でホ乳動物を免疫化し、それに より、そのホ乳動物中に、適当なポリペプチド免疫特異性を有する抗体分子を誘 導することにより生産される。

それから、この抗体分子を、そのホ乳動物から回収し、例えば、免疫親和性クロ マトグラフィーなどの従来法により、望ましい程度の単離を行う、このようにし て生成した抗体組成物は、そのまま、本発明の診断法及び診断システムに用いて 、身体中のフィブリノーゲン結合血小板の検出に使用される。

λ　モノクローナル抗体組成物 本発明は、抗ＬＩＢＳモノクローナル抗体組成物も考案している０種々の文法型 の“モノクローナル抗体組成物”という語句は、ある抗体と免疫反応することが できる唯一種の抗体結合部位を含む抗体分子の集合体を意味する。したがって典 型的に、モノクローナル抗体組成物は、それが免疫反応する抗原に対する単一の 結合親和性を示す。それゆえ、モノクローナル抗体組成物は、異なる抗原に対し て、各々が免疫特異性を有する、多種の抗体結合部位をもつ、単一の抗体分子、 例えば、二特異的モノクローナル抗体が含まれている。

典型的に、モノクローナル抗体組成物は、はんの一種の抗体分子を分泌（生産） するバイプリドーマと呼ばれる単一細胞のクローンから生産される抗体を含む、 このハイプリドーマ細胞は、抗体産生細胞及びミエローマもしくは、自己生存細 胞系列の融合によって生成する。このような抗体は、最初に、コラ−（Ｋｏｈｌ ｅｒ）及びミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）により報告されており（ネイチャ ー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、　２５６．４９５−４９７　（１９７５））、その報 告を参考としてここに組込んである。

１つの態様において、本発明のモノクローナル抗体組成物は、細胞表面レセプタ ー−リガンド複合体により発現されるＬＩＢＳ、好ましくは、その複合体中のレ セプターの潜在的抗原決定基と免疫反応する抗体分子を含むことを特徴とする。

別のＤＩにおいて、モノクローナル抗体組成物は、ｈｃｐｎｂ及びｈｃｐｎｂ潜 在的決定基ポリペプチドアナログ、好ましくはＰ１２９−１４５と免疫反応する 抗体分子を含む、これら組成物中に含まれる抗体分子は、ＧＰｎｂｌｉ能部位も しくはその付近のｈＧＰＩ［ｂと免疫反応するが、血小板会合ＧＰＩ［ｂ−ｍａ によるフィブリノーゲンの結合を阻害せず、また、それがフィブリノーゲンと結 合したときは、血小板会合ＣＰＩｌｂ−Ｈａと免疫学的に反応することができる 。このタイプの好ましいモノクローナル抗体組成物には、ハイプリドーマＰ　Ｍ 　Ｉ　−１（ＡＴＣＣＨＢ　９４７６）によって生産することができる抗体分子 、すなわちＰＭＩ−１抗体分子が含まれる。

ふ　モノクローナル抗体組成物の産生方法本発明は、（ａ）細胞表面レセプター −リガンド複合体により発現されるリガンド誘導結合部位（ＬＩＢＳ）と免疫反 応し、かつ、（ハ）そのレセプター−リガンド複合体の非占有レセプターもしく は、非結合リガンドとは免疫反応しない、モノクローナル抗体の生成法を考案し ている。この方法には、 （ａ）　動物の、細胞表面−レセプター複合体もしくはｈｃｐｎｂ滑在的決定在 的決定基ポリペプチドアナログ疫化、これは、典型的に、免疫学的受容ホ乳動物 に免疫原の免疫学的効果量、すなわち、免疫応答を起こすのに十分な量投与する ことにより行なわれる。このホ乳動物は、ウサギ、ラット又はマウス等のげっ歯 動物であることが望ましい、これからこのホ乳動物を、レセプター−リガンド複 合体と免疫反応する抗体分子を分泌する細胞を作るのに十分な時間、維持する。

（ロ）免疫化したホ乳動物から取り出した抗体産生細胞のサスペンションを調製 する。これは典型的には、そのホ乳勅物の肺臓を取り出し、ついで個々の肺細胞 を機械的に分離し、生理的に許容される媒体に分散するという、当分野でよく知 られている方法によって行なわれる。

（Ｃ）　サスペンション化した抗体産生細胞を、トランスボームした（“生存化 ”）細胞系列を作ることができるトランスボーム剤で処理する。トランスホーム 剤及び生存化細胞系列を作るための、その使用は、当分野ではよく知られている ことであり、それには、エプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）、シミアンウィ ルス４゜（ＳＶ４０）、ボリオマウィルス等のＤＮＡウィルス類、モロニー・ム ライン・リューケミア・ウィルス（ＭｏＭｕＬＶ）　、ラウス・ザルコーマウィ ルス等のＲＮＡウィルス類、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２１０−Ａｇ１ ４等のミエローマ細胞類等が含まれる。

好ましい態様において、トランスホーム剤による処理は、適当な融合促進剤の使 用による、適当な細胞系列由来のマウスミエローマ細胞を、サスペンション化牌 細胞と融合することにより、ハイプリドーマを生成する。ミエローマ細胞当り約 ５個の肺細胞を用いることが好ましい。総容積当り、約１０”個の肺細胞を使用 する。

使用する細胞系列は、いわゆる“薬剤耐性”であることが望ましく、その結果、 未融合のミエローマ細胞は、選択培地中で生存できず、一方、ハイブリットは生 存できることになる。最も一般的なものには、８−アザグアニン耐性細胞系列が あり、これは、酵素の、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランス フェラーゼを欠失しており、そのため、ＨＡＴ　（ヒボキサンチン、アミノプテ リン及びチミジン）培地で生育することができない。

また、−ｉ的に、使用するミエローマ細胞系列は、分泌型を使用したとしても、 それ自身、なんら抗体を産生しないという点で、いわゆる“非分泌”型であるこ とが望ましい、しかし、ある場合には、分泌型ミエローマ系列であることが好ま しい、好ましい融合促進剤は約１０００から約４０００の平均分子量をもつポリ エチレングリコール（ＰＥＧ１００Ｏとして市販されている）であ゛　る一方、 この分野で知られている、その他の融合促進剤も使用することができる。

（ｄ）　その後、トランスホームした細胞を、好ましくはモノクローナルにクロ ーン化する。このクローニングは、非トランスホーム細胞は生育できない組織培 養培地で行うことが望ましい、このトランスホーム細胞がハイブリドーマの場合 は、−ｉ的にこのことは、分離容器中、未融合肺細胞、未融合ミエローマ細胞及 び融合細胞（ハイブリドーマ）を、未融合ミエローマ細胞が生存できない選択培 地中に希釈し、ついで未融合細胞が死滅するのに十分な時間（約１週間）、培養 することによって行なわれる。この希釈は、制限因子の１つであり、希釈体積は 、各分離容器中にある個数の細胞（例えば１〜４個）が分離されるように統計的 に計算する（分離容器とは例えばマイクロプレートの各ウェルである）。

この培地は、薬剤耐性（例えば、８−アザグアニン耐性）未融合ミエローマ細胞 系列を生育させないものである。

（ｅ）　クローン化トランスホーマントの組織培養培地について、よ（知られて いる免疫学的技術を用い、分泌された抗ＬＩＢＳ抗体分子の存在を評価する。

（ｆ）　ステップ（ｅ）で１度望ましいトランスホーマントが同定されれば、そ れを選択し、適当な時間、適当な！１１織培養培地で生育させ、ついでその培養 上清から、望ましい抗体を回収する。適当な培地及び適当な培養時間は、既知で あるか、もしくは、容易に測定できる。

より高濃度の重積製モノクローナル抗体を生産するため、この望ましいハイプリ ドーマを、マウス、好ましくは、同種もしくは、準同種のマウスに注射する。こ のハイブリドーマは、適当なインキュベーション時間の後、抗体産生腫瘍を生成 し、これは、この宿主マウスの血液及び腹腔分泌物内に高い濃度の目的抗体を生 ずる（約５−２０　ｍｇ／ｍｌ）。

これら組成物の調製に適する培地は当分野でよく知られ、かつ、市販されており 、また、これには、合成培養培地、近文系マウス及びそれに類するものが含まれ ている。代表的合成培地は、４．５ｇ／ｌのグルコース、２０關グルタミン及び ２０％ウシ胎児血清を補った、ダルベニ最小基礎培地である。代表的な近文系マ ウス株は口ａｆｂ／ｃである。

上記の方法で調製したモノクローナル抗体組成物は、例えば、ＬＩＢＳ含有免疫 反応産物の生成が望まれるような、診断及び治療に用いることができる。代表的 反応産物には、ＧＰＩＩｂもしくは、ＧＰＩＩＩａの含有免疫反応産物が含まれ る。

１、ハイブリドーマ及びその調製性 本発明のハイブリドーマは、抗ＬＩＢＳモノクローナル抗体組成物を生産する能 力を有することを特徴とするものである。

本発明の好ましいハイブリドーマは、細胞表面レセプター潜在的抗原決定基と免 疫反応する抗体分子を生産することを特徴とする。

望ましい免疫特異性、すなわち、特定のタンパク質、特定のタンパク質上の同定 可能なエピトープ、そして、または、ポリペプチド上の同定可能なエピトープと 、免疫反応する能力を有する抗体分子を生産（分泌）するハイブリドーマの調製 方法は、当分野ではよく知られているものである。参考のためここに組入れられ ているナイマン（Ｎｉｍａｎ）等（プロシーデインダス・イン・ナショナル・ア カデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ、ＮａｔｌＡｃａｄ、Ｓｃｉ、）　（ＩＳ Ａ。

８０．４９４９−４９５３、（１９８３））及びガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）等（ メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、）　７３　。

３−４６　（１９８１））の報告にあるハイプリドーマ技術は特に利用される。

ハイプリドーマ培養物ＰＭＩ−１は、ブタベスト協定要請物に基づき、１９８７ 年７月７日、アメリカ、２０８５２、ＭＤ州、ロックビル、アメリカン・タイプ 、ティシュ・コレクション（ＡＴＣＣ）に登録され、受理番号ＨＢ９４７６が割 当てられた。

同様にハイプリドーマ培養物ＰＭＩ−２は１９８７年、１２月２２日ＡＴＣＣに 登録され、受理番号ＨＢ９６１５を割当てられた。

Ｊ、治療法及び治療組成物 本発明のｈｃｐｎｂｉ’ｗ在的決定基ポリペプチドアナログは、インビボにおけ るフィブリノーゲン結合血小板の凝集を緩和するのに用いることができる。

例えば、ｈＧＰｎｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログは、効果的量を被検者に 投与したとき、フィブリノーゲン結合血小板の凝集を競合的に阻害しうる、医療 的に許容しうる組成物で用いることができる。この阻害は、血栓生成を減速させ ると考えられている。従って、インビボでの、ｈｃｐｎｂ潜在的決定基ポリペプ チドアナログの投与は、凝血及びある炎症応答のような血小板凝集により開始さ れる生理学応答を緩和するのに用いることができる。

他の態様において、フィブリノーゲン結合血小板の凝集は、基本的に、ｈｃｐｎ ｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログ、好ましくはＰ１２９−１４５と免疫反応 する抗体分子を含む医療的に許容しうる組成物を効果量、静脈投与することによ り阻害しうる。

この抗体分子は、モノクローナル抗体組成物として存在することが好ましく、ま た、ハイブリドーマＰＭＩ−１で生産されるものがより好ましい。

投与するポリペプチドもしくは抗体分子含有組成物は〜溶液もしくはサスペンシ ョンとしてであるが、ポリペプチドは、錠剤、丸薬、カプセル、放出維持製剤又 は粉末の形でも投与される。どの場合にも、典型的な組成物は約０．１μＭから 約１．０　Ｍの活性成分、好ましくは、約１．０μＭから約１０ミリモル濃度（ ｍＭ）の活性成分を含む。

活性成分として、ポリペプチド又は、抗体分子を含む治療組成物の調製は、当分 野でよく理解されている。典型的に、これらの組成物は、溶液又はサスベンジジ ンのような接種物として調製されるが、接種前の液体である溶液もしくはサスペ ンションに適した固体も調製されることもある。また、この調製物はエマルジョ ン化することもある。しばしば、この活性治療成分は、医療的に許容され、かつ 、この活性成分と適合することが知られている賦形剤と混合される０例えば、適 当な賦形剤には、水、食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノール等及び それらの組合せたものがある。さらに、もし、望ましいときは、この組成物は、 活性成分の効果を上げるための、湿潤剤又はエマルジョン化剤、ｐｎ緩衝剤のよ うな少量の補助物質を含むこともある。

ポリペプチドもしくは抗体分子組成物は、中和した医療許容塩としての医療組成 物に整えられることもある。医療的に許容される塩には、例えば塩酸、リン酸の ような無機酸、もしくは、酢酸、酒石酸、マンデル酸のような有機酸で作られる 酸付加塩（ポリペプチド又は抗体分子の遊離アミノ基で形成される）が含まれる 。

また遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、ナ１リウム、カリウム、ア ンモニウム、カルシウムもしくは鉄の水酸化物のような無機塩基及びイソプロピ ルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロ カイン等の有機塩基から誘導されることもある。

このポリペプチド又は抗体含有医療組成物は、例えば、単位投与量の静脈注射な どの従来法で投与される０本発明の医療組成物に対して用いられる“単位投与量 ”という語句は、ヒトへの単一投与に適する物理的に分離した単位を意味し、各 単位は、必要とされる希釈剤すなわちキャリヤー又はビヒクルと合せて、望まし い医療効果を産むよう計算され、予め決められた量の活性物質を含んでいる。

この組成物は、投与物の形状に適した方法で、かつ、医療的に効果的量が投与さ れる。投与量は、治療される被検者、活性成分を利用する被検者の容量、及び望 ましいレセプター−リガンド結合の阻害度に依存する。投与するのに必要な活性 成分の正確な量は医者の判断に依存し、かつ、各個人に特異的なものである。し かし、適当な投与範囲は、１日、１人当り活性成分１から数ミリグラムのオーダ ーである。第１次及び第２次投与の適正な処方も、様々であるが、典型的には、 第１次投与についでひきつづく注射又は他の投与法で、１時間以上の間隔で反復 投与する。別に、血液中の医療的に効果的濃度を維持するのに十分な継続的な静 脈への注入も考案されている。ｈｃｐｎｂ潜在的決定基ポリペプチドに関する、 医療的に効果的な血液濃度は、約０．１ｍＭから約１０ｍＭの範囲であり、約１ ．０ｍＭが好ましい０本発明の抗体の医療的に効果的な血液濃度は約０．１μＭ から約１０μＭの範囲であり、１．０μＭが好ましいや に６診断システム 本発明のキット型の診断システムには、分包された試薬として、少なくとも１回 の検定に十分な量の、本発明の発現タンパク質、ポリペプチド、抗体組成物もし くはモノクローナル抗体組成物が含まれている。この分包試薬の使用説明書も含 まれているのが普通である。

典型的には、“使用説明書”には、その試薬濃度もしくは、混合する試薬及びサ ンプルの相対的量、試薬／サンプル混合物の維持時間、温度、バッファ条件など の、少なくとも１回の検定法のパラメータを記述した明確な表現物が含まれる。

１つの態様において、血液又は血漿のような、血小板含有血液サンプル中のフィ ブリノーゲン結合血小板を検定するための診断システムには、ｈＧＰｎｂ潜在的 決定基ポリペプチドアナログ、好ましくはｐ１２９−１４５と免疫反応する分子 を含むパッケージが含まれている。さらに、この抗体分子は、ｈｃｐｎｂと免疫 反応するハイブリドーマＰＭＩ−１から生産されるものであることがより好まし い、またこの抗体分子は、モノクローナル抗体組成物として存在することが好ま しい、さらに、この抗体分子が放射性核種ラベルに結合する、好ましくは、ｌ！ Ｊラベル化ＰＭＩ−１抗体を含むキットであることがより望ましい。

別の態様における、本発明の診断システムは、インビボで血栓の存在を検定する のに有用である。このシステムには、ｈＧＰＩＩｂ滑在的決定基ポリペプチドア ナログ、好ましくはｐ１２９−１４５と免疫反応する抗体分子を含むパッケージ が含まれる。この抗体分子は、基本的にｈｃｐｎｂと免疫反応するＰＭＩ−１抗 体分子を含むモノクローナル抗体組成物として存在することがより好ましい、こ の抗体分子は、インビボ指示手段と結合させておく。

このように、好ましい態様において、本発明の診断システムには、さらに、本発 明の抗体分子又はポリペプチドを含む複合体の生成を知らせることができるラベ ルもしくは指示手段が含まれている。

ここで用いられているように、種々の文法型の、“ラベル”及び“指示手段”と いう語句は、複合体の存在を示す検出可能なシグナルの生成に直接もしくは間接 的に関係する単−原子及び分子を意味している。“インビボ”ラベルもしくは指 示手段は、被検者身体中で有効に働くもので、それには、”’Ｉｎｓ　９９ＴＣ ％　”ＧａｃＩｍｈＲｅ及び１″２Ｉが含まれる。どのラベルもしくは指示手段 も、本発明の抗体もしくはモノクローナル抗体組成物の一部である、発現タンパ ク質、ポリペプチドもしくは抗体分子と結合するか、又はそれらに組込まれるこ ともあるし、もしくは、別々に使用されることもあり、またそれらの原子又は分 子は、単独で用いられることもあるし、別の試薬と組合せで使用されることもあ る。このようなラベルは、臨床診断化学の分野ではよく知られているものであり 、そして、これらが、ここで述べられている新しいタンパク質を用いた方法そし て、またはシステムで使用される場合に限り、本発明の一部を構成している。

ラベルの結合、すなわち、ポリペプチド及びタンパク質のラベル化は、当分野で よく知られているものである０例えば、ハイブリドーマによって生産される抗体 分子は、培養培地中の成分として提供されるラジオアイソトープ含有アミノ酸の 代謝的取込みによりラベル化することができる０例えばガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ ）等、メソッズ・インーｘンザイモロジー（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ）　、７ ３．３−４６　（１９８１）参照、活性化官能基を介するタンパク質結合技術が 特に利用される０例えば、オーラメアス（Ａｕｒａｍｅａｓ）等、スカンジナビ アン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｓｃａｎｄ、Ｊ＋Ｉｍｍｕｎｏ１．） 　８、補７．７−２３　（１９７８）、ロットウェル（Ｒｏｄｗｅｌ　Ｉ）等、 バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈ）、３．８８９−８９４　（１９８４）及 び米国特許第４．４９３，７９５号参照。

また、この診断システムには、好ましくは分包状態で特異的結合剤を含むことが できる。′特異的結合剤”は、本発明の試薬を選択的に結合できるが、本発明の タンパク質発現物質、ポリペプチドもしくは抗体分子それ自体ではない分子であ る０代表的な特異的結合剤には、抗体分子、補体タンパク質もしくはその断片、 プロティンＡ及びそれに類するものがある。この特異的結合剤は本発明の抗体分 子もしくはポリペプチドが複合体の一部として存在するとき、これを結合するこ とができることが好ましい。

好ましい態様においては、この特異的結合剤はラベル化されている。しかし、こ の診断システムがラベル化されていない特異的結合剤を含んでいる場合、典型的 にこの結合剤は、増巾手段又は増巾試薬として用いられている。これらの態様に おいて、ラベル化特異的結合剤は、その増巾手段が試薬含有複合体に結合してい るとき、その増巾手段と特異的に結合しうる。

本発明の診断キットは、血清、血漿又は尿のような体液サンプル中のフィブリノ ーゲン結合血小板の存在もしくはその量を検出するのに、“イライザ法”様式で 用いることができる。“イライザ法”とは、面相に結合した抗体又は抗原及び酵 素−抗原もしくは酵素−抗体結合体を用いて、サンプル中に存在する抗原もしく は抗体の量を検出及び定量する酵素結合免疫吸着検定法のことである。イライザ 法の説明は、参考として、組込まれている、１９８２年、ＣＡ州、ロスアラモス のレンジメディカル出版社から出版されている、Ｄ、Ｐ、サイッ（Ｓｉｔｅｓ） 等の、１基礎及び臨床免疫学”の第４ｋｍ、第２２章及び米国特許第３．６５４ ，０９０号、第３．８５０．７５２号及び第４，０１６，０４３号に報告されて いる。

このように、好ましい態様において、本発明の発現タンパク質、゛ポリペプチド 又は抗体分子は、固体マトリクスに固定され、本診断システム中、分包されてい る固体サポートとなっている。

この試薬は、当分野ではよく知られているその他の固定様式が使われることもあ るが、水性媒体中から吸着により、固体マトリクスに固定化されるのが一般的で ある。

当分野において、を用な固体マトリクスはよく知られている。

このような物質には、ファルマシア、アイインケミカルス（ＮＪ。

ビス力タウエイ）から５ＥＰＨＡＤＥＸの商標で市販されている架橋デキストラ ン、アガロース；ＩＬ州、北シカゴのアボット・ラボラトリーズ社から市販され ている約１ミクロンから約５ミリメートル径のポリスチレンビーズ、シート、小 片又はヘラ状の、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニ トロセルロースもしくはナイロンベースの織物、もしくは、ポリスチレン又はポ リ塩化ビニルから出来ているチューブ、プレートもしくは、マイクロプレートの ウェルが含まれる。

ここで述べられている診断システムの試薬、ラベル化特異的結合剤もしくは増巾 剤は、液体分散物のような溶解もしくは、例えば凍結乾燥形のような実質的に乾 燥した粉末として提供される。

指示手段が酵素の場合、その酵素基質もこのシステムの分包の形で提供される。

先に述べたマイクロプレートのような固体サポート及び１種以上のバッファ類も 本診断検定システムにおける分包要素として含まれている。

この診断システムに関してここで議論されているパッケージは、通常、診断シス テムで使用されているものである。このようなパッケージには、ガラス製及びプ ラスチック製（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン／及びポリカーボネート ）のボトル、バイアル、プラスチック及びプラスチックホイルでラミネートした 包装等が含まれている。

Ｌ、検定法 本発明は、本発明の抗体もしくは抗体分子組成物中に含まれる抗体、発現タンパ ク質もしくはポリペプチドを含む複合体を生成することにより、ｃｐｎｂ及び特 に血栓もしくは、フィブリノーゲン結合血小板中に見られるようなフィブリノー ゲン結合ｃｐｎｂを含む複合体を検出する方法を考案している。当業者は、これ ら複合体を形成するのに利用することができる、よく知られた臨床的診断化学操 作が多く存在することをよ（理解できよう。従って代表的検定法をここに示すが 、これにより本発明が制限されることはない。

１、血栓の検出 被検者中の血栓の存在を検出する方法が考案されている。インビボ指示手段を結 合した、抗ｈｃｐｎｂ抗体分子を含む、本発明の、効果的量の抗体組成物もしく は、モノクローナル抗体組成物を被検者に静脈投与する。好ましい態様において 、ラベル化抗体分子は、ｈｃｐｎｂ及びポリペプチドｐ１２５−１４５とは免疫 反応するが、ｐ５３−６４とは免疫反応しないもので、ハイブリドーマＰＭＩ− １によって生産されるものであればより好ましい。

その後、この被検者を、ラベル化抗体が血栓の一部として存在するｈｃｐｎｂと 反応し、複合体を生成するのに十分な予め決めた時間、及び好ましくは、非結合 抗体分子の実質的量が身体から一掃されるのに必要な付加的時間維持する。さら にこの被検者を、生成したラベル化複合体の存在、及び好ましくその位置につい て検定する。

λ　身体サンプル中のフィブリノーゲン結合血小板の検出好ましくは血液や血液 の血小板含有画分のような体液サンプルなどの、血小板含有身体サンプル中のフ ィブリノーゲン結合血小板の存在及び好ましくはその量を検出するために、競合 的、非競合的にかかわらず、種々の不拘−及び均一検定プロトコールが使用でき る０例えば、ヘパリン保存（非凝血化）血液サンプル及び＋ｔ％ｌラベル化ＰＭ ！−１抗体分子を混合する。このようにして生成した免疫反応混合物を、生物検 定条件下、フィブリノーゲン結合血小板がラベル化抗体と免疫反応し、ラベル化 免疫反応産物を生成するのに十分な時間維持する。それから、このラベル化免疫 反応産物を典型的には、サンプル中に存在する全ての血小板がペレット化するの に十分な遠心により、未反応ラベル化抗体から分離する。その後、この生成した ラベル化免疫反応産物の量を検定する。

生物学的検定条件とは、本発明の抗体分子及びポリペプチド分子及び検定しよう とするフィブリノーゲン結合血小板の生物学的活性を維持する条件である。これ らの条件には、約４°Ｃから約４５℃の範囲で、好ましくは約３７℃の温度、約 ５から約９の範囲で、好ましくは約７のｐＨ値、及び蒸留水から、約１モル濃度 塩化ナトリウムまでの範囲で、好ましくはおよそ生理的食塩水のイオン強度が含 まれる。このような条件を至適化する方法は、当分野ではよく知られている。

例 次に示す例は、本発明を説明するものでその制限を意図したちのではない。

１、ＧＰＩＩｂ−ｍａの単離 Ａ、血小板の単離 最終濃度、ミリリットル当り０．０６ユニツトのヒルビン（ＭＯ州、セントルイ ス、シグマケミカル社）を含むＡ　ＣＤ　５　ｄ　（０，０６５Ｍクエン酸、０ ．０８５Ｍクエン酸ナトリウム、２％デキストロース）にヒトの血液６ミリリツ トル（Ｉｉ）を採取し、これを１２０×ｇで１５分間遠心する。冨血小板血漿（ ＰＲＰ）と命名した、この上清を回収し、単離してから、さらに、１２００Ｘｇ で１５分間遠心して、単離血小板のペレットを作った。

Ｂ、血小板からのＧＰｎｂ−ｍａの単離例ＩＡにおけるように調製した血小板ペ レットを５１ｄのＴＢＳ（０，１５Ｍ　ＮａＣｊ！、０．２　Ｍ　トＩＪ　ス、 ｐＨ１，４，５Ｘ　１０−’？ｌ　ＣａＣ１ｔ。

１０−’Ｍロイペプチン）に懸濁し、モデルＭ−３７５ソンケーターを用い、最 高強度で１０分間、氷上で超音波処理した（ＮＹ州、プレインビュー、ヒートー システムス・ウルトラソニックス）。

この超音波処理したサスペンションを、ドライアイ：）、−Ｊり）−ルアイスバ スを用いて２度凍結融解を行ない、ついでマイナス２０°Ｃで保存した。この凍 結融解したペレット超音波処理物を５−のスクロース溶液（ＴＢＳ中４０％ν／ Ｖ）上に重層し、ついで、ＳＷ４１遠心ローター（ＣＡ州、フラートン、ベック マン・インスッラメンツ）を用いて、４℃、毎分３８０００回転で１時間遠心す ると、ミルク色の下層が生ずる。その後、このミルク色の下層を回収し、５Ｗ５ ０．１遠心ローター（ベックマン）を用い、４°Ｃで１時間、４３．ＯＯＯＲＰ Ｍで遠心した。生成したペレットを典型的には１〜２ｄＴＢＳに懸濁して、血小 板メンブレン溶液を作り、そのタンパク質濃度を典型的には、パイオーラドタン パク質検定キット（ＣＡ州、リッチセント、パイオーラド）を、業者の説明書に 従って用いて、１０−２５ｍｇ／ｄの範囲での測定を行った。

再度、この血小板メンブレン溶液を、Ｓ　Ｗ　５０．１遠心ローター用いて、上 述のように遠心し、ついで生成したベレットを、２ｄの抽出バッファ（０，０３ Ｍ）リス、ｐＨ７，４、ｌＸｌ０−’Ｍロイペプチン、２００ｍＭ　ｎ−オクチ ル−ベーターＤ−グルコピラノシド；ＣＡ州、ラジョラ、カルバイオケムーベー リング）に懸濁した。このようにして作った血小板メンブレン抽出物を渦巻撹拌 により完全に混合し、そして室温に３０分間、維持した。その後、この抽出物を ５Ｗ５０．１遠心ローターを用いて、４°Ｃ１４５０００ｒｐ＋１１で１時間遠 心し、そして、このようにして生成した血小板メンブレン抽出物上清を回収した 。

この回収した上清を、１リツトルのカラムバッファ（０，０３Ｍトリス、ｐＨ７ ，４，０，１ｍＭ　ＣａＣ１，ｚ　、０．１％ｎ−オクチル−ベーターＤ−グル コピラノシド）で平衡化した、ＬＫＢウルトロゲル、アクタ３４ゲル濾過カラム （３Ｘ９７ｃ＋ａ、ＭＤ州、ゲイサーズバーグ、ＬＫＢインスツルメント社）に かけ、このカラム溶出物から５Ｉａｉづつのフラクションを採取した。各フラク ションの２８０ナノメーターの光学密度を測定し、いくつかのピーク付近のフラ クションを合せて、各ピークのプールを作った。各プール由来のサンプルを、還 元バッファ及びレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）　（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　（ ロンドン）　、２２７．６８０−６８５　（１９７０））によって報告された操 作、及び１４．４キロダルトン（ＫＤａ）から９２．５ＫＤａのサイズ範囲の低 分子量タンパク質標準物質（Ｃ＾、リッチセント、パイオーラド）を用いて、６ ％ポリアクリルアミド・スラブゲルによる電気泳動で分析した。

ｃｐｎｂ及びＧＰＩｎａに相当する分子量、すなわち、各々１２０ＫＤａ及び１ ００ＫＤａの主要な２種のタンパク質を含むプールが回収された。このように調 製した、単ａＧＰＩｌｂ−ｍａ調製物のタンパク質濃度は、典型的に、バイオ− ラドタンパク質検定キットを用いて、０．３から０．８■／ｄの範囲であると測 定された。

Ｚ　ポリクローナル抗ＧＰＩ［ｂ−Ｉ［［ａ抗血清の調製例１で説明したように 調製した、完全フロイント・アジ、ユバント及び単離したＧＰＴＪｂ−ｍａタン パク質１００マイクログラム（μｇ）を含む組成物による免疫化により、ウサギ 抗ｃｐｎｂ−１１ｔａ抗体を調製した。ＧＰＴＪｂ−ｍａの二次免疫注射を三週 間の間、−週間スケジュールに従がい、不完全フロインドアジュバントを用い、 いくつかのイントラダーマル部位に投与しく典型的には４部位に１００μｇを分 配する）、ついでさらに三ケ月間、二週間スケジュールに従って投与した。

３、ｃＤＮＡライブラリー構築、抗体スクリーニング及びｃＤＮＡの同定 全細胞性Ｒ，Ｎ　Ａを、グアニジニウム・イソチオシアネート／塩化セシウム法 を用い、ＨＥＬ細胞から調製した。ポリ　（Ａ”）ＲＮＡを２サイクルのオリゴ （ｄＴ）セルロース・クロマトグラフィーにより、全ＲＮＡフラクシシンから精 製した。二本鎖ｃＤＮＡは、標準操作に従い、ＡＭＶ逆転写酵素（ＦＬ州、セン ト・ビータースバーグ、ライクサイエンス社）及びランダムオリゴヌクレオチド プライマーを用いて、１０ＭｇのＨＥＬポリ（Ａ’″）ＲＮＡから合成した。サ イズ選択したｃＤＮＡを、ファージｇｔ１１のＥｃｏＲ１部位にライゲーション し、ストラタジーン・クローニングシステムズ社から市販されているギガパック ・バッキング抽出物を用い、その業者のプロトコールに従ってそのファージ中に 包み込んでから、大腸菌Ｙ１０８８にブレーティングし、増巾した。大腸菌Ｙ１ ０９０へのファージのブレーティング、融合タンパク質合成の誘導、ニトロセル ロースフィルターへの転移及び、例２で調製したウサギのポリクローナルＧＰＩ ［ｂ−ｍａ抗血清による、そのフィルターのスクリーニングは、イムノパーオキ シダーゼに基づくベクタスタインＡＢＣ法（ＣＡ州、バーリンガム、ベクターラ ボラトリーズ社）を業者の説明書に従、て用いた、ヤング（Ｙｏｕｎｇ）等（プ ロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ。

８０．１１９４−１１９８　（１９８３））によって報告されたように行った。

陽性の組換えクローンをプラーク精製し、増巾してから、プレート溶解物として 採取した。

ウサギのポリクローナルＧＰｎｂ−Ｉ［１ａの抗血清による、２００．０００個 の組換え体の最初のスクリーニングで６個の免疫反応クローンが同定された。陽 性クローンのベーターガラクトシダーゼ−ｃＤＮＡ融合タンパク質と、モノクロ ーナル抗体ＰＭＩ−１との免疫反応性を試験するため、）７一ジ溶原体を、ヤン グ（Ｙｏｕｎｇ）等（サンエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２２．７７Ｂ−７８２ （１９８３））の報告に従い大腸菌Ｙ２Ｏ２Ｓ株で作った。ＩＰＴＧ誘導培養物 由来の溶解物を、還元性ゲルサンプルバッファ中に、そのバクテリア細胞ペレッ トを懸濁することにより調製し、その後、このサンプルを、６％５ＤＳ−ポリア クリルアミドゲルで泳動してから、トービン（Ｔｏｗｂｉｎ）等（プロシーディ ング・イン・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、）　ＵＳＡ、　２６．４３５０−４３５４　（１９７９） ）により報告されているように、ニトロセルロースフィルターに転移し、ついで ベカスタインＡＢＣ法を用い、ＰＭＩ−１で探った。

１．１キロベース（ｋｂ）の挿入物を含む、これらのクローンの１つ、ＨＥＬ４ １は、ｃｐｎｂエピトープを有するものと一致する特徴を有する１４０ＫＤａの バクテリア融合タンパク質の合成を行うことが分った。これらの特徴には、（１ ）ＨＥＬ４１クローンによりコードされる融合タンパク質との、ポリクローナル 抗ＧＰＩ［ｂ−１［１ａの抗体組成物の阻害可能な反応性は、単離したＧＰＩ［ ａ−ｍａによる予備吸着により阻害されること、（２）血小板溶解物及び精製Ｇ ＰＩＩｂ−Ｉ［ａのイムノプロットにおいて、融合タンパク質に関しアフィニテ ィー精製した抗体とＧＰｎｂとの特異的反応、及び（３）表面ラベル化血小板由 来のＧＰＩ［ｂ−ｍａの、アフィニティー精製抗血清による免疫沈殿化が含まれ る。アフィニティー精製抗体は、ウェスタンブロッティングによるビトロネクチ ンレセプター（ＶｎＲ）のアルファサブユニットとの反応を起こすことができず 、また関連する内皮細胞サイトアトへシンを免疫沈殿化することができない、さ らに、）ＩＥＬ４１によりコードされる融合タンパク質は、モノクローナル抗体 ＰＭＩ−１との免疫反応性を有し、このことは、このクローンがｃｐｎｂ上にあ るエピトーマをコードしている証拠を提供している。

４、ＤＮＡの配列決定及び配列解析 ＨＥＬ４１由来の組換えファージＤＮＡを液体培養技術により精製し、ＥｃｏＲ Ｉで消化してからＭ１３ｍｐ１８にサブクローン化した。各鎖のＤＮＡ配列は、 ビギン（Ｂｉｇｇｉｎ）等（プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ− ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、）　ＵＳＡ、　８０．３９６３−３９６５　 （１９８３））により報告されているような、３６Ｓ−ｄＡＴＰ及びバッファ勾 配ゲルを用い、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等（プロシーディング・イン・ナショ ナル・アカデミ−・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ、ユニ、５４６３−５４６７　（１９７７））のダイデ オキシ・チェーン・ターミネーション法により決定した。

ｃＤＮＡ配列は、ストラウス（Ｓｔｒａｎｓｓ）等（アナリティカル・バイオケ ミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｅｈｅｍ、）　、１５４．３５３−３６０（１ ９８６））により報告されている特異的プライマー依存ＤＮＡ配列決定法を用い て伸長した。オリゴヌクレオチド２０マーシーケンシングブライマーは、アプラ イド・バイオシステムズ、モデル３８０Ａ　ＤＮＡシンセサイザーを用いて合成 した。不明瞭さを除くため両鎖とも配列決定を行った。

クローンＨＥＬ４１のヌクレオチド配列を第１図に示したが、それは、次のよう な特性を有している。挿入物は、部位６８２番から始まるＴＡＧ終止コドンとそ れに続く４２０塩基の３′非翻訳配列を伴う、６８１塩基の読み取り枠からなる 。このクローンの５′末端の初めの１２０ヌクレオチドは、コンセンサスＡｆｕ 反復配列の特徴を有しており、このことは、このクローンが不完全なプロセッシ ングを受けたｍＲＮＡに由来することを示している。

クローンＨＥＬ４１のｃＤＮＡ配列は、２２７個のアミノ酸の読み取り枠をコー ドしている（第１図）、シャ口（Ｃｈａｒｏ）等（プロシーディング・イン・ナ ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、　８３．８３５１−８３５６　（１９７６））により 報告されているように、ｃｐｎｂの軽鎖の配列決定されたＮ末端配列は、このク ローン内のアミノ酸残基１５７番から１７１番として同定される。このコンセン サスＡ　ｌ　ｕ反復配列が読み枠どおりに翻訳されると、これは、ＨＥＬ４１に コードされている最初の４０個のアミノ酸に対応することを示している。

マトリクス分析（クローン（Ｇｅｏｒｇｅ）等、ＰＩＲレポート＃ＲＥＬ−０２ ８６、ナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファンデーション（１９８６ ））によるＣＰｎｂ及びＶｎＲアルファサブユニットの誘導されたアミノ酸配の 比較（スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカ デミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、） 　ＵＳＡ、　８３．８６１４−８６１８　（１９８６））は、保存的置換を可能 とする類似性を有する２つの領域を検出した。およそ５０個のアミノ酸残基にわ たる１つの領域は、重鎮のカルボキシ末端付近に位置する。約１５残基の第２の 領域は、軽鎖のアミノ末端付近に位置し、両タンパク質の重鎮及び軽鎖間のジス ルフィド結合の形成に関係するシスティン残基を含んでいる。突然変異データマ トリクスを用いたりレート・プログラムによる、ＧＰＩ［ｂ及びＶｎＲアルファ サブユニットの配列間の関係の統計的意義の評価は、２つの配列に存在する、こ の類似性の度合を偶然に見つける確率の低さを示している（Ｐ　＜０．０００１ ）　、　Ｇ　Ｐ　ＩＩ　ｂ及びＦｎＲアルファサブユニットの配列間の関係を分 析すると（アーグレイブス（Ａｒｇｒａｖｅｓ）等、ジャーナル・オブ・バイオ ロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　）　２６１．１２９２２−１２９２４　（１９８６））、この２つ の配列中に存在する類似性の度合を偶然に見つける確率が同様に低いことが示さ れた（　ｐ　＜ｏ、０００５）　。

コンピュータ調査では、ｃｐｎｂのこの領域とＮＢＲＦタンパク質データデ−タ ーベースする他の配列間にその他の明白な類似性は明らかにされなかった。さら に、神経細胞粘着分子、Ｎ−ＣＡＭの、報告されている部分配列との直接の比較 で有意な一致は検出されなかった。

５、　ポリペプチド合成 ヌクレオチド配列から誘導されたアミノ酸残基に基づいて、ここで使用されてい る種々のＧＰＩｌｂＧｉＭに対応するポリペプチドを、ハーゲンメイヤー（Ｈａ ｇｅｎ論ａｉｅｒ）等（ポプセイシーズ・Ｚ。

フィジオロジカル・ケミストリー（Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、　Ｐｈ １ｓｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　）　３５３．１９７３　（１９８２））の対称無水物法を用い、ア プライド・バイオシステムズ社モデル４３０ペプチドシンセタイザーで化学合成 した。

合成したポリペプチドのアミノ酸残基配列及び第１図に示したｃｐｎｂの誘導さ れたアミノ酸残基配列内のそれらの位置を第２表にリストした。

第２表 名　称　アミノ酸残基配列 ｐ　１９−３４　ＷＥＡＫＡＣ；Ｒ３ＰＥＶＲＳＳＲ３ｐ５３−６５　ＲＥＱＮ ＳＬＤＳＷＣ，ＰＫＶｐ１２９−１４５　ＰＳＰＳＰＩＨＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ ｐ　１３６−１４５　ＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱｐ１４４−１５６　ＲＱＩＦＬＰＥ ＰＥＱＰＳＲ６、モノクローナル抗体組成物の調製 単離したイムノグロブリンＩｇＧ（Ｉｇｃ）を含むモノクローナル抗体組成物を 、典型的にファルマシア社（ＮＪ、　ピスカタウェイ）から市販されており、業 者の説明書に従って用いられるプロティンＡ−セファロースを用いて、マウスの ハイブリドーマ細胞系列ＰＭＩ−１（ＡＴＣＣ番号ＨＢ９４７６）を含むマウス の腹水から単離した。単離したＩｇＧのタンパク質濃度を、バイオラドのプロテ インアセッセイ・キットを業者の説明書に従って使用することにより測定した。

＋ｔｓ　１ラベル化抗体を含むＰＭＩ−１モノクローナル抗体組成物を調製する ため、１ミリリットル当り１ミリグラムの上記単離ＰＭＩ−１ＩｇＧを含む、３ ５０マイクロリツトル（μｌ）のＰＢＳ　（０，１５Ｍ　ＮａＣｊ７、Ｏ，０１ Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０９）を、４０マイクログラム（μｇ）のクロラ ミン−Ｊ及び１ミリキユーリー＜ｍ　Ｃｉ）の無キャリヤーＮａ　”’Ｉ　（Ｉ Ｌ州、アーりントン・ハイツ、アマ−ジャム）と混合した。この混合物を約２０ ℃に５分間維持し、その後、２０μｌの２ｍｇ／ｍｆメタ重亜硫酸す）　ＩＪウ ム溶液及び２０μｌのヨウ化カリウム溶液と混合する。それから、１％のＢＳＡ を含むＰＢＳ　８００μｌを混合し、さらに最終濃度１０ｍＭとなるように、ジ イソプロピルフルオロホスフェートを混合する。この混合物を２２℃で６０分維 持してから、ＰＢＳに対して透析する。生成した１２ＳＩラベル化ＰＭ！−１の 比活性はμｇ当り約４．５マイクロキユーリーであった。

上述の単離１ｇＧ由来のＦａｂ断片を含む組成物は、パパインによる、３７℃、 ６時間の消化（パパインに対するＩｇＧの重量比、１：２００）する、メージ（ Ｍａｇｅ）等の方法に従って調製した（メソッズ・インーｘンザイモロジー（Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　［ｉｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）７０．１４２−１５０　（１９ ８０）、未消化のＩｇＧ及びＦｃ断片を、プロティンＡ−セファロースによるク ロマトグラフィーで除去した。こうしてできたＦａｂ断片含有組成物は使用準備 ができており、もしくは、必要なときは、上述のモノクローナル抗体組成物で報 告した操作と同様に、　１２′Ｉラベルした。

ＰＭＩ−１と異なる免疫特異性を有する、本発明のモノクローナル抗体も、ＰＭ Ｉ−１と同様に調製される。たとえば、このような組成物は、マウスのハイブリ ドーマ細胞系列ＰＭＩ−２を用いて調製した（ＡＴＣＣ番号ＨＢ９６１５）。

７、　イライザ検定法（ＥＬ　Ｉ　５Ａ）Ａ、ポリペブチトイライザ法 ＰＭＩ−１及びＴａｂモノクローナル抗体組成物中に含まれる抗体分子を、ポリ ペプチドｐ１２９−１４５及びｐ１４４−１５６と免疫反応する能力について調 べた。（Ｔａｂは、コントロールとして用いた無関連モノクローナル抗体である 。）、２０ａＭのポリペプチドを含む５０マイクロリツトル（μｌ）コーティン グ溶液（０，１Ｍ　ＮａＨＣＯｓ　、ｐＨ８，５，０，１％ＮａＮａ　）を、平 底９６六マイクロプレート（イムロン２、ＶＡ州、チャンテイリー、ダイナチク ・ラボラトリーズ社）のウェルに入れた。その後、このプレートを３７°Ｃに６ ０分間維持し、ポリペプチドをウェルの壁土に吸着させる。振って、このコーテ ィング溶液を除き、このウェルを、洗浄バンファ（０，ＯＩＭ　）リス、ｐＨ７ ，４，０，０５％トウイーン２０．０．１５Ｍ　ＮａＣｊ！、２００　ｍｇ／　 ｗａｎメルチオレート）で２度すすぎ、さらに各ウェル（固体サポート）に５０ μＥのプロ・ノキングバッファ（コーティング溶液中の５％ウシ血清アルブミン 溶液）を加えて、過剰のタンパク質部位をブロックした。

このウェルを約３７°Ｃに６０分間維持してから、このブロッキング溶液を除去 した。各ウェルに、（ａ）例８で調製し、かつ希釈バッフｙ　（５ｍＭ　ＥＤＴ Ａ及び１ｍｇ／ｍｊ２ＢｓＡを含む洗浄バッファ）で２００倍に希釈した、ウサ ギ抗ポリペプチド抗体、ら）例６で報告したように調製した、１．５ナノモル濃 度（ｎＭ）のＰＭｌ−１モノクローナル抗体１ｇＧ、もしくは希釈バッファで３ ２０．０００倍に希釈した、ＴＡＢハイプリドーマ腹水（ＴＸ州、サンアントニ オ、テキサス大学、Ｒ，マクエバー博士より提供された）を含む溶液５０μ２を 加えた。このようにしてできた固／液相免疫反応混合物を６０分間、室温に維持 して、固相結合ポリペプチド及び添加された抗体との第１の固相結合免疫反応産 物を形成させた。それから、この固液相を分離し、このウェルを洗浄バッファで ２度すすいでから、過剰の液体を振って除去した。

希釈バッファで２０００倍に希釈した、ホースラディツシュパーオキシダーゼラ ベル化ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＣＡ州、バーリンガム、タボ社）、もしくは、希釈 バッファで２０００倍に希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＣＡ州、リッチセンド、 バイオ・ラド・ラボラトリーズ社）を含む溶液５０μｌを各ウェルに添加し、第 ２の固／液相免疫反応混合物（ラベル化免疫反応混合物）を形成させた。このウ ェルを５０分間、室温に維持して、ラベル化抗体及び第１の免疫反応産物の固相 結合抗体間の第２免疫反応産物を形成させた後、洗浄バッファで２度すすいで、 固相結合ラベル含有免疫反応産物を単離した。それから、過剰の液体をウェルか ら除去した。

ＣＰバッファ　（水１リットル当り、０．１Ｍクエン酸２４３ｍｊ２及び０．２ Ｍリン酸二ナトリウム２５０ｍｆ）中、０．４ｍｇ／　ｗｈｌ　。

−フェニレンジアミン及び０．０１２％（Ｖ／Ｖ）過酸化水素を含む発色基質溶 液５０μ２を各ウェルに加え、発色反応混合物を作る。

この発色反応混合物を、約２０°Ｃに１０分間維持した後、２ＮＨｚＳＯａ　５ ０μ２を各ウェルに添加して、この発色反応を停止してから、この溶液の４９０ ナノメーター（ｎｍ）の吸光度を、モデル３１０イライザ・プレート・リーダー （ＶＴ州、ウィノスキー、バイオチク・インスツルメント社）を用いて測定した 。

第３表に示した、本研究の結果は、モノクローナル抗体ＰＭＩ−１が、ポリペプ チドｐ１２９−１４５と免疫反応するが、ポリペプチドＰ１４４−１５６とは免 疫反応しないことを示している。

以下に議論しているように、ＰＭＩ−１は、ＧＰＩｌｂ−ｍａがフィブリノーゲ ンと結合したとき、ｈＧＰｎｂにより形成されている（上に露出している）潜在 的決定基と免疫反応するため、本研究の結果は、ｐ１２９−１４５がｈＧＰＩＩ ｂ潜在的決定基を真似る能力を有していることを示している。

第３表 ポリペプチド　モノクローナル抗体 抗　原　ＰＭＩ−Ｉ　Ｔａｂ ｐ１２９−１４５　１．３１０±０．１３”　０．０６８±０．００９ｐ１４４ −１５６　０．０６９±０．００５　０．０６１±０．００５Ｂ　Ｓ　Ａ　’　 ０．０６８±０．００５　０．０６０±０．００４’　ＢＳＡ＝ネガティブコン トロールとして使用されたウシ血清アルブミンコーティングしたウェル。

２　五目の測定から得られた平均光学密度の値上標準偏差Ｂ、競合イライザ法 ポリペプチド及び単離ＧＰＩｒｂ−１１１ａについて、ＰＭ　Ｉ　−１及びＴａ ｂモノクローナル抗体組成物中に含まれる抗体分子との免疫反応に対し、固相Ｇ ＰＩＩｂ−ｎ［ａと抗原として競合する能力を調べた。

競合イライザ法は、ｌ）ポリペプチドの代りに、例１で報告したように単離した ＧＰＩｌｂ−ｎｌａをコーティング溶液中２０μｇ／ｒａ１で用いてマイクロプ レートのウェルをコートすること、及び２）抗体を添加し、免疫反応混合物を作 る直前にウェルにＧＰＩ［ｂ−１［１ａもしくはポリペプチドを各々、０．７３ μＭもしくは２５μＭ濃度でウェルに添加すること、以外は、例７Ａで述べたよ うに行った。

第４表で示した、本研究の結果は、ｐ１２９−１４５及びＧＰＩＩｂ−ｎｌａが 競合的に、固相ＧＰＩｌｂ−［１ａに対するｌ”Ｍｌ−１抗体分子の免疫学的結 合を阻害する一方、ｐ１４４−１５６は阻害しないことを示している。加えて、 ポリペプチドは、Ｇ　Ｐ　ＩＩ　ｂ−ｍａと免疫反応するＴａｂ抗体分子の能力 に有意な影響を示さなかった。これらの結果は、ポリペプチドｐ１２９−１４５ がＰ１２９−１４５アミノ酸残基配列を含むｈＧＰＩｌｂ領域の二次構造及び抗 原決定基を真似る能力を有することを示している。

第４表 競合者　モノクローナル抗体 ＰＭＩ−Ｉ　Ｔａｂ ｐ１２９−１４５　０．０６７±０．００２’　１．００２±０．０２６ｐ１４ ４−１５６　０．８１４±０．０１２　１．１１７±０．０２４な　し　０．８ ０４±０．００２　１．０４０±０．０５Ｇｌ’１ｌｂ−１１１ａ　０．４３３ ±０．０１３　１．１３４±０．０１０１、五目の測定から得られた平均光学密 度値上標準偏差。

８、抗ペプチド抗血清の調製 抗ペプチド抗血清は、例５で調製したペプチドでウサギを免疫化することにより 作った。グルタルアルデヒドを用いた、抗原キャリヤーとしてチログロブリン（ ＭＯ州、セントルイス、シグマケミカル社、ウシ■型）へのペプチドの結合を、 参考として、ここに組込んだＪ、　Ｇ、ドクレー（Ｄｏｃｋｒａｙ）の報告（制 御ペプチド（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、１．１６９−１８６ 　（１９８０）　’）に従って行った。その後、−次免疫に、４００μｇのチロ グロブリン結合ペプチドを用いたこと以外は、例２で述べたように免疫化　゛を 行った。

９．　ポリペプチドによる、血小板会合ｃｐｎｂへの抗体結合の阻害 Ａ、血小板の調製 ′　例ＩＡで示したように調製した単離血小板を、１■／−２のＢＳＡ及び１■ ／■２デキストロースを含む無カルシウ、ムタイローズバッフｙ　（０，１３Ｍ 　ＮａＣｊ！、０．００２６Ｍ　ＫＣｆｆｉ、　０．００２Ｍ　ＭｇＣ１ｔ　− ６＋１ｚＯ，５ｍＭヘペス、０．０１２　Ｍ　ＮａＨＣＯｓ　、ｐＨ７，２）２ ＋／！に懸濁した。この血小板サスペンションを、同様のタイローズバッファで 平衡化したセファロースＣＬ２Ｂカラム（ＮＪ州、ビスカタウェイ、ファルマシ ア社、４０−ｉ全吸着床容積）にかけた、血小板を、最終容積的４〜５　ｖａ１ ２の、ＣＬ２Ｂカラムの空隙容量から回収し、洗浄血小板及びこの洗浄血小板サ スペンションと命名し、コールタ−社モデル■カウンター（ＦＬ州、バイアリー フ、コールタ−エレクトロニクス社）で計数した。

全血小板調製操作は、プラスチック容器中及び室温で行った。

Ｂ、血小板競合検定法 例９Ａで述べた、タイローズバッファ中に調製した洗浄血小板（２Ｘ１０”　／ 　ｍｌ）を、最終濃度５ｍＭとなるようなテトラエチレン四酢酸（ＥＤＴＡ）と 混合し、３０分間３７°Ｃに維持して、ＰＭＩ−１結合エピトープに露した。そ の後、この血小板を第２図に示した濃度のポリペプチドと混合し、さらに、例６ で調製した　ＩｔＳ■ラベル化ＰＭＩ−１と混合させて、生成した免疫反応混合 物中、１μＭのラベル化抗体を作る。この混合物を２２°Ｃに３０分間維持し、 免疫反応産物を形成させる。その後、１′１ラベル化ＰＭ　Ｉ　−１／血小板免 疫反応産物は、その維持した全混合物を、ベックマン・マイクロッエージＢ　（ ＣＡ州、フラートン、ベックマン・インスッルメント社）中、０．３ｓ＋ｊ！の ２０％スクロース中での遠心により未結合の”’Ｉ−ＰＭＩ−１から単離され、 血小板ペレットとした。血小板ペレットに会合した放射活性”’Ｉ−ＰＭＩ−１ の量を、シンチレーシッンスペクトロメトリーにより測定した。

第２図に示した、本研究の結果は、ポリペプチドｐ　１２．９−１４５が、二価 カチオンの非存在下、血小板メンブレン会合ｃｐｎｂへの、抗体分子結合を競合 的に阻害しうることを示している。また、第２図は、抗体分子濃度がｌＩｊＭの とき、５０％阻害が、１．６μＭのポリペプチド濃度で起こることから、ｐ１２ ９−１４５／ＰＭＩ−１相互作用のおよそのＫｄ値が１．２μＭであることを示 している。

１０、フィブリノーゲン結合血小板による、ｈｃｐｕｂ滑在的決定在的決定 基１ａで示したように、富血小板血漿（ＰＲＰ）を調製し、３つの部分標本に分 けた。１つの部分標本において、血小板を最終濃度５０μＭとなるようアデノシ ンニリン酸は添加することにより刺激して、官能性ＧＰｎｂ−ｍａ　（フィブリ ノーゲンレセプター）を発現させ、ＡＤＰ刺激血小板を生成した。第２の部分標 本において、最終濃度５０μＭのエピネフリンの添加によりＧＰｎａ−ｍａの発 現の刺激を行った０両方の場合、刺激を受けた血小板上に発現したＧＰＩ［ｂ− ｍａフィブリノーゲンレセプターは、血漿中に存在するフィブリノーゲンと結合 し、フィブリノーゲン結合血小板となる。ネガティブコントロールとして、ＰＲ Ｐの第３の部分標本は刺激せず、非刺激血小板とした。

通常の技術で、例６で述べた、ｌ！Ｓｌラベル化抗体から調製した、ｌ！Ｓｌラ ベル化ＰＭＩ−ＩＦａｂ断片を、最終濃度０．８６　Ｍとなるよう各ＰＲＰ部分 標本に添加した。このようにして生成した免疫反応混合物を３０分間３７°Ｃに 維持し、ラベル化した免疫反応産物、すなわち、フィブリノーゲン結合血小板／ 　”’　ｒ　−ｐｈｘ−１複合体を形成させた。それから、ラベル含有免疫反応 産物を、例９Ｂで述べたようなスクロースクッションを介した血小板の遠心によ り、未結合１”ｌ−ＰＭＩ−１から分離した。

第３図は、本研究の結果を示しており、ＰＭＩ−１抗体分子が、刺激化フィブリ ノーゲン結合血小板とは免疫反応するが、実質的に、非刺激化血小板とは免疫反 応しないことを示している。非刺激化ＰＲＰ部分標本中“結合”していると見な される１、ｓ　■−ＰＭ　１−１は、非特異的結合（″スティッキング″）、そ して、または、天然のバックグランドレベルの刺激化フィブリノーゲン結合血小 板もしくは、取扱いの結果として結合及び刺激化された血小板の存在によるもの であると考えられている。それゆえ、これらの結果は、ＧＰＩ［ｂ−ｍａササイ トアトへンによる、フィブリノーゲン、ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ　（ＲＧ　Ｄ　 ）アミノ酸残基配列含有リガンドの結合は、その他の潜在的抗原決定基を発現さ せることを示している。このように、ＰＭ　Ｉ　−１抗体分子及び同様の免疫特 異性を有する抗体分子は、血液サンプル中の刺激化フィブリノーゲン結合血小板 の存在及びその量の検定に使用することができる。

１１、ポリペプチドによる血小板凝集の阻害例ＩＡで述べたように調製した冨血 小板血漿（ＰＲＰ）２００μ２を、ＢＳＡ及びテキストロース（各々１■／＠２ ）を含むタイローズバッファ１９０ＩＩＮ及び第４表で示した種々の量のポリペ プチドｐ１２９−４５もしくはｐ１４４−ｔ５６と混合した。

それから１０μ２のＡＤＰ　（タイローズバッファ中８０μＭ）を添加して、血 小板凝集を刺激したいこの混合物を３７°Ｃに維持しながら、デュアルサンプル アグリゲーションメーター（Ｃｏ州、モリマン、シエンコ社、モデルＤＰ−２４ ７Ｅ）を用い、この混合物の透過率の時間変化をモニターした。

アグリゲーションメータは、２００μｉのＰＲＰ及び２００μｌのタイローズバ ッファを含む溶液を用い、コントロールアグリゲーションに対しては５％、及び ポリペプチド存在下のアグリゲーションに対しては１０％に透過率のベースライ ンをセットすることにより補正した。１００％透過率の上限は、１００ｍｊ！Ｐ ＲＰ及び３００μ尼のタイローズバッファの混合物を用いて一律に設定した。

１２、抗ペプチド抗血清を用いたｃｐｕｂ軽鎖の免疫反応例ＩＡで述べたように 調製した約１兆個の血小板を１　ｍｅの冷ＰＢＳ　（すなわち４°Ｃ）懸濁し、 ついで、２００ｔＩｇのラクトパーオキシダーゼ（シグマ社）及び２ｍＣ１の無 キャリヤーＮａ１１５■（１６ｍＣ１／μｇ、Ｉ　Ｌ州、アーリントンハイツ、 ７　？　−シ＋　ム）と混合し血小板ラベル化サスペンションを調製した。それ から、５分間隔で２回、０．０６％ストック溶液から５μｌのパーオキサイドを このサスペンションに添加し、４　’Ｃに維持して、ラベル化反応を開始させた 。その後、２００μｇのチロシンを加えて、この反応を停止させ、１２００ｘｇ 、１５分の遠心を５回繰り返して洗浄し、さらに冷ＰＢＳに懸濁して、ラベル化 血小板サスペンションを調製した。５番目の遠心ステップの後、このラベル化血 小板を、４０Ｉｌ１２の溶解バッファ（０，５％トライトンＸ−１００（ｖ／Ｖ ）　、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｔｔｇ／　ｍｌベンズアミジン及び１００ユニ ット／−２のトラシロール；全でシグマ社製）に懸濁することにより、ラベル化 血小板溶解物を調製した。

１　ａｈ（！のラベル化血小板溶解物を１５μｒの加熱失活化正常つサギ血清（ ＮＲ３）と混合し、２２℃に３０分間維持し、さらに、免疫反応バッファ（Ｉ　 ＰＢ　：　０．０２Ｍ）リス塩酸、ｐｌ＋７．４．０．１５６Ｍ　ＮａＣｊ’、 ０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭペンスアミジンー塩酸、１０μｇ／ｍｌ！ソイ ビーン・トリプシン・インヒビター、０．２ｍＭフェニルメチルスルホニル・フ ルオライド、１％（Ｖ／Ｖ））ライト：／Ｘ−１００，０，０５％［ｖ／Ｖ）） つ・イーン２０．０．０２％［ｗ／　Ｖ）　ＮａＮ５．５ユニット／ｍｌトラシ ロール；全でシグマ製）中に調製した、１０％（ｖ／Ｖ）ハイソービル（ＣＡ州 、ラジョラ、ベージング、ダイアグ／スディクス社）溶液１００μｌを添加し、 ベックマン、マイクロフユージＢ中で１分間遠心し、ついで生成した上清を単離 して、透明な溶解物を調製した。このＮＲ３の添加、維持、パンソービンの添加 及び遠心の透明化操作を２度繰り返してから、再び、ＮＲ３及び維持ステップを 省いた、パンソービンを用いる同様の操作を行ない、三回透明化溶解物を調製し た。

その後、この三回透明化溶解物を、２５０μｌのＩＰＢ、例８で調製した抗ポリ ペプチド抗血清４μ！、例２で調製した抗ＧＰＬ［ｂ−１■ａもしくはＮＲ３、 及び最終濃度１％となるようなウシ血清アルブミ、ンと混合した。この混合物を 、４℃に１２〜１８時間維持してから、１０％パンソービン１００μｌと混合し 、その後、２２℃に１時間維持した。その後、この混合物をマイクロッエージＢ で１分間遠心してから、生成したペレットを単離した。

この単離ペレットをＩＦＢで２回、０．５ＭＬｉＣ１で１回、再びＩＰＢで１回 洗浄した。この洗浄操作には、指示したバッファ約１Ｉ１１１への懸濁、マイク ロッエージＢでの１分間の遠心及び生成したペレットの単離が含まれる。

ついでこの洗浄ペレットを溶解して、レムリ（Ｌａｅ＋ｏｎ＋１ｉ）により報告 されているように、サンプルバッファ約１００＋＋＋ｊｉ中、３分間１００℃に 加熱することにより、存在する免疫複合体を脱離させる。例えば、レムリ（Ｌａ ｅｍｍｌｉ）　、Ｕ、　Ｋ。ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）、２２ ７．６８０−６８５　（１９７０）参照。その後、溶解免疫複合体をマイクロッ エージＢで１分間遠心してから、免疫沈殿化タンパク質を含む上溝を、５％２− メルカプトエタノールを含むレムリ　（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ）バッファーを用い、 １５％ポリアクリルアミドスラブゲルでの電気泳動で分析した。さらに、このゲ ルを乾燥し、そこに含まれているタンパク質をコダックＸ−オマット（Ｏｍａｔ ）　Ａ　Ｒフィルム（ＮＹ州、ロチニスター・イーストマン・コダック社）への 放射線露光により可視化した。この可視化タンパク質の分子量を、１２．３００ 及び！３７．４００ダルトンの範囲の分子量をもつ、″Ｃラベル化タンパク質標 準物質に相対的な電気泳動移動度に基づいて見積った（標準物質；ＭＡ州、ボス トン、ニューイングランドニュークリアー製）。

この方法で分析したラベル化溶解物は、約２０ＫＤａの分子量をもつ、ゲル上に 可視化されたタンパク質を生じ、このタンパク質は、ポリクローナル抗ＧＰＩＩ ｂ−１１１ａ抗血清もしくはＮＲ３を用いたときは実質的には検出されない、抗 ポリペプチドｐ１４４−１５６抗血清使用時（７）ＧＰＩＩｂ軽鎖タンパク質（ ＩＧＰＩｌｂ）に対応している。それゆえ、抗ポリペプチドｐ１４４−１５６抗 血清及び同免疫特異性を有する抗体組成物は、ＩＧＰＩｌｂを検出するのに用い ることができる。

１３、リガンド結合による、ＧＰＩＩｂ−１１１ａ潜在的抗原決定基の発現 Ａ、混合による、潜在的抗原決定基を発現する血小板への抗体結合の検定法 使用するタイローズバッファを始めに、キレックス１００（２００−４００メツ シユ、ナトリウム型、ＣＡ州、リッチセンド、バイオラド・ラボラトリーズ社） との混合し、タイローズバッファ中に存在する二価カチオンと錯体を作るよう維 持し、ついでバッファから、錯体を作った二価カチオンを濾過して除去する処理 を行うこと以外、例９Ａで述べた方法により、洗浄血小板を、ＩＩＩ！、当りｌ Ｘｌ０”個の濃度となるように調製した。

上記の洗浄化血小板含有調製溶液を部分標本に分けた後、各部分標本中の血小板 を、最終濃度５μＭとなるようにＡＤＰを添加することにより刺激してＡＤＰ刺 激化血小板を調製した。また、刺激を行なわないものも用意した。

まず、例６で述べたように調製した、Ｉ！ＳＩラベル化全抗化分抗体分子は、Ｉ ！ＳＩラベル化Ｆａｂ断片を含むモノクローナル抗体組成物を種々のポリペプチ ド及び二価カチオンもしくはＥＤＴＡと混合した。さらに、このｌｔＪラベル化 抗体／ポリペプチド混合物を、刺激化もしくは非刺激血小板部分標本と、結果と して、抗体もしくはＦａｂ断片濃度が約０．８ＭＭとなるように混合した。

それから、この免疫反応混合物を３０分間３７°Ｃに維持し、潜在的抗原決定基 を発現させ、かつ、ｌ！Ｓｌラベル化免疫反応産物、すなわち、リガンド結合血 小板／ＩｔＪ−抗体もしくは１．５）−Ｆａｂ断片複合体を形成させた。さらに 、ラベル含有免疫反応産物は、例９Ｂで報告されているように、スクロースクッ ションを介しての部分標本の遠心により、未結合１！Ｊラベル化抗体又はＰａｂ 断片から分離した。

第５表は、モノクローナル抗体ＰＭＩ−１を用いた、リガンド存在下の、血小板 へのラベル化抗体の結合を検定した結果を示す。

第５表 ＰＭＩ−１１ｇＧ又はＦａｂの血小板への結合におけるすがンド依存の増加 抗体種　リガンド２　結合ＰＭＩ−１の増加１未刺激　刺激化 ＰＭＩ−１１ｇＧ　ＫＹＧＲＧＤＳ　６３７８±７５３　６０００±７１４ＧＲ ＧＤＳＰ　５３１３±５２２　５５６１±１５８ＧＲＧ［ｉＳＰ　８９８±３５ ７　８３７±３７４＋＋−１２Ｎ、Ｄ、’　３６６３±８７８εＤＴ八　６０６ ４±５９３　５６７４±５１２ＰＭｉｌ　Ｐａｂ　ＫＹＧＲＧＤＳ　７７２２± １１８９　５６６１±３７３ＧＲＧロＳＰ　４４３７±８５２　５２５０±３０ ０ＧＲＧＥＳＰ　−２７９±２８１　１４７±１６５＋＋−１２Ｎ、０．　３０ １４±４３０ＥＤＴＡ　５２９９±２２５　６５０５±６６０１、結合したＰＭ Ｉ−１量の増加は、リガンド存在下での結合量から、リガンドは含まないが２　 ｒｎ　Ｍ　ＣａＣＩ２＊及びｌ　ｍＭ　ＭｇＣｊ２　を存在下での結合量を引い た値として観測される増加を、血小板力りに結合したＰＭ　Ｉ　−１分子数士標 準偏差として表現されている。

非刺激又は刺激化血小板に対する、二価カチオン存在がっリガンド非存在下での 結合量は、各々、ＰＭＩ−１１ｇＧに対し、６７６９±８４又は６６４３±１５ ７分子／血小板であり、また、ＰＭ　１−１　ｊａｂに対し、各々、３９１７± ２１２又は３７８５±１５０分子／血小板であった。

２、使用するリガンドは例５で述べたように調製した。指示されたポリペプチド の１つであり、例１３Ａで述べた免疫反応混合物中の最終濃度が１ｍＭとなるよ う添加するか、又は、アミノ酸配列ＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶを有し、残基３９ ９−４１０８（７）フィブリノーゲンガンマ鎮由来のものである。コントロール ポリペプチドＨ−１２で、これも１ｍＭｆｆ１加される。コントロールと・　し てのりガントポリペプチドの非存在下では、４．５　ｍＭ　ＥＩＩＴＡが添加さ れた。ＥＤＴＡを含まない全ての場合に、２ｍＭＣａＣｊ７゜及び１　ｍ　Ｍ　 ＭｇＣＩｌｚが含まレル。

３、測定せず。

第６表は、ハイブリドーマＰＭＩ−２より生産される全モノクローナル抗体又は Ｆａｂ断片（すなわち、ＰＭＩ−２モノクローナル抗体）を含むモノクローナル 抗体組成物を用いた、リガンド存在下での、抗体の血小板への結合の実験結果を 示している。

第６表 結合ＰＭＩ−２’ リガンド２　二価イオン３　未刺激　刺激化な　し　ＣａＣ１−１２２０２，４ ８０ＲＧＤＳ　ＣａＣｆ　２　２２１０　１０．７８０ＳＤＧＲＣａＣｌ　ｔ　 １９ＧＯ２，３（ｉｏＧＲＧＥＳＰ　ＣａＣ１２−１５６０４，６８０４００− ４１１ＣａＣＩｔ　２　１８４０　９．６５０Ｆｇ　ＣａＣ１ｚ　２３００　１ ３．８００な　Ｌ　！ＥＤＴ八　８６６０　１０．６７０ＲＧ［ｌＳ　ＩＥυＴ Ａ　８５４０　１０．０８０１、ＰＭＩ−２ＩｇＧの結合量は例１３Ａで示した ように測定し、指示して条件下、血小板当り結合したＰＭＩ−２分子数として表 現されている。

λ　使用したりガントは、例５で述べたように調製した、指示されるポリペプチ ドの１つであり、最終濃度０．５ｍＭとなるよう添加するか、もしくは、これも 、０．５ｍＭとなるよう添加される。

残基部位４００から４１１番のフィブリノーゲンガンマ鎖の配列に相当する配列 を有するポリペプチド、もしくは、最終濃度１５μＭで使用する、マーグエリー （Ｍａｒｇｕｅｒｉｅ）等（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー （Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、）　、２５４．５３５７−５３６３　（１９７９） ’）により報告されているように単離したフィブリノーゲン・タンパク質ＣＦｇ ）である、またコントロールとして、リガンドの添加がないものも行った。

３、　添加二価カチオンとは、１　ｍＭ　ＣａＣ１ｚか、又は５ｍＭＥＤＴＡの 二通りの条件を意味する。

第５表及び第６表に示した結果は、フィブリノーゲン（Ｆｇ）　Ｆｇ由来ペプチ ド、４００−４１１及びＲＯＤ含有ペプチドがＧＰＩ［ｂ−ｍａを結合し、かつ 、通常、抗原決定基が抑制される条件下、すなわち、ＣａＣ１ｔの生理学的濃度 存在下、ＰＭＩ−１又はＰＭＩ−２により認識される潜在的抗原決定基を露出さ せる能力を示している。

また、この結果は、ＰＭＩ−２により認識される潜在的抗原決定基はが刺激化血 小板とのりガント結合で誘導されるが、非刺激化血小板では誘導されないことを 示している。一方、ＰＭＩ−１により認識される潜在的抗原決定基は、刺激化、 もしくは非刺激化血小板の両方との、ポリペプチドリガンドの結合により誘導さ れる。

さらに、この結果は、ＧＰＩＩｂ−ｍａに対するこのリガンドの構造特異性も示 している。逆配列ペプチド、５ＤＧＲは、ＰＭＩ−２認識抗原決定基を誘導せず 、また、通常見うけられるアスパラギン酸残基（Ｄ）の代りに、グルタミン酸（ Ｅ）を用いる保存的置換は、潜在的抗原決定基誘導リガンドとして、かなり効果 の小さいペプチドを生ずる。

このポリペプチドリガンド、ＲＧＤＳ濃度を、上記の抗体の血小板結合検定法で 変化させた時、刺激化又は、非刺激化血小板上の潜在的抗原決定基のりガント誘 導に対する投与一応答曲線が得られた。潜在的抗原決定基を検出するためにＰＭ Ｉ−１又はＰＭＩ−２を用いた、投与一応答曲線の結果をＬＩＢＳ誘導率として 表現した、第５図に示す、ポリペプチド存在下結果したＩｇＧ量は、完全なりガ ント誘導結合部位（Ｌ　Ｉ　ＢＳ）の誘導の際の、ＩｇＧの最高結合量の割合と して表現されており、そこでは、４．５ｍＭＥＤＴＡ存在下及びペプチド非存在 下での血小板当りのＩｇＧ分子量として測定したＩｇＧ結合は、１００％誘導と して考え、また、２　ｍＭ　ＣａＣ１＊及び１ｍＭＭｇＣｊ！ｚ存在下、かつ、 ペプチド非存在下でのＩｇＧ結合は、０％誘導と考えた。

第５図に示した結果は、ポリペプチドリガンドが同じハーフマキシマムリガンド 濃度約２ｍＭで２つの異なる潜在的抗原決定基を誘導することを示している。さ らに、この結果は、ＰＭＩ−２により認識される決定基は、刺激化血小板では誘 導されるが、非刺激血小板では誘導されないが、一方、ＰＭＩ−１により認識さ れる潜在的抗原決定基ば、ＲＧＤＳを用いたとき、刺激化血小板及び非刺激血小 板の両方で誘導されることを示している。

ＰＭＩ−１及びＰＭＩ−２モノクローナル抗体の両方が抗ＬＩＢＳモノクローナ ル抗体である一方、これら２つの抗体の特異性は区別可能なものであることに注 意すべきである。従って、リガンドによるレセプターの占有は１つ以上のＬＩＢ Ｓを誘導しうる。結果として、本発明の方法は、細胞表面レセプターリガンド複 合体と免疫反応する１種以上のモノクローナル抗体を生産するのに使用すること ができる。

Ｂ、潜在的抗原決定基を発現する可溶性精製ＧＰｎｂ−ｍａへの抗体結合の検定 潜在的抗原決定基の発現を誘導する、種々のポリペプチドの能力を、可溶性の単 離ＧＰＩ［ｂ−ｍａを用いて研究した。

最後に、次に示すこと以外は、例７Ｂで述べた様に、競合イライザ法を行った。

マイクロプレートは、ｖａｎ当り１０＃ｇ濃度の、例１で述べた様に単離したＧ ＰＩＩｂ−Ｉｆｆａを含むコート溶液を用いてコーティングした。ブロッキング 後、全ての使用される溶液は、その使用前、例１３Ａでタイローズバッファにつ いて述べたように、キレックス１００で処理した。（１）例５で述べたように調 製した１、５ナノモル濃度のＰＭＩ−１ＩｇＧ、又は、例７Ａで述べた、Ｔａｂ ハイブリドーマ、（２）　２　ｍ　Ｍ　ＣａＣｌ　ｔ　−（３）例１で述べたよ うに単離し、ＰＭＩ−１検定に対しては、４０ｔ１ｇ／−２の濃度、また、Ｔａ ｂ検定に対しては４μｇ／ｍｌの濃度となるように添加されるＧＰＩｌｂ−ｍａ 及び（４）　１　ｍ　Ｍのポリペプチドを含む免疫反応混合物を調製した。この 免疫反応混合物を１６〜２０時間、２２“Ｃに維持して、固相結合ＧＰＩＩｂ− １［１ａ及び添加した抗体間の、第１の固相結合免疫反応産物を形成させる。

上述の実験結保を以下の第７表に示した。

第７表 溶液中でのＧＰＩＩｂ−Ｉｌｌａへのリガンド結合により誘導されるＰＭＩ−１ 依存潜在的抗原決定基の発現発現率１ リガンド’ＰＭＩ−ＩＴａｂ ＫＹＧＲＧＤＳ　６５±２２　（３）　９８±２５　（３）ＧＲＧＤＳＰ　５３ ±２２　（５）　８５±２７　（３）ＲＧＤＳ　４２±１６（３）　９２±１１ 　（３）ＧＲＧＥＳｒ’　１８±１３（３）　１０６±２４　（３）ＳＤＧＲ１ ８±１３（３）　７９±２５　（３）コントロール　２０±９（５）　８４±１ ３　（４）１、発現率は、ポリペプチドリガンド結合により、誘導されるＧＰｎ ｂ−Ｉｆｌａ上に存在する潜在的決定基の尺度となる。このデータは、５ｍＭ　 ＥＤＴＡの存在下、ＧＰＩｌｂ−１１１ａを用いて得られた最高の決定基発現の 割合として表わされている。各条件下で行った測定数をカッコ中に示し、また、 その結果は、それらの測定値の平均値上標準偏差で示した。

２、　添加したリガンドは、例５で述べたように合成し、その配列は、−文字コ ードで示したポリペプチドである。“コントロール”とは、ポリペプチドを添加 しなかったことを意味する。

第７表に示した結果は、ＲＧＤ含有ポリペプチドリガンドは本来の血小板を用い て観察されたのと同じような方法で（例えば第６表参照）、ＧＰＩｌｂ−１１１ ａによる、潜在的抗原決定基の発現を誘導することを示している。リガンド誘導 の発現の特異性は、逆配列（ＳＤＧＲ）又は、保存的置換（ＧＲＧＥＳＰ）を有 するポリペプチドを用いることにより確証され、またさらに、Ｔａｂモノクロー ナル抗体結合に関して有意なりガントの影響が観察されなかったことにより確証 された。これらの結果は、モノクローナル抗体ＰＭＩ−１により認識される潜在 的抗原決定基のリガンド誘導の発現は、ＧＰＩＩｂ−ｍａの本質的性質でありま た、ＧＰＩ［ｂ−ｍａの血小板との会合に依存しないことを示している０例を要 する特別な態様を含む、先に示した明細は本発明を説明するためのもので、制限 を意図したものではない０本発明の精神及び範囲を逸脱することなしに、多くの 変化及び修正を行うことができる。

ＦＩＧ、１ ＰＭＩ、１給合（ｃｐｍ　ｘ　１０’）ＦＩＧ、　３ 透過率 透過率 ＬＩＢＳ誘導（％） 国際調査報告 １“ｌ−１−１“２°＋″′１１″ｐＩ−ｒ／ｎｑＲＲ１０２３，２１ａｍ＋ｔ ａｍｍ＾ロー【航１・”−’Ｏｒ”〒ＩＴｉ＜ＲＱｌｎ’）ｉ１５ＰＣＴ／ＵＳ ８８１０２３１２ Ｇｒｏｕｐ　ｍＶ、　ｃｌａｉｍｓ　１１３．２１．２５　ａｎｄ　３０　ｄｒ ａｗｎ　ｔｏ　ｉｎ　ｖｉｖ。

ａｓｓａｙｓ。

ＰＣＴ／１Ｊｓ８８１０２３１２ μ■四三ρ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、　ｃｒｙｐセｉｃ、　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ、　ａ ｎｔｉｇｅｎ？、　ａｎｔｉｂｏｄｙ。

ｍｏｎ口ｃｌｏｎａｌ、　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、　ａｓｓａｙ？、　ｄｉａｇｎ ｏｓ？、ｉｍａｇｉｎｇ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）第１図の約５０番から約２２７番の残基で示されるアミノ酸残基配列を有 するｈＧＰＩＩｂタンパク質の一部をコードする構造遺伝子を定義する配列を含 む、多くとも約１２，０００個のヌクレオチド塩基対を含むＤＮＡ断片。 （２）上記構造遺伝子が、第１図の塩基約１４８番から約６．８１番で表わされ るヌクレオチド塩基配列を有する、請求項（１）記載のＤＮＡ断片。 （３）上記構造遺伝子が、第１図の塩基約１番から約１１０４番で表わされるヌ クレオチド塩基配列を有する、請求項（１）記載のＤＮＡ断片。 （４）第１図の残基５０番から１４５番で表わされるアミノ酸残基配列を有する ｈＧＰＩＩｂの一部をコードする構造遺伝子を定義するＤＮＡ断片を機能的に結 合したベクターを含む組換えＤＮＡ分子。 （５）上記構造遺伝子が、第１図の残基約１番から約２２７番で表わされるアミ ノ酸残基配列を有するタンパク質をコードする、請求項（４）記載の組換えＤＮ Ａ分子。 （６）上記構造遺伝子が第１図の塩基約１４８番から約６８１番で表わされるヌ クレオチド塩基配列を有する、請求項（５）記載の組換えＤＮＡ分子。 （７）上記ベクターが上記ＤＮＡ断片の複製を行うことができる、請求項（５） 記載の組換えＤＮＡ分子。 （８）上記ベクターが宿主細胞中で上記構造遺伝子を発現することができる、請 求項（５）記載の組換えＤＮＡ分子。 （９）多くとも約５０個のアミノ酸残基を含み、かつ、式−ＰＳＰＳＰＩＨＰＡ ＨＨＫＲＤＲＲＱ−で表わされる配列に対応するアミノ酸残基配列を含む、ｈＧ ＰＩＩｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログ。 （１０）上記ポリペプチドが、式 ＰＳＰＳＰＩＨＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ で表わされるアミノ酸残基配列を有する、請求項（９）記載のポリペプチド。 （１１）基本的に、ａ）式 ＰＳＰＳＰＩＨＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ で表わされるポリペプチドと免疫反応する、そして、ｂ）、式 ＲＥＱＮＳＬＤＳＷＧＰＫＶ で表わされるポリペプチドと、実質的に免疫反応しない、抗体分子を含む抗体組 成物。 （１２）刺激した、フィプリノーゲン結合血小板と免疫反応する抗体分子を生成 する、ＰＭＩ−１と命名されるハイプリドーマ。 （１３）刺激した、フィプリノーゲン結合血小板と免疫反応する、ハイブリドー マＰＭＩ−１により生成される抗体分子を含むモノクローナル抗体組成物。 （１４）刺激した、フィプリノーゲン結合血小板と免疫反応する、抗体分子を生 成する、ＰＭＩ−２と命名される、ハイプリドーマ。 （１５）刺激した、フィプリノーゲン結合血小板と免疫反応する、ハイブリドー マＰＭＩ−２により生成される抗体分子を含むモノクローナル抗体組成物。 （１６）ａ）少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量の、レセプターリガン ド複合体と免疫反応するが、いずれも非結合型のとき、その細胞表面レセプター とも、リガンドとも免疫反応しない抗体分子を含むモノクローナル抗体組成物を 含むパッケージ、 を含む、特異的に結合した細胞表面レセプター及びリガンドを含む、血液サンプ ル中のレセプターーリガンド複合体の存在を検定するための、キット型の診断シ ステム。 （１７）上記抗体分子が放射性核種でラベルされている、請求項（１６）記載の 診断システム。 （１８）ａ）少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量の、上記レセプターー リガンド複合体とは免疫反応するが、それぞれ非結合型の細胞表面レセプター又 は、リガンドとは免疫反応しない、インビボ指示手段と結合した抗体分子分子を 含むモノクローナル抗体組成物を含むパッケージ、を含む、特異的に結合した細 胞表面レセプター及びリガンドを含む、細胞レセプターーリガンド複合体を、イ ンビボで検定するための、キット型の診断システム。 （１９）ａ）少なくとも１回の検定を行うのに十分な量の、ハイブリドーマＰＭ Ｉ−１又はＰＭＩ−２により生成される抗ＧＰＩＩｂ一ＩＩＩａ抗体分子を含む パッケージ、を含む、血液サンプル中の、ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ−リガンド複合 体を発現する血小板の存在を検定するための、キット型の診断システム。 （２０）上記抗体分子が放射性核種でラベル化され、かつモノクローナル抗体組 成物として存在する、請求項（１９）記載の診断システム。 （２１）ａ）少なくとも１回の検定を行うのに十分な量の、ハイブリドーマＰＭ Ｉ−１又はＰＭＩ−２により生成される、インビボ指示手段と結合した抗ＧｐＩ Ｉｂ−ＩＩＩａ抗体分子を含むモノクローナル抗体組成物を含むパッケージ、を 含む、インビボで血栓の存在を検定するための、キット型の診断システム。 （２２）特異的に結合する細胞表面レセプター及びリガンドを含む、レセプター ーリガンド複合体により発現される、リガンド誘導結合部位と免疫反応するモノ クローナル抗体を生成する方法で、ａ）該複合体でホ乳類を免疫化する、 ｂ）該免疫化ホ乳類から抗体生産細胞を取り出し、そして該細胞のサスペンジョ ンを作る、 ｃ）該細胞をトランスホーム剤で処理し、トランスホーム化抗体生産細胞を作る 、 ｄ）非トランスホーム化細胞は生存できない組織培養培地に限定希釈することに より、ステップ（ｃ）で処理した細胞をクローン化し、クローン化したトランス ホーマントを作る、ｅ）該クローン化トランスホーマントの組織培養培地を、該 レセプターーリガンド複合体とは免疫反応するが、各々非結合型の細胞表面レセ プター又はリガンドとは免疫反応しない、分泌抗体分子の存在について評価する 、ｆ）組織培養培地中、該分泌抗体分子を生成するクローン化トランスホーマン トを選択し、かつ生育させる、及びｇ）該選択及びクローン化トランスホーマン トの培養培地から、該分泌抗体分子を収穫する、 上記（ａ）〜（ｇ）のステップを含む方法。 （２３）特異的に結合する、細胞表面レセプター及びリガンドを含む、レセプタ ーーリガンド複合体により発現される、リガンド誘導結合部位と免疫反応する、 モノクローナル抗体を生成する方法で、 （３）該複合体でマウスを免疫化する、（５）該マウスから脾臓を取り出し、つ いで脾細胞のサスペンジョンを作る、 （ｃ）融合促進剤の存在下、該脾細胞をマウスのミエローマ細胞と融合し、抗体 分泌ハイプリドーマを作る、（ｄ）未融合ミエローマ細胞は生存できない培地に 希釈し、分離したウェル中で、この融合細胞を培養する、（ｅ）ハイプリドーマ を含む各ウェル中の上清を、該レセプターーリガンド複合体とは免疫反応するが 、各々非結合型である、細胞表面レセプターもしくはリガンドとは免疫反応しな い、分泌抗体分子の存在について評価する、（ｆ）該抗体分子を分泌するハイプ リドーマを選択及びクローン化する、そして、 （ｇ）該クローンの上清から、抗体分子を収穫する、以上（ａ）〜（ｇ）のステ ップを含む方法。 （２４）特異的に結合する表面レセプター及びリガンドを含む、レセプターーリ ガンド複合体により発現される、リガンド誘導結合部位と免疫反応するモノクロ ーナル抗体を生成する方法で、（ａ）該複合体でマウスを免疫化する、（６）該 マウスから脾臓を取り出し、ついでこの脾細胞のサスペンジョンを作る、 （ｃ）融合促進剤の存在下、該脾細胞をマウスミエローマ細胞と融合して、抗体 分泌ハイプリドーマを作る、（ｄ）非融合細胞は生存できない培地で融合細胞を 希釈し、分離したウェル中での培養する、 （ｅ）ハイプリドーマを含む各ウェル中の上清を、該細胞表面レセプターーリガ ンド複合体とは免疫反応するが、各々非結合型の、細胞表面レセプター又はリガ ンドとは免疫反応しない、分泌抗体分子の存在について評価する、（ｆ）該抗体 分子を分泌するハイプリドーマを選択及びクローニングを行う、 （ｇ）該クローンを、マウスの腹腔内に移す、及び（ｈ）望ましい抗体を含む腹 水又は血清を、該マウスから収穫する、 以上の（ａ）〜（ｈ）のステップを含む方法。 （２５）特異的に結合する細胞表面レセプター及びリガンドを含む、レセプター ーリガンド複合体の存在を、インビボで検出する方法で、 ａ）該レセプターーリガンド複合体と免疫反応しかつ、各々、非結合型の細胞表 面レセプター又はリガンドとは免疫反応しない、インビボの指示手段に結合した 抗体分子及び生理学的に許容しうる希釈剤を含む、効果量のモノクローナル抗体 を被検者に静脈投与する、 ｂ）該抗体分子がインビボで該レセプターーリガンド複合体と免疫反応しかつ、 免疫反応産物を生成するのに十分な予め決められた時間、投与した被検者を維持 する、ｃ）ステップｂ）で生成した免疫反応産物の存在及びそれによる該被検者 における該複合体の存在を検定する、以上、ａ）〜ｃ）のステップを含む方法。 （２６）特異的に結合する細胞表面レセプター及びリガンドを含む、血液サンプ ル中のレセプターーリガンド複合体の存在を検定する方法で、 ａ）血液サンプルを、該レセプターーリガンド複合体とは免疫反応するが、各々 非結合型の細胞表面レセプター又は、リガンドとは免疫反応しない抗体分子を含 むモノクローナル抗体組成物と混合することにより、免疫反応混合物を作る、ｂ ）該抗体がサンプル中に存在するレセプターーリガンド複合体と免疫反応し、か つ免疫反応産物を作るのに十分な時間、この混合物を維持する、 ｃ）ステップｂ）で生成した免疫反応産物の存在及びそれによる該サンプル中の 該複合体の存在を検出する、以上ａ）〜ｃ）のステップを含む方法。 （２７）該複合体の該細胞表面レセプターがサイトアドヘシンである、請求項（ ２６）記載の方法。 （２８）該アドヘシンが血小板糖タンパク質ＧｐＩＩｂ−ＩＩＩａである、請求 項（２７）記載の方法。 （２９）血小板含有血液サンプルを、ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ−リガンド複合体を 発現する血小板の存在について検定する方法で、ａ）ハイプリドーマＰＭＩ−１ 又はＰＭＩ−２により生成されるＧｐＩＩｂ−ＩＩＩａ抗体分子を含む、効果量 のモノクローナル抗体組成物を、血液サンプルと混合することにより、免疫反応 混合物を作る、 ｂ）該抗体が、サンプル中に存在するフィプリノーゲン結合血小板と免疫反応し 、かつ、免疫反応産物を生成するのに十分な時間、この混合物を維持する、 ｃ）ステップｂ）で生成した免疫反応産物の存在を検定する、以上のａ）〜ｃ） のステップを含む方法。 （３０）ａ）ハイプリドーマＰＭＩ−１又はＰＭＩ−２により生成される、イン ビボ指示手段に結合した抗ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ抗体分子及び生理学的に許容し うる希釈剤を含む、効果量のモノクローナル抗体組成物を被検者に静脈投与する 、ｂ）該抗体分子がインビボでフィプリノーゲン結合血小体と免疫反応し、免疫 反応産物を生成するのに十分な予め決められた時間、この投与された被検者を維 持する、ｃ）ステップｂ）で生成した免疫反応産物の存在を検定する、以上ａ） 〜ｃ）のステップを含む、インビボで、血栓の存在を検出する方法。