JP3541122B2 - 細胞表面レセプター−リガンド複合体に対するモノクローナル抗体を使用する診断システム、かかるモノクローナル抗体の生成方法、並びに、そのモノクローナル抗体を使用する検定方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞表面レセプター−リガンド複合体に特異的に結合するモノクローナル抗体を使用する診断システム、かかるモノクローナル抗体の生成方法、並びに、そのモノクローナル抗体を使用する検定方法に関する。
【０００２】
【発明の技術的背景】
一般的に、細胞粘着（adhesion）は、細胞表面レセプターによる特異的粘着タンパク質の認識と関係している。本発明に特に興味のもたれる一群の細胞表面レセプターは、インテグリン（integrin）である。
ハインズ（Hynes)（セル（Cell）、４８、５４９−５５４（１９８７））によれば、インテグリンは、細胞外マトリクス糖タンパク質、補体及び他の細胞と相互作用を起こす機能的及び構造的に関連した一群のレセプターである。インテグリンは、発生学的発生、止血、血栓症、傷害治癒、免疫及び非免疫防御メカニズム、及び腫瘍遺伝子トランスホーメーションを含む、多くの生理学的に重要なプロセスにおける、細胞−マトリクス及び細胞−細胞粘着に関与している。２つのヒトの遺伝病、グラスマン・トロンバスセニア及び白血球粘着欠損症は、インテグリン類のいくつかを冒している。
【０００３】
構造的に、インテグリンは、アルファ及びベータサブユニットが非共有的に会合したヘテロ二量体的複合体である。インテグリン類の中には、同様のベータサブユニットが存在することによって、関連づけられるグループがあり、また、各グループの中のメンバーは、独特のアルファサブユニットによって区別される。例えば、ＧＰIIｂ− IIIａは、アルファ及びベータサブユニットからなる非共有性、Ｃａ⁺⁺依存性のヘテロ二量体複合体である。ジェニングス（Jennings）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）２５７、１０４５８−１０４６６（１９８２）。アルファ・サブユニット、ＧＰIIｂは約１２０キロダルトン（KDa)の相対分子量を有する重鎖（ｈＧＰIIｂ）及びジスルフィド結合でこれと結合している約２０KDa の軽鎖（ｌＧＰIIｂ）からなる。ベータサブユニット、ＧＰ IIIａは約１００KDa の一本鎖ポリペプチドである。フィリップス（Phillips）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）２５２、２１２１−２１２６（１９７７）。免疫学的に、ＧＰIIｂ− IIIａと関連する細胞表面分子は、多くの細胞型で同定されてきている。チアガラジャン（Thagarajan）等（ジャーナル・オブ・クリニカル、インベスチゲーション（J. Chem. Invest.）７５、８９６−９０１（１９８５）、プロー（Plow）等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acsd. Sei.）ＵＳＡ、８３、６００２−６００６（１９８６）及びフィッツジエラルド（Fitzgerald）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）２６０、１０８９３−１０８９６（１９８５）参照。
【０００４】
ＧＰIIｂ− IIIａは、フィブリノーゲン〔ベネット（Bennett)等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sei.）ＵＳＡ、８０、２４１７−２４２１（１９８３）〕、フィブロネクチン〔ギンスベルグ（Ginsberg）等、ジャーナル・オブ・クリニカル、インベスチゲーション（J. Chem. Invest.）７１、６１９−６２４（１９８３）〕及びフォン・ウィルブランド因子〔ルゲリ（Ruggeri)等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sei.）ＵＳＡ、７９、６０３８−６０４１（１９８２）〕などのＲＧＤ含有タンパク質との相互作用を通して血小板機能に寄与しており、従って、一般的血小板粘着タンパク質レセプターの一成分である（ピテラ（Pytera）等、サイエンス（Science)２３１、１５５９−１５６２（１９８６）及びプロー（Plow）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）２５９、５３８８−５３９１（１９８４）。
【０００５】
最近、ＧＰIIｂ− IIIａは、同様のベータサブユニット及びトリペプチドアミノ酸残基配列Ａrg−Ｇly−Ａsp（一文字記号を用いるとＲＧＤ）を認識する機能的性質をもつ、いくつかの粘着レセプターのうちの１つであるという証拠が示された。ピテラ（Pytera）等、サイエンス（Science)２３１、１５５９−１５６２（１９８６）及びルオスラティ（Ruoslahti)等、セル（Cell）、４４、５１７−５１８（１９８６）。ＧＰIIｂ− IIIａに加えて、関連するレセプターのグループには、オステオザルコーマから単離したヒドロネクチンレセプター（ＶｎＲ）及びフィブロネクチンレセプター（ＦｎＲ）が含まれる（ピテラ（Pytera）等、セル（Cell）、４０、１９１−１９８（１９８５）、ピテラ（Pytera）等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sei.）ＵＳＡ、８２、５７６６−５７７０（１９８５）及びサンチェス・マドリッド（Sanches-Madrid）等、ジャーナル・オブ・エススペリメンタル・メディシン（J. Exp. Med.）１５８、１７８５−１８０３（１９８３））。
【０００６】
これらタンパク質の同様の機能的、構造的及び抗原的性質は、ＧＰIIｂ− IIIａ及びＶｎＲが、“サイトアドヘシン”という名前が提唱された粘着レセプターグループのメンバーであることを示している。プロー（Plow）等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sei.）ＵＳＡ、８２、６００２−６００６（１９８６）。サイトアドヘシングループでは、独特のアルファサブユニットが共通もしくは非常に類似しているベータサブユニットと結合しており、機能的に区別しうるレセプターとなる。ギンスバーグ（Ginsbsrg）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol. Chem.）２６２、５４３７−５４４０（１９８７）。
ヘテロ二量体粘着レセプターの少なくとも２つの他のグループが同定されており、それらの場合、１つの共通ベータサブユニットは、独特のアルファ・サブユニットのいくつかと結合している。１つのグループは、白血球で見られるもので、白血球粘着群と呼ばれ、ＬＦＡ−１、Ｍac−１、Ｐ１５０、９５が含まれる。サンチェス・マドリッド（Sanchez-Madrid）等、ジャーナル・オブ・エススペリメンタル・メディシン（J. Exp. Med.）１５８、１７８５−１８０３（１９８３）及びスプリンガー（Springer）等、（シバ・ファウンド・シンポジウム）（Ciba, Found, Symp.）１１８、１０２−１２６（１９８６）。その他のものはより広く分布しており、ＶＬＡ族と呼ばれている（ヘムラー（Hemler）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）２６２、３３００−３３０９（１９８７））。チキンのＶＬＡ族のベータサブユニット〔ヘムラー（Hemler）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）２６２、３３００−３３０９（１９８７）がクローン化され、配列決定され、“インテグリン”と命名された（タムクン（Tamkun）等、セル（Cell）、４６、２７１−２８２（１９８６）〕。チキン・インテグリンの配列はＧＰ IIIａのもの〔フィッツジエラルド（Fitzgerald）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）２６２、３９３６−３９３９（１９８７）〕及び白血球粘着族のベータサブユニットのベータサブユニットのもの〔キシモト（Kishimoto)等、セル（Cell）４８、６８１−６９０（１９８７）〕と同様である。さらに、いくつかのアルファサブユニットの部分配列も類似性を示している。ギンスベーグ（ginsberg）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）２６２、５４３７−５４４０（１９８７）；スズキ（Suzuki）等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sei.）ＵＳＡ、８２、８６１４−８６９８（１９８６）及びシャロ（Charo)等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sei.）ＵＳＡ、８３、８３５１−８３５６（１９８６）。
【０００７】
粘着レセプターとしてのそれらの機能に基本的なＧＰIIｂ− IIIａ又はその他のサイトアドヘシン上の部位は、現在でも不明である。いくつかの観察は、ＧＰIIｂ− IIIａ上の機能的に重要な部位は、モノクローナル抗体ＰＭＩ−１で決定されるエピトープ付近にあることを示している。この抗体は、ＧＰIIｂの重鎖に結合し〔シャドル（Shadle）等、ジャーナル・オブ・セルラー・バイオロジー（J. Cell. Biol.）９９、２０５６−２０６０（１９８４）、いくつかの独特な機能活性に関連するＧＰIIｂの領域を限定する。第１に、ＰＭＩ−１は、洗浄した血小板のコラーゲンへの粘着を阻害する。シャドル（Shadle）等、ジャーナル・オブ・セルラー・バイオロジー（J. Cell. Biol.）９９、２０５６−２０６０（１９８４）。第２に、本領域の表面での配向は、カルシウム又はマグネシウムのミルモル濃度（mM）がＰＭＩ−１エピトープの発現を抑制することから、二価カチオンにより制御される。ギンスバーグ（Ginsberg）等、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスチゲーション（J. Clin. Invest.）７８、１１０３−１１１１（１９８６）。第３に、この部位の構造の異常な二価カチオン制御は、機能的にトロンバスセニック状態と関連している。ギンスバーグ（Ginsberg）等、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスチゲーション（J. Clin. Invest.）７８、１１０３−１１１１（１９８６）。第４に、１００ミリモル濃度までのアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）又はエピネフリン、ミリリットル当り１ユニットのトロンビン、又は、ミリリットル当り５０マイクログラムのウシ皮膚コラーゲンによる血小板の刺激は、実質的に、血小板に対するＰＭＩ−１抗体の結合を、バックグランド以上に増加させることはなかった。
【０００８】
現在、特異的にリガンドと結合した細胞表面レセプターは、リガンド誘導抗体結合部位（ＬＩＢＳ）の存在により、非占有レセプターと区別できることが分っている。すなわち、細胞表面レセプターが特異的にリガンドと結合したときに発現するが、非占有レセプター又は非結合領域リガンドのいずれかによっても発現されない一群の抗原決定基が発見されている。
従って、ある態様において、本発明は、特異的に結合した細胞表面レセプター及びリガンドを含む、レセプター−リガンド複合体によって発現された、リガンド誘導結合部位と免疫反応するモノクローナル抗体を作る方法を考案しており、この方法には、
(a) ホ乳類をこの複合体で免疫化すること；
(b) 免疫化したホ乳類から抗体産生細胞を取り出し、この細胞のサスペンジョンを作ること；
(c) この細胞をトランスホーミング剤で処理して、トランスホームした抗体産生細胞を生成すること；
(d) 非トランスホーメーション細胞は生存できない組織培養培地で制限希釈することにより、ステップ（ｃ）で処理した細胞をクローニングし、クローン化トランスホーマントを作ること；
(e) レセプター−リガンド複合体と免疫反応するが、いずれも非結合型の細胞表面レセプター又はリガンドとは免疫反応しない分泌抗体分子の存否について、該クローン化トランスホーマントの組織培養培地の評価を行うこと；
(f) 分泌抗体分子を生産するクローン化トランスホーマントを選択し、組織培養培地中で生育させること；及び
(g) 選択され、かつクローン化されたトランスホーマントの培養培地から、分泌抗体分子を収穫すること、
が含まれる。
【０００９】
別の態様において、本発明は、特異的に結合した細胞表面レセプター及びリガンドを含むレセプター−リガンド複合体によって発現される、リガンド誘導結合部位と免疫反応するモノクローナル抗体を生成する方法を考案しており、その方法には、
(a) マウスを該複合体で免疫化すること；
(b) 該マウスから脾臓を取り出し、この脾細胞のサスペンジョンを作ること；
(c) 融合プロモーターの存在下、この脾細胞とマウスのミエローマ細胞と融合し、抗体分泌ハイブリドーマを生成すること；
(d) 分離したウェル中、未融合ミエローマ細胞を生育させない培地で希釈し、この融合細胞を培養すること；
(e) レセプター−リガンド複合体と免疫反応するが、非結合型の細胞表面レセプターもしくはリガンドとは免疫反応しない、分泌抗体分子の存在について、ハイブリドーマを含む各ウェル中の上清を評価すること；
(f) 抗体分子を分泌するハイブリドーマを選択し、これをクローニングすること；及び
(g) 上記クローンの上清から、抗体分子を収穫することが含まれる。
【００１０】
さらに、特異的に結合した表面レセプター及びリガンドを含む、レセプター−リガンド複合体により発現される、リガンド誘導結合部位と免疫反応するモノクローナル抗体を生成する方法を考案しており、その方法には、
(a) マウスを該複合体で免疫化すること；
(b) 該マウスから脾臓を取り出し、この脾細胞のサスペンジョンを作ること；
(c) 融合プロモーターの存在下、この脾細胞とマウスのミエローマ細胞と融合し、抗体分布ハイブリドーマを生産すること；
(d) 分離したウェル中、未融合ミエローマ細胞は生育できない培地で希釈し、この融合細胞を培養すること；
(e) 細胞表面レセプター−リガンド複合体とは免疫反応するが、非結合型の細胞表面レセプター又はリガンドとは免疫反応しない分泌抗体分子の存在について、ハイブリドーマを含む各ウェル中の上清を評価すること；
(f) この抗体分子を分泌するハイブリドーマを選択し、クローニングすること；
(g) このクローンを、マウス腹腔内に移すこと、そして、
(h) 望ましい抗体を含む、マウスの腹水又は血清を収穫すること；
が含まれる。
【００１１】
また、特異的に結合した細胞表面レセプター及びリガンドを含む、レセプター−リガンド複合体の存在を、インビボで検出する方法を考案しており、その方法には、
(a) 生理学的に許容される希釈剤及びレセプター−リガンド複合体と免疫反応するが、非結合型の細胞表面レセプター又はリガンドとは免疫反応しない、インビボの指示手段を結合した抗体分子を含む、効果量のモノクローナル抗体組成物を被検者に静脈注射する、
(b) インビボで抗体分子がレセプター−リガンド複合体と免疫反応し、免疫反応産物を形成するのに十分な、予め決めた時間、その被投与者を維持する、
(c) ステップ（ｂ）で形成して免疫反応産物の存在及びそれによる被検者中の複合体の存在を検定する、
以上のステップが含まれている。
【００１２】
また、さらに、血液サンプル中の、特異的に結合した細胞表面レセプター及びリガンドを含む、レセプター−リガンド複合体の存在を検定する方法を考案しており、その方法には
(a) 血液サンプルを、該レセプター−リガンド複合体とは免疫反応するが、いずれも非結合型の細胞表面レセプター又はリガンドとは免疫反応しない抗体分子を含むモノクローナル抗体組成物と混合することにより免疫反応混合物を作る；
ｂ） 抗体分子が、サンプル中に存在するレセプター−リガンド複合体と免疫反応し、かつ免疫反応産物を形成するのに十分な時間、この混合物を維持する；ｃ） ステップ（ｂ）で形成した免疫反応産物の存在を検出し、かつそれによりサンプル中の複合体の存在を検出する、
以上のステップが含まれる。
【００１３】
なお、ここでは、ＧＰIIｂ− IIIａ−リガンド複合体を発現する血小板の存在について、血小板を含む血液サンプルを検定する方法も開示され、その方法には、
(a) 血液サンプルを、ハイブリドーマＰＭＩ−１又はＰＭＩ−２によって生産されたＧＰIIｂ− IIIａ抗体分子を含む、効果量のモノクローナル抗体組成物と混合することにより、免疫反応混合物を作る；
(b) 該抗体がサンプル中に存在するフィブリノーゲン結合血小板と免疫反応し、免疫反応産物を生成するのに十分な時間、この混合物を維持する；
(c) ステップ（ｂ）で生成した免疫反応産物の存在を検出する、
以上のステップが含まれる。
【００１４】
また、インビボで血栓の存在を検定する、
(a) 生理学的に許容される希釈剤及びハイブリドーマＰＭＩ−１又はＰＭＩ−２から生産される、インビボ指示手段と結合した抗ＧＰIIｂ− IIIａ抗体分子を含む、効果量のモノクローナル抗体組成物を被検者に静脈注射する；
(b) 抗体分子がインビボでフィブリノーゲン結合血小板と免疫反応し、かつ、免疫反応産物が生成されるのに十分な、予め決められた時間、被投与者を維持する；
(c) ステップ（ｂ）で生成した免疫反応産物の存在を検出する、
以上（ａ）〜（ｃ）のステップを含む方法が開示されている。
特異的に結合した細胞表面レセプター及びリガンドを含む血液中のレセプター−リガンド複合体の存在を検定する、キット型の診断システムも開示されており、そのシステムには、
(a) 少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量の、該レセプター−リガンド複合体と免疫反応するが、非結合形の細胞表面レセプターもしくはリガンドとは免疫反応しない抗体分子を含むモノクローナル抗体組成物を含有するパッケージ、
が含まれている。
【００１５】
特異的に結合した細胞表面レセプター及びリガンドを含む細胞レセプター−リガンド複合体の存在を、インビボで検出するための、キット型の診断システムが開示されており、そのシステムには、
(a) 少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量の、該レセプター−リガンド複合体とは免疫反応するが、非結合型の細胞表面レセプターもしくはリガンドとは免疫反応しない、インビボ指示手段と結合した抗体を含むモノクローナル抗体組成物を含むパッケージ、
が含まれている。
ＧＰIIｂ− IIIａ−リガンド複合体を発現する血小板の存在について、血液サンプルを検定するための、キット型の診断システムが開示されており、そのシステムには、
(a) 少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量の、ハイブリドーマＰＭＩ−１又はＰＭＩ−２から生産された抗ＧＰIIｂ− IIIａの抗体分子を含むパッケージ、
が含まれている。
【００１６】
インビボで血栓の存在を検定するための、キット型の診断システムも開示されており、それには、
(a) 少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量の、ハイブリドーマＰＭＩ−１又はＰＭＩ−２から生産される、インビボの指示手段と結合した、抗ＧＰIIｂ− IIIａ抗体分子を含むパッケージが含まれている。
さらに、現在、血小板ＧＰIIｂ− IIIａ−リガンド複合体は、ハイブリドーマＰＭＩ−１及びＰＭＩ−２によって生産される抗体分子によって認識される、２個の潜在的抗原決定基型ＬＩＢＳを発現することが分っている。さらに、モノクローナル抗体ＰＭＩ−１により認識される潜在的決定基を真似ることができるポリペプチドがインビボで、潜在的決定基を形成しているＧＰIIｂタンパク質の一部をコードするＤＮＡ配列から誘導されている。
【００１７】
従って、本発明は、図１に示される、残基約５０番から約１４０番のアミノ酸残基配列を有するＧＰIIｂタンパク質の一部をコードする構造遺伝子を定義している配列を含むせいぜい約１２０００個のヌクレオチド塩基対を含むＤＮＡ断片を考案している。
別の態様においては、図１における残基約５０番から約１４５番までの、アミノ酸残基配列を有する、ＧＰIIｂタンパク質の一部をコードする構造遺伝子を定義しているＤＮＡ断片と機能的に結合したベクターを含む組換えＤＮＡ分子も開示されている。
さらに、せいぜい約５０アミノ酸残基を含み、かつ、式
−ＰＳＰＳＰＩＨＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ−
で表わされるアミノ酸残基配列を含む、ｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログも開示されている。
【００１８】
また、フィブリノーゲン結合血小板と免疫反応する抗体分子を生産する、ＰＭＩ−１及びＰＭＩ−２と命名されたハイブリドーマも考案している。
ファブリノーゲン結合血小板と免疫反応する、ハイブリドーマＰＭＩ−１により生産される抗体分子を含む、モノクローナル抗体組成物を考案している。
Ａ．定義
アミノ酸：ここで同定されているアミノ酸残基は、天然のＬ型のものである。標準的ポリペプチド命名法に従がい（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）２４３、３５５７−５９（１９６９）、アミノ酸残基の略号は、下記の対応表に示した。
対応表
記号 アミノ酸
一文字 三文字
Ｙ Ｔyr チロシン
Ｇ Ｇly グリシン
Ｆ Ｐhe フェニルアラニン
Ｍ Ｍet メチオニン
Ａ Ａla アラニン
Ｓ Ｓer セリン
Ｉ Ｉle イソロイシン
Ｌ Ｌeu ロイシン
Ｔ Ｔhr スレオニン
Ｖ Ｖal バリン
Ｐ Ｐro プロリン
Ｋ Ｌys リジン
Ｈ Ｈis ヒスチジン
Ｑ Ｇln グルタミン
Ｅ Ｇlu グルタミン酸
Ｗ Ｔrp トリプトファン
Ｒ Ａrg アルギニン
Ｄ Ａsp アスパラギン酸
Ｎ Ａsn アスパラギン
Ｃ Ｃys システィン
ここでは、全てのアミノ酸残基配列が左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の、伝統的に用いられている方向の式で表わされていることに注意しなければならない。さらに、アミノ酸残基配列の始めと終りのダッシュは、ポリペプチド鎖中の１つ以上で全部で約５０残基までの配列につながる結合を示していることにも注意しなければならない。
【００１９】
ポリペプチド及びペプチド；ポリペプチド及びペプチドはここでは同時に用いられている語で、隣り合うα−アミノ基とカルボキシル基の間のペプチド結合により互いに連結しているせいぜい約５０個の連続するアミノ酸残基を示している。
タンパク質；ここで用いられているタンパク質という語は、ポリペプチドのように互いに連結している連続した５０個以上のアミノ酸残基を示している。
ヌクレオシド及びヌクレオチド；糖部分（ペントース）、リン酸、及び窒素ヘテロ環塩基からなる、ＤＮＡ及びＲＮＡの単量体ユニット。この塩基は、グリコシド炭素（ペントースの１′炭素）を介して糖部分に結合しており、この塩基と糖との組合せてヌクレオシドという。このヌクレオシドが、そのペントースの３′位又は５′位に結合したリン酸基を含むとき、これをヌクレオチドと呼ぶ。
【００２０】
塩基対（bp）；二本鎖ＤＮＡ分子中のアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の水素結合の組合せ。
レセプター；ここで用いているレセプター及びレセプタータンパク質とは他の分子に特異的に結合する生物学的に活性なタンパク質性分子を示している。
リガンド及び同種リガンド；リガンドとは、特別なレセプタータンパク質と特異的相互作用によって結合する構造部分を含む分子を意味する。
リガンド誘導結合部位（ＬＩＢＳ）；ＬＩＢＳとは、細胞表面レセプター−リガンド複合体によって発現されるが、非占有レセプター又は未結合リガンドによっては発現されないネオ抗原決定基のことである。ＬＩＢＳは、“構造的”なものと“配列的”なものがある。ＬＩＢＳは、リガンド結合により誘導されるレセプターの特異的修正の結果、すなわち、“潜在的抗原決定基”であり、またこれは、レセプター−リガンド接触部位でのレセプターとリガンドアミノ酸残基の組合せによって形成される。
【００２１】
潜在的抗原決定基；同種（特異的）リガンドとの結合により、レセプタータンパク質の構造又は膜表面配位方向の変化によって生じたネオ抗原決定基を意味する。ここで述べているレセプタータンパク質は、通常、このレセプターが特異的にリガンドと結合しないかぎり、潜在的抗原決定基を発現しない。
Ｂ．ＤＮＡ断片
生物において、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸残基配列は、タンパク質をコードする構造遺伝子のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と遺伝子コードを介して直接対応している。従って、構造遺伝子は、それがコードするアミノ酸残基配列、すなわち、タンパク質又はポリペプチドで定義することができる。
遺伝子コードでよく知られており、重要な性質は、その縮退である。すなわち、タンパク質を構成する全んどのアミノ酸について、１つ以上のコードヌクレオチドトリプレット（コドン）が、１つのアミノ酸残基をコード、もしくは指定している。それゆえ、特別のアミノ酸残基配列を、多種のヌクレオチド配列がコードしうる。このようなヌクレオチド配列は、全ての生物において、同じアミノ酸残基配列の生産を起こすことから、機能的には等価と考えることができる。場合によっては、プリン又はピリミジンのメチル化体も、ヌクレオチド配列中に組込まれていることもある。しかし、これらメチル化は、コード関係になんら影響を与えることはない。
【００２２】
本発明のＤＮＡ断片には、ＧＰIIｂ関連アミノ酸残基配列、すなわち、ＧＰ IIIｂ関連タンパク質を含むタンパク質をコードする構造遺伝子が含まれる。ＧＰIIｂ関連アミノ酸残基配列は、図１の約５０番から約２２７番で示される、アミノ酸残基配列の１部と相同的、好ましくは同一の、少なくとも約１０残基の配列である。
本発明のＤＮＡ断片には、図１の残基約５０番から約１４５番で示されるアミノ酸残基配列をコードするＤＮＡ配列が含まれる。別の態様においては、図１の残基約５０番から約２２７番で示されているアミノ酸残基配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を考案している。また、図１の残基約１４６番から約２２７番で示されているアミノ酸残基配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片も考案している。本発明のＤＮＡ断片は、図１の残基約１番から約２２７番で示されるアミノ酸残基配列をコードしていることが望ましい。ＤＮＡ配列は、上述のアミノ酸残基配列中のアミノ酸残基をコードするコドンが連続して存在する、すなわち、ＤＮＡ配列がイントロンを含まないことが望ましい。
【００２３】
基本的に図１の塩基約１４８番から約４３５番で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片も、本発明の１態様を構成している。基本的に、図１の塩基約１４８番から約４３５番で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片は、本発明の別の態様を構成している。基本的に本発明のＤＮＡ断片が図１の塩基約１番から約１１０４番で示されるヌクレオチド配列からなることが好ましい。
ＧＰIIｂ関連アミノ酸残基配列をコードする本発明のＤＮＡ断片は、化学的技術、例えばマチュウシ（Matteucci)等（ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（J. Am. Chem. Soc.)１０３、３１８５（１９８１））のホスホトリエステル法によって容易に合成することができる。もちろん、コード配列を化学的に合成することによって、天然のアミノ酸残基配列をコードするものを適当な塩基に置換することによって、望ましい修正を容易に行うことができる。しかし、図１に示したものと全く相同的な配列を含むＤＮＡ分子であることが望ましい。
【００２４】
さらに、基本的に、ＧＰIIｂ関連タンパク質をコードする構造遺伝子からなるＤＮＡ断片は、これらの遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子から得ることができる。例えば、プラスミド型組換えＤＮＡ分子ＨＥＬ−４１は、図１に示したＤＮＡ配列を含み、従って、図１の残基１番から２２７番で示されるアミノ酸残基をコードしている。ＨＥＬ−４１でトランスホームした大腸菌（E. coli)培養物を、ブダペスト条約要請事項に従がい、１９８７年７月７日、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（２０８５２、ＭＤ州、ロックビル、パークローン・ドライブ、１２３０１）に登録し、受理番号６７４５６号を割当てられた。
ＧＰIIｂ関連アミノ酸残基配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を、従来法に従がい、上記登録のプラスミド由来の適当な制限断片を機能的に結合（ライゲーション）することにより作ることができる。
【００２５】
典型的に、このようにして作った本発明のＤＮＡ分子は、粘着末端、すなわち、この分子の二本鎖部分を越えて伸びる“突出した”一本鎖部分を有している。本発明のＤＮＡ分子上の粘着末端が存在することは好ましいことである。
また、上記ＤＮＡ断片と等価なリボ核酸（ＲＮＡ）も本発明で考案されている。
Ｃ．組換えＤＮＡ分子
本発明の組換えＤＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ断片にベクターを機能的に結合することにより作ることができる。
ここで用いられるように、“ベクター”という語句は、細胞中で自己増殖可能なＤＮＡ分子を意味し、別のＤＮＡ断片を機能的に結合することにより、その付随する断片の複製をもたらすことができるものである。ＧＰIIｂ関連アミノ酸残基配列を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を司るベクターを、ここでは“発現ベクター”と呼ぶ。従って、組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）は、天然では、通常一緒に発見されることはない、少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むハイブリットＤＮＡ分子である。
【００２６】
本発明のＤＮＡ断片が機能的に結合するベクターの選択は、この分野でよく知られているように、望ましい機能的性質、例えばタンパク質の発現及びトランスホームされる宿主細胞に直接依存し、これらは、組換えＤＮＡ分子を構築する分野において本質的な制限となっている。しかし、本発明で考案されているベクターは、機能的に結合されたＤＮＡ断片中に含まれるＧＰIIｂ関連アミノ酸残基配列を有するタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも複製、そして好ましくは発現も司ることができる。
好ましい態様において、本発明で考案されたベクターは、原核性レプリコン、すなわち、バクテリア宿主細胞のような原核性宿主細胞において、染色体外で組換えＤＮＡ分子を自己複製及び維持を司ることができる能力を有するＤＮＡ配列を含んでいる。このようなレプリコンは当分野ではよく知られているものである。さらに、原核性レプリコンを含む、これらの態様は、それでトランスホームしたバクテリア宿主に薬剤耐性を付与する遺伝子も含んでいる。典型的なバクテリアの薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン又はテトラサイクリン耐性を付与するものである。
【００２７】
原核性レプリコンを含む、これらベクターは、大腸菌のようなバクテリア宿主細胞をトランスホームすることで、ＧＰIIｂ関連アミノ酸残基配列をコードする遺伝子の発現（転写及び翻訳）を司る原核性プロモーターも含む。プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写を可能とするＤＮＡ配列によって形成される発現コントロール要素である。バクテリア宿主に適合するプロモーター配列は一般的に、本発明のＤＮＡ断片の挿入のための、簡便な制限部位を含むプラスミドベクター中に提供されている。このようなベクタープラスミドの典型例には、バイオ・ラド・ラボラトリー（ＣＡ州、リッチモンド）から市販されているｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９、及びファルマシア（ＮＪ州、ピスカタウェイ）から市販されているｐＰＬ及びｐＫＫ２２３がある。
【００２８】
真核性細胞好ましくは脊椎動物細胞に適合する発現ベクターは、本発明の組換えＤＮＡ分子を生成するのに用いることができる。真核性細胞発現ベクターは、当分野でよく知られており、また、いくつかの販売元から市販されている。典型的に、このようなベクターは、望ましいＤＮＡ断片の挿入するために便利な制限部位を含むものが提供されている。このようなベクターの典型例には、ｐＳＶＬ及びｐＫＳＶ−１０（ファルマシア）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（インターナショナルバイオテクノロジーズ）及びｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ、＃３１２５５）がある。
好ましい態様において、本発明の組換えＤＮＡ分子を構築するのに使用される真核細胞発現ベクターは、真核細胞中で効果的な選択マーカー、好ましくは、薬剤耐性選択マーカーを含んでいる。好ましい薬剤耐性マーカーは発現によりネオマイシン耐性となる遺伝子、すなわち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neo)遺伝子である。サウザーン（Southern）等、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジェネティクス（J, Mol. Appl. Genet.）１、３２７−３４１（１９８２）。
【００２９】
本発明のｒＤＮＡを生成するのにレトロウィルス発現ベクターを用いることも考案している。ここで用いているように“レトロウィルス発現ベクター”という語句は、レトロウィルス・ゲノムのロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）由来のプロモーター配列を含むＤＮＡ分子を意味する。
好ましい態様における、典型的な発現ベクターは、好ましくは、真核細胞中で複製不能なレトロウィルス発現ベクターである。レトロウィルスベクターの構築を使用例がソージ（Sorge)等（モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol. Cell. Biol.）４、１７３０−３７（１９８４）によって報告されている。
相補的粘着末端を介して、ベクターにＤＮＡを機能的に結合する多くの方法が開発されてきている。例えば、相補的ホモポリマー鎖を、挿入するＤＮＡ断片及びベクターＤＮＡに付加することができる。それから、この相補的ホモポリマー末端間の水素結合により、このベクター及びＤＮＡ断片を結合し組換えＤＮＡ分子を生成する。
【００３０】
１つ以上の制限部位を含む合成リンカーは、ＤＮＡ断片とベクターを結合する別法を提供する。先に説明したように、エンドヌクレアーゼによる制限消化により生じたＤＮＡ断片を３′−５′エクソヌクレアーゼ活性により、突出する３′一本鎖末端を除去し、また重合活性により、窪んだ３′末端を充填する酵素である、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ又は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩで処理する。それゆえ、これら活性の組合せは、平滑末端ＤＮＡ断片を生ずる。それから、この平滑末端断片をバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ等の平滑末端ＤＮＡ分子のライゲーションを触媒しうる酵素の存在下、大過剰のリンカー分子とインキュベーションする。このようにしてできた反応産物は、その末端に重合リンカー配列をもつＤＮＡ断片である。これらＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断し、このＤＮＡ断片の末端に適合する末端を生ずる酵素で切断した発現ベクターにライゲーションする。
【００３１】
多くの制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、ＣＮ州、ニュヘブンのインターナショナル・バイオテクノロジーズ社を含む多くの業者から市販されている。
本発明は、上述の組換えＤＮＡ分子と等価なＲＮＡも考案している。
Ｄ．トランスホームした細胞及び培養
また、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子でトランスホームした宿主にも関連している。宿主細胞は原核性のことも、真核性のこともある。バクテリア細胞が原核性宿主細胞であることが好ましく、また典型的には、ＭＤ州、ベセスダ、ベセスダ州−４、ラボラトリース社から市販されている大腸菌ＤＨ５株のような大腸菌株である。好ましい真核性宿主細胞には、イースト及び好ましくは、マウス、ラット、サル又はヒトの繊維芽細胞系列由来のもの等の脊椎細胞などホ乳類細胞が含まれる。好ましい真核性宿主細胞には、ＣＣＬ６１のようなＡＴＣＣから入手できるチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びＣＲＬ１６５８のようなＡＴＣＣから入手できるＮＩＨスイスマウス胎児細胞ＮＩＨ／３Ｔ３が含まれる。
【００３２】
好ましいトランスホーム化細胞系列とは、組換えＤＮＡ分子ＨＥＬ−４１を含む大腸菌であり、その培養物は、１９８７年７月７日、ＭＤ州、ロックビル、アメリカン・ティシュ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に登録され、受理番号６７４５６が割当てられた。
本発明の組換えＤＮＡ分子による、適当な宿主細胞のトランスホーメーションは、典型的には、使用するベクターのタイプに依存する、従来法によって行なわされる。原核性宿主細胞のトランスホーメーションに関しては、例えば、コーエン（Cohen)等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）ＵＳＡ、６９、２１１０（１９７２）、及びマニアチス（Maniatis）等、モレキュラー・クローニング、ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ＮＹ州、（１９８２）参照。ｒＤＮＡを含むレトロウィルスベクターによる脊椎動物細胞のトランスホーメーションに関しては、例えば、ソージ（Sorge)等、モレキュラー−アンド・セルラーバイオロジー（Mol. Cell. Biol.）４、１７３０−３７（１９８４）；グラハム（Graham）等、ビロロジー(Virol.)５２、４５６（１９７３）及びウィグラー（Wigler）等、プロシーディングス・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.) ＵＳＡ、７６、１３７３−７６（１９７９）参照。
【００３３】
うまくトランスホームした細胞、すなわち、本発明の組換えＤＮＡ分子を含む細胞は、従来法により同定することができる。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入により生じた細胞をクローン化し、モノクローナルコロニーを作ることができる。これらのコロニー由来の細胞を収穫し、溶解してから、そのＤＮＡ含有物について、サウザーン（Southern）（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.)９８、５０３（１９７５））及びベレント（Berent）等（バイオテクノロジー（Biotech)、３、２０８（１９８５））によって報告されているような方法を用い、ｒＤＮＡの有無を試験した。
ｒＤＮＡの存在の直接的検定に加えて、ｒＤＮＡがＧＰIIｂ関連タンパク質を発現できる場合、トランスホーメーションは、従来の免疫学的方法で確めることができる。例えば、発現ベクターでうまくトランスホームした細胞は、ＧＰIIｂ抗原性を示すタンパク質を生産する。トランスホームされた細胞サンプルを収穫し、本発明のハイブリドーマによって生産されるような、抗原に特異的な抗体を用いて、ＧＰII関連タンパク質を検定した。
【００３４】
このように、トランスホームした宿主細胞自身に加え、本発明は、栄養培地中の、これら細胞培養物、好ましくはモノクローナルな（クローン的に均一な）培養物、又は、モノクローナルな培養物由来の培養物も考案している。またこの培養物は、ＧＰIIｂ抗原性を示していることが好ましい。
トランスホームした宿主細胞を培養するために有用な栄養培地は当分野でよく知られているものであり、いくつかの販売業者から市販されている。宿主細胞がホ乳類細胞である態様の場合、“無血清”培地を用いることが好ましい。
Ｅ．ＧＰIIｂ関連タンパク質の生産方法
本発明のもう１つの特徴に、ＧＰIIｂ抗原性を示すタンパク質の生産方法がある。ＧＰIIｂ抗原性を示すタンパク質は、天然のＧＰIIｂで誘導される抗体と免疫反応するタンパク質である。ＧＰIIｂ抗原性を示すタンパク質は、抗原として、及び抗体を生じさせるものとして有用であり、それらの各々は、本発明の診断システム及び診断方法に用いることができる。
【００３５】
本方法には、ＧＰIIｂ関連アミノ酸残基配列をコードする遺伝子を発現できる本発明の組換えＤＮＡ分子でトランスホームした、宿主細胞、好ましくはヒトの細胞を含有する栄養培地を含む培養の開始を伴う。この培養を、そのトランスホームした細胞がＧＰIIｂ関連アミノ酸残基配列を含むタンパク質を発現するのに十分時間維持する。その後発現したタンパク質を培養物から回収する。
培養物から発現したタンパク質を回収する方法は、当分野ではよく知られているものであり、従来の生化学的技術を用いた培養物のタンパク質含有成分の分画が含まれる。例えば、タンパク質を分画するのによく知られている、ゲルロ過、ゲルクロマトグラフィー、限外ロ過、電気泳動法、イオン交換、アフィニティークロマトグラフィー等の方法が培養物中に存在する発現タンパク質を単離するのに用いることができる。さらに、免疫親和性、免疫吸着等の免疫学的方法も従来の方法を用いて行なわれる。
【００３６】
せいぜい約５０個のアミノ酸残基までの、以後特別に列挙する配列に付加する、本発明のポリペプチド中に存在するアミノ酸は、以後議論されているようなポリペプチドの基本的かつ新規な特性に実質的に影響を与えない残基である。このような付加残基は、通常、列挙したポリペプチドの一端又は両端に付加しており、列挙したポリペプチド配列の反復及び部分的反復も含むことがある。
Ｆ．ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、せいぜい約５０個、より通常には約３５個以下、そして、好ましくは、約２５個以下のアミノ酸残基配を含み、少なくとも、約１０個の残基を含む。さらに、本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸残基配列及び新しい機能性を特徴としている。
１．ｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログ
広く言うと、本発明の１態様は、ＲＤＧ結合細胞粘着タンパク質のアルファサブユニットの重鎖により発現される潜在的抗原決定基を真似るアミノ酸残基配列を含むポリペプチドを考案している。潜在的決定基ポリペプチドアナログのアミノ酸残基配列は、サイトアドヘシンのアルファサブユニットの重鎖の約１５個のカルボキシ末端アミノ酸残基の配列に対応している。
【００３７】
好ましいサイトアドヘシンのアルファサブユニット重鎖潜在的決定基ポリペプチドアナログは、ｈＧＰIIｂがフィブリノーゲンと結合した時に形成される、ｈＧＰIIｂ潜在的決定基に似ている。好ましい態様において、ｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログは、図１のアミノ酸残基１３７〜１４５番を表わす、次のアミノ酸残基配列、
−ＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ−
を少なくとも含んでいる。
さらに、ｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログは、少なくとも、図１のアミノ酸残基配列１２９〜１４５番を表わしている、次のアミノ酸残基配列、
−ＰＳＰＳＰＩＨＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ−
を含むことが好ましい。
【００３８】
ｈＧＰIIｂ潜在的決定基アナログには、表１に示されるアミノ酸残基配列を含むことが望ましい。
【００３９】
【表１】
表１
名 称 アミノ酸残基配列
ｐ１３６−１４５ ＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ
ｐ１３３−１４５ ＰＩＨＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ
ｐ１３１−１４５ ＰＳＰＩＨＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ
ｐ１２９−１４５ ＰＳＰＳＰＩＨＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ
ａ．各ポリペプチドの名称は、図１において、含有されるアミノ酸残基配列を表わしている。
表１に示したポリペプチドは、さらに、ｈＧＰIIｂがＧＰIIｂ〜 IIIａ／フィブリノーゲン複合体として存在するとき、以下に述べるように、ＰＭＩ−１抗体分子とｈＧＰIIｂとの結合を中和する（競合的に阻害する）能力により特徴づけられた。
【００４０】
ここで用いる語“複合体”は、抗体−抗原又はレセプター−リガンド反応のような特異的結合反応産物を意味する。代表的複合体には、免疫反応産物、ＧＰIIｂ− IIIａ−フィブリノーゲン結合反応産物及びサイトアドヘシン−リガンド結合反応産物がある。
好ましい態様において、ｈＧＰIIｂ潜在的決定基アナログは、さらに、フィブリノーゲン結合血小板の凝集を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる。フィブリノーゲン結合血小板凝集を阻害しうる代表的ｈＧＰIIｂ潜在的決定基アナログは、ポリペプチドｐ１２９−１４５がある。
本発明のｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログは、フィブリノーゲン結合血小板凝集を競合的に阻害し、そして、または、以下に述べるように、ｈＧＰIIｂがＧＰIIｂ− IIIａ／フィブリノーゲン複合体として存在する時、ＰＭＩ−１抗体分子のｈＧＰIIｂへの結合を競合的に阻害する限り、ｈＧＰIIｂのアミノ酸残基配列と同一である必要はないことが理解されなければならない。それゆえ、ｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログは、保存的であれ、非保存的であれ、挿入、欠失及び置換のような種々の変化を受けることが可能で、そのような変化はその使用に際し、ある利点を提供することもある。
【００４１】
保存的置換とは、１つのアミノ酸が別の、生物学的に同様な残基に置き換るものである。保存的置換の代表例には、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンなどの疎水性残基の間の置換又は、アルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸、グルタミンとアスパラギンなどの極性残基の間の置換などが含まれる。“保存的置換”という語句もそのようなポリペプチドが必要とされる結合活性を示すなら、未置換の元のアミノ酸の代りに置換したアミノ酸を使用することも含まれる。
本発明のポリペプチドが、１つ以上の保存的又は非保存的置換が起っているため、ｈＧＰIIｂの配列と同一ではない配列を有しているとき、本発明のポリペプチドが簡便にラベル又は固体マトリクス又は抗原性キャリヤーに固定できるように、“リンカー”を提供する目的でその末端に付加的残基が付加される場合を除いて、通常多くとも約２０％、より普通には、多くて１０％のアミノ酸残基が置換される。本発明のポリペプチドに使用できるラベル、固体マトリクス及びキャリヤーは以下に説明する。
【００４２】
通常、アミノ酸残基リンカーは、少なくとも１残基で、４０残基以上のこともあるが、普通には１個乃至１０個の残基からなる。リンカーに用いる典型的アミノ酸残基は、チロシン、システィン、リジン、グルタミン酸及びアスパラギン酸などである。さらに、本発明のポリペプチド配列は、例えばアセチル化などの末端ＮＨ₂ アシル化又は例えばアンモニア、メチルアミンその他の、チオグリコール酸アミデーション、末端カルボキシアミデーションによる修飾を受けることによる天然の配列と異なるものであることもありうる。
リンカーを介してキャリヤーに結合し、当分野でキャリヤー−ハプテン結合体として知られているものを形成する場合、本発明のｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログは、ｈＧＰIIｂが血小板会合ＧＰIIｂ− IIIａ／フィブリノーゲン複合体として存在するとき、ｈＧＰIIｂと免疫反応する抗体を誘導することができる。免疫学的交叉反応性に関する確立された原則からみて、本発明は、ポリペプチドｐ１２９−１４９の抗原的関連変異体を考案している。“抗原的関連変異体”とは、ポリペプチドｐ１２９−１４５の少なくとも６個のアミノ酸残基配列部分を含み、かつ、ｈＧＰIIｂが、血小板会合ＧＰIIｂ− IIIａ／フィブリノーゲン複合体として存在するとき、ｐ１２９−１４５及びｈＧＰIIｂと免疫反応する抗体分子を誘導することができるポリペプチドのことである。
２．ｌＧＰIIｂポリペプチド
別の態様において、本発明は、図１のアミノ酸残基１４４〜１５６番で示される次のアミノ酸残基配列
−ＲＱＩＦＬＰＥＰＥＱＰＳＲ−
を少なくとも含んでいるｌＧＰIIｂポリペプチドを考案している。
【００４３】
さらに、ｌＧＰIIｂポリペプチドは、ｌＧＰIIｂとは免疫反応するがｈＧＰIIｂとは免疫反応しない抗体分子を誘導することができる特徴を有する。ｐ１４４−１５６と命名される、好ましいｌＧＰIIｂポリペプチドは、次の式
ＲＱＩＦＬＰＥＰＱＰＳＲ
で表わされるアミノ酸残基配列を有している。
本発明のｈＧＰIIｂ及びｌＧＰIIｂポリペプチドの両方とも当分野でよく知られている技術で合成することができる。使用できる技術の秀れた概要が、Ｊ，Ｍ，スチワード（Steward)及びＪ．Ｄ．ヤング（“固相ペプチド合成”、Ｗ．Ｈ．フリーマン社、サンフランシスコ、１９６９）及びＪ．メイエンホーファー（Meienhofer) （“ホルモンタンパク質及びペプチド”、２巻、４６頁、アカデミックプレス版（ニューヨーク）、１９８３年）によって固相法について、及びＥ．シュローダー（Schroder）及びＫ．クブケ（Kubke)（“ペプチド”１巻、アカデミックプレス版（ニューヨーク）、１９６５年）によって、古典的溶液合成について、まとめられている。
【００４４】
Ｇ．接種物
別の態様において、本発明のポリペプチドもしくは、その抗原的関連変異体を、薬学的に許容しうる水性希釈組成物中で用いて、その効果的投与したとき、ｈＧＰIIｂと免疫反応する抗体を誘導できる接種物を作った。
種々の文法型の“接種物”という語は、ＧＰIIｂの重鎖又は軽鎖に対する抗体の調製に用いられる活性成分として、本発明のポリペプチドを含む組成物を示して用いている。
ポリペプチドを抗体の誘導に用いる時、このポリペプチドは単独、又は結合体として、キャリヤーに結合して、又は、ポリペプチドポリマーとして使用されることを理解すべきであるが、発現の簡便性のため、本発明の種々の態様においては、集約的に“ポリペプチド”又は、その種々の文法型のものを、その意味で用いている。
【００４５】
約３５残基以下のアミノ酸を含むポリペプチドは、すでに述べてきたように、抗体の産生を誘導する目的には、キャリヤーに結合したペプチドを使用することが好ましい。
すでに述べてきたように、１個以上の付加的アミノ酸残基をポリペプチドのアミノ及びカルボキシ末端に付加して、そのポリペプチドのキャリヤーへの結合を助けることができる。ポリペプチドのアミノ及びカルボキシ末端へ付加したシスティン残基は、ジスルフィド結合を介した結合体を作る上で特に有用なものであることが分っている。しかし、結合体を作るための、当分野でよく知られている他の方法も、使用することができる。代表的付加結合操作には、グルタルアルデヒドのようなジアルデヒド、ミカエル付加の使用（クリプスタイン（Klipstein)等、ジャーナル・オブ・インフエクシャスデシーズ（J. Infect. Dis.)１４７、３１８−３２６（１９８３）もしくは、水溶性カルボジイミドを使用して、キャリヤーへのアミド結合を生成するような、カルボジイミド技術の使用が含まれる。タンパク質結合体もしくは、活性化官能基を介しての結合のレヴューについては、オーラメアス（Aurameas）等のスカンジナビアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Scand. J. Immunol.）８、補１、７、７〜２３（１９７８）を参照せよ。
【００４６】
有用なキャリヤーは当分野ではよく知られており、一般にタンパク質それ自体である。これらキャリヤーの代表例には、キーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、エデスチン、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）もしくは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などのアルブミン、ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）のような赤血球、テタナス、トキソイド、コレラトキソイド及びポリ（Ｄ−リジン：Ｄ−グルタミン酸）などのポリアミノ酸などがある。
キャリヤーの選択は、その接種物の最終的使用により依存し、本発明に特に関係しない事項に基づいている。例えば接種を受ける動物において、不都合な反応が起こらないキャリヤーを選択すべきである。
本接種物には、典型的には、キャリヤーに結合した結合体として、効果的な免疫原的量の、本発明のポリペプチドが含まれている。他の事項の中で、単位投与当りのポリペプチドもしくはタンパク質の効果量は、接種を受ける動物種、その動物の体重及び選択された接種管理に依存し、このことは、当分野でよく知られていることである。典型的に、接種物は、接種当り約１０マイクログラムから約５００ミリグラムのポリペプチド又はタンパク質濃度、好ましくは、投与当り、約５０マイクログラムから約５０ミリグラムのポリペプチドもしくは、タンパク質を含んでいる。
【００４７】
本発明の接種物に使われる限り、“単位投与”という語句は、動物への単一投与に適した物理的に分離した単位を意味し、各単位は必要とする希釈剤、すなわち、キャリヤーもしくは、ビヒクルと合せて、望ましい免疫原的効果を産むと計算された、予め決められた量の活性物質を含んでいる。本発明の接種物の新しい単位投与に対する明細は、（ａ）活性物質の特性及び遂行される特別の免疫学的効果、及び（ｂ）動物において、免疫学的に使用するための、このような活性物質の調合技術に本質的な制限、によって記述され、直接これらに依存しており、それらは、ここに詳述されていると同時に本発明の特徴となっている。
典型的に、接種物は、水、食塩水、又は、リン酸緩衝液のような生理学的に許容される希釈剤又はビヒクル中にポリペプチド結合体を分散して、水性組成物を作ることにより、乾燥した固体ポリペプチド結合体から調製される。このような希釈剤は、当分野でよく知られているものであり、例えば、レミントン（Remington)の薬学、第１６編、マック・パブリッシング社、イーストン、ＰＡ州（１９８０）、１４６５−１４６７頁で議論されている。
【００４８】
また、接種物は、希釈剤の一部として、アジュバントも含むことがある。完全フロイント・アジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイント・アジュバント（ＩＦＡ）及びミョウバンのようなアジュバントは、当分野でよく知られた物質であり、いくつかの販売業者より、市販されている。
Ｈ．抗体及び抗体組成物
１．抗体組成物
ここで用いられている、種々の文法型の“抗体”という語は、イムノグロブリン分子及び免疫学的に活性なイムノグロブリン分子の一部、すなわち、抗体結合部位もしくは、パラトープを含む分子を意味している。代表的抗体分子には、本来のイムノグロブリン分子、実質的な、本来のイムノグロブリン分子及び当分野でＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）₂ 及びＦ（Ｖ）として知られている領域を含む、パラトープを含む、イムノグロブリン分子の一部が含まれる。
【００４９】
“抗体結合部位”とは、特異的に抗原と結合する（免疫反応する）重鎖及び軽鎖の可変及び超可変領域を含む抗体分子の構造領域のことである。種々の文法型の“免疫反応”という語は、抗原決定基含有分子及び全抗体分子もしくはその一部のような抗体結合部位を含む分子の間の結合を意味する。
“抗原決定基”とは、抗体結合部位によって、免疫学的に結合をうける抗原の実質的構造領域を意味する。また、この語句は、“エピトープ”と互換的に使用される。
本発明の抗体組成物は、ａ）ｈＧＰIIｂ又はｌＧＰIIｂ及びｂ）本発明の少なくとも１つの特別なポリペプチドと免疫反応する抗体分子を含むことを特徴とする。好ましい態様において、本発明の抗体組成物は、ＧＰIIｂと免疫反応することができる１種以上のパラトープを含んでいる。
【００５０】
例えば、血小板会合ＧＰIIｂ− IIIａ／フィブリノーゲン複合体及びｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログと免疫反応するが、そのアミノ酸残基配列を表２に示した。ポリペプチドｐ５３−６４と、実質的に免疫反応を起こさない抗体分子を含む本発明の抗体組成物は、フィブリノーゲン結合血小板と、フィブリノーゲンと結合していない血小板とを区別することができる。したがって、好ましい抗体組成物は、ａ）それが血小板会合ＧＰIIｂ− IIIａ／フィブリノーゲン複合体として存在するときの、ｈＧＰIIｂ、及びｂ）ポリペプチドｐ１２９−１４５、と免疫反応し、かつ、実質的に、ポリペプチドｐ５３−６４との免疫反応を起こさない抗体分子を含むものである。
典型的に本発明の抗体組成物は、本発明の接種物でホ乳動物を免疫化し、それにより、そのホ乳動物中に、適当なポリペプチド免疫特異性を有する抗体分子を誘導することにより生産される。それから、この抗体分子を、そのホ乳動物から回収し、例えば、免疫親和性クロマトグラフィーなどの従来法により、望ましい程度の単離を行う。このようにして生成した抗体組成物は、そのまま、本発明の診断法及び診断システムに用いて、身体中のフィブリノーゲン結合血小板の検出に使用される。
２．モノクローナル抗体組成物
本発明は、抗ＬＩＢＳモノクローナル抗体組成物も考案している。種々の文法型の“モノクローナル抗体組成物”という語句は、ある抗体と免疫反応することができる唯一種の抗体結合部位を含む抗体分子の集合体を意味する。したがって典型的に、モノクローナル抗体組成物は、それが免疫反応する抗原に対する単一の結合親和性を示す。それゆえ、モノクローナル抗体組成物は、異なる抗原に対して、各々が免疫特異性を有する、多種の抗体結合部位をもつ、単一の抗体分子、例えば、二特異的モノクローナル抗体が含まれている。
【００５１】
典型的に、モノクローナル抗体組成物は、ほんの一種の抗体分子を分泌（生産）するハイブリドーマと呼ばれる単一細胞のクローンから生産される抗体を含む。このハイブリドーマ細胞は、抗体産生細胞及びミエローマもしくは、自己生存細胞系列の融合によって生成する。このような抗体は、最初に、コラー（Kohler）及びミルスタイン（Milstein）により報告されており（ネイチャー（Neture）、２５６、４９５−４９７（１９７５））、その報告を参考としてここに組込んである。
１つの態様において、本発明のモノクローナル抗体組成物は、細胞表面レセプター−リガンド複合体により発現されるＬＩＢＳ、好ましくは、その複合体中のレセプターの潜在的抗原決定基と免疫反応する抗体分子を含むことを特徴とする。
【００５２】
別の態様において、モノクローナル抗体組成物は、ｈＧＰIIｂ及びｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログ、好ましくはｐ１２９−１４５と免疫反応する抗体分子を含む。これら組成物中に含まれる抗体分子は、ＧＰIIｂ機能部位もしくはその付近のｈＧＰIIｂと免疫反応するが、血小板会合ＧＰIIｂ− IIIａによるフィブリノーゲンの結合を阻害せず、また、それがフィブリノーゲンと結合したときは、血小板会合ＧＰIIｂ− IIIａと免疫学的に反応することができる。このタイプの好ましいモノクローナル抗体組成物には、ハイブリドーマＰＭＩ−１（ＡＴＣＣ ＨＢ ９４７６）によって生産することができる抗体分子、すなわちＰＭＩ−１抗体分子が含まれる。
３．モノクローナル抗体組成物の産生方法
本発明は、（ａ）細胞表面レセプター−リガンド複合体により発現されるリガンド誘導結合部位（ＬＩＢＳ）と免疫反応し、かつ、（ｂ）そのレセプター−リガンド複合体の非占有レセプターもしくは、非結合リガンドとは免疫反応しない、モノクローナル抗体の生成法を考案している。この方法には、
(a) 動物の、細胞表面−レセプター複合体もしくはｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログによる免疫化。これは、典型的に、免疫学的受容ホ乳動物に免疫原の免疫学的効果量、すなわち、免疫応答を起こすのに十分な量投与することにより行なわれる。このホ乳動物は、ウサギ、ラット又はマウス等のげっ歯動物であることが望ましい。これからこのホ乳動物を、レセプター−リガンド複合体と免疫反応する抗体分子を分泌する細胞を作るのに十分な時間、維持する。
【００５３】
(b) 免疫化したホ乳動物から取り出した抗体産生細胞のサスペンジョンを調製する。これは典型的には、そのホ乳動物の脾臓を取り出し、ついで個々の脾細胞を機械的に分離し、生理的に許容される媒体に分散するという、当分野でよく知られている方法によって行なわれる。
(c) サスペンジョン化した抗体産生細胞を、トランスホームした（“生存化”）細胞系列を作ることができるトランスホーム剤で処理する。トランスホーム剤及び生存化細胞系列を作るための、その使用は、当分野ではよく知られていることであり、それには、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ポリオマウイルス等のＤＮＡウイルス類、モロニー・ムライン・リューケミア・ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ラウス・ザルコーマウイルス等のＲＮＡウイルス類、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ 8,６５３、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４等のミエローマ細胞類等が含まれる。
【００５４】
好ましい態様において、トランスホーム剤による処理は、適当な融合促進剤の使用による、適当な細胞系列由来のマウスミエローマ細胞を、サスペンジョン化脾細胞と融合することにより、ハイブリドーマを生成する。ミエローマ細胞当り約５個の脾細胞を用いることが好ましい。総容積当り、約１０⁸ 個の脾細胞を使用する。
使用する細胞系列は、いわゆる“薬剤耐性”であることが望ましく、その結果、未融合のミエローマ細胞は、選択培地中で生存できず、一方、ハイブリッドは生存できることになる。最も一般的なものには、８−アザグアニン耐性細胞系列があり、これは、酵素の、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼを欠失しており、そのため、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）培地で生育することができない。また、一般的に、使用するミエローマ細胞系列は、分泌型を使用したとしても、それ自身、なんら抗体を産生しないという点で、いわゆる“非分泌”型であることが望ましい。しかし、ある場合には、分泌型ミエローマ系列であることが好ましい。好ましい融合促進剤は約１０００から約４０００の平均分子量をもつポリエチレングリコール（ＰＥＧ１０００として市販されている）である一方、この分野で知られている、その他の融合促進剤も使用することができる。
【００５５】
(d) その後、トランスホームした細胞を、好ましくはモノクローナルにクローン化する。このクローニングは、非トランスホーム細胞は生育できない組織培養培地で行うことが望ましい。このトランスホーム細胞がハイブリドーマの場合は、一般的にこのことは、分離容器中、未融合脾細胞、未融合ミエローマ細胞及び融合細胞（ハイブリドーマ）を、未融合ミエローマ細胞が生存できない選択培地中に希釈し、ついで未融合細胞が死滅するのに十分な時間（約１週間）、培養することによって行なわれる。この希釈は、制限因子の１つであり、希釈体積は、各分離容器中にある個数の細胞（例えば１〜４個）が分離されるように統計的に計算する（分離容器とは例えばマイクロプレートの各ウェルである）。この培地は、薬剤耐性（例えば、８−アザグアニン耐性）未融合ミエローマ細胞系列を生育させないものである。
【００５６】
(e) クローン化トランスホーマントの組織培養培地について、よく知られている免疫学的技術を用い、分泌された抗ＬＩＢＳ抗体分子の存在を評価する。
(f) ステップ（ｅ）で１度望ましいトランスホーマントが同定されれば、それを選択し、適当な時間、適当な組織培養培地で生育させ、ついでその培養上清から、望ましい抗体を回収する。適当な培地及び適当な培養時間は、既知であるか、もしくは、容易に測定できる。
より高濃度の準精製モノクローナル抗体を生産するため、この望ましいハイブリドーマを、マウス、好ましくは、同種もしくは、準同種のマウスに注射する。このハイブリドーマは、適当なインキュベーション時間の後、抗体産生腫瘍を生成し、これは、この宿主マウスの血液及び腹腔分泌物内に高い濃度の目的抗体を生ずる（約５−２０mg／ml）。
【００５７】
これら組成物の調製に適する培地は当分野でよく知られ、かつ、市販されており、また、これには、合成培養培地、近交系マウス及びそれに類するものが含まれている。代表的合成培地は、4.５ｇ／ｌのグルコース、２０mmグルタミン及び２０％ウシ胎児血清を捕った、ダルベユ最小基礎培地である。代表的な近交系マウス株はBalb／c である。
上記の方法で調製したモノクローナル抗体組成物は、例えば、ＬＩＢＳ含有免疫反応産物の生成が望まれるような、診断及び治療に用いることができる。代表的反応産物には、ＧＰIIｂもしくは、ＧＰ IIIａの含有免疫反応産物が含まれる。
Ｉ．ハイブリドーマ及びその調製法
本発明のハイブリドーマは、抗ＬＩＢＳモノクローナル抗体組成物を生産する能力を有することを特徴とするものである。
【００５８】
本発明の好ましいハイブリドーマは、細胞表面レセプター潜在的抗原決定基と免疫反応する抗体分子を生産することを特徴とする。
望ましい免疫特異性、すなわち、特定のタンパク質、特定のタンパク質上の同定可能なエピトープ、そして、または、ポリペプチド上の同定可能なエピトープと、免疫反応する能力を有する抗体分子を生産（分泌）するハイブリドーマの調製方法は、当分野ではよく知られているものである。参考のためここに組入れられているナイマン（Niman)等（プロシーディングス・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pro. Natl. Acad. Sci. ）（ＵＳＡ、８０、４９４９−４９５３、（１９８３））及びガルフレ（Galfre）等（メソッズ・イン・エンザイモロジー（Meth. Enzymol.）７３、３−４６（１９８１））の報告にあるハイブリドーマ技術は特に利用される。
【００５９】
ハイブリドーマ培養物ＰＭＩ−１は、ブタペスト協定要請物に基づき、１９８７年７月７日、アメリカ、２０８５２、ＭＤ州、ロックビル、アメリカン・タイプ、ティシュ・コレクション（ＡＴＣＣ）に登録され、受理番号ＨＢ９４７６が割当てられた。同様にハイブリドーマ培養物ＰＭＩ−２は１９８７年、１２月２２日ＡＴＣＣに登録され、受理番号ＨＢ９６１５を割当てられた。
Ｊ．治療法及び治療組成物
本発明のｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログは、インビボにおけるフィブリノーゲン結合血小板の凝集を緩和するのに用いることができる。
例えば、ｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログは、効果的量を被検者に投与したとき、フィブリノーゲン結合血小板の凝集を競合的に阻害しうる、医療的に許容しうる組成物で用いることができる。この阻害は、血栓生成を減速させると考えられている。従って、インビボでの、ｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログの投与は、凝血及びある炎症応答のような血小板凝集により開始される生理学応答を緩和するのに用いることができる。
【００６０】
他の態様において、フィブリノーゲン結合血小板の凝集は、基本的に、ｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログ、好ましくはｐ１２９−１４５と免疫反応する抗体分子を含む医療的に許容しうる組成物を効果量、静脈投与することにより阻害しうる。この抗体分子は、モノクローナル抗体組成物として存在することが好ましく、また、ハイブリドーマＰＭＩ−１で生産されるものがより好ましい。
投与するポリペプチドもしくは抗体分子含有組成物は、溶液もしくはサスペンジョンとしてであるが、ポリペプチドは、錠剤、丸薬、カプセル、放出維持製剤又は粉末の形でも投与される。どの場合にも、典型的な組成物は約0.１μＭから約1.０Ｍの活性成分、好ましくは、約1.０μＭから約１０ミリモル濃度（mM）の活性成分を含む。
【００６１】
活性成分として、ポリペプチド又は、抗体分子を含む治療組成物の調製は、当分野でよく理解されている。典型的に、これらの組成物は、溶液又はサスペンジョンのような接種物として調製されるが、接種前の液体である溶液もしくはサスペンジョンに適した固体も調製されることもある。また、この調製物はエマルジョン化することもある。しばしば、この活性治療成分は、医療的に許容され、かつ、この活性成分と適合することが知られている賦形剤と混合される。例えば、適当な賦形剤には、水、食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノール等及びそれらの組合せたものがある。さらに、もし、望ましいときは、この組成物は、活性成分の効果を上げるための、湿潤剤又はエマルジョン化剤、ｐＨ緩衝剤のような少量の補助物質を含むこともある。
【００６２】
ポリペプチドもしくは抗体分子組成物は、中和した医療許容塩としての医療組成物に整えられることもある。医療的に許容される塩には、例えば塩酸、リン酸のような無機酸、もしくは、酢酸、酒石酸、マンデル酸のような有機酸で作られる酸付加塩（ポリペプチド又は抗体分子の遊離アミノ基で形成される）が含まれる。また遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは鉄の水酸化物のような無機塩基及びイソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から誘導されることもある。
このポリペプチド又は抗体含有医療組成物は、例えば、単位投与量の静脈注射などの従来法で投与される。本発明の医療組成物に対して用いられる“単位投与量”という語句は、ヒトへの単一投与に適する物理的に分離した単位を意味し、各単位は、必要とされる希釈剤すなわちキャリヤー又はビヒクルと合せて、望ましい医療効果を産むよう計算され、予め決められた量の活性物質を含んでいる。
【００６３】
この組成物は、投与物の形状に適した方法で、かつ、医療的に効果的量が投与される。投与量は、治療される被検者、活性成分を利用する被検者の容量、及び望ましいレセプター−リガンド結合の阻害度に依存する。投与するのに必要な活性成分の正確な量は医者の判断に依存し、かつ、各個人に特異的なものである。しかし、適当な投与範囲は、１日、１人当り活性成分１から数ミリグラムのオーダーである。第１次及び第２次投与の適正な処方も、様々であるが、典型的には、第１次投与についでひきつづく注射又は他の投与法で、１時間以上の間隔で反復投与する。別に、血液中の医療的に効果的濃度を維持するのに十分な継続的な静脈への注入も考案されている。ｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドに関する。医療的に効果的な血液濃度は、約0.１mMから約１０mMの範囲であり、約1.０mMが好ましい。本発明の抗体の医療的に効果的な血液濃度は約0.１μＭから約１０μＭの範囲であり、1.０μＭが好ましい。
【００６４】
Ｋ．診断システム
本発明のキット型の診断システムには、分包された試薬として、少なくとも１回の検定に十分な量の、本発明の発現タンパク質、ポリペプチド、抗体組成物もしくはモノクローナル抗体組成物が含まれている。この分包試薬の使用説明書も含まれているのが普通である。
典型的には、“使用説明書”には、その試薬濃度もしくは、混合する試薬及びサンプルの相対的量、試薬／サンプル混合物の維持時間、温度、バッファ条件などの、少なくとも１回の検定法のパラメータを記述した明確な表現物が含まれる。
１つの態様において、血液又は血漿のような、血小板含有血液サンプル中のフィブリノーゲン結合血小板を検定するための診断システムには、ｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログ、好ましくはｐ１２９−１４５と免疫反応する分子を含むパッケージが含まれている。さらに、この抗体分子は、ｈＧＰIIｂと免疫反応するハイブリドーマＰＭＩ−１から生産されるものであることがより好ましい。またこの抗体分子は、モノクローナル抗体組成物として存在することが好ましい。さらに、この抗体分子が放射性核種ラベルに結合する、好ましくは、 ¹²⁵Ｉラベル化ＰＭＩ−１抗体を含むキットであることがより望ましい。
【００６５】
別の態様における、本発明の診断システムは、インビボで血栓の存在を検定するのに有用である。このシステムには、ｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログ、好ましくはｐ１２９−１４５と免疫反応する抗体分子を含むパッケージが含まれる。この抗体分子は、基本的にｈＧＰIIｂと免疫反応するＰＭＩ−１抗体分子を含むモノクローナル抗体組成物として存在することがより好ましい。この抗体分子は、インビボ指示手段と結合させておく。
このように、好ましい態様において、本発明の診断システムには、さらに、本発明の抗体分子又はポリペプチドを含む複合体の生成を知らせることができるラベルもしくは指示手段が含まれている。
ここで用いられているように、種々の文法型の、“ラベル”及び“指示手段”という語句は、複合体の存在を示す検出可能なシグナルの生成に直接もしくは間接的に関係する単一原子及び分子を意味している。“インビボ”ラベルもしくは指示手段は、被検者身体中で有効に働くもので、それには、 ¹¹¹Ｉｎ、⁹⁹Ｔｃ、⁶⁷Ｇａ、 ¹⁸⁶Ｒｅ及び ¹³²Ｉが含まれる。どのラベルもしくは指示手段も、本発明の抗体もしくはモノクローナル抗体組成物の一部である、発現タンパク質、ポリペプチドもしくは抗体分子と結合するか、又はそれらに組込まれることもあるし、もしくは、別々に使用されることもあり、またそれらの原子又は分子は、単独で用いられることもあるし、別の試薬と組合せで使用されることもある。このようなラベルは、臨床診断化学の分野ではよく知られているものであり、そして、これらが、ここで述べられている新しいタンパク質を用いた方法そして、またはシステムで使用される場合に限り、本発明の一部を構成している。
【００６６】
ラベルの結合、すなわち、ポリペプチド及びタンパク質のラベル化は、当分野でよく知られているものである。例えば、ハイブリドーマによって生産される抗体分子は、培養培地中の成分として提供されるラジオアイソトープ含有アミノ酸の代謝的取込みによりラベル化することができる。例えばガルフレ（Galfre）等、ソメッズ・イン・エンザイモロジー（Meth, Enzymol)、７３、３−４６（１９８１）参照。活性化官能基を介するタンパク質結合技術が特に利用される。例えば、オーラメアス（Aurameas）等、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Scand. J, Immunol.）８、補７、７−２３（１９７８）、ロットウェル（Rodwell)等、バイオテクノロジー（Biotech)、３、８８９−８９４（１９８４）及び米国特許第4,４９3,７９５号参照。
【００６７】
また、この診断システムには、好ましくは分包状態で特異的結合剤を含むことができる。“特異的結合剤”は、本発明の試薬を選択的に結合できるが、本発明のタンパク質発現物質、ポリペプチドもしくは抗体分子それ自体ではない分子である。代表的な特異的結合剤には、抗体分子、補体タンパク質もしくはその断片、プロテインＡ及びそれに類するものがある。この特異的結合剤は本発明の抗体分子もしくはポリペプチドが複合体の一部として存在するとき、これを結合することができることが好ましい。
好ましい態様においては、この特異的結合剤はラベル化されている。しかし、この診断システムがラベル化されていない特異的結合剤を含んでいる場合、典型的にこの結合剤は、増巾手段又は増巾試薬として用いられている。これらの態様において、ラベル化特異的結合剤は、その増巾手段が試薬含有複合体に結合しているとき、その増巾手段と特異的に結合しうる。
【００６８】
本発明の診断キットは、血清、血漿又は尿のような体液サンプル中のフィブリノーゲン結合血小板の存在もしくはその量を検出するのに、“イライザ法”様式で用いることができる。“イライザ法”とは、固相に結合した抗体又は抗原及び酵素−抗原もしくは酵素−抗体結合体を用いて、サンプル中に存在する抗原もしくは抗体の量を検出及び定量する酵素結合免疫吸着検定法のことである。イライザ法の説明は、参考として、組込まれている、１９８２年、ＣＡ州、ロスアラモスのレンジメディカル出版社から出版されている、Ｄ．Ｐ．サイツ（Sites)等の、“基礎及び臨床免疫学”の第４編、第２２章及び米国特許第3,６５4,０９０号、第3,８５0,７５２号及び第4,０１6,０４３号に報告されている。
このように、好ましい態様において、本発明の発現タンパク質、ポリペプチド又は抗体分子は、固体マトリクスに固定され、本診断システム中、分包されている固体サポートとなっている。
【００６９】
この試薬は、当分野ではよく知られているその他の固定様式が使われることもあるが、水性媒体中から吸着により、固体マトリクスに固定化されるのが一般的である。
当分野において、有用な固体マトリクスはよく知られている。このような物質には、ファルマシア、フィインケミカルス（ＮＪ．ピスカタウェイ）からＳＥＰＨＡＤＥＸの商標で市販されている架橋デキストラン、アガロース；ＩＬ州、北シカゴのアボット・ラボラトリーズ社から市販されている約１ミクロンから約５ミリメートル径のポリスチレンビーズ、シート、小片又はヘラ状の、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロースもしくはナイロンベースの織物、もしくは、ポリスチレン又はポリ塩化ビニルから出来ているチューブ、プレートもしくは、マイクロプレートのウェルが含まれる。
【００７０】
ここで述べられている診断システムの試薬、ラベル化特異的結合剤もしくは増巾剤は、液体分散物のような溶解もしくは、例えば凍結乾燥形のような実質的に乾燥した粉末として提供される。指示手段が酵素の場合、その酵素基質もこのシステムの分包の形で提供される。先に述べたマイクロプレートのような固体サポート及び１種以上のバッファ類も本診断検定システムにおける分包要素として含まれている。
この診断システムに関してここで議論されているパッケージは、通常、診断システムで使用されているものである。このようなパッケージには、ガラス製及びプラスチック製（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン／及びポリカーボネート）のボトル、バイアル、プラスチック及びプラスチックホイルでラミネートした包装等が含まれている。
【００７１】
Ｌ．検定法
本発明は、本発明の抗体もしくは抗体分子組成物中に含まれる抗体、発現タンパク質もしくはポリペプチドを含む複合体を生成することにより、ＧＰIIｂ及び特に血栓もしくは、フィブリノーゲン結合血小板中に見られるようなフィブリノーゲン結合ＧＰIIｂを含む複合体を検出する方法を考案している。当業者は、これら複合体を形成するのに利用することができる、よく知られた臨床的診断化学操作が多く存在することをよく理解できよう。従って代表的検定法をここに示すが、これにより本発明が制限されることはない。
１．血栓の検出
被検者中の血栓の存在を検出する方法が考案されている。インビボ指示手段を結合した、抗ｈＧＰIIｂ抗体分子を含む、本発明の、効果的量の抗体組成物もしくは、モノクローナル抗体組成物を被検者に静脈投与する。好ましい態様において、ラベル化抗体分子は、ｈＧＰIIｂ及びポリペプチドｐ１２５−１４５とは免疫反応するが、ｐ５３−６５とは免疫反応しないもので、ハイブリドーマＰＭＩ−１によって生産されるものであればより好ましい。
【００７２】
その後、この被検者を、ラベル化抗体が血栓の一部として存在するｈＧＰIIｂと反応し、複合体を生成するのに十分な予め決めた時間、及び好ましくは、非結合抗体分子の実質的量が身体から一掃されるのに必要な付加的時間維持する。さらにこの被検者を、生成したラベル化複合体の存在、及び好ましくその位置について検定する。
２．身体サンプル中のフィブリノーゲン結合血小板の検出
好ましくは血液や血液の血小板含有画分のような体液サンプルなどの、血小板含有身体サンプル中のフィブリノーゲン結合血小板の存在及び好ましくはその量を検出するために、競合的、非競合的にかかわらず、種々の不均一及び均一検定プロトコールが使用できる。例えば、ヘパリン保存（非凝血化）血液サンプル及び ¹²⁵Ｉラベル化ＰＭＩ−１抗体分子を混合する。このようにして生成した免疫反応混合物を、生物検定条件下、フィブリノーゲン結合血小板がラベル化抗体と免疫反応し、ラベル化免疫反応産物を生成するのに十分な時間維持する。それから、このラベル化免疫反応産物を典型的には、サンプル中に存在する全ての血小板がペレット化するのに十分な遠心により、未反応ラベル化抗体から分離する。その後、この生成したラベル化免疫反応産物の量を検定する。
【００７３】
生物学的検定条件とは、本発明の抗体分子及びポリペプチド分子及び検定しようとするフィブリノーゲン結合血小板の生物学的活性を維持する条件である。これらの条件には、約４℃から約４５℃の範囲で、好ましくは約３７℃の温度、約５から約９の範囲で、好ましくは約７のｐＨ値、及び蒸留水から、約１モル濃度塩化ナトリウムまでの範囲で、好ましくはおよそ生理的食塩水のイオン強度が含まれる。このような条件を至適化する方法は、当分野ではよく知られている。
例
次に示す例は、本発明を説明するものでその制限を意図したものではない。
１．ＧＰIIｂ−III ａの単離
Ａ．血小板の単離
最終濃度、ミリリットル当り0.０６ユニットのヒルビン（ＭＯ州、セントルイス、シグマケミカル社）を含むＡＣＤ５ml（0.０６５Ｍクエン酸、0.０８５Ｍクエン酸ナトリウム、２％デキストロース）にヒトの血液６ミリリットル（ml）を採取し、これを１２０×ｇで１５分間遠心する。富血小板血漿（ＰＲＰ）と命名した。この上清を回収し、単離してから、さらに、１２００×ｇで１５分間遠心して、単離血小板のペレットを作った。
Ｂ．血小板からのＧＰIIｂ−III ａの単離
例１Ａにおけるように調製した血小板ペレットを５mlのＴＢＳ（0.１５Ｍ ＮａＣｌ、0.２Ｍトリス、pH7.４、５×１０^-4Ｍ ＣａＣｌ₂ 、１０^-5Ｍロイペプチン）に懸濁し、モデルＭ−３７５ソンケーターを用い、最高強度で１０分間、氷上で超音波処理した（ＮＹ州、プレインビュー、ヒートーシステム・ウルトラソニックス）。この超音波処理したサスペンジョンを、ドライアイス−メタノールアイスバスを用いて２度凍結融解を行ない、ついでマイナス２０℃で保存した。この凍結融解したペレット超音波処理物を５mlのスクロース溶液（ＴＢＳ中４０％ｖ／ｖ）上に重層し、ついで、ＳＷ４１遠心ローター（ＣＡ州、フラートン、ベックマン・インスツラメンツ）を用いて、４℃、毎分３８０００回転で１時間遠心すると、ミルク色の下層が生ずる。その後、このミルク色の下層を回収し、ＳＷ５0.１遠心ローター（ベックマン）を用い、４℃で１時間、４３，０００ＲＰＭで遠心した。生成したペレットを典型的には１〜２mlＴＢＳに懸濁して、血小板メンブレン溶液を作り、そのタンパク質濃度を典型的には、バイオ−ラドタンパク質検定キット（ＣＡ州、リッチモンド、バイオ−ラド）を、業者の説明書に従って用いて、１０−２５mg／mlの範囲での測定を行った。
【００７４】
再度、この血小板メンブレン溶液を、ＳＷ５0.１遠心ローターを用いて、上述のように遠心し、ついで生成したペレットを、２mlの抽出バッファ（0.０３Ｍトリス、pH7.４、１×１０^-5Ｍロイペプチン、２００ｍＭ ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド；ＣＡ州、ラジョラ、カルバイオケム−ベーリング）に懸濁した。このようにして作った血小板メンブレン抽出物を渦巻攪拌により完全に混合し、そして室温に３０分間、維持した。その後、この抽出物をＳＷ５0.１遠心ローターを用いて、４℃、４５０００rpm で１時間遠心し、そして、このようにして生成した血小板メンブレン抽出物上清を回収した。
この回収した上清を、１リットルのカラムバッファ（0.０３Ｍトリス、pH7.４、0.１ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、0.１％ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド）で平衡化した。ＬＫＢウルトロゲル、アクタ３４ゲル濾過カラム（３×９７cm、ＭＤ州、ゲイサーズバーグ、ＬＫＢインスツルメント社）にかけ、このカラム溶出物から５mlづつのフラクションを採取した。各フラクションの２８０ナノメーターの光学密度を測定し、いくつかのピーク付近のフラクションを合せて、各ピークのプールを作った。各プール由来のサンプルを、還元バッファ及びレムリ（Laemmli)（ネイチャー（Nature）（ロンドン）、２２７、６８０−６８５（１９７０））によって報告された操作、及び１4.４キロダルトン（ＫＤａ）から９2.５ＫＤａのサイズ範囲の低分子量タンパク質標準物質（ＣＡ、リッチモンド、バイオ−ラド）を用いて、６％ポリアクリルアミド・スラブゲルによる電気泳動で分析した。
【００７５】
ＧＰIIｂ及びＧＰIII ａに相当する分子量、すなわち、各々１２０ＫＤａ及び１００ＫＤａの主要な２種のタンパク質を含むプールが回収された。このように調製した、単離ＧＰIIｂ−III ａ調製物のタンパク質濃度は、典型的に、バイオ−ラドタンパク質検定キットを用いて、0.３から0.８mg／mlの範囲であると測定された。
２．ポリクローナル抗ＧＰIIｂ−III ａの抗血清の調製
例１で説明したように調製した、完全フロイント・アジュバント及び単離したＧＰIIｂ−III ａタンパク質１００マイクログラム（μｇ）を含む組成物による免疫化により、ウサギ抗ＧＰIIｂ−III ａ抗体を調製した。ＧＰIIｂ−III ａの二次免疫注射を三週間の間、一週間スケジュールに従い、不完全フロイントアジュバントを用い、いくつかのイントラダーマル部位に投与し（典型的には４部位に１００μｇを分配する）、ついでさらに３ケ月間、二週間スケジュールに従って投与した。
３．ｃＤＮＡライブラリー構築、抗体スクリーニング及びｃＤＮＡの同定
全細胞性ＲＮＡを、グアニジニウム・イソチオシアネート／塩化セシウム法を用い、ＨＥＬ細胞から調製した。ポリ（Ａ⁺ ）ＲＮＡを２サイクルのオリゴ（ｄＴ）セルロース・クロマトグラフィーにより、全ＲＮＡフラクションから精製した。二本鎖ｃＤＮＡは、標準操作に従い、ＡＭＶ逆転写酵素（ＦＬ州、セント・ピータースバーグ、ライクサイエンス社）及びランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、１０μｇのＨＥＬポリ（Ａ⁺ ）ＲＮＡから合成した。サイズ選択したｃＤＮＡを、ファージｇｔ１１のＥcoＲＩ部位にライゲーションし、ストラタジーン・クローニクングシステムズ社から市販されているギガパック・パッキング抽出物を用い、その業者のプロトコールに従ってそのファージ中に包み込んでから、大腸菌Ｙ１０８８にプレーティングし、増巾した。大腸菌Ｙ１０９０へのファージのプレーティング、融合タンパク質合成の誘導、ニトロセルロースフィルターへの転移及び、例２で調製したウサギのポリクローナルＧＰIIｂ−III ａ抗血清による、そのフィルターのスクリーニングは、イムノパーオキシダーゼに基づくベクタスタインＡＢＣ法（ＣＡ州、バーリンガム、ベクターラボラトリーズ社）を業者の説明書に従って用いた、ヤング（Young)等（プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.) ＵＳＡ、８０、１１９４−１１９８（１９８３））によって報告されたように行った。陽性の組換えクローンをプラーク精製し、増巾してから、プレート溶解物として採取した。
【００７６】
ウサギのポリクローナルＧＰIIｂ−III ａの抗血清による、２００，０００個の組換え体の最初のスクリーニングで６個の免疫反応クローンが同定された。陽性クローンのベーターガラクトシダーゼーｃＤＮＡ融合タンパク質と、モノクローナル抗体ＰＭＩ−１との免疫反応性を試験するため、ファージ溶原体を、ヤング（Young)等（サイエンス（Science)、２２２、７７８−７８２（１９８３））の報告に従い大腸菌Ｙ１０８９株で作った。ＩＰＴＧ誘導培養物由来の溶解物を、還元性ゲルサンプルバッファ中に、そのバクテリア細胞ペレットを懸濁することにより調製し、その後、このサンプルを、６％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで泳動してから、トービン（Towbin) 等（プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.) ＵＳＡ、２６、４３５０−４３５４（１９７９））により報告されているように、ニトロセルロースフィルターに転移し、ついでベカスタインＡＢＣ法を用い、ＰＭＩ−１で探った。
【００７７】
１．１キロベース（ｋｂ）の挿入物を含む、これらのクローンの１つ、ＨＥＬ４１は、ＧＰIIｂエピトープを有するものと一致する特徴を有する１４０ＫＤａのバクテリア融合タンパク質の合成を行うことが分った。これらの特徴には、(1) ＨＥＬ４１クローンによりコードされる融合タンパク質との、ポリクローナル抗ＧＰIIｂ−III ａの抗体組成物の阻害可能な反応性は、単離したＧＰIIａ−III ａによる予備吸着により阻害されること、(2) 血小板溶解物及び精製ＧＰIIｂ−III ａのイムノブロットにおいて、融合タンパク質に関しアフィニティー精製した抗体とＧＰIIｂとの特異的反応、及び(3) 表面ラベル化血小板由来のＧＰIIｂ−III ａの、アフィニティー精製抗血清による免疫沈殿化が含まれる。アフィニティー精製抗体は、ウェスタンブロッティングによるビトロネクチンレセプター（ＶｎＲ）のアルファサブユニットとの反応を起こすことができず、また関連する内皮細胞サイトアドヘシンを免疫沈殿化することができない。さらに、ＨＥＬ４１によりコードされる融合タンパク質は、モノクローナル抗体ＰＭＩ−１との免疫反応性を有し、このことは、このクローンがＧＰIIｂ上にあるエピトーマをコードしている証拠を提供している。
４．ＤＮＡの配列決定及び配列解析
ＨＥＬ４１由来の組換えファージＤＮＡを液体培養技術により精製し、ＥcoＲＩで消化してからＭ１３mp１８にサブクローン化した。各鎖のＤＮＡ配列は、ビギン（Biggin) 等（プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.) ＵＳＡ、８０、３９６３−３９６５（１９８３））により報告されているような、³⁵Ｓ−ｄＡＴＰ及びバッファ勾配ゲルを用い、サンガー（Sanger) 等（プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.) ＵＳＡ、７４、５４６３−５４６７（１９７７））のダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法により決定した。ｃＤＮＡ配列は、ストラウス（Stranss)等（アナリティカル・バイオケミストリー（Anal. Biochem.) 、１５４、３５３−３６０（１９８６））により報告されている特異的プライマー依存ＤＮＡ配列決定法を用いて伸長した。オリゴヌクレオチド２０マーシーケンシングプライマーは、アプライド・バイオシステムズ、モデル３８０Ａ ＤＮＡシンセサイザーを用いて合成した。不明瞭さを除くため両鎖とも配列決定を行った。
【００７８】
クローンＨＥＬ４１のヌクレオチド配列を図１に示したが、それは、次のような特性を有している。挿入物は、部位６８２番から始まるＴＡＧ終止コドンとそれに続く４２０塩基の３′非翻訳配列を伴う、６８１塩基の読み取り枠からなる。このクローンの５′末端の初めの１２０ヌクレオチドは、コンセンサスＡｌｕ反復配列の特徴を有しており、このことは、このクローンが不完全なプロセッシングを受けたｍＲＮＡに由来することを示している。
クローンＨＥＬ４１のｃＤＮＡ配列は、２２７個のアミノ酸の読み取り枠をコードしている（図１）。シャロ（Charo)等（プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.) ＵＳＡ、８３、８３５１−８３５６（１９７６））により報告されているように、ＧＰIIｂの軽鎖の配列決定されたＮ末端配列は、このクローン内のアミノ酸残基１５７番から１７１番として同定される。このコンセンサスＡｌｕ反復配列が読み枠どおりに翻訳されると、これは、ＨＥＬ４１にコードされている最初の４０個のアミノ酸に対応することを示している。
【００７９】
マトリクス分析（ジョージ（George) 等、ＰＩＲレポート＃ＲＥＬ−０２８６、ナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファンデーション（１９８６））によるＧＰIIｂ及びＶｎＲアルファサブユニットの誘導されたアミノ酸配の比較（スズキ（Suzuki）等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.) ＵＳＡ、８３、８６１４−８６１８（１９８６））は、保存的置換を可能とする類似性を有する２つの領域を検出した。およそ５０個のアミノ酸残基にわたる１つの領域は、重鎖のカルボキシ末端付近に位置する。約１５残基の第２の領域は、軽鎖のアミノ末端付近に位置し、両タンパク質の重鎖及び軽鎖間のジスルフィド結合の形成に関係するシスティン残基を含んでいる。突然変異データマトリクスを用いたリレート・プログラムによる、ＧＰIIｂ及びＶｎＲアルファサブユニットの配列間の関係の統計的意義の評価は、２つの配列に存在する、この類似性の度合を偶然に見つける確率の低さを示している（Ｐ＜0.０００１）。ＧＰIIｂ及びＦｎＲアルファサブユニットの配列間の関係を分析すると（アーグレイブス（Argraves）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）２６１、１２９２２−１２９２４（１９８６））、この２つの配列中に存在する類似性の度合を偶然に見つける確率が同様に低いことが示された（Ｐ＜0.０００５）。
【００８０】
コンピュータ調査では、ＧＰIIｂのこの領域とＮＢＲＦタンパク質データーベースに存在する他の配列間にその他の明白な類似性は明らかにされなかった。さらに、神経細胞粘着分子、Ｎ−ＣＡＭの、報告されている部分配列との直接の比較で有意な一致は検出されなかった。
５．ポリペプチド合成
ヌクレオチド配列から誘導されたアミノ酸残基に基づいて、ここで使用されている種々のＧＰIIｂ領域に対応するポリペプチドを、ハーゲンメイヤー（Hagenmaier) 等（ポプセイラーズ・Ｚ．フィジオロジカル・ケミストリー（Hoppe-Seyler's Z. Phisiol. Chem.）３５３、１９７３（１９８２））の対称無水物法を用い、アプライド・バイオシステムズ社モデル４３０ペプチドシンセタイザーで化学合成した。
【００８１】
合成したポリペプチドのアミノ酸残基配列及び図１に示したＧＰIIｂの誘導されたアミノ酸残基配列内のそれらの位置を表２にリストした。
【００８２】
【表２】
表２
名称 アミノ酸残基配列
ｐ１９−３４ ＷＥＡＫＡＧＲＳＰＥＶＲＳＳＲＳ
ｐ５３−６５ ＲＥＱＮＳＬＤＳＷＧＰＫＶ
ｐ１２９−１４５ ＰＳＰＳＰＩＨＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ
ｐ１３６−１４５ ＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ
ｐ１４４−１５６ ＲＱＩＦＬＰＥＰＥＱＰＳＲ
６．モノクローナル抗体組成物の調製
単離したイムノグロブリンＩｇＧ（ＩｇＧ）を含むモノクローナル抗体組成物を、典型的にファルマシア社（ＮＪ．ピスカタウェイ）から市販されており、業者の説明書に従って用いられるプロティンＡ−セファロースを用いて、マウスのハイブリドーマ細胞系列ＰＭＩ−１（ＡＴＣＣ番号ＨＢ９４７６）を含むマウスの腹水から単離した。単離したＩｇＧのタンパク質濃度を、バイオラドのプロティンアセッセイ・キットを業者の説明書に従って使用することにより測定した。
【００８３】
¹²⁵ Ｉラベル化抗体を含むＰＭＩ−１モノクローナル抗体組成物を調製するため、１ミリリットル当り１ミリグラムの上記単離ＰＭＩ−１ＩｇＧを含む、３５０マイクロリットル（μｌ）のＰＢＳ（0.１５Ｍ ＮａＣｌ、0.０１Ｍリン酸ナトリウム、pH7.０９）を、４０マイクログラム（μｇ）のクロラミン−Ｊ及び１ミリキューリー（ｍ Ｃｉ）の無キャリィーＮａ ¹²⁵Ｉ（ＩＬ州、アーリントン・ハイツ、アマーシャム）と混合した。この混合物を約２０℃に５分間維持し、その後、２０μｌの２mg／mlメタ重亜硫酸ナトリウム溶液及び２０μｌのヨウ化カリウム溶液と混合する。それから、１％のＢＳＡを含むＰＢＳ８００μｌを混合し、さらに最終濃度１０ｍＭとなるように、ジイソプロピルフルオロホスフェートを混合する。この混合物を２２℃で６０分維持してから、ＰＢＳに対して透析する。生成した ¹²⁵Ｉラベル化ＰＭＩ−１の比活性はμｇ当り約4.５マイクロキューリーであった。
【００８４】
上述の単離１ｇＧ由来のＦａｂ断片を含む組成物は、パパインによる、３７℃、６時間の消化（パパインに対するＩｇＧの重量比、１：２００）する、メージ（Mage）等の方法に従って調製した（メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology)７０、１４２−１５０（１９８０）。未消化のＩｇＧ及びＦｃ断片を、プロティンＡ−セファロースによるクロマトグラフィーで除去した。こうしてできたＦａｂ断片含有組成物は使用準備ができており、もしくは、必要なときは、上述のモノクローナル抗体組成物で報告した操作と同様に、 ¹²⁵Ｉラベルした。
ＰＭＩ−１と異なる免疫特異性を有する、本発明のモノクローナル抗体も、ＰＭＩ−１と同様に調製される。たとえば、このうな組成物は、マウスのハイブリドーマ細胞系列ＰＭＩ−２を用いて調製した（ＡＴＣＣ番号ＨＢ９６１５）。
７．イライザ検定法（ＥＬＩＳＡ）
Ａ．ポリペプチドイライザ法
ＰＭＩ−１及びＴａｂモノクローナル抗体組成物中に含まれる抗体分子を、ポリペプチドｐ１２９−１４５及びｐ１４４−１５６と免疫反応する能力について調べた。（Ｔａｂは、コントロールとして用いた無関連モノクローナル抗体である。）２０μＭのポリペプチドを含む５０マイクロリットル（μｌ）コーティング溶液（0.１Ｍ ＮａＨＣＯ₃ 、pH8.５、0.１％ ＮａＮ₃ ）を、平底９６穴マイクロプレート（イムロン２、ＶＡ州、チャンティリー、ダイナテク・ラボラトリーズ社）のウェルに入れた。その後、このプレートを３７℃に６０分間維持し、ポリペプチドをウェルの壁上に吸着させる。振って、このコーティク溶液を除き、このウェルを、洗浄バッファ（0.０１Ｍトリス、pH7.４、0.０５％トウィーン２０、0.１５Ｍ ＮａＣｌ、２００mg／mlメルチオレート）で２度すすぎ、さらに各ウェル（固体サポート）に５０μｌのブロッキングバッファ（コーティング溶液中の５％ウシ血清アルブミン溶液）を加えて、過剰のタンパク質部位をブロックした。
【００８５】
このウェルを約３７℃に６０分間維持してから、このブロッキング溶液を除去した。各ウェルに、(a) 例８で調製し、かつ希釈バッファ（５ｍＭ ＥＤＴＡ及び１mg／mlＢＳＡを含む洗浄バッファ）で２００倍に希釈した、ウサギ抗ポリペプチド抗体、(b) 例６で報告したように調製した、1.５ナノモル濃度（ｎＭ）のＰＭＩ−１モノクローナル抗体ＩｇＧ、もしくは希釈バッファで３２０，０００倍に希釈した、ＴＡＢハイブリドーマ腹水（ＴＸ州、サンアントニオ、テキサス大学、Ｒ．マクエバー博士より提供された）を含む溶液５０μｌを加えた。このようにしてできた固／液相免疫反応混合物を６０分間、室温に維持して、固相結合ポリペプチド及び添加された抗体との第１の固相結合免疫反応産物を形成させた。それから、この固液相を分離し、このウェルを洗浄バッファで２度すすいでから、過剰の液体を振って除去した。
【００８６】
希釈バッファで２０００倍に希釈した、ホースラディッシュパーオキシダーゼラベル化ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＣＡ州、バーリンガム、タゴ社）、もしくは、希釈バッファで２０００倍に希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＣＡ州、リッチモンド、バイオ・ラド・ラボラトリーズ社）を含む溶液５０μｌを各ウェルに添加し、第２の固／液相免疫反応混合物（ラベル化免疫反応混合物）を形成させた。このウェルを５０分間、室温に維持して、ラベル化抗体及び第１の免疫反応産物の固相結合抗体間の第２免疫反応産物を形成させた後、洗浄バッファで２度すすいで、固相結合ラベル含有免疫反応産物を単離した。それから、過剰の液体をウェルから除去した。
ＣＰバッファ（水１リットル当り、0.１Ｍクエン酸２４３ml及び0.２Ｍリン酸二ナトリウム２５０ml）中、0.４mg／ml ｏ−フェニレンジアミン及び0.０１２％（ｖ／ｖ）過酸化水素を含む発色基質溶液５０μｌを各ウェルに加え、発色反応混合物を作る。この発色反応混合物を、約２０℃に１０分間維持した後、２ＮＨ₂ ＳＯ₄ ５０μｌを各ウェルに添加して、この発色反応をを停止してから、この溶液の４９０ナノメーター（ｎｍ）の吸光度を、モデル３１０イライザ・プレート・リーダー（ＶＴ州、ウィノスキー、バイオテク・インスツルメント社）を用いて測定した。
【００８７】
表２に示した、本研究の結果は、モノクローナル抗体ＰＭＩ−１が、ポリペプチドｐ１２９−１４５と免疫反応するが、ポリペプチドｐ１４４−１５６とは免疫反応しないことを示している。以下に議論しているように、ＰＭＩ−１は、ＧＰIIｂ−III ａがフィブリノーゲンと結合したとき、ｈＧＰIIｂにより形成されている（上に露出している）潜在的決定基と免疫反応するため、本研究の結果は、ｐ１２９−１４５がｈＧＰIIｂ潜在的決定基を真似る能力を有していることを示している。
【００８８】
【表３】
表３
ポリペプチド モノクローナル抗体
抗原 ＰＭＩ−１ Ｔａｂ
ｐ１２９−１４５ 1.３１０±0.１３² 0.０６８±0.００９
ｐ１４４−１５６ 0.０６９±0.００５ 0.０６１±0.００５
ＢＳＡ¹ 0.０６８±0.００５ 0.０６０±0.００４
¹ ＢＳＡ＝ネガティブコントロールとして使用されたウシ血清
アルブミンコーティングしたウェル。
２．三回の測定から得られた平均光学密度の値±標準偏差
Ｂ．競合イライザ法
ポリペプチド及び単離ＧＰIIｂ−III ａについて、ＰＭＩ−１及びＴａｂモノクローナル抗体組成物中に含まれる抗体分子との免疫反応に対し、固相ＧＰIIｂ−III ａと抗原として競合する能力を調べた。
【００８９】
競合イライザ法は、１）ポリペプチドの代りに、例１で報告したように単離したＧＰIIｂ−III ａをコーティング溶液中２０μｇ／mlで用いてマイクロプレートのウェルをコートすること、及び２）抗体を添加し、免疫反応混合物を作る直前にウェルにＧＰIIｂ−III ａもしくはポリペプチドを各々、0.７３μＭもしくは２５μＭ濃度でウェルに添加すること、以外は、例７Ａで述べたように行った。
表４で示した、本研究の結果は、ｐ１２９−１４５及びＧＰIIｂ−III ａが競合的に、固相ＧＰIIｂ−III ａに対するＰＭＩ−１抗体分子の免疫学的結合を阻害する一方、ｐ１４４−１５６は阻害しないことを示している。加えて、ポリペプチドは、ＧＰIIｂ−III ａと免疫反応するＴａｂ抗体分子の能力に有意な影響を示さなかった。これらの結果は、ポリペプチドｐ１２９−１４５がｐ１２９−１４５アミノ酸残基配列を含むｈＧＰIIｂ領域の二次構造及び抗原決定基を真似る能力を有することを示している。
【００９０】
【表４】
表４
競合者 モノクローナル抗体
ＰＭＩ−１ Ｔａｂ
ｐ１２９−１４５ 0.０６７±0.００２¹ 1.００２±0.０２６
ｐ１４４−１５６ 0.８１４±0.０１２ 1.１１７±0.０２４
なし 0.８０４±0.００２ 1.０４０±0.０５
ＧＰIIｂ−III ａ 0.４３３±0.０１３ 1.１３４±0.０１０
１．三回の測定から得られた平均光学密度値±標準偏差
８．抗ペプチド抗血清の調製
抗ペプチド抗血清は、例５で調製したペプチドでウサギを免疫化することにより作った。グルタルアルデヒドを用いた、抗原キャリヤーとしてチログロブリン（ＭＯ州、セントルイス、シグマケミカル社、ウシＩ型）へのペプチドの結合を、参考として、ここに組込んだＪ．Ｇ．ドクレー（Dockray)の報告（制御ペプチド（Regulatory Peptides)、１、１６９−１８６（１９８０））に従って行った。その後、一次免疫に、４００μｇのチログロブリン結合ペプチドを用いたこと以外は、例２で述べたように免疫化を行った。
９．ポリペプチドによる、血小板会合ＧＰIIｂへの抗体結合の阻害
Ａ．血小板の調製
例１Ａで示したように調製した単離血小板を、１mg／mlのＢＳＡ及び１mg／mlデキストロースを含む無カルシウムタイローズバッファ（0.１３Ｍ ＮａＣｌ、0.００２６Ｍ ＫＣｌ、0.００２Ｍ ＭｇＣｌ₂ −６Ｈ₂ Ｏ、５ｍＭヘペス、0.０１２Ｍ ＮａＨＣＯ₃ 、pH7.２）２mlに懸濁した。この血小板サスペンジョンを、同様のタイローズバッファで平衡化したセファロースＣＬ２Ｂカラム（ＮＪ州、ピスカタウェイ、ファルマシア社、４０ml全吸着床容積）にかけた。血小板を、最終容積約４〜５mlの、ＣＬ２Ｂカラムの空隙容量から回収し、洗浄血小板及びこの洗浄血小板サスペンジョンと命名し、コールター社モデルIIカウンター（ＦＬ州、ハイアリーフ、コールターエレクトロニクス社）で計数した。全血小板調製操作は、プラスチック容器中及び室温で行った。
Ｂ．血小板競合検定法
例９Ａで述べた、タイローズバッファ中に調製した洗浄血小板（２×１０⁸ ／ml）を、最終濃度５ｍＭとなるようなテトラエチレン四酢酸（ＥＤＴＡ）と混合し、３０分間３７℃に維持して、ＰＭＩ−１結合エピトープに露した。その後、この血小板を図２に示した濃度のポリペプチドと混合し、さらに、例６で調製した。 ¹²⁵Ｉラベル化ＰＭＩ−１と混合させて、生成した免疫反応混合物中、１μＭのラベル化抗体を作る。この混合物を２２℃に３０分間維持し、免疫反応産物を形成させる。その後、 ¹²⁵Ｉラベル化ＰＭＩ−１／血小板免疫反応産物は、その維持した全混合物を、ベックマン・マイクロフュージＢ（ＣＡ州、フラートン、ベックマン・インスツルメント社）中、0.３mlの２０％スクロース中での遠心により未結合の ¹²⁵Ｉ−ＰＭＩ−１から単離され、血小板ペレットとした。血小板ペレットに会合した放射活性 ¹²⁵Ｉ−ＰＭＩ−１の量を、シンチレーションスペクトロメトリーにより測定した。
【００９１】
図２に示した、本研究の結果は、ポリペプチドｐ１２９−１４５が、二価カチオンの非存在下、血小板メンブレン会合ＧＰIIｂへの、抗体分子結合を競合的に阻害しうることを示している。また、図２は、抗体分子濃度が１μＭのとき、５０％阻害が、1.６μＭのポリペプチド濃度で起こることから、ｐ１２９−１４５／ＰＭＩ−１相互作用のおよそのＫｄ値が1.２μＭであることを示している。
１０．フィブリノーゲン結合血小板による、ｈＧＰIIｂ潜在的決定基の発現
例１ａで示したように、富血小板血漿（ＰＲＰ）を調製し、３つの部分標本に分けた。１つの部分標本において、血小板を最終濃度５０μＭとなるようアデノシン二リン酸は添加することにより刺激して、官能性ＧＰIIｂ−III ａ（フィブリノーゲンレセプター）を発現させ、ＡＤＰ刺激血小板を生成した。第２の部分標本において、最終濃度５０μＭのエピネフリンの添加によりＧＰIIｂ−III ａの発現の刺激を行った。両方の場合、刺激を受けた血小板上に発現したＧＰIIｂ−III ａフィブリノーゲンレセプターは、血漿中に存在するフィブリノーゲンと結合し、フィブリノーゲン結合血小板となる。ネガティブコントロールとして、ＰＲＰの第３の部分標本は刺激せず、非刺激血小板とした。
【００９２】
通常の技術で、例６で述べた、 ¹²⁵Ｉラベル化抗体から調製した、 ¹²⁵Ｉラベル化ＰＭＩ−１ Ｆａｂ断片を、最終濃度0.８μＭとなるよう各ＰＲＰ部分標本に添加した。このようにして生成した免疫反応混合物を３０分間３７℃に維持し、ラベル化した免疫反応産物、すなわち、フィブリノーゲン結合血小板／ ¹²⁵Ｉ−ＰＭＩ−１複合体を形成させた。それから、ラベル含有免疫反応産物を、例９Ｂで述べたようなスクロースクッションを介した血小板の遠心により、未結合 ¹²⁵Ｉ−ＰＭＩ−１から分離した。
図３は、本研究の結果を示しており、ＰＭＩ−１抗体分子が、刺激化フィブリノーゲン結合血小板とは免疫反応するが、実質的に、非刺激化血小板とは免疫反応しないことを示している。非刺激化ＰＲＰ部分標本中“結合”していると見なされる ¹²⁵Ｉ−ＰＭＩ−１は、非特異的結合（“スティッキング”）、そして、または、天然のバックグランドレベルの刺激化フィブリノーゲン結合血小板もしくは、取扱いの結果として結合及び刺激化された血小板の存在によるものであると考えられている。それゆえ、これらの結果は、ＧＰIIｂ−III ａサイトアトヘシンによる、フィブリノーゲン、ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ（ＲＧＤ）アミノ酸残基配列含有リガンドの結合は、その他の潜在的抗原決定基を発現させることを示している。このように、ＰＭＩ−１抗体分子及び同様の免疫特異性を有する抗体分子は、血液サンプル中の刺激化フィブリノーゲン結合血小板の存在及びその量の検定に使用することができる。
１１．ポリペプチドによる血小板凝集の阻害
例１Ａで述べたように調製した富血小板血漿（ＰＲＰ）２００μｌを、ＢＳＡ及びテキストロース（各々１mg／ml）を含むタイローズバッファ１９０μｌ及び表４で示した種々の量のポリペプチドｐ１２９−１４５もしくはｐ１４４−１５６と混合した。それから１０μｌのＡＤＰ（タイローズバッファ中８０μＭ）を添加して、血小板凝集を刺激した。この混合物を３７℃に維持しながら、デュアルサンプルアグリゲーションメーター（ＣＯ州、モリソン、シエンコ社、モデルＤＰ−２４７Ｅ）を用い、この混合物の透過率の時間変化をモニターした。
【００９３】
アグリゲーションメーターは、２００μｌのＰＲＰ及び２００μｌのタイローズバッファを含む溶液を用い、コントロールアグリゲーションに対しては５％、及びポリペプチド存在下のアグリゲーションに対しては１０％に透過率のベースラインをセットすることにより補正した。１００％透過率の上限は、１００mlＰＲＰ及び３００μｌのタイローズバッファの混合物を用いて一律に設定した。
１２．抗ペプチド抗血清を用いたＧＰIIｂ軽鎖の免疫反応
例１Ａで述べたように調製した約１兆個の血小板を１mlの冷ＰＢＳ（すなわち４℃）懸濁し、ついで、２００μｇのラクトパーオキシダーゼ（シグマ社）及び２ｍ Ci の無キャリヤーＮａ ¹²⁵Ｉ（１６ｍ Ci ／μｇ、ＩＬ州、アーリントンハイツ、アマーシャム）と混合し血小板ラベル化サスペンジョンを調製した。それから、５分間隔で２回、0.０６％ストック溶液から５μｌのパーオキサイドをこのサスペンジョンに添加し、４℃に維持して、ラベル化反応を開始させた。その後、２００μｇのチロシンを加えて、この反応を停止させ、１２００ｘｇ、１５分の遠心を５回繰り返して洗浄し、さらに冷ＰＢＳに懸濁して、ラベル化血小板サスペンジョンを調製した。５番目の遠心ステップの後、このラベル化血小板を、４０mlの溶解バッファ１（0.５％トライトンＸ−１００（ｖ／ｖ）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μｇ／mlベンズアミジン及び１００ユニット／mlのトラシロール；全てシグマ社製）に懸濁することにより、ラベル化血小板溶解物を調製した。
【００９４】
１mlのラベル化血小板溶解物を１５μｌの加熱失活化正常ウサギ血清（ＮＲＳ）と混合し、２２℃に３０分間維持し、さらに、免疫反応バッフぁ（ＩＰＢ：0.０２Ｍトリス塩酸、pH7.４、0.１５６Ｍ ＮａＣｌ、0.０１Ｍ ＥＤＴＡ、１０ｍＭベンスアミジン−塩酸、１０μｇ／mlソイビーン・トリプシン・インヒビター、0.２ｍＭフェニルメチルスルホニル・フルオライド、１％（ｖ／Ｖ）トライトンＸ−１００、0.０５％〔ｖ／Ｖ〕トウィーン２０、0.０２％〔ｗ／Ｖ〕ＮａＮ₃ 、５ユニット／mlトラシロール；全てシグマ社製）中に調製した。１０％（ｖ／Ｖ）ハイソービル（ＣＡ州、ラジョラ、ベーリング、ダィアグ／スティクス社）溶液１００μｌを添加し、ベックマン、マイクロフュージＢ中で１分間遠心し、ついで生成した上清を単離して、透明な溶解物を調製した。このＮＲＳの添加、維持、パンソービンの添加及び遠心の透明化操作を２度繰り返してから、再び、ＮＲＳ及び維持ステップを省いた、パンソービンを用いる同様の操作を行ない、三回透明化溶解物を調製した。
【００９５】
その後、この三回透明化溶解物を、２５０μｌのＩＰＢ、例８で調製した抗ポリペプチド抗血清４μｌ、例２で調製した抗ＧＰIIｂ−III ａもしくはＮＲＳ、及び最終濃度１％となるようなウシ血清アルブミンと混合した。この混合物を、４℃に１２〜１８時間維持してから、１０％パンソービン１００μｌと混合し、その後、２２℃に１時間維持した。その後、この混合物をマイクロフュージＢで１分間遠心してから、生成したペレットを単離した。この単離ペレットをＩＰＢで２回、0.５Ｍ ＬｉＣｌで１回、再びＩＰＢで１回洗浄した。この洗浄操作には、指示したバッファ約１mlへの懸濁、マイクロフュージＢでの１分間の遠心及び生成したペレットの単離が含まれる。
ついでこの洗浄ペレットを溶解して、レムリ（Laemmli)により報告されているように、サンプルバッファ約１００ml中、３分間１００℃に加熱することにより、存在する免疫複合体を脱離させる。例えば、レムリ（Laemmli)、Ｕ．Ｋ．ネイチャー（Nature）（ロンドン）、２２７−６８０−６８５（１９７０）参照。その後、溶解免疫複合体をマイクロフュージＢで１分間遠心してから、免疫沈殿化タンパク質を含む上清を、５％２−メルカプトエタノールを含むレムリ（Laemmli)バッファーを用い、１５％ポリアクリルアミドスラブゲルでの電気泳動で分析した。さらに、このゲルを乾燥し、そこに含まれているタンパク質をコダックＸ−オマット(Omat)ＡＲフィルム（ＮＹ州、ロチェスター・イーストマン・コダック社）への放射線露光により可視化した。この可視化タンパク質の分子量を、１２，３００及び９７，４００ダルトンの範囲の分子量をもつ、¹⁴Ｃラベル化タンパク質標準物質に相対的な電気泳動移動度に基づいて見積った（標準物質；ＭＡ州、ボストン、ニューイングランドニュークリアー製）。
【００９６】
この方法で分析したラベル化溶解物は、約２０ＫＤａの分子量をもつ、ゲル上に可視化されたタンパク質を生じ、このタンパク質は、ポリクローナル抗ＧＰIIｂ−III ａ抗血清もしくはＮＲＳを用いたときは実質的には検出されない、抗ポリペプチドｐ１４４−１５６抗血清使用時のＧＰIIｂ軽鎖タンパク質（ｌＧＰIIｂ）に対応している。それゆえ、抗ポリペプチドｐ１４４−１５６抗血清及び同免疫特異性を有する抗体組成物は、ｌＧＰIIｂを検出するのに用いることができる。
１３．リガンド結合による、ＧＰIIｂ−III ａ潜在的抗原決定基の発現
Ａ．混合による、潜在的抗原決定基を発現する血小板への抗体結合の検定法
使用するタイローズバッファを始めに、キレックス１００（２００−４００メッシュ、ナトリウム型、ＣＡ州、リッチモンド、バイオラド・ラボラトリーズ社）との混合し、タイローズバッファ中に存在する二価カチオンと錯体を作るよう維持し、ついでバッファから、錯体を作った二価カチオンを濾過して除去する処理を行うこと以外、例９Ａで述べた方法により、洗浄血小板を、ml当り１×１０⁸ 個の濃度となるように調製した。
【００９７】
上記の洗浄化血小板含有調製溶液を部分標本に分けた後、各部分標本中の血小板を、最終濃度５μＭとなるようにＡＤＰを添加することにより刺激してＡＤＰ刺激化血小板を調製した。また、刺激を行なわないものも用意した。
まず、例６で述べたように調製した、 ¹²⁵Ｉラベル化全抗体分子もしくは、 ^{1 25}Ｉラベル化Ｆａｂ断片を含むモノクローナル抗体組成物を種々のポリペプチド及び二価カチオンもくしはＥＤＴＡと混合した。さらに、この ¹²⁵Ｉラベル化抗体／ポリペプチド混合物を、刺激化もしくは非刺激血小板部分標本と、結果として、抗体もしくはＦａｂ断片濃度が約0.８μＭとなるように混合した。それから、この免疫反応混合物を３０分間３７℃に維持し、潜在的抗原決定基を発現させ，かつ、 ¹²⁵Ｉラベル化免疫反応産物、すなわち、リガンド結合血小板／ ¹²⁵Ｉ−抗体もしくは ¹²⁵Ｉ−Ｆａｂ断片複合体を形成させた。さらに、ラベル含有免疫反応産物は、例９Ｂで報告されているように、スクロースクッションを介しての部分標本の遠心により、未結合 ¹²⁵Ｉラベル化抗体又はＦａｂ断片から分離した。
【００９８】
表５は、モノクローナル抗体ＰＭＩ−１を用いた、リガンド存在下の、血小板へのラベル化抗体の結合を検定した結果を示す。
【００９９】
【表５】
表５
ＰＭＩ−１ ＩｇＧ又はＦａｂの血小板への結合におけるリガンド依存の増加抗体種 リガンド² 結合ＰＭＩ−１の増加¹
未刺激 刺激化
ＰＭＩ−１ ＩｇＧ ＫＹＧＲＧＤＳ ６３７８±７５３ ６０００±７１４ＧＲＧＤＳＰ ５３１３±５２２ ５５６１±１５８ＧＲＧＥＳＰ ８９８±３５７ ８３７±３７４Ｈ−１２ Ｎ．Ｄ．³ ３６６３±８７８ＥＤＴＡ ６０６４±５９３ ５６７４±５１２ＰＭＩ−１ Ｆａｂ ＫＹＧＲＧＤＳ ７７２２±１１８９ ５６６１±３７３ＧＲＧＤＳＰ ４４３７±８５２ ５２５０±３００ＧＲＧＥＳＰ −２７９±２８１ １４７±１６５Ｈ−１２ Ｎ．Ｄ． ３０１４±４３０ＥＤＴＡ ５２９９±２２５ ６５０５±６６０１．結合したＰＭＩ−１量の増加は、リガンド存在下での結合量から、リガンドは含まないが２ｍＭ ＣａＣｌ₂ 及び１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 存在下での結合量を引いた値として観測される増加を、血小板当りに結合したＰＭＩ−１分子数±標準偏差として表現されている。非刺激又は刺激化血小板に対する、二価カチオン存在かつリガンド非存在下での結合量は、各々、ＰＭＩ−１ ＩｇＧに対し、６７６９±８４又は６６４３±１５７分子／血小板であり、また、ＰＭＩ−１ Ｆａｂに対し、各々、３９１７±２１２又は３７８５±１５０分子／血小板であった。
【０１００】
２．使用するリガンドは例５で述べたように調製した。指示されたポリペプチドの１つであり、例１３Ａで述べた免疫反応混合物中の最終濃度が１ｍＭとなるよう添加するか、又は、アミノ酸配列ＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶを有し、残基３９９−４１０番のフィブリノーゲンガンマ鎖由来のものである。コントロールポリペプチドＨ−１２で、これも１ｍＭ添加される。コントロールとしてのリガンドポリペプチドの非存在下では、4.５ｍＭ ＥＤＴＡが添加された。ＥＤＴＡを含まない全ての場合に、２ｍＭ ＣａＣｌ₂ 及び１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ が含まれる。
３．測定せず。
表６は、ハイブリドーマＰＭＩ−２より生産される全モノクローナル抗体又はＦａｂ断片（すなわち、ＰＭＩ−２モノクローナル抗体）を含むモノクローナル抗体組成物を用いた、リガンド存在下での、抗体の血小板への結合の実験結果を示している。
【０１０１】
【表６】
表６
結合ＰＭＩ−２¹
リガンド² 二価イオン³ 未刺激 刺激化
なし ＣａＣｌ₂ １２２０ 2,４８０
ＲＧＤＳ ＣａＣｌ₂ ２２１０ １0,７８０
ＳＤＧＲ ＣａＣｌ₂ １９６０ 2,３６０
ＧＲＧＥＳＰ ＣａＣｌ₂ １５６０ 4,６８０
４００−４１１ ＣａＣｌ₂ １８４０ 9,６５０
Ｆｇ ＣａＣｌ₂ ２３００ １3,８００
なし ＥＤＴＡ ８６６０ １0,６７０
ＲＧＤＳ ＥＤＴＡ ８５４０ １0,０８０
１．ＰＭＩ−２ ＩｇＧの結合量は例１３Ａで示したように測定し、指示して条件下、血小板当り結合したＰＭＩ−２分子数として表現されている。
【０１０２】
２．使用したリガンドは、例５で述べたように調製した。指示されるポリペプチドの１つであり、最終濃度0.５ｍＭとなるよう添加するか、もしくは、これも、0.５ｍＭとなるよう添加される。残基部位４００から４１１番のフィブリノーゲンガンマ鎖の配列に相当する配列を有するポリペプチド、もしくは最終濃度１５μＭで使用する、マーグエリー（Marguerie)等（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.) 、２５４、５３５７−５３６３（１９７９））により報告されているように単離したフィブリノーゲン・タンパク質（Ｆｇ）である。またコントロールとして、リガンドの添加がないものも行った。３．添加二価カチオンとは、１ｍＭ ＣａＣｌ₂ か、又は５ｍＭ ＦＤＴＡの二通りの条件を意味する。
【０１０３】
表５及び表６に示した結果は、フィブリノーゲン（Ｆｇ）Ｆｇ由来ペプチド、４００−４１１及びＲＧＤ含有ペプチドがＧＰIIｂ−III ａを結合し、かつ、通常、抗原決定基が抑制される条件下、すなわち、ＣａＣｌ₂ の生理学的濃度存在下、ＰＭＩ−１又はＰＭＩ−２により認識される潜在的抗原決定基を露出させる能力を示している。
また、この結果は、ＰＭＩ−２により認識される潜在的抗原決定基は刺激化血小板とのリガンド結合で誘導れるが、非刺激化血小板では誘導されないことを示している。一方、ＰＭＩ−１により認識される潜在的抗原決定基は、刺激化、もしくは非刺激化血小板の両方との、ポリペプチドリガンドの結合により誘導される。
【０１０４】
さらに、この結果は、ＧＰIIｂ−III ａに対するこのリガンドの構造特異性も示している。逆配列ペプチド、ＳＤＧＲは、ＰＭＩ−２認識抗原決定基を誘導せず、また、通常見うけられるアスパラギン酸残基（Ｄ）の代りに、グルタミン酸（Ｅ）を用いる保存的置換は、潜在的抗原決定基誘導リガンドとして、かなり効果の小さいペプチドを生ずる。
このポリペプチドリガンド、ＲＧＤＳ濃度を、上記の抗体の血小板結合検定法で変化させた時、刺激化又は、非刺激化血小板上の潜在的抗原決定基のリガンド誘導に対する投与−応答曲線が得られた。潜在的抗原決定基を検出するためにＰＭＩ−１又はＰＭＩ−２を用いた、投与−応答曲線の結果をＬＩＢＳ誘導率として表現した、図５に示す。ポリペプチド存在下結果したＩｇＧ量は、完全なリガンド誘導結合部位（ＬＩＢＳ）の誘導の際の、ＩｇＧの最高結合量の割合として表現されており、そこでは、4.５ｍＭ ＥＤＴＡ存在下及びペプチド非存在下での血小板当りのＩｇＧ分子量として測定したＩｇＧ結合は、１００％誘導として考え、また、２ｍＭ ＣａＣｌ₂ 及び１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 存在下、かつ、ペプチド非存在下でのＩｇＧ結合は、０％誘導と考えた。
【０１０５】
図５に示した結果は、ポリペプチドリガンドが同じハーフマキシマムリガンド濃度約２ｍＭで２つの異なる潜在的抗原決定基を誘導することを示している。さらに、この結果は、ＰＭＩ−２により認識れる決定基は、刺激化血小板では誘導されるが、非刺激血小板では誘導されないが、一方、ＰＭＩ−１により認識される潜在的抗原決定基は、ＲＧＤＳを用いたとき、刺激化血小板及び非刺激血小板の両方で誘導されることを示している。
ＰＭＩ−１及びＰＭＩ−２モノクローナル抗体の両方が抗ＬＩＢＳモノクローナル抗体である一方、これら２つの抗体の特異性は区別可能なものであることに注意すべきである。従って、リガンドによるレセプターの占有は１つ以上のＬＩＢＳを誘導しうる。結果として、本発明の方法は、細胞表面レセプターリガンド複合体と免疫反応する１種以上のモノクローナル抗体を生産するのに使用することができる。
【０１０６】
Ｂ．潜在的抗原決定基を発現する可溶性精製ＧＰIIｂ−III ａへの抗体結合の検定
潜在的抗原決定基の発現を誘導する、種々のポリペプチドの能力を、可溶性の単離ＧＰIIｂ−III ａを用いて研究した。
最後に、次に示すこと以外は、例７Ｂで述べた様に、競合イライザ法を行った。マイクロプレートは、ml当り１０μｇ濃度の、例１で述べた様に単離したＧＰIIｂ−III ａを含むコート溶液を用いてコーティングした。ブロッキング後、全ての使用される溶液は、その使用前、例１３Ａでタイローズバッファについて述べたように、キレックス１００で処理した。(1) 例５で述べたように調製した1.５ナノモル濃度のＰＭＩ−１ ＩｇＧ、又は、例７Ａで述べた、Ｔａｂハイブリドーマ、(2) ２ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、(3) 例１で述べたように単離し、ＰＭＩ−１検定に対しては、４０μｇ／mlの濃度、また、Ｔａｂ検定に対しては４μｇ／mlの濃度となるように添加されるＧＰIIｂ−III ａ及び(4) １ｍＭのポリペプチドを含む免疫反応混合物を調製した。この免疫反応混合物を１６〜２０時間、２２℃に維持して、固相結合ＧＰIIｂ−III ａ及び添加した抗体間の、第１の固相結合免疫反応産物を形成させる。
【０１０７】
上述の実験結果を以下の表７に示した。
【０１０８】
【表７】
表７
溶液中でのＧＰIIｂ−III ａへのリガンド結合により誘導されるＰＭＩ−１依存潜在的抗原決定基の発現
発現率¹
リガンド² ＰＭＩ−１ Ｔａｂ
ＫＹＧＲＧＤＳ ６５±２２（３） ９８±２５（３）
ＧＲＧＤＳＰ ５３±２２（５） ８５±２７（３）
ＲＧＤＳ ４２±１６（３） ９２±１１（３）
ＧＲＧＥＳＰ １８±１３（３） １０６±２４（３）
ＳＤＧＲ １８±１３（３） ７９±２５（３）
コントロール ２０± ９（５） ８４±１３（４）
１．発現率は、ポリペプチドリガンド結合により、誘導されるＧＰIIｂ−III ａ上に存在する潜在的決定基の尺度となる。このデータは、５ｍＭ ＥＤＴＡの存在下、ＧＰIIｂ−III ａを用いて得られた最高の決定基発現の割合として表わされている。各条件下で行った測定数をカッコ中に示し、また、その結果は、それらの測定値の平均値±標準偏差で示した。
【０１０９】
２．添加したリガンドは、例５で述べたように合成し、その配列は、一文字コードで示したポリペプチドである。“コントロール”とは、ポリペプチドを添加しなかったことを意味する。
表７に示した結果は、ＲＧＤ含有ポリペプチドリガンドは本来の血小板を用いて観察されたのと同じような方法で（例えば表６に参照）、ＧＰIIｂ−III ａによる、潜在的抗原決定基の発現を誘導することを示している。リガンド誘導の発現の特異性は、逆配列（ＳＤＧＲ）又は、保存的置換（ＧＲＧＥＳＰ）を有するポリペプチドを用いることにより確証され、またさらに、Ｔａｂモノクローナル抗体結合に関して有意なリガンドの影響が観察されなかったことにより確証された。これらの結果は、モノクローナル抗体ＰＭＩ−１により認識される潜在的抗原決定基のリガンド誘導の発現は、ＧＰIIｂ−III ａの本質的性質でありまた、ＧＰIIｂ−III ａの血小板の会合に依存しないことを示している。例を要する特別な態様を含む、先に示した明細は本発明を説明するためのもので、制限を意図したものではない。本発明の精神及び範囲を逸脱することなしに、多くの変化及び修正を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＰIIｂの前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び相当するアミノ酸残基配列。ヌクレオチド配列は、塩基１番から１１０４番まで連続して表わされている様に、一文字ヌクレオチド塩基コードを用いて左から右に、５′末端から３′未満の方向で示されている。アミノ酸残基配列は、アミノ末端の残基１番（Ｒ）から、カルボキシ末端の残基２２７番（Ｓ）まで連続して示されているように、一文字アミノ酸残基コードを用い、左から右へ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向で表わされている。
読み枠は、ヌクレオチド配列の下の誘導されるアミノ酸配列の位置で示されており、各アミノ酸残基を示す一文字は対応するコドンの第１塩基の下に位置している。
ｐ１２９−１４５と命名されるポリペプチド及びｐ１１４−１５６と命名されるポリペプチドに対応するアミノ酸残基配列の、ＧＰIIｂ前駆体タンパク質中の位置は、各々、大小のボックスで示した。ｐ１９−３４及びｐ５３−６５と命名されたポリペプチドの位置は各々、二重又は一本の下線で示されている。ＧＰIIｂの軽鎖に対し、提唱されているアミノ末端のアミノ酸残基配列は、点線で示し、矢印は、ＧＰIIｂの重鎖及び軽鎖を作る潜在的切断部位を示している。
【図２】血小板に結合する抗体ＰＭＩ−１に関するポリペプチドｐ１２９−１４５の影響を示すグラフ。
血小板に、５mM濃度となるようＥＤＴＡを混ぜ、ｈＧＰIIｂ上のＰＭＩ−１エピトープを十分に露出させる。その後、この血小板を０〜１００マイクロモル濃度（μＭ）の範囲の種々の濃度のポリペプチドｐ１２９−１４９及び ¹²⁵Ｉラベル化ＰＭＩ−１抗体と、例９で説明するように混合した。血小板に結合した ¹²⁵Ｉラベル化ＰＭＩ−１の割合を、検定物に加えたポリペプチド濃度に対してプロットした。
【図３】例１０で説明されるように測定された刺激を受けたファブリノーゲン結合血小板上のＰＭＩ−１エピトープの露出を示す図。
(1) 刺激なし、(2) ５μＭ ＡＤＰによる刺激又は(3) ５０μＭエペネフリンによる刺激、条件下、ファブリノーゲン結合血小板と免疫反応する ¹²⁵Ｉラベル化ＰＭＩ−１量を測定し、５μＭ ＥＤＴＡ存在下、非刺激血小板と免疫学的に結合する ¹²⁵Ｉ−ＰＭＩ−１量に対する割合として発現した。
【図４】例１１で説明されるような、血小板凝集に関する、ポリペプチドｐ１２９−１４５及びｐ１４４−１５６の影響を示したレコーダの写し。
時間（分）に対する透過率をリニアー・プロットで示してあり、１００パーセント透過は最高の血小板凝集を示している。パネルＡは、タイロード（Tyrode′s)バッファ中の富血小板血漿（ＰＲＰ）のコントロール溶液（破線）及びさらに、１mMポリペプチドｐ１２９−１４５を含むＰＲＰ（実線）の透過率を描いてある。パネルＢは、コントロール溶液（破線）及びさらに１mMポリペプチドｐ１４４−１５６を含むＰＲＰ（実線）の透過率を描いてある。
【図５】血小板ＧＰIIｂ− IIIａによる、２個の別々のリガンド誘導結合部位の発現を示す図。
各ＬＩＢＳは、アミノ酸残基配列ＲＧＤＳを有するポリペプチド型のリガンドとの特異的結合による誘導により、ＧＰIIｂ− IIIａリガンド（ＧＰIIｂ−ポリペプチド）複合体を形成する。種々のポリペプチド濃度によるＬＩＢＳ発現率は例１３Ａで説明されているように測定した。

Claims (7)

1. ａ）少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量の、血小板糖タンパク質 GPIIb-IIIa と、血小板との複合体と免疫反応するが、いずれも非結合型のとき、該血小板糖タンパク質 GPIIb-IIIaとも、該血小板とも免疫反応しない抗体分子を含むモノクローナル抗体組成物を含むパッケージ、
   を含み、特異的に結合した該血小板糖タンパク質 GPIIb-IIIa及び該血小板を含む血液サンプル中の前記複合体の存在を検定するための、診断キット。
2. 上記抗体分子が放射性核種でラベルされている、請求項１記載の診断キット。
3. ａ）少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量の、血小板糖タンパク質 GPIIb-IIIa と、血小板との複合体とは免疫反応するが、それぞれ非結合型の血小板糖タンパク質 GPIIb-IIIa又は血小板とは免疫反応しない、インビボ指示手段と結合した抗体分子を含むモノクローナル抗体組成物を含むパッケージ、
   を含み、特異的に結合した血小板糖タンパク質 GPIIb-IIIa及び血小板の複合体をインビボで検定するための、診断キット。
4. 特異的に結合する、血小板糖タンパク質 GPIIb-IIIa と、血小板との複合体により発現されるリガンド誘導結合部位と免疫反応するモノクローナル抗体を生成する方法であって、
   ａ） 該複合体でホ乳類を免疫化する、
   ｂ） 該免疫化ホ乳類から抗体生産細胞を取り出し、そして該細胞のサスペンジョンを作る、
   ｃ） 該細胞をトランスホーム剤で処理し、トランスホーム化抗体生産細胞を作る、
   ｄ） 非トランスホーム化細胞は生存できない組織培養培地に限定希釈することにより、ステップ（ｃ）で処理した細胞をクローン化し、クローン化したトランスホーマントを作る、
   ｅ） 該クローン化トランスホーマントの組織培養培地を、該血小板糖タンパク質 GPIIb-IIIa −血小板の複合体とは免疫反応するが、各々非結合型の血小板糖タンパク質 GPIIb-IIIa 又は血小板とは免疫反応しない分泌抗体分子の存在について評価する、
   ｆ） 組織培養培地中、該分泌抗体分子を生成するクローン化トランスホーマントを選択し、かつ生育させる、及び
   ｇ） 該選択及びクローン化トランスホーマントの培養培地から、該分泌抗体分子を収穫する、
   上記（ａ）〜（ｇ）のステップを含むことを特徴とする方法。
5. 特異的に結合する血小板糖タンパク質 GPIIb-IIIa と、血小板との複合体により発現される、リガンド誘導結合部位と免疫反応するモノクローナル抗体を生成する方法であって、
   (a) 該複合体でマウスを免疫化する、
   (b) 該マウスから脾臓を取り出し、ついで脾細胞のサスペンジョンを作る、
   (c) 融合促進剤の存在下、該脾細胞をマウスのミエローマ細胞と融合し、抗体分泌ハイブリドーマを作る、
   (d) 未融合ミエローマ細胞は生存できない培地に希釈し、分離したウェル中で、この融合細胞を培養する、
   (e) ハイブリドーマを含む各ウェル中の上清を、該血小板糖タンパク質 GPIIb-IIIa −血小板の複合体とは免疫反応するが、各々非結合型である、血小板糖タンパク質 GPIIb-IIIaもしくは血小板とは免疫反応しない、分泌抗体分子の存在について評価する、
   (f) 該抗体分子を分泌するハイブリドーマを選択及びクローニングする、そして、
   (g) 該クローンの上清から、抗体分子を収穫する、
   以上(a) 〜(g) のステップを含むことを特徴とする方法。
6. 特異的に結合する、血小板糖タンパク質 GPIIb-IIIa と、血小板との複合体により発現されるリガンド誘導結合部位と免疫反応するモノクローナル抗体を生成する方法であって、
   (a) 該複合体でマウスを免疫化する、
   (b) 該マウスから脾臓を取り出し、ついでこの脾細胞のサスペンジョンを作る、
   (c) 融合促進剤の存在下、該脾細胞をマウスミエローマ細胞と融合して、抗体分泌ハイブリドーマを作る、
   (d) 非融合細胞は生存できない培地で融合細胞を希釈し、分離したウェル中で培養する、
   (e) ハイブリドーマを含む各ウェル中の上清を、該血小板糖タンパク質 GPIIb-IIIa と、該血小板との複合体とは免疫反応するが、各々非結合型の、血小板糖タンパク質 GPIIb-IIIa 又は血小板とは免疫反応しない、分泌抗体分子の存在について評価する、
   (f) 該抗体分子を分泌するハイブリドーマを選択及びクローニングする、
   (g) 該クローンを、マウスの腹腔内に移す、及び
   (h) 望ましい抗体を含む腹水又は血清を、該マウスから収穫する、
   以上の(a) 〜(h) のステップを含むことを特徴とする方法。
7. 特異的に結合する、血小板糖タンパク質 GPIIb-IIIa 及び血小板を含む、血液サンプル中の血小板糖タンパク質 GPIIb-IIIa と、血小板との複合体の存在を検定する方法であって、
   ａ） 血液サンプルを、該複合体とは免疫反応するが、各々非結合型の血小板糖タンパク質 GPIIb-IIIa又は血小板とは免疫反応しない抗体分子を含むモノクローナル抗体組成物と混合することにより、免疫反応混合物を作る、
   ｂ） 該抗体がサンプル中に存在する前記複合体と免疫反応し、かつ免疫反応産物を作るのに十分な時間、この混合物を維持する、
   ｃ） ステップｂ）で生成した免疫反応産物の存在及びそれによる該サンプル中の該複合体の存在を検出する、
   以上ａ）〜ｃ）のステップを含むことを特徴とする方法。

Images