WO1991001380A1 - Anticorps monoclonaux diriges contre des proteines impliquees dans les fonctions plaquettaires, leur application en tant qu'agent diagnostique et therapeutique - Google Patents

Anticorps monoclonaux diriges contre des proteines impliquees dans les fonctions plaquettaires, leur application en tant qu'agent diagnostique et therapeutique Download PDF

Info

Publication number
WO1991001380A1
WO1991001380A1 PCT/FR1990/000565 FR9000565W WO9101380A1 WO 1991001380 A1 WO1991001380 A1 WO 1991001380A1 FR 9000565 W FR9000565 W FR 9000565W WO 9101380 A1 WO9101380 A1 WO 9101380A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibodies
platelet
platelets
monoclonal antibodies
fragments
Prior art date
Application number
PCT/FR1990/000565
Other languages
English (en)
Inventor
John Mac Gregor
Sophie Parmentier
Bruno Catimel
Habib Boukerche
Brigitte Mac Gregor
Lilian Mac Gregor
Original Assignee
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR8910016A external-priority patent/FR2650186B1/fr
Priority claimed from FR8910015A external-priority patent/FR2650185A1/fr
Priority claimed from FR8910992A external-priority patent/FR2650956A2/fr
Application filed by Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale filed Critical Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
Publication of WO1991001380A1 publication Critical patent/WO1991001380A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C07K16/2854—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72 against selectins, e.g. CD62
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2848—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • Monoclonal antibodies directed against proteins involved in platelet functions Their application as a diagnostic and therapeutic agent.
  • the invention relates to monoclonal antibodies directed against proteins involved in platelet functions and their application as a diagnostic and therapeutic agent.
  • the mechanisms of platelet adhesion, aggregation and secretion which enter into the various stages of platelet physiology, involve in vivo numerous proteins and glycoproteins, present at the platelet level, permanently or transiently, or / and present at the level of other cells such as cells
  • antibodies which can be used as platelet activation markers for diagnostic tests have already been described.
  • American patent 4,783,330 relates, for example, to antibodies of the IgG1 type which recognize activated platelets and, on the contrary, do not recognize inactivated platelets, the azurophilic granules of monocytes and granulocytes.
  • these monoclonal antibodies recognize a glycoprotein of molecular weight close to 140,000 Da (gpl40) on activated human platelets.
  • the inventors are now more particularly interested in pathologies linked to platelet physiology and their treatment by controlled means. With this in mind, they have no new antibodies directed against specific epitopes of proteins, glycoproteins or protein complexes involved in platelet physiology. These antibodies were selected for their specific ability to interfere with platelet functions.
  • the invention therefore relates to new antibodies directed against proteins, glycoproteins or protein complexes which are involved specifically in adhesion, aggregation and / or platelet secretion reactions which may lead to the formation of thro bus or even involved in inflammation or scarring process.
  • These antibodies have the advantage quite interesting in the context of 1'invention to • be able to modulate the reactions using the pads, as they have been described above.
  • monoclonal antibodies corresponding to the above definitions are characterized in that they also have the capacity to modulate the interaction between the platelets and the onocytes, when the platelets are at stimulated state, for example when they were stimulated with thrombin.
  • the invention further relates to the preparation and selection of these monoclonal antibodies as well as their use for diagnosis or as a therapeutic agent. They can thus be applied to the treatment of pathologies such as cardiovascular diseases, atherosclerosis, retinopathies, diabetes and also, for some of them, in the treatment of tumor metastases.
  • the invention relates to monoclonal antibodies, or idiotypic fragments of these monoclonal antibodies, recognizing antigens involved, either in at least one of the stages of platelet physiology and in particular in adhesion and / or aggregation and / or platelet secretion reactions, or in adhesion endothelial cells or in both types of actions, characterized in that they have the capacity to modulate the platelet functions or the endothelial functions, induced by a low concentration of agonists, for example in the presence of 2.5 to 5 ⁇ M d • ADP, or 2 ⁇ g / l of collagen, or 0.016 U / ml of thrombin and in that their capacity to inhibit platelet functions is considerably reduced or even absent in the presence of high concentrations of agonists, for example in presence of thrombin concentrations greater than 0.5 U / ml or collagen greater than 10 ⁇ g / ml.
  • the antigens recognized by the monoclonal antibodies under the conditions set out above are the glycoprotein GMP140 or the protein complex la - lia.
  • the idiotypic fragments mentioned above are Fab, Fab 1 , F (ab ') 2 fragments prepared according to conventional methods, in particular by enzymatic digestion, for example with pepsin or papain, depending on the desired result.
  • Monoclonal antibodies thus defined, or their idiotypic fragments have the particularly advantageous property of binding to an epitope of a protein, a glycoprotein or a protein complex, so that the activity normal physiological of this protein, glycoprotein or this complex, is modulated.
  • protein glycoprotein
  • protein complex will sometimes be grouped under the term antigen.
  • the modulation properties of the antibodies according to the invention can vary with the nature of the antibody and the recognized antigen. • In any event, the antibodies of the invention inhibit platelet function more in the presence of high concentrations of thrombin (greater than 0.5 U / ml) or collagen (greater than 10 mcg / ml).
  • the monoclonal antibodies or their idiotypic fragments are characterized in that they recognize an epitope of a protein, a glycoprotein or a protein complex chosen from the group of glycoproteins GMP140, gpIIb-IIIa complex, gpla-lla complex, gplc-lla complex or gplla glycoprotein.
  • the above antigens are involved at different levels of platelet physiology.
  • the GMP140 was described by McEver et al, Cell (vol '56 - 1033.1044, March 24, 1989).
  • the other antigens have been described in various publications such as McEver et al, (1984) J. Biol. Che. 259: 9799-9804; Hsu-Lin, SC et al, (1984) J. Biol. Chem. 259: 9121-9126; KunicJci, TJ et al, (1988) J. Biol. Chem. 263: 4516-4519 and Hemler, ME et al, (1988), J. Biol. Chem. 263, 7660-7665.
  • a category of antibodies or their idiotypic fragments is further characterized in that these antibodies or fragments recognize an epitope having a functional effect with respect to functions normally exercised by the antigen which contains it.
  • certain monoclonal antibodies are sensitive to the chemical reduction of the antigen which they recognize. As a result, they are inactivated when the normally recognized antigen is chemically reduced.
  • the monoclonal antibodies or their idiotypic fragments are characterized in that they recognize an epitope present on GMP140, at a site exposed on the surface of activated platelets, said antibodies or their idiotypic fragments being capable of interfering with aggregation and / or secretion reactions platelet.
  • the epitope recognized by an anti GMP 140 antibody according to the invention is a functional epitope.
  • Particularly preferred antibodies are LYP20 antibodies or antibodies with equivalent immunological and functional properties.
  • the "equivalent immunological and functional properties" will be evaluated by a test aimed at verifying that the recognized antigen is identical to that which is recognized by the comparison antibody ⁇ a ⁇ . the occurrence
  • the antibody LYP20 (also designated by P20) has
  • LYP20 also has the capacity to recognize a GMP 140- "like” antigen present in monocytes, in particular in transformed monocytes U937.
  • the monoclonal antibodies or their idiotypic fragments are characterized in that they recognize an epitope present at the level of the glycoprotein 11a, of the complex Ia-IIa, of the complex Ic-IIa, of glycoprotein GP110-120, said antibodies or their idiotypic fragments having the capacity to interfere with physiological platelet reactions.
  • These antibodies recognize an epitope or a determinant carried by the glycoprotein 11a.
  • these antibodies are the LYP22 antibodies or antibodies having equivalent immunological and functional properties.
  • the monoclonal antibody LYP22 (also designated P22) has the particular advantage of being directed against proteins which function as receptors for collagen on platelets and which are therefore important for the adhesion of platelets to the walls of damaged blood vessels. This antibody also recognizes an epitope located on a sub- beta unit ( ⁇ ) of VLA lymphocytes. In addition, the monoclonal antibody LYP22 recognizes antigens present on endothelial cells, these antigens having the same characteristics as those present on platelets.
  • the antibodies LYP20 and LYP22 have the advantage of inhibiting platelet activity at a level of approximately 60% in the presence of low concentrations of agonists such as for example (2.5-5 ⁇ M ADP, 2 ⁇ g / ml collagen, 0.016 U / ml thrombin). This corresponds to a modulation of the platelet activity insofar as this is not totally inhibited.
  • antibodies which are particularly advantageous for carrying out the invention are monoclonal antibodies in which their idiotypic fragments characterized in that they recognize an epitope of the Ilb-Illa complex on the surface of the stimulated platelets, said antibodies or their idiotypic fragments having the ability to inhibit platelet functions and being devoid of this ability when they are in the presence of high concentrations of agonists as described above.
  • Particularly preferred antibodies are LYP18 antibodies, or antibodies with equivalent immunological and functional properties.
  • These antibodies and in particular the LYP18 antibody have the advantage of detecting both 9 • antigens present on resting platelets and antigens expressed after stimulation of the cells.
  • antibodies of the invention are of particular interest for carrying out the purification of GMP140 and are represented by the antibody LYP21. Such antibodies can for example be useful in the process of obtaining anti-GMP140 antibodies capable of modulating platelet functions.
  • Antibodies belonging to this second category are further characterized by their capacity to recognize an epitope of GMP140 in platelets, after solubilization of these platelets in a detergent or else to recognize the water-soluble part of GMP140 when it is secreted by cells. endothelial.
  • the invention also relates to a mixture of monoclonal antibodies or idiotypic fragments of these antibodies or also a mixture of antibodies and fragments, characterized in that it comprises at least two different antibodies or fragments described above.
  • Particularly preferred mixtures of antibodies and / or fragments of these antibodies are for example mixtures comprising LYP20 and LYP22 or / and their idiotypic fragments. Another preferred mixture is that of LYP20 and LYP18 and / or their idiotypic fragments, or else a mixture of LYP20, LYP22 and LYP18 or their idiotypic fragments. Another particularly mixture is a mixture comprising the antibodies LYP20 and LYP21 and / or their idiotypic fragments.
  • the antibodies defined above, or their idiotypic fragments of the invention are particularly advantageous for their properties of 10- modulation of platelet functions. These antibodies or their idiotypic fragments can in this respect be used as antiplatelet agents in patients presenting risks of disturbances of platelet functions and in particular problems concerning the formation of thromboses. In this regard, the antibodies of the invention and their fragments make it possible not to completely inhibit the platelet functions, which generally entail a risk of dangerous bleeding for the patient treated.
  • the antibodies or their fragments defined in the preceding pages can therefore be used separately or in mixtures in order to target the inhibition of platelet functions as required and / or to obtain levels of inhibition of platelet functions adapted to the situation that one wishes to possibly treat.
  • the invention further relates to monoclonal antibodies or their idiotypic fragments as described above, characterized in that they are labeled, the labeling being preferably carried out with a radioactive substance, in particular a halogenic or metallic radioelement, by example 131 j ⁇ 11 in or "T, OR by a fluorescent substance.
  • a radioactive substance in particular a halogenic or metallic radioelement, by example 131 j ⁇ 11 in or "T, OR by a fluorescent substance.
  • the labeling substance should be chosen according to the desired use of the antibodies, in vitro or in vivo. In the case where these antibodies are used in vivo, the substance chosen must be physiologically acceptable to humans, and suitable for detection by means such as imaging.
  • a determined marker for example a radioelement
  • Chelating agents which can be used are for example polyaminocarboxylic acids, in particular DTPA (diethylene triamine pentaacetic acid), analogs of diethylene triamine pentaacetic acid
  • the epitope recognized by the monoclonal antibodies defined above or also recognized by the idiotypic fragments of these antibodies this epitope being present at the level of an antigen involved in the stages of platelet physiology and in particularly in adhesion and / or aggregation and / or platelet secretion reactions and / or in adhesion reactions of endothelial cells, said antigen being chosen more particularly from the GMP140 proteins, the gplla glycoprotein or the gpIIb- complexes IIIa, gpla-lla, gplc-lla, characterized in that it is a conformational epitope, necessary for activity in the above reactions of the antigen which contains it.
  • a particular epitope of the invention is an epitope sensitive to the reduction of the antigen which contains it.
  • the invention relates more specifically to the distinct epitopes recognized by each of the antibodies LYP20 and LYP22.
  • Another epitope targeted in the context of the invention is an epitope corresponding to the general definitions above characterized: a) in that it is recognized by the Ilb-IIIa complex of human platelets. b) in that it is not recognized by the Ilb-IIIa complex of dog platelets, c) in that it is recognized by the analogue of the Ilb-IIIa complex (Ilb-IIIa like complex), present on endothelial cells.
  • this epitope is 1 • 1 epitope "antibodies LYP18.
  • the epitopes recognized by the different antibodies or idiotypic fragments of these antibodies are further characterized as follows:
  • a first protocol for characterizing them comprises: the proteolytic degradation of the glycoprotein supposed to contain the epitope,
  • the invention also relates to a composition for the diagnosis of platelet activation in a subject likely to present a pathology associated with disorders of platelet physiology in particular for demonstrating thrombopathy, characterized in that it comprises at least two different antibodies or their idiotypic fragments as defined above, preferably antibodies directed against distinct proteins or glycoproteins, in particular a mixture of antibodies chosen from LYP20, LYP22 and LYP18 or their idiotypic fragments. For the purposes of detection, these antibodies or antibody fragments are labeled.
  • compositions for the diagnosis of platelet activation are compositions characterized in that they further comprise monoclonal antibodies or their idiotypic fragments directed against thrombospondin and preferably antibodies of the type LYP9 or / t LYP11.
  • the antibodies LYP9 and LYP11 are antibodies directed against thrombospondin obtained by a method such as that described in the publication of Clezardin et al (Eur J Biochem. 154, 95-102 (1986)).
  • the diagnostic compositions described above can be used to detect in vitro in a biological sample such as blood the presence of platelet antigens, indicative of a state of thrombosis.
  • compositions can also be used in the stages of a detection protocol, with a view to in vivo diagnosis, when the monoclonal antibodies or their fragments have been previously labeled with a substance physiologically acceptable to humans under conditions allowing their detection with adapted devices and in particular thanks to gamma-scintigraphy and NM methods.
  • compositions for diagnosis previously described is to allow a selective diagnosis of the presence of certain particular antigens characteristic of determined stages of platelet physiology.
  • a category of monoclonal antibodies or fragments according to the invention can also be used, in the form of a composition for in vitro diagnosis, for the detection of metastatic melanomas and for differentiating them from benign melanocytes.
  • These monoclonal antibodies are preferably the LYP18 antibodies of the invention or antibodies having similar immunological and functional properties, in particular their capacity to recognize the analogue of the Ilb-IIIa complex (Ilb-IIIa like).
  • the Ilb-IIIa like complex is characterized by an identical molecular weight, in reduced or unreduced form, to that of the platelet glycoprotein Ilb-IIIa.
  • This Ilb-IIIa like complex also has an IIb-3 like fragment (reduced form) like reduced Ilb platelets (11-0 platelet).
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition characterized in that it comprises, as active principle, a monoclonal antibody or its idiotypic fragments or a mixture of antibodies and fragments according to what has been described above or a mixture of these different antibodies and / or idiotypic fragments, in combination with an acceptable pharmaceutical vehicle.
  • such pharmaceutical compositions can be used for the treatment of various pathologies resulting from disorders of platelet physiology or linked to these platelet functions.
  • compositions comprising the antibodies of the invention or their fragments may be the treatment of cardiovascular diseases.
  • compositions are characterized in that the antibody (ies) or their idiotypic fragments, are:
  • the bond between the fragment and this substance is a covalent bond resulting from the implementation of a protocol such as that described by Bode et al (1985) Science 229, 765.
  • Other techniques which can be used are those described by Frantz and Robertson in Infect and Immunity, 3__, 193-198 (1981) or that described in Environment Microbiology (October 1981) vol. 42 n ° 4, 611-614 by PE Kauffmann.
  • the following compounds will advantageously be used as coupling agent: glutaric aldehyde, ethyl chloroformate, water-soluble carbodiimides [N-ethyl-N * (3-dimethylamino-propyl) carbodiimide, HC1], diisocyanates, bis-diazobenzidine, di- and trichloro-s-triazines, cyanogen bromides, benzoquinone, as well as the coupling agents mentioned in Scand. J. I munol. , 1978, vol. 8, p. 7-23 (AVRAMEAS, TERNYNCK, GUESDON).
  • S antibodies and / or their idiotypic fragments coupled or modified by an anticoagulant or thrombolytic substance is administered to the patient in a dose comparable to that which would be used for one of the constituents of the composition taken isolation.
  • the invention further relates to the use of antibodies or their idiotypic fragments taken separately or as a mixture, for the manufacture of a medicament intended for the treatment of pathologies linked to disorders of platelet physiology.
  • the invention also relates to the use of the antibodies according to the invention for modulating, or even inhibiting the interaction between platelets and monocytes.
  • it targets an agent capable of modulating the interactions between type cells.
  • 18 * stimulated monocytes and platelets, characterized in that it comprises at least one monoclonal antibody according to the invention.
  • a particularly advantageous agent is characterized in that it comprises the antibody LYP20.
  • the above pharmaceutical compositions can be used in a different application from the treatment of cardiovascular diseases to block the proliferation of malignant melanoma cells and thus to counter the metastatic invasion of these cells.
  • the invention relates in this regard to pharmaceutical compositions comprising the monoclonal antibody LYP18 or its idiotypic fragments or an antibody having the property of blocking the growth and / or proliferation of malignant melanoma cells, for the treatment for inhibiting growth tumor melanomas in vivo.
  • the invention also relates to the application of LYP18 antibodies or their idiotypic fragments, to inhibit the growth of malignant melanoma cells.
  • the invention also relates to the use for the in vitro diagnosis of malignant melanomas, in particular for differentiating these tumors from other tumors such as lymphomas or carcinomas, from LYP18 antibodies or from their idiotypic fragments or from antibodies having recognition properties of melanomas of the type described for LYP18.
  • the invention relates to a composition for the in vitro diagnosis of melanoma tumor cells, characterized in that it comprises LYP18 antibodies.
  • the invention relates to the application of monoclonal antibodies to the purification of the antigen that they recognize, in particular LYP21 antibodies to the purification of GMP140.
  • the invention also relates to a process for preparing the monoclonal antibodies according to the invention, characterized in that it comprises the following steps: a / fusion of spleen cells of mice with myeloma cells, said mice being previously immunized with the antigen against which one wishes to produce antibodies, the spleen cells being in excess relative to the myeloma cells, in the presence of a fusion promoter, for example PEG, b / culture of hybridomas formed by fusion, c / cloning and subcloning hybridomas producing the antibodies sought, d / production of ascites in mice, e / recovery and purification of said antibodies.
  • a fusion promoter for example PEG
  • b / culture of hybridomas formed by fusion c / cloning and subcloning hybridomas producing the antibodies sought
  • d / production of ascites in mice e / recovery and purification of said antibodies.
  • LYP18 or LYP20 antibodies human blood platelets treated with chymotripsin are used as the antigen.
  • the myeloma cells used for the fusion are for example Sp2 / 0-Agl4 cells.
  • the myeloma cells used for the fusion are advantageously P3 x 63 Ag 8 cells.
  • Other myeloma cells for the fusion are the SP2 / 0.Agl4 cells.
  • GPIIb-IIIa S12 and P20 antigen.
  • Platelet lysates labeled with 125 l were incubated with non-im IgGs (C), P20 with S12 and with an antibody P18 anhti-GPIIb-IIIa. Samples were denatured under non-reducing and reducing conditions (R), placed on a 5-15% SDS-PAGE gradient and autoradiographed. Line A shows the total unreduced labeled lysate.
  • Immunoblotting results of the antigen corresponding to MO The platelet lysates were denatured under non-reducing (NR) and reducing (R) conditions and were placed on a 5-15% SDS-PAGE gradient before transfer to mobilon I bands. The P20 and P21 bands were incubated with P20 and P21 respectively, the C band incubated with non-IgG IgG (c). The Western blot was developed with the secondary antibody conjugated to peroxidase.
  • the washed platelets made it possible to show an increased binding of P20 labeled with 125 I after stimulation with lU / ml of alpha-thrombin.
  • the monoclonal antibody P20 (50 ⁇ g / ml) partially inhibits (60%) the aggregation induced by 2.5 ⁇ M of ADP, a dose of 40 ⁇ g / ml inhibits the aggregation induced by 2 ⁇ g / ml of collagen (63 % inhibition). P20 (90 ⁇ g / ml) also inhibits (50%) the aggregation induced by 0.016 U / ml of thrombin.
  • Figure 6 Attachment of the uonoclonal antibody LYP18 to the megakaryocytes present at the level of a bone marrow biopsy (sections frozen to be cut up and then treated with peroxidase until coloring and stained with methylene blue (x200).
  • Figure 7 Attachment of the uonoclonal antibody LYP18 to the megakaryocytes present at the level of a bone marrow biopsy (sections frozen to be cut up and then treated with peroxidase until coloring and stained with methylene blue (x200).
  • Figure 7 Attachment of the uonoclonal antibody LYP18 to the megakaryocytes present at the level of a bone marrow biopsy (sections frozen to be cut up and then treated with peroxidase until coloring and stained with methylene blue (x200).
  • Platelet membranes solubilized in sodium deoxycholate were applied to a column of wheat germ (WGA) and lectin (Lens Culinaris
  • the WGA column made it possible to link a mixture of antigens including gplb, gplllb (or gpIV) gpllb-llla in addition to a certain number of proteins such as gpl50 / 155 (molecular weight not reduced / reduced) gpl50 / 130, gpl30 / 135, gpl28 / 132 and gpll5 / 120.
  • mAb monoclonal antibody
  • Gpl28 / 132 has been identified as 24 corresponding to GMP140 or PADGEM by a monoclonal antibody LYP21.
  • Gpl50 / 155 and gpl32 / 135 were identified as a GPIa-IIa complex by a LYP22 monoclonal antibody.
  • the LCH column made it possible to bind mainly the GPIlb-IIIa complex, identified by an anti-GPIIb-Illa monoclonal antibody (LYP4).
  • the N-terminal portions of a limited number of these separate glycoproteins were microsequenced using a gas phase sequencer.
  • the combined use of FPLC and gas phase sequencing allows rapid isolation and characterization of platelet glycoproteins.
  • the identification of N-terminal amino acid sequences allows the synthesis of oligonucleotide probes to screen and isolate different • cDNA clones of glycoproteins from databases.
  • Human platelet concentrates were obtained from the Beynost blood transfusion center.
  • the platelet membranes were prepared according to the method described by Cooper et al (1979, Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 1069-11073), using 10 units of human platelet concentrate (50.10 / unit).
  • the sedimented red blood cells were separated from the platelets by centrifugation at 160 g for 25 minutes at 25 "C.
  • the platelets were isolated and washed using the method of Massini et al modified by Me Gregor et al, (respectively 1974, Biochi ica and Phyica Acta 372: 109-121; 1979, Thromb. Res.
  • the wafers treated with ultrasound were centrifuged at 4 ° C for 20 minutes at 9000g in an SS34 fixed angle rotor using a Sorvall RC2B centrifuge (Dupont de Nemours, Newto n, Connecticut, USA). The supernatant was then removed and centrifuged for one hour at 4 ° C at 100,000g in a TST 55.5 variable angle rotor using a Kontron 2060 centrifuge (Kontron, Zurich, Swisse). The membranes in the form of a pellet were resuspended in a buffer containing 10 mM Tris-HCL at pH 8.2, in 5 mM EDTA and 1 ⁇ M of leupeptin.
  • the wheat germ lectin (WGA) linked to Sepharose 6MB (Pharmacia, Uppsala, Sweden) was placed in an HR10 / 10 glass column (100 mm ⁇ 10 mm) (Pharmacia). The column was then connected to a rapid liquid chromatography (FPLC) system (Pharmacia). The column was equilibrated in a starting buffer containing 10 mM Tris-HCl at pH 8.2 with 0.5% DOC, 5 mM EDTA. The membranes of the solubilized platelets were deposited on the column with a flow rate of 0.5 ml / min and the column was washed with a starting buffer until an optical density equal to the basic value was obtained.
  • WGA wheat germ lectin linked to Sepharose 6MB
  • FPLC rapid liquid chromatography
  • glycoproteins linked to the WGA column were eluted with a sugar, N-Acetyl Glucosa ine 2.5% (Sigma, Saint Louis, MO, USA). The elution peaks were dialyzed overnight against 10 mM Tris-HCl at pH 7.4 with 0.1% lubrol PX (Sigma).
  • Anion exchange chromatography The glycoproteins eluted from the lectin column and resuspended in lubrol PX were placed on an anion exchange column MONO Q HR5 / 5 (50 mm x 5 mm) (Pharmacia ).
  • the starting buffer contained 0.1% lubrol PX in 20 nM Tris-HCl at pH 7.4 and the final buffer was co-weighed with 0.1% lubrol PX in Tris-HCl at pH 7.4 containing 1M chloride sodium (Merck). A grandient was established for 25 minutes with a flow rate of 1 ml / min.
  • glycoproteins eluted from the MONO Q column were identified on immunoaffinity columns using the monoclonal antibodies LYP21 (directed against GMP140) and LYP22 (directed against gplla) linked to Sepharose-4B. These antibodies were obtained after immunization of mice with a mixture of glycoproteins isolated by affinity on a WGA column and anion exchange chromatography.
  • the Ilb-IIIa glycoproteins were identified on an immunoaffinity column using the antibody monoclonal LYP4 described by Me Gregor et al (1986, Eur. J. Biochem. 159: 443-440).
  • EXAMPLE 2 Inhibition of platelet aggregation induced by collagen with monoclonal anti-gpla-lla antibodies.
  • gp glycoprotein Ia-lla
  • VLA-2 glycoprotein IIa-lla
  • a LYP22 monclonal antibody was obtained from mice immunized with a mixture of platelet membrane glycoproteins, isolated by affinity chromatography using wheat germ agglutinin coupled to anion exchange chromatography.
  • LYP22 partially inhibits platelet aggregation induced by a low dose of collagen (l ⁇ g / ML) but has no effect on other agonists. However, LYP22 has no effect on the adhesion of platelets to collagen, fibronectin or " fibrinogen in the presence of 2 mM magnesium or calcium.
  • EXAMPLE 3 Inhibition of the platelet functions of human platelets by a LYP20 monoclonal antibody directed against a membrane glycoprotein whose expression depends on activation.
  • a limited number of membrane glycoproteins (Ib, Ilb-IIIa, Ia-IIa, Ic-IIa, Illb) play an important role in platelet aggregation and adhesion.
  • the monoclonal antibodies LYP20 and LYP21 were used.
  • the LYP20 antibodies were obtained after immunization of a BALB / C mouse with a concentrate of washed human blood platelets. treated with chymotrypsin.
  • the LYP21 monoclonal antibodies were obtained with platelet membrane glycoproteins eluted from a wheat germ agglutinin affinity column.
  • LYP20 and LYP21 precipitate a protein of 128 kDa (unreduced) and 132 kDa (reduced) which is called gpl28.
  • the antibodies LYP20 and LYP21 recognize distinct epitopes on gpl28, the antigenic determinant of LYP20 being dependent on the presence of intact disulfide bridges. Washed resting platelets made it possible to bind 2400 ⁇ 270 molecules per antibody LYP20 labeled with iodine 125 and 12,200 ⁇ 1,184 molecules per antibody after activation with 1 U / ml of thrombin.
  • LYP20 and LYP21 are directed against a platelet surface protein (gpl28) whose expression depends on platelet activation and secretion.
  • Gpl28 migrates jointly with the platelet antigen immunoprecipitated by an antibody directed against the glycoprotein GMP140 or PADGEM. This shows that gpl28 is linked to or identical to GMP140 or PADGEM.
  • studies on aggregation with washed human platelets were performed.
  • Adenosyldiphosphate (ADP), aprotinin, fibronectin (FN), lactoperoxidase and leupeptin, lubrol WX, N-acetyl glucosamine, 1 * orthophenyldiamine (OPD), phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF), prostaglandin El (PGE1) and triton X-100 were obtained from Sigma (StLouis, MO, USA). 5 Chromium, 125 Iodine and 14C serotenin were obtained from Amersham International (UK).
  • Horseradish peroxidase conjugated to goat anti-mouse antibodies, gelatin, HRP color development reagent and T een 20 were obtained from BioRad (Richmont, CA, USA).
  • Sodium deoxycholate (DOC), dithiothreitol (DTT), leupeptin and PMSF were obtained from Merck (Darmstadt, RFA).
  • Polyethylene Glycol (PEG) and Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) were obtained from BDH (Poole, UK).
  • Q Sepharose fast flo gel (trademark), Protein A sepharose, wheat germ agglutinin (WGA) and a complete FPLC system were obtained from Pharmacia (Uppsala, Sweden ).
  • Bovine serum albumin (BSA) and rabbit mouse IgG antibodies come from Miles Laboratories (Naperville, IL, USA).
  • the collagen comes from Hormon-Chemie (Munich, FRG).
  • Thrombin was obtained from Hoffman-La Roche (Basel, Switzerland) and alpha-thrombin, fibrinogen (FG) comes from IMCO.
  • Pansorbine is from Calbiochem (La Jolla, CA, USA). All cell culture reagents were obtained from the Flow (Les Ulis, France) and Intermed (Lyon, France) laboratories.
  • 2,4,6,10 teramethylpentadecane (Pristane) comes from Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI, USA).
  • the polyvinylidene difluoride membranes (Immobilon) are from Millipore Corporation (Bedford, MA, USA). D-phenyl-L-propyl- L-arginine chloromethyl ketone (PPACK) come from Calbioche -Behring (Paris, France).
  • Platelet concentrates (Beynost Blood Transfusion Center) were washed using the technique of Massini et al (1974), Biochi biophys. Acta 372, 109-121.
  • the surface proteins were iodinated according to the method described by Philipps et Al. (1977) J. Clin. Invest. 60, 535-545, using lactoperoxidase.
  • the platelets used in the fixation, aggregation and adhesion studies come from the blood (1 volume ACD: 6 volumes of blood) of normal volunteers. The plates were isolated and washed according to the technique of Mustard et Al. (1972) Br. J. Haematol. 22, 193-204 with slight modifications:
  • the platelets washed according to the method of Massini and Al cited above were resuspended at 40 ⁇ 10 9 cells / ml in 0.02 M Tris-HCl at pH 8.6, with 0.005 M EDTA, 1% (w / v) DOC, 17U / ml aprotinin, ImM leupeptin.
  • the solubilization was carried out at 4 ° C. with constant stirring for one hour.
  • the lysate was centrifuged at 100,000 g for one hour at 4 "C.
  • the supernatant was diluted in 5 volumes of 0.02 M Tris-HCl at pH 8.6, ImM EDTA, 0.5% (w / v) DOC (buffer A) and deposited on a 6B-WGA sepharose column
  • the column was pre-equilibrated in buffer A and coupled to a rapid liquid chromatography system (FPLC). The column was washed at 0.4 ml / minute with buffer A until the unbound material is removed. The specifically bound fraction was eluted with 2.5% (w / v) N-acetyl glucosamine.
  • the collected fraction was dialyzed for one overnight against a mixture of 0.02 M Tris-HCl at pH 7.4, with 0.005 M EDTA and 0.1% Lubrol PX at 4 "C.
  • the dialysis sample was subjected to anion exchange chromathography using a fast flow Q column, connected to the FPLC system and pre-equilibrated in 0.02 M Tris-HCl at pH 7.4 containing 0.1 % (w / v) of lubrol WX (buffer B).
  • the sample was applied to the column at a flow rate of 2 ml per minute and the different fractions were eluted using an NaCl gradient (0 to 1 M) in buffer B.
  • Each fraction was collected, concentrated and analyzed by SDS-PAGE using the technique
  • plastic wells were covered with 100 ⁇ l of antigen (mixture of 4 glycoproteins) diluted to 2 ⁇ g / ml in a bicarbonate buffer (25 mM Na 2 C ⁇ 3 , 25 mM NaHCC- * j, pH 9.6) left for 3 hours at 37 ° C.
  • the wells were washed and saturated with 0.5% BSA in Tris buffer (15mM Tris-HCl, pH 7.4, 2mM CaCl 2 , 0.05% (w / v) Tween) for 30 minutes at room temperature .
  • Mouse serum or hybridoma supernatants (100 ⁇ l) were incubated in the wells for 1 hour at 37 ° C. After 3 washes in Tris buffer, a goat anti-mouse antibody (secondary antibody, diluted to 1/3000) conjugated with peroxidase was added to each well and subjected to reaction for 30 minutes at 37 ° C. The wells were then washed again and filled with a solution of 100 ⁇ l of substrate (4 g OPD in 10 ml of 0.1M citrate buffer, at pH 5, with 0.7 ⁇ l of 30% H 2 O 2 ). The reaction was stopped with lOO ⁇ l of 4NH 2 S0 4 , 4N. The optical density was measured with a plate reader.
  • the immunized mice were boosted with 100 ⁇ g of mixture of antigens.
  • the spleen cells were fused 4 days later according to the method of Kohler and Milstein (1975) Nature 256, 177-181, with myeloma cells P3X63Ag8 in a ratio of 10: 1, in the presence of PEG.
  • the hybridomas were divided, 24 hours later, on 24-well plates, in hypoxanthine / aminopterin / thymidine (HAT) medium with macrophages of the peritoneum of non-immune mice of the same strain as the immunized mice, as feeder cells.
  • HAT hypoxanthine / aminopterin / thymidine
  • the F (ab ') 2 fragments of a monoclonal antibody were prepared according to the technique described Lamoyi et al (1986) Methin Enzym, vol 121, p 652-663, Acad. Press INC. c.2) Preparation of the LYP20 antibody
  • the monoclonal antibody LYP20a was obtained after immunization of BALB / C mice with platelets of human blood treated with chymotrypsin and washed.
  • the treatment with chymotrypsin (0.2 mg / ml / 10 9 platelets) was carried out for 30 minutes at 37 "C. The platelets were then washed. The platelets treated with chymotrypsin (1 x 10 8 platelets / 100 ml ) were mixed with an equal volume (100 ml) of complete adjuvant and injected intraperitoneally into BALB / C mice. The mice were immunized 3 times in 3 weeks with the platelets thus treated. Then these mice were left to rest for one month before overflowing a booster with the platelets treated with chymotrypsin.
  • the platelets were activated (lU / ml of trombin for 10 minutes, followed by 10 ' - PPACK for 10 minutes) before iodization, dissolved in 0.01M Tris-HCl, 0.15M ⁇ 'aCl, ImM EDTA, containing 1% lubrol PX (ta on S) and microcentrifuged.
  • the labeled supernatants were incubated with either the hybridoma supernatant, the ascites fluid or the purified antibody for 2 hours at room temperature, with shaking. constant. 10 ⁇ l of purified anti-rabbit mouse antibody, diluted in a ratio 1/10 in buffer S were added to each sample and placed on a rocking shaker at room temperature for 30 minutes.
  • Protein A sepharose (10% in buffer S) was incubated (1 volume of lysate for 2 volumes of protein A) with each sample, on a balance shaker for 30 minutes at room temperature. Centrifugation was then carried out at 9,000 g for 2 minutes in an Eppendorf centrifuge. Each centrifugation pellet was washed 4 times in buffer S. After the last washing, each pellet was resuspended in 0.4 ml of Laemmli buffer fl970) Nature 227, 680-685, then heated at 100 "C for 5 minutes An aliquot of each sample was reduced in the presence of 0.04M DTT, all samples were then microcentrifuged and the supernatant was stored at -70 ° C.
  • Two-dimensional SDS-PAGE (not reduced / reduced) was carried out according to the method of Phillips et Al. (1977) J.
  • Immobilon gels and membranes were equilibrated in 0.025M Tris, 0.192M glycine, at pH 8.3, for 30 minutes before performing a western blot.
  • the proteins were transferred by electrophoresis according to the method of Towbin (1979) Proc. Acad. Sci.
  • the substrate was prepared quickly using
  • the tubes were centrifuged in an Eppendorf microcentrifuge for 6 minutes. The ends of the centrifuge tubes were cut and the amount of antibody labeled with iodine 125 (I 125 ) attached was determined with a gamma counter. Nonspecific binding was achieved by the addition of 100-fold unlabeled antibodies. The number of binding sites and the dissociation constant (CD) were determined by Scatchard analysis.
  • the platelets adjusted to the height of 5 ⁇ 10 8 cells / ml were preincubated with either monoclonal antibody P20 or monoclonal antibody P21 (10 ⁇ g / ml) at 37 ° C. for one hour.
  • the suspension of preincubated platelets (100 ⁇ l) was added to each well and reacted at 37 "C for one hour. hour. All wells were washed thoroughly in a Tyrode solution to remove the unhooked platelets. The wells were then separated and subjected to individual counting on a gamma counter.
  • Extracts of platelets obtained after treatment with a detergent were dissolved in 1% DOC and subjected to affinity chromatography (WGA) in the presence of 0.5% DOC at pH 8.6.
  • WGA affinity chromatography
  • No glycoprotein of the GPIIb-IIIa complex was present in the eluted fraction as shown by the SDS-PAGE and ELISA analyzes.
  • this fraction was applied to a fast-flow anion exchange column Q and eluted in NaCl.
  • the first peak contains four proteins as shown by the result of SDS-PAGE.
  • the molecular weights were respectively 85, 120, 130 and 150 kD under non-reducing conditions and 85, 125, 140 and 155 after reduction.
  • GPIb glycoprotein was present in this fraction as shown by the detection after silver staining of the gel. However, GPIb was present in peak # 3. The first fraction was selected to immunize the mice to produce monoclonal antibodies specific for the four platelet membrane antigens.
  • the platelet lysates marked immunoprecipitated by P20 and P21 were compared in the SDS-PAGE method, with those immunoprecipitated by the antibody S12 directed against GMP-140 and described by McEver in the publication already cited. Another comparison was made with respect to the monoclonal antibody specific for the GPIIb-IIIa complex. Autoradiograms (Fig. 3) clearly show that the antigen recognized by P20 is neither GPIIb nor GPIIIa. The apparent molecular weight of this antigen has been estimated to be approximately 130 kD (unreduced) and 140 kD (reduced). The antigen recognized by P20 migrates at the same time as the antigen immunoprecipitated by an antibody S12 of McEver which does not show any reaction of modulation of platelet functions. The same results were obtained with P21.
  • the P21-labeled antibody recognized neither resting nor stimulated platelets.
  • P20 partially inhibits ADP-induced aggregation (60%), collagen (63%) and thrombin (50%) compared to control. Fab fragments of P20 allow the same results to be obtained (FIG. 8). P20 also allows the reduction of platelet secretion induced by collagen and thrombin. P21 has no effect on platelet aggregation.
  • Monoclonal antibodies against GMP-140 of the solubilized platelets were produced. These P20 and P21 antibodies tested by immunoprecipitation have shown that they have specificity for the platelet membrane antigen also recognized by the S12 antibody of McEver. However, unlike the antibody S12, P20 and P21 are directed against a conformational epitope of GMP-140. In addition, P20 is active on platelet functions. Another characteristic of these antibodies is that they recognize denatured GMP-140 as shown by the positive Western blot results. P20 recognizes only unreduced GMP-140 while P21 remains active against reduced GMP-140. These results suggest that the P20 binding site contains disulfide bridges. In contrast, the P21 binding site probably does not contain disulfide bridges. It can be concluded at this stage that P20 and P21 are specific for different epitopes on the platelet GMP-140.
  • the washed resting platelets made it possible to fix approximately 2000 molecules of P20 antibody labeled with iodine. After activation of the platelets with alpha-thrombin, the platelets had attached approximately 12,000 molecules of labeled P20 antibodies. Activation to ADP did not increase binding of P20 antibodies. The platelets were probably slightly activated during the washing steps although PGE- * and PPACK were added at the level of the first washing.
  • P21 antibodies do not cling to resting platelets or to platelets stimulated with thrombin.
  • Control experiments on samples of P21 were carried out in order to verify the reactivity of P21 with respect to GMP-140 solubilized. These results have been positive.
  • P21 does not cling to whole platelets, whether they are activated or not, the epitope recognized by P21 not being accessible on the 3 native membrane of GMP-140.
  • the P21 binding site could be expressed either on the cytoplasmic side of GMP-140, this sequence remaining cytoplastic after activation and expression of alpha-granules at the membrane level.
  • P20 partially inhibits platelet aggregation and secretion.
  • S12 is known for its lack of effect at the aggregation level
  • GMP-140 inside the alpha-granule membrane. After activation with thrombin or collagen the membrane of alpha-granules fuses with the plasma membrane of platelets and GMP-140 becomes a surface receptor. In addition, secretion
  • Tumor biopsies include 21 cases of malignant melanoma with metastases to the lymph nodes, 20 cases of lymphomas not belonging to the Hodgkin lymphoma category (1 small lyphocytic ly, 5 divided follicular lymphomas.
  • 3 mixed follicular lymphomas 3 diffuse lymphomas, 2 diffuse large cell lymphomas, 1 immunoblastic large cell lymphomas, 3 small undivided lymphomas and 2 lymphoblastics), 4 cases of Hodgkin's disease, 2 cases of thymone, 28 cases of carcinomas including 19 cases of primary carcinomas (breast 6, ovary 4, oropharynx 3, lung 2, colon 2, stomach l, thyroid 1), 9 cases of metastatic carcinomas in the lymph nodes (3 adenocarcinomas, 3 squamous, 3 poorly differentiated), 7 neuroendocrine tumors (4 carcinomas lung, 2 pancreatic islet tumors and one thyroid medullary carcinoma), 1 case ovarian dysgerminoma, 10 cases of sarcomas (5 osteosarcomas, 3 Ewing sarcomas) t 2 malignant fibrous histiocytomas) and 3 cases of neuroblastomas.
  • LYP2 and LYP18 were selected to carry out the experiments below.
  • LYP18 (IgG 2a ) do not cross during cross immunoelectrophoresis with EDTA-separated Ilb or Illa platelet glycoproteins but recognize a determinant present on the intact calcium-mediated glycoprotein complex (McGregor et al, Eur J Biochem 1986, 159: 443-449).
  • LYP2 and LYP18 were purified from ascites fluid on a protein A-Sepharose 4B column as described in the previously cited reference McGregor et al, at concentrations ranging from 1.0 to 1.5 g / ml and using a dilution of 1: 200.
  • the monoclonal antibody directed against a platelet glycoprotein Illa (IgG.,) was obtained from Dakopatts (Santa Barbara, CA) in the form of a culture supernatant and then used at a dilution of 1:50.
  • the purified monoclonal antibody Leu 9 (CD7) (IgG 2a ) served as a control antibody at a dilution of 1: 200 and was obtained from Becton-Dickinson (Mountain View, CA).
  • LYP18 strongly colors megakaryocytes in bone marrow, platelets, as well as the capillaries covering endothelial cells, venules and arterioles present in normal tissues.
  • the monoclonal antibody LYP18 also exhibits a strong staining reaction with the glomerular epithelium of the endometrial glands and weakly stains the smooth muscle cells.
  • LYP18 a large number of normal tissues from different organs were not stained with the monoclonal antibody LYP18 (Table 1).
  • the LYP2 monoclonal antibodies stained the megakaryocytes and platelets with the same intensity as LYP18 but they did not show binding with other normal tissues.
  • the antibody monoclonal control Dako directed against gpllla strongly colors megakaryocytes, platelets, 1 • glomerular epithelium and endometrial glands but weakly colors endothelial cells and smooth muscle cells. Among normal cells of a given type, no significant variation in the intensity of the number of cells stained by these 3 monoclonal antibodies is observed.
  • LYP18 monoclonal antibodies produce variable staining in melanomas. With the exception of a single case of very weak staining, no cell-to-cell variation in staining intensity was noted for each particular case. LYP18 has a weak and diffuse cytoplasmic image with enhanced staining at the peripheral membrane. The staining intensities and the percentage of melanomas bound with the Dako anti-gpllla antibody is identical to the staining obtained with LYP18.
  • LYP2 does not cling to metastatic malignant melanoma.
  • the normal melanocytes present in the skin, lentigines, dermatofibrorins, and activated melanocytes forming a nevi which include melanocytes of the junctional compound, dermal, displastic and congenital types do not allow the attachment of the LYP18 antibodies.
  • LYP2 or Dako anti-gpllla (table 2).
  • LYP18 Among the 75 non-melanocytic tumors, only 3 (4%) caused staining for LYP18 (see table 3): carcinoma of the metastatic thyroid papillae, primary endometrial adenocarcinoma of the ovaries, very weak positive, and weak positive osteosarcoma. 96% (72 out of 75) did not show a LYP18 snag. Dako anti-gpllla antibodies clung to different tumors in the same way as LYP18. LYP2 is not linked to the different tumors studied.
  • Ilb-IIIa-like glycoproteins still designated by cytoadhesins on cells of malignant melanomas but not on cells of benign melanocytes, can be interpreted as the aberrant expression of antigen taking place during the process of transition to the state clever.
  • the cytoadhesins present on melanomas can give malignant cells properties which can facilitate metastatic invasion and can also explain their interaction with the adhesive proteins of the extracellular matrix and with other blood cells. It is not clear why a quarter was not recognized by LYP18. It is possible that tumor cells did not synthesize these glycoproteins or that antigens were expressed but at an undetectable level.
  • the expression of Ilb-IIIa-like glycoproteins is not an essential factor for the establishment of metastases in malignant melanomas.
  • various neoplasms not belonging to the melanoma type only 4% had a link with LYP18.
  • the reactivity of LYP18 with 3 out of 75 malignant non-elanocytic neoplasms could be due to the synthesis of Ilb-IIIa-like antigens by these tumors.
  • Another hypothesis may be that this same epitope is present on a different molecule or that a non-specific staining has taken place.
  • the lack of reactivity of LYP18 with a large majority of the non-melanocytic tumors studied suggests that the aberrant expression of the Ilb-IIIa-like glycoproteins is not universal among malignant cells, including those which have metastatic sites.
  • MCHD Hodgkin's disease
  • the M3Dau cell lines were obtained from an acromic metastasis of the skin of a patient with malignant melanomas and the studies immunofluorescence tests were performed as previously reported.
  • Melting melanoma cells have been surface labeled with 125 I or have been metabolically labeled with 35 S methionine for 24 hours.
  • the melanoma cell lysates extracted with the newt X100 were immunoprecipitated with LYP18 or with a non-immune mouse IgG, then
  • LYP18 does not bind to gpllb or gpIII of platelets separated by EDTA, according to a cross immunoelectrophoresis result, but binds to a determinant present on the intact gpIIb-IIIa complex, produced by calcium.
  • the LYP18 antibody exhibits a binding capacity on M3Dau melanoma cells. From lysates of melanoma cells labeled on the surface with 125 I, LYP18 immunoprecipitated two proteins having the same apparent molecular weight as the glycoprotein gpllb and the glycoprotein gpllla of platelet membranes with characteristic changes in mobility during reduction. Metabolic labeling studies have confirmed that gpIIb-IIIa-like is synthesized by these cells. These results clearly demonstrate that the M3Dau line synthesizes and expresses proteins on its surface, proteins which are immunologically linked to the gpIIb-IIIa glycoproteins of platelets.
  • gpIIb-IIIa-like molecules expressed on the surface of melanoma cells binding studies of LYP18 labeled with 125 I were carried out.
  • the binding of LYP18 to M3Dau melanoma cells was specific, dependent on the concentration and was saturable with approximately 337,000 ⁇ 61,200 molecules per cell (mean ⁇ standard deviation) and a dissociation constant (kd) of 6.8nmol / l.
  • the M3Dau melanoma cells grow after subcutaneous injection in nude mice and produce tumor masses at the implantation sites. They were used as a model to study the local invasion of tumor cells through the basement membrane
  • gpIIb-IIIa-like in M3Dau cells was studied by incubating melanoma cells with a saturating amount of LYP18 (7 ⁇ g / 10 6 cells in 200 ⁇ l aliquots), by injecting the mixture cutaneous to nude mice and following tumor growth in vivo. Controls were made with both antibodies described above G7 A 5 and 2 IgG non-immune mouse isotype that LYP18 at the same concentration as • LYP18. The growth of M3Dau tumors in control mice is palpable after 20 days and measurable after 26 days.
  • LYP18 Studies of the possibility for LYP18 to have a direct cytotoxic effect on melanoma cells was carried out by preincubating these cells with an excess of LYP18 (70 ⁇ g / ml) and by monitoring the viability of the cells and their growth. No loss of cell viability of melanomas was detected with exclusion by trypan blue. In addition, cells treated with the control antibody and with LYP18 show a similar degree of 3 H thymidine retention and cell growth in vitro. Post-transplant studies have determined whether LYP18 inhibits tumor growth when injected after implantation of the tumor. LYP18 injected two days after the tumor cell transplant shows an inhibitory effect of 50% of tumor growth. However, the injection of LYP18 on day 14 or 21 does not show any significant reduction in tumor growth compared to the result obtained with the control (FIG. 9).
  • the growth of tumor cells represents a complete interaction between tumor cells and their stromal matrix.
  • the stroma of a tumor is made up of fibrin, fibronectin, laminin, collagen and other related tissues, in addition to blood vessels and inflammatory cells.
  • the monoclonal antibody LYP18 clinging to gpllb- Illa-like could block critical interactions between melanoma cells and cells of the stroma matrix, necessary for the survival and growth of M3Dau lines and this fixation could favor the access of macrophages and their activation leading to rapid destruction of melanomas in vivo.
  • Studies after transplantation indicate that LYP18 is most effective when injected at the time of tumor implantation, suggesting that LYP18 interferes with one or more early stages of tumor establishment.
  • Immunocytochemical studies performed on frozen tissue biopsies using LYP18 show the presence of gpIIb-IIIa-like on metastatic malignant melanomas but not on benign human melanocytes.
  • transformed monocytes U937 were incubated for 30 minutes with platelets shemated with thrombin (0.03 U / ml).
  • the result obtained shows under microscopy that LYP20 inhibits rosette formation by around 50%. LYP20 therefore inhibits the platelet-monocyte interaction by approximately 50%.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

L'invention concerne des anticorps monoclonaux, ou les fragments idiotypiques de ces anticorps monoclonaux, reconnaissant des antigènes impliqués dans les étapes de la physiologie plaquettaire et en particulier dans les réactions d'adhésion et/ou d'agrégation et/ou de sécrétion plaquettaire, et/ou d'adhésion des cellules endothéliales caractérisés en ce qu'ils ont la capacité de moduler les fonctions plaquettaires ou les fonctions endothiliales induites par une faible concentration d'aganistes, par exemple en présence de 2,5 à 5νM d'ADP, 2νg/ml de collagène, 0,016 U/ml de thrombine et en ce que leur capacité d'inhibition sur les fonctions plaquettaires est considérablement réduite, voire absente, en présence de concentrations élevées d'agonistes, par exemple en présence de concentrations en thrombine supérieure à 0,5 U/ml ou en collagène supérieur à 10νg/ml. Elle concerne aussi l'application diagnostique et thérapeutique de ces anticorps.

Description

Anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines impliquées dans les fonctions plaquettaires. Leur application en tant qu'agent diagnostique et thérapeutique.
L'invention concerne des anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines impliquées dans les fonctions plaquettaires et leur application en tant qu'agent diagnostique et thérapeutique. Les mécanismes de l'adhésion, de l'agrégation et de la sécrétion plaquettaires qui entrent dans les différentes étapes de la physiologie plaquettaire, font intervenir in vivo de nombreuses protéines et glycoprotéines, présentes au niveau des plaquettes, de façon permanente ou transitoire, ou/et présentes au niveau d'autres cellules telles que des cellules
' endotheliales. Certaines de ces protéines ou glycoprotéines ont été identifiées et des anticorps, notamment des anticorps monoclonaux les reconnaissant, ont été préparés.
En particulier, des anticorps utilisables en tant que marqueurs d'activation plaquettaire pour des tests de diagnostic ont déjà été décrits. Le brevet américain 4 783 330 concerne par exemple des anticorps du type IgGl qui reconnaissent des plaquettes activées et au contraire ne reconnaissent pas les plaquettes inactivées, les granules azurophiles des monocytes et des granulocytes. De préférence, ces anticorps monoclonaux reconnaissent une glycoprotéine de poids moléculaire voisin de 140 000 Da (gpl40) sur des plaquettes humaines activées.
Les inventeurs se sont maintenant plus particulièrement intéressés aux pathologies liées à la physiologie plaquettaire et à leur traitement par des moyens contrôlés. Dans cette optique, ils ont mis au point de nouveaux anticorps dirigés contre des épitopes particuliers de protéines, glycoprotéines ou complexes protéiques impliqués dans la physiologie plaquettaire. Ces anticorps ont été sélectionnés pour leur capacité spécifique d'interférence avec les fonctions plaquettaires.
L'invention concerne donc de nouveaux anticorps dirigés contre des protéines, des glycoprotéines ou des complexes protéiques intervenant spécifiquement dans les réactions d'adhésion, d'aqrégation et/ou de sécrétion plaquettaire pouvant conduire à la formation de thro bus ou encore impliquées dans les processus l'inflammation ou de cicatrisation. Ces anticorps présentent l'avantage tout à fait intéressant dans le cadre de 1'invention d•être capables de moduler les réactions mettant en oeuvre les plaquettes, telles qu'elles ont été décrites ci-dessus.
Selon un aspect particulier de l'invention, des anticorps monoclonaux répondant aux définitions ci- dessus, sont caractérisés en ce qu'ils présentent en outre la capacité de moduler 1'interaction entre les plaquettes et les onocytes, lorsque les plaquettes sont à l'état stimulé, par exemple lorsqu'elles ont été stimulées avec de la thrombine.
L'invention concerne en outre, la préparation et la sélection de ces anticorps monoclonaux ainsi que leur utilisation pour le diagnostic ou comme agent thérapeutique. Ils peuvent ainsi être appliqués au traitement de pathologies telles que les maladies cardiovasculaires, 1'athérosclérose, les rétinopathies, le diabète et également, pour certains d'entre eux, dans le traitement des métastases tumorales.
Dans le cadre des définitions ci-dessus, l'invention concerne des anticorps monoclonaux, ou les fragments idiotypiques de ces anticorps monoclonaux, reconnaissant des antigènes impliqués, soit dans au moins une des étapes de la physiologie plaquettaire et en particulier dans les réactions d'adhésion et/ou d'agrégation et/ou de sécrétion plaquettaire, soit dans l'adhésion des cellules endotheliales ou encore dans les deux types d'actions, caractérisés en ce qu'ils ont la capacité de moduler les fonctions plaquettaires ou les fonctions endotheliales, induites par une faible concentration d'agonistes, par exemple en présence de 2,5 à 5 μM d•ADP, ou 2 μg/ l de collagene, ou 0,016 U/ml de thrombine et en ce que leur capacité d'inhibition des fonctions plaquettaires est considérablement réduite voir absente en présence de concentrations élevées d'agonistes, par exemple en présence de concentrations en thrombine supérieure à 0,5 U/ml ou en collagene supérieure à 10 μg/ml.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les antigènes reconnus par les anticorps monoclonaux dans les conditions énoncées ci-dessus, sont la glycoprotéine GMP140 ou le complexe des protéines la - lia.
Les fragments idiotypiques dont il est question ci-dessus sont des fragments Fab, Fab1, F(ab')2 préparés selon les méthodes classiques, notamment par digestion enzymatique par exemple avec la pepsine ou la papaïne, selon le résultat recherché.
Ces fragments idiotypiques sont encore caractérisés en ce qu'ils sont dépourvus de tout ou partie de leur fraction constante Fc.
Des anticorps monoclonaux ainsi définis, ou leurs fragments idiotypiques présentent la propriété particulièrement intéressante de se fixer sur un épitope d'une protéine, d'une glycoprotéine ou d'un complexe protéique, de telle sorte que l'activité physiologique normale de cette protéine, glycoprotéine ou de ce complexe, est modulée.
Dans la suite les termes de protéine, glycoprotéine, complexe protéique seront parfois regroupés sous le terme antigène.
Cette modulation de l'activité physiologique normale au niveau plaquettaire ou au niveau des cellules endotheliales ou pour certains anticorps de l'invention, de l'interaction plaquettes/ onocythes dont question ci-dessus correspond, dans le cadre des définitions de l'invention, à une inhibition partielle de certaines fonctions telles que les réactions d'adhésion, d'agrégation ou de sécrétion ou de plusieurs de ces réactions, qui ont lieu à la suite de stimulation provenant par exemple de lésions au niveau de 1'endothélium vasculaire ou encore à une inhibition de réactions au niveau des cellules endotheliales. Cette limitation doit être telle que i•action des anticorps choisis ou de leurs fragments, éventuellement en combinaison avec d'autres substances, prévient la formation d'un thrombus.
Les propriétés de modulation des anticorps selon l'invention peuvent varier avec la nature de l'anticorps et l'antigène reconnu. En • tout état de cause, les anticorps de l'invention n'inhibent plus les fonctions plaquettaires en présence de fortes concentrations de thrombine (supérieure à 0,5 U/ml) ou de collagene (supérieure à 10 μg/ml) .
Il en résulte que ces anticorps peuvent être utilisés dans le traitement de pathologies telles que celles citées précédemment, sans présenter le désavantage de bloquer de manière excessive les processus physiologiques plaquettaires, ce qui risquerait d'entrainer des phénomènes hémorragiques. Selon un aspect préféré de l'invention, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques sont caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope d'une protéine, d'une glycoprotéine ou d'un complexe protéique choisi(e) parmi le groupe des glycoprotéine GMP140, complexe gpIIb-IIIa, complexe gpla-lla, complexe gplc-lla ou glycoprotéine gplla.
Les antigènes ci-dessus, interviennent à différents niveaux de la physiologie plaquettaire.
La GMP140 a été décrite par McEver et al dans Cell (vol' 56 - 1033.1044, 24 Mars 1989). Les autres antigènes ont été décrits dans différentes publications telles que McEver et al, (1984) J. Biol. Che . 259: 9799-9804; Hsu-Lin, S.C. et al, (1984) J. Biol. Chem. 259: 9121-9126; KunicJci, T.J. et al, (1988) J. Biol. Chem. 263: 4516-4519 et Hemler, M.E. et al, (1988), J. Biol. Chem. 263, 7660-7665.
Selon un autre aspect préféré de 1*invention une catégorie d'anticorps ou leurs fragments idiotypiques est encore caractérisée en ce que ces anticorps ou fragments reconnaissent un épitope ayant un effet fonctionnel vis à vis des fonctions normalement exercées par l'antigène qui le contient.
Selon un autre aspect préféré de l'invention, certains anticorps monoclonaux sont sensibles à la réduction chimique de l'antigène qu'ils reconnaissent. En conséquence, ils sont inactivés lorsque l'antigène normalement reconnu est réduit chimiquement.
L'effet fonctionnel de l'épitope vis à vis de l'antigène qui le contient indique que cet antigène ne peut exercer ses fonctions dans la physiologie plaquettaire si l'épitope n'est pas présent ou s'il est inactivé.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques sont caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope présent sur la GMP140, en un site exposé à la surface des plaquettes activées, iesdits anticorps ou leurs fragments idiotypiques étant capables d'interférer avec les réactions d'agrégation et/ou de sécrétion plaquettaire.
De préférence, l'épitope reconnu par un anticorps anti GMP 140 selon l'invention est un épitope fonctionnel. 0 Des anticorps particulièrement préférés sont les anticorps LYP20 ou des anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes.
D'une façon générale, pour les anticorps
1D i-ionoclonaux selon l'invention, on évaluera les "propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes" par un test visant à vérifier que I'antigène reconnu est identique à celui qui est reconnu par l'anticorps de comparaison <a~~. l'occurence
~~Ό LYP20) et un test déterminant la capacité des anticorps isolés, à moduler les fonctions plaquettaires dans les conditions (concentrations en agonistes) qui ont été définies précédemment.
L'anticorps LYP20 (encore désigné par P20) a
25 également la capacité de reconnaître la GMP140 présente à la surface des cellules endotheliales. De plus cet anticorps ne reconnaît plus la GMP140 lorsqu'elle est sous forme chimiquement réduite, c'est à dire lorsque son poids moléculaire passe de 128 kDa
30 à 130 kDa.
Des anticorps particuliers selon l'invention, qui ont la propriété de reconnaître un épitope présent sur la glycoprotéine GMP140, ont également de façon tout à fait avantageuse, la capacité de reconnaître des
35 glycoprotéines du type GMP140 "like", présentes sur des cellules différentes des plaquettes, par exemple des monocytes. De façon avantageuse, LYP20 a également la capacité de reconnaître un antigène GMP 140-"like" présent au niveau des monocytes, en particulier au niveau de monocytes transformés U937.
Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques sont caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope présent au niveau de la glycoprotéine lia, du complexe Ia-IIa, du complexe Ic-IIa, de la glycoprotéine GP110-120, lesdits anticorps ou leurs fragments idiotypiques ayant la capacité d'interférer avec les réactions physiologiques plaquettaires.
Ces anticorps reconnaissent un épitope ou un déterminant porté par la glycoprotéine lia.
En conséquence ils reconnaissent les complexes protéiques mettant en oeuvre la glycoprotéine lia ou ses produits de transformation ou de dégradation.
D'une façon particulièrement préférée, ces anticorps sont les anticorps LYP22 ou des anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes.
Des tests anologues à ceux décrits ci-dessus sont utilisés pour sélectionner les anticorps ayant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes en prenant pour base de comparaison, LYP22.
L'anticorps monoclonal LYP22 (encore désigné par P22) présente l'avantage particulier d'être dirigé contre des protéines fonctionnant comme récepteurs du collagene sur les plaquettes et qui sont donc importantes pour l'adhésion des plaquettes aux parois des vaissaux sanguins endommagés. Cet anticorps reconnaît également un épitope localisé sur une sous- unité beta (β) des lymphocytes VLA. De plus l'anticorps monoclonal LYP22 reconnaît des antigènes présents sur des cellules endotheliales, ces antigènes ayant les mêmes caractéristiques que ceux présents sur les plaquettes.
Les anticorps LYP20 et LYP22 présentent l'avantage d'inhiber l'activité plaquettaire à un niveau d'environ 60% en présence de faibles concentrations d'agonistes telles que par exemple (2,5-5μM d'ADP, 2 μg/ml de collagene, 0,016 U/ml thrombine) . Ceci correspond à une modulation de l'activité plaquettaire dans la mesure où celle-ci n'est pas totalement inhibée.
D'autres anticorps particulièrement intéressants pour la réalisation de l'invention, sont des anticorps monoclonaux où leurs fragments idiotypiques caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope du complexe Ilb-Illa à la surface des plaquettes stimulées, lesdits anticorps ou leurs fragments idiotypiques ayant la capacité d'inhiber les fonctions plaquettaires et étant dépourvus de cette capacité lorsqu'ils sont en présence de fortes concentrations d'agonistes telles que décrites ci-dessus.
Des anticorps particulièrement préférés sont les anticorps LYP18, ou des anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes.
Des tests analogues à ceux décrits ci-dessus sont utilisés pour sélectionner les anticorps ayant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes, en prenant pour base de comparaison, LYP18.
Ces anticorps et notamment 1'anticorps LYP18 présentent l'avantage de détecter à la fois des 9 • antigènes présents sur des plaquettes au repos et des antigènes exprimés après stimulation des cellules.
D'autres anticorps de 1'invention sont intéressants notamment pour réaliser la purification de la GMP140 et sont représentés par l'anticorps LYP21. De tels anticorps peuvent par exemple être utiles dans le processus d'obtention des anticorps anti-GMP140 capables de moduler les fonctions plaquettaires.
Les anticorps appartenant à cette deuxième catégorie sont encore caractérisés par leur capacité à reconnaître un- épitope de la GMP140 des plaquettes, après solubilisation de ces plaquettes dans un détergent ou encore à reconnaître la partie hydrosoluble de la GMP140 lorsqu'elle est sécrétée par les cellules endotheliales.
L'invention concerne également un mélange d'anticorps monoclonaux ou de fragments idiotypiques de ces anticorps ou encore un mélange d'anticorps et de fragments, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux anticorps ou fragments différents décrits précédemment.
Des mélanges particulièrement préférés d'anticorps et/ou de fragments de ces anticorps sont par exemple des mélanges comprenant LYP20 et LYP22 ou/et leurs fragments idiotypiques. Un autre mélange préféré est celui de LYP20 et LYP18 et/ou leurs fragments idiotypiques, ou encore un mélange de LYP20, LYP22 et LYP18 ou de leurs fragments idiotypiques. Un autre mélange particulièrement est un mélange comprenant les anticorps LYP20 et LYP21 et/ou leurs fragments idiotypiques.
Les anticorps définis ci-dessus, ou leurs fragment idiotypiques de 1'invention sont particulièrement intéressants pour leurs propriétés de 10- modulation des fonctions plaquettaires. Ces anticorps ou leurs fragments idiotypiques peuvent à cet égard être utilisés en temps qu'agents antiplaquettaires chez des patients présentant des risques de troubles des fonctions plaquettaires et en particulier des problèmes concernant la formation des thromboses. A cet égard les anticorps de 1*invention et leurs fragments permettent, de ne pas inhiber complètement les fonctions plaquettaires ce qui généralement entraînent un risque de saignement dangereux pour le patient traité.
Les anticorps ou leurs fragments définis dans les pages précédentes peuvent donc être utilisés séparément ou dans des mélanges afin de cibler 1'inhibition des fonctions plaquettaires selon les besoins et/ou d'obtenir des niveaux d'inhibition des fonctions plaquettaires adaptés à la situation que l'on souhaite éventuellement traiter.
L'invention vise par ailleurs des anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques tels qu'ils ont été décrits plus haut caractérisés en ce qu'ils sont marqués, le marquage étant de préférence réalisé avec une substance radioactive, notamment un radioélément halogénique ou métallique, par exemple 131j^ 11in ou "T, OU par une substance fluorescente.
La substance de marquage doit être choisie en fonction de 1'utilisation souhaitée des anticorps, in vitro ou in vivo. Dans le cas où ces anticorps sont utilisés in vivo, la substance choisie doit être physiologiquement acceptable pour l'homme, et adaptée à la détection par des moyens tels que l'imagerie.
Différents protocoles de marquage pourront être utilisés, en fonction du marqueur choisi. On aura par exemple recours aux techniques décrites dans la publication Mason, D et al (1980) Biochem J 187, 1-9. Pour les techniques relatives à l'utilisation des anticorps après le marquage, on se référera par exemple à la publication McGregor JL et al (1986) Eur J. Bioche 159, 443-449. L'invention concerne à cet égard un procédé pour le marquage d'anticorps ou de leurs fragments tels qu'ils ont été définis précédemment, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- mise en contact de 1•anticorps ou de ses fragments que l'on souhaite marquer, avec un marqueur déterminé, par exemple un radioélément, dans des conditions permettant le couplage du marqueur et de 1'anticorps,
- le cas échéant purification par exemple par filtration sur gel, pour éliminer les composants n'ayant pas réagi.
Si le marquage sur les anticorps ou leurs fragments est réalisé de façon indirecte par exemple avec le technetium 99 on aura recours aux agents chélatants connus pour complexer le marqueur et réaliser le couplage avec 1•anticorps ou les fragments. Des agents chélatants utilisables sont par exemple les acides polyaminocarboxyliques, notamment le DTPA (acide diéthylène triamine pentaacétique) , des analogues de l'acide diéthylène triamine pentaacétique
(EDTA) des composés diaminodithiols, triaminothiols
(ex : les (thioacétamide/ pentanoile) des amine≤ polycycliques des dithiosemicarbozones et des métallothionines ou des anhydrides- de ces acides, notamment des anhydrides cycliques. Ces agents chélatants sont préparés par des méthods connues. Pour le marquage au technetium, on pourra par exemple se référer à la publication Eckelman et al Nucl, Med.
Biol. vol 16 n° 2, pp 171-176, 1989) . Entre également dans le cadre de l'invention, 1'épitope reconnu par les anticorps monoclonaux définis précédemment ou encore reconnu par les fragments idiotypiques de ces anticorps cet épitope étant présent au niveau d'un antigène impliqué dans les étapes de la physiologie plaquettaire et en particulier dans les réactions d'adhésion et/ou d'agrégation et/ou de sécrétion plaquettaire et/ou dans les réactions d'adhésion des cellules endotheliales, ledit antigène étant choisi plus particulièrement parmi les protéines GMP140 la glycoprotéine gplla ou les complexes gpIIb-IIIa, gpla-lla, gplc-lla, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un épitope conformationnel, nécessaire à l'activité dans les réactions ci-dessus de l'antigène qui le contient.
Un ép_tope particulier de l'invention est un épitope sensible à la réduction de 1'antigène qui le contient. L'invention concerne de façon plus spécifique les épitopes distincts reconnus par chacun des anticorps LYP20 et LYP22.
Un autre épitope visé dans le cadre de 1'invention est un épitope répondant aux définitions générales ci-dessus caractérisé: a) en ce qu'il est reconnu par le complexe Ilb- IIIa de plaquettes humaines. b) en ce qu'il n'est pas reconnu par le complexe Ilb-IIIa de plaquettes de chien, c) en ce qu'il est reconnu par l'analogue du complexe Ilb-IIIa (complexe Ilb-IIIa like) , présent sur des cellules endotheliales.
De façon préférée cet épitope est 1•épitope reconnu par 1»anticorps LYP18. Les épitopes reconnus par les différents anticorps ou fragments idiotypiques de ces anticorps sont encore caractérisés comme suit :
Un premier protocole pour les caractériser comprend : la dégradation protéolyti ue de la glycoprotéine supposée contenir l'épitope,
- la localisation du déterminant de 1' nticorps monoclonal par SDS PAGE et Western blot, en utilisant les petits fragments de glycoprotéine, résultant de la protéolyse
- l'obtention de la séquence d'acides aminés du (des) fragment(s) reconnu(s) par l'anticorps monoclonal, - la production de peptides se chevauchant autour de la séquence d'acides aminés supposée contenir 1'épitope,
- la sélection du ou des peptide (s) capables d'inhiber la liaison de l'anticorps avec son récepteur lors d'un test de réaction d'inhibition mettant en oeuvre l'anticorps monoclonal et la glycoprotéine purifiée ou les plaquettes lavées.
Cette technique peut être mise en oeuvre par référence aux publications de Foster P.A et al (1988) J Biol Chem 263, 5230-5234 et Geysen MH et al Ciba Foundation Symposium 119, 130-149.
Les étapes suivantes peuvent encore être mises er oeuvre pour l'obtention des épitopes :
- l'utilisation d'anticorps monoclonaux ayant un effet inhibiteur et capables de se fixer en Western blot,
- 1'isolement du gène complet de glycoprotéine à partir d'une banque de cDNA λgtll d'une lignée cellulaire exprimant 1' ntigène reconnu par l'anticorps, - le séquençage du gène,
- l'isolement de cDNA de différentes tailles, reconnus par 1'anticorps monoclonal,
- la détermination, à partir du cDNA isolé, du déterminant de l'anticorps monoclonal selon un procédé conforme au premier protocole.
Ce protocole peut être réalisé par référence à la publication Bahou WF et al (1989) J Clin Invest 84, 56-61.
L'invention vise également une composition pour le diagnostic de l'activation plaquettaire chez un sujet suseptible de présenter une pathologie associée à des troubles de la physiologie plaquettaire en particulier pour mettre en évidence une thrombopathie, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux anticorps différents ou leurs fragments idiotypiques tels qu'ils ont été définis ci-dessus, de préférence des anticorps dirigés contre des protéines ou glycoprotéines distinctes, en particulier un mélange d'anticorps choisi parmi LYP20, LYP22 et LYP18 ou encore leurs fragments idiotypiques. Pour les besoins de la détection, ces anticorps ou fragments d'anticorps sont marqués. D'autres compositions pour le diagnostic de l'activation plaquettaire, répondant aux définitions ci-dessus, sont des compositions caractérisées en ce qu'elles comprennent en outre des anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques dirigés contre la thrombospondine et de préférence des anticorps du type LYP9 ou/ t LYP11.
Les anticorps LYP9 et LYP11 sont des anticorps dirigés contre la thrombospondine obtenus par une méthode telle que celle décrite dans la publication de Clezardin et al (Eur J Biochem. 154, 95-102 (1986)). Les compositions pour la diagnostic décrites ci- dessus peuvent d'être utilisées pour détecter in vitro dans un échantillon biologique tel que le sang la présence d'antigènes plaquettaires, significative d'un état de thrombose.
Ces compositions sont également utilisables dans les étapes d'un protocole de détection, en vue du diagnostic in vivo, lorsque les anticorps monoclonaux ou leurs fragments ont préalablement été marqués avec une substance physiologiquement acceptable pour l'homme dans des conditions permettant leur détection avec des appareils adaptés et en particulier grâce aux méthodes de gamma-scintigraphie et de NM.
Un autre avantage des compositions pour le diagnostic précédemment décrites est de permettre un diagnostic sélectif de la présence de certains antigènes particuliers caractéristiques d'étapes déterminées de la physiologie plaquettaire.
Une catégorie d'anticorps monoclonaux ou de fragments selon 1'invention peut également être utilisée, sous la forme d'une composition pour le diagnostic in vitro, pour la mise en évidence de mélanomes métastasiques et pour les différencier par rapport à des mélanocytes bénins. Ces anticorps monoclonaux sont de préférence les anticorps LYP18 de 1 'invention ou des anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles analogues, notamment leur capacité à reconnaître 1 'analogue du complexe Ilb-IIIa (Ilb-IIIa like) .
Le complexe Ilb-IIIa like est caractérisé par un poids moléculaire identique, sous forme réduite ou non réduite, à celui de la glycoprotéine plaquettaire Ilb-IIIa. Ce complexe Ilb-IIIa like présente en outre un fragment IIb-3 like (forme réduite) comme les plaquettes Ilb réduites (11-0 plaquettaire) . L'invention vise par ailleurs une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, un anticorps monoclonal ou ses fragments idiotypiques ou encore un mélange d'anticorps et de fragments selon ce qui a été décrit précédemment ou un mélange des ces différents anticorps et/ou fragments idiotypiques, en combinaison avec un véhicule pharmaceutique acceptable.
Selon un premier aspect préféré de l'invention, de telles compositions pharmaceutiques peuvent être utilisées pour les traitements de différentes pathologies résultant de troubles de la physiologie plaquettaire ou liés à ces fonctions plaquettaires.
Une utilisation des compositions pharmaceutiques comprenant les anticorps de 1'invention ou leurs • fragments peut être le traitement de maladies cardiovasculaires.
Selon un autr aspect particulier de la réalisation de l'invention, les compositions pharmaceutiques sont caractérisées en ce que le (les) anticorps ou leurs fragments idiotypiques, sont :
- soit couplés à une substance anticoagulante ou à une substance ayant une activité thrombolytique, cette substance pouvant être par exemple le tpa, la streptokinase ou l'urokinase,
- soit modifiés au niveau de l'une de leurs chaînes idiotypiques de façon à remplacer l'un des fragments variables ou au moins une partie de ces fragments par l'une des susdites substances anticoagulantes.
Lorsque le fragment idiotypique de 1'anticorps est couplé avec une substance ayant une activité décrite ci-dessus, la liaison entre le fragment et cette substance est une liaison covalente résultant de la mise en oeuvre d'un protocole tel que celui décrit par Bode et al (1985) Science 229, 765. D'autres techniques utilisables sont celles décrites par Frantz et Robertson dans Infect and Immunity, 3__, 193-198 (1981) ou celle décrite dans Environnement Microbiology (octobre 1981) vol. 42 n° 4, 611-614 par P.E. Kauffmann.
Dans la pratique, on utilisera avantageusement comme agent de couplage les composés suivants, cités à titre non limitatif : aldéhyde glutarique, chloroformiate d'éthyle, carbodiimides hydrosolubles [N-éthyl-N* (3-diméthylamino-propyl) carbodiimide, HC1] , diisocyanates, bis-diazobenzidine, di- et trichloro-s-triazines, bromures de cyanogène, benzoquinone, ainsi que les agents de couplage mentionnés dans Scand. J. I munol. , 1978, vol. 8, p. 7-23 (AVRAMEAS, TERNYNCK, GUESDON) .
Dar.s le cas où 1= composition pharmaceutique est composée d'un antic-_-ps ou d'un mélange de ces
«s anticorps et/ou de leurs fragments idiotypiques couplés ou modifiés par une substance anticoagulante ou thrombolytique, cette composition, associée a un véhicule physiologiquement acceptable est administrée au patient selon une dose comparable à celle qui serait utilisées pour un des constituants de la composition pris isolément.
L'invention vise en outre l'utilisation d'anticorps ou de leurs fragments idiotypiques pris séparément ou en mélange, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des pathologies liées à des troubles de la physiologie plaquettaire.
L'invention vise aussi l'utilisation des anticorps selon l'invention pour moduler, voire inhiber 1'interaction entre les plaquettes et les monocytes. Elle vise à cet égard un agent, capable de moduler les interactions entre des cellules de type 18 * monocytes et des plaquettes stimulées, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps monoclonal selon l'invention. Un agent particulièrement avantageux est caractérisé en ce qu'il comprend l'anticorps LYP20.
Selon un autre aspect préféré de 1'invention les compositions pharmaceutiques ci-dessus peuvent être utilisées dans une application différente du traitement des maladies cardiovasculaires pour bloquer la prolifération des cellules malignes de mélanomes et ainsi contrarier l'invasion métastasique de ces cellules. L'invention concerne à cet égard des compositions pharmaceutiques comprenant 1'anticorps monoclonal LYP18 ou encore ses fragments idiotypiques ou encore un anticorps ayant la propriété de bloquer la croissance et/ou la prolifération des cellules malignes de mélanomes, pour le traitement pour inhiber la croissance des mélanomes tumoraux in vivo.
L'invention vise aussi l'application des anticorps LYP18 ou de leurs fragments idiotypiques, pour inhiber la croissance de cellules de mélanomes malins.
L'invention vise aussi l'utilisation pour le diagnostic in vitro de mélanomes malins, notamment pour différencier ces tumeurs d'autres tumeurs telles que les lymphomes ou les carcinomes, d'anticorps LYP18 ou de leurs fragments idiotypiques ou encore d'anticorps ayant des propriétés de reconnaissance des mélanomes du type de celles décrites pour LYP18. A cet égard l'invention concerne une composition pour le diagnostic in vitro de cellules tumorales de mélanomes caractérisée en ce qu'elle comprend des anticorps LYP18.
En outre 1'invention vise 1'application des anticorps monoclonaux, à la purification de l'antigène qu'ils reconnaissent, en particulier des anticorps LYP21 à la purification de la GMP140.
L'invention concerne également un procédé de préparation des anticorps monoclonaux selon 1*invention caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a/ fusion de cellules spléniques de souris avec des cellules myélomateuses, lesdites souris étant préalablement immunisées avec 1'antigène contre lequel on souhaite produire des anticorps, les cellules spléniques étant en excès par rapport aux cellules myélomateuses, en présence d'un promoteur de fusion, par exemple le PEG, b/ culture des hybridomes formés par la fusion, c/ clonage et sous-clonage des hybridomes producteurs des anticorps recherchés, d/ production d'asciter dans les souris, e/ récupération et purification desdits anticorps. Pour la production des anticorps LYP18 ou LYP20 on utilise à titre d'antigène, des plaquettes de sang humain traitées à la chymotripsine. Dans ce cas, les cellules myélomateuses utilisées pour la fusion sont par exemple des cellules Sp2/0-Agl4. Pour la préparation des anticorps LYP21 ou LYP22, on utilise un mélange des antigènes GMP140, glycoprotéines la, le, lia, GP110-115 pour immuniser les souris. Dans ce cas, les cellules myélomateuses utilisées pour la fusion sont avantageusement des cellules P3 x 63 Ag 8. D'autres cellules myélomateuses pour la fusion sont les cellules SP2/0.Agl4. On se référera aux exemples pour les détails du protocole d'obtention. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples et les figures qui suivent :
Figure 1 :
Profile d»élution des extraits plaquettaires traités au Lubrol obtenus à partir d'une colonne Mono Q de Sepharose à flux rapide sur FFLC.
La fraction éluée de la colonne de Sepharose WGA a été dialysée contre 0,1 % de Lubrol dans un tampon Tris. Le pic 1 a été élue à 0,15 M NaCl, le pic 2 à 0,25M NaCl, le pic 3 à 0,32M. NaCl, les pics 4, 5, 6 élues entre 0,6 - 0,75M NaCl. Analyse SDS-FΑGE des pics élues par chromatographie d'échange d'anions.
Chaque fraction a été concentrée et traitée dans des conditions non-réductrices (NR) et dans des conditions réductrices (R) . Les échantillons ont été soumis à une électrophorèse SDS-PAGE 7,5% et les gels ont été colorés à l'argent.
Figure 2 :
Comparaison des données obtenues en SDS-PAGE de
GPIIb-IIIa, de l'antigène S12 et P20.
Des lysats de plaquettes marquées avec 125l ont été incubés avec des IgG non-im unes (C) , P20 avec S12 et avec un anticorps P18 anhti-GPIIb-IIIa. Des échantillons ont été dénaturés dans des conditions non-réductrices et réductrices (R) , placés sur un gradient SDS-PAGE 5-15% et autoradiographiées. La ligne A montre le lysat total marqué non-réduit.
Figure 3 :
Résultats immunoblott de l'antigène correspondant à MO. 21 Les lysats plaquettaires ont été dénaturés dans des conditions non-réductrices (NR) et réductrices (R) et ont été placés sur un gradient SDS-PAGE à 5-15%, avant le transfert sur des bandes I mobilon. Les bandes P20 et P21 ont été incubées avec P20 et P21 respectivement, la bande C incubée avec des IgG non- i munes (c) . Le Western blot a été développé avec l'anticorps secondaire conjugué à la peroxidase.
Figure 4 :
Liaison d'anticorps nonoclonal P20 à des plaquettes non-stimulées et stimulées.
Des plaquettes lavées à une concentration de
108/B_1 ont été incubées pendant 30 minutes à 25"C dans une solution complète de Tyrode avec différentes concentrations (0,1-4 μg/ml) de P20 marqué avec 125I.
Les plaquettes lavées ont permis de montrer une liaison accrue de P20 marqué avec 125I après stimulation par lU/ml d'alpha-thrombine.
Figure 5
Effet de P20 sur l ' adhésion plaquettaire.
L' anticorps monoclonal P20 (50 μg/ml) inhibe partiellement (60%) l ' agrégation induite par 2 , 5 μM d 'ADP, une dose de 40 μg/ml inhibe l ' agrégation induite par 2μg/ml de collagene (63% d ' inhibition) . P20 (90 μg/ml) inhibe également (50%) l ' agrégation induite par 0, 016 U/ml de thrombine.
Figure 6 : Fixation de l' anticorps uonoclonal LYP18 aux mégacaryocytes présents au niveau d'une biopsie de la moelle osseuse (sections congelées pour être découpées puis traitées avec la peroxidase jusqu 'à coloration et colorées avec le bleu de méthylène (x200) . Figure 7 :
Fixation de l'anticorps nonoclonal LYF18 à des mélanomes maélins métastatiques des ganglions lymphatiques. A et encadré (gauche) : des sections congelées traitées à la peroxidase jusqu'à coloration puis colorées avec du bleu de méthylène comme colorant additionnel (xlOO ; encadré x200) . LYP18 ne se fixe pas à des nevo-mélanocytes du nevi- B (droite) : sections congelées traitées avec la phosphatase alkaline pour une première coloration puis colorée avec l'hexatoxyline (x200) .
Figure 8 :
Croissance des tumeurs de M3Dau en présence d'anticorps LYP18, G7A5, IgG2a
Figure 9 :
Effet de l'injection de LYP18 sur la croissance des tumeurs.
23 EXEMPLE 1
- Isolement et caractérisation de glycoprotéines de plaquettes par chromatographie FPLC suivie d'un séquençaqe en phase gazeuse. Dans cette expérience on a isolé des glycoprotéines présentes en faible quantité à la surface des plaquettes. Pour cela on a utilisé la chromatographie rapide en phase liquide (FPLC) ainsi que le séquençage en phase gazeuse permettant de procéder à l'étude de la structure, des caractères immunologiques et fonctionnels des glycoprotéines présentes sur les plaquettes, en faible quantité.
Les membranes plaquettaires solubilisées dans du sodium déoxycholate ont été appliquées sur une colonne de germe de blé (WGA) et de lectine (Lens Culinaris
• LCH) montée séquentiellement avec une chromatographie
FPLC. Les glycoprotéines éluées des colonnes de lectine dans un détergent non ionique ont ensuite été séparées sur une colonne échangeuse d'anions (Mono-Q) . Les pics élues à partir de la colonne Mono-Q à différentes concentrations de NaCl ont été soumis à des électrophorèses en une et deux dimensions sur des gels de polyacrylamide SDS et analysés en Western blot sur des membranes Immobilon PVDF. Les glycoprotéines présentes sur les membranes Immobilon ont été directement séquencées en utilisant un séquenceur automatique en phase gazeuse. La colonne WGA a permis de lier un mélange d'antigènes comprenant la gplb, la gplllb (ou gpIV) la gpllb-llla en plus d'un certain nombre de protéines telles que gpl50/155 (poids moléculaire non réduit/réduit) gpl50/130, gpl30/135, gpl28/132 et gpll5/120. Ces glycoprotéines séparées par FPLC ont ensuite pu être identifiées en utilisant un anticorps monoclonal (AcM) ou des anticorps polyclonaux. La gpl28/132 a été identifiée comme 24 correspondant à la GMP140 ou PADGEM par un anticorps monoclonal LYP21. La gpl50/155 et la gpl32/135 ont été identifiées sous forme de complexe GPIa-IIa par un anticorps monoclonal LYP22. La colonne LCH a permis de lier principalement le complexe GPIlb-IIIa, identifié par un anticorps monoclonal anti-GPIIb-Illa (LYP4) . Les parties N-terminales d'un nombre limité de ces glycoprotéines séparées ont été microséquencées en utilisant un séquençeur en phase gazeuse. L'usage combiné de FPLC et du séquençage en phase gazeuse permet un isolement rapide et une caractérisation des glycoprotéines plaquettaires. Par ailleurs, l'identification des séquences d'acides aminés N- terminales permet la synthèse de sondes oligonucléotidiques pour cribler et isoler différents • clones cDNA de glycoprotéines à partir de banques de données.
Matériels et méthodes Préparation des membranes :
Des concentrés de plaquettes humaines ont été obtenus au centre de transfusion sanguine de Beynost. Les membranes plaquettaires ont été préparées selon la méthode décrite par Cooper et al (1979, Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 1069-11073), en utilisant 10 unités de concentré de plaquettes humaines (50.10/unité) . Les globules rouges sédimentés ont été séparés des plaquettes par centrifugation à 160g pendant 25 minutes à 25"C. Les plaquettes ont été isolées et lavées en utilisant la méthode de Massini et al modifiée par Me Gregor et al, (respectivement 1974, Biochi ica and Phyica Acta 372: 109-121; 1979, Thromb. Res. 16: 437-452). Les plaquettes lavées ont été resuspendues (5.10/ml) dans 15 mM Tris (Hydroxymethyl-Aminométhane) -HCL (Boerhinger Mannheim, Meylan France) à pH 7,4 avec 5mM EDTA (BDH, Poole, Grande Bretagne) et 1 μM de leupeptine (Boerhinger Mannheim) . Ces plaquettes ont ensuite été soumises à un appareil à sonication Branson réglé sur le mode discontinu avec un cycle d'opération de 50 % et un niveau d'intensité des ultrasons de 5. Les plaquettes traitées par ultrasons ont été centrifugées à 4'C pendant 20 minutes à 9000g dans un rotor à angle fixe SS34 en utilisant une centrifugeuse Sorvall RC2B (Dupont de Nemours, Newto n, Connecticut, USA). Le surnageant a ensuite été retiré et centrifugé pendant une heure à 4'C à 100 000g dans un rotor à angle variable TST 55.5 en utilisant une centrifugeuse Kontron 2060 (Kontron, Zurich, Swisse) . Les membranes sous forme de culot ont été resuspendues dans un tampon contenant 10 mM Tris-HCL à pH 8,2, dans 5 mM EDTA et 1 μM de leupeptine.
Extraction avec le sodium deoxycholate (DOC) : Les membranes plaquettaires ont été traitées pendant 30 minutes à 4*C avec du sodium deoxycholate 1 % (w/w) (Merck, Daπnstadt, RFA) dans 10 MM Tris-HCl à pH 8,2 avec 5 mM EDTA et 1 μM de leupeptine. Les membranes extraites des plaquettes ont été soumises à une ultracentrifugation à 4*C pendant 30 minutes à 100000 g dans un rotor à angle variable TST 55.5 en utilisant une centrifugeuse Kontron 2060. Le surnageant ultracentrifugé a été collecté.
Chromatographie d'affinité sur lectine
Le germe de blé-lectine (WGA) lié au Sepharose 6MB (Pharmacia, Uppsala, Suède) a été placé dans une colonne de verre HRlO/10 (100 mm x 10 mm) (Pharmacia) . La colonne a ensuite été reliée à un système de chromatographie rapide en phase liquide (FPLC) (Pharmacia) . La colonne a été équilibrée dans un tampon de départ contenant 10 mM Tris-HCl à pH 8,2 avec 0,5 % DOC, 5 mM EDTA. Les membranes des plaquettes solubilisées ont été déposées sur la colonne avec un débit de 0,5 ml/mn et la colonne a été lavée avec un tampon de départ jusqu'à l'obtention d'une densité optique égale à la valeur de base. Les glycoprotéines liées à la colonne de WGA ont été éluées avec un sucre, le N-Acetyl Glucosa ine 2,5 % (Sigma, Saint Louis, MO, USA). Les pics d'élution ont été dialyses pendant une nuit contre 10 mM Tris-HCl à pH 7,4 avec 0,1 % de lubrol PX (Sigma).
Chromatographie d'échange d'anions: Les glycoprotéines éluées à partir de la colonne de lectine et resuspendues dans du lubrol PX ont été placées sur une colonne d'échange d'anions MONO Q HR5/5 (50 mm x 5 mm) (Pharmacia) . Le tampon de départ contenait 0,1 % de lubrol PX dans 20 nM Tris-HCl à pH 7,4 et le tampon final était co psé de 0,1 % lubrol PX dans Tris-HCl à pH 7,4 contenant 1M de chlorure de sodium (Merck) . Un grandient a été établi pendant 25 minutes avec un débit de 1 ml/mn.
Chromatographie d'immunoaffinité :
Les glycoprotéines éluées à partir de la colonne MONO Q ont été identifiées sur des colonnes d'immunoaffinité en utilisant les anticorps monoclonaux LYP21 (dirigés contre la GMP140) et LYP22 (dirigés contre la gplla) liés au Sepharose-4B. Ces anticorps ont été obtenus après immunisation de souris avec un mélange de glycoprotéines isolées par affinité sur colonne WGA et chromatographie d'échange d'anions. Les glycoprotéines Ilb-IIIa ont été identifiées sur colonne d'immunoaffinité en utilisant l'anticorps monoclonal LYP4 décrit par Me Gregor et al (1986, Eur. J. Biochem. 159: 443-440).
EXEMPLE 2 - Inhibition de l'agrégation plaquettaire induite par le collagene, avec des anticorps monoclonaux anti- gpla-lla.
On a mis en évidence qu'une glycoprotéine (gp) Ia-lla (VLA-2) a un rôle important dans l'adhésion des plaquettes au collagene. Les plaquettes d'un patient présentant un défaut en gpla ne subissent pas d'agrégation en réponse au collagene. Un anticorps monclonal LYP22, a été obtenu à partir de souris immunisées avec un mélange de glycoprotéines membranaires de plaquettes, isolées par chromatographie d'affinité à l'aide d'agglutinine de germe de blé couplée à une chromatographie d'échange d'anions.
Une immunoprécipitation ultérieure d'un lysat de plaquettes solubilisées dans un détergent, iodées en surface, a montré que LYP22 précipitait deux glycoprotéines ayant un poids moléculaire estimé dans des conditions non réductrices et réductrices (NR/R) de 140/155 JDa, et de 120/135 kDa respectivement. Les changements des poids moléculaires de ces deux glycoprotéines dus à la réduction sont en accord avec ceux précédemment décrits pour GPIa et GPIIa respectivement. Quand des plaquettes solubilisées avec du Lubrol ont été mises en contact avec le LYP22 sur une colonne d'affinité de sepharose, deux autres glycoprotéines (120/128 et 100/105 kDa) ont été détectées en quantité beaucoup plus faible à l'aide du bleu de Coo assie. Des études des liaisons de l'anticorps LYP22 marqué avec l'iode 125 (I125) aux plaquettes ont montré que les liaisons sont de l'ordre 28 de 7708 ± 928 molécules par plaquette au repos et 8940 ± 86 liaisons de molécules par plaquette activée avec la thrombine (Kd ***** 65,6nM ± l,43nM). Ces données suggèrent que l'expression en surface des sites de liaisons au LYP22 n'est pas augmentée après l'activation des plaquettes.
Pour déterminer l'effet de LYP22 sur les fonctions plaquettaires, des études d'agrégation avec des plaquettes humaines lavées ont été réalisées. LYP22 inhibe partiellement l'agrégation plaquettaire induite par une faible dose de collagene (lμg/ML) mais n'a pas d'effet sur d'autres agonistes. Cependant, LYP22 n'a pas d'effet sur l'adhésion des plaquettes au collagene, à la fibronectine ou au "fibrinogène en présence de 2 mM de magnésium ou de calcium.
Ces résultats montrent que : a/ LYP22 est dirigé contre le complexe GPIa-IIa, b/ le complexe GPIa-IIa peut être lié à deux autres protéines qui ne sont pas exprimées à la surface des plaquettes, c/ le complexe GPIa-IIa est impliqué dans l'agrégation plaquettaire induite par le collagene.
EXEMPLE 3 - Inhibition des fonctions plaquettaires de plaquettes humaines par un anticorps monoclonal LYP20 dirigé contre une glycoprotéine de membrane dont l'expression dépend de l'activation.
Un nombre limité de glycoprotéines de membrane (Ib, Ilb-IIIa, Ia-IIa, Ic-IIa, Illb) jouent un rôle important dans l'agrégation plaquettaire et l'adhésion. On a utilisé les anticorps monoclonaux LYP20 et LYP21. Les anticorps LYP20 ont été obtenus après immunisation d'une souris BALB/C avec un concentré de plaquettes de sang humain lavées. traitées à la chymotrypsine. Les anticorps monoclonaux LYP21 ont été obtenus avec des glycoprotéines de membrane de plaquettes éluées à partir d'une colonne d'affinité à l'agglutinine de germe de blé. L'immunoprécipitation faisant appel à des lysats plaquettaires marqués en surface, activés à l'aide de thrombine, a montré que LYP20 et LYP21 précipitent une protéine de 128 kDa (non réduite) et 132 kDa (réduite) qui est appelée gpl28. Les anticorps LYP20 et LYP21 reconnaissent des épitopes distincts sur la gpl28, le déterminant antigénique de LYP20 étant dépendant de la présence de ponts disulfure intacts. Des plaquettes au repos lavées ont permis de lier 2400 ± 270 molécules par anticorps LYP20 marqué avec l'iode 125 et 12.200 ± 1.184 molécules par anticorps après activâtion par 1 U/ml de thrombine. Ces données montrent que LYP20 et LYP21 sont dirigés contre une protéine de surface plaquettaire (gpl28) dont l'expression dépend de l'activation plaquettaire et de la sécrétion. La gpl28 migre conjointement avec l'antigène plaquettaire immunoprécipité par un anticorps dirigé contre la glycoprotéine GMP140 ou PADGEM. Ceci montre que la gpl28 est liée ou identique à la GMP140 ou PADGEM. Afin de déterminer le rôle potentiel de la gpl28 dans les fonctions plaquettaires, les études concernant l'agrégation avec des plaquettes.humaines lavées ont été réalisées. Des fragments F(ab)2' de LYP20 mais pas de LYP21 inhibent partiellement l'agrégation plaquettaire et la libération induite par 2,5μM d'ADP, 2μg/ml de collagene et 0,016U/ml de thrombine. Ces résultats montrent que : a/ LYP20 et LYP21 sont dirigés contre des épitopes différents de la protéine de surface plaquettaire (gpl28) dont l'expression dépend de l'activation plaquettaire ; b/ la gpl28 est liée ou identique à la GMP140 ou PADGEM ; c/ la gpl28 exposée à la surface de plaquettes activées peut jouer un rôle important dans l'agrégation plaquettaire.
EXEMPLE 4 - Préparation d'anticorps monoclonaux dirigés contre la glycoprotéine GMP 140 - Matériel
L'adénosyldiphosphate (ADP) , l'aprotinine, la fibronectine (FN) , la lactoperoxidase et la leupeptine, le lubrol WX, la N-acétyl glucosamine, 1*orthophényldiamine (OPD) , le fluorure de phénylméthylsulphonyle (PMSF) , la prostaglandine El (PGE1) et le triton X-100 ont été obtenus auprès de Sigma (StLouis, MO, USA). Le 5 Chrome, l'125 Iode et la 14C séroténine ont été obtenus chez Amersham International (U.K.). La peroxidase de raifort conjuguée à des anticorps anti-souris de chèvre, la gélatine, le réactif de développement de couleur HRP et le T een 20 ont été obtenus auprès de BioRad (Richmont, CA, USA) . Le sodium deoxycholate (DOC) , le dithiothreitol (DTT) , la leupeptine et le PMSF ont été obtenus auprès de Merck (Darmstadt, RFA) . Le polyethylene Glycol (PEG) et le Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) ont été obtenus auprès de BDH (Poole, U.K.). Le gel à flux rapide Q-sepharose (Q Sepharose fast flo gel (marque déposée)) , la protéine A sepharose, l'agglutinine de germe de blé (WGA) et un système complet FPLC ont été obtenus auprès de Pharmacia (Uppsala, Suède) . La sérum albumine bovine (BSA) et les anticorps IgG anti-souris de lapin proviennent de Miles Laboratories (Naperville, IL, USA) . Le collagene provient de Hormon-Chemie (Munich, RFA) . La Thrombine a été obtenue auprès de Hoffman-La Roche (Bâle, Suisse) et l'alpha-thrombine, le fibrinogène (FG) proviennent de IMCO. La pansorbine provient de Calbiochem (La Jolla, CA, USA) . Tous les réactifs de culture cellulaire ont été obtenus auprès des laboratoires Flow (Les Ulis, France) et Intermed (Lyon, France). Le 2,4,6,10 teramethylpentadecane (Pristane) provient de Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI, USA). Les membranes de difluorure de polyvinylidène (Immobilon) proviennent de Millipore Corporation (Bedford, MA, USA) . Le D-phényl-L-propyl- L-arginine chloromethyl cétone (PPACK) proviennent de Calbioche -Behring (Paris, France) .
- Méthodes a) Préparation de Plaquettes et Marquage
Des concentrés de plaquettes (Centre de Transfusion Sanguine de de Beynost) ont été lavés selon la technique de Massini et al (1974) , Biochi biophys. Acta 372, 109-121.
Les protéines de surface ont été iodées selon la méthode décrite par Philipps et Al. (1977) J.Clin. Invest. 60, 535-545, en utilisant la lactoperoxidase.
Les plaquettes utilisées dans les études de fixation, d'agrégation et d'adhésion proviennent du sang (1 volume ACD : 6 volumes de sang) de volontaires normaux. Les plaquettes ont été isolées et lavées selon la technique de Mustard et Al. (1972) Br. J. Haematol. 22, 193-204 avec de légères modifications :
-6
20 ng/ml PGE1 et 10 M PPACK ont été ajoutés au premier lavage. b) Isolement des glycoprotéines de membrane plaquettaire
Les plaquettes lavées conformément à la méthode de Massini et Al. citée plus haut ont été resuspendues à 40 x 109 cellules/ml dans 0,02 M Tris-HCl à pH 8,6, avec 0,005 M EDTA, 1% (w/v) de DOC, 17U/ml d'aprotinine, ImM de leupeptine. La solubilisation à été réalisée à 4'C sous agitation constante pendant une heure. Le lysat a été centrifugé à 100.000 g pendant une heure à 4"C. Le surnageant a été dilué dans 5 volumes de 0,02 M Tris-HCl à pH 8,6, ImM EDTA, 0,5% (w/v) DOC (tampon A) et déposé sur une colonne de sepharose 6B-WGA. La colonne était pré-équilibrée dans le tampon A et couplée à un système de chromatographie rapide en phase liquide (FPLC) . La colonne a été lavée à 0,4 ml/minute avec le tampon A jusqu'à ce que le matériel non fixé soit éliminé. La fraction spécifiquement liée a été éluée par 2,5% (w/v) de N- acétyl glucosamine. La fraction collectée a été dialysée pendant une nuit contre un mélange de 0,02 M Tris-HCl à PH 7,4, avec 0,005 M EDTA et 0,1% de Lubrol PX à 4"C. L'échantillon dialyse a été soumis à une chromathographie d'échange d'anions en utilisant une colonne Q à flux rapide, reliée au système FPLC et pré-équilibrée dans 0,02 M Tris-HCl à pH 7,4 contenant 0,1% (w/v) de lubrol WX (tampon B) . L'échantillon a été appliqué sur la colonne à un débit de 2 ml par minute et les différentes fractions ont été éluées en utilisant un gradient de NaCl(0 à 1 M) dans le tampon B. Chaque fraction a été collectée, concentrée et analysée par SDS-PAGE en utilisant la technique
Laemmli (1970) Nature 227, 680-685. La concentration de protéine a été déterminée par la méthode de Lowry
(1951) modifée par Markwell (1978) Anal. Biochem. 87, 33 206-210. Pour plus de détails concernant l'isolement des glycoprotéines on pourra se reporter à exemple 1. c) Production d'anticorps monoclonaux cl) Préparation de l'anticorps LYP21 Des souris BALB/c (des femelles de 6 semaines) , obtenues chez IFFA CREDO (L'Arbresle, France) , ont été immunisées intrapéritonéalement avec lOOμg d'un mélange de 4 glycoprotéines (isolées de la façon décrite ci-dessus et correspondant aux glycoprotéines GMP140, la, le, lia, GP110-115) , avec un volume égal d'adjuvant complet de Freund. Deux semaines plus tard, lOOμg de l'antigène ont été injectés aux souris en présence d'adjuvant incomplet de Freund.
On a vérifié que le sérum des souris réagissait vis à vis de l'antigène en utilisant la technique ELISA. A cet égard, on rappelle brièvement la technique : des puits de plastique ont été recouverts avec lOOμl d'antigène (mélange de 4 glycoprotéines) dilués à 2μg/ml dans un tampon de bicarbonate (25 mM Na2Cθ3, 25mM NaHCC-*j, pH 9,6) laissés pendant 3 heures à 37'C. Les puits ont été lavés et saturés avec 0,5% de BSA dans un tampon Tris(15mM Tris-HCl, pH 7,4, 2mM CaCl2, 0,05% (w/v) Tween) pendant 30 minutes à température ambiante. Le sérum de souris ou les surnageants d'hybrido es (lOOμl) ont été incubés dans les puits pendant 1 heure à 37*C. Après 3 lavages dans un tampon Tris, un anticorps anti-souris de chèvre (anticorps secondaire, dilué à 1/3000) conjugé à la peroxidase a été ajouté à chaque puits et soumis à réaction pendant 30 minutes à 37'C. Les puits ont ensuite été lavés une nouvelle fois et remplis avec une solution de lOOμl de substrat (4 g OPD dans 10 ml de 0,1M tampon citrate, à pH 5, avec 0,7 μl de 30%H2O2) . La réaction a été arrêtée avec lOOμl de 4NH2S04, 4N. La densité optique a été mesurée avec un lecteur de plaque.
Quatre semaines après la première injection, les souris immunisées ont subi un rappel avec lOOμg de mélange d'antigènes. Les cellules spléniques ont été fusionnées 4 jours plus tard selon la méthode de Kohler et Milstein (1975) Nature 256, 177-181, avec des cellules myélomateuses P3X63Ag8 selon un rapport de 10:1, en présence de PEG. Les hybridomes ont été divisés, 24 heures plus tard, sur des plaques à 24 puits, dans un milieu hypoxanthine/aminoptérine/thymidine (HAT) avec des macrophages du péritoine de souris non immunes de la même souche que les souris immunisées, en tant que cellules nourricières. Les surnageants d'hybridomes
' ont été criblés en utilisant la technique ELISA décrite plus haut. Des surnageants positifs ont été testés pour leur capacité d'accrochage aux antigènes de surface de membrane plaquettaire marqués, selon le protocole décrit dans la partie "Immunoprécipitation", ainsi que pour leur capacité d'accrochage sur des antigènes de membrane plaquettaire non marqués, transférés sur des membranes Immobilon selon le protocole décrit dans "Immunoblot". Des puits positifs ont été clones et sous-clonés par dilution limitée et criblés à nouveau en utilisant les mêmes techniques avant la production d'ascites dans les souris BALB/c traitées avec du pristane. Des immunoglobulines monoclonales ont été purifiées par la méthode Ey et al. (1978) Immunochemistry 15, 429-436 en utilisant une chromatotraphie d'affinité sur protéine A- sépharose. Les fragments F(ab')2 d'un anticorps monoclonal ont été préparés conformément à la technique décrite Lamoyi et al (1986) Methin Enzym, vol 121, p 652-663, Acad. Press INC. c.2) Préparation de l'anticorps LYP20
L'anticorps monoclonal LYP20a ont été obtenus après immunisation de souris BALB/C avec des plaquettes de sang humain traitées à la chymotrypsine et lavées.
Le traitement à la chymotrypsine (0,2 mg/ml/109 plaquettes) a été fait pendant 30 minutes à 37"C. Les plaquettes ont ensuite été lavées. Les plaquettes traitées à la chymotrypsine (1 x 108 plaquettes/100 ml) ont été mélangées avec un volume égal (100 ml) d'adjuvant complet et injectées intrapéritonéalement à des souris BALB/C. Les souris ont été immunisées 3 fois en 3 semaines avec les plaquettes ainsi traitées. Puis ces souris ont été laissées au repos pendant un mois avant de surbir un rappel avec les plaquettes traitées à la chymotrypsine. Trois jours après les cellules spléniques (de la rate) ont été prélevées et fusionnées avec des cellules Sp2/O.Ag4 selon la technique décrite précédemment pour préparer les anticorps LYP21. Les surnageants de fusion obtenus avec les plaquettes traitées à la chymotrypsine ont été sélectionnés pour leur capacité à inhiber les fonctions plaquettaires. Immunoprécitation L'immunoprécipitation a été réalisée selon la méthode décrite par McEver et al (1984) J. Biol. Chem. 259, 9799-9804. Les plaquettes ont été activées (lU/ml de trombine pendant 10 minutes, suivi par 10'- PPACK pendant 10 minutes) préalablement à une iodation, solubilisées dans 0,01M Tris-HCl, 0,15M ï'aCl, ImM EDTA, contenant 1% de lubrol PX (ta on S) et microcentrifugées. Les surnageants marqués ont été incubés avec soit le surnageant d'hybridomes, soit le fluide d'ascite ou l'anticorps purifié pendant 2 heures à température ambiante, sous agitation constante. 10 μl d'anticorps purifié anti-souris de lapin, dilué selon un rapport 1/10 dans le tampon S ont été ajoutés à chaque échantillon et placé sur un agitateur à balancier à température ambiante pendant 30 minutes. La protéine A sepharose (10% dans le tampon S) a été incubée (1 volume de lysat pour 2 volumes de protéines A) avec chaque échantillon, sur un agitateur à balancier pendant 30 minutes à température ambiante. Une centrifugation a ensuite été réalisée à 9.000 g pendant 2 minutes dans une centrifugeuse Eppendorf. Chaque culot de centrifugation a été lavé 4 fois dans le tampon S. Après le dernier lavage, chaque culot a été resuspendu dans 0,4 ml de tampon Laemmli fl970) Nature 227, 680-685, puis chauffé à 100"C pendant 5 minutes. Une partie aliquote de chaque échantillon a été réduite en présence de 0.04M DTT. Tous les échantillons ont été ensuite microcentrifugés et le surnageant a été conservé à -70*C.
SDS-PAGE et immunoblot
Une électrophorèse sur gel en une dimension a été réalisée selon la méthode de Laemmli. La technique
SDS-PAGE en deux dimensions (non réduit/réduit) a été réalisée selon la méthode de Phillips et Al. (1977) J.
Clin. Invest. 60, 535-545. Les gels ont été colorés à l'argent selon la méthode de Merril et Al. (1982)
Electrophoresis, 3, 17-23.
Les gels et les membranes Immobilon ont été équilibrés dans 0.025M Tris, 0,192 M glycine, à pH8,3, pendant 30 minutes avant de réaliser un western blot.
Les protéines ont été transférées par électrophorèe selon la méthode de Towbin (1979) Proc. Acad. Sci.
U.S.A. 76, 4350-4354, à partir du gène vers la membrane Immobilon en utilisant un appareil miniblot 37 de BioRad à 100 V pendant une heure. Après le transfert, la membrane a été laissée pendant 30 minutes dans un tampon TBS (0,02 M Tris, 0,05 M NaCl, pH 7.5) contenant 0,05% (w/v) tween-20 et 3% (w/v) de 5 gélatine pour bloquer les sites de liaison non spécifiques. Les bandes Immobilon ont été coupées et placées dans un tube contenant soit le surnageant d*hybridomes, soit le fluide ascitique soit l'anticorps purifié. Chaque tube a été soumis à
***° réaction sur un bloc pendant une heure à température ambiante. Les bandes ont ensuite été lavées trois fois dans un tampon TBS contenant 0,05% (w/v) de Tween-20 et 1% (w/v) de gélatine. Ils ont ensuite été incubés pendant 30 minutes en présence de peroxidase de
15 raifort conjuguée à des anticorps anti-souris de
" chèvre, dilués à 1/3000 dans un tampon tween TBS avec
1% de gélatine. Toutes les bandes ont été lavées et une fois dans un tampon TBS-tween et deux fois dans le
TBS. Le substrat a été préparé rapidement en utilisant
20 60 mg de réactif de développement de couleur HRP dans 20 ml de méthanol à température de la glace, 100 ml de TBS et 60μl de 30% de H202. La réaction a été arrêtée en rinçant les bandes avec de l'eau distillée.
5 Etude de la fixation des plaquettes
Le nombre d'anticorps monoclonaux LYP20 ET LYP21 marqués avec I-125 fixés à des plaquettes non stimulées et à des plaquettes stimulées (par l'ADP et la thrombine) ont été testés selon la méthode par 0 McGregor et Al. (1986) Eur. J. Biochem. 159, 443-449. Lorsque la thrombine (lU/ml) a été utilisée, son activité a été bloquée avec 10*6 M PPACK avant l'addition des autres réactifs. Les plaquettes non stimulées et stimulées ont été incubées avec 5 différentes concentrations des anticorps monoclonaux 38 marqués P20 ou P21 (0,1 à 4μg/ml) pendant 30 minutes à 25* C. Ensuite 50μl de la suspension ont été repris et étalés sur des tubes Eppendorf 400 μl contenant 300 μl de 20% (w/v) sucrose et 2% (w/v) BSA dans une solution.
Les tubes ont été centrifugés dans une microcentrifugeuse Eppendorf, pendant 6 minutes. Les extrémités des tubes de centrifugation ont été coupées et la quantité d'anticorps marqués avec l'iode 125 (I125) fixés a été déterminée avec un compteur gamma. La fixation non spécifique a été réalisé par l'addition d'anticorps non marqués concentrés 100 fois. Le nombre de sites de fixation et la constante de dissociation (CD) ont été déterminés par analyse Scatchard.
Agrégation et Sécrétion plaquettaires Des études d'agrégation ont été réalisées avec des plaquettes lavées traitées avec la sérotonine C selon la méthode de Greenberg et al. (1979...). Les plaquettes, ajustées à 2 x 108 plaquettes/ml ont aggrégé avec 2,5 μM ADP, 2μg/ml de collagene ou 0,016 U/ml de thrombine en présence ou à l'absence soit de l'anticorps monoclonal P20 soit de l'anticorps monoclonal P21, (anticorps monoclonal complet ou fragment F(ab) *2) . Après chaque agrégation, la suspension a été microcentrifugée et 100 μl de surnageant ont été passés dans un compteur-,9 pour mesurer le niveau de sécrétion.
Adhésion plaquettaire
Les études d'adhésion ont été réalisées sur des plaquettes lavées traitées avec du 51Cr (0,1 mCi par 5 x 109 plaquettes) selon la méthode décrite par Cazenave et al. (1979...), PGE, (20 ng/ l) a été 39 ajouté à une solution de Tyrode pendant toute la procédure. Les puits plastiques ont été recouverts avec 100 μl de BSA (0,5 %) , de la fibronectine (2 μg/ml) , du fibrinogène (2 μg/ml) ou du collagene (2 μg/ml) dans 25 M de tampon de bicarbonate à pH 9,5 pendant 3 heures à 37"C. Les puits ont été bloqués pendant 90 minutes à température ambiante avec 1 % de BSA. Les plaquettes ajustées à hauteur de 5 x 108 cellule/ml ont été préincubées avec soit l'anticorps monoclonal P20 ou l'anticorps monoclonal P21 (10 μg/ml) à 37*C pendant une heure. La suspension de plaquettes préincubées (100 μl) a été ajoutée à chaque puits et soumise à réaction à 37"C pendant une heure. Tous les puits ont été lavés soigneusement dans une solution de Tyrode afin d'enlever les plaquettes non accrochées. Les puits ont ensuite été séparés et soumis un comptage individuel sur compteur gamma.
RESULTATS Isolement des glycoprotéines de membranes plaquettaires
Des extraits de plaquettes obtenus après traitement avec un détergent ont été solubilisés dans 1 % de DOC et soumis un chromatographie d'affinité (WGA) en présence de 0,5 % DOC à pH 8,6. Aucune glycoprotéine du complexe GPIIb-IIIa n'était présente dans la fraction éluée comme le montrent les analyses SDS-PAGE et ELISA. Après dialyse contre 0,1 % de Lubrol WX, cette fraction a été appliquée sur une colonne Q d'échange d'anions à flux rapide, et éluée dans du NaCl. Le premier pic contient quatre protéines comme le montre le résultat de SDS-PAGE. Les poids moléculaires étaient respectivement de 85, 120, 130 et 150 kD dans des conditions non réductrices et 85, 125, 140 et 155 après réduction. Aucune glycoprotéine GPIb n'était présente dans cette fraction comme le montre la détection après coloration à l'argent du gel. Cependant, la GPIb était présente dans le pic n* 3. La première fraction a été sélectionnée pour immuniser les souris de façon à produire des anticorps monoclonoaux spécifiques pour les quatre antigènes de membrane plaquettaire.
Production anticorps monoclonaux Des surnageants d'hybridomes ont été criblés avec un mélange de 4 glycoprotéines en utilisant la technique ELISA. Plusieurs surnageants ont présenté une réaction vis à vis du mélange d'antigènes. Les anticorps sélectionnés P20 et P21, _ont été purifiés sur Sepharose protéine A et ces deux anticorps ont été caractérisés comme étant des lgG_ puisqu'ils sont été élues à pH 6.
Identification de l'antigène plaquettaire reconnu par P20 et P21
Les lysats de plaquettes marquées immunoprécipités par P20 et P21 ont été comparés dans la méthode SDS-PAGE, à ceux immunoprécipités par l'anticorps S12 dirigé contre la GMP-140 et décrit par McEver dans la publication déjà citée. Une autre comparaison a été faite vis-à-vis de l'anticorps monoclonal spécifique du complexe GPIIb-IIIa. Des autoradiogrammes (Fig. 3) montrent clairement que l'antigène reconnu par P20 n'est ni la GPIIb ni la GPIIIa. Le poids moléculaire apparent de cet antigène a été estimé à environ 130 kD (non-réduit) et 140 kD (réduit). L'antigène reconnu par P20 migre en même temps que l'antigène immunoprécipité par un anticorps S12 de McEver qui ne présente aucune réaction de modulation des fonctions plaquettaires. Les mêmes résultats ont été obtenus avec P21.
Ce résultat a été confirmé par une analyse Western blot. L'anticorps monoclonal P20 s'accroche spécifiquement à 1'antigène dans des conditions dénaturantes non-réductrices. Le poids moléculaire apparent de la tache était estimé à 128 kD. Cependant, P21 a reconnu l'antigène dénaturé dans des conditions non-réductrices et réductrices (Fig. 4) .
Accrochage de l'anticorps P20 aux plaquettes lavées
Des plaquettes lavées (4 donneurs) ont accroché 2.400 266 molécules d'anticorps P20 marqués, par plaquette non-stimulée (1^=2,3nM ± 0,54) et 12.200 ± 1184 molécules d'anticorps P20 marquées par cellule après stimulation avec la thrombine (Kj-≈Sn ± 0,61) (Fig. 5, 6). L'anticorps marqué P21 n'a reconnu ni les plaquettes au repos ni les plaquettes stimulées.
Effet des anticorps P20 et P21 sur l'adhésion plaquettaire
Ni P20 ni P21 n'ont un effet siqnificatif sur 1*adhésion des plaquettes présentes sur des puits plastiques recouverts de fibronectine, de fibrinogène ou de collagene (Fig. 7) .
Effet de P20 et P21 sur l'agrégation plaquettaires et la sécrétion
P20 inhibe partiellement l'agrégation induite à l'ADP (60 %) , au collagene (63 %) et à la thrombine (50 %) comparée au contrôle. Des fragments Fab de P20 permettent l'obtention des mêmes résultats (Fig.8). P20 permet aussi la réduction de la sécrétion plaquettaire induite par le collagene et la thrombine. P21 n'a pas d'effet sur l'agrégation plaquettaire. DISCUSSION
Des anticorps monoclonaux dirigés contre la GMP-140 des plaquettes solubilisées ont été produits. Ces anticorps P20 et P21 testés par immunoprécipitation ont montré qu'ils présentent une spécificité pour 1'antigène de membrane plaquettaire également reconnu par l'anticorps S12 de McEver. Cependant, à la différence de l'anticorps S12, P20 et P21 sont dirigés contre un épitope confor ationel de la GMP-140. De plus, P20 est actif sur les fonctions plaquettaires. Une autre caractéristique de ces anticorps est qu'ils reconnaissent la GMP-140 dénaturée comme le montrent les résultats positifs de Western blot. P20 reconnaît uniquement la GMP-140 non-réduite alors que P21 reste actif contre la GMP-140 réduite. Ces résultats suggèrent que le site de liaison du P20 contient des ponts disulfure. En revanche, le site de liaison de P21 ne contient probablement pas de ponts disulfure. On peut conclure à ce stade que P20 et P21 sont spécifiques d'épitopes différents sur la GMP-140 plaquettaire.
Les plaquettes au repos lavées ont permis de fixer environ 2000 molécules d'anticorps P20 marqué avec l'iode. Après activation des plaquettes avec l'alpha-thrombine, les plaquettes ont accroché environ 12 000 molécules d'anticorps P20 marqués. L'activation à l'ADP n'a pas accru la liaison des anticorps P20. Les plaquettes ont probablement été légèrement activées pendant les étapes de lavage bien que PGE-* et PPACK aient été ajoutées au niveau du premier lavage.
Les anticorps P21 marqués ne s'accrochent ni aux plaquettes au repos ni aux plaquettes stimulées avec la thrombine. Des expériences de contrôle sur des échantillons de P21 ont été réalisées afin de vérifier la réactivité de P21 vis-à-vis de la GMP-140 solubilisée. Ces résultats se sont avérés positifs. On en conclut que P21 ne s'accroche pas à des plaquettes entières qu'elles soient activées ou non, l'épitope reconnu par P21 n'étant en pas accessible sur la 3 membrane native de la GMP-140. Le site de liaison de P21 pourrait être exprimé soit sur la face cytoplasmique de GMP-140, cette séquence demeurant cytoplas ique après 1'activation et 1'expression des alpha-granules au niveau de membrane. On pourrait
10 également penser que l'accrochage de P21 n'est pas possible à cause de la conformation de la GMP-140 native qui masque l'épitope de P21. Cependant, P21 réagit avec des plaquettes entières solubilisées dans le Triton X-100 et soumises à une immunoélectrophorèse
_o croisée, conditions qui ne sont apparement pas . dénaturantes.
P20 inhibe partiellement l'agrégation plaquettaire et la sécrétion. S12 est connu pour son absence d'effet au niveau de 1'agrégation
-**0 plaquettaire. Ceci confirme bien que S12 et P20 sont dirigés contre des épitopes différents. L'effet inhibiteur de l'anticorps P20 sur l'aqrégation plaquettaire induite par la thrombine ou le collagene est tout à fait en accord avec la localisation de la
25 GMP-140 à l'intérieur de la membrane des alpha- granules. Après activation avec la thrombine ou le collagene la membrane des alpha-granules fusionne avec la membrane plasmatique des plaquettes et la GMP-140 devient un récepteur de surface. De plus, la sécrétion
30 de Sérotonine C est affectée par la présence de P20.
EXEMPLE 5:
Recherche de la présence de glycoprotéine gpIIb-IIIa- like sur des tissus normaux et des tissus 5 néoplastiques, grâce à des anticorps LYP18 Matériels et méthodes Etudes de tissus
Des tissus normaux, anormaux et des tissus présentant des lésions bénignes de la peau ont été obtenus auprès du Département de Pathologie et du Dermatologie à l'université de Stanford au centre médical. 16 échantillons des tissus normaux d'organes sélectionnés (tableau 1) et 96 biopsies de tumeurs (tableau 2 et 3) ont été obtenus auprès du département de pathologie. Les biopsies de tumeur comprennent 21 cas de mélanome malin présentant des métastases au niveau des ganglions lymphatiques, 20 cas de lymphomes n'appartenant pas à la catégorie des lymphomes Hodgkin (1 petit ly phocytaire, 5 lymphomes folliculaires divisés. 3 lymphomes folliculaires mixtes, 3 lymphomes diffus, 2 lymphomes diffus à large cellule, 1 lymphome immunoblastiques à grande cellule, 3 lymphomes petits non-divisés et 2 lymphoblastiques) , 4 cas de maladie de Hodgkin, 2 cas de thymone, 28 cas de carcinomes comprennant 19 cas de carcinomes primaires (sein 6, ovaire 4, oropharynx 3, poumon 2, colon 2, estomac l, thyroide 1) , 9 cas de carcinomes métastasiques dans les ganglions lymphatiques (3 adénocarcinomes, 3 squameux, 3 faiblement différenciés) , 7 tumeurs neuroendocrines (4 carcinomes du poumon, 2 tumeurs des ilôts pancréatiques et un carcinome médullaire de la thyroide), 1 cas dysgerminome des ovaires, 10 cas de sarcomes (5 ostéosarcomes, 3 sarcomes d'Ewing et 2 histiocytomes fibreux maligne) et 3 cas de neuroblastomes. 13 cas de lésions bénignes de la peau ont été obtenus au département de dermatologie comprennant 9 nevis (1 jonction, l composé, 2 dermiques, 2 displastiques et 3 congénitaux) , 3 lentigo-éphélides et 1 dermatofibrome. Anticorps monoclonaux
Les anticorps monoclonaux LYP2 et LYP18 ont été sélectionnés pour réaliser les expériences ci-après. LYP2 (IgG!) et LYP18 (IgG2a) ne croisent pas lors d'une immunoélectrophorèse croisée avec les glycoprotéines de plaquettes Ilb ou Illa séparées par l'EDTA mais reconnaissent un déterminant présent sur le complexe glycoprotéique Ilb-IIIa intact calcium médié (McGregor et al, Eur J Biochem 1986, 159: 443-449) . LYP2 et LYP18 ont été purifiés à partir de fluide d'ascite sur une colonne protéine A-Sepharose 4B comme décrit dans la référence McGregor et al prédédemment cité, à des concentrations s 'étalant dans un intervalle de 1,0 à 1,5 g/ml et en utilisant une dilution de 1:200. L'anticorps monoclonal dirigé contre une glycoprotéine Illa de plaquette (IgG.,) a été obtenu auprès de Dakopatts (Santa Barbara, CA) sous forme d'un surnageant de culture puis utilisé à une dilution de 1:50. L'anticorps monoclonal purifié Leu 9 (CD7) (IgG2a) a servi d'anticorps contrôle à une dilution de 1:200 et a été obtenu de Becton-Dickinson (Mountain View, CA) .
Marquage immunohistologique Tous les tissus normaux, anormaux ainsi que les spécimens présentant des lésions bénignes de la peau ont été gelés, traités dans la même façon et colorés comme décrit par Bindl (Am J Clin Pathol 1986,85 : 490-493) . En bref, des sections de cryostat séchées à l'air, fixées avec de l'acétone (4-5 μm) ont été incubées pendant 30 minutes dans une chambre humidifiée, avec les différents anticorps monoclonaux. Les sections ont ensuite été incubées par série (avec des lavages dans un tampon salin de phosphate entre les incubations dans un récipient de Coplin contenant des i munoglobulines anti-souris de chèvres biotinylées (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) . Puis ces sections ont été traitées avec de la peroxidase de raifort conjugée avec de la streptavidine (Jackson) , chaque incubation durant 30 minutes à 4°C. La coloration a été développée avec 3 mq/ml 3,3 diamino-benzidine (Siq a Chemical Co/, St Louis, MO) et 0,3 % de peroxide d'hydrogène, pendant 5 minutes à température ambiante. Après coloration du produit de réaction avec de sulfate de cuivre 0,5 % dans du NaCl IN pendant 5 minutes, les sections ont été lavées, colorées avec 2 % de bleu de méthylène, déshydratées et recouverts d'une lamelle. Pour l'étude de la lésion dérivée de élanocyte pigmenté, la phosphatase alkaline conjugée avec la streptavidine (Jackson) a été substituée à la peroxidase et la coloration a été réalisée dans un Fast Red Sait (FRS, Sigma) pendant 20 minutes comme décrit précédemment.
Résultats
LYP18 colore fortement les mégacaryocytes dans la moelle osseuse, les plaquettes, ainsi que les capillaires recouvrant les cellules endotheliales, les vénules et les artérioles présents dans des tissus normaux. L'anticorps monoclonal LYP18 présente éqalement une forte réaction de coloration avec i'épithélium glomérulaire des glandes endométriques et colore faiblement les cellules des muscles lisses. Cependant, un grand nombre de tissus normaux, provenant de différents ' organes n'a pas été coloré avec l'anticorps monoclonal LYP18 (tableau 1). Les anticorps monoclonaux LYP2 ont coloré les mégacaryocytes et les plaquettes avec la même intensité que LYP18 mais ils n'ont pas présentés de liaison avec les autres tissus normaux. L'anticorps monoclonal de contrôle Dako, dirigé contre la gpllla colore fortement les mégacaryocytes, les plaquettes, 1•épithélium glomérulaire et les glandes endométriques mais colore faiblement les cellules endotheliales et les cellules du muscle lisse. Parmi les cellules normales d'un type donné, on observe pas de variation significative de 1'intensité du nombre de cellule coloré par ces 3 anticorps monoclonaux.
Parmi les 21 cas de mélanomes étudiés, 16 (75%) ont donné lieu à une réaction avec l'anticorps LYP18. Les anticorps monoclonaux LYP18 produisent une coloration variable au niveau des mélanomes. A l'exception d'un seul cas de coloration très faible, on a remarqué aucune variation de cellule à cellule dans 1'intensité de la coloration pour chaque cas particulier. LYP18 présente une image cytoplasmique faible et diffuse avec une coloration renforcée au niveau de la membrane périphérique. Les intensités de coloration et le pourcentage de mélanomes liés avec l'anticorps Dako anti-gpllla est identique à la coloration obtenue avec LYP18.
LYP2 ne s'accroche pas au mélanome malin métastasique. En revanche les mélanocytes normaux présents au niveau de la peau, de lentigines, des dermatofibrornes, et des mélanocytes activés formant un nevi, qui comprennent des mélanocytes de types de jonctionnel composé, dermique, displastique et congénital ne permettent pas 1'accrochage des anticorps LYP18, LYP2 ou Dako anti-gpllla (tableau 2). Parmi les 75 tumeurs non mélanocytiques, seulement 3 (4%) ont entraîné une coloration pour LYP18 (voir tableau 3) : un carcinome des papilles thyroïdiennes métastasiques, un adénocarcinome endométrique primaire des ovaires, très faiblement positif, et un osteosarcome faiblement positif. 96% (72 parmi 75) n'ont pas présenté d'accrochage de LYP18. Les anticorps Dako anti-gpllla se sont accrochés à différentes tumeurs, de la même façon que le LYP18. LYP2 n'est pas lié aux différentes tumeurs étudiées.
Discussion
Ces études démontrent la présence de glycoprotéines IIB-IIIa-like sur les cellules de mélanomes malins métastasiques et l'absence de ces complexes glycoprotéiques sur des mélanocytes bénins. Des sections congelées de biopsies de mélanomes n'ont pas été reconnues par d'autres anticorps monoclonaux (LYP2) également dirigés contre le complexe plaquettaire Ilb-IIIa mais ont reconnu 1'anticorps monoclonal anti-gpllla Dako, ce qui suqgère que l'un des composants du complexe intégrine sur les mélanomes malins métastasiques est la gpllla. L'absence de reconnaissance par LYP2 pourrait indiquer des différences de structure entre les glycoprotéines Ilb-IIIa-like des mélanomes et le complexe plaquettaire.
La présence de glycoprotéines Ilb-IIIa-like encore désignées par cytoadhésines sur les cellules des mélanomes malins mais pas sur des cellules de mélanocytes bénins, peut être interprêtée comme l'expression aberrante d'antigène ayant lieu lors du processus de passage à l'état malin. Les cytoadhésines présentes sur les mélanomes peuvent donner aux cellules malignes des propriétés qui peuvent faciliter 1'invasion métastasique et peuvent également expliquer leur interaction avec les protéines adhésives de la matrice extracellulaire et avec d'autres cellules du sang. La raison pour laquelle un quart n'a pas été reconnu par LYP18 n'est pas claire. Il est possible que les cellules tumorales n'aient pas synthétisé ces glycoprotéines ou que les antigènes aient été exprimés mais à un niveau non détectable. Si la première hypothèse est correcte, elle peut impliquer le fait que l'expression des glycoprotéines de Ilb-IIIa-like n'est pas un facteur essentiel pour l'établissement de métastases dans les mélanomes malins. Parmi les différents néoplasmes n'appartenant pas au type des mélanomes, seulement 4% présentaient une liaison avec LYP18. La réactivité de LYP18 avec 3 sur 75 néoplasmes non élanocytiques malins, pourrait être due à la synthèse d'antigènes Ilb-IIIa-like par ces tumeurs. Une autre hypothèse peut être que ce même épitope est présent sur une molécule différente ou qu'une coloration non spécifique a eu lieu. L'absence de réactivité de LYP18 avec une grande majorité des tumeurs non mélanocytiques étudiée suggère que 1•expression aberrante des glycoprotéines Ilb-IIIa- like n'est pas universelle parmi les cellules malignes, y compris celles qui présentent des sites métastasiques.
Tableau I
Réactivité de LYP18 aux sections congelées de tissus normaux
Tissus Coloration des types cellulaires *
Moelle osseuse meqacaryocites Amygdales 0
Thymus 0
Rate 0
Ganglion lymphatique o
Sang périphérique 0
Foie 0
Reins épitheliu glomérulaire Peau 0
Estomac 0
• Thyroide 0
Poumon 0
Prostate 0
Seins 0
Utérus glandes endometriales
Tous les tissus présentent une réctivité de LYP18 avec les cellules endotheliales et avec les plaquettes dans les sections de tissus.
Tableau 2 : Fixation de LYP18 aux mélanomes et aux mélanocytes normaux sur des sections congelées.
Lésions Nombre de réactions/Nombre testés
Mélanomes 16/21 (75%)
N. Mélanocytes
Peau normale 0/2
Len igines 0/3
Dermatofibrome 0/1
Nevi 0/9
Tableau 3 :
Réaction de LYP18 avec des sections congelées de différentes tumeurs
Types histopathologiques Nombre de réactions/ Nombre testés
Lymphomes non hodgkiniens 0/20 stade initial 0/9 stade intermédiaire 0/5 stade avancé 0/6
Maladie de hodgkin (MCHD) 0/4
Thvmomes 0/2
Carcinomes metastatiques malpighien 0/8 glandulaire 1/3,
Tumeurs neuroendocrines bien différentiées 0/3 mal différentiées 0/4
Sarcomes osteosarcome 1/5 sarcoe Erwing 0/3
M.F.H 0/2
Autres neuroblastome 0/3 dygermonome 3/75 EXEMPLE 6
Inhibition in vivo de la croissance des mélanomes humains par l'anticorps LYP18 dirigé contre le complexe qlvcoprotéique Ilb-IIIa. Dans cette expérience on a testé la fixation de 1'anticorps monoclonal LYP18 dirigé contre la glycoprotéine Ilb-IIIa des plaquettes humaines sur une lignée cellulaire de mélanome humain fortement tumorigène (M3Dau) . Les résultats de ce test montrent que les cellules de mélanome M3Dau se fixent spécifiquement aux anticorps LYP18 marqués à 135I. Pour étudier le rôle biologique des glycoprotéines Ilb- IIIa-like présentes en surface de mélanomes, une lignée de cellules de mélanome M3Dau a été incubée avec LYP18 , ou avec un anticorps monoclonal de contrôle dirigé contre d'autres antigènes de surface de cellules de mélanome, puis implanté selon un mode sous-cutané chez des souris nude. Les résultats montrent que LYP18 inhibe considérablement la croissance de tumeurs in vivo. LYP18 n'est pas directement cytotoxique vis-à-vis des cellules de mélanome. Ces résultats démontrent que la glycoprotéine gpIIb-IIIa-like est présente sur des cellules de mélanome et joue un rôle important dans la croissance des cellules tumorales. Il est donc possible de penser à l'utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre certains récepteurs cytoadhésifs de tumeurs pour le traitement des tumeurs.
MATERIELS ET METHODES
- Cellules
Les lignées cellulaires M3Dau ont été obtenues à partir d'une métastase acromique de la peau d'un patient présentant des mélanomes malins et les études d'immunofluorescence ont été réalisées comme rapporté précédemment.
- Immunoprécipitation par LYP18
Des cellules confluentes de mélanome ont été marquées en surface avec 125I ou ont été marquées métaboliquement avec la méthionine 35S pendant 24 heures. Les lysats de cellules de mélanome extraits avec le triton X100 ont été immunoprécipités avec LYP18 ou avec une IgG de souris non immune, puis
10 analysés par électrophorèse sur gel de SDS (SDS-PAGE) comme décrit précédemment. LYP18 ne se fixe pas à la gpllb ou à la gpIII des plaquettes séparées par EDTA, d'après un résultat d'immunoélectrophorèse croisée, mais se fixe à un déterminant présent sur le complexe gpIIb-IIIa intact, édié par le calcium.
- Fixation de LYP18 sur des cellules de mélanome
Les cellules de mélanome humains poussant jusqu'à confluence ont été détachées des plaques de culture par la trypsine-EDTA ou par l'EDTA, puis resuspendues
•*-0 dans un milieu RPMI 1640 contenant BSA 2mg/ml. Des concentrations croissantes de LYP18 125I ont été ajoutées et incubées pendant une nuit à 4°C. Une fixation non spécifique de LYP18 marqué a été obtenue en utilisant un excès (100 fois) de LYP18 non marqué.
25 Le nombre de sites de fixation par cellule et la constante de dissociation ont été obtenus par analyses à l'aide d'un proqramme informatique désigné par "double-réciprocal plots and least-squares analysis". - Effet de LYP18 sur la croissance des mélanomes
30 tumoraux chez des souris.
200 microlitres de cellules M3Dau 1.106 ont été greffées de façon sous-cutanée sur le ventre de souris nude après pré-incubation pendant 20 minutes avec l'anticorps LYP18 purifié, ou avec un anticorps G7A5
35 (dirigé contre un antigène de surface des cellules de mélanome différent de la gpIIb-IIIa-like) ou une IgG2a de souris non immune (même isotype que LYP18) à une concentration finale de 35μg/ml. Les tailles des tumeurs à différents moments ont été exprimées sous forme de la moyenne de la somme des diamètres opposés. Dans des études réalisées après la transplantation, LYP18 a été injecté 2, 14 et 21 jours après l'implantation de la tumeur. Dans ces expériences, 5 souris ont été utilisées pour chaque test.
RESULTATS
L'anticorps LYP18 présente une capacité de fixation sur des cellules de mélanome M3Dau. A partir de lysats de cellules de mélanome marquées en surface avec 125I, LYP18 a immunoprécipité deux protéines présentant le même poids moléculaire apparent que la glycoprotéine gpllb et la glycoprotéine gpllla des membranes plaquettaires avec des changements caractéristiques dans la mobilité lors d'une réduction. Les études de marquage métabolique ont confirmé que la gpIIb-IIIa-like était synthétisée par ces cellules. Ces résultats démontrent clairement que la liqnée M3Dau synthétise et exprime des protéines sur sa surface, protéines qui sont immunologiquement liées aux glycoprotéines gpIIb-IIIa des plaquettes. Pour déterminer le nombre de molécules gpIIb-IIIa-like exprimé à la surface des cellules de mélanome, des études de fixation de LYP18 marqué avec 125I ont été réalisées. La fixation de LYP18 aux cellules de mélanome M3Dau était spécifique, dépendait de la concentration et était saturable avec environ 337.000 ± 61.200 molécules par cellule (moyenne ± déviation standard) et une constante de dissociation (kd) de 6,8nmol/l. Les cellules de mélanome M3Dau poussent après injection sous cutanée chez des souris nude et produisent des masses tumorales aux sites d'implantation. Elles ont été utilisées comme modèle pour étudier 1'invasion locale des cellules tumorales à travers la membrane basale
Le rôle biologique de la gpIIb-IIIa-like au niveau des cellules M3Dau a été étudié en incubant des cellules de mélanome avec une quantité saturante de LYP18 (7 μg/106 cellules dans 200μl aliquotes) , en injectant le mélange de façon sous-cutanée à des souris nude et en suivant la croissance des tumeurs in vivo. Des contrôles ont été réalisés avec les deux anticorps décrits ci-dessus G7A5 et IgG2 non immuns de souris de même isotype que LYP18, à la même • concentration que LYP18. La croissance des tumeurs de M3Dau chez les souris de contrôle est palpable après 20 jours et mesurable après 26 jours. Avec 1'addition de LYP18, la croissance des tumeurs de M3Dau n'est pas visible ou palpable après 26 jours et devient mesurable après 40 jours(figure 8). En augmentant le temps d'incubation à plus de 50 jours, on obtient de petites tumeurs visibles, à croissance plus lente que celles des contrôles et visibles uniquement chez l'une des 5 souris(figure 8). Un degré similaire d'inhibition de la croissance des tumeurs par LYP18 a été observé même lorsque plus de cellules de mélanome (2 x 106 cellules) ont été utilisées. L'absence d'effet causé par les anticorps G7A5 anti-mélanome suggère que 1'inhibition observée avec LYP18 in vivo n'était pas due à une cytotoxicité dépendante du complément ou à une opsonization.
L'étude de la possibilité pour LYP18 d'avoir un effet cytotoxique direct sur les cellules de mélanome a été réalisée en préincubant ces cellules avec un excès de LYP18 (70μg/ml) et en suivant la viabilité des cellules et de leur croissance. Aucune perte de viabilité cellulaire des mélanomes n'a été détectée avec l'exclusion par le bleu trypan. De plus, les cellules traitées par l'anticorps contrôle et par LYP18 présentent un degré similaire de rétention de thymidine-3H et de croissance cellulaire in vitro. Les études après transplantation ont permis de déterminer si LYP18 inhibait la croissance tumorale dans le cas d'une injection après l'implantation de la tumeur. LYP18 injecté deux jours après la greffe de cellules tumorales montre un effet inhibiteur de 50% de la croissance tumorale. Cependant, l'injection de LYP18 au jour 14 ou 21 ne montre aucune réduction significative de la croissance tumorale comparée au résultat obtenu avec le contrôle (figure 9) .
DISCUSSION
Cette étude démontre que les glycoprotéines Ilb- IIIa-like sont synthétisées et présentes sur une lignée cellulaire de mélanome humain et jouent un rôle fondamental dans la croissance tumorale des cellules. L'utilisation d'une chromatographie d'affinité sur RGDS-sépharose a révélé deux protéines de poids moléculaires similaires à celui des glycoprotéines de plaquettes gpIIb-IIIa dans la lignée cellulaire de mélanome M21. Un autre anticorps monoclonal LYP2 également dirigé contre le complexe plaquettaire gpIIb-IIIa ne se fixe pas sur les cellules de mélanome M3Dau ou précipite l'une quelconque des protéines de ces cellules. L'absence de reconnaissance par LYP2 des antigènes de mélanome pourrait indiquer une différence de structure entre les glycoprotéines gpIIb-IIIa-like de la lignée M3Dau et leur contrepartie sur les plaquettes.
La croissance des cellules de tumeurs représente une interaction complète entre les cellules tumorales et leur matrice du stroma. Le stroma d'une tumeur est composé de fibrine, de fibronectine, de laminine, de collagene et d'autres tissus connexes, en plus de vaisseaux sanguins et de cellules inflammatoires. L'anticorps monoclonal LYP18 s'accrochant à la gpllb- Illa-like pourrait bloquer des interactions critiques entre les cellules de mélanome et les cellules de la matrice du stroma, nécessaires pour la survie et la croissance des lignées M3Dau et cette fixation pourrait favoriser l'accès des macrophages et leur activation conduisant à une destruction rapide des mélanomes in vivo. Les études réalisées après la transplantation indiquent que LYP18 est plus efficace quand il est injecté au moment de l'implantation de la tumeur, suggérant que LYP18 interfère avec une ou plusieurs étapes précoces de l'établissement de la tumeur. Les études d'immunocytochimiques réalisées sur des biopsies de tissu congelé en utilisant LYP18 montrent la présence de gpIIb-IIIa-like sur des mélanomes malins métastasiques mais pas sur des mélanocytes humains bénins.
EXEMPLE 7
Inhibition des monocytes transformés, par LYP20.
Dans un premier temps des monocytes transformés U937 ont été incubés pendant 30 minutes avec des plaquettes stiumées avec la thrombine (0,03 U/ml).
A l'issue de cette incubation, on a détecté des rosottes de plaquette stimulées autour des cellules U937. Dans un second temps l'anticorps monoclonal LYP20
(60 μg/ml) a été ajouté aux plaquettes stimulées pendant 5 minutes avec la thrombine. Puis on a ajouté du PPALK de manière à inhiber la thrombine. Ensuite les plaquettes ont été mises en présence des monocytes transformés U937 et incubées pendant 30 minutes.
Le résultat obtenu montre en microscopie que LYP20 inhibe d'environ 50% la formation des rosettes. Par conséquent LYP20 inhibe d'environ 50% l'interaction plaquettes-monocytes transformés.

Claims

REVENDICATIONS 1/ Anticorps monoclonaux, ou les fragments idiotypiques de ces anticorps monoclonaux, reconnaissant la glycoprotéine GMP140 ou le complexe des protéines Ia-IIa impliqués dans les étapes de la physiologie plaquettaire et en particulier dans les réactions d'adhésion et/ou d'agrégation et/ou de sécrétion plaquettaire, et/ou d'adhésion des cellules endotheliales caractérisés en ce qu'ils ont la capacité de moduler les fonctions plaquettaires ou les fonctions' endotheliales induites par une faible concentration d'agonistes, par exemple en présence de 2,5 à 5μM d'ADP ou 2μg/ml de collagene ou 0,016 U/ml de thrombine et en ce que leur capacité d'inhibition sur les fonctions plaquettaires est considérablement réduite, voire absente, en présence de concentrations élevées d'agonistes, par exemple en présence de concentrations en thrombine supérieures à 0,5 U/ml ou en collagene supérieures à lOμg/ml. 2/ Anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope ayant un effet fonctionnel vis à vis de la glycoprotéine GPM140 ou du complexe Ia-IIa et en ce qu'ils sont sensibles à la réduction de l'antigène qui le contient.
3/ Anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope présent sur la GMP140, exposé à la surface des plaquettes activées, les dits anticorps ou leurs fragments idiotypiques étant capables d*interférer avec les réactions d'agrégation et/ou de sécrétion plaquettaire et étant en particulier caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps LYP20 ou d'anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes.
4/ Anticorps monoclonaux , ou leurs fragments idiotypiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope présent au niveau de la glycoprotéine lia, du complexe Ia-IIa, ces anticorps ou leurs fragments idiotypiques ayant la capacité d'interférer avec les réactions d'agrégation plaquettaires et étant en particulier caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps LYP22 ou d'anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes. 5/ Anticorps monoclonaux LYP18 dirigés contre un épitope du complexe Ilb-IIIa à la surface des plaquettes stimulées, anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques ayant les propriétés immunologiques et fonctionnelles de l'anticorps LYP18 lesdits anticorps ou leurs fragments idiotypigues ayant la capacité d'inhiber les fonctions plaquettaires et étant dépourvus de cette capacité en présence d'une forte concentration d'agonistes par exemple de thrombine (supérieure à 0,5 U/ml) ou de collagene (supérieure à lOμg/ml) 6/ Anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques, dirigés contre la glycoprotéine GMP140 présente sur les plaquettes ou relâchée par ces plaquettes à la suite d'un traitement par un agoniste tel que l'ADP, la thrombine ou le collagene et/ou présente sur des cellules endotheliales à la suite d'un traitement avec un agoniste tel que l'ADP, la thrombine ou le collagene ou un agent inducteur caractérisés en ce que après couplage à la protéine A liée de façon covalente à un support et en présence de plaquettes traitées au moyen d'un détergent en présence d'un marqueur radioactif, ils présentent deux bandes de poids moléculaire correspondant aux formes réduites et non réduites de la GMP140, notamment en ce qu'il s'agit des anticorps LYP20 et LYP21. 7/ Anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisés en ce qu'ils sont marqués , le marquage étant de préférence réalisé avec une substance radioactive, notamment 131I, 111In ou WT, ou par une substance fluorescente. 8/ Epitope présent au niveau d'un antigène impliqué dans les étapes de la physiologie plaquettaire et en particulier dans les réactions d'adhésion et/ou d'agrégation plaquettaire et/ou - d'adhésion des cellules endotheliales ledit antigène étant choisi •plus particulièrement parmi les protéines GMP140 la glycoprotéine gplla ou les complexes gpIIb-IIIa, gpla-lla, gplc-lla, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un épitope conformationnel, nécessaire à l'activité dans les réactions ci-dessus de l'antigène qui le contient.
8/ Epitope selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est sensible à la réduction de l'antigène qui le contient. 10/ Epitope selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est reconnu par l'anticorps LYP20. 11/ Epitope selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est reconnu par l'anticorps LYP22. 12/ Epitope selon la revendication 8 ou la revendication 9, a) en ce qu'il est reconnu par le complexe Ilb- Illa de plaquettes humaines. b) en ce qu'il n'est pas reconnu par le complexe Ilb-IIIa de plaquettes de chien. c) en ce qu'il est reconnu par l'analogue du complexe Ilb-IIIa des cellules endotheliales, et en particulier en ce qu'il s'agit de 1*épitope reconnu par 1'anticorps LYP18. 13/ Composition pour le diagnostic de 1•activation plaquettaire chez un sujet susceptible de présenter une thrombose ou pour la localisation d'un thrombus, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux anticorps différents ou leurs fragments idiotypiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ces anticorps étant le cas échéant marqués /de préférence des anticorps dirigés contre des protéines ou glycoprotéines distinctes, en particulier un mélange d'anticorps choisis parmi LYP20, LYP22, LYP18, ou leurs fragments idiotypiques.
• 14/ Composition selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'elle comprend en outre des anticorps monoclonaux, ou leurs fragments idiotypiques, dirigés contre la thrombospondine et de préférence des anticorps du type LYP9 ou/et LYPll.
15/ Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif un anticorps monoclonal ou/et ses fragments idiotypiques, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ou un mélange de ces différents anticorps, ou/et fragments idiotypiques, en combinaison avec un véhicule pharmaceutique acceptable.
16/ Composition pharmaceutique selon la revendication 15, caractérisée en ce que le ou les anticorps, ou fragments idiotypiques, de ces anticorps sont
- soit couplés à une substance anti-coagulante, ou une substance ayant une activité thrombolytique, cette substance pouvant être par exemple le tPa, la streptokinase, 1'urokinase, - soit modifiés au niveau de l'une de leurs chaines idiotypiques de façon à remplacer l'un des fragments ou au moins une partie de ce fragment, par l'une des susdites substances anticoagulantes. 5 17/ Utilisation d'anticorps, ou de leurs fragments idiotypiques, selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3, ou 6 ou d'un mélange de ces anticorps monoclonaux ou de leurs fragments idiotypiques, pour la fabrication d'un médicament
10 destiné au traitement des pathologies liées à des troubles de la physiologie plaquettaire. 18/ Agent capable de moduler les interactions entre des cellules de type monocytes et des plaquettes stimulées, caractérisé en ce qu'il comprend au moins
"•-^ un anticorps monoclonal selon la revendication 2.
• 19/ Agent selon la revendication 18 caractérisé en ce qu'il comprend l'anticorps LYP20.
20/ Composition pour le diagnostic in vitro de la présence de cellules tumorales de mélanomes, 0 caractérisée en ce qu'elle comprend des anticorps LYP18 selon la revendication 5.
21/ Procédé pour la préparation d'anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, 7,comprenant les étapes suivantes :
25 a) fusion de cellules spléniques de souris ayant préalablement été immunisées avec des antigènes purifiés avec des cellules du myélome en présence d'un promoteur de fusion, par exemple le PEG b) culture des hybridomes produits par la fusion 30 dans un milieu HAT en présence de macrophages du péritoine de souris normales, c) criblage du surnageant des hybridomes pour détecter la présence des anticorps recherchés, notamment par la méthode ELISA, 35 d) sélection et clonage, le cas échéant à plusieurs reprises, des hybridomes producteurs des anticorps, ^ e) production d'ascites à partir de souris dans
5 lesquelles ont été transférés les clones positifs pour * la production d'anticorps monoclonaux, f) purification des anticorps monoclonaux obtenus.
22/ Hybridomes producteurs des anticorps monoclonaux 10 selon l'une quelconque des revendications 3, 5 ou 7, caractérisés tels qu'obtenus par fusion des cellules myélomateuses Sp2/0-Agl4 avec des cellules spléniques de souris préalablement immunisées avec des plaquettes de sang humain traitées à la chymotrypsine 15 (0,2mg/ml/109 plaquettes).
23/ Hybridomes producteurs des anticorps monoclonaux selon la revendication 4 caractérisés tels qu'obtenus par fusion des cellules myélomateuses P3 x 63 Ag8 avec des cellules spléniques de souris préalablement 20 immunisées avec un mélange d'antigènes GMP140, glycoprotéines la, le, lia, GP110-115.
25
30
35
PCT/FR1990/000565 1989-07-25 1990-07-25 Anticorps monoclonaux diriges contre des proteines impliquees dans les fonctions plaquettaires, leur application en tant qu'agent diagnostique et therapeutique WO1991001380A1 (fr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR8910016A FR2650186B1 (fr) 1989-07-25 1989-07-25 Anticorps monoclonaux diriges contre des proteines impliquees dans les fonctions plaquettaires. leur application en tant qu'agent diagnostique et therapeutique
FR8910015A FR2650185A1 (fr) 1989-07-25 1989-07-25 Anticorps monoclonaux diriges contre la glycoproteine gmp140, leur production et leurs applications
FR89/10016 1989-07-25
FR89/10015 1989-07-25
FR8910992A FR2650956A2 (fr) 1989-07-25 1989-08-17 Anticorps monoclonaux reconnaissant des glycoproteines ayant un role au niveau des fonctions plaquettaires. leur application en tant qu'agent diagnostique et therapeutique
FR89/10992 1989-08-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1991001380A1 true WO1991001380A1 (fr) 1991-02-07

Family

ID=27251954

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1990/000565 WO1991001380A1 (fr) 1989-07-25 1990-07-25 Anticorps monoclonaux diriges contre des proteines impliquees dans les fonctions plaquettaires, leur application en tant qu'agent diagnostique et therapeutique

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO1991001380A1 (fr)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992010520A1 (fr) * 1990-12-12 1992-06-25 The Blood Center Research Foundation Anticorps monoclonal op-g2 et procede d'utilisation
WO1993006863A1 (fr) * 1991-09-30 1993-04-15 Biogen, Inc. Inhibition du retrecissement vasculaire par l'utilisation d'anticorps anti-padgem
US5610148A (en) * 1991-01-18 1997-03-11 University College London Macroscopically oriented cell adhesion protein for wound treatment
US5629287A (en) * 1991-01-18 1997-05-13 University College London Depot formulations

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0182634A2 (fr) * 1984-11-15 1986-05-28 New England Medical Center Hospitals, Inc. Méthodes diagnostiques utilisant les anticorps
EP0206533A2 (fr) * 1985-06-14 1986-12-30 The Research Foundation Of State University Of New York Fragment d'anticorps monoclonal inhibant les plaquettes
WO1989000200A1 (fr) * 1987-07-08 1989-01-12 Scripps Clinic And Research Foundation Peptides et anticorps empechant l'adherence de plaquettes

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0182634A2 (fr) * 1984-11-15 1986-05-28 New England Medical Center Hospitals, Inc. Méthodes diagnostiques utilisant les anticorps
EP0206533A2 (fr) * 1985-06-14 1986-12-30 The Research Foundation Of State University Of New York Fragment d'anticorps monoclonal inhibant les plaquettes
WO1989000200A1 (fr) * 1987-07-08 1989-01-12 Scripps Clinic And Research Foundation Peptides et anticorps empechant l'adherence de plaquettes

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Blood, Volume 74, No. 1, Juillet 1989, B.S. COLLER et al.: "Collagen-Platelet Interactions: Evidence for a Direct Interaction of Collagen with Platelet GPIa/IIA and an Indirect Interaction with Platelt GPIIB/IIIA Mediated by Adhesive Proteins", pages 182-192 voir page 189, discussion *
CHEMICAL ABSTRACTS, Volume 100, No. 23, 4 Juin 1984, (Columbus, Ohio, US) R. VILELLA et al.: "An Antiplatelet Monoclonal Antibody that Inhibits ADP and Epinephrine-Induced Aggregation", voir page 431, Resume 190025r & Thromb. Haemostasis 1984, 51(1), 93-6 (Eng). *
CHEMICAL ABSTRACTS, Volume 105, No. 9, 1 Septembre 1986, (Columbus, Ohio, US) R.C.L. MILTON et al.: "A Monoclonal Antibody to the Platelet Membrane IIb-IIIa Glycoprotein Complex", voir page 502, Resume 77220r & S. Afr. J. Sci. 1986, 82(5), 261-5 (Eng). *
The Journal of Biological Chemistry, Volume 262, No. 21, 25 Juillet 1987, The American Society of Biological Chemists, Inc., (US), A. SONNENBERG et al.: "A Complex of Platelet Glycoproteins Ic and IIa Identified by a rat Monoclonal Antibody", pages 10376-10383 voir page 10376, Resume *
Tissue Antigens, Volume 33, No. 2, Febrier 1989, Munksgaard, (Copenhagen, DK), Abstracts from 4th International Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens, Vienne, 21-25 February 1989, M.M. METZELAAR et al.: "A new Cluster of Moabs Recognizing a 140 Kd Platelet alpha-Granule Membrane Protein", pages 49-365 voir page 356 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992010520A1 (fr) * 1990-12-12 1992-06-25 The Blood Center Research Foundation Anticorps monoclonal op-g2 et procede d'utilisation
US5610148A (en) * 1991-01-18 1997-03-11 University College London Macroscopically oriented cell adhesion protein for wound treatment
US5629287A (en) * 1991-01-18 1997-05-13 University College London Depot formulations
WO1993006863A1 (fr) * 1991-09-30 1993-04-15 Biogen, Inc. Inhibition du retrecissement vasculaire par l'utilisation d'anticorps anti-padgem
AU678757B2 (en) * 1991-09-30 1997-06-12 Biogen, Inc. Inhibition of vascular narrowing using anti-padgem antibodies

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bardin et al. Identification of the S-Endo 1 endothelial-associated antigen
US6280731B1 (en) Antithrombotic agent and anti-von willebrand factor monoclonal antibody
Castro et al. Development of monoclonal antibodies against the human sodium iodide symporter: immunohistochemical characterization of this protein in thyroid cells
BR112016017649B1 (pt) Polipeptídeo isolado compreendendo substratos de matriptase e de ativador do plasminogênio u e outras porções cliváveis, composição farmacêutica compreendendo o dito polipeptídeo, bem como métodos para produzir e fabricar um polipeptídeo isolado compreendendo uma porção clivável e uso da composição farmacêutica e quantidade terapeuticamente eficaz da dita composição no tratamento de um distúrbio ou doença
JPH03505329A (ja) 心筋梗塞の処置のための方法および治療用組成物
JP2009183303A (ja) Ｉｃａｍ−１に対するヒト化抗体、それらの生成および使用
BE1000611A5 (fr) Anticorps monoclonaux et antigene du carcinome pulmonaire humain a cellules non petites et de certains autres carcinomes humains.
US5034223A (en) Methods for improved targeting of antibody, antibody fragments, hormones and other targeting agents, and conjugates thereof
AU2016250900A1 (en) Therapeutic antibodies and uses thereof
US6251393B1 (en) Conformation-specific anti-von Willebrand Factor antibodies
CN109071629A (zh) 治疗动脉粥样硬化的方法
PT98398A (pt) Processo de preparacao de composicoes farmaceuticas, a base de homologo de d30 de preparacao de um anticorpo anti-(idiotipo d30), de deteccao da quantidade de homologo de d30 em amostras e de deteccao da quantidade de um complexo receptor mac-1:homologo de d30 numa composicao liquida
JP7356727B2 (ja) アクアポリン３（ａｑｐ３）の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ａｑｐ３モノクローナル抗体、及びその使用
LU85366A1 (fr) Methods immunologiques de determination de l&#39;activite metastatique de cellules
WO1991001380A1 (fr) Anticorps monoclonaux diriges contre des proteines impliquees dans les fonctions plaquettaires, leur application en tant qu&#39;agent diagnostique et therapeutique
EP0624201A1 (fr) Production de sous-unites de recepteurs t solubles par co-transfection, utilisations des produits ainsi obtenus
JP2019535753A (ja) 抗ＣＤ３００ｆ抗体およびその利用
FR2658197A1 (fr) Anticorps monoclonaux restreints reconnaissant un peptide associe a un antigene du complexe majeur d&#39;histocompatibilite - applications au diagnostic et au traitement.
FR2650186A1 (fr) Anticorps monoclonaux diriges contre des proteines impliquees dans les fonctions plaquettaires. leur application en tant qu&#39;agent diagnostique et therapeutique
FR2650956A2 (fr) Anticorps monoclonaux reconnaissant des glycoproteines ayant un role au niveau des fonctions plaquettaires. leur application en tant qu&#39;agent diagnostique et therapeutique
CA1335082C (fr) Anticorps monoclonal reconnaissant –-hanp et reactif pour un dosage immunologique d&#39;–-hanp
US7122324B2 (en) Vitro methods for determining in vivo thrombotic events
FR2650185A1 (fr) Anticorps monoclonaux diriges contre la glycoproteine gmp140, leur production et leurs applications
RU2258935C2 (ru) Каталитические аллоантитела к фактору viii
EP0252787A1 (fr) Polypeptides de surfaces cellulaires, isolés et purifiés, reconnus par les anticorps responsables de la pathogénie du lupus érythémateux disséminé (LED), leur méthode d&#39;obtention et leur application au diagnostic du LED

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB IT LU NL SE

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA