FR2658197A1 - Anticorps monoclonaux restreints reconnaissant un peptide associe a un antigene du complexe majeur d'histocompatibilite - applications au diagnostic et au traitement. - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne des anticorps monoclonaux restreints caractérisés par leur capacité à reconnaître spécifiquement un complexe formé par un peptide caractéristique d'un antigène d'un agent pathogène ou un peptide caractéristique d'une dérégulation cellulaire et par une molécule du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH) ayant la capacité de reconnaître et de fixer ce peptide, lesdits anticorps étant des anticorps monoclonaux restreints, dès lors qu'ils ne reconnaissent pas ledit peptide en association avec une molécule de CMH d'haplotype non spécifique du peptide. Elle vise aussi l'application de ces anticorps au diagnostic de pathologies dues à des agents infectieux ou à des dérèglements cellulaires impliqués par exemple dans des tumeurs ou des maladies autoimmunes.
Description
ANTICORPS MONOCLONAUX RESTREINTS RECONNAISSANT UN
PEPTIDE ASSOCIE A UN ANTIGENE DU COMPLEXE MAJEUR
D'HISTOCOMPATIBILITE - APPLICATIONS AU DIAGNOSTIC ET
AU TRAITEMENT
L'invention concerne des anticorps monoclonaux restreints reconnaissant un peptide associé à un antigène du complexe majeur d'histocompatibilité.
PEPTIDE ASSOCIE A UN ANTIGENE DU COMPLEXE MAJEUR
D'HISTOCOMPATIBILITE - APPLICATIONS AU DIAGNOSTIC ET
AU TRAITEMENT
L'invention concerne des anticorps monoclonaux restreints reconnaissant un peptide associé à un antigène du complexe majeur d'histocompatibilité.
L'invention concerne aussi les applications de ces anticorps au diagnostic et au traitement de certaines pathologies.
On connait l'intérêt des molécules du Complexe
Majeur d'Histocompatibilité (molécules du CMH) en tant que structures membranaires de reconnaissance permettant au système immunitaire de reconnaître le soi du non-soi. Une fonction majeure des molécules de
CMH est de présenter des antigènes aux lymphocytes T.
Majeur d'Histocompatibilité (molécules du CMH) en tant que structures membranaires de reconnaissance permettant au système immunitaire de reconnaître le soi du non-soi. Une fonction majeure des molécules de
CMH est de présenter des antigènes aux lymphocytes T.
Selon l'appartenance de la molécule du CMH à la classe I ou à la classe II, le complexe formé par la molécule du CMH et l'antigène est en général reconnu respectivement par des cellules T cytotoxiques ou par des cellules T auxiliaires capables d'activer la synthèse d'un anticorps par les lymphocytes B.
Des travaux ont déjà permis de mettre en évidence l'existence d'anticorps reconnaissant un antigène associé à une molécule de CMH. Par exemple, Van
Leuveen et al (J. Exp. Med. (1979) 150, 1075-1083) ont décrit l'existence, chez une malade atteinte d'anémie, d'un sérum polyclonal contenant des anticorps capables de lyser spécifiquement des lymphocytes portant l'antigène H-Y associé à une molécule de CMH du type
HLA-A2.
Leuveen et al (J. Exp. Med. (1979) 150, 1075-1083) ont décrit l'existence, chez une malade atteinte d'anémie, d'un sérum polyclonal contenant des anticorps capables de lyser spécifiquement des lymphocytes portant l'antigène H-Y associé à une molécule de CMH du type
HLA-A2.
Cependant les résultats connus jusqu'à présent montrent qu'il n'a pas été possible de produire ni d'identifier et de caractériser des anticorps monoclonaux restreints, c'est-à-dire spécifiques du complexe formé par un antigène déterminé et une molécule de CMII spécifique de cet antigène, également déterminée.
A cet égard, plusieurs équipes ayant tenté de mettre au point des modèles expérimentaux en vue de produire des anticorps monoclonaux restreints, ont publié des résultats négatifs.
Par exemple, l'équipe de Tamminen et al utilisant comme antigène du virus grippal Influenza type A, souche H3N2 (X-31) (Tamminen et al., Eur. J. Immunol.
(1987) 17, 999-1006) et également le groupe de Rubin,
Malissen, Jorgensen et Zeuthen utilisant comme antigène l'insuline (Rubin et al., Res. Immunol.
Malissen, Jorgensen et Zeuthen utilisant comme antigène l'insuline (Rubin et al., Res. Immunol.
(1989) 140, 67) ont publié des résultats négatifs, c'est-à-dire qu'ils n'ont pas réussi à produire des anticorps restreints. L'équipe de Klinman a décrit des résultats positifs (Wylie et al., J. Exp. Med. (1982) 155, 403-414 ; Frescher and Klinman, J. Exp. Med.
(1986) 164, 196-210). Cependant les travaux de Klinman et al. montrent que les anticorps monoclonaux produits reconnaissent des cellules trasnformées par un virus oncogène SV40, sans que l'antigène reconnu, ni la molécule du CMII impliquée, soient identifiés.
Les difficultés rencontrées pour la préparation des anticorps monoclonaux restreints selon l'invention peuvent être attribuées à différents facteurs et en particulier à la mise au point d'une technique particulière de préparation des anticorps et également à des techniques très sensibles pour le criblage.
Les inventeurs se sont intéressés au rôle que pourraient présenter des anticorps monoclonaux restreints pour le diagnostic mais aussi le traitement de différentes pathologies.
Ils ont été capables de remédier aux difficultés rencontrées jusqu'à présent et ont obtenu des anticorps monoclonaux restreints caractéristiques d'un complexe constitué par un antigène en association avec une molécule du CMII reconnaissant spécifiquement cet antigène.
L'invention a donc pour objet des anticorps monoclonaux restreints reconnaissant des antigènes associes à des molécules du CMH. Entrent également dans le cadre de l'invention, des souches d'hybridomes productrices des anticorps monoclonaux restreints.
L'invention concerne aussi des compositions pour le diagnostic de la présence d'une infection ou d'un dérèglement cellulaire susceptible de génerer un etat tumoral ou une maladie autoimmune.
L'invention se rapporte aussi à des compositions pour le traitement d'infections ou de dérèglements cellulaires tels que décrits ci-dessus.
Elle vise de plus un procédé pour la production des anticorps monoclonaux restreints de l'invention.
Les antigènes dont il est question dans les paragraphes précédents et qui constituent l'une des deux entités du complexe reconnu par les anticorps restreints selon l'invention, sont soit des peptides tels qu'issus de la dégradation de protéines provenant d'un agent infectieux ou pathogène soit des peptides caractéristiques d'un dysfonctionnement (dérégulation) cellulaire ou encore des protéines dégradées du soi.
Ces peptides peuvent par exemple être obtenus par coupure enzymatique par exemple par les enzymes du lysozome ou de l'appareil de Golgi.
La formation du complexe nécessite également que le peptide et la molécule du CMII soient capables de se lier entre elles.
Pour la préparation d'anticorps monoclonaux restreints, ces peptides sont avantageusement obtenus par voie de synthèse chimique selon les méthodes classiques de synthèse des peptides.
Ils peuvent aussi être préparés à partir de protéines naturelles par exemple des protéines issues d'agents pathogènes ou des protéines mises en jeu lors de dérèglements cellulaires de type tumoral ou de type autoimmun, notamment des protéines mutées.
Les anticorps monoclonaux de l'invention sont caractérisés par leur capacité à reconnaître spécifiquement un complexe formé par un peptide caractéristique d'un antigène d'un agent pathogène ou un peptide caractéristique d'une dérégulation cellulaire et par une molécule du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH) ayant la capacité de reconnaître et de fixer ce peptide, lesdits anticorps étant des anticorps monoclonaux restreints, dès lors qu'ils ne reconnaissent pas ledit peptide en association avec une molécule de CMII d'haplotype non spécifique du peptide.
Pour déterminer la spécificité du couple peptide-molécule du CMII de classe I, on peut effectuer un test tel que décrit par BOUILLOT et al, (Nature, 1989, vol. 339, p.473-475). Conformément à ce test, un peptide dont on recherche la spécificité vis-à-vis de la molécule de CMII est incubé avec une molécule de CMII connue, sur des cellules marquées avec un isotope radioactif tel que le chrome 51. Après cette incubation, la suspension est mise en présence de lymphocytes cytotoxiques (CTL) spécifiques du peptide.
Lorsque les cellules CTL lysent les cellules mises en présence du peptide et de la molécule du CMH, on peut en déduire que la molécule du CMII a une affinité spécifique pour le peptide.
De la même manière, il existe divers tests qui permettent de repérer l'association fonctionnelle et spécifique d'un peptide à un antigène du CMII de classe II. On peut par exemple, mettre en oeuvre le test de
Sette et al (P.N.A.S. (1989), vol. 86, p3296-3300).
Sette et al (P.N.A.S. (1989), vol. 86, p3296-3300).
Les anticorps ci-dessus définis sont désignés par le terme anticorps monoclonaux restreints.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les anticorps monoclonaux restreints sont encore caractérisés en ce qu'ils sont dépourvus ou pratiquement dépourvus de réaction à l'égard du peptide contre lequel ils sont dirigés, présent à l'état isolé et/ou en ce qu'ils reconnaissent faiblement ou pas du tout, la molécule du CMII seule.
Un anticorps pratiquement dépourvu de la capacité à reconnaître un peptide seul est selon l'invention, un anticorps qui présente avec ce peptide une réaction inférieure à deux fois le signal correspondant au bruit de fond.
Un anticorps reconnaissant faiblement une molécule de CMII seule reconnaît cette molécule de CMII suivant une réaction qui est de l'ordre de 1/10 à 1/5 de la réaction existant dans les mêmes conditions avec le complexe peptide-CMH spécifique.
Pour déterminer si un anticorps monoclonal obtenu répond aux définitions de l'invention, une réaction immunoenzymatique de type ELISA, telle que décrite ci-après à titre d'exemple, peut être réalisée.
La réaction immunoenzymatique est effectuée d'abord au moyen du réactif à base d'anticorps conjugué anti-Ig de souris couplé soit à l'uréase, soit à la phosphatase alcaline, sur un surnageant de culture d'hybridomes. La réaction est ensuite confirmée par l'anticorps conjugué anti-Ig de souris couplé par exemple à la phosphatase alcaline. Les cellules servant de cibles sont par exemple des cellules spléniques préalablement incubées avec le peptide contre lequel on veut former les anticorps (5 à 50g/ml pour 107 cellules à 370C pendant une à deux heures). Les cellules sont fixées sur plaques de polyvinyle selon la technique décrite par Ternynck et
Avrameas (Ternynck et Avrameas: Techniques immunoenzymatiques - Les éditions INSERM, 1987) au moyen du poly-L-lysine.
Avrameas (Ternynck et Avrameas: Techniques immunoenzymatiques - Les éditions INSERM, 1987) au moyen du poly-L-lysine.
Des témoins utilisés pour vérifier l'appartenance des anticorps monoclonaux restreints à l'invention et qui par conséquent ne doivent pas donner une réaction positive avec les anticorps monoclonaux restreints de l'invention sont constitués d'une part par l'un ou l'autre des constituants pris séparément, à savoir le peptide contre lequel on souhaite former des anticorps monoclonaux restreints ou les cellules portant la molécule du CMII correspondante seule sans ledit peptide, et d'autre part par l'un ou l'autre de ces constituants en association avec un partenaire non relié c'est-à-dire non spécifique (le peptide différent de celui contre lequel on veut obtenir des anticorps monoclonaux restreints associé à la molécule de CMII étudiée ou le peptide contre lequel on souhaite produire des anticorps monoclonaux restreints, associé à une molécule du CMII non spécifique).
La réaction positive ci-dessus est marquée par une densité optique (D.O) supérieure à au moins deux fois celle observée pour les puits qui contiennent tous les constituants de la réaction excepté les anticorps restreints.
Les anticorps monoclonaux restreints de l'invention, ont l'avantage de présenter une sélectivité importante ce qui les rend particulièrement intéressants dans leur application au diagnostic ou au traitement.
Les peptides reconnus par les anticorps de l'invention peuvent être caractéristiques d'agents pathogènes tels que des virus, des bactéries, des parasites, par exemple le plasmodium ou des champignons notamment des levures pathogènes.
Il peut s'agir également des peptides représentant des antigènes mineurs d'histocompatibilité, de peptides caractéristiques de dérèglements cellulaires de type tumoral ou cancéreux ou encore de type auto-immum.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les anticorps monoclonaux restreints sont caractérisés en ce que les peptides reconnus présentent de 7 à 25, de préférence une dizaine d'acides aminés.
Pour la présentation de certains antigènes par les molécules du CMH, la présence d'un peptide ayant une longueur en acides aminés voisine de ce qui est donné dans ce qui précède peut suffire à la réaction de fixation avec les molécules de CMII et à celle de reconnaissance par les anticorps de l'invention.
Des anticorps monoclonaux restreints particuliers sont caractérisés en ce que le peptide reconnu est spécifique d'un rétrovirus humain HIV et notamment en ce qu'il s'agit des peptides de la protéine gag par exemple gag 5 ou des peptides de la protéine interne p14 (nucléoprotéine) notamment le peptide K16F décrit par Claverie JM et al dans Eur jour Imm 1988 vol 18 p 1547-1553.
D'autres anticorps monoclonaux restreints selon l'invention sont dirigés contre des peptides tels que les suivants .le peptide de l'autoantigène de la protéine basique de myéline MPB 1 à 11 décrit par Wraith.D et al dans (Cell 1989 vol. 59 p 247-255), .le peptide de la sous-unité a du récepteur de l'acétylcholine décrit par Mozes et al (EMBO journal 1989 vol 8 p 4049-4052), .le peptide de la chaîne a de l'insuline décrit par
Gradehandt et al, (Immunological Reviews, (1988) vol.
Gradehandt et al, (Immunological Reviews, (1988) vol.
106, p59 à 75), .le peptide de l'enveloppe du virus de l'hépatite B,
Chisari et al (Cell 1989 vol 59 p 1145-1156).
Chisari et al (Cell 1989 vol 59 p 1145-1156).
Des anticorps selon l'invention peuvent aussi être caractérisés en ce que la molécule du CMII humain reconnue est de divers haplotypes (par exemple HLA-A2,
HLA-A3, HLA-B7, HLA-B12, HLA-B27, HLA-B37, HLA-CW3) de classe I comme de classe II.
HLA-A3, HLA-B7, HLA-B12, HLA-B27, HLA-B37, HLA-CW3) de classe I comme de classe II.
L'invention concerne aussi un procédé pour la préparation d'anticorps monoclonaux restreints de l'invention. Un premier procédé adapté à la production de ces anticorps monoclonaux restreints est caractérisé en ce que: - on fusionne des cellules spléniques d'un animal préalablement immunisé avec des cellules spléniques isogèniques recouvertes d'un peptide déterminé, avec des cellules de myélome en présence d'un promoteur de fusion, par exemple le polyéthylène glycol, les cellules spléniques étant en excès par rapport aux cellules myélomateuses, par exemple dans une proportion de 10 pour 1 environ, - on réalise un criblage afin de sélectionner ceux des hybridomes capables de produire des anticorps monoclonaux restreints, par exemple par la technique
ELISA, effectuée avec un réactif & base d'anticorps conjugué anti-Ig de souris couplé à une enzyme par exemple l'uréase, ou la phosphatase alcaline, - on récupère et on clone les hybridomes ainsi sélectionnés.
ELISA, effectuée avec un réactif & base d'anticorps conjugué anti-Ig de souris couplé à une enzyme par exemple l'uréase, ou la phosphatase alcaline, - on récupère et on clone les hybridomes ainsi sélectionnés.
Entrent également dans le cadre de l'invention les hybridomes producteurs des anticorps monoclonaux restreints ci-dessus. Ces hybridomes sont les produits de fusion de cellules de myélomes et de cellules spléniques d'un animal préalablement immunisé avec le peptide-antigène, dans des conditions telles que l'antigène contre lequel sont formés les anticorps, est constitué par un complexe comportant le peptide ci-dessus associé à une molécule de CMH.
De préférence les hybridomes résultent de la fusion des cellules spléniques ci-dessus décrites avec un myélome de type HGPRT par exemple: X63-Ag8, NS-1 ou SP2/0.
La réalisation des hybridomes est faite d'après le protocole de Kohler et Milstein (Nature, 1974, 256:495- 497).
Les cellules lymphocytaires ou non, normales ou tumorales apportant la molécule de CMII sont de préférence d'haplotype H-2d, H-2b, H-2k ou H-2s chez la souris, mais il pourra s'agir également de cellules exprimant des molécules de CMII humaines (ou d'une autre espèce) chez des souris transgéniques (exprimant le même CMII humain) ou non transgéniques.
L'invention se rapporte aussi à des cellules lymphocytaires ou non, humaines ou animales, par exemple de souris recouvertes d'un peptide ou d'un polypeptide de préférence immunogène, contre lequel on veut préparer des anticorps monoclonaux restreints.
Un second procédé pour la production des anticorps monoclonaux restreints selon l'invention consiste à réaliser la fusion entre des cellules B du sang immortalisées avec le virus d'Epstein Barr et des lymphocytes B humains préalablement mis en contact avec des peptides contre lesquels on cherche à former des anticorps monoclonaux restreints.
Les cellules B préalablement mises au contact des peptides contre lesquels on cherche à former des anticorps monoclonaux, peuvent être prélevées dans le sang périphérique d'un donneur préalablement immunisé avec le peptide, lorsqu'il n'est pas toxique pour ce donneur. Ces lymphocytes B peuvent aussi être obtenus par culture in vitro au contact des peptides, la récupération des cellules B recouvertes de peptides étant précédée d'un ou plusieurs cycles de stimulation.
Enfin, les anticorps restreints ou des molécules analogues telles que la partie Fab de ces anticorps, ou des analogues des récepteurs des cellules T ayant la capacité de reconnaître le complexe CMH-peptide peuvent être obtenus dans E.coli ou d'autres microorganismes, selon les techniques de Huse et al (Science, (1989), 246, 1275), Ward et al (Nature, (1989), 341, 544), Bird et al (Science, (1988), 242, 423); ou d'autres auteurs.
Conformément à ces techniques, on introduit à l'aide de vecteurs appropriés, les gènes amplifiés par la technique PCR, codant pour les anticorps monoclonaux restreints ou les gènes codant pour les récepteurs de cellules T spécifiques murins ou humains ou d'autres espèces, dans E. coli, dans des conditions permettant leur expression. Puis, on réalise un criblage afin de déterminer celles des molécules exprimées qui présentent la spécificité requise pour la reconnaissance du complexe peptide-molécule du CMH.
Le criblage peut être effectué selon la méthode décrite précédemment.
La technique ci-dessus peut également être mise en oeuvre en introduisant des séquences de gènes codant pour les anticorps restreints ou les récepteurs de cellules T spécifiques, ou encore des mutants de ces séquences.
Les gènes ou fragments de gènes codant pour les anticorps monoclonaux restreints sont obtenus par extraction de 1'ADN des cellules immunes, dont la préparation est décrite ci-dessus.
L'invention se rapporte donc à des anticorps ou à des analogues, produits dans E.coli ou dans d'autres micro-organismes, à des anticorps monoclonaux restreints humains ou d'autres règnes (par exemple obtenus chez le rat ou le hamster par des techniques analogues à celles décrites précédemment ou obtenus selon les méthodes de Borrebaeck et al, P.N.A.S (1988), vol. 85, p.3995-3999).
Les anticorps de l'invention présentent un grand intérêt pour différentes applications. Ils peuvent être utilisés par exemple pour des applications au diagnostic d'infections ou pour le diagnostic de dérèglements cellulaires tels qu'ils se manifestent dans certains cancers ou maladies autoimmunes.
L'invention se rapporte à cet égard à une composition pour le diagnostic de la présence de peptides associés à des molécules de CMII dans un échantillon biologique testé, caractérisée en ce qu'elle comprend des anticorps monoclonaux restreints tels que décrits précédemment.
Cette composition de diagnostic peut être mise oeuvre soit sur un échantillon biologique, soit dans un organisme vivant.
Selon cette dernière application, on aura recours aux techniques de diagnostic pratiquées en imagerie médicale.
Dans cette hypothèse, l'anticorps monoclonal restreint est marqué par une substance radioactive ou par une substance pouvant être rendue visible par les techniques de fluorochrome ou de LASER.
Pour le diagnostic d'une pathologie déterminée, dans laquelle interviennent des antigènes tels que décrits précédemment, il est nécessaire de prendre en considération l'haplotype des molécules du CMII présentes chez le patient chez lequel est réalisée la détection.
L'invention vise aussi un kit pour le diagnostic in vitro sur un échantillon biologique d'une infection par un organisme pathogène ou pour le diagnostic d'un cancer, d'une maladie autoimmune ou d'un autre dérèglement cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend: - des anticorps monoclonaux restreints selon l'invention, ayant la spécificité recherchée compte tenu du diagnostic à effectuer.
- des moyens pour révéler la présence d'un conjugué de type complexe (antigène-molécule du CMH) lié avec 1' anticorps.
L'échantillon biologique utilisé est avantageusement un échantillon de sérum ou tout autre fluide biologique.
Entre également dans le cadre de l'invention un test pour la détection in vitro d'une infection ou d'un dérèglement cellulaire, comprenant les étapes suivantes:
- mise en contact de l'échantillon biologique avec des anticorps selon l'invention,
- détection de la présence d'un conjugué du type anticorps-complexe (antigene-molécule du CMH).
- mise en contact de l'échantillon biologique avec des anticorps selon l'invention,
- détection de la présence d'un conjugué du type anticorps-complexe (antigene-molécule du CMH).
L'application au diagnostic, des anticorps de l'invention peut être utilisée pour détecter un virus tel que le virus HIV du SIDA, ou encore pour détecter des tumeurs ou des dérèglements autoimmuns.
Selon un mode de réalisation de l'invention on peut aussi rendre les anticorps monoclonaux restreints cytotoxiques. Ils peuvent alors entrer à titre de principe actif dans une composition pharmaceutique pour le traitement des infections ou des dérèglements ci-dessus. Dans ce cas, ils sont mélangés avec un véhicule pharmaceutique acceptable.
Des substances capables de rendre les anticorps cytotoxiques sont des toxines, des antibiotiques, des isotopes radioactifs.
L'invention vise aussi une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, des anticorps monoclonaux restreints conformes à l'invention. De tels anticorps formulés dans une composition pharmaceutique pourraient être utilisés notamment comme agents compétiteurs pour bloquer l'action de cellules T spécifiques, particulièrement dans des pathologies autoimmunes.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples qui suivent.
EXEMPLE
ETABLISSEMENT DES HYBRIDOMES SECRETANT DES ANTICORPS
DE TYPE RESTREINT.
ETABLISSEMENT DES HYBRIDOMES SECRETANT DES ANTICORPS
DE TYPE RESTREINT.
Immunisation
Des souris de lignée BALB/c (H-2d) sont immunisées par injection intra-péritonéale i.p. de cellules spléniques isogéniques couvertes de peptide.
Des souris de lignée BALB/c (H-2d) sont immunisées par injection intra-péritonéale i.p. de cellules spléniques isogéniques couvertes de peptide.
I1 s'agit en l'occurrence du peptide de la nucléoprotéine du virus grippal dénommé NP147-158R.
Les cellules spléniques sont incubées au préalable avec le peptide à raison de 107 cellules pour lOOAg de peptide dans un volume de îml de milieu de culture (DMEM + 2% de sérum de veau foetal). L'incubation se fait dans une étuve à C02 (5%) pendant 1 heure. Les souris reçoivent 3 injections intra-péritonéales à raison d'une injection par semaine. Un intervalle de 3 semaines sépare le 3ème de la 4ème injection qui précède le sacrifice et le prélèvement de la rate.
Trois jours séparent la 4ème injection du prélèvement de la rate. La 4ème injection se fait par deux voies: 0,5ml de la suspension est injectée par voie intrapéritonéale, 0,5ml par voie intra-veineuse.
Fusion cellulaire
Les cellules spléniques sont obtenues à partir de la rate après dissociation en milieu DMEM + 5% de sérum de veau foetal. Les globules rouges sont lysés au moyen du chlorure d'ammonium (NH4C1) à 0,83% et les lymphocytes sont ensuite lavés trois fois en DMEM + 5% de sérum de veau foetal.
Les cellules spléniques sont obtenues à partir de la rate après dissociation en milieu DMEM + 5% de sérum de veau foetal. Les globules rouges sont lysés au moyen du chlorure d'ammonium (NH4C1) à 0,83% et les lymphocytes sont ensuite lavés trois fois en DMEM + 5% de sérum de veau foetal.
Le partenaire de fusion est constitué par 3 myélomes HGPRT-, à h savoir X63-Ag8, NS-1 et SP2/0.
Autrement dit, les lymphocytes sont fusionnés soit avec le myélome X63, NS-1 ou SP2/0 séparément. La fusion se fait au moyen du polyéthylène glycol (PEG 1500) de la firme MERCK, à raison de 10 lymphocytes pour une cellule de myélome. Le protocole est basé sur celui décrit par Kôhler et Milstein (Nature, 1974, 256:495-497). rappelé ci-après: les lymphocytes et les cellules de myélome (X63, NS-1 et SP2/0) sont mis ensemble dans la proportion indiquée en haut. Les trois préparations (lymphocytes plus XG3 ou plus NS-1 ou plus SP2/0) sont centrifugées pendant 10 minutes à 250g et à 4"C. Les surnageants sont enlevés en laissant cependant un film de liquide au-dessus du culot cellulaire. Les tubes sont mis à 37"C dans un bain marie.On ajoute goutte à goutte lml d'une solution de polyéthylène glycol 1500 (solution de 50% de PEG 1500 dans RPMI à pH 7) sur le culot cellulaire.
L'opération devant durer 1 minute, est suivie par l'addition de 20ml de DMEM plus 10% de sérum de veau foetal. Le tout est laissé encore trois minutes dans le bain marie à 37 C puis les tubes sont centrifugés pendant 15 minutes à 250g et à +4 C. Les surnageants sont enlevés et les cellules sont lavées une fois avec 20ml de DMEM +10% de sérum de veau foetal. Les cellules sont remises ensuite dans une solution de
DMEM plus 10% de sérum de veau foetal auquel est ajouté le milieu HAT (solution mère HAT lOOX:
Hypoxanthine à 1,36mg/ml, Aminoptérine à 0,018mg/ml et
Thymidine à 0,76mg/ml).Les suspensions cellulaires sont distribuées dans les puits de plaques de culture en plastique (NUNCLON, 96 puits) à raison de 200 1 par puits et contenant 10.000 cellules. On ajoute ensuite 50.000 cellules spléniques normales dans chaque puits à titre de "cellules de remplissage". Les cellules sont incubées ainsi pendant 7 à 10 jours dans une étuve à C02 (5%) et à 37-C.
DMEM plus 10% de sérum de veau foetal auquel est ajouté le milieu HAT (solution mère HAT lOOX:
Hypoxanthine à 1,36mg/ml, Aminoptérine à 0,018mg/ml et
Thymidine à 0,76mg/ml).Les suspensions cellulaires sont distribuées dans les puits de plaques de culture en plastique (NUNCLON, 96 puits) à raison de 200 1 par puits et contenant 10.000 cellules. On ajoute ensuite 50.000 cellules spléniques normales dans chaque puits à titre de "cellules de remplissage". Les cellules sont incubées ainsi pendant 7 à 10 jours dans une étuve à C02 (5%) et à 37-C.
CRIBLAGE
Au bout de 7 à 10 jours1 le surnageant de chaque puits est prélevé et soumis au criblage par la réaction immunoenzymatique "ELISA". Elle est effectuée d'abord au moyen du réactif à base d'anticorps conjugué anti-Ig de souris couplé à l'uréase puis confirmée ensuite par l'anticorps conjugué anti-Ig de souris couplé à la phosphatase alcaline. Les cellules servant de cibles sont des cellules spléniques préalablement incubées avec le peptide NP 147-158R- (5 à 50Ag/ml pour 107 cellules) à 37"C pendant une à deux heures. Elles sont fixées sur plaques de polyvinyle (Dynatech) selon la technique décrite par Ternynck et
Avrameas (Ternynck et Avrameas: Techniques immunoenzymatiques- Les éditions INSERM, 1987) au moyen du poly-L-lysine.
Au bout de 7 à 10 jours1 le surnageant de chaque puits est prélevé et soumis au criblage par la réaction immunoenzymatique "ELISA". Elle est effectuée d'abord au moyen du réactif à base d'anticorps conjugué anti-Ig de souris couplé à l'uréase puis confirmée ensuite par l'anticorps conjugué anti-Ig de souris couplé à la phosphatase alcaline. Les cellules servant de cibles sont des cellules spléniques préalablement incubées avec le peptide NP 147-158R- (5 à 50Ag/ml pour 107 cellules) à 37"C pendant une à deux heures. Elles sont fixées sur plaques de polyvinyle (Dynatech) selon la technique décrite par Ternynck et
Avrameas (Ternynck et Avrameas: Techniques immunoenzymatiques- Les éditions INSERM, 1987) au moyen du poly-L-lysine.
Les puits ayant donné une valeur en densité optique (D.O) supérieure au moins de deux fois celle du témoin négatif (réaction des cellules cibles avec l'anticorps conjugué sans surnageant de culture) sont sélectionnés. Les surnageants des mêmes puits sont testés aussi sur les cellules non couvertes de peptide et de même haplotype pour s'assurer que la réaction observée n'est pas due aux "autoanticorps". De même le test sur le peptide en question, fixé seul (sans cellules) directement sur la plaque, confirme ainsi que les surnageants sélectionnés réagissent seulement avec les cellules couvertes de peptide.
La sélection étant effectuée, les puits sont soumis à des clônages et sous-clônages pendant 3 à 4 fois. A chaque clônage et sous-clônage, les surnageants sont examinés de nouveau sur les mêmes critères décrits en haut. En même temps, la réaction immunoenzymatique est appliquée pour déterminer l'isotype de l'hybridome. A ce stade est effectuée parallèlement la réaction en vue de déterminer la restriction, autrement dit, la réaction devant être observée seulement avec l'haplotype recherché, en l'occurrence H-2d.
EN CONCLUSION:
Trois hybridomes ont été obtenus présentant les caractéristiques des anticorps de type dit restreint, en ce sens qu'ils réagissent seulement avec des cellules spléniques d'un haplotype précis (H-2d) couvertes de peptide (NP 147-158R-). Ces trois clônes sont dénommés N6.6, S.2.2 et X5.3 d'isotype IgG2b,R,
IgG3,K et IgG2b,K respectivement.
Trois hybridomes ont été obtenus présentant les caractéristiques des anticorps de type dit restreint, en ce sens qu'ils réagissent seulement avec des cellules spléniques d'un haplotype précis (H-2d) couvertes de peptide (NP 147-158R-). Ces trois clônes sont dénommés N6.6, S.2.2 et X5.3 d'isotype IgG2b,R,
IgG3,K et IgG2b,K respectivement.
Claims (16)
1/ Anticorps monoclonaux restreints caractérisés par leur capacité à reconnaître spécifiquement un complexe formé par un peptide caractéristique d'un antigène d'un agent pathogène ou un peptide caractéristique d'une dérégulation cellulaire et par une molécule du
Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH) ayant la capacité de reconnaître et de fixer ce peptide, lesdits anticorps étant des anticorps monoclonaux restreints, dès lors qu'ils ne reconnaissent pas ledit peptide en association avec une molécule de CMII d'haplotype non spécifique du peptide.
2/ Anticorps monoclonaux restreints selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'ils sont dépourvus ou pratiquement dépourvus de réaction à l'égard du peptide seul et/ou en ce qu'ils reconnaissent faiblement ou pas du tout la molécule du CMII seule.
3/ Anticorps monoclonaux restreints selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisés en ce que les peptides reconnus sont caractéristiques d'agents pathogènes des virus, des bactéries, des parasites par exemple le plasmodium, des champignons, notamment des levures pathogènes, ou des peptides représentant des antigènes mineurs d'histocompatibilité, des antigènes spécifiques de tumeurs ou des antigènes spécifiques de dérèglements autoimmuns.
4/ Anticorps monoclonaux restreints selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce que les peptides reconnus présentent de 7 à 25, de préférence une dizaine d'acides aminés.
5/ Anticorps monoclonaux restreints selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que le peptide reconnu et spécifique d'un rétrovirus humain HIV et notamment en ce qu'il s'agit de peptides de la protéine gag, de la nucléoprotéine ou du peptide K16F.
6/ Anticorps monoclonaux restreints selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisés en ce que la molécule du CMII reconnue est de différents haplotypes, de classe I comme de classe Il.
7/ Procédé pour la préparation d'anticorps monoclonaux restreints selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que:
- on fusionne des cellules spléniques d'un animal préalablement immunise avec des cellules spléniques isogéniques recouvertes d'un peptide déterminé, avec des cellules de myélome en présence d'un promoteur de fusion, par exemple le polyéthylène glycol, les cellules spléniques étant en excès par rapport aux cellules myélomateuses, par exemple dans une proportion de 10 pour 1 environ,
- on réalise un criblage afin de sélectionner ceux des hybridomes capables de produire des anticorps monoclonaux restreints, par exemple par la technique
ELISA effectuée avec un réactif à base d'anticorps conjugué anti-Ig de souris couplé à une enzyme par exemple l'urêase ou la phosphatase alcaline,
- on récupère et on clone les hybridomes ainsi sélectionnés.
8/ Hybridomes tels qu'obtenus par fusion de cellules de myélomes et de cellules spléniques d'un animal préalablement immunisé avec le peptide contre lequel on souhaite produire des anticorps monoclonaux restreints, dans des conditions telles que l'antigène contre lequel sont formés les anticorps, est constitué par un complexe comportant le peptide ci-dessus associé à une molécule de CMII qui le reconnait spécifiquement.
9/ Composition pour le diagnostic de la présence de peptides associés à des molécules de CMH, dans un échantillon biologique ou dans un organismes vivant, caractérisée en ce qu'elle comprend des anticorps monoclonaux restreints selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
10/ Composition pour le diagnostic selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle permet de détecter une infection par un agent pathogène, notamment un virus.
11/ Composition pour le diagnostic selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle permet la détection de tumeurs.
12/ Composition pour le diagnostic selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle permet la détection de dérèglements autoimmuns.
13/ Anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisés en ce qu'ils sont couplés à des substances capables de les rendre cytotoxiques par exemple à une toxine, un antibiotique ou un isotope radioactif.
14/ Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, des anticorps monoclonaux restreints selon la revendication 13.
15/ Kit pour le diagnostic in vitro sur un échantillon biologique d'une infection par un organisme pathogène ou pour le diagnostic d'un cancer, d'une maladie autoimmune ou d'un autre dérèglement cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend: - des anticorps monoclonaux restreints selon l'invention, ayant la spécificité recherchée compte tenu du diagnostic à effectuer.
- des moyens pour révéler la presence d'un conjugué de type complexe (antigène-molécule du CMH) lié avec 1 'anticorps.
16/ Compositions pharmaceutique comprenant à titre de principe actif, des anticorps monoclonaux restreints, non couplés à des substances toxiques, pour la modulation de l'action de cellules T, notamment dans les pathologies autoimmunes.
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