BE1000587A4 - Coordinats et procedes en vue d'augmenter la proliferation des lymphocytes b. - Google Patents

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Abstract

Nouveau récepteur de lymphocytes B, à savoir Bp50, qui est un polypeptide à 50 kilodaltons et qui entre en jeu dans la prolifération des lymphocytes B. On peut utiliser des coordinats tels que des lymphokines, des molécules d'anticorps ou les fragments Fv de molécules d'anticorps, qui se lient à Bp50 et qui augmentent la prolifération de lymphocytes B activés, afin d'assurer la régulation de la prolifération ou de la différentiation des lymphocytes B.

Description


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  Coordinats et procédés en vue d'augmenter la prolifération des lymphocytes   B.   



   1. INTRODUCTION
La présente invention concerne des coordinats tels que des molécules d'anticorps ou des fragments de molécules d'anticorps ou d'autres coordinats tels que les lymphokines qui se lient   bol   un marqueur superficiel de lymphocytes B à 50kDa, désigné dans la présente spécification par l'appellation   Bp50,   qui intervient dans la prolifération   des lymphocytes B,   mais non dans l'activation précoce des lymphocytes B. La presente invention concerne également l'antigène Bp50 lui-même des lymphocytes B.

   Dans une forme de réalisation particulière de la présente invention, on décrit un anticorps monoclonal, G28-5, qui définit   Bp50   et semble jouer un role dans la prolifération des lymphocytes B   actives. sans cependant   exercer aucun effet détectable sur la prolifération des lymphocytes B au repos. 



   Les coordinats tels que les anticorps, les lymphokines et leurs fragments selon la présente invention peuvent etre utilisés pour diriger et régler la prolifération et/ou la différentiation des lymphocytes B humains. En outre, les coordinats de la présente invention peuvent être modifies par la fixation d'autres composés qui peuvent être utilisés dans le traitement 

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 et/ou la détection de cellules malignes qui expriment   l'antigène Bp50. 



  2. DE L'INVENTION  
L'activation de lymphocytes B au repos de la phase Go à la phase G1 du cycle cellulaire et l'amor- çage ultérieur de la prolifération des lymphocytes B activés sont des étapes distinctes nécessitant des mécanismes de régulation également distincts. Certains agents, notamment le facteur-pl stimulant les lymphocytes   B murins (BSF-pl) (Rabin et al., 1985, Proc. Nat. 



  Acad. Sei. EUA 82,2935-2939) ou de faibles doses   d'anti-immunoglobuline' (anti-Ig) (DeFranco, et al., 1985, J. Immunol. 135 : 87-94 ; Wetzel et   al.,   1984, 
 EMI2.1 
 J. Immunol. 133 et al., 1982, J. et al., 1984, J. Immunol. 132 sont des facteurs d'"activa-    : 2327-2332 ; DeFrancotion"   ou de "compétence". En d'autres mots, ces agents amènent les lymphocytesBà s'agrandir, & synthétiser plus d'acide ribonucléique et à entrer dans G1, mais à eux seuls, ils ne provoquent pas la synthèse de l'acide désoxyribonucléique dans les lymphocytes B. 



  D'autres facteurs de "croissance" tels que   le.   facteur de croissance des lymphocytes B humains (BCGF) et l'interleucine-2 (IL-2) amènent les lymphocytes B activés. à traverser le cycle cellulaire et à entrer dans la phase S, mais ils ne déclenchent pas les lymphocytes B au repos (Kehrl et al., 1984, Immunol. Rev. 18 : 75-96 ; Muraguchi et al., 1984, J. Immunol. 132 : 176-180 ; Zubler et al. 1984, J. Exp. Med. 160 : 1170-1183 ; Jung et al., 1984, J. Exp. Med.   160 : 1597-1604).   



   Un certain nombre de facteurs qui favorisent la croissance des lymphocytes   B. ont ete ä present decrits   par des chercheurs à la fois de systèmes murins et humains. Ces facteurs englobent des facteurs de croissance de lymphocytes   B (BCGF) dérivant   de plusieurs 

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 sources différentes, notamment des hybridomes ou des lignées de lymphocytes T, des 1ignées de lymphocytes Bou des cellules dendritiques. Bien qu'il ait été démontré   qu'bol   la fois l'interleucine-l   (IL-1)   et l'interleucine-2 (IL-2) augmentaient la croissance des lymphocytes   B, elles   sont apparemment distinctes de certains BCGF.

   Par exemple, des anticorps monoclonaux (mAb) dirigés contre un BCGF murin (O'Hara et al., 1985, Nature (Lond.) 315 : 333) ou un BCGF 
 EMI3.1 
 humain (Ambrus et al., 1985, J. Exp. Med. 162 bloquent llactivité de BCGF, mais non l'activité d'IL-1 ou d'IL-2. Bien qu'ils soient distincts : 1319)d'IL-1 ou d'IL-2, les BCGF eux-memes semblent etre hétérogènes sur la base de données biochimiques et d'une activité différentielle sur différents sousensembles de   Iymphocytes Bou différents   dosages de co-stimulation. Par exemple, on a identifié un BCGF humain de poids moléculaire élevé à 60 kilodaltons (kDa), BCGF (élevé), qui est distinct d'une forme de faible poids   moleculaire   à 12 kDa, BCGF (faible) (Ambrus et al., 1985, J. Clin. Invest. 75 : 732). 



  L'acide c-désoxyribonucléique codant un BCGF murin à 20 kDa, appelé, avec une certaine hésitation, "facteur pl stimulant les   lymphocytesB" (BSF-pl),   a été récemment clone et mis en séquence (Noma et al., 1986, Nature 319 : 640). Le recombinant lymphokine non seulement exerce une activité de BCGF, mais il peut également activer deslymphocytes B au repos et provoquer la différentiation de cellules productrices   d'IgG.   ; dès lors, il diffère de BCGF humain (élevé) et de BCGF (faible)   a   la fois par son poids moléculaire 
 EMI3.2 
 et sa gamme d'activités. 



  Ces signaux d'activation et de croissance assurent probablement la régulation des cellules par interaction avec des structures superficielles   specs-   

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 EMI4.1 
 fiques de lymphocytes B. Outre le signal spécifique à l'antigène passant à travers Ig superficielle, on a identifié plusieurs autres polypeptides superficiels candidats de lymphocytes Bqui, d'une certaine   facon,   peuvent agir dans l'activation ou la croissance des lymphocytes B. Par exemple, les récepteurs superficiels de cellules pour IL-1 (Dower et al., 1985, J. Exp. Med.   160 : 501)   et IL-2 (Robb et al., 1984, J. Exp. Med.   160 : 1126)   ont été caractérisés et, récemment, on a identifie des récepteurs fonctionnels d'IL-2 sur des lymphocytes B (Zubler et al., 1984, J. 



  Exp. Med. 160 : 1170 ; Jung, et al., 1984, J. Exp. Med. 



    160 : 1597 ;   Muraguchi et al., 1985, J. Exp. Med. 



    161 : 181).   Toutefois, des récepteurs pour des facteurs d'activation et de croissance des   lymphocytes B doivent   encore être complètement caractérisés. On a identifié plusieurs polypeptides superficiels candidats de lymphocytes Bqui, d'une certaine façon, peuvent agir dans l'activation ou la croissance des lymphocytes B. 



  Par exemple, Subbarao et Mosier (Subbarao et al., 1983, Immunol. Rev.   69 : 81-97)   ont trouvé que des anticorps monoclonaux (mAb) dirigés contre l'antigène Lyb2. des lymphocytes B murins activaient les lymphocytes B et, récemment, il a été donné une preuve suggérant que Lyb2 pouvait être le récepteur pour BSF-pl (Yakura, 1985, Fed. Proc.   44 : 1532).   De meme, la Demanderesse a trouve qu'un mAb approprié   (1F5)   dirigé contre un polypeptide à 35 kDa, Bp35, activait les lymphocytes B humains de la phase G0 à la phase G1 (Clark et   al.,   1985, Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 82 : 1766-1770 ; Gollay et al., 1985, J. Immunol. 



    135 : 3795-3801).   Des agrégats de C3d ou d'anticorps diriges contre le récepteur de C3d à 140 kDa, Bpl40, provoquent la prolifération des lymphocytesBqui sont dépendants des lymphocytes T (Melchers et al., 1985, 

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 Nature 317 : 264-267 ; Nemerow et al., 1985, J. Immunol. 



  135 : 3068-3073 ; Frade et al., 1985, Eur. J. Immunol. 



    15 : 73-76).   Bien que des BCGF aient été identifiés à la fois chez la souris et chez l'homme, les récepteurs de ces facteurs n'ont pas encore   ete   isolés. 



  Wang et ses collaborateurs (Wang et al., 1979, J. 



  Exp. Med.   149 : 1424-1433)   ont préparé des   antisérums   polyclonaux qui ont identifiE un polypeptide à 54 kDa (gp54) sur des lymphocytes B humains et ils ont démontré que les antiserum de lapin dirigés contre gp54 provoquaient la division des lymphocytes B amygdaliens. 



  Récemment, Jung et Fu (Jung et al., 1984, J. Exp. 



  Med.   160 : 1919-1924)   ont isolé un mAb   (AB-1)   dirigé contre un antigene à 55 kDa, restreint   a   des lymphocytes B activés et bloquant la prolifération dépendant du BCGF. Toutefois, on ne sait pas encore si antigp54 ou AB-1 reconnatt ou non un récepteur de BCGF. 



    3. SOMMAIRE DE L'INVENTION   
 EMI5.1 
 La présente invention concerne des coordinats qui (a) se lient a Bp50, à savoir un polypeptide superficiel spécifique aux lymphocyts 50 kDa décrit ici, et qui (b) augmentent la prolifération de lymphocytes B activés. L'invention concerne également l'antigene   Bp50   lui-même qui est défini par l'anticorps monoclonal G28-5 et qui agit dans la prolifération des lymphocytes B actives. En outre, l'invention concerne des coordinats qui viennent se lier à   Bp50,   mais qui n'exercent aucune fonction ni aucun effet biologique tel qu'une augmentation de la prolifération de lymphocytes B activés. 



   Les coordinats de la présente invention englobent des molécules d'anticorps, des molécules d'anticorps monoclonaux et des fragments de ces molecules d'anticorps qui contiennent le site de fixation de l'antigène ou des anticorps et des fragments 

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 modifiés chimiquement ; ces fragments englobent, sans aucune limitation, Fv, Fab,   F (ab') , Fab'et analogues.   



   En outre, les coordinats de la présente invention comprennent des lymphokines qui peuvent englober, sans aucune limitation, des facteurs de croissance de lymphocytes B humains, de même que des lymphokines modifiées chimiquement. Les coordinats de la présente invention peuvent être modifiés chimiquement, par exemple, en reliant ou en couplant un composé avec le coordinat. Ces composés englobent, sans aucune limitation, des agents cytotoxiques, des agents thérapeutiques, des agents   chimiotherapeutiques,   des marqueurs tels que des radiomarqueurs, des colorants, des enzymes, des   ccnposés opaques   aux rayons X et analogues. 



  Sous leur forme modifiée ou non, les coordinats de la   presente   invention peuvent être utilisés pour assurer la direction, la régulation et la modification de la prolifération et/ou de la differentiation des lymphocytes B humains. 



   La présente invention est basée sur la découverte selon laquelle deux antigènes de différentiation des lymphocytes B humains savoir Bp35 et l'antigène des   lymphocytesB decrit   ici,   A   savoir   Bp50,   jouent apparemment des rôles distinctifs en tant que récepteurs de signaux dans l'activation des lymphocytes B. Des anticorps monoclonaux (mAb) dirigés contre Bp35 et Bp50 émettent tous deux des signaux positifs vers les lymphocytes B, stimulant ainsi leur transition à travers le cycle cellulaire. Tout comme les anticorps anti-Ig, mAb dirige contre Bp35 agit principalement pour activer les lymphocytes B au repos de telle sorte qu* ils deviennent compétents pour entrer dans la phase   G.   du cycle cellulaire.

   En revanche, un anticorps monoclonal du type décrit ici ou son fragment   F (ab')- dirige   contre Bp50, à savoir un poly- 

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 peptide   AL   50 kDa exprimé sur tous les lymphocytes B, agit pour stimuler des   lymphocytesBactives afin   qu'ils traversent le cycle cellulaire, tout en augmentant la prolifération des lymphocytes B activés. 



  Tout comme les anticorps anti-Ig, les anticorps monoclonaux dirigés contre Bp 35 activent les lymphocytes B 
 EMI7.1 
 amygdaliens et provoquent la prolifération des lymphocytes En revanche, à lui seul, l'anticorps monoclonal anti-Bp50 n'active pas les lymphocytes B, pas plus qu'il ne provoque la prolifération des   lymphocytesBmais, conjointement avec   les anticorps anti-Bp35 ou anti-Ig, il augmente la prolifération des lymphocytes B. A cet égard, l'action de l'anticorps anti-Bp50 ressemble à l'activité de facteurs de croissance des lymphocytes B (BCGF). Une quantité aussi faible que   0, 05 fg/ml d'anti-Bp50   est nécessaire pour augmenter la proliferation et, tout comme un BCGF, anti-Bp50 est efficace même lorsqu'il est ajouté 12 à 24 heures après que les lymphocytes B ont été activés avec anti-Ig ou anti-Bp35.

   Sans signaux exogènes supplémentaires, les anticorps antiBp35 et anti-Bp50 ensemble provoquent une forte prolifération   delyhocytes Bpurifiés   au repos. Ces résultats suggèrent que les molécules superficielles de Bp35 et de Bp50 interviennent dans le controle de la regulation de l'activation et de la progression des   lymphocytes A   travers le cycle cellulaire. Etant donné l'importance que les molécules anti-Bp35 et analogues ont sur l'effet et l'action des coordinats de la présente invention, l'article de Clark et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA) 82 : 1766-1770 est mentionné ici à titre de référence. 



   Bien que l'activité d'anti-Bp50 ressemble à celle de BCGF (faible), étant donné qu'anti-Bp50 et BCGF (faible) sont tous deux co-stimulants avec 

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 les mêmes agents, mais non l'un avec l'autre et étant donné que anti-Bp50 et BCGF (faible) influencent tous deux uniquement les lymphocytesB activés et agissent sous une forme soluble, l'activité d'anti-Bp50 peut être distinguée de celle de BCGF (faible), puisqu'aussi bien la prolifération   des lymphocytes B stimulés   avec des quantités optimales d'anti-Bp50 et   d'anti-Bp35   (ou anti-Ig) peut être augmentée davantage avec BCGF (faible) et qu'a la fois des lymphocytes B du sang et 
 EMI8.1 
 certains lymphomes de lymphocytes ment a anti-Bp50 vis-à-vis du BCGF.

   Pour exercer une activité optimale, anti-Bp50 doit être ajouté dans les 12 heures qui suivent l'activation des lymphocytes B, tandis que BCGF (faible) conserve une activité optimale, même lorsqu'il est ajouté 24 heures après l'activation. En outre, Bp50 est exprimé sur tous les lymphocytes   B, tandis   que les récepteurs ou BCGF (faible) sont restreints à des lymphocytes B activés. 



  Dès lors, en coordination,   anti-Bp50   et BCGF (faible) peuvent assurer la régulation de la croissance des lymphocytes B mais, apparemment, ils se comportent de la sorte   AL   l'intervention de signaux distincts. 



   Dans une forme de réalisation de la présente invention, les coordinats qui se lient à Bp50 et qui augmentent la prolifération de lymphocytes B activés, peuvent   etre   utilises pour augmenter une réponse immunitaire. Par exemple, ces coordinats qui se lient à Bp50, peuvent être utilises comme "adjuvants" afin d'augmenter une réponse immunitaire à un vaccin. En variante, ces coordinats peuvent être utilisés pour augmenter la réponse immunitaire d'un individu atteint   d'immunosuppression.   



   Dans une autre forme de réalisation, les coordinats de l'invention peuvent etre modifiés   chimi-   quement de teile sorte que les cellules auxquelles 

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 se lient les coordinats, soient tuées. Etant donné que tous les lymphocytes B expriment 11 antigène Bp50, cette méthode devrait aboutir   a   la suppression de la réponse immunitaire. Par exemple, un médicament cytotoxique relié à un coordinat de la présente invention peut etre utilise in vivo pour provoquer l'immunosuppression afin de franchir les barrières d'histocompatibilité chez des patients ayant regu une greffe ; en variante, ces coordinats modifiés peuvent être utilisés pour combattre des maladies auto-immunes. 



   Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, des malignités telles que des cellules tumorales exprimant   Bp50,   peuvent être traitées en utilisant un coordinat de l'invention relié à un agent   chimiothérapeutique   utile pour le traitement d'une telle maladie néoplasique. Ces   coordinats modifiés peuvent être utilisés in vivo   pour diriger   l'agent chimiotherapeutique   vers   n'im-   porte quel type de cellulesmalignes qui exprime l'antigène Bp 50, y compris les cellules-qui ne sont pas des lymphocytes B, mais qui expriment Bp50.

   Lorsqu'on utilise les coordinats de l'invention, qui augmentent la prolifération des lymphocytes B, on devrait bénéficier d'un avantage particulier lors du traitement des malignités   deslymphocytesBlorsque l'agent     chimiothérapeutique   relié au coordinat est un agent plus efficace pour tuer les cellules qui prolifèrent; dans ce cas, on devrait obtenir une potentialisation de l'effet du médicament. 



   En variante, les coordinats de l'invention   peuvent etre utilisés in vitro pour identifier ou   séparer des cellules qui expriment l'antigène Bp50 et/ou pour déterminer, dans les humeurs de l'organisme, la présence de l'antigène   Bp50   qui peut être perdu 

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 ou non. En outre, les coordinats de l'invention   peuvent être utilises in vivo pour visualiser des   cellules ou des tumeurs qui expriment l'antigène Bp50. 



   L'antigène   Bp50   purifié de la présente invention peut être utilisé pour former des anticorps, de meme que pour former ou concevoir d'autres coordinats de l'invention. En outre, l'antigène   Bp50   pourrait être utilisé dans des dosages tels que des immuno-dosages diagnostiques. De plus,   Bp50   lui-même peut être utilisé comme médiateur d'immunité cellu-   laire in vivo ou in vitro.   



     3. 1.   DEFINITIONS
Telles qu'elles sont utilisées dans la présente spécification, les abréviations suivantes auront les significations indiquées : AO = Orange   d'acridine   BCGF = Facteur de croissance des lyrnphocytes B 
 EMI10.1 
 BCGF (eleve) humain à 60 kDa = BCGFBCGF (faible) = BCGF humain à 12 kDa Bp35 = Polypeptide (CD20) superficiel spécifique aux lyrnphocytes B à 35 kDa, défini par mAb 1F5 Bp50 = Polypeptide superficiel spécifique aux lymphocytes B a 50 kDa, défini par mAb G28-5 Fv = Région variable ou site de fixation de l'antigène d'une molécule d'anticorps. 
 EMI10.2 
 



  11 peut s'agir la de n'importe quel fragment qui contient l'idiotype de la molécule, englobant, sans aucune limitation, Fab,   F (ab') , Fab'et   analogues. 



  IF = Immunofluorescence Ig = Immunoglobuline 
 EMI10.3 
 IL-1 = 
Interleucine lIL-2   = Interleucine   2 kDa   Kilodalton   

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 mAb = Anticorps monoclonal SDS-PAGE = Electrophorèse sur gel de polyacrylamide/ dodecyl-sulfate de sodium TPA = Acétate de 12-0-tétradécanoylphorbol-13. 



    4. DESCRIPTION DES FIGURES  
Figure 1. L'expression de Bp50 est restreinte à Bp35   lymphocytes B. L'analyse cytométrique   à écoulement bicolore de 50.   000 lynphocytes a été effec-   tuée comme décrit (Clark et   al.,   1985, Proc. Nat. 



  Acad. Sci. EUA   82 : 1766-1770).   On trace le diagramme des données par le nombre de lymphocytes vis-à-vis du logarithme de fluorescence verte et du logarithme de fluorescence rouge où 4-5 points représentent environ un doublage de fluorescence. Les données sont présentées afin de montrer des cellules négatives autofluorescentes. La coloration PE   (rouge) -anti-   Bp35   (lF5)   vis-à-vis de FITC (vert) -anti-Bp50 (G28-5) montre que toutes les cellules   Bp50+   sont également   Bp35+.   



   Figure 2. Comparaison biochimique du polypeptide de Bp50 avec d'autres antigènes superficiels de lymphocytes B. L'immunoprécipitation de Bp50 de   125 cellules amygdaliennes marquees 1 en surface a   été effectuée comme décrit. On a soumis des antigènes isolés à une électrophorèse sur des gels en plaques de dodecyl-sulfate de sodium à 10%/polyacrylamide sans réduction. Les gels ont été visualisés par autoradiographie et avec des écrans renforçateurs. 
 EMI11.1 
 



  Tableau A : colonne 1, (G28-5) ; colonne 2, anti-Bp95 (G28-8) ; colonne 3, Sépharose-chèvre anti-Ig de souris uniquement. Temps d'exposition 4 jours. Tableau B : colonne   1 ; anti-Bp50 (G28-5) ;   colonne 2, anti-Bp45 (BLASTE-2) ; colonne 3, anti-Bp39 (G28-1) ; colonne 4, anti-Bp39   (41--H16)   ; colonne 5,   Sepharose-chevre   anti-Ig de souris uniquement. On 

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 a choisi un temps d'exposition de deux jours de telle sorte que les bandes des colonnes 2 à 4 ne soient pas surexposées et qu'elles puissent être distinguées clairement par rapport   A   Bp50. Une expérience sur trois. 



   Figure 3. Analyse d'expression de Bp50 par immunofluorescence bicolore. Des cellules mononucléaires   amygdaliennes ou de   sang périphérique ont été isolées par centrifugation sur"Ficoll"et elles ont été colorées avec G28-5 (anti-Bp50) conjugué à PE (rouge) en combinaison avec des anticorps de   refe-   rence conjugués à la fluorescéine (vert), englobant 2C3 (anti-IgM) ; 1F5 (anti-Bp35) ; HB10a   (anti-DR) ;   et   9, 6   (anti-CD2, récepteur E). On a analyse les cellules avec un FACS IV   equipe   d'amplificateurs logarithmiques   A   quatre décades    &    la fois dans les dimensions du rouge et du vert. On a utilise un détecteur à spot mobile à angle en avant et   a   angle droit pour contrôler les monocytes.

   Les cellules non colorées sont placées sur le dos de la grille ; la fluorescence rouge est à droite et la fluorescence verte, à gauche. 



   Figure 4. Courbes de réponse à la dose pour 1'augmentation de la proliferation de lymphocytes B Er-amygdaliens denses par des anticorps anti- 
 EMI12.1 
 Bp50 comme indiqué : milieux uniquement ; anti-Bp50 uniquement plus anti-Bp35 (Spg/ml) uniquement ; BCGF uniquement ; anti-Bp35 plus BCGF ; anti-Bp35 plus doses graduées d'anti-Bp50. La prolifération moyenne erreur type de quatre échantillons a été mesurée le jour 3. 



   Figure 5. Les mAb   anti-Bp50   sont les plus efficaces pour l'augmentation de la prolifération s'ils sont ajoutés après un signal d'activation de lymphocytes B. On a incubé des lymphocytes B   Er- amygda-   liens denses pendant 4 jours avec des milieux unique- 

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 ment, on a ajouté anti-Bp50 (0,5  g/ml) à différents moments après l'incubation, on a ajoute anti-Bp35   (5 rg/ml) à différents   moments après l'incubation ; on a maintenu anti-Bp50 à une valeur constante puis, plus tard, à différents moments, on y a ajouté antiBp35 ; on a maintenu anti-Bp35 à une valeur constante puis, à différents moments, on a ajouté anti-Bp50 à des cultures. Au cours des 10 dernières heures, 
 EMI13.1 
 Q on a ajouté la 3H-thymidine et on a mesuré son incor- poration. 



   Figure 6. Comparaison de l'aptitude d'anti- 
 EMI13.2 
 amener deslymphocytes amygdaliens au repos à quitter le stade Go du cycle cellulaire. 



  Le jour 3 après le traitement, milieux uniquement    . Bp35 et, d'anti-Bp50 à (),   anti-Bp35 uniquement (-----) ; et anti-Ig uniquement   (.....), A,   pas d'additifs supplémentaires ; B, on a ajoute anti-Bp50   (0, 5 pglml) A chaque groupe   C, on a ajoute 5% de BCGF à chaque groupe. Les données sont reprises sous forme de diagrammes du nombre relatif de cellules vis-à-vis du logarithme de fluorescence rouge d'Orangé d'acridine (acide ribonucléique). 



   Figure 7. Cinétique de prolifération des   lymphocytesB après stimulation avec   anti-Bp50 vis-àvis de BCGF. On a stimulé des lymphocytes B   E-amygda-   liens denses avec des milieux uniquement ; 10% de BCGF uniquement ; anti-Bp35 uniquement ; anti-Bp50 uniquement   ; anti-Bp35   + 10% de   BCGF ;   anti-Bp35 + anti-Bp50 ; et anti-Bp35 + anti-Bp50 + 10% de BCGF. 



  On a mesuré la prolifération aux jours indiqués, par 
 EMI13.3 
 g une impulsion de 18 heures de 3H-thymidine. On a mesuré la prolifération en quadruplication et les erreurs types sont indiquées. Une expérience sur trois. 

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 EMI14.1 
 



  Figure 8. Temps s'écoulant par anti-Bp35lorsque (A) ou BCGF (B) augmente la prolifération de manière optimale. On a stimulé des lymphocytes B E-amygdaliens denses comme indiqué et on a mesuré la prolifération par une impulsion 
 EMI14.2 
 3 de 18 heures de 3H-thymidine le jour 3. Milieux anti-Bp35 uniquement ajoute auxtemps indiqués ; antiBp50 ou BCGF uniquement ; anti-Bp35 ajouté au début de la culture, puis addition d'anti-Bp50 ou de BCGF aux temps indiqués ; anti-Bp50 ou BCGF ajoute au début de la culture, puis addition d'anti-Bp35. Une   expé-   rience sur deux. On a mesure la prolifération en quadruplication et les erreurs types sont indiquées. 



  Doses utilisées : anti-Bp35, 5 ug/ml ; anti-Bp50, 
 EMI14.3 
 Ot2 BCGF (faible) 5%. Les concentrations utilisées étaient les suivantes : anti-Bp35, 5 pg/ml anti-Bp50, 0, ; BCGF, 5%. 



   Figure 9. Anti-Bp50 et BCGF exercent des effets additifs sur la prolifération des lymphocytes B. 



  Des lymphocytes B E- amygdaliens denses ont été stimu-   le s   avec des doses graduées de BCGF (faible) conjointement avec anti-Bp50 uniquement ; anti-Bp35 uniquement ; perles d'anti-Ig uniquement ; anti-Bp35 + antiBp50 ; ou anti-Bp50 + anti-Ig. La prolifération a été mesurée le jour 3 après stimulation avec une 
 EMI14.4 
 g impulsion de 18 heures de 3H-thymidine. On a mesuré la proliferation en quadruplication et les erreurs types sont indiquées. Une expérience sur quatre. 
 EMI14.5 
 Doses utilisées pour cellules. : anti-Bp35, 5 ? ; anti-Bp50, 0, ; perles d'anti-Ig, 50 Figure 10. Effets comparatifs d'anti-Bp50 et de BCGF sur des lymphocytes B normaux et malins. 



  On a stimulé des lymphocytes B E-de sang périphérique (A) ou des lymphocytes B E- amygdaliens denses (C) avec ou sans TPA (75 ng/ml) en présence de 10% de 

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 BCGF ou 1   pglml     d'anti-Bp50.   Deux lymphomes séparés   delymphocytesB (tableaux B   et D) ont été stimulés de la   meme   manière. On a mesuré la prolifération le jour 3 par incorporation de   3H-thymidine   au cours d'une impulsion de 12 heures. On a mesuré la proli-   fération   en quadruplication et les erreurs types sont indiquées. 



   5. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention concerne des coordinats 
 EMI15.1 
 qui (a) se lient à Bp50, qui est un polypeptide superficiel aux lymphocytes 50 kDa, et qui (b) augmentent la prolifération   delymphocytesB actives.   



  L'invention concerne également l'antigene Bp50 luimême qui est défini par mAb G28-5 et qui agit dans la prolifération des lymphocytes B. En outre, l'invention concerne des coordinats qui se lient A   Bp50,   mais qui n'exercent ni une fonction, ni un effet biologique tel que l'augmentation de la prolifération de lymphocytes B   activé s.   



   Les coordinats de la présente invention englobent des molécules d'anticorps, des molécules d'anticorps monoclonaux et des fragments de ces molecules-d ! anticorps, qui contiennent le site de fixation de l'antigene venant se lier au récepteur de Bp50, y compris les anticorps et les fragments modifiés chimiquement ; ces fragments englobent, sans aucune limitation, Fv, Fab,   F(ab'), Fab'et   analogues. 



  En outre, les coordinats de la présente invention comprennent des lymphokines venant se lier au récepteur de Bp50. Ces coordinats peuvent englober, sans aucune limitation, les BCGF, de même que des lymphokines modifiees chimiquement et analogues. Les coordinats de l'invention peuvent etre utilisés sous leurs formes modifiées ou non pour assurer la modulation et la régulation de réponses   immunitaires,   ainsi que dans la 

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 thérapie de malignités exprimant   l'antigène Bp50.   



   Ces utilisations sont décrites plus en détail dans le paragraphe   5. 4 ci-après.   



   Lorsque le coordinat est un anticorps mono- clonal ou un fragment de cet anticorps, on peut pré- parer l'anticorps monoclonal contre Bp50 en adoptant n'importe quelle technique assurant la production de molécules d'anticorps par des lignées de cellules continues en culture. Par exemple, la technique aux hybridomes initialement élaborée par Kohler et Milstein (1975, Nature 256 : 495-497), ainsi que d'autres techni- ques qui ont été mises plus récemment à disposition telles que la technique aux hybridomes des lymphocytes
B humains (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4 : 72) et la technique aux EBV-hybridomes pour la production d'anticorps monoclonaux humains (Cole et al., 1985,
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. 



   Liss,   Inc.,   pages 77-96) et analogues rentrent dans le cadre de la présente invention. 



   Des fragments d'anticorps contenant l'idiotype   'de   la molécule pourraient être engendrés par des techniques connues. Par exemple, de tels fragments englobent, sans aucune limitation : le fragment   F (ab')    qui peut être engendré en traitant la molécule d'anticorps avec de la pepsine ; les fragments Fab' qui peuvent être engendrés en réduisant les ponts disulfures du fragment   F (ab') p   ; le fragment    F (ab') 2   qui peut etre engendré en traitant la molécule d'anti- corps avec la papaine ; et les fragments 2Fab ou Fab qui peuvent   etre   engendres en traitant la molécule d'anticorps avec la papaine et un agent réducteur pour réduire les ponts disulfures. 



   Lorsque le coordinat qui se lie à Bp50,' est une lymphokine, celle-ci peut être obtenue à partir de sources naturelles   ousi sä sequence d'amino-acides   

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 est connue ou déduite, la lymphokine peut être synthétisée par des méthodes de   syntheseschimiques.   En variante, si la séquence des gènes de la lymphokine est connue, on peut adopter des techniques à l'acide désoxyribonucléique recombinant pour cloner le gène dans un vecteur d'expression assurant la transcription et la translation de la séquence de gènes dans une cellule   hote   appropriée. 



   Suivant son utilisation envisagée, le coordinat ou des fragments appropriés du coordinat peuvent être modifiés chimiquement en fixant l'un ou l'autre composé faisant partie d'une variété au coordinat en adoptant des techniques de couplage connues. De telles techniques peuvent englober, sans aucune limitation, l'utilisation du carbodiimide, du bromure de cyanogène, de réactifs difonctionnels tels que le glutaraldéhyde, de   3- (2-pyridyldithio) propionate   de   N-sueeinimidy1e   (SPDP), des réactions de bases de Schiff, la fixation   A   des fractions sulhydryle, l'utilisation d'isothiocyanate de sodium ou une liaison enzymatique, pour n'en citer que quelquesuns.

   Lorsqu'un radioisotope doit etre fixé au coordinat, on peut également recourir à des moyens enzymatiques, à une substitution oxydative, à une   chélation,   etc. Pour obtenir un aperçu des réactifs chimiques que l'on peut utiliser pour la modification des protéines, on se référera à Lundblad et Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification, volume   II,   CRC Press,   Inc.,   Boca Raton, Floride, chapitre 5, pages 123-139,1984. 



   Le couplage ou la liaison chimique d'un composé au coordinat pourrait etre dirigé vers un site du coordinat qui ne participe pas à la liaison   AL   Bp50. A cet effet, on pourrait protéger le site de fixation du coordinat avant d'effectuer la réaction 

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 de couplage. Par exemple, le coordinat peut etre tout d'abord lié à Bp50 afin de protéger le site de fixation de Bp50, après quoi la réaction de couplage peut etre effectuée pour relier le composé désiré aux sites réactifs disponibles sur le complexe coordinat/Bp50. Dès que la réaction de couplage est achevée, le complexe peut etre rompu, engendrant ainsi un coordinat modifié auquel le composé désiré est fixé, exerçant ainsi une influence minimale sur le site de la molécule, sur lequel se fixe Bp50. 



  Lorsque le coordinat comprend un anticorps monoclonal tel que G28-5, dans lequel le domaine Fc de la molecule n'est pas requis pour que le coordinat exerce son effet (voir paragraphe   5.3.3 ci-après), il   peut être avantageux de diriger le couplage des composés désirés vers le domaine Fc de la molécule. 



   Les sous-paragraphes ci-après décrivent le nouveau marqueur superficiel de lymphocytes B à 50 kDa,   A   savoir   Bp50,   qui apparemment agit dans la proliferation des lymphocytes B, ainsi que des coordinats qui se lient au nouveau récepteur à 50 kDa, ainsi que leurs 
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 utilisations. Pour donner un exemple des coordinats de la présente invention, on décrit également un anticorps monoclonal qui définit Bp50, ainsi que ses fragments F(ab')2 qui, tout comme BCGF, augmentent la prolifération des lymphocytes B. Contrairement   a   mAb anti-Bp35 qui peut amener des lymphocytes B au repos dans la phase    GO, à   entrer dans la phase G1, mAb anti-Bp50 n'active pas les lymphocytes B au repos.

   Les mAb anti-Bp35 et anti-Bp50 ensemble, sans aucun signal exogène   supplementaire,   provoquent une forte activation et une forte prolifération des lymphocytes B purifiés. 



   Les experiences décrites ci-après démontrent également que l'activité anti-Bp50 ressemble à l'activity 

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 BCGF, mais que anti-Bp50 est distinct d'un BCGF, étant donne qu'anti-Bp50 et BCGF de faible poids   moleculaire   sont nettement additifs et agissent différemment sur différents sous-ensembles ou malignités de lymphocytes B. Bp50 peut etre un récepteur pour un BCGF distinct ou pour un signal transmembrane qui module la production de BCGF ou l'expression du récepteur de BCGF. 



    5. 1.   METHODES ADOPTEES POUR CARACTERISER LE RECEPTEUR
Bp50
Préparations de cellules. On a isolé des cellules mononucléaires de sang périphérique normal ou leucémique hépariné par des gradients de Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ). On a obtenu des cellules mononucléaires à partir de tissus amygdaliens comme décrit par Clark et   al.,   1985, Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 82 : 1766-1770. On a épuisé des lymphocytes T avec formation de rosettes d'erythrocytes de mouton traités par AET (bromhydrate de bromure   d'amino-éthyl-isothiuronium)   et par séparation à gradient de Ficoll-Hypaque. Dans certaines expériences, des lymphocytes B du sang ont été enrichis en isolant des cellules adhérant à de la laine de nylon.

   On a éliminé les monocytes par incubation sur des boites de Petri en matière plastique une ou deux fois à   370C   pendant 45 minutes,. sauf indication contraire. On a isolé des fractions de lymphocytes B amygdaliens flottants ou denses par des gradients   echelonnes de Percoll   comme décrit par Clark et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 82 : 1766-1770. Des préparations de lymphocytes B amygdaliens denses comportaient logiquement plus de 95% de cellules sIg+ Bp35+. Des préparations enrichies de lymphocytes B du sang comportaient 60-85% de cellules   sIg+.   



  On a isolé des cellules lympholdes de lymphocytes B en dissociant modérément des cellules lympholdes 

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 en milieu, en procédant ensuite à une centrifugation à gradient de Ficoll-Hypaque. 



   Anticorps monoclonaux. On a engendré l'anticorps G28-5 dirigé contre Bp50 en immunisant des souris BALB/c avec des lymphocytes E- amygdaliens humains et en fusionnant des cellules spléniques immunes avec le myélome NS-1 (Kohler et al., 1975, Nature 256 : 495-497 ; Ledbetter et al., 1979, Immunol. Rev. 



  47 : 63-82). Des cultures de cellules hybrides sécrétant un anticorps réagissant avec des lymphocytes B amygdaliens et non avec des lymphocytes T ont été identifiées en utilisant l'immunofluorescence indirecte (IF) et une analyse avec un   selecteur   de cellules FACS IV ; des cultures comportant un anticorps donnant des tracés d'histogrammes semblables à ceux de mAb connus dirigés contre des pan-marqueurs de lymphocytes B (par exemple, Bp35) ont été clonées et sélectionnées pour des études complémentaires. Le clone de G28-5 a produit un mAb   d'IG   qui a réagi uniquement avec des lignées de lymphocytes B ou des lymphocytes B normaux ou malins. D'autres mAb utilisés lors de cette étude ont été décrits en détail par Clark et   al.,   1985, Proc. Nat. Acad. Sei.

   EUA 82 : 1766-1770 ; Clark et al., 1986, Human Immunol. 16 : 100 ; Ledbetter et al., 1986, Human Immunol. 15 : 30-44 ; Ledbetter et al., 1985, dans Perspective in Immunogenetics 
 EMI20.1 
 and HistOcOm2atibiLLtand Histocompatibility, ASHI, New York, 6, pages 325-340. Ces anticorps monoclonaux englobent 1F5 ) anti-Bp35, HbIlOa ), 2C3 (igG) anti-chalne f'G19-4 FC-2 (igG) de Fc CD16 et a a (IgG-anti-CD2 (récepteur E) fournis par le Docteur Paul Martin (Martin et al., 1983, J. Immunol.   131 : 180).   



  On a purifié les mAb d'IgGl par precipitation en utilisant du sulfate d'ammonium saturé à 45 ou 50% 

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 et une chromatographie en colonne de DEAE-Sephacryl et l'on a purifié les mAb d'IgG-en utilisant des a colonnes de Sépharose enduit de Protéine A. On a préparé les fragments F (ab')2 de G28-5 par la méthode de Parham (Parham, et al., 1983, J.   Immunol : 131 : 2895),   on les a purifiés dans une colonne de Sephacryl S200 de 2 mètres de long et on en a déterminé la pureté par SDS-PAGE (Ledbetter et al., 1985, J. Immunol. 



    135 : 1819).   Le mAb 2C3 dirigé contre des   chaines   a été conjugué avec des perles de Sépharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suède) en utilisant un couplage au bromure de cyanogène. 



   Conjugaisons à la fluorescéine et à la phyco- érythrine. Des mAb purifiés ont été soit directement conjugues avec la fluorescéine en utilisant l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC ; Molecular Probes) (vert) par la méthode de Goding (Goding, et   al.,   1976, J. Immunol. Meth. 13 : 215-226), soit conjugues à la   R-phycoérythrine   (PE) (rouge) en utilisant SPDP (Pharmacia) selon une méthode que la Demanderesse a décrite en détail dans Ledbetter et   al.,   1985, dans Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New   York,.   6,119-129.

   On a incubé des cellules lymphoïdes dans des plaques de microtitrage à fond rond pendant 30 minutes avec une dilution appropriée de mAb vert et/ou rouge, on les a lavées deux fois, puis on les a   analysees   dans un sélecteur de cellules FACS IV. 



   Immunofluorescence bicolore. On a pratique des études bicolores avec un sélecteur de cellules   activees   par fluorescence (FACS IV : Becton-Dickinson, Mountain View, CA) en utilisant un miroir dichroïque à 560 nm pour diviser le faisceau et un filtre à passage long 580 et un filtre   AL   passage court 540   (Ditric   Optics, Hudson, MA) devant les tubes photo- 

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 multiplicateurs du rouge et du vert respectivement. 



  En outre, on a utilisé un compensateur bicolore (T. Nozaki, Stanford University) en vue de corriger les débordements mineurs des signaux verts et rouges. 



  Pour chaque coloration bicolore, on a recueilli des données de 40. 000 cellules et on les a mémorisées sur des disques souples. Les données sont présentées sous forme d'un nombre de cellules (vertical) vis- à-vis du logarithme de fluorescence verte   vis-à-vis   du logarithme de fluorescence rouge sur une grille à 64 x 64 points. Une valeur d'environ 4, 5 points représente un doublage de fluorescence. Des cellules non colorées sont situées au coin arrière de la grille ; la fluorescence rouge est à droite et la fluorescence verte, à gauche.

   Le système de cytométrie à écoulement pour l'immunofluorescence bicolore avec la fluorescéine et la phycoérythrine est décrit plus en détail par Ledbetter et al., 1985, dans   Perspectives Immunogenetics and Histocompatibility,   ASHI, New York,   6, 119-129   et 325-340. 



    Culture de cellules : On a cultivé des   cellules   lympholdes     anygdaliennes   ou du sang à 5- 
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 5 10 x ml en quadruplication dans des plaques de microtitrage à 96 réservoirs contenant   200 ul   de milieu   RPMl-1640   additionné de 15% de sérum bovin foetal, d'antibiotiques, de glutamine et de pyruvate (R15). Après   1   à 7 jours, on a pulsé des cellules 
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 Q avec 0, de 3H-thymidine par reservoir (New England Nuclear, 6, Ci/millimole ; 1 Ci = 37) pendant 18 heures. On a ensuite récolté les cellules sur des filtres en fibres de verre avec un récolteur et on a mesuré la radioactivité dans un compteur à scintillation.

   Dans certaines expériences, on a ajouté des anticorps ou des facteurs à différents moments après le début des cultures ; au cours de ces   experience :   

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 on a mesuré la prolifération au jour 3. 



  Facteurs On s'est un BCGF purifié auprès   de"Cytokine Technology"   (Buffalo, New York), ne contenant aucune activité détectable d'IL-1, d'IL-2 ou d'interféron. Ce BCGF a été préparé par le procédé de Maizel et ses collaborateurs (Maizel et   al.,   1982,   Proc. Nat.   Acad. Sei. EUA 79 : 5998) qui ont démontré que 1'activité majeure de BCGF dans cette matière résidait dans une espèce à 12 kDa appelée ci-après"BCGF (faible)" (Mehta et al., 1985, J. Immunol.   135 : 3298).   Les étapes de purification comportaient une chromatographie d'affinité de DEAE à l'échelle de préparation, suivie d'une 
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 chromatographie en colonne d'hydroxylapatite. IL-1 a l'état pur jusqu'à homogénéité a été le don généreux du Docteur Steven Dower (Dower, et al., 1985, J. Exp. 



  Med.   162 : 501).   IL-2 recombinant a été aimablement fourni par"Cetus Corporation". TPA (acétate de   12-0-tétradécanoyl-phorbol-13)   a été fourni par "Sigma". 



   Détection de l'activation des cellules. 



  On a mesuré des changements provoqués dans le volume des cellules par mAb et/ou des facteurs en utilisant. un sélecteur de cellules et un détecteur à spot mobile à angle en avant. On a mesuré des changements de cycle cellulaire dans des teneurs en acide ribonucléique et en acide désoxyribonucléique cellulaires en colorant des cellules activées avec de l'Orangé d'acridine et en mesurant, les teneurs relatives en acide ribonucléique (rouge) et en acide   desoxyribo-   nucléique (vert) cellulaires avec un sélecteur de cellules selon la methode de Darzynkiewicz et al. 



  (Darzynkiewicz, et   al.,   1980, Proc. Nat. Acad. Sei. 



  EUA   77 : 6697-6702).   Les changements intervenant dans les teneurs relatives d'antigènes superficiels de 

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 cellules ont été contrôlés en utilisant un mAb directement conjugué avec la fluorescéine, puis on les a quantifiés par des teneurs d'immunofluorescence directe avec un   selecteur   de cellules Epics V. 
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  Caractérisation munoprecipitation de Bp50 hors de cellules amygdalien- nes marquees 125I en surface a été   effectuée comme décrit   par Ledbetter et   al.,   1985, J. Immunol.   134 : 4250-4254.   



  On a soumis des antigènes isolés à une électrophorèse sur des gels en plaques de SDS à 10%/polyacrylamide sans reduction. Les gels ont été visualises en recourant à une autoradiographie   à -70oC   et des écrans d'allégement plus renforcement Cronex (Dupont). 



     5. 2.   CARACTERISATION DU RECEPTEUR Bp50
Les sous-paragraphes ci-après décrivent les résultats des experiences effectuées en adoptant les méthodes décrites ci-dessus. 



     5. 2. 1.   IDENTIFICATION D'UN MARQUEUR SUPERFICIEL DE CELLULES   a 50 kDa. SPECIFIQUE   AUX LYMPHOCYTES 
 EMI24.2 
 B, Bp50 
On a élevé un anticorps mAb dirigé contre Bp50 en immunisant des souris BALB/c avec des lymphocytes amygdaliens humains et en fusionnant des cellules spléniques immunes avec le myélome de NS-1. Un clone, G28-5, a produit un mAb d'IgGl qui ne contenait pas la chalne légère de   NS-1.   Lors d'un examen minutieux pratique par analyse d'immunofluorescence, on a trouvé que G28-5 réagissait uniquement avec des lignées de lymphocytes B ou des lymphocytes B normaux ou malins. Une très large sélection de tissus normaux par des méthodes établies (Clark, et   al.,   1985, Proc. 



  Nat. Acad. Sei. EUA   82 : 1766-1770 ;   Ledbetter et al., 1986, Human Immunol. 15 : 30-44 ; Ledbetter, 1985, dans Perspectives in Immunogenetics and   Histocompatibility,   ASHI, New York, 6, pages 325-340) a révélé que l'anti- 

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 corps G28-5 réagissait avec des cellules négatives formant des rosettes E (Er-) provenant du sang ou des amygdales, mais non avec des lymphocytes T n'adhérant pas à la laine de nylon, des blastes de lymphocytes T provoqués par PHA (=   phytohémagglutinine)   ou avec des granulocytes du sang, des monocytes, des globules rouges ou des plaquettes.

     11   a réagi fortement avec toutes les sept lignées de cellules lymphoblastoldes B soumis à l'essai et avec trois lignées de lymphomes de Burkitt (Raji, Daudi, Namalwa), mais non avec quatre lignées de lymphocytes T (CEM, HSB-2, JURKAT et HPB-ALL). Toutes les leucémies lymphocytiques chroniques soumises à l'essai (3/3) et 90% (9/10) de lymphomes B soumis à l'essai ont exprimé le marqueur Bp50, tandis que 28% (2/7) seulement de leucémies lymphocytiques aiguës non T, non B CALLA+ ont exprimé   Bp50.   



   La répartition restreinte de   Bp50   sur des tissus normaux a été confirmée davantage par des analyses quantitatives d'immunofluorescence bicolore (IF bicolore). En utilisant un anticorps (rouge) conjugué à la   R-phycoerythrine   (PE) et dirigé contre le pan-antigène Bp35 de lymphocytes B   (bol,   CD20) et l'anticorps (vert) anti-Bp50 conjugué   bol   la fluorescéine, la Demanderesse a trouve que   Bp50   était exprimé uniquement sur des lymphocytes B   Bp35+   (figure 1) dans le sang ou les amygdales. Les lymphocytes B du sang ont exprimé logiquement Bp50 à des concentrations quelque peu inférieures   a   celles de lymphocytes B amygdaliens, ce qui est semblable à l'expression de HLA-DR (Ledbetter et al., 1986, Human Immunol. 



  15 : 30-44) et à l'expression de gp54 (Wang, et al., 1979, J. Exp. Med.   149 : 1424-1433),   qui sont également plus faibles sur les lymphocytes B du sang. Bp50 a été exprimé à des concentrations semblables sur 

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 des sous-populations de lymphocytes B amygdaliens séparées sur des gradients de Percoll en fractions flottantes et denses. En utilisant le mAb conjugue à PE et dirigé contre le marqueur de lymphocytes T,   CD3 (T3)   et le marqueur associé aux cellules NK,
CD16 (récepteur de Fc) (Ledbetter, et al., 1979,
Immunol. Rev.   47 : 63-82),   la Demanderesse a trouvé que Bp50 n'était pas exprimé sur les lymphocytes T ou les cellules NK.

   En faisant appel à l'immunofluorescence bicolore, la Demanderesse a également trouvé que des blastes de CD3+ PHA qui ont exprime des concentrations élevées de récepteurs d'IL-2, n'exprimaient pas Bp50. 



   L'anticorps G28-5 a réagi avec un seul polypeptide sur des lymphocytes amygdaliens qui ont migré à environ 50 Kd dans des conditions non réductrices (figure 2A). Cette molecule est plus grosse que celle des marqueurs de lymphocytes B mentionnés précédemment, dans le même intervalle de poids moleclaires, tels que   Bp39   ou Bp45 (Zipf, et al. 1983, J. Immunol. 131 : 3064-3072 ; Kitner, et al., 1981, Nature 294,458-460 ; Clark, et al., 1986, dans   - Leukocy. te Typing II, eds. Reinherz, et al., Springer   Verlag, Berlin, chapitre 12, volume 2, 155-167 ; 
 EMI26.1 
 Slovin, et al., 1982, Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 79 : 2649-2653 ; Thorley-Lawson, et   al.,   1985, J. Immunol. 



    134 : 3007-3012,   et figure 2B). Le temps d'exposition pour ce gel a été sélectionné de telle sorte que les poids moléculaires des autres marqueurs de lymphocytes B puissent être compares aisément avec Bp50. Contraitement à Bp50, le marqueur Bp39 est exprimé sur des granulocytes et, contrairement à Bp50, Bp45 est 
 EMI26.2 
 restreint aux blastes de lymphocytes B. Des anticorps dirigés contre Bp39 (41-H16) et Bp45 (MNM6, baste-1, blaste-2) fournis par un groupe de travail international 

 <Desc/Clms Page number 27> 

   (Clark, et al., 1986, dans Leukocyte Typing II, eds.   



  Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlin, chapitre 12, volume 2,155-167) n'ont pas bloque la liaison d'anticorps   anti-Bp50   traités à la fluorescéine, à des lymphocytes B. Dès lors, sur la base de la répartition des tissus, de l'analyse biochimique et d'études de blocage, l'anticorps monoclonal   G28-5   reconnalt une structure à 50 Kd distincte de celle d'autres antigènes connus de lymphocytes B. 



   5. 2. 2. L'EXPRESSION DE Bp50 EST RESTREINTE   AUX LYMPHOCYTES B.   



   Des études de répartition de lignées de 
 EMI27.1 
 cellules et de tissus hematopoletiques, ainsi que des anaLyses cytaretriques detaillées a écoulspent bicolore ontrévélé que Bp50 était exprimé uniquement sur des lymphocytes B. Comme illustre en figure 3, Bp50 est exprimé sur un petit sous-ensemble de lymphocytes du sang et sur une grande population de lymphocytes amygdaliens. Pratiquement tous les lymphocytes Bp50+ a la fois du sang et des amygdales ont également exprimé Bp35 et HLA-DR, mais ils n'ont pas exprimé les molécules de lymphocytes T, CD2 (figure   1)   ou CD3, non plus que les récepteurs Fc d'IgG qui se trouvent sur les cellules NK. De plus, des blastes de lymphocytes T CD3+ activés par ConA ont exprimé des récepteurs d'IL-2, mais non Bp50. 



   Des analyses   cytométriques   à écoulement bicolore permettent la mesure quantitative de la relation de densité. entre deux antigènes superficiels. 



  La Demanderesse a indiqué précédemment que les lymphocytes B denses au repos situés dans la zone périphérique de follicules secondaires exprimaient IgM et de faibles concentrations de Bp35, tandis que les lymphocytes B activés flottants se trouvant dans le centre germinatif sont Im-négatifs et expriment des concentrations 

 <Desc/Clms Page number 28> 

 
 EMI28.1 
 élevées de Bp35 (Ledbetter, et al., Human Immunol. 15 La figure 3 montre qu'à la fois des sousensembles de lymphocytes B IgM-positifs et IgM-néga- tifs ont exprimé Bp50 en quantités égales, indiquant ainsi que   Bp50   est exprime à la fois sur des lymphocytes B au repos et des lymphocytes B activés in vivo. 



   5. 3. AUGMENTATION DE LA PROLIFERATION DES   LYMPHOCYTES B AVEC L'ANTICORPS ANTI-Bp50.   



   Ainsi qu'on l'a exposé précédemment, des lymphocytes B peuvent être activés avec de faibles doses d'anticorps spécifiques aux chaines   anti-u.   



  Récemment, la Demanderesse a découvert que le marqueur Bp35   (Bl)   spécifique aux lymphocytes B,   AL   savoir un polypeptide à 35 kDa, pouvait également remplir sa fonction lors de l'activation précoce des lymphocytes B : tout comme de faibles doses d'anticorps   anti-,   le mAb 1F5 dirige contre Bp35 active les lymphocytes B de telle sorte que leur volume et leur teneur en acide ribonucléique augmentent et afin qu'ils deviennent sensibles au BCGF (Clark, et al., 1985, Proc. 



  Nat. Acad. Sei. EUA 82 : 1766-1770 ; Gollay, et al., 1985, J. Immunol.   135 : 3795-3801).   En consequence, il a été intéressant de comparer l'effet du mAb anti-   Bp50   dans la prolifération de lymphocytes B non traités ou de lymphocytes B activés soit avec des anticorps anti-Bp35, soit avec des anticorps   anti-u   (tableau 1). 



  Dans des conditions appropriées uniquement, des anticorps anti-Bp35 en solution ou des anticorps anti-pu fixés à des perles de Sépharose pourraient stimuler une certaine prolifération de lymphocytes B (tableau   1,   ligne   1)   ; en revanche, des anticorps   anti-Bp50   seuls n'ont pas stimulé la prolifération (tableau 1, ligne 2). Toutefois, mAb anti-Bp50 a augmenté considérablement la prolifération lorsqu'il a été cultivé 
 EMI28.2 
 avec des perles anti-u ou avec anti-Bp35. A cet égard, I 

 <Desc/Clms Page number 29> 

 anti-Bp50 ressemblait à BCGF (tableau   1,   ligne 3). 



  Dès lors, il a été important de déterminer si antiBp50 et BCGF ensemble pouvaient provoquer la prolifération des lymphocytes B. Comme illustre dans le tableau   1,   ligne 4, anti-Bp50 et BCGF ensemble n'ont provoque aucune prolifération, mais ils ont augmenté la prolifération de cellules activées par   anti-?   ou anti-Bp35 à un degré quelque peu supérieur à l'un ou l'autre stimulant seul.

   Dans un intervalle à trois logarithmes et lorsqu'il a été utilise avec anti-Bp50 sans autres signaux, BCGF n'a eu aucun effet sur la prolifération de lymphocytes B denses, même lorsqu'on a utilisé anti-Bp50 à des doses se situant dans l'intervalle allant de 0, 1 à 10   pglml.   
 EMI29.1 
 TABLEAU 1 Augmentation de la prolifération des lymphocytes B, provoquée par anti-Ig ou anti-Bp35, avec des anticorps anti-Bp50 
 EMI29.2 
 
<tb> 
<tb> Prolifération <SEP> moyenne <SEP> erreur <SEP> type <SEP> de
<tb> lymphocytes <SEP> B <SEP> cultivés <SEP> avec <SEP> :

   <SEP> 
<tb> Lignée <SEP> Co-sti-Perles <SEP> Anti-Bp35 <SEP> 
<tb> mulant <SEP> Milieux <SEP> anti
<tb> 1 <SEP> Néant <SEP> 1. <SEP> 212+547 <SEP> 10. <SEP> 219+462 <SEP> 5. <SEP> 539+308 <SEP> 
<tb> 2 <SEP> Anti-Bp50 <SEP> 719+718 <SEP> 38. <SEP> 792+1. <SEP> 329 <SEP> 25. <SEP> 465+616 <SEP> 
<tb> 3 <SEP> BCGF <SEP> 456+217 <SEP> 14. <SEP> 217+445 <SEP> 9. <SEP> 443+343 <SEP> 
<tb> 4 <SEP> Anti-Bp50
<tb> + <SEP> BCGF <SEP> 1. <SEP> 456+126 <SEP> 54. <SEP> 393+2. <SEP> 537 <SEP> 46. <SEP> 488+3. <SEP> 387 <SEP> 
<tb> 
 
 EMI29.3 
 La prolifération de lymphocytes B amygdaliens Erdenses (95% de cellules IgM+ superficielles) a été mesurée le jour 3, comme décrit.

   En résumé, on a 
 EMI29.4 
 5 cultive 2 x cellules/rEservoir de 200 PI en quadruplication pendant 48 heures avec le milieu 

 <Desc/Clms Page number 30> 

 RPMI 1640 contenant 15% de sérum bovin foetal plus des additifs sans anticorps, ou avec l'anticorps monoclonal 2C3 dirigé contre des   chaines u, couplé   
 EMI30.1 
 à des perles de Sépharose ("perles anti-u", 50 pg/ml) ou l'anticorps anti-Bp35 1F5 libre (5   pglml).   Des cultures contenant des milieux, des"perles anti-u" ou anti-Bp35 ont été cultivées seules ou avec BCGF (concentration finale : 5%, Cytokine Technology, Buffalo, New York ; aucune activité détectable d'IL-l ou IL-2), avec anti-Bp50 (dilution   1 : 1. 000 d'ascites)   comme co-stimulants.

   Après 40 heures, on a pulsé 
 EMI30.2 
 g des cellules avec 3H-thymidine et l'on a mesuré les coups incorporés après 18 heures. 



     5. 3. 1.   mAb ANTI-Bp50 AUGMENTE LA PROLIFERATION UNIQUEMENT APRES QUE LES LYMPHOCYTES B ONT ETE ACTIVES PAR DES ANTICORPS ANTI-Bp35 ou ANTI-u. 



   Les résultats du tableau   1   suggèrent que mAb anti-Bp50 ne pourrait, en lui-meme,'provoquer une prolifération. Comme indiqué en figure 4, des   doses d'anti-Bp50 se situant entre 0, 05 ug et 2, 0 ut/ ml n'ont eu aucun effet sur la fixation de la 3H-   thymidine. Toutefois, en présence de concentrations optimales de mAb anti-Bp35, une concentration aussi faible que   0, 1 à 0, 5 rg/ml d'anticorps anti-Bp50   a augmenté sensiblement la prolifération.

   Des valeurs aussi élevées que   50. 000 à 70. 000   coups par minute ont pu être détectées au moment optimum de la prolifération lorsque des lymphocytes B hautement purifiés ont été cultivés uniquement avec anti-Bp35 plus   anti-Bp50.   Ainsi qu'on l'a observé logiquement, les doses supérieures   d'anti-Bp50   (plus de 2-5   pglml)   ont été moins efficaces que des doses se situant dans l'intervalle de 100-200 ng. 



   Ces résultats ont suggéré que anti-Bp50 

 <Desc/Clms Page number 31> 

 pouvait remplir sa fonction uniquement apres l'activation des lymphocytes B par d'autres signaux. Les données de la figure 5 suggèrent que ceci est, en fait, le cas. Si les lymphocytes B étaient tout d'abord activés avec anti-Bp35, anti-Bp50 pourrait être ajouté jusqu'à 24-48 heures plus tard en augmentant toujours la proliferation au jour 4. En revanche, lorsque les cellules ont tout d'abord été traitées avec anti-Bp50, anti-Bp35 n'a été efficace que lorsqu'il a été ajouté endéans quelques heures après le démarrage des cultures. On a trouvé des résultats semblables lorsqu'on a utilisE anti-u plutôt qu'antiBp35. 



     5. 3. 2.   LES mAb ANTI-Bp50 N'ACTIVENT PAS LES LYMPHOCYTES B DE LA PHASE GOt MAIS ILS AMENENT LES LYMPHOCYTES B ACTIVES A PROGRESSER A TRAVERS LE CYCLE CELLULAIRE. 



   Antérieurement, la Demanderesse a trouvé que, tout comme de faibles doses d'anticorps   anti-u,   anti-Bp35 amenait des lymphocytes B amygdaliens au repos en phase GO à s'agrandir (Clark, et al., 1986,   Leukocyte. Typing 11. eds..   Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlin, volume 2,455-462) et à entrer dans la phase   G.   du cycle cellulaire (Gollay et   al.,   1985, J. Immunol.   135 : 3795-3801). Dès   lors, il a été intéressant de comparer les facultés de mAb antiBp50 et de mAb anti-Bp35 concernant leurs effets sur l'activation des lymphocytes B.

   Comme indiqué en figure 6A, meme après 3 à 4 jours en culture, des lymphocytes B amygdaliens denses non stimulés avaient un profil uniforme d'acide ribonucléique, caractéristique des cellules en phase Go (Darzynkiewicz, 1980, Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 77 : 6697-6702). Toutefois, environ 15-30% de cellules stimulées avec anti-Bp35 ou   anti-?   avaient une plus forte teneur 

 <Desc/Clms Page number 32> 

 en acide ribonucléique, indiquant ainsi leur entrée dans la phase   G   En revanche, ni anti-Bp50 (figure 6B), ni BCGF (figure   60   seuls n'ont pas amené des nombres importants de lymphocytes B à entrer dans la phase   G..   Par exemple, 2 jours après l'activation, des mAb anti-Bp35 et anti-Ig ont amené respectivement 13, 5 et 20, 9% de cellules amygdaliennes à entrer dans la phase G1,

   tandis que des cellules traitées uniquement avec anti-Bp50 (2, 7%) ou BCGF (3, 2%) sont restées à des concentrations de milieux témoins (2, 2%). Toutefois, lorsque anti-Bp50 ou BCGF a été ajouté conjointement avec des anticorps antiBp35 ou   anti-n,   la proportion de cellules entrant dans la phase   G.   a augmente considérablement. De même, anti-Bp50 et BCGF seuls n'ont pas amené les lymphocytes B à entrer dans la phase S (tableau 2) mais, conjointement avec anti-Bp35 ou   antijP, i15   ont augmenté   deux à   trois fois le nombre de cellules en phase S. 

 <Desc/Clms Page number 33> 

 



    TABLEAU 2   Effet   d'anti-Bp50   et de BCGF sur la Progression du cycle cellulaire dans des lymphocytes amygdaliens. 
 EMI33.1 
 
<tb> 
<tb> 



  Signal <SEP> de <SEP> Signal <SEP> de <SEP> Cellules, <SEP> %
<tb> compétence <SEP> progression <SEP> G0 <SEP> G1 <SEP> S/G2/M
<tb> Milieux <SEP> Néant <SEP> 89, <SEP> 9. <SEP> 7, <SEP> 1 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> anti-Bp35 <SEP> " <SEP> 80,4 <SEP> 14,5 <SEP> 3,7
<tb> anti-Ig"65, <SEP> 6 <SEP> 27, <SEP> 6 <SEP> 5, <SEP> 7 <SEP> 
<tb> Milieux <SEP> anti-Bp50 <SEP> 83, <SEP> 6 <SEP> 12, <SEP> 0 <SEP> 3, <SEP> 3 <SEP> 
<tb> anti-Bp35 <SEP> " <SEP> 54,1 <SEP> 35,5 <SEP> 9,7
<tb> anti-Ig <SEP> " <SEP> 43,6 <SEP> 36,2 <SEP> 16,2
<tb> Milieux <SEP> BCGF <SEP> 85, <SEP> 4 <SEP> 11, <SEP> 7 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> anti-Bp35 <SEP> " <SEP> 56,6 <SEP> 32,6 <SEP> 11,6
<tb> anti-Ig <SEP> " <SEP> 48,4 <SEP> 36,1 <SEP> 14,1
<tb> 
 
 EMI33.2 
 Pourcentage de cellules dans les phases G, ou S et   G,

   déterminé   en adoptant le procédé de coloration à l'Orangé d'acridine (Darzynkiewicz, et   al.,   1980, Proc. Nat. Acad. Sei. EUA   77 : 6697-6702) j   1 x 106 lymphocytes amygdaliens denses avec anti-Bp35 (5   fg/ml),     anti-?   sur perles (50 pg/ml), anti-Bp50 (0,4  g/ml), BCGF (5%) ou leurs combinaisons, comme indiqué. 



   5. 3. 3. CONDITIONS OPTIMALES POUR AUGMENTER LA PROLIFERATION DES LYMPHOCYTES B AVEC DES ANTICORPS ANTI-Bp50
En eux-mêmes, des anticorps dirigés contre   Bp50   ont peu ou pas d'effet détectable sur des lymphocytes B denses au repos (tableau 3). Toutefois, en présence d'agents qui peuvent activer des lymphocytes B, par exemple, anti-Ig, anti-Bp35 et TPA, mAb anti-   Bp50   a augmenté nettement la proliferation. Anti-Bp50 

 <Desc/Clms Page number 34> 

 n'a pas provoque de co-stimulation avec différentes interleucines, y compris IL-1 purifiée, IL-2 recombinante et BCGF (faible). Une comparaison des effets   d'anti-Bp50   avec ceux de BCGF (faible) a révélé que les mêmes agents qui étaient co-stimulants avec anti-   Bp50,   étaient également co-stimulants avec BCGF (faible) (tableau 3).

   Il a été particulièrement intéressant de découvrir que BCGF et anti-Bp50 ensemble n'étaient toujours pas co-stimulants pour des cellules au repos. 



    TABLEAU 3   Augmentation de la prolifération des lymphocytes B avec des anticorps anti-Bp50 ou un facteur de croissance de lymphocytes B 
 EMI34.1 
 
<tb> 
<tb> Prolifération <SEP> moyenne <SEP> ! <SEP> erreur <SEP> type <SEP> de
<tb> lymphocytes <SEP> B <SEP> cultivés <SEP> avec <SEP> :

   <SEP> 
<tb> Co-stimulant <SEP> Milieux <SEP> Anti-Bp50 <SEP> BCGF
<tb> (200 <SEP> ng/ml) <SEP> (5%)
<tb> Néant <SEP> 96 <SEP> + <SEP> 1 <SEP> 267 <SEP> + <SEP> 15 <SEP> 285 <SEP> + <SEP> 74
<tb> Anti-Ig <SEP> 5. <SEP> 833 <SEP> + <SEP> 391 <SEP> 41. <SEP> 634 <SEP> + <SEP> 2. <SEP> 103 <SEP> 25. <SEP> 094 <SEP> + <SEP> 61
<tb> Anti-Bp35
<tb> (5 g/ml) <SEP> 457 <SEP> # <SEP> 45 <SEP> 8.143 <SEP> # <SEP> 280 <SEP> 1.733 <SEP> # <SEP> 32
<tb> TPA <SEP> (2 <SEP> ng/ml) <SEP> 7. <SEP> 361 <SEP> + <SEP> 537 <SEP> 21. <SEP> 163 <SEP> + <SEP> 871 <SEP> 13. <SEP> 064 <SEP> + <SEP> 1. <SEP> 030 <SEP> 
<tb> 11. <SEP> -1 <SEP> (10 <SEP> V/ml) <SEP> 264 <SEP> + <SEP> 2 <SEP> 308 <SEP> + <SEP> 23 <SEP> 221 <SEP> + <SEP> 8
<tb> IL-2 <SEP> (100 <SEP> U/ml) <SEP> 204 <SEP> + <SEP> 34 <SEP> 350 <SEP> + <SEP> 7 <SEP> 220 <SEP> + <SEP> 11.
<tb> 



  BCGF <SEP> (5%) <SEP> 220 <SEP> + <SEP> 7 <SEP> 851 <SEP> + <SEP> 28 <SEP> 270 <SEP> + <SEP> 18
<tb> 
 
 EMI34.2 
 Lymphocytes B Er-amygdaliens denses (plus de 95% de cellules sIgM) pendant 48 heures à 2 x cellules/reservoir, puis par impulsion 3 pendant 24 heures avec la 3H-thymidine avant le comptage. 

 <Desc/Clms Page number 35> 

 



   La cinétique de prolifération augmentée par anti-Bp50 est illustrée en figure 7. Le pic de proliferation est apparu au jour 4, puis il a décliné, que les cellules ont été activées ou non avec anti-Bp35 ou d'autres activateurs tels que anti-Ig ou TPA. La cinétique de prolifération augmentée par BCGF ou par anti-Bp50 était semblable. 



   Une quantité aussi faible que   0, 05 fg   d'anticorps anti-Bp50 a augmenté la prolifération. 



  Au cours   d'etudes   ultérieures, on a utilise une dose optimale de   0, 3 fg/ml.   On a observé logiquement   quoten   utilisant des molécules entières d'anticorps, des doses plus élevées   d'anti-Bp50   (plus de 2-5 ug/ml) étaient moins efficaces que des. doses se situant dans l'intervalle allant de 0, 1   à 0, 5 fg/ml.   



   Les lymphocytes B humains sont extrêmement sensibles aux effets inhibiteurs provoqués par les récepteurs Fc d'anticorps venant se lier à Ig superficielle (Parker, 1980, Immunol. Rev. 52 : 115 ; Bijsterbosch, et   al.,   1985, J. Exp. Med. 162 : 1825). 



  Des lors, il a été important de comparer l'efficacité de mAb anti-Bp50 entier avec celle de fragments   F (ab') 2 anti-Bp50.   Dans un intervalle de dosage au centuple, des fragments   F (ab') etaient   manifestement aussi efficaces, voire même plus efficaces qu'un anticorps entier concernant l'augmentation de la prolifération des lymphocytes B (tableau 4). Dès lors, le domaine Fe de mAb anti-Bp50 n'est pas requis pour que anti-Bp50 exerce son effet et il peut etre   meme   inhibiteur.

   En d'autres mots, tout comme BCGF, anti-Bp50 peut apparemment agir comme médiateur soluble sans faire appel à la fonction cellulaire accessoire avec le récepteur Fc comme médiateur 

 <Desc/Clms Page number 36> 

 
TABLEAU 4 Le domaine Fc d'anticorps anti-Bp50 n'est pas requis pour augmenter la prolifération des lymphocytes B 
 EMI36.1 
 
<tb> 
<tb> Prolifération <SEP> moyenne <SEP> des
<tb> lymphocytes <SEP> B <SEP> cultivés <SEP> avec <SEP> :

   <SEP> 
<tb> Anti-Bp50 <SEP> Dose <SEP> Milieux <SEP> Anti-Bp35
<tb> (ug/ml)
<tb> Néant <SEP> -- <SEP> 295 <SEP> + <SEP> 16 <SEP> 269 <SEP> + <SEP> 27
<tb> Ab <SEP> entier <SEP> 0, <SEP> 125 <SEP> 278 <SEP> + <SEP> 32 <SEP> 5. <SEP> 140 <SEP> + <SEP> 20
<tb> 1, <SEP> 25 <SEP> 275 <SEP> + <SEP> 24 <SEP> 4. <SEP> 686 <SEP> + <SEP> 342
<tb> 12, <SEP> 5 <SEP> 163 <SEP> + <SEP> 15 <SEP> 3. <SEP> 852 <SEP> + <SEP> 203
<tb> F <SEP> (ab') <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 125 <SEP> 594 <SEP> + <SEP> 21 <SEP> 10. <SEP> 635 <SEP> + <SEP> 449
<tb> 1, <SEP> 25 <SEP> 531 <SEP> + <SEP> 3 <SEP> 10. <SEP> 893 <SEP> + <SEP> 575 <SEP> 
<tb> 12, <SEP> 5 <SEP> 279 <SEP> + <SEP> 8 <SEP> 9.411 <SEP> + <SEP> 870
<tb> 
 
 EMI36.2 
 Les conditions de culture des cellules étaient celles décrites dans le tableau 3. 



  5. DIFFERENCES ENTRE L'ACTIVITE D'ANTI-Bp50 ET DE BCGF (FAIBLE). 



  Anti-Bp50 et BCGF (faible) exerçaient un effet semblable sur les lymphocytes B et ils étaient co-stimulants avec les mêmes agents (tableau 3). 



  Toutefois, plusieurs ordres de preuve indiquent   qu'anti-Bp50   et le BCGF utilisés lors de cette étude, entrent manifestement en jeu à 1'intervention de signaux différents. En premier lieu, contrairement aux récepteurs de BCGF (faible) (Bijsterbosch, et al., 1985, J. Exp. 



  Med. 162 : 1825), les molécules de Bp50 sont exprimées sur des lymphocytes B au repos du sang (figure 3). 



  En second lieu, bien   qu'à   la fois anti-Bp50 et BCGF (faible) exercent le plus efficacement leur fonction lorsqu'ils sont ajoutés après anti-Bp35 ou anti-Ig, 

 <Desc/Clms Page number 37> 

 anti-Bp50 a exercé manifestement son effet optimum lorsqutil a été ajouté 12 heures après que les cultures ont commencé (figure 8A). En revanche, BCGF (faible) a pu être ajouté au bout d'une période aussi longue que 24 heures après le démarrage des cultures ; tout en augmentant encore de manière optimale la prolifération (figure 8B). Ces expériences cinétiques, qui sont modelees sur la méthode de Howard et Paul (1983, Ann. Rev. Immunol.   1 : 307), suggèrent qu'un   signal dépendant de   Bp50   peut normalement exercer son effet avant BCGF. 



   Anti-Bp50 et BCGF (faible) ont augmenté tous deux la prolifération des lymphocytes B activés avec anti-Bp35 ou anti-Ig (tableau 3). Toutefois, les effets d'anti-Bp50 et de BCGF (faible) étaient additifs dans bon nombre d'expériences (figure 7). 



  La figure 9 illustre un titrage de BCGF (faible) au cours d'une expérience dans laquelle on a utilisé anti-Bp50 à sa concentration optimale   (0, 2 ug/ml).   



  BCGF (faible) a pu augmenter davantage la prolifération de lymphocytes B au repos en présence d'antiBp50 après activation soit par anti-Ig, soit par anti-Bp35. Des concentrations-optimales de BCGF (faible) étaient de 5-10%, tandis que des concentrations de 25% étaient inhibitrices. Dès lors, lorsqu'on a utilisé à la fois anti-Bp50 et BCGF (faible) à leurs concentrations optimales, ils ont toujours exercé des effets additifs sur la prolifération des lymphocytes B. 



   Enfin, à la fois les sous-ensembles de lymphocytes B normaux et de lymphocytes B malins se différencient par leur réponse à anti-Bp50 et à BCGF 
 EMI37.1 
 (faible). Par exemple, certains lymphocytes B du sang ont été sensibles à BCGF (faible), mais ils n'ont pas répondu à anti-Bp50 (tableau 5). Un signal 

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   . d'activation supplementaire   tel   qu'anti-Bp35   (tableau 5) ou TPA (figure 10) était logiquement nécessaire pour que les lymphocytes B du sang puissent répondre à anti-Bp50. Bien qu'en règle générale, des lymphocytes B amygdaliens denses n'aient pas répondu soit 
 EMI38.1 
 a BCGF, soit à anti-Bp50, les lymphocytes B flottants ont répondu (tableau 5).

   Les malignités des lymphocytes B se différenciaient également par leur sensibilité à anti-Bp50   vis-à-vis   de BCGF. Par exemple, certains lymphomes de lymphocytes B ont répondu à TPA plus BCGF   (faible),   mais non à TPA plus anti-   Bp50   G28-5 (figures lOB et D). En revanche, des lymphocytes B amygdaliens denses et des lymphocytes B de sang périphérique ont répondu à TPA plus BCGF (faible) ou anti-Bp50 (figures 10A et C). 

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   TABLEAU 5 Les sous-ensembles de lymphocytes B se différencient par leur sensibilité à anti-Bp50 ou BCGF 
 EMI39.1 
 
<tb> 
<tb> Prolifération <SEP> moyenne <SEP> (+ <SEP> erreur <SEP> type <SEP> de <SEP> la <SEP> moyenne) <SEP> de
<tb> lymphocytes <SEP> provenant
<tb> du <SEP> sang <SEP> des <SEP> amygdales
<tb> Stimulation <SEP> Expérience <SEP> Expérience <SEP> Expérience <SEP> denses <SEP> flottants <SEP> 
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 
<tb> Néant <SEP> 527 <SEP> # <SEP> 70 <SEP> 659 <SEP> # <SEP> 133 <SEP> 906 <SEP> # <SEP> 106 <SEP> 385 <SEP> # <SEP> 43 <SEP> 387 <SEP> # <SEP> 12
<tb> BCGF <SEP> (5%) <SEP> 13.918 <SEP> # <SEP> 37.584 <SEP> # <SEP> 3.347 <SEP> # <SEP> 174 <SEP> 332 <SEP> # <SEP> 33 <SEP> 1.451 <SEP> # <SEP> 57
<tb> 1. <SEP> 082 <SEP> 2.

   <SEP> 023 <SEP> 
<tb> Anti-Bp50 <SEP> (0,5 g/ml) <SEP> 519 <SEP> # <SEP> 28 <SEP> 1.013 <SEP> # <SEP> 81 <SEP> 1.151 <SEP> # <SEP> 28 <SEP> 472 <SEP> # <SEP> 8 <SEP> 1.543 <SEP> # <SEP> 20
<tb> Anti-Bp35 <SEP> (5 <SEP>  g/ml) <SEP> 554 <SEP> # <SEP> 90 <SEP> 645 <SEP> # <SEP> 89 <SEP> 665 <SEP> # <SEP> 115 <SEP> 2.415 <SEP> # <SEP> 80 <SEP> 1.129 <SEP> # <SEP> 68
<tb> Anti-Bp50 <SEP> + <SEP> anti-Bp35 <SEP> - <SEP> 12. <SEP> 274 <SEP> + <SEP> 546 <SEP> 15. <SEP> 667 <SEP> + <SEP> 333 <SEP> 36. <SEP> 589 <SEP> + <SEP> 1. <SEP> 335 <SEP> 4. <SEP> 843 <SEP> + <SEP> 136
<tb> Anti-Bp50 <SEP> + <SEP> BCGF--3. <SEP> 943 <SEP> + <SEP> 115 <SEP> 1. <SEP> 342 <SEP> + <SEP> 19 <SEP> 2. <SEP> 899 <SEP> + <SEP> 91
<tb> 
 Conditions de culture de cellules comme décrit au tableau 1.

   Des lymphocytes du sang adhérant à la laine de nylon (lymphocytes B plus monocytes) ont été épuisés de leurs monocytes par incubation sur des boites en matière plastique pendant une nuit avant la stimulation (expérience 1 et expérience 2). 



  Au cours de l'expérience 3, des lymphocytes E du sang ont été épuisés de leurs monocytes par incubation sur des boîtes en matière plastique pendant   1   heure avant la stimulation.   Des lymphocytes Er-amygdaliens   ont été fractionnés, en utilisant des gradients de Percoll, en sous-ensembles (32) denses (pastilles) ou flottants (fraction 1). 

 <Desc/Clms Page number 40> 

 
 EMI40.1 
 



  5. UTILISATIONS DE COORDINATS ANTI-Bp50 IL- 
4.ET DE   Bp50.   



   Les coordinats de la présente invention   peuvent être utilisés in vivo ou in vitro tant sous   leurs formes non modifiées que sous leurs formes rnodifiées, pour moduler des réponses   innunitaires.   Par exemple, les coordinats eux-mêmes peuvent être utilisés   comme"adjuvants"afin d'augmenterune reponse immunitaire    à un vaccin ou afin   d'augmenterla reponse immunitaire   d'un individu atteint d'immunosuppression. En variante, si des cytotoxines ou des agents   anti-prolifératifs   sont couplés aux coordinats, ces coordinats modifies peuvent être utilisés pour diminuer la réponse immunitaire, par exemple, dans une maladie auto-immune ou chez des patients ayant reçu une transplantation afin d'éviter le rejet du greffon.

   Ces coordinats modifiés pourraient également être utilisés pour traiter des malignités où interviennent des cellules ou des tumeurs qui expriment l'antigène Bp50, que la malignité trouve son origine dans des lymphocytes B ou non. 



   Les coordinats de la présente invention   et/ou BpSO lui-même peuvent être utilisés in vitro. 



  De telles applications englobent des dosages in vitro   tels que des immuno-dosages pour la detection de cellules qui expriment l'antigène   Bp50   et/ou pour la détection de l'antigène Bp50 éventuellement perdu dans les humeurs de l'organisme. Dans ce cas, le coordinat ou Bp50 pourrait etre marqué avec un radiomarqueur, le fluor, une enzyme, un substrat d'enzyme, un colorant, etc. En outre, les coordinats peuvent être utilisés pour séparer et/ou identifier des cellules qui expriment l'antigène   Bp50,   auquel cas le coordinat peut etre couplé   A   un support immobile ou à un fluor qui peut etre utilisé dans un FACS (sélecteur de cellules activées par fluorescence). 

 <Desc/Clms Page number 41> 

 



   Les différentes applications et utilisations des coordinats et de Bp50 de la présente invention sont décrites plus en détail ci-après. 



     5. 4. 1. RECEPTEUR Bp50   ET UTILISATIONS DE COORDINATS TELS QUE ANTI-Bp50 POUR AUGMENTER LA PROLIFERATION DES LYMPHOCYTES B. 



   Des études antérieures ont suggéré que les facteurs impliqués dans l'induction de lymphocytes B de la phase Go dans la phase   G.   du cycle cellulaire étaient distincts des facteurs ou des conditions requises pour le transit dans la phase S. Ce modèle est basé, en principe, sur des études montrant que des agents tels que de faibles doses de facteurs d'activation de lymphocytes B   anti-Igou   anti-Bp35 seul avaient peu ou pas d'effet sur la prolifération des lymphocytes B. Cependant, ces memes agents peuvent conduire des lymphocytes B vers un point d'activation où ils sont susceptibles aux facteurs de croissance. 



  Par contraste, des facteurs de croissance tels que BCGF ou IL-2 seul n'ont aucun effet sur des lymphocytes B au repos, mais ils augmentent réellement la croissance de lymphocytes B activés. 



   Bien que la présente invention ne soit limitée à aucune théorie ni à aucune explication, les résultats présentés ici étayent davantage un modèle de régulation distincte des étapes de croissance et d'activation des lymphocytes B. En l'occurrence, la Demanderesse a démontré que des signaux d'activation et de prolifération apparaissant dans des lymphocytes B humains pouvaient être transmis par des structures superficielles cellulaires distinctes.

   Bien que mAb antiBp35 ait activé des lymphocytes B pour les faire entrer dans la phase   G du   cycle cellulaire, à lui seul, il provoque peu ou pas de prolifération. mAb antiBp50 a exercé l'effet opposé : il n'a pas pu activer 

 <Desc/Clms Page number 42> 

 des lymphocytes B mais, lorsqu'il a été ajouté même au terme d'une période aussi longue que 12-24 heures après l'activation, il a pu provoquer la croissance des lymphocytes B. 



   Comme on le présume, la molécule de Bp50 pourrait normalement se comporter comme un récepteur d'un coordinat tel qu'un facteur de croissance soluble ou pour un signal dont un contact cellule-cellule est le médiateur   (c'est-a-dire   un coordinat se trouvant sur la surface d'une autre cellule). Des études antérieures ont permis d'identifier plusieurs BCGF dérivant de lymphocytes T qui, tout comme   anti-Bp50,   augmentent la prolifération des lymphocytes B. A la fois des formes de poids   moleculaire   élevé et des formes de poids moléculaire faible de facteurs de croissance des lymphocytes B ont été identifiées et il a été démontré que différents types exerçaient des effets additifs (Kehrl, et al., 1984, Immunol. 



  Rev. 18 : 75-96 ; Kishimoto, 1985, Ann. Rev. Immunol. 



    3 : 133-157 ;   Swain, et al. 1983, J. Exp. Med. 



    158 : 822-835 ; Howard   et al., 1984, Immunol. Rev. 



    78 : 185-210 ; Ambrus,   et al., J. Clin. Invest. 



    75 : 732-739 ; Ambrus,   1985, J. Exp. Med.   162 : 1319-1335).   



  Dès lors,   Bp50   pourrait être un récepteur pour un de ces facteurs. 



   A l'exception des récepteurs d'IL-2 et du récepteur de C3d, les récepteurs se trouvant sur des lymphocytes B pour des signaux de croissance n'ont pas encore été identifiés. Le mAb   AB-1   réagit avec un marqueur de lymphocytes B exprimé uniquement sur des lymphocytes B activés et il bloque la proliferation dépendant de BCGF, si bien qu'il pourrait reconnaltre le récepteur de BCGF ou une structure apparentée. 



  Bp50 semble   entre   distinct du marqueur d'AB-1, étant donne aue le mAb   AB-1   ne bloque pas la liaison de 

 <Desc/Clms Page number 43> 

 l'anticorps anti-Bp50 G28-5 et que, contrairement à mAb G28-5, il réagit uniquement avec des lymphocytes
B activés (Jung et al., 1984, J. Exp. Med.   160 : 1919-  
1924). Bp50 se trouve sur tous les lymphocytes B ce qui, sur la base d'une analyse par absorption et de dosages faisant appel à une liaison directe, ne semble pas être le cas pour les récepteurs de BCGF. 



   Les données dont dispose actuellement la Demanderesse, indiquent que Bp50 et le récepteur pour BCGF de faible poids moléculaire sont des structures distinctes. 



   En utilisant un   hetero-antiserum   de lapin, Wang et ses collaborateurs (Wang, 1979, J. Exp. Med. 149 : 1424-
1433) ont décrit antérieurement une glycoprotéine à 54 kDa, gp54, qui, tout comme Bp50, est exprimée sur tous les lymphocytes B, mais à des concentrations inférieures sur les lymphocytes B du sang que sur les lymphocytes B amygdaliens.   11   est possible, mais improbable, que   l'hétéro-antisérum   de lapin et anti-   Bp50   reconnaissent les mêmes structures ou des struc- tures apparentées : à l'oppose de mAb anti-Bp50, l'antiserum de lapin dirigé contre gp54 seul a été suffisant pour stimuler la prolifération des lympho- cytes B. 



   A l'inverse   d'anti-Bp50,   anti-Bp35 seul peut activer des lymphocytes B de la phase GO à la phase G1 et, dès lors, il peut être   appelé t'signal   d'activation". On ne sait pas encore clairement si
Bp35 entre en jeu ou non uniquement lors de l'activa- tion précoce des lymphocytes B, car les anticorps anti-Bp35 peuvent stimuler la division de certains lymphocytes B (Clark et al., 1985, Proc. Nat. Acad. 



  Sei. EUA   82 : 1766-1770).   De même, Bp50 ne peut pas strictement entrer en jeu uniquement comme 'signal de croissance" : conjointement avec des signaux d'activation (anti-Bp35 ou   anti-u),   les anticorps 

 <Desc/Clms Page number 44> 

 anti-Bp50 non seulement augmentent la proliferation, mais également le nombre total de lymphocytes B entrant dans la phase   G.   (tableau 2). En d'autres mots, en tant que co-stimulant, anti-Bp50 agit pour activer la progression à la fois des phases d'activation (de Go à    gui)   et de croissance (G à S) du cycle cellulaire. Le BCGF utilisé au cours de ces études a également exercé une activite semblable (figure 6C). 



  Dès lors, anti-Bp35 et anti-Bp50 (ou BCGF) semblent être essentiellement analogues aux facteurs de "compétence" et de "progression" décrits au cours des études effectuées sur la régulation de la croissance des fibroblastes. La façon dont les lymphocytes B réagissent à anti-Bp35 ou à anti-Bp50 peut clairement dépendre de leur état de differentiation ou d'activation. 



     11   a été démontré ici que deux mAb,   aL   savoir anti-Bp35 (signal de "compétence") et anti-Bp50 (signal   de"progression")   ensemble pouvaient provoquer une importante prolifération de lymphocytes B hautement purifiés en absence d'antigene ou d'autres facteurs connus. Les coordinats naturels pour ces structures ne sont pas encore connus.

   Toutefois, étant donné que mAb dirigé contre des groupements   antigéniques   déterminants peut imiter à la fois des facteurs solubles et des signaux dont des interactions cellulescellules sont les médiateurs,   i. l   peut être possible d'utiliser des combinaisons appropriées de mAb pour diriger et assurer la régulation de la proliferation ou de la différentiation de lymphocytes B humains ce qui, à son tour, contribuera à concevoir des strate-   gies in vivo pour combattre des maladies humaines   telles que les malignités des lymphocytes B, les déficits immunitaires et certaines maladies autoimmunes. 



   Le nouvel anticorps monoclonal, G28-5, qui 

 <Desc/Clms Page number 45> 

 réagit avec un polypeptide à une seule chaine d'environ 50 Kd, exprime sur la surface de lymphocytes B humains, n'est qu'une forme de réalisation particulière des coordinats de la présente invention, qui peuvent augmenter la prolifération de lymphocytes B activés. 



  Etant donné que la prolifération des lymphocytes B humains peut être augmentée de la meme manière par des BCGF dérivant de lymphocytes T, y compris les BCGF de faible poids moléculaire et de poids moléculaire   relevé,   la Demanderesse a comparé l'activité de G28-5 anti-Bp50 avec celle d'une préparation de BCGF contenant principalement un BCGF de faible poids   moleculaire.   



  G28-5   anti-Bp50   et BCGF (faible) étaient très semblables en ce sens qu'ils étaient co-stimulants avec les mêmes agents d'activation (anti-Ig, anti-Bp35 et TPA), cependant qu'ils n'étaient pas co-stimulants l'un avec l'autre ou avec IL-1 ou encore IL-2. De plus, l'activite de G28-5 anti-Bp50 ne dépendait pas de son domaine Fc, étant donné que des fragments   F (ab')    de G28-5 étaient fonctionnellement actifs, ce qui donne à penser que, tout comme BCGF soluble, anti-Bp50 soluble ne nécessite pas des cellules accessoires portant un récepteur Fe pour exercer un effet. De plus, antiBp50 et BCGF sont tous deux efficaces uniquement en présence d'un stimulus d'activation.

   En d'autres mots, anti-Bp50 et BCGF ne sont pas des facteurs de "compétence", mais ils favorisent plutôt   la"progres-   sion" des lymphocytes B à travers le cycle cellulaire. 



   Bien que, selon toute probabilité, Bp50 puisse entrer en jeu comme récepteur pour un coordinat tel qu'un facteur de croissance de lymphocytes B, plusieurs résultats donnent à penser que Bp50 n'est pas le récepteur, du moins pour le BCGF (faible) utilisé au cours de cette étude : il est exprimé sur des lymphocytes B du sang, tandis que des récepteurs 

 <Desc/Clms Page number 46> 

 de BCGF (faible) ne le sont apparemment pas. A l'opposé de   Bp50,   des structures candidates pour le récepteur de BCGF (faible) sont également exprimées uniquement sur des lymphocytes B activés. De plus, des populations de lymphocytes B tant normaux que malins diffèrent par leur sensibilité à anti-Bp50 vis-à-vis de BCGF (faible) (tableau 5 et figure 10). 



  Par exemple, certains lymphomes B prolifèrent en réponse à BCGF (faible), mais non en réponse à antiBp50. Enfin, dans un certain nombre d'expériences, des concentrations optimales d'anti-Bp50 et de BCGF ont provoqué, ensemble, une plus forte prolifération qu'individuellement. Anti-Bp50 imite l'activité d'autres BCGF tels que des BCGF (élevé) qui sont costimulants avec anti-IgM (Ambrus, et al., 1985, J. 



  Exp. Med. 162 : 1319 ; Ambrus, et   al.,   1985, J. Clin. 



  Invest.   75 : 732),   ce qui donne à penser que   Bp50   pourrait entrer en jeu comme récepteur pour BCGF (élevé). 



   Bien que Bp50 puisse être un récepteur pour un coordinat soluble, en variante, Bp50 peut jouer le role d'un récepteur pour un signal dont un contact cellule-cellule est le médiateur et qui assure la régulation des concentrations en récepteurs de BCGF et/ou la production autocrine. La préséance d'antigènes de différentiation servant d'amplificateurs d'une voie de récepteurs autocrines provient d'études effectuées avec des lymphocytes T. mAb dirigé contre l'antigène leucocytaire commun Lp220 augmente la prolifération en élevant l'expression du récepteur d'IL-2 sur des lymphocytes T activés (Ledbetter, et   al.,   1985, J. Immunol.   135 : 1819).   Un mécanisme analogue peut entrer en jeu avec anti-Bp50 et l'expression de certains récepteurs de BCGF.

   Apparemment,   Bp50   et BCGF (faible) sont sous un certain contrôle   coordiné   

 <Desc/Clms Page number 47> 

 car, tout comme les récepteurs d'IL-1 et d'IL-2, BCGF augmente l'expression de   Bp50   sur certaines cellules leucémiques. La molécule de Bp50 partage également des similitudes avec la molecule de Tp44 qui entre en jeu pour influencer la production d'IL-2. La Demanderesse et d'autres chercheurs ont démontré que l'anticorps   9. 3 anti-Tp44   augmentait la prolifération de lymphocytes T activés par antiCD3 ou TPA (Ledbetter, et   al.,   1985, J. Immunol. 



  135 : 2331 ; Hara, et   al.,   1985, J. Exp. Med.   161 : 1513).   



  De meme,   anti-Bp50   augmente la   proliferation   de lymphocytes B activés par anti-Bp35 ou TPA. Le signal Tp44 agit en stimulant la production d'IL-2 plutôt qu'en stimulant la croissance de lymphocytes T. 



  Probablement, le signal Bp50 pourrait agir d'une manière analogue en stimulant la production   autocrine   de lymphocytes B (Gordon, et al., 1984, Nature, Lond. 



    310 : 145).    



   5. 4. 2. COORDINATS MODIFIES UTILISES POUR L'IMMUNOSUPPRESSION OU LE TRAITEMENT DE MALIGNITES. 



   Selon cette forme de réalisation, le coordinat de la présente invention peut être modifié par la fixation d'un agent   antiprolifératif, de telle   sorte que la molécule obtenue puisse être utilisée pour tuer des cellules qui expriment l'antigène   Bp50.   



  De tels coordinats modifiés peuvent être utilises dans le traitement de maladies auto-immunes, afin de supprimer la proliferation de lymphocytes B et supprimer ainsi la réponse auto-immunitaire. Ces coordinats modifiés peuvent également être utilises pour assurer l'immunosuppression chez un patient ayant reçu une transplantation afin d'empecher le rejet d'un greffon. En conséquence, des agents cytotoxiques qui sont utilisés pour la suppression des réponses immunitaires, peuvent etre fixés aux coordinats de 

 <Desc/Clms Page number 48> 

 l'invention. Lorsqu'on utilise des coordinats qui augmentent la proliferation des lymphocytes B, i1 doit en résulter un effet accru, puisqu'aussi bien le médicament sera dirigé vers les lymphocytes B en prolifération. 



   Dans une autre forme de réalisation, les coordinats de la présente invention, qui sont modifiés 
 EMI48.1 
 par la fixation d'un agent antiprolifératif, peuvent etre utilisés pour traiter des malignités dans lesquelles des tumeurs ou des cellules expriment   l'anti-   gène Bp50. La fixation de ces agents   chimiothérapeu-   tiques aux coordinats de l'invention doit assurer une plus grande spécificité du médicament pour les cellules malignes. De plus, un avantage particulier devrait être obtenu lors du traitement d'une malignité des lymphocytes B avec un coordinat couplé   A   une cytotoxine qui est plus efficace pour tuer des cellules proliférantes que des cellules non proliférantes ; un traitement avec un tel coordinat devrait assurer une potentialisation de l'action de la cytotoxine. 



   En conséquence, les agents chimiothérapeutiques ou les agents   antiproliferatifs   qui peuvent être couplés aux coordinats de la présente invention, englobent, sans aucune limitation, les agents énumérés dans le tableau 6 ei-après qui provient de Goodman et Gilman, The Parmacological Basis of Therapeutics, 6e édition, MacMillan Publishing Co.,   Inc.,   New York, pages 1249-1313,1980, dont il est fait mention ici à titre de référence. 

 <Desc/Clms Page number 49> 

 
 EMI49.1 
 



  TABLEAU 6 Ag ¯ Agents a des coordinats d'anti-Bp50 
 EMI49.2 
 
<tb> 
<tb> chimiotherapeutiques <SEP> qui <SEP> peuvent <SEP> @tre <SEP> couplesClasse <SEP> Type <SEP> Agent <SEP> 
<tb> Agent <SEP> d'al- <SEP> Moutarde <SEP> Chlorméthine
<tb> kylation <SEP> azotée <SEP> Cyclophosphamide
<tb> Melphalan
<tb> Moutarde <SEP> uracile
<tb> Chlorambucil
<tb> Dérivés <SEP> d'éthy- <SEP> Thiotépa <SEP> 
<tb> lène-imine
<tb> Sulfonates <SEP> Busulfan
<tb> d'alkyle
<tb> Nitroso-urées <SEP> Carmustine
<tb> Lomustine
<tb> Semustine
<tb> Streptozotocine
<tb> Triazenres <SEP> Dacarbazine
<tb> Antiméta- <SEP> Analogues <SEP> de <SEP> Methotrexate
<tb> bolites <SEP> l'acide <SEP> folique
<tb> Analogues <SEP> de <SEP> la <SEP> Fluorouracile
<tb> pyrimidine <SEP> Cytarabine
<tb> Azaribine
<tb> Analogues <SEP> de <SEP> Mercaptopurine
<tb> la <SEP> purine <SEP> Thioguanine
<tb> Produits <SEP> 

  Alcaloïdes <SEP> Vinblastine
<tb> naturels <SEP> extraits <SEP> de <SEP> la <SEP> Vincristine
<tb> pervenche
<tb> (Pervinca)
<tb> Antibiotiques <SEP> Dactinomycine
<tb> Daunorubicine
<tb> Doxorubicine
<tb> Bléomycine
<tb> Mi <SEP> thramyc <SEP> ine <SEP> 
<tb> Mitomycine
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 50> 

 
 EMI50.1 
 TABLEAU 6 (suite)

   
 EMI50.2 
 
<tb> 
<tb> Classe <SEP> Type <SEP> Agent
<tb> Enzymes <SEP> L-asparaginase
<tb> Agents <SEP> Complexes <SEP> Cisplatine
<tb> divers <SEP> coordinés <SEP> de
<tb> platine
<tb> Urée <SEP> substi-Hydroxy-urée
<tb> tuée
<tb> Déri <SEP> vé <SEP> de <SEP> Procarbazine
<tb> méthyl-hydrazine
<tb> Suppresseur <SEP> Mitotane
<tb> corticosurrénal
<tb> Hormones <SEP> et <SEP> Cortico-Prednisone
<tb> antagonistes <SEP> stéroïdes
<tb> Progestines <SEP> Caproate <SEP> d'hydroxyprogesterone
<tb> Acétate <SEP> de <SEP> médroprogestérone
<tb> Acétate <SEP> de <SEP> mégestrol
<tb> Oestrogènes <SEP> Diéthyl-stilbestrol
<tb> Ethinyl-oestradiol
<tb> Anti-oestrogène <SEP> Tamoxifen
<tb> Androgènes <SEP> Propionate <SEP> de <SEP> testostérone
<tb> Fluoxymestérone
<tb> Isotopes <SEP> Phosphore <SEP> Phosphate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 32p
<tb> radioactifs <SEP> lode 

  <SEP> Iodure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 131 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 
 
On peut adopter n'importe quelle méthode connue dans la technique pour coupler le coordinat 
 EMI50.3 
 à l'agent chimiothérapeutique ou antiprolifératif. Des exemples de telles méthodes ont été énumérés précédemment (voir paragraphe 5, ci-dessus). 

 <Desc/Clms Page number 51> 

 



    5. 4. 3. AUTRES UTILISATIONS DE COORDINATS ET DE Bp50  
Outre les applications thérapeutiques, les coordinats et   Bp50   lui-meme permettent d'autres applications dans des dosages diagnostiques à la fois   in vitro et in vivo, des schémas de séparation, etc.   



   Le'récepteur   Bp50   peut être utilisé pour la préparation et/ou la conception des coordinats de l'invention. Bp50 peut également être utilisé avec les coordinats de l'invention dans des dosages   in vitro qui nécessitent un étalon pour quantifier   la quantité de Bp50 détectée dans une prise d'essai. 



  Enfin, Bp50 lui-meme peut être utile comme facteur soluble constituant un médiateur d'immunité, par exemple, une lymphokine. 



   Outre le traitement thérapeutique et les dosages diagnostiques, les coordinats de la présente invention pourraient etre utilisés pour identifier ou séparer des cellules qui expriment l'antigene Bp50. En outre, si un composé opaque aux rayons X ou un radio-marqueur approprié est relié au coordinat, celui-ci pourrait être utilise pour la visualisation   in vivo de tumeurs exprimant l'antigene Bp50. D'après   la description ci-dessus, d'autres utilisations devront   etre   évidentes pour l'homme de métier. 
 EMI51.1 
 



  6. DEPOT DE LIGNEES DE CELLULES 
L'hybridome suivant a été déposé à 1'American Type Culture Collection", Rockville, MD, et il lui a été attribué le numéro d'ordre suivant :   Hybridome Numéro d'ordre ATCC   
 EMI51.2 
 G28-5 
HB9110Le cadre de la présente invention n'est nullement 1imité par l'hybridome déposé, étant donné que le type déposé est donné simplement afin d'illustrer un aspect de l'invention et que n'importe quelles 

 <Desc/Clms Page number 52> 

 lignées de cellules qui sont fonctionnellement equivalentes, rentrent dans le cadre de la présente invention.

   En fait, à la lecture de la description qui précède et au vu des figures annexées, l'homme de métier reconnaltra diverses modifications de l'invention en plus de celles illustrées et décrites dans la présente spécification.   11   est entendu que ces modifications rentrent dans le cadre des revendications ci-après. 

 <Desc/Clms Page number 53> 

   TABLE DES MATIERES   
 EMI53.1 
 
<tb> 
<tb> Page
<tb> 1. <SEP> Introduction........................... <SEP> 1
<tb> 2. <SEP> Fondement <SEP> de <SEP> l'invention............... <SEP> 2
<tb> 3. <SEP> Sommaire <SEP> de <SEP> l'invention <SEP> 5
<tb> 3.1. <SEP> Définitions <SEP> 10 <SEP> 
<tb> 4. <SEP> Description <SEP> des <SEP> figures <SEP> 11
<tb> 5. <SEP> Description <SEP> détaillée <SEP> de <SEP> l'invention... <SEP> 15
<tb> 5. <SEP> 1.

   <SEP> Méthodes <SEP> adoptées <SEP> pour <SEP> caractériser <SEP> le <SEP> récepteur <SEP> Bp50....... <SEP> 19
<tb> 5. <SEP> 2. <SEP> Caractérisation <SEP> du <SEP> récepteur
<tb> Bp50 <SEP> 24
<tb> 5. <SEP> 2. <SEP> 1. <SEP> Identification <SEP> d'un
<tb> marqueur <SEP> superficiel <SEP> de
<tb> cellules <SEP> à <SEP> 50 <SEP> kDa
<tb> spécifique <SEP> aux <SEP> lymphocytes <SEP> B, <SEP> Bp50 <SEP> 24 <SEP> 
<tb> 5. <SEP> 2. <SEP> 2. <SEP> L'expression <SEP> de <SEP> Bp50 <SEP> est
<tb> restreinte <SEP> aux <SEP> lymphocytes <SEP> B <SEP> 27
<tb> 5. <SEP> 3. <SEP> Augmentation <SEP> de <SEP> la <SEP> prolifération
<tb> des <SEP> lymphocytes <SEP> B <SEP> avec <SEP> l'anticorps <SEP> anti-Bp50 <SEP> 28
<tb> 5. <SEP> 3. <SEP> 1.

   <SEP> mAb <SEP> anti-Bp50 <SEP> augmente <SEP> la
<tb> prolifération <SEP> uniquement
<tb> après <SEP> que <SEP> les <SEP> lymphocytes
<tb> B <SEP> ont <SEP> été <SEP> activés <SEP> par <SEP> des
<tb> anticorps <SEP> anti-Bp35 <SEP> ou
<tb> anti- ................. <SEP> 30
<tb> 5. <SEP> 3. <SEP> 2. <SEP> Les <SEP> mAb <SEP> anti-Bp50
<tb> n'activent <SEP> pas <SEP> les <SEP> lymphocytes <SEP> B <SEP> de <SEP> la <SEP> phase
<tb> GO, <SEP> mais <SEP> 11s <SEP> amènent <SEP> les
<tb> lymphocytes <SEP> B <SEP> activés <SEP> à
<tb> progresser <SEP> a <SEP> travers <SEP> le
<tb> cycle <SEP> cellulaire......... <SEP> 31
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 54> 

 
 EMI54.1 
 
<tb> 
<tb> Page
<tb> 5. <SEP> 3. <SEP> 3.

   <SEP> Conditions <SEP> optimales
<tb> pour <SEP> augmenter <SEP> la <SEP> prolifération <SEP> des <SEP> lymphocytes
<tb> B <SEP> avec <SEP> des <SEP> anticorps
<tb> anti-Bp50................ <SEP> 33
<tb> 5. <SEP> 3. <SEP> 4. <SEP> Différences <SEP> entre
<tb> l'activité <SEP> d'anti-Bp50
<tb> et <SEP> de <SEP> BCGF <SEP> (faible)...... <SEP> 36
<tb> 5. <SEP> 4. <SEP> Utilisations <SEP> de <SEP> coordinats <SEP> antiBp50 <SEP> et <SEP> de <SEP> Bp50.................. <SEP> 40
<tb> 5. <SEP> 4. <SEP> 1. <SEP> Récepteur <SEP> Bp50 <SEP> et
<tb> utilisations <SEP> de <SEP> coordinats
<tb> tels <SEP> que <SEP> anti-Bp50 <SEP> pour
<tb> augmenter <SEP> la <SEP> prolifération
<tb> des <SEP> lymphocytes <SEP> B........ <SEP> 41
<tb> 5. <SEP> 4. <SEP> 2.

   <SEP> Coordinats <SEP> modifiés
<tb> utilises <SEP> pour <SEP> l'immunosuppression <SEP> ou <SEP> le <SEP> traitement <SEP> de <SEP> malignités <SEP> 47
<tb> 5. <SEP> 4. <SEP> 3. <SEP> Autres <SEP> utilisations <SEP> de
<tb> coordinats <SEP> et <SEP> de <SEP> Bp50..... <SEP> 51
<tb> 6. <SEP> Dépôt <SEP> de <SEP> lignées <SEP> de <SEP> cellules <SEP> 51
<tb>

Claims (67)

  1. REVENDICATIONS 1. Coordinat pratiquement pur qui (a) se lie à Bp50, à savoir un antigène superficiel des lymphocytes B à 50 kilodaltons, défini par l'anticorps monoclonal G28-5, et qui (b) lors de sa liaison a un lymphocyte B active, stimule le lymphocyte B activé pour l'amener AL traverser le cycle cellulaire afin d'augmenter la proliferation de ce lymphocyte B.
  2. 2. Coordinat selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'anticorps ou une fraction Fv, Fab, F (ab') p ou Fab'de la molécule d'anticorps.
  3. 3. Coordinat selon la revendication 2, dans lequel la molecule d'anticorps comprend une molécule d'anticorps monoclonal ou une fraction Fv, Fab, F (ab') ou Fab'de la molécule d'anticorps monoclonal.
  4. 4. Molécule d'anticorps monoclonal selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle comprend G28-5 ou n'importe quelle fraction Fv, Fab, F (ab') 2 ou Fab'de G28-5.
  5. 5. Molécule d'anticorps monoclonal selon la revendication 3, produite par une lignée de cellules d'hybridomes, déposée à l'ATCC sous le numéro d'ordre HB9110, ou un de ses mutants, un de-ses recombinants <Desc/Clms Page number 56> ou un de ses derives appartenant au génie génétique.
  6. 6. Coordinat selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une lymphokine.
  7. 7. Lymphokine selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle comprend un facteur de croissance de lymphocytes B.
  8. 8. Coordinat selon la revendication 6, dans lequel la lymphokine se trouve sur la surface d'une cellule.
  9. 9. Coordinat selon la revendication 1, 2 ou 6, caractérisé en ce qu'il comprend également un composé couple pour être coordinat.
  10. 10. Coordinat selon la revendication 9, dans lequel le composé qui y est couple, comprend un agent antiproliferatif.
  11. 11. Coordinat selon la revendication 9, dans lequel le composé qui y est couple, comprend un agent d'alkylation.
  12. 12. Coordinat selon la revendication 9, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un antimétabolite.
  13. 13. Coordinat selon la revendication 9, dans lequel le compose qui y est couple, comprend uh antibiotique.
  14. 14. Coordinat selon la revendication 9, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un alcalolde extrait de la pervenche (Pervinca).
  15. 15. Coordinat selon la revendication 9, dans lequel le composé qui y est couple, comprend une enzyme.
  16. 16. Coordinat selon la revendication 9, dans lequel le compose qui y est couplé, comprend un complexe coordiné de platine.
  17. 17. Coordinat selon la revendication 9, dans lequel le composé qui y est couple, comprend un <Desc/Clms Page number 57> radio-isotope.
  18. 18. Coordinat selon la revendication 9, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un composé fluorescent.
  19. 19. Coordinat pratiquement pur qui se lie à Bp50, à savoir un antigène superficiel de lymphocytes B a 50 kilodaltons, défini par l'anticorps monoclonal G28-5.
  20. 20. Coordinat selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'anticorps ou une fraction Fv, Fab, F (ab') ? ou Fab'de la molécule d'anticorps.
  21. 21. Coordinat selon la revendication 20, dans lequel la molécule d'anticorps comprend une molécule d'anticorps monoclonal ou une fraction Fv, Fab, F (ab') 2 ou Fab'de la molecule d'anticorps monoclonal.
  22. 22. Coordinat selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend une lymphokine.
  23. 23. Lymphokine selon la revendication 22, caractérisée en ce qu'elle comprend un facteur de croissance de lymphocytes B.
  24. 24. Coordinat selon la revendication 19, 20 ou 22, caractérisé en ce qu'il comprend également un composé couplé pour astre coordinat.
  25. 25. Coordinat selon la revendication 24, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un agent antiproliferatif.
  26. 26. Coordinat selon la revendication 24, dans lequel le compose qui y est couplé, comprend un agent d'alkylation.
  27. 27. Coordinat selon la revendication 24, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un antimétabolite.
  28. 28. Coordinat selon la revendication 24, <Desc/Clms Page number 58> dans lequel le compose qui y est couple, comprend un antibiotique.
  29. 29. Coordinat selon la revendication 24, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un alcaloïde extrait de la pervenche (Pervinca).
  30. 30. Coordinat selon la revendication 24, dans lequel le composé qui y est couple, comprend une enzyme.
  31. 31. Coordinat selon la revendication 24, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un complexe coordiné de platine.
  32. 32. Coordinat selon la revendication 24, dans lequel le compose qui y est couplé, comprend un radio-isotope.
  33. 33. Coordinat selon la revendication 24, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un composé fluorescent.
  34. 34. Antigène superficiel de lymphocytes B à 50 kilodaltons, qui est défini par l'anticorps monoclonal G28-5.
  35. 35. Antigène pratiquement pur à 50 kilodaltons selon la revendication 34, caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide.
  36. 36. Procédé en vue d'augmenter la prolifération des lymphocytes B, caractérisé en ce qu'il consiste à traiter des lymphocytes B activesavec une dose efficace d'un coordinat qui se lie à Bp50, à savoir un antigène superficiel de lymphocytes B à 50 kilodaltons, defini par l'anticorps monoclonal G28-5, de telle sorte que les lymphocytes B activés traversent le cycle cellulaire et que leur prolifération augmente.
  37. 37. Procédé selon la revendication 36, dans lequel les lymphocytes B ont été. activés par traitement avec une dose efficace d'un second coor- <Desc/Clms Page number 59> dinat qui se lie à Bp35, à savoir un antigène superficiel de lymphocytes B à 35 kilodaltons, de telle sorte que le lymphocyte B progresse de la phase Go à la phase GI du cycle cellulaire.
  38. 38. Procédé selon la revendication 36 ou 37, caractérisé en ce qu'il est effectue in vivo.
  39. 39. Procédé selon la revendication 36 ou 37, caractérisé en ce qu'il est effectue in vitro.
  40. 40. Procédé selon la revendication 36 ou 37, dans lequel le coordinat comprend une molécule EMI59.1 d'anticorps qui se lie A Bp50, ou une fraction Fv, Fab, F ou Fab'de la molecule d'anticorps, se lie à Bp50.
  41. 41. Procédé selon la revendication 36 ou 37, dans lequel le coordinat comprend une molécule d'anticorps monoclonal qui se lie à Bp50, ou une fraction Fv, Fab, F (ab') 2 ou Fab'd'une molecule d'anticorps monoclonal, qui se lie AL Bp50.
  42. 42. Procédé selon la revendication 41, dans lequel la molécule d'anticorps monoclonal compren G28-5 ou n'importe quelle fraction Fv, Fab, F (ab') ou Fab'de G28-5.
  43. 43. Procédé selon la revendication 41, dans lequel l'anticorps monoclonal est produit par une lignée de cellules d'hybridomes, déposée à l'ATCC sous le numéro d'ordre HB9110, ou un de ses mutants, un de ses recombinants ou un de ses dérivés appartenant au génie génétique.
  44. 44. Procédé selon la revendication 36 ou 37, dans lequel le coordinat comprend une lymphokine.
  45. 45. Procédé selon la revendication 44, dans lequel la lymphokine comprend un facteur de croissance des lymphocytes B.
  46. 46. Procédé selon la revendication 44, dans lequel la lymphokine se trouve sur la surface <Desc/Clms Page number 60> d'une cellule.
  47. 47. Procédé selon la revendication 37, dans lequel le second coordinat comprend une molécule d'anticorps qui se lie à Bp35.
  48. 48. Procédé selon la revendication 47, dans lequel l'anticorps qui se lie à Bp35, comprend encore un anticorps monoclonal.
  49. 49. Procédé selon la revendication 37, dans lequel les lymphocytes B activés sont traités EMI60.1 avec le coordinat qui se lie à Bp50, à peu près dans les 12 heures qui suivent l'activation par le second coordinat qui se lie à Bp35.
  50. 50. Procédé en vue de supprimer la prolifération des cellules qui expriment Bp50, à savoir un antigène superficiel de lymphocytes B à 50 kilodaltons, défini par l'anticorps monoclonal G28-5, caractérisé en ce qu'il consiste à traiter les cellules qui expriment Bp50, avec une dose efficace d'un coordinat qui se lie à Bp50, ce coordinat étant coupl EMI60.2 à un agent antiproliferatif.
  51. 51. Procédé selon la revendication 50, dans lequel les cellules qui expriment Bp50, comprennent des lymphocytes B.
  52. 52. Procédé selon la revendication 50, dans lequel les cellules qui expriment Bp50, comprennent des cellules malignes.
  53. 53. Procédé selon la revendication 50, caractérisé en ce qu'il est effectué in vivo.
  54. 54. Procédé selon la revendication 50, caractérisé en ce qu'il est effectué in vitro.
  55. 55. Procédé selon la revendication 50, dans lequel le coordinat comprend une molécule d'anticorps ou une fraction Fv, Fab, F (ab') ou Fab'de la molécule d'anticorps. <Desc/Clms Page number 61>
  56. 56. Procédé selon la revendication 55, dans lequel la molécule d'anticorps comprend une molécule d'anticorps monoclonal ou une fraction Fv, Fab, F (ab') ? ou Fab'de la molécule d'anticorps monoclonal.
  57. 57. Procédé selon la revendication 56, dans lequel l'anticorps monoclonal comprend G28-5 ou n'importe quelle fraction Fv, Fab, F (ab') p ou Fab'de G28-5.
  58. 58. Procédé selon la revendication 56, dans lequel l'anticorps monoclonal est produit par une lignée de cellules d'hybridomes, déposée a l'ATCC sous le numéro d'ordre HB9110, ou l'un ou l'autre de ses mutants, de ses recombinants ou de ses dérivés appartenant au génie génétique
  59. 59. Procédé selon la revendication 50, dans lequel le coordinat comprend une lymphokine.
  60. 60. Procédé selon la revendication 59, dans lequel la lymphokine comprend un facteur de croissance de lymphocytes.
  61. 61. Procédé selon la revendication 50, 55 ou 59, dans lequel l'agent antiprolifératif comprend un agent d'alkylation.
  62. 62. Procédé selon la revendication 50, 55 ou 59, dans lequel l'agent antiprolifératif comprend un antimetabolite.
  63. 63. Procédé selon la revendication 50, 55 ou 59, dans lequel l'agent antiprolifératif comprend un antibiotique.
  64. 64. Procédé selon la revendication 50, 55 ou 59, dans lequel l'agent antiprolifératif comprend un alcaloide extrait de la pervenche (Pervinca).
  65. 65. Procédé selon la revendication 50, EMI61.1 55 ou 59. lequel l'agent antiprolifératif comprend une enzyme. <Desc/Clms Page number 62>
  66. 66. Procédé selon la revendication 50, 55 ou 59, dans lequel l'agent antiprolifératif comprend un complexe coordiné de platine.
  67. 67. Procédé selon la revendication 50, 55 ou 59, dans lequel l'agent antiprolifératif comprend un radio-isotope.
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