AT398437B - Verfahren zur gewinnung eines neuen liganden und verfahren zur verstärkung der proliferation von b-zellen - Google Patents

Description

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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung eines neuen, im wesentlichen reinen Liganden, der sich (a) an Bp50, ein 50 Kilodalton B-Zellen-Oberflächenantigen, bindet und (b) durch die Bindung an eine aktivierte B-Zelle dieselbe zur Durchschreitung des Zellzyklus anregt, sodaß die Proliferation der B-Zellen verstärkt wird. Derartige Liganden sind Antikörper-Moleküle oder Fragmente von Antikörper-Molekülen oder andere Liganden, wie Lymphokine. Das Bp50 ist ein B-Zellen-Oberflächenmarker mit 50 kDa, der bei der Proliferation der B-Zellen, nicht jedoch bei der frühen Aktivierung der B-Zellen in Funktion tritt. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird ein monoklonaler Antikörper, G28-5, beschrieben. Er definiert Bp50 und scheint bei der Proliferation aktivierter B-Zellen eine Rolle zu spielen, hat jedoch keine feststellbare Wirkung auf die Proliferation ruhender B-Zellen.

Die erfindungsgemäß hergestellten Liganden, wie Antikörper, Lymphokine und Fragmente derselben, können zur Lenkung und Steuerung der Proliferation und/oder Differenzierung humaner B-Zellen verwendet werden. Außerdem können diese Liganden durch Anhängen anderer Verbindungen modifiziert werden, die zur Behandlung und/oder Feststellung maligner Zellen, die das Bp50 Antigen exprimieren, verwendet werden.

Die Aktivierung ruhender B-Zellen aus der G0- in die Gi-Phase des Zellzyklus und die anschließende Anregung der aktivierten B-Zellen zur Proliferation sind getrennte Stufen, die unterschiedliche Regulationsmechanismen erfordern. Manche Stoffe, wie der murine B-Zellen-Stimulierungsfaktor p1 (BSF-p1) (Rabin et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82, 2935-2939) oder geringe Dosen Antiimmunoglobulin (anti-IG) (DeFranco et al., 1985, J.lmmunol. 135:87-94; Wetzel, et.al. 1984, J.lmmunol. 133:2327-2332; DeFranco, et.al. 1982, J.Exp.Med. 155:1523-1536; Muraguchi, et.al., 1984, J.lmmunol. 132:176-180) sind "Aktivierungs-" oder "Kompetenz-"Faktoren. Das heißt, daß sie die B-Zellen dazu veranlassen, größer zu werden, mehr RNA zu produzieren und in Gi einzutreten, daß sie jedoch allein nicht die DNA-Synthese in den B-Zellen induzieren. Andere "Wachstums-" Faktoren, wie der humane B-Zellen-Wachstumsfaktor (BCGF) und das lnterleukin-2 (IL-2) veranlassen die aktivierten B-Zellen, durch den Zellzyklus hindurchzugehen und in die S-Phase einzutreten, regen jedoch die ruhenden B-Zellen nicht an (Kehrl, et al., 1984, Immunol. Rev. 18:75-96; Muraguchi, et al., 1984, J.lmmunol. 132:176-180; Zubier, etal. 1984, J.Exp. Med. 160:1170-1183; Jung, et al., 1984, J.Exp. Med. 160-1597-1604).

Von Forschern sowohl muriner als auch humaner Systeme wurden zahlreiche Faktoren beschrieben, die das Wachstum von B-Zeilen promovieren. Unter diesen sind B-Zellen-Wachstumsfaktoren (BCGF), die von verschiedenen unterschiedlichen Quellen stammen, wie von T-Zellinien oder Hybridomen, B-Zellinien oder dendritischen Zellen. Obwohl für lnterleukin-1 (IL-1) ebenso wie für lnterleukin-2 (IL-2) gezeigt wurde, daß sie das B-Zellen-Wachstum verstärken, unterscheiden sie sich offensichtlich von bestimmten BCGFs. Beispielsweise blockieren monoklonale Antikörper (MAb) für einen murinen BCGF (O-Hara et al., 1985, Nature (London) 315:333) oder einen humanen BCGF (Ambrus et al, 1985, J.Exp.Med. 162:1319) die Aktivität des BCGF, jedoch nicht die Aktivität von IL-1 oder IL-2. Obwohl sie von IL-1 oder IL-2 verschieden sind, scheinen die BCGFs selbst heterogen zu sein in bezug auf biochemische Daten und die unterschiedliche Wirkung auf verschiedene B-Zellen-Untergruppen oder Costimulierungsassays. Beispielsweise wurde der hochmolekulare humane BCGF mit 60 Kilodalton (kDa), BCGF (hoch), identifiziert, der sich von einer niedrigmolekularen Form mit 12 kDa, BCGF(niedrig), unterscheidet (Ambrus et al., 1985, J.CIin. Invest. 75:732). Die für einen murinen 20 kDa BCGF codierende cDNA, die vorsichtig als B-Zell-Stimulierungsfaktor p1 (BSF-pl) bezeichnet wird, wurde vor kurzem geklont und sequenziert (Noma et al., 1986, Nature 319:640). Das rekombinante Lymphokin hat nicht nur BCGF-Wirkung, sondern kann auch ruhende B-Zellen aktivieren und die Differenzierung von IgGi produzierenden Zellen induzieren; so unterscheidet es sich von humanem BCGF (hoch) und BCGF (niedrig) sowohl in seinem Molekulargewicht als auch in seinem Wirkungsbereich.

Diese Aktivierungs- und Wachstumssignale regulieren die Zellen wahrscheinlich durch die Wechselwirkung mit spezifischen Oberflächenstrukturen der B-Zellen. Zusätzlich zu dem antigenspezifischen Signal über das Oberflächen-Ig wurden verschiedene andere konkurrierende Oberflächenpolypeptide von B-Zellen identifiziert, die in gewisser Weise auf die Aktivierung oder das Wachstum von B-Zellen wirken. Beispielsweise wurden die Zelloberflächenrezeptoren für IL-1 (Dower, et al., 1985, J.Exp. Med. 160:501) und IL-2 (Robb et al., 1984, J.Exp. Med. 160:1126) gekennzeichnet und vor kurzem wurden funktionelle IL-2-Rezeptoren an B-Zellen identifiziert (Zubier, et al., 1984, J.Exp. Med. 160:1170; Jung, et al., 1984, J.Exp. Med. 160:1597; Muraguchi, et al., 1985, J.Exp. Med. 161:181) Es müssen jedoch die Rezeptoren für B-Zellen-Wachstums- und Aktivierungsfaktoren noch vollständig charakterisiert werden. Verschiedene konkurrierende B-Zellen-Oberflächenpolypeptide wurden identifiziert, die in gewisser Weise auf die Aktivierung oder das Wachstum von B-Zellen wirken. Beispielsweise haben Subbarao und Mosier (Subbarao, et al., 1983, Immunol. Rev. 69:81-97) gefunden, daß monoklonale Aktikörper (mAb) für murines B-Zellen-Antigen 2

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Lyb2 B-Zellen aktivieren und vor kurzem wurden Arbeiten vorgelegt, in denen Lyb2 als Rezeptor für BSF-p1 vorgeschlagen wurde (Yakura, 1985, Fed.Proc. 44:1532). In ähnlicher Weise konnte von der Anmeiderin gefunden werden, daß der geeignete mAb (1F5) für ein 35 kDa Polypeptid, Bp35, humane B-Zellen von G0 auf Gi aktiviert (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82:1766-1770; Gollay, et al., 1985, J.lmmunol 135: 3795-3801). Als Aggregat vorliegendes C3d oder Antikörper für den 140 kDa C3d Rezeptor, Bp140, verursachen eine Proliferation von T-Zellen-abhängigen B-Zellen (Melchers, et al., 1985, Nature 317:264-267; Nemerow, et al., 1985, J.lmmunol. 135:3068-3073; Frade et al., 1985, Eur. J.lmmunol. 15:73-76). Obwohl BCGFs sowohl in Mäusen als auch in Menschen identifiziert worden waren, wurden die Rezeptoren für diese Faktoren nocht nicht isoliert. Wang und Mitarbeiter (Wang et al., 1979, J.Exp. Med. 149:1424-1433) stellten ein polyklonales Antiserum dar, das ein 54 kDa Polypeptid (gp54) auf humanen B-Zellen identifizierte, und zeigten, daß das Kaninchen-Antiserum für gp54 tonsillare B-Zellen zur Teilung veranlaßte. Vor kurzem isolierten Jung und Fu (Jung, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1919-1924) einen mAb (AB-1) für ein auf aktivierte B-Zellen beschränktes 55 kDa-Antigen, der die BCGF-abhängige Proliferation blockiert. Es ist jedoch noch nicht bekannt, ob entweder anti-gb54 oder AB-1 einen BCGF-Rezeptor erkennen oder nicht.

Die erfindungsgemäß hergestellten Liganden umfassen Antikörper-Moleküle, monoklonale Antikörper-Moleküle und Fragmente dieser Antikörpermoleküle, die die Antigenbindungsstelle enthalten, oder chemisch modifizierte Antikörper und Fragmente; derartige Fragmente umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Fv, Fab, F(ab')2, Fab' und dergl.. Zusätzlich dazu sind in diesen Liganden auch Lymphokine enthalten, die humane B-Zeilen-Wachstumsfaktoren ebenso wie chemisch modifizierte Lymphokine umfassen, jedoch nicht auf sie beschränkt sind. Die erfindungsgemäß hergestellten Liganden können beispielsweise durch Verknüpfung oder Kupplung einer Verbindung an den Liganden chemisch modifiziert sein.

Solche Verbindungen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf cytotoxische, therapeutische, chemotherapeutische Mittel, Markierungen, wie Radiomarkierungen, Farbstoffe, Enzyme, radiopake Verbindungen und dergl.. Die erfindungsgemäß hergestellten Liganden können in ihrer modifizierten oder unmodifizierten Form zur Lenkung, Steuerung und Modifizierung humaner B-Zellen-Proliferation und/oder -Differenzierung verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß entweder aus einem Hybridom, das aus der Reaktion auf die Immunisierung durch das B-Zellen-Oberflächenantigen Bp50 stammt, welches Oberflächenantigen durch den von der Hybridom-Zellinie mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB9110 oder einer Mutanten, Rekombinanten oder einem durch gentechnische Maßnahmen erhaltenen Derivat derselben produzierten monoklonalen Antikörper G28-5 definiert ist, oder aus natürlichen Quellen, wie Blutzellen, Serum oder anderen Körperflüssigkeiten, -abscheidungen oder -ausscheidungen, der Ligand in Form eines Antikörpers, monoklonalen Antikörpers, insbesondere des monoklonalen Antikörpers G28-5, oder eines Fv-, Fab-, F(ab')2- oder Fab'-Teiles desselben, gegebenenfalls in Kombination mit einem Lymphokin, isoliert wird.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß zwei humane B-Zellen-Differentiationsantige-ne, Bp35 gnd das hier beschriebene B-Zellen-Antigen Bp50 offensichtlich eine unterschiedliche Rolle als Signalrezeptoren bei der B-Zellen-Aktivierung spielen. Beide monoklonalen Antikörper (mAb) für Bp35 und Bp50 liefern positive Signale für B-Zellen, die deren Durchgang durch den Zellzyklus stimulieren. Der mAb für Bp35 bewirkt prinzipiell, wie die anti-lg-Antikörper, die Aktivierung der ruhenden B-Zellen, um bereit für den Eintritt in die Gi-Phase des Zellzyklus zu werden. Im Gegensatz dazu wirkt ein hier beschriebener monoklonaler Antikörper oder sein F(ab')2-Fragment für Bp50, ein auf allen B-Zellen exprimiertes 50 kDa Polypeptid, als Stimulierung für die aktivierten B-Zellen zum Durchgang durch den Zellzyklus und erhöht die Proliferation der aktivierten B-Zellen. Monoklonale Antikörper für Bp35 aktivieren, wie die anti-lg-Antikörper, die tonsillaren B-Zellen und induzieren in geringem Ausmaß eine B-Zellen-Proliferation. Im Gegensatz dazu aktiviert der monoklonale anti-Bp50-Antikörper allein weder die B-Zellen, noch induziert er eine B-Zellen-Proliferation, doch zusammen mit den anti-Bp35- oder anti-lg-Antikörpem erhöht er die B-Zellen-Proliferation. In dieser Hinsicht gleicht die Wirkung des anti-Bp50-Antikörpers der Wirkung des B-Zellen-Wachstumsfaktors (BCGF). So geringe Mengen wie 0,05 ug/ml anti-Bp50 werden zur Verstärkung der Proliferation gebraucht und, wie BCGF, wirkt anti-Bp50, selbst wenn es 12 bis 24 Stunden nach der Aktivierung der B-Zellen mit anti-lg oder anti-Bp35 zugesetzt wird. Ohne zusätzliche exogene Signale induzieren anti-Bp35- und anti-Bp50-Antikörper gemeinsam eine starke Proliferation von gereinigten ruhenden B-Zellen. Diese Resultate deuten darauf hin, daß die Bp35- und Bp50-Oberflächenmoleküle eine Funktion in der regulatorischen Kontrolle der B-Zellen-Aktivierung und der Progression durch den Zellzyklus hat. Wegen der Signifikanz, die die anti-Bp35- und ähnlichen Moleküle auf den Effekt und die Wirkung der Liganden der vorliegenden Erfindung haben, wird hier auf Clark et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei (USA) 82:7166-1770 Bezug genommen. 3

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Obwohl die Wirkung von anti-Bp50 der von BCGF(niedrig) ähnlich ist, da sowohl anti-Bp50 als auch BCGF(niedrig) costimulierend mit den gleichen Substanzen, jedoch nicht miteinander sind und sowohl anti-Bp50 als auch BCGF(niedrig) nur die aktivierten B-Zellen beeinflussen und in löslicher Form wirken, kann die Wirkung von anti-Bp50 von der Wirkung von BCGF(niedrig) unterschieden werden, da die durch optimale Mengen anti-Bp50 und anti-Bp35 (oder anti-lg) stimulierte Proliferation der B-Zellen weiter durch BCGF(niedrig) verstärkt werden kann und sowohl Blut-B-Zellen als auch bestimmte B-Zellen-Lymphome unterschiedlich auf anti-Bp50 im Verhältnis zu BCGF reagieren. Zur Erzielung der optimalen Wirkung sollte anti-Bp50 innerhalb von 12h nach der B-Zellen-Aktivierung zugegeben werden, während BCGF(niedrig) die optimale Wirkung auch bei Zusatz 24h nach der Aktivierung beibehält. Außerdem wird Bp50 an allen B-Zellen exprimiert, während die Rezeptoren oder BCGF(niedrig) auf aktivierte B-Zellen beschränkt sind. Somit können anti-Bp50 und BCGF(niedrig) das B-Zellen-Wachstum koordiniert regulieren, tun dies jedoch offensichtlich über unterschiedliche Signale.

Die Liganden, die sich an Bp50 binden und die Proliferation aktivierter B-Zellen verstärken, können zur Steigerung einer Immunreaktion verwendet werden. Beispielsweise können diese sich an Bp50 bindenden Liganden als "Hilfsmittel" zur Steigerung einer Immunreaktion auf ein Vakzin verwendet werden. Andererseits können diese Liganden zur Steigerung der Immunreaktion eines immunsupprimierten Individuums verwendet werden.

Andererseits können die erfindungsgemäß hergestellten Liganden in vitro zur Identifizierung oder Trennung von Zeilen verwendet werden, die das Bp50-Antigen exprimieren, und/oder es können Körperflüssigkeiten auf die Anwesenheit von gegebenenfalls vorhandenem Bp50-Antigen geprüft werden. Zusätzlich dazu können diese Liganden in vivo zur Abbildung von Zellen oder Tumoren, die das Bp50 Antigen exprimieren, verwendet werden.

Das gereinigte Bp50-Antigen kann zur Herstellung von Antikörpern und zur Herstellung oder Konstruktion anderer Liganden der oben genannten Art verwendet werden. Außerdem könnte das Bp50-Antigen in Assays, wie diagnostischen Immunoassays, verwendet werden. Weiters kann das Bp50 selbst als Vermittler von Zellimmunität in vivo oder in vitro dienen.

Die folgenden hier verwendeten Abkürzungen haben die angegebene Bedeutung: AO - Acridinorange BCGF - B-Zellen-Wachstumsfaktor BCGF(hoch) - ein humaner BCGF mit 60 kDa BCGF(niedrig) - ein humaner BCGF mit 12 kDA Bp35 - 35 kDa B-Zellen-spezifisches Oberflächenpolypeptid (CD20), das durch den mAb 1F5 definiert ist, Bp50 - ein 50 kDa B-Zellen-spezifisches Oberflächenpolypeptid, das durch den mAb G28-5 definiert ist, Fv - die variable Region oder die antigen-bindende Stelle eines Antikörpermoleküls. - Diese kann jedes Fragment sein, das den Idiotyp des Moleküls enthält, inklusive Fab, (F(ab')2, Fab’ und dergl., worauf sie jedoch nicht beschränkt ist; IF - Immunofluoreszenz ig - Immunoglobulin IL-1 - lnterleukin-1 IL-2 - lnterleukin-2 kDa - Kilodalton mAb - monoklonaler Antikörper SDS-PAGE - Natriumdodecylsulfat-Poiyacrylamid-Gel-Elektrophorese TPA -12-0-Tetradecanoylphorbol-13-acetat

Beschreibung der Figuren

Figur 1: Die Expression von Bp50 ist auf Bp35± B-Zellen beschränkt. Eine zytometrische Zweifarbenstromanalyse wurde nach der Beschreibung von Clark et al., 1985, Proc.Nat.Acad. Sei. USA 82:1766-1770 vorgenommen. Die Ergebnisse sind als Zellanzahl gegen den Logarithmus der Grünfluoreszenz und den Logarithmus der Rotfluoreszenz aufgetragen, wobei 4-5 Punkte etwa eine Verdopplung der Fluoreszenz angeben. Die Ergebnisse sind dargestellt, um autofluoreszenz-negative Zellen darzustellen. Eine PE (rot)-anti-Bp35(1 F5) gegen FITC (grün)-anti-Bp50 (G28-5) Färbung zeigt, daß alle Bp50+ Zellen auch Bp35 + sind.

Figur 2: Biochemischer Vergleich von Bp50 Polypeptid mit anderen B-Zellen-Oberflächenantigenen. Die Immunopräzipitation von Bp50 aus oberflächlichen 12Sl-markierten Tonsillarzellen wurde wie beschrieben 4

AT 398 437 B durchgeführt. Die isolierten Antigene wurden auf 10% SDS Polyacrylamid-Plattengelen ohne Reduktion der Elektrophorese unterworfen. Die Gele wurden durch Autoradiographie und Verstärker-Screens optisch analysierbar gemacht. Platte A: Streifen 1, anti-Bp50 (G28-5); Streifen 2, anti-Bp95 (G28-8); Streifen 3, Sepharose-Ziege anti-Maus lg allein, Belichtungszeit: 4 Tage. Platte B: Streifen 1, anti-Bp50 (G28-5); Streifen 2, anti-Bp45 (BLAST-2); Streifen 3, anti-Bp39 (G28-1), Streifen 4, anti-Bp39 (41-H16); Streifen 5, Sepharose-Ziege anti-Maus lg allein. Es wurde eine Belichtungszeit von 2 Tagen ausgewählt, sodaß die Banden in Streifen 2 und 4 nicht überbelichtet waren und klar in bezug auf Bp50 unterschieden werden konnten. Eines von drei Experimenten.

Figur 3: Zwei-Farben-Immunofluoreszenz-Analyse der Bp50-Expression. Mononucleare periphere Blutzellen oder mononucleare tonsillare Zellen wurden durch Ficoll-Zentrifugieren isoliert und gefärbt mit PE (rot)-konjugiertes G28-5 (antl-Bp50) in Kombination mit Fluorescein (grün)-konjugierte Vergleichsantikörper, inklusive 2C3 (anti-lgM); 1F5 (anti-Bp35);HB10a (anti-DR); und 9,6 (anti-CD-2, E-Rezeptor). Die Zellen wurden mit einem FACS IV, ausgestattet mit einem 4-Dekaden-Log-Amplifier sowohl in der roten als auch in der grünen Dimension, analysiert. Die gerade und rechtwinkelige Lichtstreuung wurde zur Ausscheidung der Monozyten verwendet. Die ungefärbten Zellen werden hinten am Gitter angeordnet, rote Fluoreszenz ist rechts und grüne Fluoreszenz ist links.

Figur 4: Dosisabhängige Kurven für die Proliferationszunahme von dichten tonsillaren Er- B-Zellen durch anti-Bp50 Antikörper wie angegeben:

Medium allein; anti-Bp50 allein; anti-Bp35 (5 ug/ml) allein; BCGF allein; anti-Bp35 plus BCGF; anti-Bp35 mit abgestuften Dosen von anti-Bp50. Die mittlere Proliferation t dem Standardfehler der vierfachen Proben wurden am 3.Tag gemessen.

Figur 5: Anti-Bp50 mAb verstärken die Proliferation am meisten, wenn sie nach einem B-Zellen-Aktivierungssignal zugesetzt werden. Dichte tonsillare Er- B-Zelien wurden 4 Tage lang nur mit Medium allein inkubiert, anti-Bp50 (0,5ug/ml) zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Inkubation zugesetzt; anti-Bp35 (5ug/ml) wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Inkubation zugesetzt; anti-Bp50 wurde konstant gehalten, wobei anti-Bp35 später zu verschiedenen Zeiten zugesetzt wurde; anti-Bp35 wurde konstant gehalten, wobei anti-Bp50 zu verschiedenen Zeiten zu den Kulturen zugesetzt wurde. Während der letzten 10h wurde 3H-Thymidin zugesetzt und sein Einbau gemessen.

Figur 6: Vergleich der Fähigkeit von anti-Bp35 und anti-Bp50, ruhende tonsillare B-Zellen zu veranlassen, den G0-Zustand des Zellzyklus zu verlassen. 3 Tage nach der Behandlung mit Medium allein (_), anti-

Bp35 allein (------), und lg allein (.....), A, keine zusätzlichen Additive; B, anti-Bp50 (0,5ug/ml) Zusatz zu jeder Grupppe; C; 5% BCGF Zusatz zu jeder Gruppe. Die Werte sind als relative Zellanzahl gegen den Log von AO rote Fluoreszenz (RNA) aufgetragen.

Figur 7: Kinetische Werte der B-Zell-Proliferation nach der Stimulierung mit anti-Bp50 gegen BCGF. Dichte tonsillare E- B-Zellen wurden mit Medium allein stimuliert; 10% BCGF allein; anti-Bp35 allein; anti-Bp50 allein; anti-Bp35 + 10% BCGF;anti-Bp35 + anti Bp50; und anti-Bp35 + 10% BCGF. Die Proliferation wurde an den durch einen 18h - Puls von von 3H-Thymidin angegebenen Tagen gemessen. Die Proliferation wurde vierfach gemessen und die Standardfehler sind aufgezeigt. Einer von drei Versuchen.

Figur 8: Zeiten nach der Stimulierung mit anti-Bp35, wenn anti-Bp50 (A) oder BCGF (B) die Proliferation optimal verstärken. Dichte tonsillare E- B-Zeller 10 wurden in gezeigter Weise stimuliert und die Proliferation wurde durch einen 18h- Puls von 3H-Thymidin am 3. Tag gemessen. Medium; anti-Bp35 allein zu den angegebenen Zeiten zugesetzt; anti-Bp50 oder BCGF allein; anti-Bp35 zu Beginn der Kultur zugesetzt und anschließend Zusatz von anti-Bp50 oder BCGF an den angegebenen Zeiten; anti-Bp50 oder BCGF zu Beginn der Kultur zugesetzt, gefolgt von anti-Bp35. Einer von zwei Versuchen.

Die Proliferation wurde vierfach gemessen und die Standardfehler sind aufgezeigt. Verwendete Dosen: anti-Bp35, 5 ug/ml; anti-Bp50 0,2 ug/ml; BCGF(niedrig) 5%. Die verwendeten Konzentrationen waren folgende: anti-Bp35 5ug/ml; anti-Bp50 0,2 ug/ml; BCDF 5%.

Figur 9: Anti-Bp50 und BCGF haben zusätzliche Wirkungen auf die B-Zellen-Proliferation. Dichte tonsillare E- B-Zellen wurden mit abgestuften Dosen von BCGF (niedrig) gemeinsam mit anti-Bp50 allein stimuliert; anti-Bp35 allein; anti-lg-Perlen-allein; anti-Bp35 + anti-Bp50; oder anti-Bp50 + anti-lg. Die Proliferation wurde am 3.Tag nach der Stimulierung mit einem 18h Puls von 3H-Thimidin gemessen. Die Proliferation wurde vierfach gemessen und die Standardfehler sind aufgezeigt. Einervon vier Versuchen. Verwendete Dosen: 106 Zellen, anti-Bp35 5 ug/ml; anti-Bp50 0,2ug/ml; anti-lg-Perien 50ug/ml.

Figur 10: Vergleichende Wirkungen von anti-Bp50 und BCGF auf normale und maligne B-Zellen. Periphere Blut-E- und B-Zellen (A) oder dichte tonsilsillare E- und B-Zellen (C) wurden mit oder ohne TPA (75 ng/ml) in Gegenwart von 10% BCGF oder 1 ug/ml anti-Bp50 stimuliert. Zwei getrennte B-Zell-Lymphome (Platten B und D) wurden in gleicher Weise stimuliert. Die Proliferation wurde am Tag 3 durch Einbau von 3H-Thymidin während eines 12-h-Puises gemessen. Die Proliferation wurde vierfach gemessen 5

AT 398 437 B und die Standardfehler sind aufgezeigt. im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens kann beispielsweise die ursprünglich von Köhler und Milstein (1975, Nature 256: 495-497) entwickelte Methode ebenso wie andere Verfahren verwendet werden, die in jüngerer Zeit bekannt wurden, wie etwa das Verfahren der humanen B-Zell-Hybridome (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) und das EBV-Hybridom-Verfahren zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, Inc. S. 77-96) sowie ähnliche, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegen.

Antikörper-Fragmente, die den Idiotyp des Moleküls enthalten, können auf bekannte Weise hergestellt werden. Beispielsweise können solche Fragmente folgendes, enthalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt: das F(ab')2-Fragment das durch Behandlung des Antikörper-Moleküls mit Pepsin erzeugt werden kann; die Fab'-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')2- Fragmentes erzeugt werden können; das F(ab')2-Fragment, das durch Behandlung des Antikörper-Moleküls mit Papain erzeugt werden kann; und die 2Fab- oder Fab-Fragmente, die durch Behandlung des Antikörper-Moleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel zur Reduktion der Disulfidbrücken erzeugt werden können.

Wenn der sich an Bp50 bindende Ligand ein Lymphokin ist, kann dasselbe aus natürlichen Quellen erhalten werden oder, wenn seine Aminosäuresequenz bekannt oder abgeleitet ist, kann das Lymphokin über chemische Syntheseverfahren gewonnen werden. Andererseits können, wenn die Gensequenz des Lymphokins bekannt ist, rekombinante DNA-Verfahren zur Klonierung des Gens in einem Expressionsvektor verwendet werden, wodurch die Transkription und Translation der Gensequenz in einer geeigneten Wirtszel-ie vor sich geht.

Je nach dem Verwendungszweck können der Ligand oder die geeignetenFragmente desselben chemisch durch Anhängen irgendeiner von vielen Verbindungen an den Ligand nach irgend einem an sich bekannten Kupplungsverfahren chemisch modifiziert werden. Derartige Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf die Verwendung von Carbodiimid, Cyanbromid, bifunktionellen Reagentien, wie Glutaraidehyd, N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP), Reagentien der Schiff’schen Basen, Anhängen von Sulfhydrylgruppierungen, die Verwendung von Natrium-Isothiocyanat oder enzymatische Verknüpfung, um nur wenige zu nennen. Wenn ein Radioisotop an den Ligand geknüpft wird, kann dies auch auf enzymatische Weise, durch oxidative Substitution, Chelatbildung, etc. vor sich gehen. Als Überblick über die zur Proteinmodifizierung verwendbaren Reagentien vgl. Lundblad und Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification, Volume II, CRC Press,Inc. Boca Raton, Florida, Ch. 5. S. 123-139,1984).

Die chemische Verknüpfung oder Kupplung einer Verbindung an den Liganden kann an eine Stelle des Liganden gerichtet werden, die an der Bindung mit 8p50 nicht teilhat. Das könnte durch Schutz dieser Bindungsstelle des Liganden vor der Durchführung der Kupplungsreaktion erfolgen. Beispielsweise kann der Ligand zuerst an Bp50 gebunden werden, um die Bp50-Bindungsstelle zu blockieren, dann kann die Kupplungsreaktion zur Bindung der gewünschten Verbindung an die verfügbaren reaktiven Stellen am Ligand-Bp50-Komplex erfolgen. Wenn die Kupplungsreaktion vollendet ist, kann der Komplex zerlegt werden, wobei ein modifizierter Ligand entsteht, an welchen die gewünschte Verbindung geknüpft ist, sodaß die Bp50-Bindungsstelle des Moleküls minimal beeinflußt wird. Wenn der Ligand einen monoklonalen Antikörper, wie G28-5, enthält, in welchem der Fc-Bereich des Moleküls für die Ausübung der Wirkung des Liganden nicht erforderlich ist (vgl. den später folgenden Abschnitt 5.3.3.), kann es von Vorteil sein, die Kupplung der gewünschten Verbindungen an den Fc-Bereich des Moleküls zu lenken.

Die folgenden Ausführungen beschreiben den neuen 50 kDa B-Zellen-Oberflächenmarker Bp50, der offensichtlich eine Funktion bei der B-Zellen-Proliferation hat, ebenso wie die Liganden, die sich an den neuen 50 kDa Rezeptor binden; sowie ihre Verwendungen. Als Beispiel der erfindungsgemäßen Liganden werden auch ein monoklonaler Antikörper, der Bp50 definiert, und ebenso dessen F(ab')2-Fragmente beschrieben, die wie BCGF die Zellen-Proliferation verstärken. Zum Unterschied von anti-Bp35 mAb, der die ruhenden B-Zellen in G0 zum Eintritt in Gi veranlassen kann, aktiviert anti--Bp50 mAb die ruhenden B-Zellen nicht. Anti-Bp35 und anti-Bp50 mAb gemeinsam bewirken jedoch ohne zusätzliche äußere Signale eine starke Aktivierung und Proliferation der gereinigten B-Zellen.

Die im folgenden beschriebenen Versuche zeigen, daß die Wirkung von anti-Bp50 der Wirkung von BCGF ähnlich ist, daß sich jedoch anti-Bp50 von einem BCGF unterscheidet, da anti-Bp50 und niedrigmolekulares BCGF deutlich additiv sind und unterschiedlich auf verschiedene B-Zell-Untergruppen oder maligne Zustände wirken. Bp50 kann ein Rezeptor für einen unterschiedlichen BCGF oder für ein Transmembransignal sein, das die BCGF-Produktion oder die BCGF-Rezeptorexpression moduliert. 6

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Verfahren zur Charakterisierung des Bp50 Rezeptors

Zellzubereitungen. Mononukleare Zellen wurden aus normalem oder leukämisch heparanisiertem peripherem Blut durch Ficoll-Hypaque-Gradienten isoliert (Pharmacia, Piscataway, NJ.). Die mononuclearen Zellen wurden aus Tonsillargeweben nach der Beschreibung (Clark et al., 1985, Proc. Nat.Acad. Sei. USA 82:1766-1770) erhalten. T-Zellen wurden durch AFT-behandelte Schaf-Erythrozyten-Rosettierung und Ficoll-Hypaque-Gradienten-Trennung abgereichert Bei manchen Versuchen werden die B-Zeilen des Blutes durch Isolierung von an Nylonwolle haftenden Zellen angereichert. Die Monozyten wurden durch ein- oder zweimalige Inkubation in Kunststoff-Petrischalen bei 37 "C während 45 min entfernt, wenn nicht anders angegeben. Schwimmende oder dichte tonsillare B-Zell-Fraktionen wurden durch Percoll-Stufengradienten nach der Beschreibung von Clark, et al., 1985, Proc. Nat.Acad. Sei. USA 82:1766-1770 isoliert. Dichte tonsillare B-Zell-Präparationen hatten übereinstimmend mehr als 95% slg + Bp35 + Zellen. Mit Blut-B-Zellen angereichterte Präparationen hatten 60-80% slG +Zellen. Die B-Zellen-Lymphomzellen wurden durch vorsichtiges Zerlegen von Lymphomzellen in Medium and anschließende Ficoll-Hypaque-Gradienten-Zentrigugierung isoliert.

Monoklonale Antikörper. Der G28-5 Antikörper für Bp50 wurde durch Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit menschlichen tonsillaren E-Leukozyten und Fusionierung der immunen Milzzellen mit NS-1-Myelom erzeugt (Köhler, et al., 1975, Nature 256:495:497;Ledbetter, et al., 1979, Immunol. Rev. 47:63-82) Kulturen hybrider Zellen, die den mit tonsillaren B-Zellen, jedoch nicht mit T-Zellen reaktiven Antikörper abgeben, wurden durch Verwendung der indirekten Immunofluoreszenz (IF) und Analyse mit einem FACS IV Zellsortierer identifiziert: Kulturen mit einem Antikörper, dessen Histogramm-Muster ähnlich dem des bekannten mAb für Pan-B-Zellen-Marker (z.B. Bp35) ist, wurden geklont und für weitere Studien ausgewählt. Der G28-5-Klon produzierte einen IgGi-mAb, der nur mit normalen oder malignen B-Zellen oder B-Zellinien reagierte. Andere bei dieser Studie verwendete mAb wurden detalliert beschrieben (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82:1766-1770; Clark et al., 1986, Human Immunol. 16-100; Ledbetter, et al., 1986, Human Immunol. 15: 30-44; Ledbetter, et al., 1985, in Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASH, New York, 6, S. 325-340). Sie umfassen 1F5 (lgG2a) anti-Bp35, HB10a (lgG2a), anti-HLA-DR, 2C3 (!gG1) anti-u Kette, G19-4 (IgGi), anti-CD3, FC-2 (lgG2a) anti-Fc Rezeptor CD16 und 9.6 (lgG2a) anti-CD2 (E Rezeptor), die von Dr. Paul Martin (Martin et al, 1983, J.lmmunol. 131:180) zur Verfügung gestellt wurden. Die IgGi mAbs wurden durch Ausfällung mit 45-50%igem gesättigtem Ammoniumsulfat und Säulenchromatographie über DEAE Sephacryl gereinigt und die lgG2a mAbs wurden unter Verwendung von Protein A Sepharose-Säulen gereinigt. Die F(ab')2-Fragmente von G28-5 wurden nach dem Verfahren von (Parham et al., 1983, J.lmmunol. 131:2895) bereitet, über eine 2 m lange Sephacryl-S200 -Säule gereinigt und durch SDS-PAGE (Ledbetter et al., 1985, J.lmmunol. 135:1819) auf Reinheit untersucht. Der 2C3 mAb für u-Ketten wurde an Sepharose 4B-Perlen (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) unter Verwendung der Bromcyan-Kupplung gekuppelt.

Fluorescein- und Phycoerythrin-Konjugationen. Gereinigte mAb wurden entweder direkt mit Fluorescein unter Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat (FITC; Moiekularsonden) (grün) nach dem Verfahren von Goding (Goding et al., 1976, J.lmmunol. Meth. 13215-226) oder an R-Phycoerythrin (PE) (rot) unter Verwendung von SPDP (Pharmacia) nach einem Verfahren, das detailliert in Ledbetter et al., 1985, Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, 119-129 beschrieben ist, konjugiert. Die Lymphoidzellen wurden in rundbödigen Mikrotiter-Platten 30 min mit einer geeigneten Verdünnung von grünem und/oder rotem mAb inkubiert, zweimal gewaschen und dann mit einem PACS IV Zellsortierer analysiert.

Zweifarben-Immunofluoreszenz. Zweifarben-Studien wurden mit einem fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS IV: Becton-Dickinson, Mountain View, CA) unter Verwendung eines 560-nm Dichroidspiegels zur Aufspaltung des Strahls und eines 580 Longpass-Filters sowie eines 540 Kurzpass-Filters (Ditric Optics, Hudson MA) vor der roten bzw. grünen Photomultiplier -Röhre vorgenommen. Außerdem wurde ein Zweifarben-Kompensator (T.Nozaki, Stanford University) zur Korrektur eines geringen Spill-over von grünen und roten Signalen verwendet. Für jeden Zweifarben-Fleck wurden Daten von 40 000 Zellen aufgenommen und auf Floppy Disks gespeichert. Die Daten sind als Zellanzahl (vertikal) gegen den Logarithmus der grünen Fluoreszenz gegen den Logarithmus der roten Fluoreszenz auf einem 64 x 64 Punktgitter dargestellt. Etwa 4,5 Punkte stellen eine Verdopplung der Fluoreszenz dar. Ungefärbte Zellen sind in der hinteren Ecke des Gitters angeordnet; die rote Fluoreszenz ist rechts, die grüne Fluoreszenz links. Das cytomethri-sche Fließsystem für Zweifarben-IF mit Fluorescein und Phycoerythrin ist detailliert von (Ledbetter, et al., 1985, in Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6,119-129 und 325-340) beschrieben. 7

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Zellkultur. Blut- oder Tonsillar-Lymphoidzellen wurden vierfach in einer Menge von 5-10 x 10s/ml in 96 Mulden-Mikrotiterplatten gezüchtet, die 200 ul RPM1-1640-Medium, ergänzt mit 15% fötalem Rinderserum, Antibiotika, Glutamin und Pyruvat (R15), enthielten. Nach 1 bis 7 Tagen wurden die Zellen mit 0,5 uCi 3H-Thymidin pro Mulde (New England Nuclear, 6,7 Ci/mMol; 1 Ci=37) während 18h pulsiert. Die Zellen wurden auf Glasfaser-Filtern in einem Zellemter geerntet, die Radioaktivität in einem Scintillationszähler gemessen. Bei manchen Versuchen wurden Antikörper oder Faktoren zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Beginn der Züchtung zugesetzt; die Proliferation bei diesen Versuchen wurde am 3.Tag gemessen.

Costimulationsfaktoren. Von Cytokine Technology (Buffalo, New York) wurde gereinigter BCGF besorgt, der keine feststellbare IL-1-, IL-2- oder Interferon-Wirkung hatte. Dieser BCGF wurde nach dem Verfahren von Maizel und Mitarb. (Maizel, et.al. 1982, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 79:5998) hergestellt, die gezeigt hatten, daß die hauptsächliche BCGF-Wirkung in diesem Material in einer 12 kDa-Spezies liegt, die im Folgenden als BCGF(niedrig) bezeichnet wird (Metha et al., 1985, J.lmmunol. 135:3298). Die Reinigungsstufen umfaßten eine DEAE Affinitätschromatographie im präparativen Maßstab und anschließend eine Chromatographie über eine Hydroxylapatit-Säule. Bis zur Homogenität gereinigter IL-1 war das großzügige Geschenk von Dr.Steven Dower (Dower et al., 1985, J.Exp.Med. 162:501). Rekombinantes IL-2 wurde freundlicherweise von der Cetus Corporation zur Verfügung gestellt. TPA (12-0-Tetradecanoyl-phorbol-13-acetat) wurde bei Sigma besorgt.

Feststellung der Zellaktivierung. Änderungen im Zellvoiumen, die durch mAb und/oder Faktoren hervorgerufen werden, wurden unter Verwendung eines Zellsortierers und eines Lichtstreuers mit Vorwärtswinkel gemessen. Änderungen des Zellzyklus in den zellulären Niveaus von RNA und DNA wurden durch Färben der aktivierten Zellen mit Acridinorange und Messen der relativen RBA-(rot)- und DNA-(grün)-Zellgehalte mit einem Zeilsortierer nach dem Verfahren von Darzynkiewicz et al (Darzynkiewicz et al., 1980, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 77:6697-6702) gemessen. Änderungen im relativen Ausmaß der Zelloberflächenantigene wurden durch Verwendung von direkt mit Fluorescein konjugiertem mAb überwacht und dann anhand der direkten IF Fluoreszenz-Niveaus mit einem Epics V Zellsortierer quantitativ bestimmt.

Biochemische Kennzeichnung von Bp50. Die Immunopräzipitation von Bp50 aus oberflächlich 1251-markierten Tonsillarzellen wurde nach der Beschreibung von Ledbetter et al., 1985, J.lmmunol. 134:4250-4254 durchgeführt. Die isolierten Antigene wurden einer Elektrophorese auf 10% SDS Polyacrylamid-Plattengelen ohne Reduktion unterworfen. Die Gele wurden durch Autoradiographie bei -70 "C und Cronex Belichtung mit Verstärkungs-Screens (Dupont) sichtbar gemacht.

Kennzeichnung des Bp5Q Rezeptors.

Die folgenden Kapitel beschreiben die Ergebnisse der unter Anwendung der obigen Verfahren durchgeführten Versuche.

Identifizierung eines B-Zellen-spezifischen 50 kDa Zelloberflächenmarkers, Bp50.

Ein mAb für Bp50 wurde durch Immunisierung von BALB/c Mäusen mit humanen Tonsillarylmphozyten und Fusion der immunen Milzzellen mit dem NS-1-Myelom gewonnen. Ein Klon, G28-5, produzierte einen IgGi mAb, der keine leichte NS-1-Kette enthielt. Durch sorgfältige IF-Analyse wurde gefunden, daß G28-5 nur mit normalen oder malignen B-Zellen oder B-Zellinien reagierte. Eine umfassende Sichtung der normalen Gewebe durch abgesicherte Methoden (Clark, et al., 1985, Proc.Nat. Acad. Sei. USA 82:1766-1770; Ledbetter et al., 1986, Human Immunol. 15:30-44; Ledbetter, 1985, in Perspectives in Immunogene-tics and Histocompatibility, ASH, New Nork, 6,S. 325-340) zeigte, daß der G28-5 Antikörper mit E-Rosetten-negativen (Er-)-Zellen aus Blut oder Tonsillen reagierte, jedoch nicht mit an Nylonwolle nichtadherenten T-Zeilen, PHA-induzierten T-Zell-Blasten oder mit Blut-Granulozyten, Monozyten, roten Zellen oder Plättchen. Er reagierte stark m'it allen sieben untersuchten B-Lymphoblastoid-Zellinien und mit dreiBurkitt-Lymphom-Linien (Raji, Daudi, Namalwa), jedoch nicht mit vier T-Zellinien (CEM, HSB-2, JURKAT und HBP-ALL). Alle untersuchten chronischen Lymphozyten-Leukämien(3/3) und 90% (9/10) der untersuchten B-Lymphome exprimierten den Bp50-Marker, während nur 28% (2/7) von nicht T-, nicht B CALLA+-akuten lymphozyti-schen Leukämien Bp50 exprimierten.

Die beschränkte Verteilung von Bp50 auf normalen Geweben wurde weiters durch quantitative Zweifar-ben-lmmunofluoreszenz-(2 Farben-IF)-Analysen bestätigt. Bei Verwendung eines R-Phycoerythrin (PE)-konjugierten Antikörpers (rot) für das Pan-B-Zellantigen Bp50 (B1, CD20) und der Fluorescein-konjugierten anti-Bp50 Antikörper (grün) wurde gefunden, daß Bp50 nur an Bp35 +B-Zellen (Fig. 1) in Blut oder Tonsillen exprimiert wurde. Blut-B-Zellen exprimierten übereinstimmend etwas geringere Ausmaße an Bp50 als tonsillare B-Zellen; 8

AT 398 437 B das ist ähnlich der HLA-DR Expression (Ledbetter et al., 1986 Human Immunol. 15:30-44) und der gp54 Expression (Wang et al., 1979, J. Exp. Med. 149:1424-1433) die ebenfalls bei Blut-B-Zellen niedriger sind. Bp50 wurde an Tonsillar-B-Zell-Subpopulationen, die über Percoll-Gradienten in schwimmende und dichte Fraktionen aufgetrennt waren, in gleichem Ausmaß exprimiert. Bei Verwendung des PE-konjugierten mAb für den T-Zell-Marker CD3 (T3) und den NK-Zellenassoziierten Marker CD16 (Fc-Rezeptor) (Ledbetter et al„ 1979, Immunol. Rev. 47:63-82) wurde gefunden, daß Bp50 an T-Zellen oder NK-Zellen nicht exprimiert wurde. Bei Verwendung von 2Farben-IF wurde auch gefunden, daß CD3 + PHA Blästen, die hohe Mengen IL-2-Rezeptoren exprimierten, Bp50 nicht exprimierten.

Der G28-5 Antikörper reagierte mit einem einzigen Polypeptid an tonsillaren Lymphozyten, die bei etwa 50 Kd unter nicht reduzierenden Bedingungen wanderten (Fig. 2). Dieses Molekül ist größer als ursprünglich bekannt gewordene B-Zell-Marker im gleichen Molekulargewichtsbereich, wie Bp39 oder Bp45, (Zipf, et al., 1983, J.lmmunol. 131:3064-3072; Kitner, et al., 1981, Nature 294, 458-460; Clark, et al., 1986, in Leukocyte Typing II, eds. Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlin, Chap, 12 Vol. 2, 155-167; Slovin, et al., 1982, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 79:2649-2653; Thorley-Lawson, et al., 1985 J. Immunol. 134:3007-3012 und Fig. 2B). Die Belichtungszeit dieses Gels wurde so ausgewählt, daß die Molekulargewichte anderer B-Zell-Marker leicht mit Bp50 verglichen werden konnten. Der Bp39-Marker wird ungleich dem Bp50 an Granulozyten exprimiert und Bp45 ist ungleich Bp50 auf B-Zell-Blasten beschränkt. Antikörper für 8p39 (41-H16) und Bp45(MNM6, Blast-1, Blast-2) die durch ein Internationales Workshop erhältlich waren (Clark, et al., 1986, in Leukocyte Typing II, eds. Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlin, Chap. 12 Vol. 2,155-167) blockierten nicht die Bindung von fluoresceinierten anti-Bp50 Antikörpern für B-Zellen. Basierend auf Gewebeverteilung, biochemischer Analyse und Blockierungsstudien unterscheidet der G28-5 monoklonale Antikörper eine 50 Kd Struktur deutlich von anderen bekannten B-Zeli-Antigenen.

Die Expression von Bp50 ist auf B-Zellen beschränkt.

Sowohl hämatopoethische Gewebe- und Zellinien-Verteilungs-Studien als auch detaillierte cytometri-sche 2-Farben-Strömungsanalysen zeigten, daß Bp50 nur an B-Lymphozycten exprimiert wird. Wie in Fig. 3 erläutert, wird Bp50 an einer kleinen Untergruppe von Blutlymphozyten und einer großen Population von Tonsillarlymphozyten exprimiert. Praktisch alle Bp50 + Zellen sowohl in Blut als auch in Tonsillen exprimierten Bp35 und HLA-DR, exprimierten jedoch nicht CD2 (Fig. 1) oder CD3, T-Zell-Moleküle oder die IgG Fc Rezeptoren, die an NK-Zellen gefunden wurden. Weiters exprimierten ConA-aktivierte CD3+ T-Zell-Blasten IL-2-Rezeptoren, jedoch nicht Bp50.

Cytometrische 2-Farben-Strömungsanalysen erlauben die quantitative Messung der Dichtebeziehung zwischen zwei Oberflachenantigenen. Es konnte früher gezeigt werden, daß die dichten ruhenden B-Zellen in der Mantelzone sekundärer Follikel IgM und niedrige Mengen Bp35 exprimieren, während schwimmende aktivierte B-Zellen im Keimzentrum IgM-negativ sind und erhöhte Mengen Bp35 exprimieren (Ledbetter et al., Human, Immunol. 15:30). Fig. 3 zeigt, daß sowohl IgM-positive als auch IgM-negative B-Zellen-Untergruppen Bp50 in gleichen Mengen exprimierten, was darauf hindeutet, daß Bp50 sowohl an ruhenden B-Zellen als auch an in-vivo-aktivierten B-Zellen exprimiert wird.

Verstärkung der B-Zellen-Proliferation mit Anti-Bp50-Antikörper.

Wie vorher erklärt, können B-Zellen mit niedrigen Dosen von anti-u-Ketten-spezifischen Antikörpern aktiviert werden. Kürzlich wurde gefunden, daß der B-Zellen-spezifische Marker Bp35 (B1), ein 35 kDa Polypeptid, auch bei der frühen B-Zellen-Aktivierung eine Rolle spielt; der 1F4 mAb für Bp35 aktiviert ebenso wie geringe Dosen von anti-u-Antikörper die B-Zellen zur Verstärkung des Zellvolumens und des RNA-Gehalts und zur Reaktivität auf BCGF (Clark et al., 1985, Proc. Nat.Acad. Sei. USA 82:1766-1770; Gollay, et al., 1985, J. Immunol. 135:3795-3801). Daher war es imteressant , die Wirkung von anti-Bp50 mAb auf die Proliferation von unbehandelten B-Zellen oder von B-Zellen, die entweder mit anti-Bp35 oder mit anti-u-Antikörpern aktiviert worden waren, zu vergleichen (Tab. 1). Anti-Bp35 in Lösung oder anti-u-Antikörper, die an Sepharose-Perlen gebunden sind, können nur unter geeigneten Bedingungen eine gewisse B-Zellen-Proliferation stimulieren (Tabelle 1, Zeile 1); im Gegensatz dazu stimulierten anti-Bp50 Antikörper allein nicht die Proliferation (Tabelle 1, Zeile 2). Jedoch erhöhte anti-Bp50 mAb die Proliferation beträchtlich, wenn mit anti-u-Perlen oder mit anti-Bp35 gezüchtet wurde. In dieser Hinsicht ähnelt anti-Bp50 dem BCGF (Tabelle 1, Zeile 3). Somit war es interessant zu bestimmen, ob anti-Bp50 und BCGF gemeinsam die B-Zellen-Proliferation induzieren können. Wie aus Tabelle 1, Zeile 4 hervorgeht, induzierten anti-Bp50 und BCGF gemeinsam die Proliferation nicht, erhöhten jedoch die Proliferation von entweder anti-u- oder anti-Bp35-aktivierten Zellen um Etliches mehr als jede Stimulierung allein. Über einen 3-Log-Bereich 9

AT 398 437 B hatte BCGF bei Verwendung mit anti-Bp50 ohne anderen Signalen keine Wirkung auf die Proliferation von dichten B-Zellen, selbst wenn anti-Bp50 in Dosen von 0,1 bis 10 ug verwendet wurde.

Tabelle 1

Verstärkung der Anti-Ig- oder Anti-Bp35-induzierten B-Zellen-Proliferation mit Anti-Bp50-Antikörpern

Mittlere Proliferation + Standardfehler von B-Zellen, gezüchtet mit:

Linie Co-Stimulans Medium Anti-u-Perlen Anti-Bp35 1 keines ' 1,212+547 10,219+462 5,539+308 2 Anti-Bp50 719+718 38,792+1,329 25,465+616 3 BCGF 456+217 14,217+445 9,443+343 4 Anti-Bp50 + BCGF 1,456+126 54,393+2,537 46,488+3,3

Proliferation von dichten Er- tonsillaren B-Zellen (95% Oberflächen IgM*-Zellen) wurde wie beschrieben am 3.Tag gemessen. Kurz gesagt, wurden 2 x 10° Zellen/200 μ.1-Mulden vierfach 48h mit RPMI 1640 Medium mit einem Gehalt an 15% fötalem Rinderserum plus Zusätzen ohne Antikörper oder mit entweder 2C3 monoklonalem Antikörper für u-Ketten, gekuppelt an Sepharose-Perlen (*anti-u-Perlen" 50ug/ml) oder freiem 1F5 anti-Bp35-Antikörper (5μg/ml) gezüchtet.

Die Kulturen, die Medium, "anti-u-Perlen" oder anti-Bp35.enthielten,wurden allein oder mit BCGF (5% Endkonzentration, Cytokine Technology, Buffalo, New York) gezüchtet; keine feststellbare IL-1-oder IL-2-Aktivität), mit anti-Bp50 (1:1000.-Verdünnung des Ascites) als Co-Stimulans gezüchtet. Nach 40 h wurden die Zellen mit 3H-Thymidin pulsiert und die eingebauten Zähler wurden nach 18h gemessen. 5.3.1. Anti-Bp.50 mAb verstärkt die Proliferation nur nachdem die B-Zellen mit Anti-Bp35 oder Anti-u-Antikörpern aktiviert wurden.

Die Resultate von Tabelle 1 zeigen, daß anti-Bp50 mAb die Proliferation selbst nicht induzieren konnte. Wie aus Fig. 4 hervorgeht, hatten Dosen von anti-Bp50 im Bereich von 0,05 bis 2,0 ug/ml keine Wirkung auf die Aufnahme von 3H-Thymidin. In Gegenwart optimaler Mengen von anti-Bp35 mAb verstärkten so geringe Mengen wie 0,1 bis 0,5 ug/ml anti-Bp50-Antikörper die Proliferation wesentlich. Bis zu 50 000 bzw. 70 000 cpm wurden bei der optimalen Proliferationszeit festgestelit, wenn hochgereinigte B-Zellen nur mit anti-Bp35 plus anti-Bp50 gezüchtet wurden. Übereinstimmend wurde beobachtet, daß höhere Dosen von anti-Bp50 (größer als 2-5 ug/ml) weniger wirksam waren als Dosen im Bereich von 100-200 ng.

Diese Resultate legten nahe, daß anti-Bp50 nur wirken kann, wenn die B-Zellen durch andere Signale aktiviert sind. Die in Fig. 5 gezeigten Daten geben an, daß dies tatsächlich der Fall ist. Wenn B-Zellen zuerst mit anti-Bp35 aktiviert wurden, konnte anti-Bp50 sogar bis zu 24-48h später zugesetzt werden und verstärkte immer noch die Proliferation am 4. Tag. Wurden im Gegensatz dazu die Zellen zuerst mit anti-Bp50 behandelt, wirkte das anti-Bp35 nur, wenn es innerhalb weniger Stunden nach Beginn der Kulturen zugesetzt wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden gefunden, wenn anti-u statt anti-Bp35 verwendet wurde.

Anti-Bp50 mAb aktivieren B-Zellen nicht aus ihrem G0-Zustand, induzieren aktivierte B-Zellen jedoch zum Fortschreiten durch den Zellzyklus.

Ursprünglich wurde gefunden, daß anti-Bp35 ebenso wie geringe Dosen von anti-u-Antikörpern die ruhenden Tonsillar-B-Zellen in G0 zur Vergrößerung (Clark et al„ 1986, Leukocyte Typing II, eds. Reinherz, 10

AT 398 437 B et al., Springer Verlag, Berlin, Vol. 2,455-462) und zum Eintritt in die Gi-Phase des Zellzyklus anregen (Gollay, et al., 1985, J.lmmunol. 135:3795-3801). Daher war es von Interesse, die Eigenschaften von anti--Bp50 mAb gegenüber anti-Bp35 mAb bezüglich ihrer Wirkung auf die B-Zellen-Aktivierung zu vergleichen. Wie in Fig. 6A gezeigt, hatten unstimulierte dichte Tonsillar-B-Zellen selbst nach 3 bis 4 Tagen in der Kultur ein einheitliches RNA-Profil, das für Zellen in G„ charakteristisch ist (Darzynkiewicz, 1980, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 77: 6697 :6702. 15-30% der mit anti-Bp35 oder anti-u stimulierten Zellen hatten jedoch einen erhöhten RNA-Gehalt, der auf den Eintritt in Gi hinweist. Im Gegensatz dazu induzierten weder anti-Bp50 (Fig. 6B) noch BCGF (Fig. 6C) allein deutliche Mengen von B-Zellen zum Eintrtt in Gi. Beispielsweise regten anti-Bp35 und anti-lg mAb 2 Tage nach der Aktivierung 13,5 bzw. 20,9 % der Tonsillarzellen zum Eintritt in Gi an, während Zellen, die nur mit anti-Bp50 (2,7%) oder BCGF (3,2%) behandelt waren, die mittleren Kontrollwerte (2,2%) beibehielten. Wenn jedoch entweder anti-Bp50 oder BCGF gemeinsam mit anti-Bp35 oder anti-u-Antikörpern zugesetzt wurden, stieg der Anteil an Zellen, die in Gi eintreten, dramatisch. In gleicher Weise induzierten anti-Bp50 und BCGF allein nicht die B-Zellen zum Eintritt in die S-Phase (Tabelle 2), jedoch gemeinsam mit entweder anti-Bp35 oder anti-u stieg die Anzahl der S-Phase-Zellen um das 2- bis 3-Fache. 11

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AT 398 437 B

Optimale Bedingungen für die Verstärkung der B-Zellen-Proliferation mit anti-Bp50-Antikörpern.

Antikörper für Bp50 haben selbst einen geringen oder keinen merkbaren Effekt auf dichte ruhende B-Zellen (Tabelle 3). In Gegenwart von B-Zellen aktivierenden Mitteln, wie anti-lg, anti-Bp35 und TPA, verstärkte anti-Bp50 mAb deutlich die Proliferation. Anti-Bp50 wirkte mit verschiedenen Interleukinen, wie gereinigtem IL-1, rekombinantem IL-2 und BCGF(niedrig) nicht als Costimulans.

Ein Vergleich der Wirkungen von anti-Bp50 mit denen von BCGF (niedrig) zeigte, daß die gleichen Mittel, die mit anti-Bp50 costimulierend wirkten, auch mit BCGF(niedrig) costimulierend sind (Tabelle 3). Von besonderem Interesse war das Ergebnis, daß BCGF und anti-Bp50 gemeinsam für ruhende Zellen nicht costimulierend wirken.

Tabelle 3

Verstärkung der B-Zellen-Proliferation mit Anti-Bp50-Antikörpern oder B-Zellen-Wachstumsfaktoren. Costimulans Mittlere Proliferation ± Standardfehler von B-Zellen, die gezüchtet sind mit: Medium Anti-Bp50 (200 ng/mL) BCGF (5%) keines 96 ± 1 267 ± 15 285 ±74 anti-lg 5,833 ± 391 41,634 ±2,103 25,094 ± 61 anti-Bp35 (5 ug/ml) 457 ± 45 8,143 ±280 1,733 ±32 TPA (2 ng/ml) 7,361 ± 537 21,163 ±871 13,064 ± 1,030 IL-1 (10 U/ml) 264 ±2 308 ± 23 221 ±8 IL-2 (100 U/ml) 204 ± 34 350 ±7 220 ±11 BCGF (5%) 220 ±7 851 ± 28 270 ± 18 Dichte Er- tonsillare B-Zellen (mehr als 95% slgM+ Zellen) werden 48h mit 2-105 Zellen/Mulden gezüchtet und anschließend 24h mit 3H-Thymidin pulsiert, bevor sie gezählt werden.

Die Kinetik der durch anti-Bp50 gesteigerten Proliferation ist in Fig. 7 gezeigt. Die Proliferationsspitze trat am 4.Tag auf und nahm dann ab, unabhängig davon ob die Zeilen mit anti-Bp35 oder anderen Aktivatoren, wie anti-lg oder TPA aktiviert waren oder nicht. Die Kinetik der durch BCGF oder durch anti-Bp50 gesteigerten Proliferation war ähnlich.

Die Proliferation wurde durch so geringe Mengen wie 0,05 ug anti-Bp50-Antikörper verstärkt. Eine optimale Dosis von 0,3 ug/ml wurde bei den darauffolgenden Untersuchungen verwendet. Übereinstimmend wurde beobachtet, daß bei Verwendung der ganzen Antikörper-Moleküle höhere Dosen anti-Bp50 (größer als 2-5 ug/ml) weniger wirksam waren als Dosen im Bereich von 0,1-0,5 ug/ml).

Die humanen B-Zellen sind außerordentlich empfindlich auf Inhibitionswirkungen, die durch die Fc Rezeptoren von Antikörpern, die sich an die Ig-Oberfläche binden, vermittelt werden. (Parker, 1980, Immunol. Rev. 52:115; Bijsterbosch, et al., 1985, J.Exp. Med. 162:1825). Es war daher wichtig, die Wirksamkeit von ganzem anti-Bp50 Antikörper mit der der anti-Bp50 F (ab’)2 Fragmente zu vergleichen. Über einen Bereich des Hundertfachen waren die F(ab')2 Fragmente eindeutig ebenso wirksam oder sogar wirksamer bei der Verstärkung der B-Zellen-Proliferation als der ganze Antikörper (Tabelle 4). Daher ist der Fc-Bereich des anti-Bp50 mAb nicht zur Ausübung der Wirkung von anti-Bp50 notwendig und kann sogar inhibierend wirken. Mit anderen Worten kann anti-Bp50 ebenso wie BCGF offensichtlich als löslicher Mediator ohne Hilfe der Fc-Rezeptor-mediierten Nebenfunktion der Zeile wirken. 13

AT 398 437 B

Tabelle 4

Der Fc-Bereich von Anti-Bp50-Antikörpern ist zur Verstärkung der B-Zellen-Proliferation nicht erforderlich. Anti-Bp50 Dosis (ug/mi) Mittlere Proliferation der B-Zellen die gezüchtet sind mit: Medium Anti-Bp35 keiner - 295 ± 16 269 ± 27 ganzer Ab 0.125 278 ± 32 5,140 ±20 1.25 275 ± 24 4,686 ± 342 12.5 163 ± 15 3,852 ± 203 F(ab')2 0.125 594 ± 21 10,635 ±449 1.25 531 ±3 10,893 ±575 12.5 279 ±8 9,411 ± 870

Die Zellkulturbedingungen sind wie in Tabelle 3 beschrieben.

Unterschiede zwischen der Wirkung von Anti-Bp5Q und von BCGF(niedrig)

Anti-Bp50 und BCGF(niedrig) hatten eine ähnliche Wirkung auf die B-Zellen und waren costimulierend mit den gleichen Substanzen (Tabelle 3). Verschiedene Beweisführungen deuten jedoch darauf hin, daß anti-Bp50 und der in diesem Versuch verwendete BCGF über verschiedenen Signale arbeiten. Erstens werden Bp50 Moleküle zum Unterschied von BCGF(niedrig)-Rezeptoren (Bijsterbosch et al., 1985, J. Exp. Med. 162:1825) an ruhenden Blut-B-Zellen exprimiert (Fig. 3). Zweitens war anti-Bp50 eindeutig optimal wirksam, wenn es 12h nach Beginn der Kultur zugesetzt war (Fig. 8A), auch wenn sowohl anti-Bp50 als auch BCGF(niedrig) am wirksamstem sind, wenn sie nach anti-Bp35 oder anti-lg zugesetzt werden. Im Gegensatz dazu konnte BCGF(niedrig) sogar 24h nach Beginn der Kultur zugesetzt werden und immer noch optimal die Proliferation verstärken (Fig. 8B). Diese kinetischen Experimente, die nach den Angaben von Howard und Paul (1983, Ann. Rev. Immunol. 1: 307) durchgeführt wurden, legen nahe, daß ein Bp50-abhängiges Signal diese Wirkung normalerweise vor BCGF ausübt.

Sowohl anti-Bp50 als auch BCGF(niedrig) verstärken die Proliferation von B-Zellen, die mit anti-Bp35 oder anti-lg aktiviert waren (Tabelle 3). Die Wirkungen von anti-Bp50 und BCGF(niedrig) waren jedoch in vielen Fällen additiv (Fig. 7). Hg. 9 zeigt eine Titration von BCGF(niedrig) in einem Versuch, bei dem anti-Bp50 bei seiner optimalen Konzentration (0,2 ng/ml) eingesetzt wurde. BCGF(niedrig) konnte weiters die Proliferation von ruhenden B-Zellen in Gegenwart von anti-Bp50 nach der Aktivierung entweder durch antilg oder durch anti-Bp35 verstärken. Optimale Konzentrationen von BCGF(niedrig) waren 5-10%, während 25% inhibierend wirken. Somit zeigten anti-Bp50 und BCGF(niedrig) immer noch additive Wirkungen auf die B-Zellen-Proliferation, wenn sie beide mit ihren optimalen Konzentrationen eingesetzt werden.

Schließlich unterschieden sich normale und maligne B-Zellen-Untergruppen in ihren Reaktionen auf anti-Bp50 und BCGF(niedrig). Beispielsweise reagierten einige Blut-B-Zellen auf BCGF(niedrig), reagierten jedoch nicht auf anti-Bp50 (Tabelle 5). Übereinstimmend war ein zusätzliches Aktivierungssignal wie anti-Bp35 (Tabelle 5) oder TPA (Hg. 10) notwendig, um eine Blut-B-Zellen-Reaktion auf anti-Bp50 hervorzurufen. Während dichte Tonsillar-B-Zellen im allgemeinen nicht auf BCGF oder anti-Bp50 reagierten, taten dies schwimmende B-Zellen doch (Tabelle 5). Maligne B-Zell-Zustände unterschieden sich auch in ihrer Reaktivität auf anti-Bp5C im Vergleich zu BCGF. Beispielsweise reagierten manche B-Zell-Lymphome auf TPA plus BCGF(niedrig), jedoch nicht auf TPA plus G28-5 anti-Bp50 (Hg. 10B und D). Im Gegensatz dazu reagierten dichte Tonsillar-B-Zellen und periphere Blut-B-Zellen auf TPA plus entweder BCGF(niedrig) oder anti-Bp50 (Fig. 10A und C). 14 5

AT 398 437 B 70 75 20 25 £· 47 £ 3 C V 03 47 BO. p US P H > ρ px α 47 cc £ 4) £ 3 c in £ 43 « 30 4) Λ Ci e- 35 40 c 4) 3 P U. 4) O £ O v ca n 4« 4. 4) 4) p Ό c o 3 o c m 4) α aco a i 3 p 4. P BO C 4- < 4) P £ 3 I c 4) 45 43 N m

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Die neuen Liganden können in vivo oder in vitro, in ihrer unveränderten oder modifizierten Form zur Modulierung von Immunoreaktionen verwendet werden. Beispielsweise können die Liganden selbst als 15

AT 398 437 B "Hilfsmittel” zur Verstärkung einer Immunreaktion auf ein Vakzin oder zur Verstärkung einer Immunreaktion eines immunounterdröckten Individuums verwendet werden. Andererseits können modifizierte Liganden, bei denen Cytotoxine oder antiproliferative Mittel an die Liganden gebunden sind, zur Herabsetzung einer Immunreaktion, beispielsweise bei Autoimmunkrankheiten oder bei Transplantationspatienten zur Verhinde-5 rung der Organabstoßung verwendet werden. Diese modifizierten Liganden können auch zur Behandlung maligner Zustände verwendet werden, bei denen Zellen oder Tumore auftreten, die das Bp50 Antigen exprimieren, unabhängig davon, ob der maligne Zustand nun von der B-Zelle stammt oder nicht.

Sowohl die neuen Liganden als auch Bp50 können allein oder gemeinsam in vitro verwendet werden. Derartige Anwendungen umfassen in vitro-Assays, wie Immunoassays zur Feststellungg von Zellen, die das io Bp50 Antigen exprimieren, und/oder zur Feststellung einer Ausschüttung von Bp50 Antigen in Körperflüssigkeiten sofern dies der Fall ist. Für diesen Zweck kann der Ligand oder das Bp50 mit einer Radiomarkierung, fluoreszierenden Stoffen, einem Enzym, Enzymsubstrat, Farbstoff etc. markiert werden. Zusätzlich dazu können die Liganden zur Auftrennung und/oder Identifizierung von Zellen verwendet werden, die das Bp50 Antigen exprimieren, in welchem Fall der Ligand an einen immobilen Träger oder an einen 75 fluoreszierenden Stoff gekuppelt wird, der dann in einem FACS (Fluoreszentaktivierter Zellsortierer) verwendet werden kann.

Die verschiedenen Anwendungen und Einsatzmöglichkeiten der Liganden und von Bp50 werden im Folgenden detaillierter besprochen. 20 Bp50 Rezeptor und Verwendung von Liganden, wie Anti-Bp50, zur Verstärkung der B-Zell-Proliferation

In früheren Studien nahm man an, daß die bei der Anregung von B-Zellen von der G0- in die Gi -Phase des Zellzyklus involvierten Faktoren sich von den Faktoren oder Erfordernissen zum Eintritt in die S-Phase unterscheiden. Dieses Modell beruht prinzipiell auf Untersuchungen, die zeigen, daß Mittel, wie niedrige 25 Dosen von Anti-Ig B-Zell-Aktivierungsfaktoren oder anti-Bp35 allein, einen geringen oder keinen Effekt auf die B-Zellen-Proliferation haben. Doch können diese gleichen Mittel die B-Zellen zu einem Punkt in der Zellaktivierung bringen, wo sie für Wachstumsfaktoren empfänglich sind. Im Gegensatz dazu haben die Wachstumsfaktoren, wie BCGF oder IL-2 allein keine Wirkung auf ruhende B-Zelien, sondern verstärken das Wachstum aktivierter B-Zellen. 30 Obwohl die vorliegende Erfindung nicht auf irgend eine Theorie oder Erklärung beschränkt ist, zeigen die hier vorgeiegten Ergebnisse eine weitere Stütze für ein Modell einer deutlichen Regulierung der B-Zeilen-Aktivierung und der Wachstumsstufen. Es wurde gezeigt, daß die Aktivierungs- und Proliferationssignale in humanen B-Zelien durch eindeutige Zelloberflächenstrukturen übermittelt werden können. Obwohl anti-Bp35 mAb allein die B-Zellen zum Eintritt in die G1 -Phase des Zellzyklus aktivierte, regte es die 35 Proliferation nur wenig oder gar nicht an. Anti-Bp50 mAb hatte den gegenteiligen Effekt; es konnte die B-Zellen nicht aktivieren, konnte jedoch selbst bei einer so späten Zugabe von l2-24h nach der Aktivierung das Wachstum der B-Zellen auch anregen.

Voraussichtlich fungieren die Bp50 Moleküle normalerweise entweder als Rezeptor für einen Liganden, wie einen löslichen Wachstumsfaktor, oder für ein durch Zell-Zell-Kontakt übermitteltes Signal (das ist ein 40 an der Oberfläche einer anderen Zelle gefundener Ligand).Frühere Untersuchungen ergaben die Identifizierung verschiedener T-Zell-abgeleiteter BCGFs, die wie anti-Bp50 die B-Zellen-Proliferation verstärken. Sowohl hoch- als auch niedrigmolekulare Formen von B-Zellen-Wachstumsfaktoren wurden identifiziert und verschiedene Arten Zeigten additive Wirkungen (Kehrl, et al., 1984, Immunoi. Rev. 18:75-96; Kishimoto, 1985, Ann. Rev. Immuno. 3:133-157; Swain, et al. 1983, J.Exp. Med. 158: 822-835; Howard et al., 1984, 45 Immunoi. Rev. 78:185-210; Ambrus, et al., J.CIin Invest. 75:732-739; Ambrus, 1985, J.Exp.Med. 162:1319-1335). Somit kann Bp50 ein Rezeptor für einen dieser Faktoren sein.

Mit Ausnahme der IL-2-Rezeptoren und des C3d-Rezeptors wurden die Rezeptoren für Wachstumssignale an den B-Zellen noch nicht identifiziert. Der mAb AB-1 reagiert mit einem B-Zell-Marker, der nur an aktivierten B-Zellen exprimiert wird, und blockiert die BCGF-abhängige Proliferation. Er könnte somit den 50 BCGF-Rezeptor oder eine verwandte Struktur erkennen. Bp5Q scheint vom AB-1-Marker unterschiedlich zu sein, da der mAb AB-1 die Bindung des G28-5 anti-Bp50-Antikörpers nicht blockiert und zum Unterschied von G28-5 mAb nur mit aktivierten B-Zellen reagiert (Jung et al., 1984, J.Exp.Med. 160:1919-1924). Bp50 tritt an allen B-Zellen auf, was auf Grund der Adsorptionsanalyse und direkter Bindungsversuche für BCGF-Rezeptoren nicht der Fall zu sein scheint. Laufend ergeben die ermittelten Werte, daß Bp50 und der 55 Rezeptor für niedrig molekulare BCGF unterschiedliche Strukturen sind. Bei Verwendung eines Kaninchen-Heteroantiserums beschrieben Wang und Mitarbeiter (Wang 1979, J.Exp.Med. 149:1424-1433) ein 54 kDa Glycoprotein gp54, das wie Bp50 an allen B-Zellen exprimiert wird, jedoch an Blut-B-Zellen in geringerem Ausmaß als den Tonsillarzeilen. Es ist möglich, jedoch unwahrscheinlich, daß das Kaninchen-Heteroantise- 16

AT 398 437 B rum und anti Bp50 die gleichen oder verwandten Strukturen erkennen: zum Unterschied von anti-Bp50 mAb genügte das Kaninchen-Antiserum für gp54 allein zur Stimulierung der B-Zellen-Proliferation.

Anti-Bp35 allein kann zum Unterschied von anti-Bp50 die B-Zellen vom G0-Zustand in den Gi -Zustand anregen und kann somit als ein "Aktivierungs"-signal bezeichnet werden. Es ist noch nicht klar, ob Bp35 nur bei der frühen B-Zellen-Aktivierung funktioniert oder nicht, da anti-Bp35 Antikörper manche B-Zellen zur Teilung veranlassen können (Clark et al., 1985, Proc. Nat.Acad. Sei. USA 82:1766-1770). In ähnlicher Weise kann Bp50 nicht ausschließlich nur als ein "Wachstums"signal fungieren: anti-Bp50 Antikörper gemeinsam mit Aktivierungssignalen (anti-Bp35 oder anti-u) erhöhen nicht nur die Proliferation sondern auch die Gesamtzahl der B-Zellen, die in Gr eintreten (Tabelle 2). Mit anderen Worten wirkt anti-Bp50 als Costimulans zur Promovierung des Fortschritts sowohl der Aktivierungs-(G0 in Gi) als auch der Wachstums-(G in S)-Phasen des Zellzyklus. Der bei diesen Untersuchungen verwendete BCGF hatte auch eine ähnliche Wirkung (Fig. 6C). Somit erscheinen anti-Bp35 und anti-Bp50 (oder BCGF) weitgehend analog zu den "Kompetenz"- und "Progressions"-Faktoren zu sein, die bei Studien der Fibroblastwachstumsregulierung beschrieben wurden. Die Art der Reaktion von B-Zellen auf anti-Bp35 oder anti-Bp50 kann eindeutig von ihrem Differentiations- oder Aktivierungszustand abhängen.

Es wurde nun gezeigt, daß zwei mAb, Anti-Bp35 (ein "Kompetenz" Signal) und anti-Bp50 (ein"Progressions"-signal) gemeinsam eine deutliche Proliferation von hoch gereinigten B-Zellen ohne Anwesenheit eines Antigens oder anderen bekannten Faktors anregen können. Die natürlichen Liganden für diese Strukturen sind bis jetzt noch nicht bekannt. Da jedoch mAb für geeignete Epitope sowohl lösliche Faktoren als auch durch Zell-Zell-Wechselwirkung mediierte Signale nachahmen können, kann es möglich sein, geeignete Kombinationen von mAb zur Lenkung und Regulierung der humanen B-Zellen-Proliferation oder -Differentiation zu verwenden . Das wird seinerseits helfen, in vivo-Strategien zu entwerfen, um Humanleiden, wie maligne B-Zell-Zustände, Immunomängel und bestimmte Autoimmunkrankheiten zu behandeln.

Der neue monoklonale Antikörper G28-5, der mit einer einzelsträngigen Polypeptidkette von etwa 50 kD, die an der Oberfläche von humanen B-Zellen, exprimiert wird, reagiert, ist nur eine spezielle Ausführungsform der erfindungsgemäßen Liganden, die die Proliferation aktivierter B-Zellen verstärken können. Da die humane B-Zellen-Proliferation in ähnlicher Weise von T-Zell-abgeleiteten BCGFs, wie niedrig- und hochmolekulargewichtigen BCGF, verstärkt werden kann, wurde die Aktivität von anti-Bp50 G28-5 mit der einer BCGF-Zubereitung verglichen, die hauptsächlich niedrigmolekulargewichtigen BCGF enthielt. Anti-Bp50 G28-5 und BCGF (niedrig) waren insofern sehr ähnlich, als sie mit den gleichen Aktivierungssubstanzen (anti-lg, anti-Bp35 und TPA) costimulierend, jedoch miteinander oder mit IL-1 oder IL-2 nicht costimulierend wirkten. Weiters war die Wirkung von anti-Bp50 G28-5 nicht abhängig von seinem Fc-Bereich, da F(ab')2-Fragmente von G28-5 funktionell aktiv waren. Das legt nahe, daß lösliches anti-Bp50 ebenso wie löslicher BCGF zur Ausübung seiner Wirkung keine Fc-Rezeptor-tragenden zusätzlichen Zellen braucht. Weiters sind sowohl anti-Bp50 als auch BCGF nur in Gegenwart eines Aktivierungsstimulans wirksam. Mit anderen Worten anti-Bp50 und BCGF sind keine "Kompetenz"-Faktoren, sondern begünstigen eher die "Progression" der B-Zellen durch den Zellzyklus.

Obwohl es möglich ist, daß Bp50 als Rezeptor für einen Ligand, wie einen B-Zell-Wachstumsfaktor, wirken kann, deuten verschiedene Resultate darauf hin, daß Bp50 nicht der Rezeptor zumindest für den in dieser Untersuchung verwendeten BCGF(niedrig) ist: er wird an Blut-B-Zellen exprimiert, während dies für BCGF(niedrig) offenbar nicht der Fall ist. Mögliche Strukturen für den BCGF(niedrig)Rezeptor werden im Gegensatz zu Bp50 auch nur an aktivierten B-Zellen exprimiert. Weiters unterscheiden sich sowohl normale als auch maligne B-Zell-Populationen in ihrer Reaktionsfähigkeit gegenüber anti-Bp50 im Verhältnis zu BCGF(niedrig) (Tabelle 5 und Fig. 10). Beispielsweise proliferieren manche B-Lymphome als Reaktion auf BCGF(niedrig), jedoch nicht als Reaktion auf anti-Bp50. Schließlich regten in einer Reihe von Versuchen die optimalen Konzentrationen von anti-Bp50 und BCGF gemeinsam die Proliferation stärker an als jeder allein. Anti-Bp50 imitiert die Wirkung von anderen BCGF, wie BCGF(hoch), die costimulierend mit anti-lgM wirken (Ambrus, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:1319; Ambrus, et al., 1985, J. Clin. Invest. 75:732) Dadurch kann man annehmen, daß Bp50 als Rezeptor für BCGF(hoch) wirken kann.

Obwohl Bp50 ein Rezeptor für einen löslichen Liganden sein kann, kann andererseits Bp50 auch als Rezeptor für ein Zell-Zell-mediiertes Signal dienen, das die BCGF-Rezeptor-Niveaus und/oder die Autocrin-produktion regelt. Die vorangehende Zugabe von Differentiationsantigenen, die als Vervielfältiger eines Autocrin-Rezeptor-Weges dienen, stammt aus Studien mit I-Zellen. Mab für das bekannt Lp220 Leukozytenantigen verstärkt die Proliferation durch Anhebung der IL-2-Rezeptor-Expression an aktivierten T-Zellen (Ledbetter et al., 1985, J.lmmunol. 135:1819). Ein analoger Mechanismus kann beim Arbeiten mit anti-Bp50 und der Expression bestimmter BCGF-Rezeptoren auftreten. Bp50 und BCGF(niedrig) stehen offenbar unter einer koordinierten Kontrolle, da BCGF ebenso wie IL-1 und IL-2 die Expression von Bp50 an bestimmten 17

Claims (10)

1. AT 398 437 B leukämischen Zellen verstärkt. Das Bp50 Molekül hat auch Ähnlichkeiten mit dem Tp44 Molekül, das zur Beeinflussung der Ι-2-Produktion dient. Es wurde von verschiedenen Seiten gezeigt, daß der 9.3 anti-Tp44-Antikörper die Proliferation von durch anti-CD3 oder TPA aktivierten T-Zellen verstärkt (Ledbetter, et al., 1985, J.lmmunol. 135:2331; Hara, et al., 1985, J.Exp.Med. 161:1513). In ähnlicher Weise verstärkt anti-Bp50 die Proliferation von durch anti-Bp35 oder TPA aktivierten B-Zellen. Das Tp44-Signal wirkt durch Stimulierung der IL-2-Produktion eher als durch Stimulierung des T-Zellenwachstums. Das Bp50-Signal kann voraussichtlich in analoger Weise durch Stimulierung der B-Zellen-Autocrin-Produktion wirken (Gordon et al., 1984, Nature, Lond. 310:145). Andere Verwendungsmöglichkeiten der Liganden und von Bp50 Zusätzlich zu den therapeutischen Verwendungsmöglichkeiten der Liganden und von Bp50 selbst finden diese noch weitere Anwendungsmöglichkeiten sowohl in vitro als auch in vivo bei diagnostischen Assays, in Auftrennungsschemata und dergl.. Der Bp5Q Rezeptor kann zur Herstellung und/oder Planung der neuen Liganden eingesetzt werden. Bp50 kann auch mit den neuen Liganden in vitro in Assays eingesetzt werden, die einen Standard zur Quantifizierung der in einer Probe festgestellten Menge an Bp50 brauchen. Schließlich kann Bp50 selbst als löslicher Faktor der Immunität, der z.B. ein Lymphokin mediiert, nützlich sein. Zusätzlich zur therapeutischen Behandlung und den diagnostischen Assays können die erfindungsgemäß hergestellten Liganden zur Identifizierung oder Trennung von Zellen verwendet werden, die das Bp50 Antigen exprimieren. Außerdem kann der Ligand, wenn an ihn eine geeignete radioaktive Markierung oder eine radiopake Verbindung gebunden ist, zur in vivo-Abbildung von das Bp50-Antigen exprimierenden Tumoren verwendet werden. Andere Verwendungszwecke sind aus der vorhergehenden Beschreibung für jeden Fachmann zu entnehmen. Hinterlegung von Zell-Linien Das folgende Hybridom wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD hinterlegt und hat die angegebene Hinterlegungsnummer: Hybridom ATCC Hinterlegungsnummer G28-5 HB9110 Die vorliegende Erfindung ist nicht beschränkt auf das hinterlegte Hybridom, da die hinterlegte Ausführungsform nur als einzige Erläuterung eines Aspekts der Erfindung gedacht ist.Mutanten, Rekombinanten oder dürch gentechnische Maßnahmen erhaltene Derivate der genannten Zell-Linie sind ebenfalls für das erfindungsgemäße Verfahren verwendbar. Patentansprüche 1. Verfahren zur Gewinnung eines neuen, im wesentlichen reinen Liganden, der sich (a) an Bp50, ein 50 Kilodalton B-Zellen-Oberflächenantigen, bindet und (b) durch die Bindung an eine aktivierte B-Zelle dieselbe zur Durchschreitung des Zeilzyklus anregt, sodaß die Proliferation der B-Zellen verstärkt wird, dadurch gekennzeichnet, daß entweder aus einem Hybridom, das aus der Reaktion auf die Immunisierung durch das B-Zellen-Oberflächenantigen Bp50 stammt, welches Oberflächenantigen durch den von der Hybridom-Zellinie mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB9110 oder einer Mutanten, Rekombinanten oder einem durch gentechnische Maßnahmen erhaltenen Derivat derselben produzierten monoklonalen Antikörper G28-5 definiert ist, oder aus natürlichen Quellen, wie Blutzellen, Serum oder anderen Körperflüssigkeiten, -abscheidungen oder -ausscheidungen, der Ligand in Form eines Antikörpers, monoklonalen Antikörpers, insbesondere des monoklonalen Antikörpers G28-5, oder eines Fv-, Fab-, F(ab' )2- oder Fab'-Teiles desselben, gegebenenfalls in Kombination mit einem Lymphokin, isoliert wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Ligand gewonnen wird, bei dem sich das Lymphokin an der Oberfläche einer Zelle befindet. 18 AT 398 437 B
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Ligand gewonnen wird, der einen B-Zellen-Wachstumsfaktor enthält.
4. 4. Verfahren zur Verstärkung der Proliferation von B-Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß aktivierte B- 5 Zellen mit einer wirksamen Dosis eines Liganden behandelt werden, der nach einem der Ansprüche 1 bis 3 hergestellt wurde.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die B-Zellen durch Behandlung mit einer wirksamen Dosis eines zweiten Liganden aktiviert werden, der sich an Bp35, ein 35 Kilodalton B-Zellen- io Oberflächenantigen, bindet, sodaß die B-Zellen vom Go- in den Gi-Zustand des Zellzyklus fortschreiten.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß es in vitro vorgenommen wird.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Ligand ein Antikörpermoieküi enthält, das sich an Bp35 bindet.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der sich an Bp35 bindende Antikörper einen monoklonalen Antikörper umfaßt. 20
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die aktivierten B-Zellen innerhalb von 12 Stunden nach der Aktivierung mit dem sich an Bp35 bindenden Liganden mit dem sich an Bp50 bindenden Liganden behandelt werden. 25 Hiezu
10. 10 Blatt Zeichnungen 40 45 50 19 55