NL8701371A - Liganden en werkwijzen voor het versterken van b-celuitbreiding. - Google Patents

Liganden en werkwijzen voor het versterken van b-celuitbreiding. Download PDF

Info

Publication number
NL8701371A
NL8701371A NL8701371A NL8701371A NL8701371A NL 8701371 A NL8701371 A NL 8701371A NL 8701371 A NL8701371 A NL 8701371A NL 8701371 A NL8701371 A NL 8701371A NL 8701371 A NL8701371 A NL 8701371A
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
ligand
cell
cells
fab
monoclonal antibody
Prior art date
Application number
NL8701371A
Other languages
English (en)
Other versions
NL195022C (nl
Original Assignee
Oncogen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oncogen filed Critical Oncogen
Publication of NL8701371A publication Critical patent/NL8701371A/nl
Application granted granted Critical
Publication of NL195022C publication Critical patent/NL195022C/nl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

* ' * VO 9180
Liganden en werkwijzen voor het versterken van B-celuitbreiding.
Inhoudsopgave.
Blz.
1. Inleiding ................................................. 2 2. Achtergrond van de uitvinding . —......................... 2 3. Samenvatting van de uitvinding ............................ 4 3.1. Definities.................................. 8 5 4. Figuurbeschrijving .................................. 8 5. Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding ............. 11 5.1. Methoden gebruikt voor karakterisering van de
Bp5Q receptor................... 14 5.2. Karakterisering van de Bp50 receptor............... 17 10 5.2.1. Identificatie van een B-cel
Specifieke 50 kDa celoppervlaktemerker
Bp50...................................... 17 5.2.2. Expressie van Bp50 is beperkt tot B-cellen. 19 5.3. Versterking van B-celuitbreiding met 15 Anti-Bp50 antilichamen............................. 20 5.3.1. Anti-Bp50 mAh versterkt uitbreiding alleen nadat B-cellen zijn geactiveerd door anti-Bp35 of anti-u antilichamen .......... 21 5.3.2. Anti-Bp50 mAb geven geen activering van 20 B-cellen uit GQ maar induceren wel geactiveerde B-cellen tot verder doorlopen van de celcyclus .................. 22 5.3.3. Optimale condities voor versterking van B-celuitbreiding met anti-Bp50 antilichamen 23
25 5.3.4. Verschillen tussen anti-Bp50 en BCGF
(laag) activiteit ........................ 26 5.4. Toepassing van anti-Bp50 liganden en Bp5Q -------.... 29 5.4.1. Bp50 receptor en toepassing van liganden zoals anti-3p50 voor versterking van 30 B-celuitbreiding.......................... 29 5.4.2. Gemodificeerde liganden, gebruikt voor
Immunosuppresie of behandeling van maligniteiten .....................'........ 34 5.4.3. Andere toepassingen van liganden en Bp50 .. 37 35 6. Depots van cellijnen...................................... 37
t' '3 ' ·« * - ~T
>. : ? V» ƒ » -2- 1. Inleiding
De onderhavige uitvinding is gericht op liganden, zoals anti-lichaammoleculen of fragmenten van antilichaammoleculen of andere liganden zoals lymfokines die binden aan een 50kBa B-celoppervlaktemerker, 5 verder aangeduid als Bp50, die in B-celuitbreiding een rol vervult maar niet in vroege B-celactivering. De onderhavige uitvinding is ook gericht op het Bp50 B-celantigeen zelf. In een bijzondere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding, wordt een monoklonaal antilichaam G28-5 beschreven dat Bp50 definieert en een rol blijkt te spelen in de uitbrei-10 ding van geactiveerde B-cellen maar geen detecteerbaar effect heeft op de uitbreiding van rustende B-cellen.
De liganden zoals antilichamen, lymfokines en fragmenten daarvan volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden gebruikt voor het richten ên reguleren van humane B-celuitbreiding en/of differentiatie.
15 Bovendien kunnen de liganden volgens de onderhavige uitvinding worden gemodificeerd door bevestiging daaraan van andere verbindingen die gebruikt kunnen worden in de behandeling en/of detectie van malignecellen die het Bp50 antigeen tot expressie brengen.
2. Achtergrond van de uitvinding 20 De activering van rustende B-cellen van naar G^ fase van de celcyclus en de daaropvolgende inductie van geactiveerde B-cellen tot uitbreiding zijn onderscheiden stappen die onderscheiden regelmechanismen vereisen. Sommige middelen, waaronder muize-B-cel stimulerende factor-pl (BSF-pl) (Rabin, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 2935-2939) 25 of lage doses van anti-immunoglobuline (anti-Ig) (DeFranco, et al., 1985, J. Immunol. 135:87-94; Wetzel, et al., 1984, J. Immunol. 133: 2327-2332; DeFranco, et al., 1982, J. Exp. Med. 155:1523-1536;
Muraguchi, et al., 1984, J. Immunol. 132:176-180), zijn "activatie" of "competentie" factoren. Dit betekent dat ze B-cellen opwekken om groter 30 te worden, meer RNA te synthetiseren, en over te gaan in G^, maar alleen leiden ze niet tot inductie van DNA synthese in B-cellen. Andere "groei"-factoren zoals hymane B-celgroeifactor (BCGF) en interleukine-2 (IL-2) veroorzaken dat geactiveerde B-cellen de celcyclus doorlopen en overgaan in de S fase maar leiden niet tot aanzetten van rustende B-cellen 35 (Kehrl, et al., 1984, Immunol. Rev. 18:75-96; Muraguchi, et al., 1984, J. Immunol. 132:176-180; Zubler·, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1170-1183; Jung, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1597-1604.
^ *r -3-
Thans is een aantal factoren die de groei van B-cellen bevorderen, beschreven door onderzoekers van zowel muize-als humane systemen.
Deze omvatten B-celgroeifactoren (BCGF), die afgeleid zijn van verscheidene uiteenlopende bronnen waaronder T-cellijnen of hybridoma's, B-cel-5 lijnen, of dendrietcellen. Hoewel zowel interleukine-1 (11-1} als inter-leukine-2 (IL-2) hebben bewezen om de B-celgroei te versterken, zijn ze kennelijk verschillend van bepaalde BCGFs. Bijvoorbeeld geven monoklo-nale antilichamen (mAb) tegen een muize-BCGF (O'Hara, et al., 1985,
Nature (Lond.) 315:333) of humane BCGF (Ambrus, et al., 1985, J. Exp.
10 Med. 162:1319) blokkering van de BCGF activiteit maar niet van de 11-1 of 11-2 activiteit. Hoewel onderscheiden van 11-1 of 11-2, lijken de BCGFs zelf heterogeen te zijn, gebaseerd op biochemische gegevens en . activiteitsverschillen op verschillende B-celsubsets of costimulatie-tests. Bijvoorbeeld is 60-kilodalton (kDa) hoogmoleculairgewicht humaan 15 BCGF, BCGF (hoog) geïdentificeerd dat verschillend is van een 12-kDa laagmoleculairgewichtvorm, BCGF (laag) (Ambrus, et al., 1985, J. Clin. Invest. 75:732). Onlangs is het cDNA, dat codeert voor een 20-kDa muize-BCGF, dat voorlopig is aangeduid als B-celstimuleringsfactor pl (BSF-pl), gekloneerd en gesequenced (Noma et al., 1986, Nature 319:640).
20 Het reccmbinante lymfokine heeft niet alleen BCGF activiteit, maar kan ook rustende B-cellen activeren en de differentiatie van IgG^ producerende cellen opwekken; het verschil derhalve van humaan BCGF (hoog) en BCGF (laag) in zowel zijn molecuulgewicht als in zijn activiteitsbereik.
Deze activering en groeisignalen reguleren vermoedelijk cellen 25 door een interactie met specifieke B-celoppervlaktestructuren. Naast het antigeen-specifieke signaal door middel van oppervlakte Ig, zijn verscheidene andere kandidaat B-celoppervlaktepolypeptiden geïdentificeerd die op enige wijze een rol kunnen spelen in de activering of groei van B-cellen. Zo zijn bijvoorbeeld de celoppervlaktereceptoren voor 11-1 30 (Dower, et al., 1985, J. Exp. Med. 160:501) en IL-2 (Robb et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1126) gekarakteriseerd, en onlangs zijn functionele 11-2 receptoren op B-cellen geïdentificeerd (Zubler, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1170; Jung, et al., 1984, J, Exp. Med. 160:1597,
Muraguchi, et al., 1985, J. Exp. Med. 161:181). Receptors voor B-celgroei 35 en activatiefactoren moeten echter nog volledig worden gekarakteriseerd.
-4- *
Verscheidene kandidaat B-celoppervlaktepolypeptiden zijn geïdentificeerd die op enige wijze een rol kunnen spelen in de activering of groei van B-cellen. Bijvoorbeeld is door Subbarao en Mosier (Subbarao, et al., 1983, Immunol. Rev. 69:81-97) gevonden dat monoklonale antilichamen 5 (mAb) tegen het muize-B-cel antigeen Lyb2 activering van B-cellen geven, en onlangs is bewijsmateriaal verschenen dat erop wijst dat Lyb2 de receptor voor BSF-pl kan zijn (Yakura, 1985, Fed. Proc. 44:1532). Evenzo is door ons gevonden dat geschikt mAb (1F5) tegen een 35 kDa polypeptide, Bp35, humane B-cellen activeert van GQ tot G (Clark, et al., 1985, 10': Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770; Gollay, et al., J. Immunol.
135:3795-3801). Geaggregeerde C3d of antilichamen tegen de 140 kDa C3d receptor, Bpl40, veroorzaken uitbreiding van B-cellen die T-cel afhankelijk zijn (Melchers, et al., 1985, Nature 317:264-267; Nemerow, et al., 1985, J. Immunol. 135:3068-3073; Frade, et al., 1985, Eur. J. Immunol.
15 15:73-76). Hoewel BCGFs in zowel de muis als de mens zijn geïdentificeerd, zijn de receptors voor deze factoren nog niet geïsoleerd. Door Wang en medewerkers (Wang, et al., 1979, J. Exp. Med. 149:1424-1433) is een poly-klonaal antiserum bereid dat een 54 kDa polypeptide (gp54) op humane B-cellen identificeerde en is aangetoond dat het konijne-antiserum tegen 20 gp54 tonsillaire B-cellen aanzette tot deling. Onlangs werd door Jung en Fu (Jung, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1919-1924) een mAb (AB-1) tegen een 55-kDa, tot geactiveerde B-cellen beperkt antigeen geïsoleerd dat BCGF-afhankelijke uitbreiding blokkeert. Of anti-gp54 of AB-1 al dan niet een BCGF receptor herkennen, is echter nog niet bekend.
25 3. Samenvatting van de uitvinding
De onderhavige uitvinding is gericht op liganden die (a) binden aan Bp50, een 50kDa B-cel-specifiek oppervlaktepolypeptide dat hierin is beschreven, en (b) de uitbreiding van geactiveerde B-cellen versterken. De uitvinding is ook gericht op het Bp50 antigeen zelf, dat gede-30 finieerd wordt door monoklonaal antilichaam G28-5 en in de uitbreiding van geactiveerde B-cellen een rol speelt. Bovendien is de uitvinding gericht op liganden die aan Bp50 binden, maar geen biologisch effect of functie laten zien zoals versterking van de uitbreiding van geactiveerde B-cellen.
- _ - - ., . t -5- > r.
De liganden volgens de onderhavige uitvinding omvatten anti-lichaammoleculen, monoklonale antilichaaxnmoleculen en fragmenten van deze antilichaammcleculen die de met het antigeen combinerende plaats bevatten/ of chemisch gemodificeerde antilichamen en fragmenten; dergelijke 5 fragmenten omvatten, zonder daartoe beperkt te zijn, Fv, Fab, F(ab')2,
Fab1 en dergelijke. Bovendien omvatten de liganden volgens de onderhavige uitvinding lymfokines, die, zonder daartoe beperkt te zijn, humane B-celgroeifactoren evenals chemisch gemodificeerde lymfokines kunnen omvatten. De liganden volgens de onderhavige uitvinding kunnen chemisch 10 worden gemodificeerd, bijvoorbeeld door een verbinding aan het ligand te binden of koppelen. Dergelijke verbindingen omvatten, zonder daartoe beperkt te zijn, cytotoxische middelen, therapeutische middelen, cherno-therapeutische middelen, labels zoals radiolabels, kleurstoffen, enzymen, radicöpake verbindingen, en dergelijke. De liganden volgens de onderis havige uitvinding kunnen in hun gemodificeerde of ongemodificeerde vorm worden gebruikt voor het richten, reguleren en modificeren van humane 3-celuitbreiding en/of differentiatie.
De onderhavige uitvinding is gebaseerd op de vondst dat twee humane B-celdifferentiatieantigenen, Bp35 en het hierin beschreven B-cel-20 antigeen, Bp50, kennelijk onderscheiden functies hebben als signaal- receptors in B-celactivering. Monoklonale antilichamen (mAb) tegen Bp35 en Pb50 geven allebei positieve signalen aan B-cellen die hun doorlopen van de celcyclus stimuleren. Monoklonale antilichamen tegen 3p35, evenals anti-Ig antilichamen, functioneren in principe door activering van 25 rustende B-cellen tot competentie voor het betreden van de fase van de celcyclus. Daarentegen functioneert een hierin beschreven monoklonaal antilichaam of zijn F(ab')2 fragment tegen Bp5Q, een 50 kDa polypeptide dat op alle B-cellen tot expressie komt, door stimulering van geactiveerde B-cellen tot doorlopen van de cellcyclus en versterkt het de uit-30 breiding van geactiveerde B-cellen. Monoklonale antilichamen tegen
Bp35, evenals anti-Ig antilichamen, activeren tonsillaire B-cellen en wekken lage niveaus van B-celuitbreiding op. Daarentegen leidt anti-Bp50 monoklonaal antilichaam alleen noch tot activering van B-cellen, noch tot het opwekken van uitbreiding van B-cellen, maar samen met anti-35 Bp35 of anti-Ig antilichamen, versterkt het B-celuitbreiding. In dit opzicht lijkt de werking van anti-Bp50 antilichaam op de activiteit van f ' * .:* * -6- B-celgroeifactoren (BCGF). Slechts een geringe hoeveelheid van 0,05 ug/ml van anti-Bp50 is nodig om uitbreiding te versterken en evenals BCGF is anti-Bp50 zelfs effectief wanneer het 12-24 uur nadat B-cellen zijn geactiveerd met anti-Ig of anti-Bp35 is toegevoegd. Zonder bijkomende 5 exogene signalen, wekken anti-Bp35 en anti-Bp50 antilichamen samen een sterke uitbreiding van gezuiverde rustende B-cellen op. Deze resultaten wijzen in de richting dat de Bp35 en Bp50 oppervlaktemoleculen een rol spelen in de regulering van B-celactivering en voortgang door de cel-cyclus. Vanwege de betekenis die anti-Bp35 en soortgelijke moleculen 10' hebben op het effect en de werking van de liganden volgens de onderhavige uitvinding, dient de publikatie van Clark et al., 1985, Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA) 82:1766-1770 hier door verwijzing opgenomen te worden geacht.
Hoewel de activiteit van anti-Bp50 lijkt op die van BCGF (laag) 15 omdat zowel anti-Bp50 als BCGF (laag) met dezelfde middelen maar 'niet met elkaar costimulerend werken en zowel anti-Bp50 als BCGF (laag) alleen invloed uitoefenen op geactiveerde B-cellen en in een oplosbare vorm werken, kan de activiteit van anti-Bp50 worden onderscheiden van de activiteit van BCGF (laag), doordat de uitbreiding van B-cellen die met op-20 timale hoeveelheden van anti-Bp50 en anti-Bp35 (of anti-Ig) is gestimuleerd, verder kan worden versterkt met BCGF (laag) en zowel B-cellen in het bloed als bepaalde B-cellymfoma's op een verschillende wijze reageren op anti-Bp50 versus BCGF. Voor optimale activiteit dient anti-Bp50 binnen 12 uur na B-celactivering te worden toegevoegd, terwijl BCGF (laag) 25 een. optimale activiteit behoudt, zelfs wanneer het 24 uur na activering wordt toegevoegd. Bovendien wordt Bp50 op alle B-cellen tot expressie gebracht, terwijl receptors of BCGF (laag) beperkt zijn tot geactiveerde B-cellen. Derhalve kunnen anti-Bp50 en BCGF (laag) op gecoördineerde wijze B-celgroei reguleren, maar kennelijk doen ze dat via onderscheiden 30 signalen.
In één uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding, kunnen de liganden die aan Bp50 binden en de uitbreiding van geactiveerde B-cellen versterken, worden gebruikt voor het vergroten van een immuunrespons. Bijvoorbeeld kunnen deze liganden die Bp50 binden worden gebruikt als 35 "adjuvans" om een immuunrespons op een vaccin te vergroten. Anderzijds kunnen deze liganden worden gebruikt om de immuunrespons van een in een toestand van immunosuppressie verkerend individu te vergroten.
-.- V $ '·} Λ . 4 ' Γ.
-7- Ιη een andere uitvoeringsvorm kunnen de liganden volgens de uitvinding chemische worden gemodificeerd op een zodanige wijze dat.de cellen waaraan de liganden binden, worden gedood- Omdat alle B-cellen hef Bp50 antigeen tot expressie brengen, zou deze benadering resulteren 5 in een suppressie van de immuunrespons. Bijvoorbeeld kan een aan een ligand volgens de onderhavige uitvinding gebonden cytotoxisch geneesmiddel worden gebruikt in vivo om immunosuppressie te veroorzaken teneinde grenzen van histccompatibiliteit in transplantatiepatiënten te overschrijden? anderzijds kunnen deze gemodificeerde liganden worden gê-10 bruikt voor het beheersen van autoimmuunziekten.
In een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding, kunnen maligniteiten zoals tumorcellen die Bp50 tot expressie brengen, worden behandeld onder toepassing van een ligand volgens de uitvinding, gekoppeld aan een chemotherapeutisch middel dat bruikbaar is voor de 15 behandeling van dergelijke neoplastische ziekten. Deze gemodificeerde liganden kunnen in vivo worden gebruikt om het chemotherapeutische middel te sturen naar elk type malignecel die het Bp50 antigeen tot expressie brengt, met inbegrip van cellen die geen B-cellen zijn maar wel Bp50 tot expressie brengen. Wanneer de liganden volgens de uitvinding worden 20 gebruikt die B-celuitbreiding versterken, zou een bijzonder voordeel worden bereikt wanneer B-celmaligniteiten worden behandeld waarbij het chemotherapeutische middel dat aan het ligand is gebonden een stof omvat die effectiever is in het doden van zich uitbreidende cellen; in dit geval zou een versterking van de geneesmiddelwerking worden verkregen.
25 Anderzijds kunnen de liganden volgens de uitvinding in vitro worden gebruikt voor het identificeren of scheiden van cellen die het Bp50 antigeen tot expressie brengen en/of voor het onderzoeken van lichaamsvloeistoffen op de aanwezigheid van het Bp50 antigeen dat al dan niet afgeworpen kan zijn. Bovendien kunnen de liganden volgens de uit-30 vinding in vivo worden gebruikt voor het verkrijgen van een beeld "imaging" van cellen of tumoren die het Bp50 antigeen tot expressie brengen.
Het gezuiverde Bp50 antigeen volgens de onderhavige uitvinding kan worden toegepast voor het bereiden van antilichamen en voor het be-35 reiden of ontwerpen van andere liganden volgens de uitvinding. Bovendien zou het Bp50 antigeen kunnen worden toegepast in tests zoals diagnostische * c -8- immunoassays. Bovendien kan Bp50 zelf worden gebruikt als een middel voor het bevorderen van celimmuniteit in vivo of in vitro.
3,1« Definities
Zoals hierin gebruikt zullen de volgende afkortingen de aange-5 geven betekenissen hebben: AO = acridine oranje BCGF = B-celgroeifactor
BCGF (hoog) = een 60 kDa humaan BCGF
BCGF (laag) = een 12 kDa humaan BCGF
10 Bp35 = een 35 kDa B-cel- specifiek oppervlakte- polypeptide (CD20) gedefinieerd door mAb 1F5 Bp50 = een 50 kDa B-cel~specifiek oppervlakte polypeptide gedefinieerd door mAb G28-5 Fv = het variabele gebied of de antigeen-combinerende 15 plaats van een antilichaammolecuul. Dit kan elk fragment zijn dat het idiotype van het mol‘ecuul bevat, waaronder (zonder beperking daartoe)
Fab, F(ab') , Fab', en dergelijke IF = immunofluorescentie t 20 Ig = immunoglobuline IL-1 - interleukine 1 IL-2 = interleukine 2 kDa = kilodalton mAb = monoklonaal antilichaam 25- SDS-PAGE = natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese TPA = 12-0-tetradecanoylforbol-13-acetaat 4. Figuurbeschrijving
Fig. 1. Expressie van Bp50 is beperkt tot Bp35± B-cellen. Een 30 twee-kleuren stroom cytometrische analyse van 50.000 cellen werd uitgevoerd op de wijze als beschreven door Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770. De gegevens zijn uitgezet als aantal cellen versus de logaritme van groene fluorescentie en de logaritme van rode fluorescentie waarbij 4-5 stippen ongeveer een verdubbeling van -9- * fluorescentie vertegenwoordigen. De gegevens worden verstrekt om auto-fluorescente negatieve cellen te tonen. PE (rood) -anti-Bp35 (1F5) versus FITC (groen) -anti-Bp5Q (G28-5) kleuring toont dat alle Bp50+ cellen ook Bp35+ zijn.
5 Fig. 2. Biochemische vergelijking van Bp50 polypeptide met andere 3-celoppervlakteantigenen. Immunoprecipitatie van Bp50 van aan het opper-125 vlak met I-gelabelde tonsillaire cellen werd uitgevoerd op de beschreven wijze. Geïsoleerde antigenen werden elektroforetisch behandeld op 10% SDS polyacrylamide slab-gels zonder reductie. De gels werden zicht-10 baar gemaakt met autoradicgrafie en versterkingsschermen.
Paneel Aï laan 1, anti-Bp50 (G28-5); laan 2, anti-Bp95 (G28-8); laan 3, sefarose-geit anti-muis Ig alleen.
Belichtingstijd: 4 dagen. Paneel B: laan 1, anti-Bp50 (G28-5); laan 2, anti-Bp45 (3LAST-2); laan 3, anti-Bp39 (G28-1); laan 4, anti-Bp39 15 (41-H16); laan 5, sefarose-geit anti-muis Ig alleen.
Een belichtingstijd van 2 dagen werd gekozen zodat de banden in -de lanen 2-4 niet overbelicht werden en met betrekking tot Bp50 duidelijk konden worden onderscheiden. Eén van drie experimenten.
Fig. 3. Twee-kleuren immunofluorescentie-analyse van Bp50 expres-20 sie. Periferaal bloed of tonsillaire mononucleaire cellen werden door centrifugering op Ficoll geïsoleerd en gekleurd met PE (rood)-geconjugeerd G28-5 (anti-3p50) in combinatie met fluoresceïne (groen)-geconjugeerde referentie-antilichamen, omvattende 2C3 (anti-IgM); 1F5 (anti-Bp35); HBlOa (anti-DR); en 9.6 (anti-CD2), E receptor). Cellen werden ge-25 analyseerd met een FACS IV, uitgerust met vier decade logversterkers in zowel rode als groene dimensies. Voorwaartse en onder een rechte hoek lichtverstrooiing werd gebruikt om monocyten uit te sluiten. Ongekleurde cellen bevinden zich aan de achterkant van het rooster; rode fluorescentie aan de rechter zijde en groene fluorescentie aan de linker zijde.
30 Fig. 4. Dosisresponskrommen voor versterking van uitbreiding van dichte tonsillaire Er- B-cellen door anti-Bp50 antilichamen zoals aangegeven: Media alleen; anti-Bp50 alleen; anti-Bp35 (5 ug/ml) alleen; BCGF alleen; anti-Bp35 plus BCGF; anti-Bp35 plus getrapte doses van anti-Bp50. Gemiddelde uitbreiding ± standaardfout van monsters in viervoud 35 werd gemeten op dag 3.
-10- *
Fig. 5. Anti-Bp50 mAh zijn zeer effectief in versterking van uitbreiding indien toegevoegd na een B-celactiveringssignaal. Dichte tonsillaire Er- B-cellen werden gedurende 4 dagen gelncubeerd met media alleen, anti-Bp50 (0,5 ug/ml) toegevoegd op verschillende tijdstippen 5 na incubatie, anti-Bp35 (5 ug/ml) toegevoegd op verschillende tijdstippen na incubatie; anti-Bp50 constant gehouden waaraan later op verschillende tijdstippen anti-Bp35 werd toegevoegd; anti-Bp35 constant gehouden waaraan anti-Bp50 werd toegevoegd aan culturen op verschillende tijd- 3 stippen. Gedurende de laatste 10 uur werd H-thymidine toegevoegd en 10. zijn opname gemeten.
Fig. 6. Vergelijking van het vermogen van anti-Bp35 en anti-Bp50 om rustende tonsillaire B-cellen aan te zetten tot verlaten van het Gq stadium van de celcyclus. Dag 3 na behandeling media alleen (-), anti-Bp35 alleen (-----); en Ig alleen (.....), A, geen extra toevoegin- 15 gen; B, anti-Bp50 (0,5 ug/ml) toegevoegd aan elke groep; C, 5% BCGF toegevoegd aan elke groep. De gegevens zijn uitgezet als relatief aantal cellen versus de logaritme van AO rode fluorescentie (RNA).
Fig. 7. Kinetiek van B-celuitbreiding na stimulering met anti-Bp50 versus BCGF. Dichte tonsillaire E- B-cellen werden gestimuleerd 20 met media alleen; 10% BCGF alleen? anti-Bp35 alleen? anti-Bp50 alleen? anti-Bp35 + 10% BCGF? anti-Bp35 + anti-Bp50? en anti-Bp35 + anti-Bp50 + 10% BCGF. Uitbreiding werd gemeten op de aangegeven dagen door een 3 stoot gedurende 18 uur H-thymidine. Uitbreiding werd gemeten m viervoud en standaardfouten zijn aangegeven. Eén van drie experimenten.
25 Fig. 8. Tijden na stimulering met anti-Bp35 waarop anti-Bp50 (A) of BCGF (B) de uitbreiding optimaal versterken. Dichte tonsillaire E-B-cellen werden op de getoonde wijze gestimuleerd en de uitbreiding werd 3 gemeten door een stoot gedurende 18 uur van H-thymidine op dag 3.
Media? anti-Bp35 alleen toegevoegd op de aangegeven tijdstippen; anti-30 Bp50 of BCGF alleen; anti-Bp35 toegevoegd bij het begin van de kweek gevolgd door toevoeging van anti-Bp50 of BCGF op de aangegeven tijdstippen? anti-Bp50 of BCGF toegevoegd bij het begin van de kweek gevolgd door anti-Bp35. Eén van twee experimenten. De uitbreiding werd gemeten in viervoud en standaardfouten zijn aangegeven. De gebruikte doses: 35 anti-Bp35, 5 ug/ml; anti-Bp50, 0,2 ug/ml? BCGF (laag) 5%. De gebruikte concentraties waren als volgt: anti-Bp35, 5 ug/ml; anti-Bp50, 0,2 ug/ml; BCGF, 5%.
* , ’ '*·ν |Λ» ,,/ ; s ♦ 7 -.J ·: „ ƒ ^ -11-
Fig- 9. Anti-Bp50 en BCGF hebben additieve effecten op de B-cel-uitbreiding. Dichte tonsillaire E- B-cellen werden gestimuleerd met getrapte doses van BCGF (laag) samen met anti-Bp50 alleen; anti-Bp35 alleen? anti-Ig-korrels alleen; anti-3p35 + anti-Bp50; of anti-Bp50 + 5 anti-Ig. De uitbreiding werd gemeten op dag 3 na stimulering met een 3 stoot gedurende 18 uur van H-thymidine. De uitbreiding werd gemeten in viervoud en standaardfouten zijn aangegeven. Eén van vier experi- 6 menten. De gebruikte doses voor 10 cellen: anti-Bp35, 5 ug/ml? anti-3p50, 0,2 ug/ml; anti-Ig-korrels, 50 ug/ml.
10 Fig. 10. Vergelijkende effecten van anti-Bp50 en BCGF op normale en maligne B-cellen. Periferale bloed E- B-cellen (A) of dichte tonsillaire E- B-cellen (C) werden gestimuleerd met of zonder TPA (75 ng/ml) in tegenwoordigheid van 10% BCGF of 1.ug/ml anti-Bp50. Twee aparte 3-cellymfoma1s (panelen B en D) werden op dezelfde wijze gestimuleerd.
3 15 De uitbreiding werd gemeten op dag 3 door opname van H-thymidine gedurende een stoot van 12 uur. De uitbreiding werd gemeten in viervoud en standaardfouten zijn aangegeven.
B
5. Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding De onderhavige uitvinding is gericht op liganden die (a) binden 20 aan Bp50, een 50 kDA B-cel-specifiek oppervlaktepolypeptide, en (b) de uitbreiding van geactiveerde B-cellen versterken. De uitvinding is ook gericht op het Bp50 ahtigeen zelf, dat gedefinieerd wordt door mAb G28-5 en in B-celuitbreiding een rol speelt. Bovendien is de uitvinding gericht op liganden die binden aan Bp50 maar geen biologisch effect of 25 functie vertonen zoals versterking van uitbreiding van geactiveerde B-cellen.
De liganden volgens de onderhavige uitvinding omvatten antilichaam-moleculen, monoklonale antilichaammoleculen en fragmenten van deze anti-lichaammoleculen die 'de antigeen-combinerende plaats bevatten die aan de 30 Bp5Q receptor binden met inbegrip van chemisch gemodificeerde antilicha-men en fragmenten; dergelijke fragmenten omvatten, zonder daartoe beperkt te zijn, Fv, Fab, F(ab')Fab' en dergelijke. Bovendien omvatten de : liganden volgens de onderhavige uitvinding lymfokines, die aan de Bp50 receptor binden. Deze kunnen, zonder daartoe beperkt te zijn, 35 BCGFs omvatten evenals chemisch gemodificeerde lymfokines en dergelijke.
-12-
De liganden volgens de uitvinding kunnen worden gebruikt in hun gemodificeerde of ongemodificeerde vormen voor het moduleren en reguleren van immuunreacties en. in de therapie van maligniteiten die het Bp50 antigeen tot expressie brengen. Deze toepassingen worden in groter detail bespro-5 ken in hoofdstuk 5.4.
Wanneer het ligand een monoklonaal antilichaam of een fragment daarvan is, kan het monoklonale antilichaam tegen Bp50 worden bereid volgens elke techniek die leidt tot de produktie van antilichaammole-culen door een cultuur van continue cellijnen. Bijvoorbeeld behoren de 10 hybr.idomatechniek die oorspronkelijk ontwikkeld is door Kohier en
Milstein (1975, Nature 256:495-497) evenals andere technieken die meer recent beschikbaar zijn gekomen zoals de humane B-celhybridomatechniek (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) en de EBV-hybridomatechniek voor het bereiden van humane monoklonale antilichamen (Cole et al., 1985, 15 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pag. 77-96) en dergelijke tot de omvang van de onderhavige uitvinding.
Antilichaamfragmenten die het idiotype van het molecuul bevatten, kunnen volgens bekende technieken worden gegenereerd. Bijvoorbeeld omvatten dergelijke fragmenten, zonder daartoe beperkt te zijn: het 20 F(ah')2 fragment dat gegenereerd kan worden door het antilichaammolecuul te behandelen met pepsine; de Fab' fragmenten die gegenereerd kunnen worden door de disulfidebruggen van het F(ab')2 fragment te reduceren; het F(ab')2 fragment dat gegenereerd kan worden door het antilichaammolecuul te behandelen met papaïne; en de 2Fab of Fab fragmenten die gegenereerd 25 kunnen worden door het antilichaammolecuul te behandelen met papaïne en een reductiemiddel om de disulfidebruggen te reduceren.
Wanneer het ligand dat Bp50 bindt een lymfokine is, kan het lymfo-kine worden verkregen uit natuurlijke bronnen of, wanneer zijn aminozuur-sequentie bekend of afgeleid is, kan het lymfokine via chemische synthe-30 tische methoden worden bereid. Anderzijds kunnen, wanneer de gensequentie van het lymfokine bekend is, recombinant DNA technieken worden gebruikt om het gen te kloneren in een expressievector die voor transcriptie en translatie van de gensequentie in een geschikte gastheercel zorgt.
Afhankelijk van het beoogde gebruik, kunnen het ligand of geschikte 35 fragmenten van het ligand chemisch worden gemodificeerd door bevestiging aan het ligand van één van verscheidene verbindingen waarbij op zichzelf ·. i ♦ Λ fj -13- •r * bekende koppelingstechnieken worden gebruikt. Dergelijke technieken kunnen/ zonder daartoe beperkt te zijn, het gebruik omvatten van carbodi-imide, cyanogeenbromide, bifunctionele reagentia zoals glutaaraldehyde, N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionaat (SPDP), Schiff basereacties, 5 bevestiging aan sulfhydrylgroepen, het gebruik van natriumisothiocyanaat, of enzymatische aanhechting, om slechts een paar mogelijkheden te noemen. Wanneer een radioisotoop aan het ligand moet worden gebonden, kan dit eveneens worden uitgevoerd via enzymatische middelen, oxydatieve substitutie, chelaatvorming enz. Voor een overzicht van de chemische reagentia 10 die voor modificatie van eiwitten kunnen worden gebruikt, wordt verwezen naar Lundblad en Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification,
Volume II, CSC press, Inc., Boca Raton, Florida, hoofdstuk 5, pag. 123-139, 1984.
De chemische binding of koppeling van een verbinding aan het li-15 gand zou kunnen worden gestuurd naar een plaats op het ligand dat geen deel heeft aan de binding aan Bp50. Dit zou kunnen worden gereduceerd door de bindingsplaats van het ligand te beschermen voordat de koppe-lingsreactie' wordt uitgevoerd. Het ligand kan bijvoorbeeld eerst aan Bp50 worden gebonden om de 3p50 bindingsplaats te beschermen, waarna 20 de koppelingsreactie kan worden uitgevoerd om de gewenste verbinding te verbinden aan beschikbare reactieve plaatsen op het Iigand-Bp50 complex. Wanneer de koppelingsreactie eenmaal voltooid is, kan het complex worden verbroken onder vorming van een gemodificeerd ligand waaraan de gewenste verbinding is gebonden zodat de Bp50 bindingsplaats van het molecuul 25 zo weinig mogelijk is beïnvloed. Wanneer het ligand een monoklonaal antilichaam zoals G28-5 omvat, waarin het Fc domein van het molecuul niet vereist is voor het ligand om zijn effect uit te oefenen (zie hoofdstuk 5.3.3.) kan het voordelig zijn om de koppeling van gewenste verbindingen te sturen naar het Fc domein van het molecuul.
30 De onderstaande subsecties beschrijven de nieuwe, 50-kDa B-cel-
oppervlaktemerker, Bp50, die kennelijk in B-celuitbreiding een rol speelt evenals liganden die aan de nieuwe 50-kDa receptor binden, en hun toe-. passingen. Als een voorbeeld van de liganden volgens de onderhavige uitvinding worden ook een monoklonaal antilichaam dat Bp5Q definieert 35 alsmede zijn F (ab1) 2 fragmenten beschreven die evenals BCGF B-celuitbreiding versterken. Anders dan anti-Bp35 mAb, dat rustende B-cellen in GQ
,Ji * -14- kan opwekken tot overgang naar G^ geeft anti-Bp50 mAb geen activering ' van rustende B-cellen. Anti-Bp35 en anti-Bp50 mAb samen, zonder enige additionele exogene signalen, induceren een sterke activering en uitbreiding van gezuiverde B-cellen.
5 De onderstaand beschreven experimenten laten ook zien dat anti-
Bp50 activiteit lijkt op BCGF activiteit maar dat anti-Bp50 verschilt van één BCGF omdat anti-Bp50 en laagmoleculair gewicht BCGF duidelijk additief zijn en verschillend werken op verscheidene B-celsubsets of maligniteiten. BpSO kan een receptor zijn voor een onderscheiden BCGF 1D' of voor een transmembraansignaal dat BCGF produktie of BCGF receptor-express ie moduleert.
5.1. Methoden, gebruikt voor karakterisering van de Bp50 receptor Celpreparaten. Mononucleaire cellen werden geïsoleerd van normaal of leukemisch, geheparaniseerd periferaal bloed door Ficoll-Hypaque 15 gradiënten (Pharmacia, Piscataway, NJ). Mononucleaire cellen werden verkregen van tonsillaire weefsels zoals beschreven door (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770). Een verarming aan T-cellen werd gerealiseerd met AET-behandelde schapeërythrocytrozetvorming en Ficoll-Hypaque gradiëntscheiding. In sommige experimenten werd een ver-20 rijking aan bloed B-cellen gerealiseerd door aan nylonwol hechtende cellen te isoleren. Monocyten werden verwijderd door incubatie op kunststof petrischalen, één of twee keer gedurende 45 minuten bij 37°C, tenzij anders is aangegeven. Opdrijvende of dichte tonsillaire B-cel fracties werden geïsoleerd door Percoll stapgradiënten zoals beschreven door 25 (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770). Dichte tonsillaire B-celpreparaten bevatten consistent meer dan 95% slg+
Bp35+ cellen. Preparaten die verrijkt waren aan B-cellen van het bloed bevatten 60-85% slg+ cellen. B-cellymfomacellen werden geïsoleerd door voorzichtig lymfomacellen in het medium te pesten gevolgd door Ficoll-30 Hypaque gradiëntcentrifugatie.
Monoklonale antilichamen. Het G28-5 antilichaam tegen Bp50 werd verkregen door BALB/c muizen te immuniseren met humane E- tonsillaire lymfocyten en immuunmiitcellen te fuseren met het NS-1 myeloma (Kohier, et al., 1975, Nature 256:495-497; Ledbetter, et al., 1979, Immunol.
35 Rev. 47:63-82). Hybridecelculturen die antilichaam uitscheiden dat reac- = · . *ij -·- Λ -15- tief is ten opzichte van tonsillaire B-cellen en niet ten opzichte van T-cellen werden geïdentificeerd met behulp van indirekte immunofluores-centie (I?) en analyse met een FACS IV celsorteerder? culturen met anti-lichaam dat soortgelijke histogrampatronen geeft als bekende mAb tegen 5 pan 3-celmerkers (b.v. Bp35) werd gekloneerd en voor verder onderzoek geselecteerd. De G28-5 kloon produceerde een IgG^ mAb dat alleen met normale of maligne B-cellen of B-cellijnen reageerde. Andere mAb, die in dit onderzoek werden gebruikt, zijn in detail beschreven (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770? Clark, et al., 19S6, Human 10 Immunol. 16:100? Ledbetter, et al., 1986, Human Immunol. 15:30-44; Ledbetter, et al., 1985, in Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, pag. 325-340). Deze omvatten 1F5 (IgG ) anti-Bp35, HBlOa (IgG ), anti-HLA-DR, 2C3 (IgG.) anti-u keten,
Zd Zd X
G19-4 (IgG ) anti-CD3, FC-2 (IgG. ) anti-Fc receptor CD16, en 9.6 (IgG ) X £ci 15 anti-CD2 (E receptor) geleverd door Dr. Paul Martin (Martin, et al., 1983, J. Immunol. 131:180). De IgG^ mAbs werden gezuiverd door precipi-tatie gebruikmakend van 45% of 50% verzadigd ammoniumsulfaat en DEAE Sephacryl kolomchromatografie, en de IgG mAbs werden gezuiverd met be- 4» 3.
hulp van proteïne A Sepharose kolommen. De F(ab*)^ fragmenten van G28-5 20 werden bereid met de methode van Parham (Parham, et al., 1983, J. Immunol. 131:2895), gezuiverd op een 2-meter lange Sephacryl S200-kolom, en getest op zuiverheid door SDS-PAGE (Ledbetter, et al., 1985, J. Immunol. 135: 1819). Het 2C3 mAb tegen u-ketens werd geconjugeerd aan Sepharose 4B-korrels (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) waarbij cyanogeen-25 bromidekoppeling werd gebruikt.
Fluorescelne en fycoërythrineconjugaties. Gezuiverde mAb werden hetzij direkt geconjugeerd met fluorescelne gebruikmakend van fluores-celne-isothiocyanaat (FITC; Molecular Probes) (groen) volgende methode van Goding (Goding, et al., 1976, J. Immunol. Meth. 13:215-226), hetzij 30 geconjugeerd aan R-phycoërythrine (PE) (rood) met behulp van SPDP
(Pharmacia) met een methode welke gedetailleerd door ons is beschreven in Ledbetter, et al., 1985, in Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, 119-129. Lymfoldecellen werden geincubeerd in rond-bodem microtiterplaten gedurende 30 minuten met een 35 geschikte verdunning van groen en/of rood mAb, tweemaal gewassen, en daarna geanalyseerd op een FACS IV celsorteerder.
X * -16-
Twee-kleuren immunofluorescentie. Twee-kleuren onderzoeken werden uitgevoerd met een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder (FACS IV: Becton-Dickinson, Mountain View, CA) waarbij gebruik werd gemaakt van een 560-nm dichrolsche spiegel om de bundel te splitsen en een 580 lang-5 doorlaatfilter en 540 kort-doorlaatfilter (Ditric Opties, Hudson, MA) opgsteld voor respectievelijk de rode en de groene fotomultiplicator-buizen. Bovendien werd een twee-kleuren compensator (T. Nozaki, Stanford University) gebruikt om te corrigeren voor ondergeschikt overlopen van groene en rode signalen. Voor elke twee-kleuren kleuring, werden gege-10 vens van. 40.00 cellen verzameld en opgeslagen op floppy disks. Gegevens worden weergegeven als aantal cellen (verticaal) versus de logaritme van de groene fluorescentie versus de logaritme van de rode fluorescentie op een 64 x 64 stippenrooster. Ongeveer 4.5 stippen vertegenwoordigen een verdubbeling van de fluorescentie. Ongekleurde cellen bevinden zich aan 15 de achterste hoek van het rooster; rode fluorescentie is aan de rechter kant en groene fluorescentie aan de linker kant. Ons stroomcytometrie-systeem voor twee-kleuren IF met fluorescelne en fycoërythrine is in groter detail beschreven door (Ledbetter, et al., 1985, in Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, 119-129 en 20 325-340).
Celcultuur. Bloed of tonsillaire lymfoïdecellen werden gekweekt bij 5-10 x 105 ml in viervoud in microtiterplaten met 96 putjes, bevattend 200 ul KPMI-1640 medium aangevuld met 15% feutaal runderserum, antibiotica, glutamine, en pyruvaat (R15). Na 1-7 dager werd aan de cel-25 len een stoot van H-thymidine toegediend van 0.5 uCi/putje (New England Nuclear, 6.7 Ci/mmol; 1 Ci=37) gedurende 18 uur. De cellen werden daarna geoogst op glas-vezelfliters met een celoogster, en de radioactiviteit werd gemeten in een scintillatieteller. In sommige experimenten werden antilichamen of factoren op verschillende tijdstippen na het begin van 30 de kweek toegévoegd; uitbreiding in deze experimenten werd gemeten op dag 3.
Costimulerende factoren. Gezuiverd BCGF werd gekocht bij Cytokine Technology (Buffalo, New York) en bevatte geen detecteerbare IL-1, 11-2 of interferonactiviteit. Dit BCGF werd bereid met de methode 35 volgens Maizel en medewerkers (Maizel, et al., 1982, Proc. Nat. Acad.
Sci. USA 79:5998), die hebben aangetoond dat de belangrijkste BCGF acti-
τ·* X
-17- viteit in dit materiaal schuilt in een 12-kDa species dat verder wordt aangeduid als nBCGF (laag)" (Mehta, et al., 1985, J. Immunol. 135:3298).
De zuiveringsstappen omvatten preparatieve schaal DEAE affiniteitschro-matografie gevolgd door hydroxylapatietkolomchromatografie. IL-1 gezui- 5. verd tct homogeniteit was een genereuze gift van Dr. Steven Dower (Dower, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:501). De Cetus Corporation was zo vriendelijk om recombinant IL-2 te leveren. TPA (12-0-tetradeconoyl-forbol 13-acetaat) werd gekocht bij Sigma.
Detectie van celactivering. Veranderingen in celvolume, cpge-10 roepen door mAb en/of factoren, werden gemeten met een celsorteerder en een voorwaartse hoeklichtverstrooier. Celcyclusveranderingen in cellulaire RNA en DNA niveaus werden gemeten door geactiveerde cellen te kleuren met acridine oranje en het relatieve cellulaire RNA (rood) en DNA (groen) gehalte te meten met een celsorteerder volgens de methode 15 van Darzynkiewicz et al. (Darzynkiewicz, et al., 1980, Proc. Nat. Acad.
Sci. USA 77:6697-6702). Veranderingen in relatieve gehaltes van cel-oppervlakte-antigenen werden gevolgd door gebruik te maken van mAb, direkt geconjugeerd met fluoresceine, en daarna kwantitatief bepaald door direkte IP fluorescentieniveaus met een Epics V celsorteerder.
20 Biochemische karakterisering van Bp50. Immunoprecipitatie van 125
Bp50 van aan het oppervlak met I-gelabelde tonsillaire cellen werd uitgevoerd op de beschreven wijze (Ledbetter, et al., 1985, J. Immunol. 134:4250-4254). Geïsoleerde antigenen werden aan elektroforese onderworpen op 10% SDS polyacrylamide slabgels zonder reductie. De gels 25 werden zichtbaar gemaakt met behulp van autoradiografie bij -70°C en Cronex belichting plus versterkingsschermen (Dupont).
5.2. Karakterisering van de Bp50 receptor De onderstaande subsecties beschrijven de resultaten van de experimenten die met de bovenstaand beschreven methoden werden uitgevoerd.
30 5.2.1. Identificatie van een B-cel-specifieke _50 kDa celoppervlaktemerker, Bp50_
Een mAb tegen Bp50 werd opgewekt door BALB/c muizen te immuniseren met humane tonsillaire lymfocyten en immuunmiltcellen te fuseren met de NS-1 myeloma. Eén kloon, G28-5, produceerde een IgG^ mAb dat niet de 35 NS-1 lichte keten bevatte. Na onderzoek met IF analyse, bleek G28-5
#*- *·· 'V
' l ’ > ; _* *· -18- alleen te reageren met normale of maligne B-cellen of B-cellijnen. Een uitgebreid onderzoek van normale weefsels volgens bekende methoden (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770; Ledbetter et al,, 1986, Human Immunol. 15:30-44; Ledbetter, 1985, in Perspectives 5 in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, pag. 325-340) openbaarde dat het G28-5 antilichaam reageert met E rozet-negatieve (Er-) cellen uit bloed of tonsillen maar niet met niet aan nylonwol hechtende T-cellen, PHA-geïnduceerde T-celblasts, of met bloedgranulo-cyten, monocyten, rode cellen, of plaatjes. Het reageerde sterk met 10. alle. zeven geteste B lymfoblastoïdecellijnen en met drie Burkitt's lymfomalijnen (Raji, Daudi, Namalwa), maar niet vier T-cellijnen (CEM, HSB-2, JURKAT, en HPB-ALL). Alle geteste chronische lymfocytische leukemieën (3/3) en 90% (9/10) van geteste B lymfoma's brachten de Bp50 merker tot expressie terwijl slechts 28% (2/7) van non T, non B CALLA+ 15 acute lymfocytische leukemieên Bp50 tot expressie brachten.
De beperkte distributie van Bp50 op normale weefsels werd verder bevestigd door kwantitatieve twee-kleuren immunofluorescentie (twee-kleuren IF) analyses.
Onder toepassing van een R-fycoërythrine (PE)-geconjugeerd anti-20 lichaam (rood) tegen het pan B-celantigeen Bp35 (Bl, CD20) en fluores-ceïne-geconjugeerd anti-Bp50 antilichaam (groen), vonden wij dat Bp50 slechts tot expressie werd gebracht op Bp35+ B-cellen (fig. 1) in bloed of tonsillen. B-cellen van bloed brachten consistent iets lagere niveaus van Bp50 tot expressie dan tonsillaire B-cellen; dit vertoont overeen-25 stemming met HLA-DR expressie, (Ledbetter, et al., 1986, Human Immunol. 15-30-44) en met gp54 expressie (Wang, et al., 1979, J. Exp. Med. 149:1424-1433) die eveneens lager zijn aan bloed B-cellen. Bp50 werd in overeenkomstige niveaus tot expressie gebracht op tonsillaire B-cel-subpopulaties die gescheiden waren op Percoll gradiënten tot opdrijvende 30 en dichte fracties. Gebruikmakend van ons PE-geconjugeerd mAb tegen de T-celmerker, CD3(T3), en NK cel-gebonden merker, CD16(Fc receptor) (Ledbetter, et al., 1979, Immunol. Rev. 47:63-82), vonden wij dat Bp50 niet tot expressie kwam op T-cellen of NK cellen. Gebruikmakend van twee-kleuren IF, vonden wij ook dat CD3+ PHA blasts die hoge niveaus 35 van IL-2 receptoren tot expressie brachten, Bp50 niet tot expressie brachten.
jW1 -Λϊ .i # ^ i1 f ‘ ' ·1 -19-
Eet G28-5 antilichaam reageerde met één enkel polypeptide op tonsillaire lymf ocyten, dat bij ongeveer 50 Kd migreerde onder niet-reducerende omstandigheden (Fig. 2A). Dit molecuul is groter dan eerder beschreven B-celmerkers in hetzelfde molecuulgewichtsfcereik zoals Bp39 5 of Bp45 (Zipf, et al., 1983, J. Immunol. 131:3064-3072; Kitner, et al., 1981, Nature 294, 458-460; Clark, et al., 1986, in Leukocyte Typing II, eds. Reinherz, et al... Springer Verlag, Berlijn, hoofdstuk 12 Vol. 2, 155-167; Slovin, et al., 1982, Proc. Nat- Acad. Sci. üSA 79:2649-2653; Thorley-Lawson, et al., 1985, J. Immunol. 134:3007-3012 en Fig. 2B).
10 De belichtingstijd werd voor deze gel zo gekozen dat de molecuulgewich-ten van de andere B-celmerkers gemakkelijk kon vergeleken met Bp50.
De Bp39 merker, wordt in tegenstelling tot Bp5Q tot expressie gebracht op granulocyten en Bp45 is in tegenstelling tot Bp50 beperkt tot B-cel-blasts. Antilichamen tegen Bp39 (41-H16) en Bp45 (MNM6, Blast-1, Blast-2) 15 die ter beschikking waren gekomen via een internationale workshop (Clark, et al., 1986, in Leukocyte Typing II, eds. Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlijn, hoofdstuk 12 Vol. 2, 155-167) gaven geen blokkering van de binding van gefluorescelneerde anti-3p50 antilichamen tegen B-cellen. Gebaseerd op weefselverdeling, biochemische analyse, 20 en blokkeringsonderzoeken, herkent derhalve het G28-5 monoklonaal antilichaam een 50-Kd structuur die verschilt van andere bekende B-cel anti-genen.
5.2.2. Expressie van Bp50 is beperkt tot B-cellen Zowel verdelingsonderzoeken aan hematopoietisch weefsel en cel-25 lijnen als gedetailleerde twee-kleuren stroomcytometrische analyses openbaarden dat Bp50 alleen op B lymfocyten tot expressie komt. Zoals weergegeven in fig. 3, komt Bp50 tot expressie op een kleine subset van bloedlymfocyten en op een grote populatie van tonsillaire lymfocyten. Nagenoeg alle Bp5Q+ cellen in zowel bloed als tonsillen brachten ook 30 3p35 en HLA-DR tot expressie, maar brachten niet het CD2 (fig. 1) of CD3, T-celmoleculen of de IgG Fc receptoren die op NK cellen worden aangetroffen, tot expressie. Verder vertoonden ConA-geactiveerde CD3+ T-celblasts IL-2 receptoren tot expressie, maar brachten geen Bp50 tot expressie.
35 Twee-kleuren stroomcytometrische analyses maken een kwantitatieve meting mogelijk van het dichtheidsverband tussen twee oppervlakte- 1 · . > « 1 ** ‘ v ft *~ -20- antigenen. Eerder is door ons aangetoond dat de dichte, rustende B-cellen in de mantelzone van secundaire follikels IgM en geringe niveaus van Bp35 tot expressie brengen, terwijl de opdrijvende, geactiveerde B-cellen in het germinale centrum IgM-negatief zijn en verhoogde niveaus van 5 Bp35 tot expressie brengen (Ledbetter, et al., Human Immunol. 15:30).
Fig. 3 laat zien dat zowel IgM-positieve als IgM-negatieve B-celsubsets Bp50 in gelijke hoeveelheden tot expressie brachten, hetgeen erop wijst dat Bp50 zowel op rustende B-cellen als op B-cellen die in vivo geactiveerd zijn tot expressie komt.
10 5.3, Versterking van B-celuitbreiding _met anti-Bp50 antilichaam_
Zoals eerder uitgelegd kunnen B-cellen worden geactiveerd met lage doses van anti-u keten-specieke antilichamen. Onlangs werd door ons gevonden dat de B-cel-specifieke merker Bp35 (Bl), een 35-kDa polypep-15 tide, eveneens in vroege B-celactivering een rol kan spelen: het 1F5 m£b tegen Bp35 activeert evenals lage doses van anti-u antilichaam, B-cellen "tot een vergroting van celvolume en RNA gehalte en tot respon-siviteit op BCGF (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 1766-1770; Gollay, et al., 1985, J. Immunol. 135:3795-3801). Het was 20 daarom interessant om het effect van anti-Bp50 mAb in de uitbreiding van onbehandelde B-cellen of B-cellen, geactiveerd met hetzij anti-Bp35 hetzij anti-u antilichamen te vergelijken (tabel A). Anti-Bp35 in oplossing of aan Sepharose-korrels gebonden anti-u antilichamen konden onder gepaste omstandigheden alleen enige B-celuitbreiding stimuleren (tabel A 25.' regel 1); daarentegen stimuleerden anti-Bp50 antilichamen alleen geen uitbreiding (tabel A, regel 2). Anti-Bp50 mAb versterkte echter de uitbreiding aanzienlijk bij kweken met anti-u korrels of met anti-Bp35.
In dit opzichte leek. anti-Bp50 op BCGF (tabel A, regel 3). Het was derhalve belangrijk om te bepalen of anti-Bp50 en BCGF samen B-celuitbrei-30 ding konden opwekken. Zoals geïllustreerd in tabel A, regel 4, werd door anti-Bp50 en BCGF samen geen uitbreiding opgewekt, maar werd uitbreiding van hetzij anti-u hetzij anti-Bp35 geactiveerde cellen iets meer versterkt dan door elk stimuleringsmiddel alleen. BCGF had over een drie-logbereik, indien toegepast met anti-Bp50 zonder andere signalen, geen 35 effect op de uitbreiding van dichte B-cellen, zelfs niet wanneer anti-Bp50 werd gebruikt in doses variërend van 0,1 tot 10 ug/ml.
.. i . j --vs -4 " ‘ ''> * f • W 5 * Δ * » -21-
TABEL A
Versterking van anti-Ig of anti-Bp35 geïnduceerde B-celuitbreiding met anti-Bp50 antilichamen
Gemiddelde uitbreiding ± S.E. van B-cellen, gekweekt met: 5 regel Co-stimulans_media_anti-u-korrels_anti-Bp35 1 geen 1.2121547 10.219±462 5.539+308 2 anti-Bp50 719±718 38.792+1.329 25.465+616 3 BCGF 456±217 14.217±445 9.443+343 4 1.456Ü26 54.393+2.537 46.488+3.387
10 + BCGF
•4-
Uitbreiding van dichte Er- tonsillaire B-cellen (95% oppervlak IgM cellen) werd op de beschreven wijze op dag 3 gemeten. In het kort werden 2 x IQ5 cellen/200 ul putje gekweekt in viervoud gedurende 48 uur met RPMI 1640 medium dat 15% feutaal runderserum plus additieven bevatte 15 zonder antilichaam of met hetzij 2C3 monaklonaal antilichaam tegen u-ketens gekoppeld aan sefarosekorrels ("anti-u korrels", 50 ug/ml) het-• zij vrij 1F5 anti-Bp35 antilichaam (5 ug/ml). Cultures die media, "anti-u korrels", of anti-Bp35 bevatten, werden alleen of mat BCGF (5% eindConcentratie, Cytokine Technology, Buffalo, New York; zonder detec-20 teerbare IL-1 of IL-2 activiteit), met anti-BpSO (1:1000 verdunning van ascites) als co-stimuleringsmiddelen gekweekt. Na 40 uur werd aan de 3 cellen een stoot H-thymidine gegeven, en opgenomen aantallen werden na 18 uur gemeten.
5.3.1. Anti-Bp5Q mAb versterkt uitbreiding alleen 25 nadat B-cellen zijn geactiveerd door _anti-Bp35 of anti-u antilichamen_
De resultaten in tabel A wijzen erop dat anti-Bp50 mAb op zichzelf niet in staat zouden zijn om uitbreiding te induceren. Zoals getoond in fig. 4 hadden doses van anti-3p50 variërend van 0,05 ug tot 2,0 ug/ml 3 30 geen effect op de opname van H-thymidine. In tegenwoordigheid van optimale niveaus van anti-Bp35 mAb echter versterkten geringe hoeveelheden anti-Bp50 antilichamen van slechts 0,1 tot 0,5 ug/ml de uitbreiding aanzienlijk. Grote hoeveelheden van wel 50.000 tot 70.000 cpm waren detecteerbaar bij het optimale tijdstip van uitbreiding wanneer sterk gezui-35 verde B-cellen alleen met anti-Bp35 plus anti-Bp50 werden gekweekt.
v ·* -22-
Ccnsistent werd waargenomen dat hogere doses van anti-Bp50 (groter dan 2-5 ug/ml) minder effektief waren dan doses in het gebied van 100-200 ng.
Deze resultaten wezen erop dat anti-Bp50 alleen kunnen functioneren nadat B-cellen door andere signalen zijn geactiveerd. De in fig. 5 5 getoonde gegevens wijzen erop dat dit inderdaad het geval is. Wanneer B-cellen eerst geactiveerd werden met anti-Bp35, kon anti-Bp50 zo laat als 24-48 uur later worden toegevoegd en toch uitbreiding op dag 4 versterken. Daarentegen was anti-Bp35, in het geval dat de cellen eerst met anti-Bp50 werden behandeld, alleen effectief wanneer het binnen een 10; paar uur. na het begin van de kweek werd toegevoegd. Soortgelijke resultaten werden gevonden wanneer anti-u in plaats van anti-Bp35 werd gebruikt.
5.3.2. Anti-Bp50 mAb geven geen activering van B-cellen uit maar induceren wel 15 geactiveerde B-cellen tot verder door- _lopen van de celcyclus__
Eerder werd door ons gevonden dat anti-Bp35, evenals geringe doses van anti-u antilichamen, rustende tonsillaire B-cellen in GQ tot vergroting opwekken (Clark, et al., 1986, Leukocyte Typing II, eds., 20 Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlijn, Vol. 2, 455-462} en tot over-gang naar de G^ fase van de celcyclus (Gollay, et al., 1985, J. Immunol. 135:3795-3801). Het was daarom belangwekkend om het vermogen van anti-Bp50 mAb te vergelijken met dat van anti-Bp35 mAb voor wat betreft hun effekten op de B-celactivering. Zoals getoond in fig. 6A, hadden niet 25 gestimuleerde dichte tonsillaire B-cellen zelfs na 3-4 dagen in cultuur een uniform RNA profiel dat karakteristiek is voor cellen in G^ (Darzynkiewicz, 1980, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77:6697-6702). Ongeveer 15-30% van met anti-Bp35 of anti-u gestimuleerde cellen had echter een verhoogd RNA gehalte dat duidt op overgang naar G^. In tegenstellen 30 daarmee induceerden noch anti-Bp50 (fig. 6B) noch BCGF (fig. 60 alleen een overgang van significante aantallen van B-cellen naar G^. Bijvoorbeeld induceerden 2 dagen na de activering anti-Bp35 en anti-Ig mAb respectievelijk 13,5% en 20,9% van tonsillaire cellen tot overgang naar G^, terwijl cellen die alleen met anti-Bp50 (2,7%) of BCGF (3,2%) waren 35 behandeld, op mediacontroleniveaus bleven (2,2%). Wanneer echter hetzij anti-Bp50 hetzij BCGF samen met anti-Bp35 of anti-u antilichamen werden C -7 n -r , v / V j J ƒ 1 1 *.
-23- toegevoegd, steeg de hoeveelheid cellen die overgingen naar G^ dramatisch. Evenzo gaven anti-Bp50 en BCGF alleen geen inductie van B-cellen tot overgang naar de S fase (tabel B), maar samen met hetzij anti-B35 hetzij anti-u leidden zij tot een twee- tot drievoudige verhoging van 5 het aantal cellen in de S fase.
TABEL B
Effekt van anti-Bp50 en BCGF op voortgang van de celcyclus in tonsülaire lymfocyten
Competentie- Progressie- GQ % Cellen S/G^/M
IQ signaal signaal G^ media geen 89,9 7,1 2,5 anti-Bp35 * 80,4 14,5 3,7 anti-Ig " 65,6 27,6 5,7 media anti-Bp50 83,6 . 12,0 3,3 15 anti-Bp35 ” 54,1 35,5 9,7 anti-Ig " 43,6 36,2 16,2 media BCGF 85,4 11,7 2,2 anti-Bp35 n 56,6 32,6 11,6 anti-Ig " 48,4 36,1 14,1 20 Percentage van cellen in G^, G^, of S en G^ bepaald met behulp van de acridine oranje-kleuringsprocedure (Darzynkiewicz, et al., 1980, Proc.
g
Nat. Acad. Sci. USA 77:6697-6702); 1 x 10 dichte tonsillaire lymfo-cyten met anti-Bp35 (5 ug/ml), anti-u op korrels (50 ug/ml), anti-Bp50 (0,4 ug/ml), BCGF (5%) of combinaties zoals getoond.
25 5.3,3. Optimale condities voor versterking van B-celuitbreiding met anti-Bp50 _antilichamen_
Antilichamen tegen Bp50 hebben op zichzelf weinig of geen detecteerbaar effekt op dichte rustende B-cellen (tabel C). In tegenwoordig-30 heid van middelen die B-cellen kunnen activeren zoals anti-Ig, anti-Bp35 en TPA, versterkte anti-Bp50 mAb echter de uitbreiding duidelijk'.
-24-
Anti-Bp50 vertoonde geen costimulatie met verscheidene interleukines, ' met inbegrip van gezuiverd IL-1, recombinant IL-2 en BCGF (laag). Een vergelijking van de effekten van anti-Bp50 met die van BCGF (laag) liet zien dat dezelfde middelen die costimulatie met anti-Bp50 gaven, ook 5 costimulatie gaven met BCGF (laag) (tabel C). Van bijzonder belang was de vondst dat BCGF en anti-Bp50 tezamen nog geen costimulatie van rustende cellen gaven.
TABEL· C
Versterking van B-celuitbreiding met anti-Bp50 10' antilichamen of B-celgroeifactor
Gemiddelde uitbreiding ± S.E. van B-cellen, gekenmerkt met:
Co-stimulans media anti-Bp50 BCGF
(200 ng/ml) (5%) 15 geen 96 ± 1 267 ± 15 285 ± 74' anti-Ig 5.833 ± 391 41.634 ± 2.103 25.094 ± 61 anti-Bp35 457+45 8.143 ± 280 1,733 ± 32 (5 ug/ml) TPA (2 ng/ml) 7.361 ± 537 21.163 ± 871 13.064 ± 1.030 20 IL-1 ( 10 U/ml) 264 ±2 308 ± 23 221 ± 8 11-2 (100 U/ml) 204 ±‘34 350 ± 7 220 ±11 BCGF (5%) 220 ±7 851 ± 28 270 ± 18
Dichte Er- tonsillaire B-cellen (meer dan 95% slgM cellen) gekweekt gedurende 48 uur bij 2 x 105 cellen/putje, gevolgd door een 24 uur 3 25 stoot van H-thymidine voordat geteld werd.
De kinetiek van de door anti~Bp50 versterkte uitbreiding is in fig. 7 getoond. De uitbreidingspiek vondplaats op dag 4 en nam daarna af ongeacht of de cellen met anti-Bp35 of andere activatoren zoals anti-Ig of TPA waren geactiveerd. De kinetiek van de door BCGF of door anti-30 Bp50 versterkte uitbreiding was hetzelfde.
Een geringe hoeveelheid anti-Bp50 antilichamen van slechts 0,05 ug versterkte de uitbreiding. Een optimale dosis van 0,3 ug/ml werd in daaropvolgende onderzoeken gebruikt. Een consistente waarneming was -·.* ' <ί ' -.v * -· ? * -25- dat wanneer hele antilichaammoleculen werden gebruikt, hogere doses van anti-PB50 (groter dan 2-5 ug/ml) minder effektief waren dan doses in het bereik van 0,1-0,5 ug/ml.
Humane B-cellen zijn fcuigengewoon gevoelig voor inhibitoire effek-5 ten die via de Fc receptoren van aan oppervlakte Ig bindende antilichamen worden uitgeoefend (Parker, 1980, Immunol. Rev. 52:115; Bijsterbosch, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:1825). Het was derhalve belangrijk om de werkzaamheid van volledig anti-Bp50 mAb te vergelijken met die van anti-3p50 F(ab'>2 fragmenten. Over een 100-voudig dosisbereik waren 10 F(ab1)2 fragmenten duidelijk even effektief als of effektiever dan volledig antilichaam voor wat betreft de versterking van B-celuitbreiding (tabel D). Derhalve is het Fc domein van anti-Bp50 mAb niet nodig voor anti-Bp50 om zijn effekt uit te oefenen en kan het hoogstens inhibitoir werken. Met andere woorden kan anti-Bp50 evenals BCGF kennelijk werken 15 als een oplosbare mediator zonder assistentie van Fc receptor-gemedi-eerde accessoire celfunctie.
TABEL D
Het Fc domein van anti-Bp50 antilichamen is niet vereist voor versterking van B-celuitbreiding 20 Gemiddelde uitbreiding van B-cellen, gekweekt met:___
Dosis
Anti-Bp50 (ug/ml) media anti-Bp35 geen - 295 ± 16 269 ± 27 25 volledig Ab 0,125 278 ±32 5.140 ± 20 1.25 275 ± 24 4.686 ± 342 12,5 163 ±15 3.852 ± 203 F(ab2)2 0,125 594 ± 21 10.635 ± 449 1.25 531 ± 3 10.893 ± 575 30 12,5 279 ± 8 9.411 ± 870
De celcultuurcondities waren zoals beschreven in tabel C.
' ·*** 2 y Λ -26- 5.3.4. Verschillen tussen anti-Bp50 _en BCGF (laag) activiteit
Anti-Bp50 en BCGF (laag) hadden een vergelijkbaar effekt op B-cellen en waren costimulatoir met dezelfde middelen (tabel C). Ver-5 schillende soorten bewijs wijzen echter in de richting dat anti-Bp50 en het in dit onderzoek gebruikte BCGF kennelijk via verschillende signalen werken. Op de eerste plaats worden Bp50 moleculen, anders dan BCGF
(laag) receptoren (Bijsterbosch, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:1825) tot expressie gebracht op rustende bloed B-cellen (fig. 3). Op de tweede 10' plaats, hoewel zowel anti-Bp50 als BCGF (laag) het meest effektief functioneren wanneer ze worden toegevoegd na anti-Bp35 of anti-Ig, was anti-Bp50 duidelijk het effektiefst wanneer het 12 uur na het begin van de ksreek werd toegevoegd'(fig. 8A). Daarentegen kon BCGF (laag) zelfs 24 uur na de start van de cultures worden toegevoegd en toch een optimale verster-15 king van de uitbreiding geven (fig. 8B). Deze kinetiekexperimenten, die de benadering van Howard en Paul (1983, Ann. Rev. Immunol. 1:307), als model gebruikten, wijzen erop dat een Bp50-afhankelijk signaal normaal zijn effekt kan uitoefenen voor BCGF.
Zowel anti-Bp50 als BCGF (laag) versterkte uitbreiding van B-20 cellen die geactiveerd waren met anti-Bp35 of anti-Ig (tabel C). Het effekt van anti-Bp50 en BCGF (laag) was echter in veel experimenten additief (fig. 7). Fig. 9 toont een titratie van BCGF (laag) in een experiment waarin anti-Bp50 werd gebruikt in zijn optimale concentratie (0,2 ug/ml). BCGF (laag) kon verder de uitbreiding van rustende B-cellen 25: versterken in tegenwoordigheid van anti-Bp50 na activering met anti-Ig of met anti-Bp35. Optimale concentraties van BCGF (laag) waren 5-10%, terwijl 25% inhibitoir was. Wanneer derhalve anti-Bp50 en BCGF (laag) allebij in hun optimale concentraties werden toegepast, vertoonden ze nog steeds additieve effekten op de B-celuitbreiding.
30 Tenslotte verschilden zowel normale als maligne B-celsubsets in hun reacties op anti-Bp50 en op BCGF (laag). Bijvoorbeeld reageerden sommige bloed B-cellen op BCGF (laag) maar niet op anti-Bp50 (tabel E).
Een extra activeringssignaal zoals anti-Bp35 (tabel E) of TPA (fig. 10) was consistent nodig om mogelijk te maken dat bloed B-cellen reageerden 35 op anti-Bp50, Terwijl dichte tonsillaire B-cellen in het algemeen niet reageerden op BCGF of anti-Bp50, reageerden opdrijvende B-cellen wel - ct
ƒ 'J i O / I
-27- y » (tabel E). B-celmaligniteiten verschilden ook in hun respons op anti-Bp50 versus BCGF. Bijvoorbeeld reageerden sommige B-cellymfoma's op TPA plus BCGF (laag), maar niet op TPA plus G28-5 anti-BpSO (fig. 10B en D). Daarentegen reageerden dichte tonsillaire B-cellen en periferale bloed 5 B-cellen op TPA plus hetzij BCGF (laag) hetzij anti-Pb50 (fig. 10A en C).
’·»'?·» ·. , t i
A
-28- Ό VO 3 3 CN Γ~ O CO PO H d
a) h in cn η σι —t I
> td ο I
•n +1 +1 +1 +1 +1 +1 T3 A 3 3
•H (U ϋ Ο H
M t'- η po σι ro σι o tn S
'O CO m ^ CN N1 01 a Ή d) a ro ^ in a co co ,30330 0 · . · . · JJ Λ Ή Ό a a a Ν’ CN +1 01 cd cd 3 3 ¢)-)-1 a d <u A ω ’d h > H 3 S ·Η ·η H 3 3 3 ω ·Η H cd Ai Ο 3 3 .. οι m > M o 'd jj s ro a <D Ê-1 O,
•H O PO 3 O > O
3 £-1 co co o · σι ¢) +1 'd'rOCOOOHH +) +1 C O' +4
3 A >1 Λ ¢) 3 O
0) O +1 +1 +1 +1+1+1 ü O -P -H
jj *H O O +1 - a cd m (N· cn in σι cn +4 s u o +>
rjn CO O t' H (D <J S O a O
no co co Ν’ Ν' m ro >i s +4 3 a cqiu . . . h ai ε e h
£ CNVOH O >1 ‘3 O
a >1 to m H +j a n rJ ^2 <υ i co —' 0 H 'g -d w λ e? - £ c o) φ S § $ 2 « « -y
Pi ^ j-t M Ci Λ ff vo^· inrow "dOCü
1 Λ ro OP'COr-lrOH M cd a cd -H
a . HHCNHPO H ΪΦΛΓΰΤ) +i2 · ” O1 3 . a +i +i +i +i +i +i fi j +! id m x ai <u 'd o . H vOr'H ldr-fO H-rlidS+l a w o vf m co ίο vf o +) 3 o _ o σι ro a m 10 σι 3 cd o its 3 υ +| . · 3 Λ !5 CD 0) οι vj> ro a in co 0 3 +4 4-1 A Η H ü ro cd 3 0 Dl ^ S n '2 as s ·Η · o -η m -H a O T3 ïï ra 3 3 * > 3 H ft -3 5 o W u ¢) ro rij O *· O' o 3 3 cn Φ 3 3
Mpn POO vo · K O H
CQ r* +1 CN PO · a CTi Ν’ << 3 HH
C -η T3 a pn co co in 0*30
Fh 3 3 o · γ-I +J —. Λ ü -i-j O a +1 +1 +1 +1 +1 1 dl CN Cl 3 0) HO? -Q O 01 01
3 ό W η σι Ν' ro m Ν' cd o · +4 A
(UH w σι a n· r* +13040 H o 13 in O ΙΟ PN _ Q * +i g H T3 ... Ö g W öï (y .,-j frt Γ- H (N *ri *P > 3 .η η η £ G ω Λ OS G <Ö <U G & 01 § g ό g ^ urn > H Ai d S <u *ΰ Λ > u ε · a o CN A 3 a O Λ οι co o cd x jj o 01 Μ Μ M +1 01 HO-COO 0)01^-30 οι η-Ηηισι Λ>^38 ”§ a +1 +1 +1 +1 I 1 01 3 C H 'd
01 i—1 0) O M
r-1 (jar'cn^'d' 3τ3>αιοι m CN a H in O +1 01 T3 0) 0 ιησιηιη noj+icc
1 . 3 cd ai O
ffl PO 3 tö Μ ·Η Η Φ — H 3 +> μ oi a 'd o <-»
fö <D CU 3 CN
3 +i &i Cn M po — m ^3+4^ H po 0! O -H <0 <11 g —» a cuoM-naoi \Hffl ·Η3ω+1 +1
Dl ε I +) O H cd 3 <D
3\-na -Hgdxidoi D1+1C5 <d ε3Τ!Χ1 in 3 3 Ο 3W-HOM3 - cdcq 03+JCdioi 0 m ϋ h 01 a 3 -^++ Ai a -—·
¢) .0 !-l 3 H
01 οιηοο.<υ3τ30<υ 3 tnroinin 3<u O+icu td aac^a ai ri υ ώ >ι ·η
η mcnram HH3 O +J
3 1111 CD ¢) Cd 3 o o g fi h -ri ·4 ·Η ·Η υ Ο 3 ¢1 a Cd •H (DU +) +)+1+1 1 O +1 ε Μ +) 003333 d) ff) O >1 >i a
Ui O! ffl nj <Ö cd' <0 _ Q w O <—) ' .
?; I '< / 1 + f -vi j ~-J& ( ·+ t Λ -29- 5.4. Toepassingen vaa anti-Bp50 liganden en Bp50 De liganden volgens de onderhavige uitvinding kunnen in vivo of in vitro in hun ongemodificeerde of gemodificeerde vorm worden gebruikt voor het moduleren van de immuunrespons. De liganden zelf kunnen 5 bijvoorbeeld worden gebruikt als "adjuvans" voor het vergroten van een immuunrespons op een vaccin of voor het vergroten van de immuunrespons van een individu dat in een toestand van immunosuppressie verkeert.
Ook kunnen wanneer cytotoxinen of anti-uitbreidingsmiddelen aan de liganden gekoppeld zijn, deze gemodificeerde liganden worden gebruikt 10 voor het verlagen een immuunrespons, bijvoorbeeld in auto-immuunziekten of in transplantatiepatiënten om afstoting van het geënte materiaal te vermijden. Deze gemodificeerde liganden zouden ook kunnen worden gebruikt voor het behandelen van maligniteiten die cellen of tumoren omvatten welke het 3p50 antigeen tot expressie brengen, ongeacht of de maligni-15 text oorspronkelijk een B-cel is.
Zowel de liganden volgens de onderhavige uitvinding en/of Bp5Q zelf kunnen in vitro worden gebruikt. Dergelijke toepassingen omvatten in vitro assays, zoals immunoassays voor de bepaling van cellen die het Bp50 antigeen tot expressie brengen en/of voor de detectie van eventueel 20 afgeworpen Bp5Q in lichaamsvloeistoffen. In dit geval zou het ligand of Bp50 gelabeld kunnen worden met een radiolabel, fluor, enzym, enzym-substraat, kleurstof, enz. Bovendien kunnen de liganden worden gebruikt voor het scheiden en/of identificeren van cellen die het 3p50 antigeen tot expressie brengen, in welk geval het ligand gekoppeld kan zijn aan 25 een onbeweeglijke drager, of aan eèn fluor dat gebruikt kan worden in een FACS (fluorescentie-geactiveerde celsorteerder).
De verschillende toepassingen en gebruiken van de liganden en Bp50 volgens de onderhavige uitvinding worden onderstaand in groter detail besproken.
30 5.4.1. Bp50 receptor en toepassingen van liganden zoals anti-Bp50 voor _versterking van B-celuitbreiding
Voorgaande onderzoeken wezen in de richting dat de bij de inductie van.B-cellen van GQ naar de fase van de celcyclus betrokken fac-35 toren verschillen van de factoren of vereisten voor overgang in de S fase.
. , i -30-
Dit model is in essentie gebaseerd op onderzoeken waarmee werd aangetoond dat middelen zoals lage doses van anti-Ig B-celactiveringsfactoren of anti-Bp35 alleen weinig of geen effekt op B-celuitbreiding hebben.
Toch kunnen deze zelfde middelen B-cellen brengen tot een punt in de 5 celactivering waar ze gevoelig zijn voor groeifactoren. In tegenstelling daarmee hebben groeifactoren zoals BCGF of IL-2 alleen geen effekt op rustende B-cellen maar versterken de groei van geactiveerde B-cellen.
Hoewel de onderhavige uitvinding niet beperkt is tot enige theorie of verklaring, verschaffen de hierin gepresenteerde resultaten een 10 verdere steun voor een model van onderscheiden regulering van B-celacti-vering en groeistappen. Hierin is aangetoond dat activering en uitbrei-dingssignalen in humane B-cellen kunnen worden doorgegeven via onderscheiden celoppervlaktestructuren. Hoewel anti-Bp35 mAb B-cellen activeerde tot het overgaan naar de fase van de celcyclus induceerde het 15 alleen weinig of geen uitbreiding. Anti-Bp50 mAb had het tegengestelde effekt. Het kon B-cellen niet activeren, maar indien het zelfs pas 12-24 uur na de activering werd toegevoegd, kon het B-celgroei induceren.
Het Bp50 molecuul zou waarschijnlijk normaal kunnen functioneren als hetzij een receptor voor een ligand zoals een oplosbare groeifactor 20 hetzij voor een via cel-celcontact tot stand gebracht signaal (d.w.z.
een op het oppervlak van een andere cel aangetroffen ligand). Voorgaande onderzoeken hebben verschillende T-cel-afgeleide BCGFs geïdentificeerd die evenals anti-BP50 de uitbreiding van B-cellen versterken. Zowel hoge als lage molecuulgewichtsvormen van B-celgroeifactoren zijn geïdentificeerd 25 en voor verschillende typen is aangetoond dat ze additieve effekten hebben (Kehrl, et al., 1984, Immunol. Rev. 18:75-96; Kishimoto, 1985,
Ann. Rev. Immunol. 3:133-157; Swain, et al., 1983, J. Exp. Med. 158: 822-835; Howard, et al., 1984, Immunol. Rev. 78:185-210; Ambrus, et al., J. Clin. Invest. 75:732-739; Ambrus, 1985, J. Exp. Med. 162:1319-1335).
30 Bp50 zou derhalve een receptor voor één van deze factoren kunnen zijn.
Met de uitzondering van IL-2 receptoren en de C3d receptor, zijn de receptoren op B-cellen voor groeisignalen nog niet geïdentificeerd. Het mAb AB-1 reageert met een B-celmerker die alleen tot expressie komt op geactiveerde B-cellen en BCGF-afhankelijke uitbreiding blokkeert, 35.' en derhalve de BCGF receptor of een verwante structuur zou kunnen herkennen. Bp50 blijkt van de AB-1 merker te verschillen omdat het AB-1 mAb ^ i g i 3 / f ' * * -31- niet de binding van het G28-5 anti-Bp50 antilichaam blokkeert, en anders dan het G28-5 mSb alleen reageert met geactiveerde B-cellen (Jung, et al, 1984, J. Exp. Med. 160:1919-1924). Bp50 bevindt zich op alle B-cellen, hetgeen op basis van absorptie-analyse en direkte bindingstests niet 5 het geval blijkt te zijn voor BCGF receptoren. Onze huidige gegevens wijzen erop dat Bp50 en de receptor voor laagmoleculairgewicht BCGF onderscheiden structuren zijn. Gebruikmakend van een konijneheteroanti-serum, is door Wang en medewerkers (Wang, 1979, J. Exp. Med. 149:1424-1433) eerder een 54-kDa glycoproteine beschreven, gp54, dat evenals Bp50 tot expressie 10 komt op alle B-cellen maar in lagere niveaus op bloed B-cellen dan op tonsillaire B-cellen. Het is mogelijk, maar onwaarschijnlijk, dat het konijneheteroantiserum en anti-Bp50 dezelfde of verwante structuren herkennen: anders dan anti-BpSO mAb, was het konijneantiserum tegen gp54 alleen voldoende om de uitbreiding van B-cellen te stimuleren.
15 Anti-Bp35 alleen kan anders dan anti-Bp50 B-cellen activeren van
Gq naar G1 en kan derhalve worden aangeduid als een "activerings" signaal. Of Bp35 al dan niet alleen in vroege B-celactivering functioneert is nog niet duidelijk omdat anti-Bp35 antilichamen sommige B-cellen kunnen stimuleren tot deling (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci.
20 USA 82:1766-1770). Evenzo is mogelijk dat Bp50 niet uitsluitend functioneert als een "groei" signaal: anti-Bp50 antilichamen samen met active-ringssignalen (anti-Bp35 of anti-u) leidt niet alleen tot versterking van de uitbreiding maar ook tot vergroting van het totaal aantal B-cellen dat in G^ overgaat (tabel B). Met andere woorden leidt anti-3p50 als 25 costimulans tot bevordering van de progressie van zowel de activering (Gq naar G^) als de groei (G naar S) fasen van de celcyclus. Het in deze onderzoeken toegepaste BCGF had eveneens een soortgelijke activiteit (fig. 6C). Anti-Bp35 en anti-Pb50 (of BCGF) blijken derhalve zeer analoog te zijn aan de "competentie" en "progressie" factoren die in onder-30 zoeken van fibroblast groeiregulering zijn bechreven. Hoe B-cellen reageren op anti-Bp35 of anti-Bp50 kan duidelijk afhangen van hun toestand van differentiatie of activering.
Hierin hebben wij aangetoond dat twee mAb, anti-3p35 (een "competentie" signaal) en anti-Bp50 (een "progressie" signaal), samen een 35 aanzienlijke uitbreiding van sterk gezuiverde B-cellen in afwezigheid van antigeen of andere bekende factoren kunnen induceren. De natuurlijke 2 ^ » r -32- liganden voor deze structuren zijn nog niet bekend. Aangezien mAb tegen geschikte epitopen echter zowel oplosbare factoren als door cel-cel-interacties gemedieerde signalen kan imiteren, kunnen wellicht geschikte combinaties van mAb worden gebruikt om humane B-celuitbreiding of diffe-5 rentiatie te sturen en reguleren. Dit zal op zijn beurt bijdragen aan het ontwerpen van strategieën in vivo voor de beheersen van humane ziekten zoals B-celmaligniteiten, immunodeficiënties en bepaalde auto-immuun-ziekten.
Het nieuwe monoklonale antilichaam G28-5, dat reageert met een 10) enkele ketenpolypeptide van ongeveer 50 Kd dat op het oppervlak van humane B-cellen tot expressie komt, is slechts één bijzondere uitvoeringsvorm van de liganden volgens de onderhavige uitvinding die de uitbreiding van geactiveerde B-cellen kunnen versterken. Omdat humane B-celuitbreiding eveneens kan worden versterkt door T-cel-afgeleide BCGFs 15 waaronder laag- en hoogmoleculairgewicht BCGF, is door ons de activiteit van anti-Bp50 G28-5 vergeleken met die van een BCGF preparaat dat overwegend laagmoleculairgewicht BCGF bevat. Anti-Bp50 G28-5 en BCGF (laag) vertoonden grote gelijkenis doordat ze met dezelfde activeringsmiddelen costimulatie gaven (anti-Ig, anti-Bp35 en TPA), maar geen costimulatie 20 gaven met elkaar of met IL-1 of IL-2. Verder was de activiteit van anti-Bp50 G28-5 niet afhankelijk van zijn Fc domein omdat F(ab')2 fragmenten van G28-5 functioneel actief waren. Dit wijst erop dat oplosbaar anti-Bp50 evenals oplosbaar BCGF geen Fc-receptor-dragende accessoire cellen nodig heeft om een effekt uit te oefenen. Verder zijn zowel anti-Bp50 25. als. BCGF alleen effektief in tegenwoordigheid van een activeringsprikkel. Met. andere woorden zijn anti-Bp50 en BCGF geen "competentie" factoren, maar bevorderen eerder de "progressie" van B-cellen door de celcyclus.
Hoewel het mogelijk is dat Bp50 functioneert als receptor voor een ligand zoals een B-celgroeifactor, wijzen verscheidene resultaten 30 erop dat Bp50 althans niet de receptor voor het in dit onderzoek toegepaste BCGF (laag) is: het komt tot expressie op bloed B-cellen terwijl BCGF (laag) receptoren daarop kennelijk niet tot expressie komen. Kandidaatstructuren voor de PCGF (laag) receptor komen anders dan Bp50 alleen tot expressie op geactiveerde B-cellen. Verder verschillen zowel 35 normale als maligne B-celpopulaties in hun respons op anti-Bp50 versus BCGF (laag) (tabel E en fig. 10). Bijvoorbeeld vertonen sommige B lym- \ ·" :---}¾ >- -33- foma's uitbreiding in respons op BCGF (laag), maar niet in respons op anti-Bp50. Tenslotte riepen in een aantal experimenten optimale concentraties van anti-Bp50 en BCGF samen meer uitbreiding op dan elk van beide alleen. Anti-Bp50 imiteert de activiteit van ander BCGF, zoals 5 BCGF (hoog) die costimulatie geven met anti-IgM (Ambrus, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:1319? Ambrus, et al..# 1985, J. Clin. Invest. 75:732).
Dit wijst erop dat Bp50 zou kunnen functioneren als de receptor voor BCGF (hoog).
Hoewel Bp50 een receptor kan zijn voor een oplosbaar ligand, kan 10 Bp50 anderzijds functioneren als een receptor voor een cel-cel-gemedieerd signaal dat BCGF receptor-gehaltes en/of autocrine-produktie reguleert. Aanwijzingen voor het dienst doen van differentiatie-antigenen zoals versterkers van een autocrine-receptorroute komen uit onderzoeken met T cellen. Monoklonaal antilichaam tegen het Lp220 algemene leukocyt-15 antigeen versterkt de uitbreiding door verhoging van de IL-2 receptor-expressie op geactiveerd T cellen (Ledbetter, et al., 1985, J. Immunol. 135:1819). Een analoog mechanisme zou kunnen werken met anti-Bp50 en expressie van bepaalde BCGF receptoren. Bp50 en BCGF (laag) staan kennelijk onder enige gecoördineerde controle omdat BCGF, evenals IL-1 en 20 IL-2 receptoren, de expressie van Bp50 op bepaalde leukemische cellen versterkt. Het Bp50 molecuul vertoont ook overeenkomsten met het Tp44 molecuul dat een invloed uitoefent op de IL-2 produktie. Door ons en anderen is aangetoond dat het 9.3 anti-Tp44 antilichaam de uitbreiding van T cellen, geactiveerd door anti-CD3 of TPA versterkt (Ledbetter et al., 25 1985, J. Immunol. 135:2331? Hara, et al., 1985, J. Exp. Med. 161:1513).
Evenzo versterkt anti-Bp50 de uitbreiding van B-cellen, die geactiveerd zijn door anti-Bp35 of TPA. Het Tp44 signaal functioneert eerder door stimulering van de IL-2 produktie dan door stimulering van de T celgroei. Het Bp50 signaal zou verffloedelijk op een analoge wijze kunnen functione-30 ren door stimulering van B-cel autocrine produktie (Gordon, et al., 1984, Nature, Lond. 310:145).
Λ —: **·! . > t ‘C ' -34- 5.4.2. Gemodificeerde liganden, gebruikt voor immuno-_suppressie of behandeling van maligniteiten
Volgens deze uitvoeringsvorm kan het ligand volgens de onderhavige uitvinding worden gemodificeerd door de aanhechting van een anti- 5. uitbreidingsmiddel zodat het resulterende molecuul kan worden gebruikt voor het doden van cellen die het Bp50 antigeen tot expressie brengen. Dergelijke gemodificeerde liganden kunnen worden gebruikt in de behandeling van autoïmmuunziekten om de uitbreiding van B-cellen te onderdrukken en daardoor de autoimmuunrespons te onderdrukken. Deze gemodifi-10 ceerde liganden kunnen ook worden gebruikt voor immunosuppressie van een transplantatiepatiënt om afstoting van een geënt materiaal te voorkomen. Dienovereenkomstig kunnen cytotoxische middelen die gebruikt worden voor het onderdrukken van de immuunrespons, aan de liganden volgens de uitvinding worden gebonden. Wanneer liganden worden gebruikt 15 die de uitbreiding van B-cellen versterken, zou een vergroot effekt het gevolg moeten zijn omdat het geneesmiddel gestuurd zal worden naar uitbreidende B-cellen.
In een andere uitvoeringsvorm kunnen de liganden volgens de onderhavige uitvinding die gemodificeerd zijn door de aanhechting van een 20 anti-uitbreidingsmiddel worden gebruikt voor het behandelen van maligniteiten waarin tumoren of cellen het Bp50 antigeen tot expressie brengen. Bevestiging van deze chemotherapeutische middelen aan de liganden volgens de uitvinding zou moeten leiden tot een grotere specificiteit van het geneesmiddel voor de malignecellen. Bovendien zou een bijzonder voor-25 deel worden verkregen wanneer een B-celmaligniteit wordt behandeld met een ligand dat gekoppeld is aan een cytotoxine dat effektiever is in het doden van uitbreidende cellen dan niet-uitbreidende cellen; behandeling met een dergelijk ligand zou moeten leiden tot een versterking van de werking van het cytotoxine.
30 Dienovereenkomstig omvatten de chemotherapeutische middelen of anti-uitbreidingsmiddelen die aan de liganden volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden gekoppeld, zonder daartoe beperkt te zijn, de in tabel F vermelde middelen, welke tabel afgeleid is van Goodman en Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, zesde editie, 35 MacMillan Publishing Co., Inc. New York, pag. 1249-1313, 1980 die door verwijzing hierin opgenomen moet worden geacht.
**" -Λ Vf Mf ·/ >* i 1.) J .1 ï -35-
TABEL F
Chemotherapeutische middelen die gekoppeld kunnen _worden aan anti-3p5Q liganden__
Klasse Type Middel 5 alkyleringsmiddel stikstofmosterd Mechlorethamine
Cyclophosphamide Melphalan Uracil Mustard Chlorambucil 10 ethyleenimine Thiotepa derivaten alkylsulfonaten Busulfan nitrosourea's Carmustine
Lomustine 15 Semustine
Streptozocin triazenen Dacarbazine antimetabolieten folinezuur Methotrexaat analoga 20 pyrimidine Fluorouracil analoga _ , , .
Cytarabme
Azaribine purine Mercaptopurine analoga .
Thioguamne 25 natuurlijke Vinca Vinblastine produkten alkaloïden . . .
c Vxncristxne I S- -36- antibiotica Dactinomycine
Daunorubicine
Doxorubicine
Bleomycine
Mithramycine
Mitomycine enzymen L-Asparaginase diverse middelen platina Cisplatin coördinatie- complexen gesubstitueerd Hydroxyureum ureum methylhydrazine- Procarbazine derivaat adrenocorticaal Mitotane suppressant hormonen en adrenocorti- Prednisone antagonisten costeroiden progestinen Hydroxyprogesterone caproaat
Medroprogesterone acetaat
Megestrol acetaat estrogenen Diethylstilbestrol
Ethinyl estradiol antiestrogeen . Tamoxifen androgenen Testosterone propionaat
Fluoxymesterone -ΛΚ - «·«» , ·' 'V' " » ' 5- -37- radioactieve fosfor Natriumfosfaat, 32
. „ - P
isotopen jodium Natriumjodide, 131^
Elke op zichzelf bekende methode kan worden gebruikt voor het koppelen van het ligand aan het chemotherapeutische of anti-uitbreidings-5 middel. Voorbeelden van dergelijke methoden zijn bovenstaand opgesomd (zie hoofdstuk 5.).
5.4.3. Andere toepassingen van liganden en 3p50
Naast de therapeutische toepassingen hebben de liganden en Bp50 zelf andere toepassingen in zowel in vitro als in vivo diagnostische 10 assays, scheidingsschema's, enz.
De Bp50 receptor kan worden gebruikt voor het bereiden en/of ontwerpen van de liganden volgens de uitvinding. Bp50 kan ook worden gebruikt met de liganden volgens de uitvinding in in vitro assays die een standaard vereisen voor het kwantificeren van de hoeveelheid Bp50 die 15 in een monster is gedetecteerd, üiteindelijk kan Bp50 zelf bruikbaar zijn als een oplosbare factor die immuniteit bevordert, bijvoorbeeld een lymfokine.
Naast therapeutische behandeling en diagnostische assays, zouden de liganden volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden gebruikt 20 voor het identificeren of scheiden van cellen die het Bp50 antigeen tot expressie brengen. Bovendien zou, wanneer een geschikt radiolabel of radio-opake verbinding aan het ligand is gebonden, het ligand kunnen worden gebruikt voor in vivo imaging van tumoren die het Bp5Q antigeen tot expressie brengen. Andere toepassingen zullen aan de deskundigen 25 uit de hiervoorgaande beschrijving duidelijk worden.
6. Depots van cellijnen
De volgende hybridoma is gedeponeerd bij de American Type Culture Collection, Hockville, MD, en heeft het vermelde inschrijvingsnummer toegekend gekregen: 30 Hybridoma ATCC inschrijvingsnummer G28-5 HB9110 **** .4 * ' tf 4 ^ -38-
De onderhavige uitvinding is niet beperkt in omvang door de gedeponeerde hybridoma omdat de gedeponeerde uitvoeringsvorm bedoeld is als een enkele illustratie van één aspect van de uitvinding en alle cellijnen die functioneel equivalent zijn tot de omvang van de uitvinding 5 ’ behoren. Inderdaad zullen verscheidene modificaties van de uitvinding naast de hierin getoonde en beschreven varianten aan de deskundigen duidelijk worden op basis van de voorgaande beschrijving en de bijbehorende tekeningen. Beoogd wordt dat dergelijke modificaties binnen de omvang van de bijbehorende conclusies vallen.
10 . v' ··«? ft} ^ v / 'i

Claims (67)

1. In essentie zuiver ligand dat (a) bindt aan Bp50, een 50 kilo-dalton B-celoppervlakteantigeen dat gedefinieerd wordt door monoklonaal antilichaam G28-5 en (b) na binding aan een geactiveerde B-cel de geactiveerde B-cel stimuleert tot doorlopen van de celcyclus zodat uit- 5 breiding van de B-cel wordt versterkt.
2. Ligand volgens conclusie 1, omvattende een antilichaammolecuul of een Fv, Fab, F(ab’)2 of Fab' gedeelte van het antilichaammolecuul.
3. Ligand volgens conclusie 2, waarin het antilichaammolecuul een monoklonaal antilichaammolecuul of een Fv, Fab, Fiab1)^ of Fab' gedeelte 10 van het monoklonale antilichaammolecuul omvat.
4. Monoklonaal antilichaammolecuul volgens conclusie 3, omvattende G28-5, of een Fv, Fab, F(ab')2 of Fabr gedeelte daarvan.
5. Monoklonaal antilichaammolecuul volgens conclusie 3, geproduceerd door een hybridomacellijn zoals gedeponeerd bij het ATCC met inschrij- 15 vingsnummer HB9110, of een mutant,recombinant of genetisch gemanipuleerd derivaat daarvan.
6. Ligand volgens conclusie 1, omvattende een lymfokine.
7. Lymfokine volgens conclusie 6, omvattende een B-celgroeifactor.
8. Ligand volgens conclusie 6, waarin het lymfokine zich op het 20 oppervlak van een cel bevindt.
9. Ligand volgens conclusie 1, 2 of 6, dat verder een aan het ligand gekoppelde verbinding omvat.
10. Ligand volgens conclusie 9, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een anti-uitbreidingsmiddel omvat.
11. Ligand volgens conclusie 9, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een alkyleringsmiddel omvat.
12. Ligand volgens conclusie 9, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een antimetaboliet omvat.
13. Ligand volgens conclusie 9, waarin de aan het ligand gekoppelde 30 verbinding een antibioticum omvat.
14. Ligand volgens conclusie 9, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een vinca alkaloïde omvat.
15. Ligand volgens conlcusie 9, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een enzym omvat. . - ' 5 > -i j * > t -40-
16. Ligand volgens conclusie 9, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een platina coördinatiecomplex omvat.
17. Ligand volgens conclusie 9, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een radioïsotoop omvat.
18. Ligand volgens conclusie 9, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een fluorescente verbinding omvat.
19. In essentie zuiver ligand dat bindt aan Bp50, een 50 kilodalton B-celoppervlakteantigeen dat gedefinieerd wordt door monoklonaal anti-lichaam G28-5.
20. Ligand volgens conclusie 19, omvattende een antilichaammolecuul of een Fv, Fab, Fiab')^ of Fab' gedeelte van het antilichaammolecuul.
21. Ligand volgens conlcusie 20, waarin het antilichaammolecuul een monoklonaal antilichaammolecuul of een Fv, Fab, F(ab')2 of Fab' gedeelte van het monoklonale antilichaammolecuul omvat.
22. Ligand volgens conclusie 19, dat een lymfokine omvat.
23. Lymfokine volgens conclusie 22, omvattende een B-celgroeifactor.
24. Ligand volgens conclusie 19, 20 of 22 dat verder een aan het ligand gekoppelde verbinding omvat.
25 Fab;' gedeelte van het monoklonale antilichaammolecuul.
25. Ligand volgens conclusie 24, waarin de aan het ligand gekoppelde 20 verbinding een anti-uitbreidingsmiddel omvat.
26. Ligand volgens conclusie 24, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een alkyleringsmiddel omvat.
27. Ligand volgens conclusie 24, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een antimetaboliet omvat.
28. Ligand volgens conclusie 24, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een antibioticum omvat.
29. Ligand volgens conclusie 24, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een vinca alkaloïde omvat.
30 ATCC met inschrijvingsnummer Hb9110, of een mutant, recombinant of genetisch gemanipuleerd derivaat daarvan.
30. Ligand volgens conclusie 24, waarin de aan het ligand gekoppelde 30 verbinding een enzym omvat.
31. Ligand volgens conclusie 24, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een platina coördinatiecomplex omvat.
32. Ligand volgens conclusie 24, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een radioïsotoop omvat.
33. Ligand volgens conclusie 24, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een fluorescente verbinding omvat. ' ·· · ' - 7 *4 , , .·· 'J · ï *ί ' *. -41-
34. In essentie zuiver 50 kilodalton B-celoppervlakteantigeen dat gedefinieerd wordt door monoklonaal antilichaam G28-5.
35. In essentie zuiver 50 kilodalton antigeen volgens conclusie 34, dat een polypeptide omvat.
36. Werkwijze voor het versterken van de uitbreiding van B-cellen, omvattende de behandeling van geactiveerde B-cellen met een effektieve dosis van een ligand dat aan Bp50, een 50 kilodalton B-celoppervlakteantigeen gedefinieerd door monoklonaal antilichaam G28-5, bindt, zodat de geactiveerde B-cellen de celcyclus doorlopen en uitbreiding wordt 10 versterkt.
37. Werkwijze volgens conclusie 36, waarin de B-cellen geactiveerd werden door behandeling met een effectieve dosis van een tweede ligand, dat aan 3p35, een 35 kilodalton B-celoppervlakteantigeen, bindt zodat de B-cel van het GQ naar het stadium van de celcyclus overgaat.
38. Werkwijze volgens conclusie 36 of 37, die in vivo wordt uitgevoerd.
39. Werkwijze volgens conclusie 36 of 37, die in vitro wordt uitgevoerd.
40. Werkwijze volgens conclusie 36 of 37, waarin het ligand een anti-lichaammolecuul omvat dat bindt aan Bp50 of een Fv, Fab, F(ab')^ of Fab' 20 gedeelte van het antilichaammolecuul dat aan Bp50 bindt.
41. Werkwijze volgens conclusie 36 of 37, waarin het ligand een monoklonaal antilichaammolecuul omvat dat aan Bp50 bindt of een Fv, Fab, F(ah'of Fab* gedeelte van een monoklonaal antilichaammolecuul dat aan 3p50 bindt.
42. Werkwijze volgens conclusie 41, waarin het monoklonale antilichaam molecuul G28-5 omvat, of een Fv, Fab, F(ab')2 of Fab1 gedeelte daarvan.
43. Werkwijze volgens conclusie 41, waarin het monoklonale antilichaam geproduceerd is door een hybridomacellijn als gedeponeerd bij het ATCC met inschrijvingsnummer HB9110, of een mutant, recombinant of genetisch 30 gemanipuleerd derivaat daarvan.
44. Werkwijze volgens conclusie 36 of 37, waarin het ligand een lymfokine omvat.
45. Werkwijze volgens conclusie 44, waarin het lymfokine een B-cel-groeifactor omvat.
46. Werkwijze volgens conclusie 44, waarin het lymfokine zich op het oppervlak van een cel bevindt. .- ' *· -42-
47. Werkwijze volgens conclusie 37, waarin het tweede ligand een antilichaammolecuul omvat dat aan Bp35 bindt.
48. Werkwijze volgens conclusie 47, waarin het antilichaam dat aan Bp35 bindt, verder een monoklonaal antilichaam omvat.
49. Werkwijze volgens conclusie 37, waarin de geactiveerde B-cellen behandeld worden met het ligand dat aan Bp50 bindt binnen ongeveer 12 uur na activering door het tweede ligand dat aan Bp35 bindt.
50. Werkwijze voor het onderdrukken van de uitbreiding van cellen die Bp5Q tot expressie brengen, een 50 kilodalton B-celoppervlakte- 1.0., antigeen dat door monoklonaal antilichaam G28-5 wordt gedefinieerd, omvattende de behandeling van de cellen die Bp50 tot expressie brengen met een effektieve dosis van een ligand dat aan 3p50 bindt, welk ligand gekoppeld is aan een anti-uitbreidingsmiddel.
51. Werkwijze volgens conclusie 50, waarin de cellen die Bp50 tot 15 expressie brengen, B-cellen omvatten.
52. Werkwijze volgens conclusie 50, waarin de cellen die Bp50 tot expressie brengen, malignecellen omvatten. a
53. Werkwijze volgens conclusie 50, die in vivo wordt uitgevoerd.
54. Werkwijze volgens conclusie 50, die in vitro wordt uitgevoerd.
55. Werkwijze volgens conclusie 50, waarin het ligand een antilichaam molecuul of een Fv, Fab, F(ab’)2 of Fab' gedeelte van het antilichaammolecuul omvat.
56. Werkwijze volgens conclusie 55, waarin het antilichaammolecuul een monoklonaal antilichaammolecuul omvat of een Fv, Fab, FCab'^ of
57. Werkwijze volgens conclusie 56, waarin het monoklonale antilichaam G28-5 omvat, of een Fv, Fab, Fiab'^ of Fab' gedeelte daarvan.
58. Werkwijze volgens conclusie 56, waarin het monoklonale antilichaam geproduceerd wordt door een hybridomacellijn als gedeponeerd bij het
59. Werkwijze volgens conclusie 50, waarin het ligand een lymfokine . omvat.
60. Werkwijze volgens conclusie 59, waarin het lymfokine een B-cel-35 groeifactor omvat. * -* . -43-
61. Werkwijze volgens conclusie 50, 55 of 59, waarin het anti-uitbreidingsmiddel een alkyleringsmiddel omvat.
62. Werkwijze volgens conclusie 50, 55 of 59, waarin het anti-uithreidingsmiddel een antimetaboliet omvat.
63. Werkwijze volgens conclusie 50, 55 of 59, waarin het anti- uitbreidingsmiddel een antibioticum omvat.
64. Werkwijze volgens conclusie 50, 55 of 59, waarin het anti-uitbreidingsmiddel een vinca alkaloïde omvat.
65. Werkwijze volgens conclusie 50, 55 of 59, waarin het anti-101 uitbreidingsmiddel een enzym omvat.
66. Werkwijze volgens conclusie 50, 55 of 59, waarin het anti-uitbreidingsmiddel een platina coördinatiecomplex omvat.
67. Werkwijze volgens conclusie 50, 55 of 59, waarin het anti-uitbreidingsmiddel een radiclsotoop omvat. 15 t
NL8701371A 1986-06-13 1987-06-12 Antilichamen en actieve fragmenten daarvan die dienen voor het hiermee versterken van B-celuitbreiding. NL195022C (nl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US87388486A 1986-06-13 1986-06-13
US87388486 1986-06-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NL8701371A true NL8701371A (nl) 1988-01-04
NL195022C NL195022C (nl) 2003-06-18

Family

ID=25362524

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL8701371A NL195022C (nl) 1986-06-13 1987-06-12 Antilichamen en actieve fragmenten daarvan die dienen voor het hiermee versterken van B-celuitbreiding.

Country Status (22)

Country Link
JP (1) JPH0762040B2 (nl)
KR (1) KR910004100B1 (nl)
AT (1) AT398437B (nl)
AU (1) AU617087B2 (nl)
BE (1) BE1000587A4 (nl)
CA (1) CA1338781C (nl)
CH (1) CH676600A5 (nl)
CY (1) CY1681A (nl)
DE (1) DE3719398C2 (nl)
DK (1) DK173940B1 (nl)
FR (1) FR2607136B1 (nl)
GB (1) GB2191494B (nl)
GR (1) GR870930B (nl)
HK (1) HK10293A (nl)
IE (1) IE60486B1 (nl)
IL (1) IL82841A (nl)
IT (1) IT1208649B (nl)
LU (1) LU86919A1 (nl)
NL (1) NL195022C (nl)
PT (1) PT85073B (nl)
SE (1) SE504675C2 (nl)
SG (1) SG118992G (nl)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5506126A (en) * 1988-02-25 1996-04-09 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
RS50101B (sr) * 1996-02-24 2009-01-22 Boehringer Ingelheim International Gmbh., Farmaceutski preparati za imunomodulaciju

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4443427A (en) * 1982-06-21 1984-04-17 Sidney Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibody
EP0117705A3 (en) * 1983-02-24 1985-09-25 The Regents Of The University Of California Monoclonal antibody specific for monocytes and blast cells
FR2547731A1 (fr) * 1983-06-27 1984-12-28 Centre Nat Rech Scient Immunotoxine antitumorale, preparations pharmaceutiques la contenant et son utilisation in vitro
US4585742A (en) * 1983-12-14 1986-04-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibody with specificity to human small cell carcinoma and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
LU86919A1 (fr) 1989-03-08
JPS6480299A (en) 1989-03-27
JPH0762040B2 (ja) 1995-07-05
AT398437B (de) 1994-12-27
KR910004100B1 (ko) 1991-06-22
DK302287A (da) 1987-12-14
BE1000587A4 (fr) 1989-02-14
FR2607136A1 (fr) 1988-05-27
AU7421487A (en) 1987-12-17
IE871563L (en) 1987-12-13
FR2607136B1 (fr) 1989-09-15
DE3719398C2 (de) 1996-03-28
SG118992G (en) 1993-01-29
PT85073B (pt) 1990-07-31
DE3719398A1 (de) 1988-01-28
GR870930B (en) 1987-12-16
IT8720899A0 (it) 1987-06-12
IT1208649B (it) 1989-07-10
NL195022C (nl) 2003-06-18
DK173940B1 (da) 2002-03-04
PT85073A (en) 1987-07-01
ATA151387A (de) 1994-04-15
GB2191494A (en) 1987-12-16
IL82841A (en) 1992-11-15
GB8713650D0 (en) 1987-07-15
SE504675C2 (sv) 1997-04-07
SE8702463L (sv) 1987-12-14
IE60486B1 (en) 1994-07-27
HK10293A (en) 1993-02-19
CY1681A (en) 1993-10-10
DK302287D0 (da) 1987-06-12
AU617087B2 (en) 1991-11-21
GB2191494B (en) 1990-08-22
CH676600A5 (nl) 1991-02-15
IL82841A0 (en) 1987-12-20
KR880000582A (ko) 1988-03-28
SE8702463D0 (sv) 1987-06-12
CA1338781C (en) 1996-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5182368A (en) Ligands and methods for augmenting B-cell proliferation
US5786456A (en) Bp 50-specific antibodies and fragments thereof
Clark et al. Activation of human B cells mediated through two distinct cell surface differentiation antigens, Bp35 and Bp50.
Gollob et al. CD2 regulates responsiveness of activated T cells to interleukin 12.
Yodoi et al. TCGF (IL 2)-receptor inducing factor (s). I. Regulation of IL 2 receptor on a natural killer-like cell line (YT cells).
Fleischer A novel pathway of human T cell activation via a 103 kD T cell activation antigen.
Perussia et al. A human NK and K cell subset shares with cytotoxic T cells expression of the antigen recognized by antibody OKT8.
Kamoun et al. A novel human T cell antigen preferentially expressed on mature T cells and shared by both well and poorly differentiated B cell leukemias and lymphomas.
Leo et al. Identification of a monoclonal antibody specific for a murine T3 polypeptide.
US6641809B1 (en) Method of regulating cellular processes mediated by B7 and CD28
EP0537293A1 (en) Ligand for cd28 receptor on b cells and methods
JPH013128A (ja) 二官能性抗体構造体及び細胞集団を選択的に破壊する方法
Chouaib et al. Differential effect of anti-beta 2-microglobulin on IL 2 production and IL 2 receptor expression in the primary mixed lymphocyte culture reaction.
US7070776B1 (en) Methods for blocking binding of CD28 receptor to B7
EP0203403B1 (en) A cloned t cell capable of recognizing tumors and a t cell antigen receptor
NL8701371A (nl) Liganden en werkwijzen voor het versterken van b-celuitbreiding.
US5028424A (en) Antibodies to receptor and antigen for natural killer and non-specific cytotoxic cells
EP0325489B1 (en) Leu 23: Monoclonal antibody for monitoring leukocyte activation
WO2003072068A2 (en) Targeted immunotherapy of acute lymphoblastic leukemia (all)
US5229494A (en) Receptor for natural killer and non-specific cytotoxic cells
Colamonici et al. IL-2-dependent expansion of CD3+ large granular lymphocytes expressing T cell receptor-gamma delta. Evidence for a functional receptor by anti-CD3 activation of cytolysis.
AT400956B (de) Verfahren zur gewinnung eines liganden und verfahren zur unterdrückung der proliferation von bp50 exprimierenden zellen
US5194593A (en) Antibodies to natural killer cell and non-specific cytotoxic cell receptor and target cell antigens
Ritz CD2 Regulates Responsiveness of Activated T Cells to Interleukin 12 By Jared A. Gollob,* Jing Li,* Ellis L. Reinherz, r
TANIYAMA et al. Monoclonal antibody against human macrophages/monocytes and granulocytes

Legal Events

Date Code Title Description
BA A request for search or an international-type search has been filed
BB A search report has been drawn up
BC A request for examination has been filed
NP1 Patent granted (not automatically)
V4 Discontinued because of reaching the maximum lifetime of a patent

Effective date: 20070612