FR2607136A1 - Ligands et procedes pour augmenter la proliferation des cellules b et pour supprimer la proliferation des cellules qui expriment bp50 - Google Patents

Ligands et procedes pour augmenter la proliferation des cellules b et pour supprimer la proliferation des cellules qui expriment bp50 Download PDF

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Abstract

LA PRESENTE INVENTION A POUR OBJET DES LIGANDS, AINSI QUE DES PROCEDES POUR AUGMENTER LA PROLIFERATION DES CELLULES B ET POUR SUPPRIMER LA PROLIFERATION DES CELLULES QUI EXPRIMENT BP50. UN LIGAND SENSIBLEMENT PUR SELON CETTE INVENTION SE LIE A BP50, QUI EST UN ANTIGENE DE SURFACE DE CELLULE B DE 50 KDA, DEFINI PAR UN ANTICORPS MONOCLONAL G28-5 ET, APRES LIAISON A UNE CELLULE B ACTIVEE, STIMULE LA CELLULE B ACTIVEE POUR TRAVERSER LE CYCLE CELLULAIRE DE SORTE QUE LA PROLIFERATION DE LA CELLULE B SOIT AUGMENTEE. LES LIGANDS DE CETTE INVENTION PEUVENT ETRE UTILISES POUR REGULER LA DIFFERENTIATION OU LA PROLIFERATION DES CELLULES B.

Description

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La présente invention a pour objet des ligands, des procédés pour augmenter la prolifération des cellules B et
pour supprimer la prolifération des cellules exprimant Bp50.
La présente invention concerne des ligands, tels que des molécules d'anticorps ou des fragments de molécules d'anticorps ou d'autres ligands comme des lymphokines qui se lient à un marqueur de surface d'une cellule B de 50kDa,
ici référencée Bp50, qui a une fonction dans la proliféra-
tion des cellulesB mais non dans l'activation des jeunes
cellulesB. La présente invention concerne également l'anti-
gène Bp50 lui-même de la cellule B. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, un anticorps monoclonal, G28-5, est décrit qui définit Bp50 et qui semble jouer un rôle dans la prolifération des cellules B activées mais n'a pas d'effet détectable sur
la prolifération des cellules B restantes.
Les ligands de la présente invention, tels que des anticorps, lymphokines, et leurs fragments peuvent être utilisés pour diriger et réguler la prolifération des cellulesB humaineset/ou leurdifférenciation. De plus, les ligands de la présente invention peuvent être modifiés par la fixation d'autres composés qui peuvent être utilisés dans le traitement et/ou pour la détection des cellules
malignes qui expriment l'antigène Bp50.
L'activation des cellules B restantes de la phase
G0 à la phase G1 du cycle cellulaire et l'induction ulté-
rieure des cellules B activées pour leur prolifération sont des étapes distinctes requérant des mécanismes régulateurs distincts. Certains agents, comprenant un facteur -pl stimulant une cellule B murine (BSF-pl) (Rabin et autres, 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 2935-2939) ou de petites quantités d'anti-immunoglobuline (anti-Ig) (DeFranco et autres, 1985, J. Immunol. 135:87-94; Wetzel et autres, 1984,
J. Immunol. 133:2327-2332; DeFranco et autres, 1982; J. Exp.
Med. 155:1523-1536; Muraguchi et autres, 1984, J. Immunol. 132:176-180), sont des facteurs "d'activation" ou "de compétence". C'est-à-dire, qu'ils induisent les cellules B afin qu'elles s'accroissent, synthétisent plus de ARN, et entrent en phase G1, mais seuls ils n'induisent pas la synthèse d'ADN dans les cellules B. D'autres facteurs de "croissance", tels qu'un facteur de croissance de la cellule B humaine (BCGF)et une interleukine-2 (IL-2) inter-
viennent sur les cellules B activées afin qu'elles pour-
suivent le cycle cellulaire et entrent en phase S mais
n'interviennent pas pour déclencher les cellules B res-
tantes (Kehrl et autres, 1984, Immunol. Rev. 18:75-96; Muraguchi et autres, 1984, J. Immunol. 132:176-180; Zubler et autres, 1984, J. Exp. Med. 160:1170-1183; Jung
et autres, 1984, J. Exp. Med. 160:1597-1604).
Un certain nombre de facteurs qui favorisent la croissance des cellules B ont déjà été décrits par des
chercheurs à la fois sur des systèmes murine et humains.
Ces facteurs de croissance comprennent des facteurs de croissance des cellulesB (BCGF) provenant d'origines
différentes incluant des hybridomes ou lignées de cel-
lules T, des lignées de cellules B, ou des cellules nerveuses. Bien qu'il ait été démontré qu'à la fois
l'interleukine-1 (IL-1) et l'interleukine-2 (IL-2) inter-
viennent pour augmenter la croissance des cellules B, elles sont apparemment distinctes de certains BCGFs. Par exemple, des anticorps monoclonaux (mAb) d'un BCFG murin (O'Hara et autres, 1985, Nature (Lond.) 315-333) ou BCGF humain (Ambrus et autres, 1985, J. Exp. Med. 162:1319) bloquent l'activité de BCFG mais ne bloquent pas l'activité de IL-1
ou IL-2. Bien que distincts des IL-1 ou IL-2, les BCFGs eux-
mêmes apparaissent être hétérogènes sur la base de données-
biochimiques, d'activité différentielle sur des sous-
populations de cellules B différentes ou. d'essais de co-
stimulation. Par exemple, un BCGF humain à haut poids moléculaire de 60 kilodaltons (kDa), BCFG (haut), a été identifié comme étant distinct d'une forme de bas poids moléculaire de 12-kDa, BCGF (bas) (Ambrus et autres, 1985, J. Clin. Invest. 75:732). L'ANDc codant un BCGF murin de 20- kDa, expérimentalement désigné comme le facteur pl
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stimulant la cellule B (BSF-pl), a récemment été cloné et séquencé (Noma et autres, 1986, Nature 319:640). La lymphokine recombinante non seulement a une activité BCGF mais peut aussi activer les cellules B restantes et induire la différenciation des cellules produisant IgG1; ainsi elle diffère du BCGF humain (haut) et BCGF (bas) à la fois
par son poids moléculaire et par son champ d'activité.
Ces signaux d'activation et de croissance régulent probablement les cellules par interaction avec des structures de surface des cellules B spécifiques. En plus du signal spécifique de l'antigène à travers la surface Ig, plusieurs autres polypeptides de surface de la cellule B ont été identifiés comme pouvant fonctionner d'une certaine façon dansl'activation ou croissance des cellules B. Par exemple, les récepteurs de surface de cellule pour IL-1 (Dower et autres, 1985, J. Exp. Med. 160:501) et pour IL-2 (Robb et autres, 1984, J. Exp. Med. 160:1126) ont été caractérisés, et récemment des récepteurs fonctionnels pour IL-2 ont été identifiés sur des cellules B (Zubler et autres, 1984; J. Exp. Med. 160:1170; Jung et autres, 1984, J. Exp. Med.
:1597; Muraguchi et autres, 1985, J. Exp. Med. 161:181).
Cependant, les récepteurs pour les facteurs d'activation et de croissance de la cellule B doivent encore être complètement caractérisés. Plusieurs polypeptides de surface de la cellule B ont été identifiés comme pouvant intervenir d'une certaine manière dansl'activation ou la croissance des cellules B. Par exemple, Subbarao et Mosier (Subbarao et autres, 1983, Immunol. Rev. 69:81-97) ont trouvé que des anticorps monoclonaux (mAb) pour un antigène Lyb2
d'une cellule B murine activent les cellules B, et récem-
ment une preuve a été présentée suggérant que Lyb2 pouvait être le récepteur pour BSF-pl (Yakura, 1985, Fed. Proc. 44:1532). De façon similaire, il a été trouvé qu'un mAb approprié (iF5) pourun polypeptide de 35 kDa, Bp35, active les cellules B humaines à partir de la phase Go jusqu'à la phase G1 (Clark et autres, 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770; Gollay et autres, 1985, J. Immunol. a
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:3795-3801). Des agrégats de C3d ou des anticorps pour le récepteur C3d de 140 kDa, Bpl40, provoquent la
prolifération des cellules B qui sont cellules T dépen-
dantes (Melchers et autres, 1985, Nature 317:264-267; Nemerow et autres, 1985, J. Immunol. 135:3068-3073; Frade et autres, 1985, Eur. J. Immunol. 15:73-76). Bien que des BCGFs aient été identifiés à la fois chez la souris et chez l'homme, les récepteurspour ces facteurs n'ont maintenant pas encore été isolés. Wang et ses Collaborateurs (Wang et autres, 1979, J. Exp. Med. 149:1424-1433) ont fabriqué un antisérum polyclonal qui a identifié un polypeptide de 54-kDa (gp54) sur des cellules B humaines et ont montré que l'antisérum de lapin de gp54 induisait les cellules B amygdalaires à se diviser. Récemment, Jung and Fu (Jung et autres, 1984, J. Exp. Med. 160:1919-1924) ont isolé un mAb (AB-1) pour un antigène de kDa limité aux cellules B activées et qui bloque la prolifération des cellules BCGF dépendantes. Cependant, le fait de savoir si l'anti-gp54 ou l'AB-1 reconnait ou non
un récepteur de BCGF n'est pas encore connu.
La présente invention concerne des ligands qui (a) se lient à Bp50 un polypeptide de surfacespécifique d'une
cellule B de 50 kDa tel que décrit ici, et (b) accrois-
sent la prolifération des cellules B activées. L'invention concerne également l'antigène Bp50 lui-même, qui est défini par un anticorps monoclonal G28-5 et a une fonction dans la prolifération des cellules B activées. De plus, l'invention concerne des ligands qui se lient à Bp50, mais ne montrent pas un effet ou une fonction biologique tel qu'une augmentation de la prolifération des cellules B activées. Les ligands de la présente invention comprennent des molécules d'anticorps, des molécules d'anticorps monoclonaux et des fragments de ces molécules d'anticorps qui contiennent le site pour le combinaison à l'antigène ou des anticorps modifiés chimiquement et leurs fragments;de tels fragments comprennent mais ne sont pas limités aux
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Fv, Fab, F(ab')2, Fab' et leurs semblables. De plus, les ligands de la présente invention comprennent des lymphokines, qui peuvent comprendre mais ne sont pas limitées aux facteurs de croissances de la cellule B humaine aussi bien qu'auxlymphokines modifiées chimiquement. Les ligands de la présente invention peuvent être modifiés chimiquement, par exemple par liaison ou couplage d'un composé au ligand. De tels composés comprennent mais ne
sont pas limités aux agents cytotoxiques, agents thérapeu-
tiques, agents chimiothérapeutiques, marqueurs comme des radiomarqueurs, colorants, enzymes, composés radio-opaques et leurs semblables. Les ligands de la présente invention peuvent, dans leur forme modifiée ou non, être utilisés pour diriger, réguler et modifier la prolifération des
cellulesB humaineset/ou leurdifférenciation.
La présente invention est basée sur la découverte que deux antigènes de différenciation des cellules B humaines,Bp35 et l'antigène de la cellule B décrit ici, Bp50, apparemment ont des rôles distincts comme récepteurs des signaux dans l'activation des cellules B. Des anticorps monoclonaux (mAb) pour Bp35 et Bp50 donnent à la fois des signaux positifs aux cellules B
qui stimulent leur transition à travers le cycle cellulaire.
MAb pour Bp35, comme les anticorps anti-Ig, a principalement pour fonction d'activer des cellules B restantes afin qu'elles deviennent compétentes pour entrer en phase G1 du cycle cellulaire. Par contraste, un anticorps monoclonal décrit ici ou son fragment F(ab')2 pour Bp50, un polypeptide de 50-kDa exprimé sur toutes les cellules B, a pour fonction de stimuler les cellules B activées afin qu'elles poursuivent le cycle cellulaire et augmente la prolifération des cellules B activées. Des anticorps monoclonaux pour Bp35, comme les anticorps anti-Ig, activent des cellules B amygdalaires et induisent de faibles taux de prolifération des cellules B. Par contraste, l'anticorps monoclonal anti-Bp50 seul n'active pas les cellules B ni n'induit
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des cellules B pour qu'elles prolifèrent, mais avec des anticorps antiBp35 ou anti-Ig, il augmente la prolifération des cellulesB. A cet égard, l'action de l'anticorps anti-Bp50 ressemble à l'activité des facteurs de croissance des cellules B (BCGF). Une quantité aussi petite que 0,05 pg/ml de l'anti-Bp50 est nécessaire pour augmenter la prolifération et, comme BCGF, l'anti-Bp5O est encore efficace quand il est ajouté 12 à 24 heures après que les cellules B aient été activées avec l'anti-Ig ou l'anti-Bp35. Sans signaux exogènes supplémentaires, les anticorps anti- Bp35 et anti-Bp50 ensemble induisent une
prolifération élevée des cellules B restantes purifiées.
Ces résultats suggèrent que les molécules de surface Bp35 et Bp50 ont une fonction dans le contrôle de régulation de l'activation des cellules B et dans leur progression à travers le cycle cellulaire. En raison de l'importance qu'ont les anti-Bp35 et les molécules semblables sur l'effet et l'action des ligands de la présente invention, Clark et autres, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:
1766-1770 est cité ici à titre de référence.
Bien que l'activité de l'anti-Bp50 ressemble à celle de BCGF (bas) puisqu'à la fois anti-Bp50 et BCGF (bas) sont costimuleurs avec les mêmes agents mais non l'un avec l'autre et que les deux anti-Bp50 et BCGF (bas) affectent seulement les cellules B activées et agissent dans une forme soluble, l'activité de l'anti-Bp50 peut cependant être distinguée de l'activité de BCGF (bas), puisque la prolifération des
cellules B stimulées avec des quantités optimales d'anti-
Bp50 et d'anti-Bp35 (ou d'anti-Ig) peut être augmentée davantage avec du BCGF (bas) et que des cellules B sanguines et certains lymphomes de cellules B répondent différemment à l'anti-Bp50 par rapport au BCGF. Pour une activité optimale, l'anti-Bp50 doit être ajouté dans les
12 heures suivant l'activation des cellule B,- alors que.
BCGF (bas) maintient une activité optimale même quand il est ajouté 24 heures après l'activation. De plus, Bp50 est
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exprimé sur toutes les cellules B tandis que des récepteurs ou BCGF (bas) sont limités aux cellules B activées. Ainsi l'anti-Bp50 et le BCGF (bas) peuvent en coordination réguler la croissance des cellulesB, mais apparemment le font par l'intermédiaire de signaux distincts. Selon un mode de réalisation de la présente invention, les ligands qui se lient à Bp50 et augmentent la prolifération des cellules B activées peuvent être utilisés pour augmenter une réponse immunitaire. Par exemple, ces ligands qui lient Bp50 peuvent être utilisés comme un
"adjuvant" pour augmenter une réponse immunitaire à un vaccin.
Alternativement, ces ligands peuvent être utilisés pour augmenter la réponse immunitaire d'un individu immunosupprimé Selon un autre mode de réalisation, les ligands de l'invention peuvent être modifiés chimiquement afin que
les cellules auxquelles les ligands se lient soient tuées.
Puisque toutes les cellules B expriment l'antigène Bp50, il en résultera une suppression de la réponse immune. Par exemple, une drogue cytotoxique liée à un ligand de la présente invention peut être utilisée in vivo pour provoquer une immunosuppression afin de traverser les barrières d'histocompatibilité dans les transplantations chez des patients; alternativement ces ligands modifiés
peuvent être utilisés pour contrôler les maladies auto-
immunes.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, les cellules malignes telles que les cellules tumorales qui expriment Bp50 peuvent être traitées en utilisant un ligand selon l'invention lié à un agent chimiothérapeutique utile dans le traitement d'une telle maladie néoplastique. Ces ligands modifiés peuvent
être utilisés in vivo pour diriger l'agent chimiothérapeu-
tique sur n'importe quel type de cellule maligne qui exprime l'antigène Bp50 comprenant des cellules qui ne sont pas des cellules B mais qui expriment Bp50. En utilisant les ligands selon l'invention lesquels augmentent la prolifération des cellulesB, un avantage particulier
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pourra être obtenu en traitant des malignités des cellules B si l'agent chimiothérapeutique lié au ligand en est un qui est plus efficace pour tuer les cellules proliférantes; dans ce cas une potentialisation de l'action de la drogue doit être obtenue. Alternativement, les ligands selon l'invention peuvent être utilisés in vitro pour identifier ou séparer des cellules qui expriment l'antigène Bp50 et/ou pour tester des fluides du corps pour détecter la présence de
l'antigène Bp50 lequel peut ou peut ne pas avoir été perdu.
De plus, les ligands selon l'invention peuvent être utilisés in vivo pour imager des cellules ou
destumeurs qui expriment l'antigène Bp50.
L'antigène Bp5O purifié de la présente invention peut être utilisé pour fabriquer des anticorps et pour faire ou créer d'autres ligands de l'invention. De plus l'antigène Bp50 pourrait être utilisé dans des essais comme les immuno-essais de diagnostic. Du reste, Bp50 lui-même peut être utilisé comme un médiateur de l'immunité
cellulaire in vive ou in vitro.
Telles qu'utilisées ici, les abréviations suivantes ont les significations indiquées: AD =d'organe acridine BCGF = facteur de croissance d'une cellule B BCGF (haut) = BCGF humain de 60 kDa BCGF (bas) = BCGF humain de 12 kDa Bp35 = un polypeptide de surface spécifique d'une cellule B de 35 kDa (CD20) défini par mAb 1F5 Bp50 = un polypeptidedesurface spécifique d'une cellule B de 50 kDa défini par mAB G28-5
Fv = la région variable ou le site de combinai-
son à l'antigène d'une molécule d'anticorps.
Ce peut être n'importe quel fragment qui contient l'idiotype de la molécule incluant mais non limité aux Fab, F(ab')2, Fab',
et leurs analogues.
9 t2607?136 IF = immunofluorescence Ig = immunoglobuline IL-1 = interleukine 1 IL-2 = interleukine 2 kDa = kilodalton mAb = anticorps monoclonal
SDS-PAGE = électrophorèse sur gel de polyacrylamide-
dodécyl sulfate de sodium TPA = acétate de 12-0-tétradécanoylphorbol-13 BALBC/C mice = à une référence à une suspention dans une lignée spécifique de souris qui sont génétiquement homogènes IRS-1 = myelome parental PHA = phytohémagglutinine NK = cellules naturelles tueuses J J yj /
260 713 6
L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts,
caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparai-
tront plus clairement à la lecture de la description
explicative faite en référence aux figures annexées dans lesquelles: - la figure 1 représente une photographie d'un échantillon de sang périphérique, une photographie d'un échantillon de tissu amygdalaire, et un schéma vectoriel représentant un nombre de cellules par rapport au log d'une fluorescence rouge et par rapport au log d'une fluorescence verte; la figure 2 représente une photographie d'une électrophorèse; - la figure 3 représente plusieurs échantillons de sang périphérique et de tissu amygdalaire;
- la figure 4 représente deux courbes de proliféra-
tion moyenne +SE en fonction des logs de quantités d'anti-
corps; - la figure 5 représente plusieurs courbes donnant une prolifération moyenne (CPM) en fonction du temps; - la figure 6 représente trois courbes montrant un nombre de cellules relatif en fonction des logs de fluorescence; - la figure 7 représente des courbes donnant une proliférarion moyenne +SE (CPM) en fonction du temps; - la figure 8 représente des tracés correspondant à une prolifération moyenne + SE (CPM) en fonction du temps; - la figure 9 représente une titration de BCGF avec des co-stimulateurs; et
- la figure 10 représente des proliférations mesu-
rées après incorporation de thymidine 3H dans quatre
échantillons cellulaires.
Selon la figure 1, une analyse de cytométrie de flux de deux couleurs de 50.000 cellules a été réalisée telle que décrite (Clark et autres, 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770). L'expression de Bp50 a été limitée aux cellules B +Bp35. Les données sont tracées en nombre de cellules par rapport au log de la fluorescence verte et au log de la fluorescence rouge o 4-5 points représentent approximativement un doublement de fluorescence. Les
données ont été présentées pour montrer des cellules néga-
tives auto-fluorescentes. Des colorations PE (rouge)- anti-Bp35 (1F5) par rapport à FITC (verte)-anti-Bp50 (G28-5) montrent que toutes les cellules' Bp5O+ sont aussi Bp35+. La figure 2 correspond à une comparaison biochimique d'un polypeptide de Bp50 avec d'autres antigènes de surface de cellule B. Une immunoprécipitation de Bp50 à partir de cellules amygdalaires de surface marquées 125I fut réalisée comme décrit Des antigènes isolés ont été électrophérésés sur des gels en plaques de polvacrylamide SDS 10 sans réduction. Les gels ont été viqualisés avec une autoradiographie et des écrans intensifiants. Dans la plaque A: le passage 1, correspond à un anti-Bp50 (G28-5); le passage 2 correspond à un
anti-Bp95 (G28-8); le passage 3 correspond à un Ig anti-
souris chèvre-sépharose seulement. Le temps d'exposi-
tion est de 4 jours. Sur la plaque B: le passage 1 corres-
pond à un anti-Bp50 (G28-5); le passage 2, correspond à un
anti-Bp45 (BLASTE-2); le passage 3, correspond à un anti-
Bp39 (G28-1); le passage 4 correspond à un anti-Bp39 (41-H16);
le passage 5 correspond à un Ig anti-souris chèvre -
sépharose seulement. Un temps d'exposition de 2 jours a été choisi afin que les bandes dans les passages 2 à 4 ne soient pas surexposées et puissent être clairement distinguées
par rapport à Bp50. Une des trois expériences.
Selon la figure 3, une analyse immunofluores-
cence deux couleusr de l'expression de Bp50 a été réalisée. Des cellules mononucléaires amygdalaires ou du sans périphérique ont été isolées par centrifugation sur
Ficoll et colorées avec PE (rouge)-conjugué G28-5 (anti-
Bp50) en combinaison avec des anticorps de référence fluorescéine (verte) -conjuguée, comprenant 2C3 (anti-IgM);
1F5 (anti-Bp35); HB10a (anti-DR); et 9.8(anti-CD2, récep-
teur E). Les cellules ont été analysées avec un FACS IV
12 2607136
muni ce quatre amplificateurs à 4 log dix à la fois dans les dimensions verte et rouge. Une diffusion de la lumière à angle droit et avant a été utilisée pour isoler
des monocytes. Les cellules non colorées ont été position-
nées à l'arrière de la grille; la fluorescence rouge est
vers la droite et la fluorescence verte est vers la gauche.
La figure 4 représente des courbes de réponse à des quantités pour une augmentation de la prolifération des cellules B Er- amygdalaires denses par des anticorps anti-Bp50 comme indiqué: milieu seulement; anti-Bp50 seulement anti-Bp35 (5 pg/ml) seulement; BCGF seulement; anti-Bp35 plus BCGF; anti-Bp35 plus doses échelonnées
anti-Bp50. Une prolifération moyenne + une erreur nor-
male d'échantillons en quatre exemplaires a été mesurée au
3ème jour.
La figure 5 montre que des mAb anti-Bp50 sont plus efficaces pour augmenter une prolifération s'ils sont ajoutés après un signal d'activation des cellules B. Des cellules B Er- amygdalaires denses ont été incubées pendant 4 jours avec du milieu seulement, de l'anti-Bp50 (0, 5 pg/-ml)
ajouté à des temps différents après incubation; de.l'anti-
Bp35 (5 pg/ml) ajouté à des temps différents après incuba-
tion; de l'anti-Bp50 gardé constant auquel de l'anti-Bp35
a été ajouté plus tard à des temps différents; de l'anti-
Bp35 constant auquel de l'anti-Bp50 a été ajouté aux cultures à des temps différents. Durant les dernières
heures de la thymidine-3H a été ajoutée et son incorpo-
ration a été mesurée.
La figure 6 montre une comparaison de la capacité de l'anti-Bp35 et de l'anti-Bp50 pour induire des cellules B amygdalaires restantes pour qu'elles quittent la phase GO0 du cycle cellulaire. Au 3ème jour après traitement du milieu seulement (), de l'anti-Bp35 seulement ( -----),
et de l'Ig seulement (.....), sur A, sans additif supplé-
mentaire; sur B, de l'anti-Bp50 (0,5 pg/ml) ajouté à
chaque groupe; sur C, BCGF 5% ajouté à chaque groupe.
a courbe donnent le ndmbre de cellules relatif 13 2u607l136
en fonction du log d'une fluorescence rouge AO (ARN).
La figure 7 représente des cinétiques de proliféra-
tion des cellules B après une stimulation avec de l'anti-
Bp50 par rapport au BCGF. Des cellules B E amygdalaires denses ont été stimulées avec du milieu seulement; du BCGF % seulement; de l'anti-Bp35 seulement; de l'anti-Bp50 seulement; de l'anti-Bp35 + du BCGF 10%; de l'anti-Bp35 + de l'anti-Bp50; et de l'anti-Bp35 + de l'anti-Bp50 + du BCGF 10%. Une prolifération a été mesurée au jour indiqué
par un pulse de 18 heures de thymidine 3H. La proliféra-
tion a été mesurée sur quatre exemplaires et les erreurs
normales ont été données. Une des trois expériences.
La figure 8 illustre des temps après une stimutation anti-
Bp35 quand anti-Bp50 (A) ou BCGF (B) augmentent la prolifération de façon optimale. Des cellules B E amygdalaires denses ont été stimulées comme montré et la prolifération a été mesurée par un pulse de 18 heures de thymidine 3H au 3ème jour. Milieu; anti-Bp35 seulement ajouté auxtemps indiqués;anti-Bp5O ou BGCF seulement; anti-Bp35 ajouté au démarrage d'une culture suivi par une addition d'anti-Bp50 ou de BCGF aux temps indiqués; anti-Bp50 ou BCGF ajouté au démarrage d'une culture suivi
par de l'anti-Bp35. Une des deux expériences. Une prolifé-
ration a été mesurée sur quatre exemplaires et les erreurs normales sont données. Quantités utilisées: anti-Bp35, pg/ml; anti-Bp50, 0,2 pg/nl; BCGF (bas) 5%. Les concen- trations utilisées étaient conme suit anti- Bp35, 5 pg/ml;
anti-Bp50, 0,2 pg/ml; BCGF, 5%.
La figure 9 montre que l'anti-Bp50 et le BCGF ont des effets additifs sur la prolifération des cellules B. Des cellules B E amygdalaires denses ont été stimulées avec des quantités échelonnées de BCGF (bas) avec de l'antiBp50 seulement; de l'anti-Bp35 seulement; des grains anti-Ig seulement; de l'anti-Bp35 + de l'anti-Bp50; ou de l'anti-Bp50 + de l'anti-Ig. La
14 2607136
prolifération a été mesurée au 3ème jour après stimula-
tion avec un pulse de 18 heures de thymidine 3H.
La prolifération a été mesurée sur quatre exemplaires et les erreurs normales sont données. Une des quatre expériences. Les doses utilisaient 106 cellules: anti-Bp35, 5 pg/ml; anti-Bp50, 0,2 pg/ml; grains
anti-Ig, 50 pg/ml.
La figure 10 montre les effets comparatifs de l'anti-Bp50 et de BCGF sur des cellules B malignes et normales. Des cellules B E du sang périphérique (A) ou des cellules B E amygdalaires denses (C) ont été stimulées avec ou sans TPA (75 ng/ml) en présence de BCGF 10o ou de 1 pg/ml d'anti-Bp50. Deux lymphomes de cellules B séparés ( plaques B et D) ont été stimulés de la même manière. La prolifération a été mesurée au 3ème jour par incorporation de thymidine 3H durant un pulse de 12 heures. La prolifération a été mesurée sur quatre exemplaires et les erreurs normales
sont données.
2 60! 7136
La présente invention concerne des ligands qui (a) se lient à Bp50, un polypeptide de surface spécifique d'une cellule B de 50 kDa et (b) qui augmentent la prolifération des cellules B activées. L'invention concerne également l'antigène Bp50 lui-même, qui est défini par mAb G28-5 et a une fonction dans la prolifération des cellules B. De plus, l'invention concerne des ligands qui se lient à
Bp50 mais ne manifestent pas un effet ou une fonction bio-
logique tel que l'augmentation de la prolifération des
cellules B activées.
Les ligands de la présente invention comprennent des molécules d'anticorps, des molécules d'anticorps monoclonaux et des fragments de ces molécules d'anticorps qui contiennent le site de combinaison à l'antigène qui se lie au récepteur de Bp50 comprenant des anticorps modifiés chimiquement et leurs fragments; de tels fragments comprennent Fv, Fab, F(ab')2, Fab' et leurs semblables, mais ne sont cependant pas limités à ceux-ci. De plus, les ligands de la présente invention comprennent des lymphokines,.qui se lient au récepteur de Bp5O. Ceux-ci peuvent comprendre mais ne sont pas limités aux BCGFs aussi bien qu'aux
lymphokines modifiées chimiquement et leurs analogues.
Les ligands de l'invention peuvent être utilisés dans leurs formes modifiées ou non pour moduler et réguler des réponses immunitaires et dans la thérapie de malignités qui
expriment l'antigène Bp50.
Quand le ligand est un anticorps monoclonal, ou un fragment de celui-ci, l'anticorps monoclonal peut être préparé contre Bp50 en utilisant une technique qui permet la production de molécules d'anticorps par deslignées cellulairescontinues en culture. Par exemple, la technique des hybridomes originairement développée par Kohler et Milstein (1975, Nature 256:495-497) aussi bien que d'autres techniques qui sont plus récemment devenues réalisables, telles que la technique des hybridomes des celluies B humaines(Kozbor et autres, 1983, Immunology Today 4:72) et la technique des hybridomes EBV (virus d'Epstein-Barr) 1 6 pour produire des anticorps monoclonaux humains (Cole et autres, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96) et leurs semblables sont
dans la portée de la présente invention.
Des fragments d'anticorps qui contiennent l'idiotype de la molécule pourraient être produits par des techniques connues. Par exemple, de tels fragments comprennent mais ne sont pas limités à: le fragment F(ab')2 lequel peut être produit par traitement de la molécule d'anticorps par la pepsine; les fragments Fab' qui peuvent être produits par réduction des ponts disulfures du fragment F(ab')2; le fragment F(ab')2 qui peut être produit par traitement
de la molécule d'anticorps avec la papaine; et les frag-
ments 2Fab ou Fab qui peuvent être produits par traitement de la molécule d'anticorps avec la papaine et un agent de
réduction pour réduire les ponts disulfures.
Quand le ligand qui se lie à Bp50 est une lymphokine,
la lymphokine peut être obtenue à partir de sources natu-
relles ou si sa séquence en aminoacides est connue ou déduite, la lymphokine peut être synthétisée par des méthodes synthétiques chimiques. Alternativement, si la séquence du gène de la lymphokine est connue, des techniques d'ADN recombinant peuvent être utiliséespour cloner le gène dans un vecteur d'expression qui permet la transcription et la traduction de la séquence du gène, dans une cellule
hôte appropriée.
En fonction de son usage, le ligand ou des fragments appropriés du ligand peuvent être modifiés chimiquement par la liaison au ligand de n'importe quel composé d'une variété de composés en utilisant des techniques de couplage connues. De telles techniques peuvent comprendre mais ne sont pas limitées à l'utilisation de carbodiimide, bromure de cyanogène, réactifs bifonctionnels
tels que le glutaraldéhyde, N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-
propionate (SPDP), réactions de base de Schiff,
liaison à des fractions sulfhydryle, utilisation d'iso-
thiocyanate de sodium, ou liaison enzymatique, pour
17 2 07136
n' en citer que quelques-uns. Si un radio-isotope doit
être attaché au ligand cela peut aussi être effectué aussi par.
des moyens enzymatiques, une substitution oxydative, une chélation, etc... . Pour un examen des réactifs chimiques qui peuvent être utilisés pour la modification d'une protéine voir, Lundblad and Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification, Volume II, CRC Press, Inc.,
Boca Raton, Floride, Ch. 5, pp. 123-139, 1984.
La liaison chimique ou le couplage d'un composé au ligand pourrait être dirigé vers un site sur le ligand qui ne participe pas dans la liaison à Bp50. Cela pourrait être effectué en protégeant le site de liaison du ligand avant d'accomplir la réaction de couplage. Par exemple, le ligand peut être premièrement lié à Bp50 pour protéger le site de liaison de Bp50, puis la réaction de couplage peut être effectuée en liant le composé désiré
aux sites réactifs disponibles sur le complexe ligand-Bp50.
Une fois que la réaction de couplage est accomplie, le complexe peut être rompu produisant de cette façon un ligand modifié auquel le composé désiré est attaché afin que le site de liaison à Bp50 de la molécule soit affecté au minimum. Quand le ligand comprend un anticorps monoclonal tel que G28-5, dans lequel le domaine Fc de la molécule n'est pas exigé pour que le ligand puisse déployer son effet, il peut être avantageux de diriger le couplage
des composés désirés vers le domaine Fc de la molécule.
Il sera décrit ultérieurement, le nouveau marqueur de surface des cellulesB de 50 kDa, Bp50, qui apparemment fonctionne dans la prolifération des cellules B aussi bien que des ligands qui se lient au nouveau récepteur de kDa, et leurs utilisations. Comme exemple des ligands selon la présente invention, un anticorps monoclonal qui définit Bp50 et ses fragments F(ab')2 ont aussi été décrits, lequel comme BCGF, augmente la prolifération des cellules B. A la différence du mAb anti- Bp35, qui peut induire les cellules B restantes en phase Go pour qu'elles entrent en phase G1, un mAb anti-Bp50 n'active pas les cellules B restantes. Les mAb anti-Bp35 et anti-Bp50 ensemble, sans signaux exogènes supplémentaires, induisent une forte activation et prolifération des
cellules B purifiées.
Les expériences qui seront décrites ultérieurement démontrent aussi que l'activité de l'anti-Bp5O ressemble à l'activité de BCGF mais qu'un anti-Bp5O est distinct d'un BCGF puisque l'anti-Bp50 et le BCGF de bas poids moléculaire sont clairement additifs et qu'ils agissent différemment sur diverses sous-populations de cellules B ou de cellules malignes. Bp50 peut être un récepteur pour un BCGF distinct ou pour un signal transmembranaire qui module la production de BCGF ou l'expression d'un
récepteur de BCGF.
On décrira maintenant des procédés pour augmenter une-
prolifération des cellules B activées avec une quantité efficace du ligand qui se lie à Bp-50, et pour supprimer
une prolifération des cellules qui expriment Bp 50.
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PROCEDESUTILISESPOUR CARACTERISER LE RECEPTEUR
de Bp50 Préparations cellulaires Des cellules mononucléaires ont été isolées à partir de sang périphérique normal ou à partir de sang périphérique héparinisé leucémique par des gradients Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ). Les cellules rononucléaires ont été obtenue à partir de tissus amygdalaires comme décrit
(Clark et autres; 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770).
Des cellules T ont été épuisées par formation de rosettes avec des érythrocytes de mouton traités -AET (EAT) et séparées par gradient FicollHypaque. Dans certaines expériences les cellules B du sang ont été enrichies en isolant des cellules adhérentes sur laine nylon. Desmonocytes ont été supprimés par incubation sur des plaques de pétri en plastique en une ou deux fois à 37 C pendant 45 minutes, à moins qu'ils aient été supprimés autrement. Des fractions des cellules B amygdalaires denses ou surnageantes ont été isolées par gradients de phase Percoll tel que décrit (Clark et autres, 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770) . Les préparations de cellules B amygdalaires denses conséquemment avaient plus de 95% de cellules Bp35+sIg+.Les préparations
de cellules B enrichies,du sang, avaient 60 d 85% des cellules sIg+.
Les cellules de lymphomes de cellules B ont été isolées en plaçent doucement les cellules de lymphomes à l'intérieur
d'un milieu suivi par une centrifugation de gradient Ficoll-
Hypaque.
Anticorps monoclonaux.
L'anticorps G28-5 pour Bp 50 a été produit en immuni-
sant des cellules de souris BALB/c par des lymphocytes amygdalaires-Ehumains, et en fusionnant des cellules, spléniques immunisées avec le myélome NS-1 (Kohler et autres, 1975, Nature 256:495-497; Ledbetter et autres, 1979, Immunol. Rev. 47:63-82). Des cultures de cellules hybrides secrétant l'anticorps réagissant avec les cellules B amygdalaires
et non avec les cellules T ont été identifiées par immuno-
fluorescence indirecte (IF) et analyse avec un sélecteur
2Z607136
de cellules FACS IV; des cultures avec un anticorps donnant des histogrammes identiques au mAb connu pour visualiser des marqueurs des cellules B (tel que, Bp 35) ont été clonées et sélectionnéespour plus d'étude. Le clone de G28-5 produit un mAb IgG1 qui réagissait seulement avec des cellules B malignes ou normales ou des lignées de cellules B. D'autres mAb utilisés dans cette étude ont été décrits en détail
(Clark et autres, 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-
1770; Clark et autres, 1986, Human Immunol. 16:100; Ledbetter et autres, 1986, Human Immunol. 15:30-44;
Ledbetter et autres, 1985, dans Perspectives in Immunogene-
tics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, pp. 325-340).
Ceux-ci comprennent le 1F5 (IgG2a) anti-Bp35, le HBlOa (IgG2a), l'antiHLA-DR, 2C3 (IgG1)chaîne anti-u, le G19-4 (IgG1) anti-CD3, le FC-2 (IgG2a) CD16 récepteur anti-Fc, et le 9.6 (IgG2a) anti-CD2 (récepteur E) produit par le Docteur Paul Martin (Martin et autres, 1983, J. Immunol. 131:180). Les mAbs IgG1 ont été purifiés par une précipitation en utilisant % ou 50% de sulfate d'ammonium saturé et une colonne de chromatographie Sephacryl DEAE et les mAbs IgG2a ont été purifiés par l'utilisation de colonnes de Sepharose de
protéine A. Les fragments F(ab')2 de G28-5 ont été prépa-
rés par la méthode de P'arham (Parham et autres, 1983, J. Immunol. 131:2895), ont été purifiés sur une colonne S200 Sephacryl de 2 mètres de long, et ont été testés pour leur pureté par du SDS-PAGE (Ledbetter et autres, 1985, J. Immunol. 135:1819). Le mAb 2C3 pour chaînes-u a été conjugué à des grains 4B de Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals,
Uppsala, Sweden) en utilisant du bromure de cyanogène couplant.
Conjugaisonsde phycoerythrine et de fluorescéine.
Les mAb purifiés ont été soit directement conjugus
avec une fluorescéine en utilisant de l'isothiocyanate-
fluorescéine (FITC; Molecular Probes) (vert) par la méthode de Goding (Goding et autres, 1976, J. Immunol. Meth. 13: 215-226), soit conjugués à une phycoérythrine-R (PE) (rouge) par utilisation de SPDP (Pharmacia) avec une méthode qui a été détaillée dans Ledbetter et autres, 1985, dans
21 26 07136
Perspectives in Immunogenetics and Histocompatability, ASHI, New York, 6, 119-129. Des cellules lymphoides ont été incubées dans des plaques de microtitrage fond rond pendant 30 minutes avec une dilution appropriée d'un mAb vert et/ou rouge, lavées deux fois et puis analysées sur un sélecteur de
cellules FACS IV.
Immunofluorescence de deux couleurs.
Des études de deux couleurs ont été faites avec un sélecteur de cellules activées par fluorescence (FACS IV: Becton-Dickinson, Mountain View, CA) en utilisant un miroir dichroique 560-nm pour séparer le faisceau et un filtre à bande passante longue 580 et un filtre à bande passante courte 540 (Ditric Optics, Hudson, MA) en avant des tubes
de photomultiplicateur rouge et vert, respectivement.
De plus, un compensateur de deux couleurs (T. Nozaki, Stanford University) a été utilisé pour corriger la perte mineure des signaux du vert et rouge. Pour chaque tache de deux couleurs, des données à partir de 40.000 cellules ont
été recueillies et stockées sur des disques souples.
Les données sont représentées en nombre de cellules (verti-
cal) par rapport au log de fluorescence verte par rapport J qu'elles s'agrandissent(Clark et autres, 1986, Leukocyte Typing II, eds. Reinherz et autres, Springer Verlag, Berlin, Vol. 2, 455-462) et entrent en phase G1 du cycle
cellulaire (Gollay et autres, 1985, J. Immunol. 135:3795-
3801). Ainsi, il était intéressant de comparer la capacité du mAb antiBp50, par rapport au mAb anti-Bp35, pour leurs effets sur l'activation des cellules B. Tel que montré à la figure 6A, des cellules B amygdalaires denses non stimulées même après 3 à 4 jours de culture avait un profil d'ARN uniforme caractéristique des cellules en !
* CONDITIONS OPTIMALES POUR AUGMENTER LA PROLIFERATION-
DES CELLULES B AVEC DES ANTICORPS ANTI-Bp50 Des anticorps de Bp50 par euxmêmes ont un petit ou pas d'effet détectable sur les cellules B restantes denses (Tableau 3). Cependant, en présence d'agents qui peuvent activer les cellules B, tels qu'un anti-Ig, un anti-Bp35 et TPA, un mAb anti-Bp50, une prolifération augmentait clairement. Un anti-Bp50 ne co-stimulait pas avec de
32 2607136
plusieurs interleukines, comprenant IL-1 purifié, IL-2 recombinant et BCGF (bas). Une comparaison des effets d'un anti-Bp50 avec ceux de BCGF (bas) montrait que lés mêmes agents qui étaient co-stimulateurs avec anti- Bp5O étai.ent également co-stimulateurs avec BCGF (bas) (Tableau 3)
(Tableau 2). En d'autres termes, l'anti-Bp50 comme co-
stimulan t agi t pourengendrer la progression à la fois des phases d'activation (G0 à G1) et de *( ?,^ Q\ cL _-._,rl_ rall,,..iiy: | PCVrP m,
:1i A..DTD: 23 2607136
et autres, 1980, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77:6697-6702).
Les changements dans les taux relatifs des antigènes de surface de cellule ont été contrOlés par l'utilisation de mAb directement conjugué avec de la fluorescéine et puis ont été quantifiés par des taux de fluorescence IF directe avec un sélecteur de cellules Epics V.
Caractérisation biochimique de BP50.
Une immunoprécipitation de Bp50 à partir de cellu-
les amygdalaires marquées 125I de surface a été réalisée comme décrit (Ledbetter et autres, 1985, J. Immunol. 134: 4250-4254). Des antigènes isolés ont été électrophorésés sur des gels en plaques de polyacrylamide SDS 10% sans réduction. Les gels ont été visualisés en utilisant une autoradiographie à -70 C et des écrans intensifiants et
éclairants Cronex (Dupont).
CARACTERISATION DU RECEPTEUR DE Bp50O
La description ci-après donne les résultats des
expériences conduites en utilisant les méthodes telles que décrites.
IDENTIFICATION D'UN MARQUEUR DE SURFACE DE
CELLULESDE 50 kDA SPECIFIQUES DE CELLULES B, Bp5O Un mAbpourBp50 a été produit en immunisant les cellules BALB/c de souris par des lymphocytes amygdalaires humains et en fusionnant les cellules spléniques immunisées avec le myélome NS-1. Un clone, G28-5, produisait un mAb IgG1 qui ne contenait pas la chaîne légère NS-1. Après examen minutieux par analyse IF, il a été trouvé que G28-5 réagissait seulement avec les cellules B malignes ou normales ou les lignées de cellules B. Un criblage d'ensemble des tissus normaux par des méthodes établies(Clark et autres, 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770; Ledbetter et autres, 1986, Human Immunol. 15:30-44; Ledbetter, 1985, dans Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, pp. 325-340) ont révélé que l'anticorps G28-5 réagit avec les cellules négatives rosette E (Er-)
du sang ou des amygdales mais ne réagit pas avec les -
cellules T non adhérentes laine nylon, avec des blastes de cellules T induites PHA, ou avec les granulocytes, monocytes, globules rouges sanguins, ou les plaquettes. Il
réagissait fortement avec toutes les sept lignées cellu-
laires delymphoblastoides B testées et avec trois lignées du lymphome de Burkitt (Raji, Daudi, Namalwa), mais non avec les quatre lignées de cellules T (CEM, HSB-2, JURKAT, et HPB-ALL). Toutes les leucémies lymphocytiques chroniques testées (3/3) et 90% (9/10) des lymphomes B testés exprimaient le marqueur Bp50 alors que seulement 28% (2/7) des leucémies lymphocytiques aiguës, non T, non B CALLA+ exprimaient Bp50. La distribution restreinte de Bp50 sur des tissus
normaux a été davantage confirmée par les analyses d'immuno-
fluorescence de deux couleurs quantitatives (deux couleurs IF).
En utilisant un anticorps conjugué avec la R-phycoérythrine (PE) (rouge) pour l'antigène Bp35 des cellules B (Bl, CD20) et un anticorps anti-Bp50 (vert) conjugé avec la fluorescéine, on a trouvé que Bp50 était exprimé seulement dans le sangoules amygdales sur des cellules B Bp35+
(figure 1). Les cellules B sanguines conséquemment expri-
maient destaux quelque peu plus faiblesde Bp50 que les cellules B amygdalaires; ceci est similaire à l'expression HLA-DR, (Ledbetter et autres, 1986, Human Immunol. 15:30-44) et de l'expression de gp54 (Wang et autres, 1979, J. Exp. Med. 149:1424-1433) qui sont aussi plus faiblessur les cellules B sanguines. Bp50 a été exprimé à des quantité
similaires sur des sous-populations de cellules B amygda-
laires séparées sur des gradients Percoll en fractions denses et surnageantes. En utilisant le mAb conjugué-PE au marqueur de la cellule T, CD3 (T3),.et au marqueur associé aux cellules NK, CD16 (récepteur Fc) (Ledbetter et autres, 1979, Immunol. Rev. 47:63-82), on a trouvé que Bp50 n'est pas exprimé sur les cellules T ni sur les cellules NK. En utilisant une IF deux couleurs, on a aussi trouvé que des blastes PHA CD3 + qui exprimaient des quantités élevées de récepteurs IL-2, n'exprimaient
pas Bp50.
L'anticorps G28-5 réagissait avec un polypeptide unique sur des lymphocytes amygdalaires qui migrait à environ 50 Kd dans des conditions de non réduction (figure 2A). Cette molécule est plus grande que les mar-
queurs des cellules B donnés précédemment dans le même inter-
valle de poids moléculaires tels que Bp39 ou Bp45 (Zipf et autres, 1983, J. Immunol. 131:3064-3072; Kitner et autres, 1981, Nature 294, 458-460; Clark et autres, 1986, dans Leukocyte Typing II, eds. Reinherz et autres, Springer Verlag, Berlin, Chap.12 Vol. 2, 155-167; Slovin et autres,
1982, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79: 2649-2653; Thorley-
Lawson et autres, 1985, J. Immunol. 134:3007-3012, et figure 2B). Le temps d'exposition pour ce gel a été choisi afin que les poids moléculaires des autres marqueurs de
cellules B puissent être facilement comparés avec Bp50.
Le marqueur Bp39, au contraire de Bp50, est exprimé sur les granulocytes et Bp45, au contraire de Bp50, est restreint aux blastes des cellules B. Les anticorps pour Bp39 (41-H16) et Bp45 (MNM6, Blaste-1, Blaste-2) qui
ont pu être obtenus par un atelier ou centre inter-
national (Clark et autres, 1986, dans Leukocyte Typing II, eds. Reinherz et autres, Springer Verlag, Berlin, Chap.12 Vol. 2, 155-167) ne bloquaient pas la liaison des anticorps anti-Bp50 fluorescéinés pour des cellules B. Ainsi, sur la base d'une distribution tissulaire, d'une analyse biochimique, et d'études de blocage, l'anticorps monoclonal G28-5 reconnaît une structurede 50 Kd distincte des autres antigènes connus de cellules B. L'EXPRESSION DE Bp50 EST RESTREINTE AUX CELLULES B A la fois des études de tissushématopoiétiques et de distribution des lignées cellulaires et des analyses détaillées par cytométrie de flux de deux couleurs ont révélé que Bp50 est exprimé seulement sur des lymphocytes B. Tel qu'illustré à la figure 3, Bp50 est exprimé sur une petite souspopulation de lymphocytes sanguins et sur une grande population de lymphocytes amygdalaires.Virtuellement,
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toutes les cellules Bp50+ à la fois du sang et des amygdales exprimaient aussi Bp35 et HLA-DR, mais n'exprimaient pas le CD2 (figure 1) ou CD3, les molécules de cellule T ou les récepteurs de IgG Fc qui sont trouvées sur les cellules NK. De plus, les blastes des cellules T CD3+ activées- ConA exprimaient les récepteurs de IL-2 mais
n'exprimaient pas Bp50.
Des analyses par cytométrie de flux de deux couleurs permettent d'effectuer la mesure quantitative du rapport de densité entredeux antigènes de surface. On a préalablement montré que les cellules B restantes, denses dans la zone de manteau des follicules secondaires expriment IgM et de petites quantités de Bp35, tandis que les cellules B activées,.surnageantes dans le centre germinal sont IgM-négatives et expriment des quantités élevées de Bp35 (Ledbetter et autres, Human Immunol. 15:30). La figure 3
montre qu'à la fois des sous-populations de cellules B IgM-
positives et IgM-négatives exprimaient Bp5O en quantités égales,cequi indique que Bp5O est exprimé à la fois sur les
cellules B restantes et sur les cellules B activées in vivo.
AUGMENTATION DE LA PROLIFERATION DES CELLULES
B AVEC UN ANTICORPS ANTI - Bp50 Comme préalablement expliqué, les cellules B peuvent
être activées avec de petites quantités d'anticorps spécifi-
ques des chaines anti-u. On a récemment trouvé que le marqueur spécifique des cellulesB Bp35 (Bl), polypeptidede 35-kDa, peut également avoir une fonction dans l'activation des cellules B jeunes: le mAb 1F5 pour Bp35, comme despetites quantités de l'anticorps anti-u,
active les cellules B pour augmenter en volume cellu-
laire et en teneuren d'ARN et pour pouvoir répondre au BCGF (Clark et autres, 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766:1770; Gollay et autres, 1985, J. Immunol. :3795-3801). Par conséquent, il était intéressant de comparer l'effet du mAb anti-Bp50 dans la prolifération des cellules B non traitées ou des cellules B activées avec
soit l'anti-Bp35 ou des anticorps anti-u (Tableau 1).
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L'anti-Bp35 en solution o les anticorps anti-u liés aux grains de Sepharose, dans des conditions appropriées seuls, pourrait stimulerune prolifération des cellules B (Tableau 1, ligne 1); par contraste, des anticorps anti-Bp50 seuls ne stimulaient pas la prolifération (Tableau 1, ligne 2). Cependant, le mAb anti-Bp50 augmentait considérablement la prolifération quand il était-cultivé avec des grains anti-u ou avec de l'anti-Bp35. A cet égard l'anti-Bp50 ressemblait au BCGF (Tableau 1, ligne 3). Ainsi, il était important de déterminer si l'anti-Bp50 et le BCGF ensemble pouvaient induire la prolifération des cellules B. Comme illustré dans le Tableau 1, ligne 4 l'anti-Bp50 et le BCGF
ensemble n'induisaient pas la prolifération, mais augmen-
taient la prolifération de soit les cellules activées anti-u soit des cellules activées anti-Bp35 un peu plus que l'un ou l'autrestimulant seul. BCGF, sur une échelle de 3 logs, quand il est utilisé avec anti-Bp50 sans d'autres signaux, n'avait pas d'effet sur la prolifération des cellules B denses même quand l'anti-Bp50 était utilisé à
des quantités de 0,01 à 10 "g/ml.
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2 8
TABLEAU 1
Augmentation de la prolifération des cellules B induites par Anti-Ig ou Anti-Bp35 avec les anticorps anti-Bp50 Prolifération moyenne + S.E.de cellules B cultivées avec: Lignée Co-stimulant Milieu Grains anti-u AntiBp35 1I Aucun 1.212+547 10.219+462 5.539+308 - 2 Anti-Bp50 719+718 38.792+ 1.329 25.465+616
3 BCGF - 456+217 14.217+445 9.443+343
4 Anti-Bp50
+ BCGF 1.456+126 54.393+2.537 46.488+3.387
La prolifération des cellules B amygdalaires-Er denses (95% de cellules IgM+ de surface) a été mesurée le troisième jour comme décrit. Brièvement, 2 x 105 cellules/puits de 200 pl ont été cultivées en quadruple pendant 48 heures avec un milieu 1640 RPMI contenant du sérum foetal de bovin 15% plus des additifs sans anticorps ou avec soit un anticorps monoclonal 2C3 pour chaInes - u couplé à des grains de sépharose
("grains antl-u", 50 pg/ml) soit un anticorps anti-Bp35 1F5-
libre (5 jg/ml). Les cultures contenant un milieu, "des grains anti-u", ou de l'anti-Bp35 ont été cultivées seules ou avec du BCGF (concentration finale 5%, Cytokine, Technology, Buffalo, New York; pas d'activité IL-l ou IL-2), détectable avec de l'anti-Bp50 (dilution 1: 1000 d'ascites) comme co-stimulants. Après340 heures les cellules ont été pulsées avec de thymidine- H, et les coups incorporés ont
été mesurés après 18 heures.
MAb ANTI- Bp50 AUGMENTE UNE PROLIFERATION
SEULEMENT APRES QUE DES CELLULES B AIENT
ETE ACTIVEES PAR ANTI-Bp35 OU ANTICORPS ANTI-U Les résultats du Tableau I suggèrent qu'un mAb anti-Bp5O pourrait ne pas induire la prolifération par lui-même. Tel que montré à la figure 4, des quantités d'anti-Bp50 de 0,05 pg à 2,0 pg/ml n'avaient pas d'effet sur la thymidine 3H Cependant, en prsence de quantits sur la thymidine H. Cependant, en présence de quantités optimales desmAb anti-Bp35, des quantités aussi petites que
0,1 à 0,5 pg/ml d'anticorps anti-Bp50 augmentaient sensible-
ment la prolifération. Des cpm aussi importants que 50.000 à 70.000 étaient détectables au temps maximum de prolifération quand des cellules B purifiées hautement avaient
été cultivées seulement avec l'anti-Bp35 plus l'anti-Bp50.
Une observation conséquente fut que des quantités plus grandes d'antiBp50 (plus grandes que 2-5Vg/ml) étaient
moins efficaces que des quantités comprises entre 100-200 ng.
Ces résultats suggéraient que l'anti-Bp50 peut fonc-
tionner seulement après que les cellules B aient été acti-
vées par d'autres signaux. Les données illustrées à la figure 5 suggèrent que c'est vraiment le cas. Si les cellules
B ont été premièrement activées avec l'anti-Bp35, l'anti-
Bp50 pourrait être ajouté aussi tard que 24 à 48 heures plus
tard et augmentent la prolifération au quatrième jour.
Contrairement, quand les cellules sont d'abord traitées avec l'anti-Bp50, l'anti-Bp35étaitefficace seulement si ajouté dans les quelques heures après le démarrage des cultures. Des résultats similaires ont été obtenus
quand on a utilisé de l'anti-u plutôt que de l'anti-Bp35.
MAb ANTI-Bp50 N'ACTIVE PAS LES CELLULES B
HORS DE GO MAIS INDUIT LA PROGRESSION DES
CELLULES B ACTIVEES SANS LE CYCLE CELLULAIRE.
Au préalable, on a trouvé que l'anti-Bp35, de même que de petites quantités d'anticorps anti-u, induisent les cellules B amygdalaires restantes en phase Go0 pour qu'elles s'agrandissent(Clark et autres, 1986, Leukocyte Typing II, eds. Reinherz et autres, Springer Verlag, Berlin, Vol. 2, 455-462) et entrent en phase G1 du cycle
cellulaire (Gollay et autres, 1985, J. Immunol. 135:3795-
3801). Ainsi, il était intéressant de comparer la capacité du mAb antiBp50, par rapport au mAb anti-Bp35, pour leurs effets sur l'activation des cellules B. Tel que montré à la figure 6A, des cellules B amygdalaires denses non stimulées même après 3 à 4 jours de culture avait un profil d'ARN uniforme caractéristique des cellules en
Z 2607136
phase G0 (Darzynkiewicz, 1980, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77:6697-6702). Cependant, environ 15 à 30% des cellules stimulées avec l'anti-Bp35 ou l'anti-u avait une teneur
accrue en ARN, signe indicatif de leur entrée en phase G1.
Contrairement, ni l'anti-Bp50 (figure 6B) ni le BCGF (figure 6C) seulsn'induisaient des nombres significatifs de cellules B pour qu'elles entrent en phase G1. Par exemple, 2 jours après l'activation, le mAb antiBp35, et le mAb anti-Ig, induisaient respectivement 13,5% et 20,9% de cellules amygdalaires pour qu'elles entrent en phase G1, alors que les cellules traitées avec seulement l'anti-Bp50 (2,7%) ou le BCGF (3,2%) restaient à des taux de contrôle moyens (2,2%). Cependant, lorsque soit l'anti-Bp50 soit le BCGF étaientajoutés ensemble avec de l'anti-Bp35 ou des anticorps anti-u, la proportion
de cellules entrant en phase G1 augmentaientconsidérablement.
De façon similaire, l'anti-Bp50 et le BCGF seuls n'indui-
saient pas les cellules B pour qu'elles entrent en phase S (Tableau 2), mais ensemble avec soit de l'anti-Bp35 soit de l'anti-u augmentaient le nombre de cellules en
phase S de 2 à 3 fois.
TABLEAU 2
Effet de l'Anti-Bp50 et de BCGF sur la Progression du Cycle Cellulaire dans des Lymphocytes Amygdalaires Signal de Signal de % cellules compétence progression G0 G1 S/G2/M milieu aucun 89,9 7,1 2,5 anti-Bp35 " 80,4 14,5 3,7 anti-Ig " 65,6 27,6 5,7 milieu anti-Bp50 83,6 12,0 3,3 antiBp35 " 54,1 35,5 9,7 anti-Ig " 43,6 36,2 16,2 milieu BCGF 85,4 11,7 2,2 anti-Bp35 " 56,6 32,6 11,6 anti-Ig " 48,4 36,1 14,1 Pourcentage de cellules en phases GoG1 ou S et G2 déterminé par l'utilisation d'un procédé avec le colorant orange acridine (Darzynkiewicz et autres, 1980Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77:6697-6702); 1 x 106 lymphocytes amygdalaires denses avec de l'anti-Bp35 (5 pg/ml), de l'anti-u sur grains (50 pg/ml),
de l'anti-Bp50 (0,4 pg/ml), du BCGF (5%) ou leurs combinaisons comme montré.
CONDITIONS OPTIMALES POUR AUGMENTER LA PROLIFERATION
DES CELLULES B AVEC DES ANTICORPS ANTI-Bp50 Des anticorps de Bp50 par euxmêmes ont un petit ou pas d'effet détectable sur les cellules B restantes denses (Tableau 3). Cependant, en présence d'agents qui peuvent activer les cellules B, tels qu'un anti-Ig, un anti-Bp35 et TPA, un mAb anti-Bp50, une prolifération augmentait clairement. Un anti-Bp50 ne co-stimulait pas avec de plusieurs interleukines, comprenant IL-1 purifié, IL-2 recombinant et BCGF (bas). Une comparaison des effets d'un anti-Bp50 avec ceux de BCGF (bas) montrait que les mêmes agents qui étaient co- stimulateurs avec anti-Bp5O étai.ent également co-stimulateurs avec BCGF (bas) (Tableau 3). La découverte, qu'ensemble BCGF et anti-Bp50 n'étaient encore pas co-stimulateurs pour les cellules B
restantes, fut d'un intérêt particulier.
TABLEAU 3
Augmentation de la Prolifération des Cellules B avec des Anticorps AntiBp50 ou un Facteur de Croissance des Cellules B Prolifération Moyenne + S. E. des cellules B cultivées avec: Anti-Bp50 BCGF Co-stimulant Milieu (200 ng/ml) (5%) Aucun 96 + 1 267 + 15 285 + 74 anti-Ig 5.833 + 391 41.634 + 2. 103 25.094 + 61 anti-Bp35 pg/ml) 457 + 45 8.143 + 280 1.733 + 32 TPA (2 ng/ml) 7.361 + 537 21.163 + 871 13.064 + 1.030 IL-1 (10 U/ml) 264 + 2 308 + 23 221 + 8 IL-2 (100 U/ml) 204 + 34 350 + 7 220 + 11
BCGF (5%) 220 + 7 851 + 28 270 + 18
Cellules B amygdalaires-Erdenses (plus grandes que des cellules sIgM+ 95%) cultivées pendant 48 heures à 2 x 105 cellules par puits suivies par -un pulse de 24 heures avec de
la thymidine- 3H avant comptage.
Les cinétiques de prolifération augmentées par
anti-Bp50 sont montrées à la figure 7. Le pic de proliféra-
tion survenait au quatrième jour et puis blêmissait que les cellules aient été activées ou non avec un anti-Bp35 ou
33 260 713 6
ou d'autres activateurs tels que anti-Ig ou TPA. Les cinétiques de prolifération augmentées par BCGF ou par
un anti-Bp50 étaient similaires.
Des quantités aussi petites que 0,05 ug d'anticorps anti-Bp50 augmentaient une prolifération. Une dose optimale de 0,3 pg/ml fut utilisée dans des études subséquentes. Une observation conséquente fut que lorsque l'on utilisait des molécules d'anticorps entières des quantités plus importantes d'anti-Bp50 (plus grandes que
2-5 pg/ml) étaient moins efficaces que des quantités com-
prisesentreO,1-0,5 pg/ml.
Les cellules B humaines sont excessivement sensibles aux effets inhibiteurs produits indirectement par des récepteurs de Fc des anticorps se liant à un Ig de surface (Parker, 1980, Immunol. Rev. 52:115; Bijsterbosch et autres, 1985, J. Exp. Med. 162:1825). Aussi, il était important de comparer l'efficacité de mAb anti-Bp50 entier avec celle des fragments F(ab')2 d'un anti-Bp50. Sur doses des fragments F(ab')2 apparaissaient clairement aussi efficaces, ou plus efficaces qu'un anticorps entierpour augmenter la prolifération des cellules B (Tableau 4) . Ainsi, le domaine Fc de mAb anti-Bp50 n'est pas exigé pour anti-Bp50 en vue d'exercer son effet et, s'il y en a, peut être inhibiteur. En d'autres termes, anti-Bp50, comme BCGF, peut apparemment agir comme un médiateur soluble sans l'aide d'une fonction cellulaire subsidiaire par l'intermédiaire d'un récepteur de Fc
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TABLEAU 4
Le Domaine Fc des Anticorps Anti-Bp50 n'est pas Exigé pour Augmenter la Prolifération des Cellules B Prolifération moyenne des Cellules B cultivées avec Quantité Anti-Bp50 (pg/ml) Milieu Anti-Bp35 - aucun -- 295 + 16 269 + 27 Ab entier 0,125 278 + 32 5.140 + 20
1,25 275 + 24 4.686 + 342
12,5 163 + 15 3.852 + 203
F(ab')2,125 594 + 21 10.635 + 449
1,25 531 + 3 10.893 + 575
12,5 279 + 8 9.411 + 870
Les conditions de culture des cellules furent telles que
décrites dans le Tableau 3.
DIFFERENCES ENTRE L' ACTIVITE ANTI-Bp5O
ET BCGF (BAS)
Anti-Bp50 et BCGF (bas) avaient un effetsimilaire sur les cellules B et étaient co-stimulateurs avec les mêmes agents (Tableau 3). Toutefois, plusieurs lignées d'évidence indiquent que l'anti-Bp5O et le BCGF utilisés dans cette
étude opèrent apparemment à travers des signaux différents.
Premièrement, des molécules de Bp5O, contrairement aux récepteurs de BCGF (bas)(Bijsterbosch et autres, 1985, J. Exp. Med. 162:1825), sont exprimées sur des cellules B sanguines restantes (Figure 3). Deuxièmement, quoique à la fois l'anti-Bp5O et BCGF (bas)fonctionnent plus efficacement quand ils ont été ajoutés après de l'anti-Bp35 ou anti-Ig,
2607136
l'anti-Bp50 était clairement efficace d'une façon optimale quand il a été ajouté 12 heures après que les cultures aient été commencées (figure 8A). Contrairement, BCGF (bas) pourrait être ajouté aussi longtemps que 24 heures après le démarrage des cultures et augmente encore optimalement une prolifération (figure 8B). Ces expériences cinétiques, qui ont été modelées après l'approche de Howard et Paul (1983, Ann. Rev. Immunol. 1:307), suggèrent qu'un signal Bp50-dépendant peut normalement exercer son
effet avant BCGF.
A la fois l'anti-Bp50 et BCGF (bas) augmentaient une prolifération des cellules B activées avec un anti-Bp35 ou un anti-Ig (Tableau 3). Cependant, les effets de l'anti-Bp50 et de BCGF (bas) étaient additifs dans de nombreuses expériences (figure 7). La figure 9 montre une titration de BCGF (bas) dans une expérience o un anti-Bp50
était utilisé à sa concentration optimale (0,2 Vg/ml).
BCGF (bas) pouvait davantage augmenter une prolifération des cellules B restantes en présence d'un anriti-Bp50 après activation soit par anti-Ig soit par un anti-Bp35. Des concentrations optimales de BCGF (bas) étaient de 5-10%, tandis qu'une concentration de 25% était inhibitrice. Ainsi, quand un anti-Bp50 et un BCGF (bas) étaient à la fois utilisés à leurs concentrations optimales, ils montraient encore des effets additifs sur une prolifération des cellules B. Finalement, à la fois des souspopulations de cellules B normales et malignes différaient dans leurs réponses à un anti-Bp50 et au BCGF (bas). Par exemple, des cellules B sanguines répondaient au BCGF (bas) mais ne répondaient pas à un antiBp50 (Tableau 5). Un signal d'activation supplémentaire tel que anti-Bp35 (Tableau 5) ou TPA (figure 10) était conséquemment nécessaire pour permettre
aux cellules B sanguines de répondre à un anti-Bp50.
Alors que les cellules B amygdalaires denses ne répondaient pas généralement soit à un BCGF soit à un anti-Bp50, les
6 6 27 13 6
cellules B surnageantes répondaient (Tableau 5). Des cellules B malignes différaient aussi dans leur réponse à un anti-Bp50 par rapport à un BCGF. Par exemple, des lymphomes de cellules B répondaient à TPA plus BCGF (bas) mais ne répondaient pas à du TPA plus anti-Bp50 G28-5 (figures lOB et D). Contrairement des cellules B
amygdalaires denses et des cellules B sanguines périphé-
riques répondaient au TPA plus soit BCGF (bas) soit
anti-Bp50 (figures lOA et C).
TABLEAU 5
Les sous-populations de cellules B diffèrent dans leurs réponses à l'antiBp50 ou à BCFG Prolifération moyenne (+S.E.M.) des lymphocytes du Sang Amygdales Stimulation Exp 1 Exp 2 Exp 3 Dense Surnageant Aucun 527 + 70 659 + 133 906 + 106 385+ 43 387+ 12
BCGF (5%) 13.918 + 1.082 37.594 + 2023 3.347 + 174 332+ 33 1.451+ 57
anti-Bp50(0,5 pg/ml) 519 + 28 1.013 + 81 1.151 + 28 472+ 8 1,543+ 20 antiBp35(5 pg/ml) 554 + 90 645 + 89 665 + 115 2.415+ 80 1.129+ 68 anti-Bp50 + anti-Bp35 -- 12.274 + 546 15.667 + 333 36.589+ 1.335 4.843+ 136 anti-Bp50 + BCGF -- -- 3.943 + 115 1.342+ 19 2.899+ 91 Conditions de culture cellulaire telles que décrites dans le Tableau 1. Des lymphocytes adhérents laine nylon sanguins (cellules B plus monocytes) furent supprimés des monocytes
par incubation sur des plaques de plastique la nuit avant stimulation (Exp. 1 et Exp. 2).
Dans l'Exp.3, des lymphocytes -E sanguins furent séparés des monocytes par incubation sur des plaques de plastique pendant 1 heure avant stimulation. Des lymphocytes Er- amygdalaires furent fractionnés en utilisant des gradients Percoll en sous-populations (32) denses (grains) o
ou surnageantes (fraction I).
Lm1
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UTILISATIONS DES LIGANDS ANTI-Bp50 ET Bp50 Les ligands de la présente invention peuvent être utilisés in vivo ou in vitro, dans leurs formes modifiées ou non pour moduler des réponses immunitaires. Par exemple, les ligands eux-mêmes peuvent être utilisés comme un "adjuvant" pour accroître une réponse immunitaire à un vaccin ou pour augmenter la réponse immunitaire d'un individu immunoréprimé. Alternativement, si des cytotoxines ou des agents anti-prolifératifs sont couplés aux ligands, ces ligands modifiés peuvent être utilisés pour diminuer une
réponse immunitaire,par exemple, dans une maladie auto-
immune ou dans un transplant à des patients afin d'éviter un rejet de greffe. Ces ligands modifiés pouvaient aussi être utilisés pour traiter des malignités qui comprennent des cellules ou des tumeurs lesquelles expriment l'antigène
Bp50 que la malignité soit la cellule B à l'origine ou non.
A la fois les ligands de la présente invention et/ou Bp50 lui-même peuvent être utilisés in vitro. De telles applications comprennent des essais in vitro, tels que des immuno-essais pour la détection des cellules qui expriment l'antigène Bp50 et/ou pour la détection d'un
antigène Bp50 perdu, s'ilyen a, dans les fluides du corps.
Dans ce cas, le ligand ou Bp50 pourrait être marqué avec un marqueur radio-actif,du fluor, une enzyme, un substrat d'enzyme, un colorant, etc.. . De plus, les ligands peuvent être utilisés pour séparer et/ou identifier des cellules qui expriment l'antigène Bp50, dans quel cas le ligand peut être couplé à un support immobile, ou à du fluor qui peut être utilisé dans un FACS (sélecteur de cellules activées
par fluorescence).
Les différentes applications et usages des ligands et de Bp50 selon la présente invention seront
discutés plus en détail ci-dessus.
RECEPTEUR Bp50 ET UTILISATIONS DES LIGANDS TELS QUE ANTI-Bp50 POUR AUGMENTER UNE PROLIFERATION
DES CELLULES B
Des études antérieures ont suggéré que les facteurs
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qui intervenaient dans l'induction des cellules B de la phase GO à la phase G1 du cycle cellulaire sont distincts des facteurs ou des exigences pour passer en phase S. Ce modèle est basé principalement sur des études montrant que des agents tels que de petites quantités de facteurs d'activation des cellules B anti-Ig, ou anti-Bp35 seul ont peu ou pas d'effet sur la prolifération des cellules B. Cependant, ces mêmes agents peuvent conduire les cellules B à un point de l'activation cellulaire o ils sont susceptibles d'être des facteurs decroissance. Contrairement, des facteurs de croissance tels que BCGF ou IL-2 seuls n'ont pas d'effet sur les cellules B restantes mais augmentent la croissance
des cellules B activées.
Bien que la présente invention n'est pas limitée à une quelconque théorie ou explication, les résultats présentés ici fournissent un support supplémentaire pour un modèle de régulation distinct de l'activation des cellules B et des étapes de croissance. Ici on a montré que des signaux d'activation et de prolifération dans des cellules B humaines peuvent être transmis à travers des structures de surface cellulaire distinctes. Bien qu'un mAb anti-Bp35 activait des cellules B pour qu'elles entrent dans la phase G1 du cycle cellulaire, seul,il induisait peu ou pas de prolifération. Un mAb anti-Bp50 avait l'effet opposé: il ne pouvait pas activer les cellules B, mais quand il était ajouté même aussi tard que 12 à 24 heures après une activation il pouvait induire la croissance des cellules B. La molécule Bp50 probablement pouvait normalement fonctionner comme soit un récepteur pour un ligand tel qu'un facteur de croissance soluble ou pour un signal produit indirectement à travers un contact cellule-cellule (c'est-à-dire, un ligand qui se trouvait sur la surface d'une autre cellule). Des études antérieures ont identifié plusieurs BCGFs dérivés de cellules T qui, comme un anti-Bp50, augmentent la prolifération des cellules B.
C2 607136
A la fois des formes de haut et bas poids moléculaire des facteurs de croissance des cellules B ont été identifiées et différents types ont été montrés comme ayant des effets additifs (Kehrl et autres, 1984, Immunol. Rev. 18:75-96; Kishimoto, 1985, Ann. Rev. Immunol. 3:133-157; Swain et autres, 1983, J. Exp. Med. 158:822-835; Howard et autres, 1984, Immunol. Rev. 78:185-210; Ambrus et autres, J. Clin.
Invest. 75:732-739; Ambrus, 1985, J. Exp. Med. 162:1319-
1335). Ainsi, Bp50 pourrait être un récepteur pour un de
ces facteurs.
A l'exception des récepteurs IL-2 et du récepteur C3d, les récepteurs sur les cellules B pour des signaux de croissance n'ont encore pas été identifiés. Le mAb AB-1 réagit avec un marqueur des cellules B exprimé seulement sur des cellules B activées et bloque une prolifération BCGF dépendante, et ainsi pourrait reconnaître le récepteur de BCGF ou une structure apparentée. Bp50 apparaît être distinct du marqueur de AB-1 puisque le mAb AB-1 ne bloque pas la liaison de l'anticorps anti-Bp50 de G28-5, à la différence du mAb G28-5, réagit seulement avec les cellules B activées (Jung et autres, 1984, J. Exp. Med. :1919-1924). Bp50 est sur toutes les cellules B, ce qui, sur la base d'une analyse d'absdrption et des essais de liaison directe,n'apparait pas être le cas pour des récepteurs de BCGF. Les données courantes indiquent que Bp50 et le récepteur pour BCGF de bas poids moléculaire sont des structures distinctes. Utilisant un hétéro-antisérum
de lapin, Wang et ses Collaborateurs (Wang, 1979, J. Exp.
Med. 149:1424-1433) ont préalablement décrit une glyco-
protéine de 54 kDa, gp54, qui comme Bp50 est exprimée sur toutes les cellules B mais à des taux plus bas sur les
cellules B sanguines que sur les cellules B amygdalaires.
Il est possible, mais peu probable, que l'hétéro-antisérum de lapin et un anti-Bp50 reconnaissent les mêmes structures ou des structures rapprochées: à la différence du mAb anti-Bp50, l'antisérum de lapin de gp54 seul était suffisant pour stimuler une prolifération des cellules B. L'anti-Bp35 seul, à la différence d'un anti-Bp50, peut activer des cellules B de la phase G0 à la phase G1 et
ainsi peut être appelé comme un signal "d'activation ".
Que Bp35 fonctionne ou non seulement dans l'activation des jeunes cellules B n'est pas encore clair puisque des anticorps anti-Bp35 peuvent stimuler des cellules B pour qu'elles se divisent (Clark et autres, 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770). Similairement, Bp50 peut ne pas strictement fonctionner comme un signal "de croissance": des anticorps anti-Bp50 ensemble avec des signaux d'activation (anti-Bp35 ou anti-u) non seulement augmentent la prolifération mais aussi augmentent le nombre total des cellules B entrant en phase G1
(Tableau 2). En d'autres termes, l'anti-Bp50 comme co-
stimulant agit pour engendrer la progression à la fois des phases d'activation (Go0 à G1) et de croissance (G à S) du cycle cellulaire. Le BCGF utilisé dans ces études a également une activité similaire (figure
6C). Ainsi, l'anti-Bp35 et l'anti-Bp50 (ou BCGF) apparais-
sent être les plus analogues aux facteurs "compétence" et "progression" décrits dans des études sur la régulation de croissance des fibroblastes. La façon dont les cellules B répondent à l'anti-Bp35 ou l'anti-Bp50 peut clairement
dépendre de leur état de différenciation ou d'activation.
Ici on a décrit que deux mAb, anti-Bp35 (signal " compétence") et antiBp50 (signal " progression"), ensemble peuvent induire une prolifération substantielle des cellules B hautement
purifiées en absence d'antigène ou d'autres facteurs connus.
Les ligands naturels pour ces structures ne sont actuelle-
ment pas connus. Cependant, puisqu'un mAb aux épitopes appropriés peut imiter à la fois des facteurs solubles et des signaux produits par l'intermédiaire des interactions cellule-cellule, il peut être possible d'utiliser des combinaisons appropriées de mAb pour diriger et réguler la prolifération ou la différenciation des cellules
42 6 15
42 2607136
humaines. Cela, aidera à imaginer des stratégies in vivo pour le contrôle de
maladies humaines telles que des malignités des cellules B, des immuno-
déficiences et certaines maladies auto-immunes.
Le nouvel anticorps monoclonal, G28-5, qui réagit avec un polypeptide constitué d'une chaîne unique d'approxi- mativement 50 Kd exprimé sur la surface des cellules B humaines n'est qu'une réalisation particulière des ligands selon la présente invention qui peut augmenter la prolifération des cellules B activées. Puisque la prolifération des cellules B humaines peut être augmentée similairement par des BCGFs dérivés de cellules T comprenant du BCGF à haut poids moléculaire et bas poids moléculaire, on a comparé l'activité d'un anti-Bp5O G28-5 avec celle d'une préparation de BCGF contenant d'une façon prédominante du BCGF de bas poids moléculaire. L'anti-Bp50 G28-5 et BCGF (bas) étaient très similaires du fait qu'ils étaient co-stimulateurs avec les mêmes agents d'activation (anti-Ig, antiBp35 et TPA) mais ils n'étaient pas co-stimulateurs l'un avec l'autre ou avec Il-1 ou IL-2. De plus, l'activité de l'anti-Bp50 G28-5 n'était pas dépendante de son domaine Fc
puisque des fragments F(ab')2 de G28-5 étaient fonctionnel-
lement actifs. Cela suggère qu'un anti-Bp50 soluble, comme un BCGF soluble, n'exigent pas des cellules accessoires de
support d'un récepteur de Fc en vue d'exercer un effet.
De plus, à la fois anti-Bp50 et BCGF sont efficaces seulement en présence d'un stimulus d'activation. En d'autres termes, l'anti-Bp50 et BCGF ne sont pas des facteurs de "compétence", mais plutôt favorisent la
"progression" des cellules B à travers le cycle cellulaire.
Bien qu'il soit possible que Bp50 puisse fonction-
ner comme récepteur pour un ligand tel qp'un facteur de croissance des cellules B, plusieurs résultats suggèrent que Bp50 n'est pas le récepteur au moins pour le BCGF (bas) utilisé dans cette étude: il est exprimé sur des cellules B
sanguines tandis que des récepteurs de BCGF (bas-) apparem-
ment ne le sont pas. Des structures candidates pour le récepteur de BCGF (bas), contrairement àBp50, sont également
43 2607136
exprimées seulement sur les cellules B activées. De plus, à la fois les populations de cellules B malignes et normales diffèrent dans leur réponse à un anti-Bp5O par rapport au BCGF (bas) (Tableau 5 et figure 10) : par exemple, des lymphomes B prolifèrent en réponse à BCGF (bas), mais non en réponse à l'anti-Bp50. Finalement, dans un certain nombre d'expériences, des concentrations optimales d'anti-Bp50 et de BCGF ensemble induisaient une plus grande prolifération que chacun seul. Un anti-Bp50 imite l'activité
d'autres BCGF, tels que des BCGF (hauts) qui sont co-
stimulateurs avec de l'anti-IgM (Ambrus et autres, 1985, J. Exp. Med. 162:1319; Ambrus et autres, 1985, J. Clin. Invest. 75:732). Cela suggère que Bp50 pourrait fonctionner
comme le récepteur pour BCGF (haut).
Bien que Bp50 puisse être un récepteur pour un ligand soluble, alternativement, Bp50 peut fonctionner comme
un récepteur pour un signal intermédiaire cellule -
cellule qui réguleles niveaux de récepteur de BCGF et/ou la production autocrine.Un précédent pour les antigènes de différenciation servant comme amplificateurs d'une voie récepteur autocrine provient des études faites avec des cellules T. MAb de l'antigène du leucocyte commun Lp220 augmente une prolifération par une élévation de l'expression du récepteur IL-2 sur les cellules T activées (Ledbetter et autres, 1985, J. Immunol. 135:1819). Un mécanisme analogue peut être mis en oeuvre avec l'anti-Bp50 et l'expression de certains récepteurs de BCGF. Bp50 et BCGF (bas) sont apparemment sous un contrôle de coordination puisque, comme les récepteurs IL-1 et IL-2, BCGF augmente l'expression de Bp50 sur certaines cellules leucémiques. La molécule de Bp50 partage également des similitudes avec la molécule de Tp44 qui fonctionne pour influencer la production de IL-2. On a montré ainsi que d'autres que l'anticorps anti- Tp44 9,3 augmente la prolifération des cellules T activées par un anti- CD3 ou TPA (Ledbetter et autres, 1985, J. Immunol. 135:2331; Hara et autres, 1985, J. Exp. Med. 161:1513). Similairement, l'anti-Bp50 augmente la
44 2607136
prolifération des cellules B activées par anti-Bp35 ou TPA. Le signal de Tp44 fonctionne en stimulant une production de IL-2 plutôt qu'en stimulant une croissance des cellules T. Probablement le signal de Bp50 pourrait fonctionner d'une manière analogue par stimulation d'une production autocrine des cellules B (Gordon et autres, 1984,
Nature, Lond. 310:145).
LIGANOS MODIFIES UTILISES POUR UNE IMMUNO-
SUPPRESSION OU POUR LE TRAITEMENT DE MALIGNITES
Selon cette réalisation, le ligand de la présente invention peut être modifié par la liaison d'un agent anti-prolifératif de façon à ce que la molécule résultante puisse être utilisée pour tuer des cellules qui expriment l'antigène Bp50. De tels ligands modifiés peuvent être utilisés dans le traitement d'une maladie auto-immune pour supprimer la prolifération des cellules B et de cette façon supprimer la réponse autoimmune. Ces ligands modifiés peuvent également être utilisés pour immunosupprimer un
patient transplanté afin de prévenir d'un rejet de greffe.
En conséquence, des agents cytotoxiques qui sont utilisés pour la suppression des réponse immunitaires peuvent être attachés aux ligands de l'invention. En utilisant des ligands qui augmentent la prolifération des cellules B, un effet augmenté pourrait être obtenu puisque la drogue sera
dirigée vers des cellules B proliférantes.
Dans un autre mode de réalisation, les ligands de la présente invention qui sont modifiés par la liaison d'un agent anti-prolifératif peuvent être utilisés pour traiter
des malignités dans lesquelles des tumeurs ou des cellules-
expriment l'antigène Bp50. Une liaison de ces agents chimiothérapeutiques aux ligands selon l'invention devrait donner une plus grande spécificité de la drogue pour les cellules malignes. Par ailleurs, un avantage particulier doit être obtenu en traitant une malignité d'une cellule B avec un ligand couplé à une cytotoxine qui est plus efficace pour tuer des cellules proliférantes que pour tuer des cellules non proliférantes; un traitement avec un
2607136
tel ligand doit donner une potentialisation de l'action
de la cytotoxine.
En conséquence, les agents chimiothérapeutiques ou les agents antiprolifératifs qui peuvent être couplés aux ligands de la présente invention comprennent mais ne sont pas limités aux agents répertoriés dans le Tableau 6 ci-dessous lequel est dérivé de Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Sixth Edition, MacMillan Publishing Co., Inc, New York, pp. 1249-1313,
1980, qui est donné ici à titre de référence.
46 2 6 07 13 6
TABLEAU 6
Agents chimiothérapeutiques qui peuvent être couplés aux ligands AntiBp5O Classe Type Agent Agent Moutarde Méchloréthamine d'alcoylation Azote Cyclophosphamide Melphalan Moutarde Uracile Chlorambucile Dérivés Thiotépa d'éthylèneimine Sulfonates d'alcoyle Busulfan Nitrosourées Carmustine Lomustine Sémustine Streptozocine Triazenres Dacarbazine Antimétabolites Analogues Méthotréxate Acide folique Analogues Fluorouracile Pyrimidine Cytarabine Azaribine Analogues Mercaptopurine Purine Thioguanine Produits Alcaloîdes Vinblastine naturels Vinca Vincristine Antibiotiques Dactinomycine Daunorubicine Doxorubicine Bléomycine Mithramycine Mitomycine Enzymes L-Asparaginase Agents divers Complexes Cispiatine coordinés Platine Urée substituée Hydroxyurée Dérivés Procarbazine Hydrazine Méthyl suppressant Mitotane Adrénocorticale Hormones et Adrénocortico- Prednisone Antagonistes stéroides Progestines Caproate d'hyo-r;1pro ,stérone Acetate de Médroprogestérone Acétate de Megestérol Oestrogènes Diéthylstilbestrol Ethinyl estradiol Antioestrogène Tamoxifène Androgène Proprionate de Testostérone Isotopes Phosphore Phosphate de sodium radioactifs 32 Iode Iodure de Sodium I Toute méthode connue peut être utilisée pour coupler
le ligand à l'agent chimiothérapeutique ou anti-prolifératif.
* Des exemples de telles méthodes ont été exposés précédemment.
48 - C 2607136
AUTRES UTILISATIONS DES LIGANDS ET DE Bp50 En plus des applications thérapeutiques les ligands et Bp50 lui-même ont d'autres applications à la fois dans des essais de diagnostic in vivo et in vitro, des schémas de séparation, etc.
Le récepteur de Bp50 peut être utilisé pour fabri-
quer et/ou concevoir les ligands de l'invention. Bp50 peut aussi être utilisé avec les ligands de l'invention dans des essais in vitro qui exigent un étalon pour quantifier la quantité de Bp50 détecté dans un échantillon. En fin de compte, Bp50, lui-même peut être utilisé comme un facteur
soluble qui sert d'intermédiaire de l'immunité, par exem-
ple unelymphokine.
En plus des essais de diagnostic et de traitement
thérapeutiques, les ligands de la présente invention pour-
raient être utilisés pour identifier ou séparer des cellules qui expriment l'antigène Bp50. De plus, si un radio-parqueur approprié ou un composé radio-opaque est lié au ligand, le ligand pourraitêtreutilisé pour donner des images
in vivo, des tumeurs qui expriment l'antigène Bp50.
D'autres usages pourraient devenir apparents pour les familiers
de la technique à partir de la description précédente.
DEPOT DE LIGNEES CELLULAIRES
L'hybridome suivant a été déposé auprès de l'American Type Culture Collection, Rockville, MD, et il lui a été assigné le numéro d'accès suivant: Hybridome Numéro d'accès ATCC
G28-5 HB9110
La présente invention n'est pas limitée dans sa portée à l'hybridome déposé puisque la réalisation déposée constitue une simple illustration d'un aspect
de l'invention et les lignées cellulaires quelcon-
ques, qui sont fonctionnellement équivalentes, font
partie de la portée de cette invention. En effet>diverses modifica-
3 tions de l'invention en plus de celles montrées et décrites ici apparaîtront
à ceux familiers de cette technique à partir de la description et des dessins
qui précèdent.
L'invention comprend donc tous les équivalents ou modifications
effectués selon l'esprit de l'invention.
49 2 6 0713 6

Claims (45)

R E V E N D I C A T I ONS
1.- Ligand sensiblement pur caractérisé en ce que (a) il se lie à Bp5O, un antigène de surface de cellule B de 50 kilodaltons défini par un anticorps monoclonal G28-5 et en ce que (b) par liaison à une cellule B activée il stimule la cellule B activée pour qu'elle traverse le cycle cellulaire de façon à ce qu'une prolifération de la
cellule B soit augmentée.
2.- Ligand selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'anticorps ou une partie
Fv, Fab, F(ab')2 ou Fab' de la molécule d'anticorps.
3.- Ligand selon la revendication 2, caractérisé en ce que la molécule d'anticorps comprend une molécule d'anticorps monoclonal ou une partie Fv, Fab, F(ab')2 ou
Fab' de la molécule d'anticorps monoclonal.
4.- Molécule d'anticorps monoclonal selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle comprend G28-5,
ou n'importe quelle partie Fv, Fab, F(ab')2 ou Fab' de celle-ci.
5.- Molécule d'anticorps monoclonal selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est produite par une lignée de cellules d'hybridomes telle que déposée à l'ATCC sous le N HB9110, ou par un
mutant,recombinant,ou son dérivé oroduit génétiouement.
6.- Ligand selon la revendication 1, caractérisé
en ce qu'il comprend une lymphokine.
7.- Ligand selon la revendication 6, caractérisé en ce que la lymphokine précitée comprend un facteur de croissance de cellule B.
8.- Ligand selon la revendication 6, caractérisé
en ce que la lymphokine est sur la surface d'une cellule.
9.- Ligand selon l'une des revendications 1, 2 ou 6,
caractérisé en ce qu'il comprend de plus un composé couplé
pour devenir ligand.
CU 2607136
10.- Ligand selon la revendication 9, caractérisé en ce que le composé couplé au ligand comprend un agent
anti-prolifératif, un agent d'alcoylation, un anti-
métabolite, un antibiotique, un alcaloïde vinca, un enzyme, un complexe coordinné de platine, un radio-isotope,
ou un composé fluorescent.
11.- Ligand sensiblement pur caractérisé en ce qu'il se lie à Bp50, un antigène de surface de cellule B de
kilodaltons défini par un anticorps monoclonal G28-5.
12.- Ligand selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'anticorps ou une partie
Fv, Fab, F(ab')2 ou Fab' de la molécule d'anticorps.
13.- Ligand selon la revendication 12, caractérisé en ce que la molécule d'anticorps comprend une molécule d'anticorps monoclonal ou une partie Fv, Fab, F(ab')2 ou
Fab' de la molécule d'anticorps monoclonal.
14.- Ligand selon la revendication 11, caractérisé
en ce qu'il comprend une lymphokine.
15.- Ligand selon la revendication 14, caractérisé en ce que la lymphokine précitée comprend un facteur de croissance de cellule B.
16.- Ligand selon l'une des revendications 11, 12,
ou 14, caractérisé en ce qu'il comprend de plus un composé
couplé pour être ligand.
17.- Ligand selon la revendication 16, caractérisé en ce que le composé couplé au ligand comprend un agent
anti-prolifératif, un agent d'alcoylation, un anti-
métabolite, un antibiotique, un alcaloide vinca, un
enzyme, un complexe coordinné de platine, un radio-
isotope, ou un composé fluorescent.
18.- Antigène de surface de cellule B de kilodaltons sensiblement pur, caractérisé en ce qu'il
est défini par un anticorps monoclonal G28-5.
19.- Antigène de 50 kilodaltons sensiblement pur selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend
un polypeptide.
20.- Procédé pour augmenter la prolifération des cellules B, caractérisé en ce qu'il consiste à traiter, des cellules B activées avec une quantité efficace d'un ligand qui se lie à Bp50, un antigène de surface d'une
cellule B de 50 kilodaltons définipar un anticorps mono-
clonal G28-5, de sorte que les cellules B activées traversent
le cycle cellulaire et que la prolifération soit augmentée.
21.- Procédé selon là revendication 20, caractérisé en ce que les cellules B ont été activées par traitement avec une quantité efficace d'un second ligand qui se lie
à Bp35, un antigène de surface de cellule B de 35 kilo-
daltons, de sorte que la cellule B progresse de la phase Go0
à la phase G1 du cycle cellulaire.
22.- Procédé selon la revendication 20. ou
21, caractérisé en ce qu'il est effectué in vivo.
23.- Procédé selon la revendication 20
ou 21, caractérisé en ce qu'il est effectué in vitro.
24.- Procédé selon la revendication 20 ou 21, caractérisé en ce que le ligand comprend une molécule d'anticorps qui se lie à Bp50 ou une partie Fv, Fab, F(ab')2 ou Fab de la molécule d'anticorps qui se
lie à Bp50.
25.- Procédé selon la des revendication 20 ou 21, caractérisé en ce que le ligand comprend une molécule d'anticorps monoclonal qui se lie à Bp50 ou une partie Fv, Fab, F(ab')2 ou Fab' d'une molécule d'anticorps
monoclonal qui se lie à Bp50.
26.- Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que la molécule d'anticorps monoclonal comprend
G28-5, ou une partie Fv, Fab, F(ab')2 ou Fab' de celle-ci.
27.- Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal est produit par une lignée de cellules d'hybridomes telle que déposée à l'ATCC sous le numéro HB9110, ou un mutant, un recombinant ou son
dérivé produit génétiquement.
28.- Procédé selon la revendication 20 ou 21, caractérisé en ce que le ligand comprend une lymphokine.
29.- Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce que la lymphokine précitée comprend un facteur de croissance cellule B.
30.- Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce que la lymphokine est sur la surface d'une cellule.
31.- Procédé selon la revendication 21, caractérisé
en ce que le second ligand comprend une molécule d'anti-
corps qui se lie à Bp35.
32.- Procédé selon la revendication 31, caractérisé en ce que l'anticorps qui se lie à Bp35 comprend de plus
un anticorps monoclonal.
33.- Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que les cellules B activées sont traitées avec le ligand qui se lie à Bp50 environ dans les 12 heures après
activation par le second ligand qui se lie à Bp35.
34.- Procédé pour supprimer la prolifération des cellules qui expriment Bp50, un antigène de surface de cellule B de 50 kilodaltons défini par un anticorps monoclonal G28-5, caractérisé en ce qu'il consiste à traiter les cellules qui expriment Bp50 avec une quantité efficace d'un ligand qui se lie à Bp50, lequel
ligand est couplé à un agent anti-prolifératif.
35.- Procédé selon la revendication 34, caractérisé en ce que les cellules qui expriment Bp50 comprennent des cellules B.
36.- Procédé selon la revendication 34, caractérisé en ce que les cellules qui expriment Bp50 comprennent des
cellules malignes.
37.- Procédé selon la revendication 34, caractérisé
en ce qu'il est effectué in vivo.
38.- Procédé selon la revendication 34, caractérisé
en ce qu'il est effectué in vitro.
39.- Procédé selon la revendication 34, caractérisé en ce que le ligand comprend une molécule d'anticorps ou une partie Fv, Fab, F(ab')2 ou Fab' de la molécule d'anticorps.
53 2607136
40.- Procédé selon la revendication 39, caractérisé en ce que la molécule d'anticorps comprend une molécule d'anticorps monoclonal ou une partie Fv, Fab, F(ab')2 ou
Fab' de la molécule d'anticorps monoclonal.
41.- Procédé selon la revendication 40, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal comprend G28-5 ou une
partie Fv, Fab, F(ab')2 ou Fab' de celui-ci.
42.- Procédé selon la revendication 40, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal est produit par une lignée de cellules d'hybridomes telle que déposée à 1'ATCC sous le numéro HB9110, ou un mutant, recombinant ou son
dérivé produit génétiquement.
43.- Procédé selon la revendication 34, caractérisé
en ce que le ligand comprend une lymphokine.
44.- Procédé selon la revendication 43, caractérisé en ce que la lymphokine comprend un facteur de croissance de cellule B.
45.- Procédé selon l'une des revendications 34,
39, ou 43, caractérisé en ce que l'agent anti-prolifératif comprend un agent d'alcoylation, un antimétabolite, un antibiotique, un alcaloïde vinca, un enzyme, un complexe
coordinné de platine, ou un radio-isotope.
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IL (1) IL82841A (fr)
IT (1) IT1208649B (fr)
LU (1) LU86919A1 (fr)
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