LU86919A1 - Coordinats et procedes en vue d'augmenter la proliferation des lymphocytes b. - Google Patents

Coordinats et procedes en vue d'augmenter la proliferation des lymphocytes b. Download PDF

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Description

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Γ ,· ,C ' 7r 7'1 ·:..κ λ\: ι· Η- DI: I L XFMBOLRG
-,ν· > ·' ri U ί Ιί * Bre\ et N *- U i M.^ eurk Ministre 1 V » - ! du 12 juin I9&7 I de l'Economie et des Claies Moyennes I , j Service de la Propriété intellectuelle
I Titre délivré , :¾.¾ LUXEMBOURG
\________... ,.1 .·*—-,7
Demande de Brevet d’invention ________________________.. . . ___________________________________________________________ (ii I. Requête
La société, dite..:........ONCQGEN,........société, .en -commandite,......3-005...-First <
Avenue, SEATTLE.,.......Washington......981.21,.....Etats-Unis .-d'Amérique, représentés par .Monsieur.....Jacques......de Muyser, -agissant en qualité .de mandataire-----------------------------------------------------------—.................—------------------------------ -..... ( 3i déposemt) ce .........douze ..juin 19.00 quatre-vingt....sept.................... ......- - « + à .15................heures, au Ministère de l'Économie et des Classes Moyennes, à Luxembourg: 1. la présente requête pour l'obtention d'un brevet d'invention concernant: "Coordinats et procédés en vue d'augmenter la prolifération ( 5i des ...lymphocytes.....E, "........................ .............................. ..... ..... -........................ -.................... ...... - 2. la description en langue......française....................... de l'invention en trois exemplaires: 3. 10 .............. planches de dessin, en trois exemplaires: 4. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le IQ juin 1987 ; 5. la délégation de pouvoir, datée de Sew York................................... le ...3.7 1987 ' 6. le document d'avant cause (autorisation ): déclaremti en assumant la responsabilité de cette déclaration, que l'(es) inventeur(s) est (sont): ( b' 1. Jeffrey A. LEDEETTER, 616N.W. 67 Street, SEATTLE,
Washington 98117., Etats-Unis d'Amérique .......
2, Eoward A. CLARK, 1505 16th East, SEATTLE, Washington 98112, .................Etats-Unis d'Amérique _... ......................................... ........................
\ revendique!nti pour la susdite demande de brevet la priorité d'une (des) demande(s) de ( 7) ............. brevet................................... ................. déposée(sten(8) aux. Etats-Unis d'Amérique le (9) 13 juin 1986 .......- ............................................ ......................................... . .........
sous le N° (10) 873.884 ................... ..........
au nom de (11 ) s inventeurs __ ........
élilféliscnt) domicile pour lui (elle) et. si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg ....
..........35, boulevard Royal . _ ..... . ......... (12i sollicite(nt) la délivrance d'un brevet d'invention pour l'objet décrit et représenté dans les annexes susmentionnées.
ayeiuqpumement de cette délivrance à 18 ................... ................................... mois. (131
Le déposant / mandataire: ......, . ............... .............. (14) ’ l 1 t i Î Π. Procès-verbal de Dépôt
La susdite demande de brevet d'invention a été déposée au Ministère de l'Économie et des Classes Moyennes. Service de la Propriété Intellectuelle àLuxemboure. en date du: 2 riuin 1987 /. fy\ / y. '««Vi % \ P T. le Ministre de l'Économie et des Classes Moyennes, μ / ^ . fit -.-..¾ %.\ à .. ..heures / J : , \ . p. d.
fv= : p-v'%- * 1 r j ^ -·. pt 'ïp * I Le chef du service de la propriété îmdkctuelk.
\ z · r~ · - ' .ie / U /
Ao-m»1"___N.**·/ ιΛ1+ / Ε\Β.Κ va .'N;- RELATIVES Al ff VetifolP'' ». s.. v i ha. DiTn<:nijr ck ci'vfi;;-· c <. ia dernandt ot Drevet pnnan;-.» N«_ ... di.. .. ' - .2 •r*^····. «r* non, Γτ,ίτκ»ιτ. r-:?»»·.** ddr-'>: J*. s'iCTP-iinO'JUT ior^ùUf «Tiitii'Ct es) un DatLI JLüÎ T fU té“* üer'nminatiL'D sflCItllc. lormc tüTidlimt x,rirî-ss: rli, siiPe Alliât i.irw.i» ir n-Tnxnneir *-» iir.,- T^'siT.nr ηΐΊτ>'·- - - '» nv.··,··.
/ . , - ' 52.671
REVENDICATION DE LA PRIORITE
* '1 ........ ...........................
de la demande de brevet / fëî Aux Etats-Unis d’Amérique •Du 13 juin 1986 (No. 873.884) ; Mémoire Descriptif déposé à l'appui d'une demande de
BREVET D’INVENTION
au
Luxembourg au nom de: ONCOGEN, société en commandite SEATTLE, Washington 98121 (Etats-Unis d’Amérique) pour: "Coordinats et procédés en vue d’augmenter la prolifération des lymphocytes B." • \ r , » *
Coordinats et procédés en vue d'augmenter la prolifération des lymphocytes B.
1. INTRODUCTION
La présente invention concerne des coordinats 5 tels que des molécules d'anticorps ou des fragments de molécules d'anticorps ou d'autres coordinats tels que les lymphokines qui se lient à un marqueur superficiel de lynphocytes B à 50kDa, désigné dans la présente spécification par l'appellation Bp50, qui inter-10 vient dans la prolifération des lymphocytes B., mais non dans l'activation précoce des lymphocytes B; La présente invention concerne également l'antigène Bp50 lui-même des lymphocytes B. Dans une forme de réalisation particulière de la présente invention, on décrit un anti-15 corps monoclonal, G28-5, qui définit Bp50 et semble jouer un rôle dans la prolifération des lymphocytes B activés^ sans cependant exercer aucun effet détectable sur la prolifération des lymphocytes B au repos.
Les coordinats tels que les anticorps, les 20 lymphokines et leurs fragments selon la présente invention peuvent être utilisés pour diriger et régler la prolifération et/ou la différentiation des lymphocytes B humains. En outre, les coordinats de la présente invention peuvent être modifiés par la fixation d'autres 25 composés qui peuvent être utilisés dans le traitement i 2 t et/ou la détection de cellules malignes qui expriment l'antigène Bp50.
2. FONDEMENT DE L'INVENTION
L'activation de lymphocytes B au repos de la 5 phase GQ à la phase du cycle cellulaire et l'amorçage ultérieur de la prolifération des lymphocytes B activés sont des étapes distinctes nécessitant des mécanismes de régulation également distincts. Certains agents, notamment le facteur -pl stimulant les lymphocytes 10 B murins (BSF-pl) (Rabin et al., 1985, Proc. Nat.
Acad. Sei. EUA 82, 2935-2939) ou de faibles doses d'anti-immunoglobuline (anti-Ig) (DeFranco, et al., 1985, J. Immunol. 135:87-94 ; Wetzel et al., 1984, J. Immunol. 133:2327-2332 ; DeFranco et al., 1982, 15 J. Exp. Med. 155:1523-1536 ; Muraguchi et al., 1984, J. Immunol. 132:176-180) sont des facteurs d'"activation" ou de "compétence". En d'autres mots, ces agents amènent les lymphocytes B à s'agrandir, à synthétiser plus d'acide ribonucléique et à entrer dans 20 G^, mais à eux seuls, ils ne provoquent pas la synthèse de l'acide désoxyribonucléique dans les lymphocytes B. D'autres facteurs de "croissance" tels que le facteur de croissance des lymphocytes B humains (BCGF) et 1 ' interleucine-2 (IL-2) amènent les lymphocytes B activés. 25 à traverser le cycle cellulaire et à entrer dans la phase S, mais ils ne déclenchent pas les lymphocytes B au repos (Kehrl et al., 1984, Immunol. Rev. 18:75-96 ; Muraguchi et al., 1984, J. Immunol. 132:176-180 ;
Zubler et al. 1984, J. Exp. Med. 160:1170-1183 ; 30 Jung et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1597-1604).
Un certain nombre de facteurs qui favorisent la croissance des lymphocytes B,ont été à présent décrits p.ar des chercheurs à la fois de systèmes murins et humains. Ces facteurs englobent des facteurs de 35 croissance de lymphocytes B (BCGF) dérivant de plusieurs 1 '* < 3 sources différentes, notamment des hybridomes ou des lignées de lymphocytes T, des lignées de lymphocytes B ou des cellules dendritiques. Bien qu'il ait été démontré qu'à la fois 1'interleucine-1 (IL-1) et 5 1'interleucine-2 (IL-2) augmentaient la croissance des lymphocytes B, elles sont apparemment distinctes de certains BCGF. Par exemple, des anticorps monoclonaux (mAb) dirigés contre un BCGF murin (O'Hara et al., 1985, Nature (Lond.) 315:333) ou un BCGF 10 humain (Ambrus et al., 1985, J. Exp. Med. 162:1319) bloquent l'activité de BCGF, mais non l'activité d'IL-1 ou d'IL-2. Bien qu'ils soient distincts d'IL-1 ou d'IL-2, les BCGF eux-mêmes semblent être hétérogènes sur la base de données biochimiques et 15 d'une activité différentielle sur différents sous-ensembles de lymphocytes B ou différents dosages de co-stimulation. Par exemple, on a identifié un BCGF humain de poids moléculaire élevé à 60 kilodaltons (kDa), BCGF (élevé), qui est distinct d'une forme 20 de faible poids moléculaire à 12 kDa, BCGF (faible) (Ambrus et al., 1985, J. Clin. Invest. 75:732).
L'acide c-désoxyribonucléique codant un BCGF murin à 20 kDa, appelé, avec une certaine hésitation, "facteur pl stimulant les lymphocytes B" (BSF-pl ), a 25 été récemment cloné et mis en séquence (Noma et al., 1986, Nature 319:640). Le recombinant lymphokine non seulement exerce une activité de BCGF, mais il peut également activer des lymphocytes B au repos et provoquer la différentiation de cellules productrices 30 d'IgG.^ ; dès lors, il diffère de BCGF humain (élevé) et de BCGF (faible) à la fois par son poids moléculaire et sa gamme d'activités.
Ces signaux d'activation et de croissance assurent probablement la régulation des cellules par 35 interaction avec des structures superficielles spéci- i t 4 , , ï fiques de lymphocytes B. Outre le signal spécifique à l'antigène passant à travers Ig superficielle, on a identifié plusieurs autres polypeptides superficiels candidats de lymphocytes B qui, d'une certaine 5 façon, peuvent agir dans l'activation ou la croissance des lymphocytes B. Par exemple, les récepteurs superficiels de cellules pour IL-1 (Dower et al., 1985, J. Exp. Med. 160:501) et IL-2 (Robb et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1126) ont été caractérisés et, 10 récemment, on a identifié des récepteurs fonctionnels d'IL-2 sur des lymphocytes B ( Zub 1er et al., 1984, J.
Exp. Med. 160:1170 ; Jung, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1597 ; Muraguchi et al., 1985, J. Exp. Med. 161:181). Toutefois, des récepteurs pour des facteurs 15 d'activation et de croissance des lymphocytes B doivent encore être complètement caractérisés. On a identifié plusieurs polypeptides superficiels candidats de lymphocytes B qui, d'une certaine façon, peuvent agir dans l'activation ou la croissance des lymphocytes B.
20 Par exemple, Subbarao et Mosier (Subbarao et al., 1983, Immunol. Rev. 69:81-97) ont trouvé que des anticorps monoclonaux (mAb) dirigés contre l'antigène Lyb2 des lymphocytes B murins activaient les lymphocytes B et, récemment, il a été donné une preuve suggérant 25 que Lyb2 pouvait être le récepteur pour BSF-pl (Yakura, 1985, Fed. Proc. 44:1532). De même, la Demanderesse a trouvé qu'un mAb approprié (1F5) dirigé contre un polypeptide à 35 kDa, Bp35, activait les lymphocytes B humains de la phase GQ à la phase G1 30 (Clark et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 82:1766-1770 ; Gollay et al., 1985, J. Immunol. 135:3795-3801). Des agrégats de C3d ou d'anticorps dirigés contre le récepteur de C3d à 140 kDa, Bpl40, provoquent la prolifération des lymphocytes B qui sont 35 dépendants des lymphocytes T (Melchers et al., 1985, 5 t
Nature 317:264-267 ; Nemerow et al., 1985, J. Immunol. 135:3068-3073 ; Frade et al., 1985, Eur. J. Immunol. 15:73-76). Bien que des BCGF aient été identifiés à la fois chez la souris et chez l'homme, les récep-5 teurs de ces .facteurs n'ont pas encore été isolés.
Wang et ses collaborateurs (Wang et al., 1979, J.
Exp. Med. 149:1424-1433) ont préparé des antisérums polyclonaux qui ont identifié un polypeptide à 54 kDa (gp54) sur des lymphocytes B humains et ils ont démontré 10 que les antisérums de lapin dirigés contre gp54 provoquaient la division des lymphocytes B amygdaliens. Récemment, Jung et Fu (Jung et al., 1984, J. Exp.
Med. 160:1919-1924) ont isolé un mAb (AB-1) dirigé contre un antigène à 55 kDa, restreint à des lymphocytes 15 B activés et bloquant la prolifération dépendant du BCGF. Toutefois, on ne sait pas encore si anti-gp54 ou AB-1 reconnaît ou non un récepteur de BCGF.
3. SOMMAIRE DE L'INVENTION La présente invention concerne des coordinats 20 qui (a) se lient à Bp50, à savoir un polypeptide superficiel spécifique aux lymphocytes B à 50 kDa décrit ici, et qui (b) augmentent la prolifération de lymphocytes B activés. L'invention concerne également l'antigène Bp50 lui-même qui est défini par l'anticorps 25 monoclonal G28-5 et qui agit dans la prolifération des lymphocytes B activés. En outre, l'invention concerne des coordinats qui viennent se lier à Bp50, mais qui n'exercent aucune fonction ni aucun effet biologique tel qu'une augmentation de la prolifération 30 de lymphocytes B activés.
Les coordinats de la présente invention englobent des molécules d'anticorps, des molécules d'anticorps monoclonaux et des fragments de ces molécules d'anticorps qui contiennent le site de 35 fixation de l'antigène ou des anticorps et des fragments Μ 6 si* / modifiés chimiquement ; ces fragments englobent, sans aucune limitation, Fv, Fab, F(ab')2, Fab' et analogues. En outre, les coordinats de la présente invention comprennent des lymphokines qui peuvent englober, 5 sans aucune limitation, des facteurs de croissance de lymphocytes B humains, de même que des lymphokines modifiées chimiquement. Les coordinats de la présente invention peuvent être modifiés chimiquement, par exemple, en reliant ou en couplant un composé avec 10 le coordinat. Ces composés englobent, sans aucune limitation, des agents cytotoxiques, des agents thérapeutiques, des agents chimiothérapeutiques, des marqueurs tels que des radiomarqueurs, des colorants, des enzymes, des composés opaques aux rayons X et analogues.
15 Sous leur forme modifiée ou non, les coordinats de la présente invention peuvent être utilisés pour assurer la direction, la régulation et la modification de la prolifération et/ou de la différentiation des lymphocytes B humains.
20 La présente invention est basée sur la découverte selon laquelle deux antigènes de différentiation des lymphocytes B humains, . à savoir Bp35 et l'antigène des lymphocytes B décrit ici, à savoir Bp50, jouent apparemment des rôles distinctifs en tant que 25 récepteurs de signaux dans l'activation des lymphocytes B. Des anticorps monoclonaux (mAb) dirigés contre Bp35 et Bp50 émettent tous deux des signaux positifs vers les lymphocytes B, stimulant ainsi leur transition à travers le cycle cellulaire. Tout comme les anti-30 corps anti-Ig, mAb dirigé contre Bp35 agit principalement pour activer les lymphocytes B au repos de telle sorte qu' ils deviennent compétent s pour entrer dans la phase du cycle cellulaire. En revanche, un anticorps monoclonal du type décrit ici ou son 35 fragment F(ab')2 dirigé contre Bp50, à savoir un poly- 7 ί .· * *
J
peptide à 50 kDa exprimé sur tous les lymphocytes B, agit pour stimuler des lynphocytes B activés afin qu' ils traversent le cycle cellulaire, tout en augmentant la prolifération des lymphocytes B activés.
5 Tout comme les anticorps anti-Ig, les anticorps monoclonaux dirigés contre Bp 35 activent les lymphocytes B amygdaliens et provoquent la prolifération des lymphocytes B à de faibles niveaux. En revanche, à lui seul, l'anticorps monoclonal anti-Bp50 n'active pas 10 les lymphocytes B, pas plus qu'il ne provoque la prolifération des lymphocytes B mais, conjointement avec les anticorps anti-Bp35 ou anti-Ig, il augmente la prolifération des lymphocytes B. A cet égard, l'action de l'anticorps anti-Bp50 ressemble à l'activité de 15 facteurs de croissance des lymphocytes B (BCGF). Une quantité aussi faible que 0,05yug/ml d'anti-Bp50 est nécessaire pour augmenter la prolifération et, tout comme un BCGF, anti-Bp50 est efficace même lorsqu'il est ajouté 12 à 24 heures après que les lymphocytes B 20 ont été activés avec anti-Ig ou anti-Bp35. Sans signaux exogènes supplémentaires, les anticorps anti-Bp35 et anti-Bp50 ensemble provoquent une forte prolifération· de lymphocytes B purifiés au repos. Ces résultats suggèrent que les molécules superficielles 25 de Bp35 et de Bp50 interviennent dans le contrôle de la régulation de l'activation et de la progression des lymphocytes B à travers le cycle cellulaire. Etant donné l'importance que les molécules anti-Bp35 et analogues ont sur l'effet et l'action des coordinats 30 de la présente invention, l'article de Clark et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA) 82:1766-1770 est mentionné ici à titre de référence.
Bien que l'activité d'anti-Bp50 ressemble à celle de BCGF (faible), étant donné qu'anti-Bp50 35 et BCGF (faible) sont tous deux co-stimulants avec 8 1 r - » « l les mêmes agents, mais non l'un avec l'autre et étant donné que anti-Bp50 et BCGF (faible) influencent tous deux uniquement les lymphocytes B activés et agissent sous une forme soluble, l'activité d'anti-Bp50 peut 5 être distinguée de celle de BCGF (faible), puisqu'aussi bien la prolifération des lymphocytes B stimulés avec des quantités optimales d'anti-Bp50 et d'anti-Bp35 (ou anti-Ig) peut être augmentée davantage avec BCGF (faible) et qu'à la fois des lymphocytes B du sang et 10 certains lymphomes de lymphocytes B réagissent différemment à anti-Bp50 vis-à-vis du BCGF. Pour exercer une activité optimale, anti-Bp50 doit être ajouté dans les 12 heures qui suivent l'activation des lymphocytes B, tandis que BCGF (faible) conserve une 15 activité optimale, même lorsqu'il est ajouté 24 heures après l'activation. En outre, Bp50 est exprimé sur tous les lymphocytes B, tandis que les récepteurs ou BCGF (faible) sont restreints à des lymphocytes B activés. Dès lors, en coordination, anti-Bp50 et BCGF (faible) 20 peuvent assurer la régulation de la croissance des lymphocytes B mai s, apparemment, ils se comportent de la sorte à l'intervention de signaux distincts.
Dans une forme de réalisation- de la présente invention, les coordinats qui se lient à Bp50 et qui 25 augmentent la prolifération de lymphocytes B activés, peuvent être utilisés pour augmenter une réponse immunitaire. Par exemple, ces coordinats qui se lient à Bp50, peuvent être utilisés comme "adjuvants" afin d'augmenter une réponse immunitaire à un vaccin. En 30 variante, ces coordinats peuvent être utilisés pour augmenter la réponse immunitaire d'un individu atteint d'immunosuppression.
Dans une autre forme de réalisation, les coordinats de l'invention peuvent être modifiés chimi-35 quement de telle sorte que les cellules auxquelles 9 , i ! ! ί i se lient les coordinats, soient tuées. Etant donné que tous les lymphocytes B expriment l'antigène Bp50, cette méthode devrait aboutir à la suppression de la réponse immunitaire. Par exemple, un médicament 5 cytotoxique relié à un coordinat de la présente invention peut être utilisé in vivo pour provoquer l'immunosuppression afin de franchir les barrières d'histocompatibilité chez des patients ayant reçu une greffe ; en variante, ces coordinats modifiés 10 peuvent être utilisés pour combattre des maladies auto-immunes.
Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, des malignités telles que des cellules tumorales exprimant Bp50, peuvent être 15 traitées en utilisant un coordinat de l'invention relié à un agent chimiothérapeutique utile pour le traitement d'une telle maladie néoplastique. Ces coordinats modifiés peuvent être utilisés in vivo pour diriger l'agent chimiothérapeutique vers n'im-20 porte quel type de cellules malignes qui exprime l'antigène Bp 50, y compris les cellules-qui ne sont pas des lymphocytes B, mais qui expriment Bp50. Lorsqu'on utilise les coordinats de l'invention, qui augmentent la prolifération des lymphocytes B, on devrait 25 bénéficier d'un avantage particulier lors du traitement des malignités des lymphocytes B lorsque l'agent chimiothérapeutique relié au coordinat est un agent plus efficace pour tuer les cellules qui prolifèrent; dans ce cas, on devrait obtenir une 30 potentialisation de l'effet du médicament.
En variante, les coordinats de l'invention peuvent être utilisés in vitro pour identifier ou séparer des cellules qui expriment l'antigène Bp50 et/ou pour déterminer, dans les humeurs de l'organisme, 35 la présence de l'antigène Bp50 qui peut être perdu 10 ί a ί ί ou non. En outre, les coordinats de l'invention peuvent être utilisés in vivo pour visualiser des cellules ou des tumeurs qui expriment l'antigène Bp 50.
5 L'antigène Bp50 purifié de la présente invention peut être utilisé pour former des anticorps, de même que pour former ou concevoir d'autres coordinats de l'invention. En outre, l'antigène Bp50 pourrait être utilisé dans des dosages tels que des 10 immuno-dosages diagnostiques. De plus, Bp50 lui-même peut être utilisé comme médiateur d'immunité cellulaire in vivo ou in vitro.
3.1. DEFINITIONS
Telles qu'elles sont utilisées dans la 15 présente spécification, les abréviations suivantes auront les significations indiquées : AO = Orangé d'acridine BCGF = Facteur de croissance des lymphocytes B BCGF ( élevé) = BCGF humain à 60 kDa 20 BCGF (faible) = BCGF humain à 12 kDa
Bp35 = Polypeptide (CD20) superficiel spécifique aux lyrnphocytes B à 35 kDa, défini par mAb 1F5 Bp50 = Polypeptide superficiel spécifique aux lymphocytes B à 50 kDa, défini par mAb G28-5 25 Fv = Région variable ou site de fixation de l'antigène d'une molécule d'anticorps.
Il peut s'agir là de n'importe quel fragment qui contient l'idiotype de la molécule, englobant, sans aucune limitation, Fab, 30 F(ab')g, Fab' et analogues.
IF = Immunofluorescence
Ig = Immunoglobuline IL-1 = Interleucine 1 IL-2 = Interleucine 2 35 kDa = Kilodalton * » 1 < 11 mAb = Anticorps monoclonal SDS-PAGE = Electrophorèse sur gel de polyacrylamide/ dodécyl-sulfate de sodium TPA = Acétate de 12-0-tétradécanoylphorbol-13.
5 4. DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1. L'expression de Bp50 est restreinte à Bp35 + lyrrphocytes B. L'analyse cytométrique à écoulement bicolore de 50.000 lymphocytes a été effectuée comme décrit (Clark et al., 1985, Proc. Nat.
10 Acad. Sei. EUA 82:1766-1770). On trace le diagramme des données par le nombre de lymphocytes vis-à-vis du logarithme de fluorescence verte et du logarithme de fluorescence rouge où 4-5 points représentent environ un doublage de fluorescence. Les données 15 sont présentées afin de montrer des cellules négatives autofluorescentes. La coloration PE (rouge) -anti-Bp35 (1F5) vis-à-vis de FITC (vert) -anti-Bp50 (G28-5) montre que toutes les cellules Bp50+ sont également Bp35+.
20 Figure 2. Comparaison biochimique du poly peptide de Bp50 avec d'autres antigènes superficiels de lymphocytes B. L'immunoprécipitation de Bp50 de cellules amygdaliennes marquées I en surface a été effectuée comme décrit. On a soumis des antigènes 25 isolés à une électrophorèse sur des gels en plaques de dodécyl-sulfate de sodium à 10%/polyacrylamide sans réduction. Les gels ont été visualisés par autoradiographie et avec des écrans renforçateurs. Tableau A : colonne 1, anti-Bp50 (G28-5) ; colonne 2, 30 anti-Bp95 (G28-8) ; colonne 3, Sépharose-chèvre anti-Ig de souris uniquement. Temps d'exposition : 4 jours. Tableau B : colonne 1, anti-Bp50 (G28-5) ; colonne 2, anti-Bp45 (BLASTE-2) ; colonne 3, anti-Bp39 (G28-1) ; colonne 4, anti-Bp39 (41-H16) ; colonne 5, 35 Sépharose-chèvre anti-Ig de souris uniquement. On i * » * 12 f a choisi un temps d'exposition de deux jours de telle sorte que les bandes des colonnes 2 à 4 ne soient pas surexposées et qu'elles puissent être distinguées clairement par rapport à Bp50. Une expérience sur 5 trois.
Figure 3. Analyse d'expression de Bp50 par immunofluorescence bicolore. Des cellules mononucléaires amygdaliennes ou de sang périphérique ont été isolées par centrifugation sur "Ficoll" et elles 10 ont été colorées avec G28-5 (anti-Bp50) conjugué à PE (rouge) en combinaison avec des anticorps de référence conjugués à la fluorescéine (vert), englobant 2C3 (anti-IgM) ; 1F5 (anti-Bp35) ; HBlOa (anti-DR) ; et 9,6 (anti-CD2, récepteur E). On a analysé les 15 cellules avec un FACS IV équipé d'amplificateurs logarithmiques à quatre décades à la fois dans les dimensions du rouge et du vert. On a utilisé un détecteur à spot mobile à angle en avant et à angle droit pour contrôler les monocytes. Les cellules non colorées 20 sont placées sur le dos de la grille la fluorescence rouge est à droite et la fluorescence verte, à gauche.
Figure 4. Courbes de réponse à la dose pour l'augmentation de la prolifération de lymphocytes B Er- amygdaliens denses par des anticorps anti-25 Bp50 comme indiqué : milieux uniquement ; anti-Bp50 uniquement plus anti-Bp35 (5yug/ml) uniquement ; BCGF uniquement ; anti-Bp35 plus BCGF ; anti-Bp35 plus doses graduées d'anti-Bp50. La prolifération moyenne + erreur type de quatre échantillons a été 30 mesurée le jour 3.
Figure 5. Les mAb anti-Bp50 sont les plus efficaces pour l'augmentation de la prolifération s'ils sont ajoutés après un signal d'activation de lymphocytes B. On a incubé de s lymphocytes B Er- amygda-35 liens denses pendant 4 jours avec des milieux unique- « ' » * 13 ment, on a ajouté anti-Bp50 (0,5yag/ml) à différents moments après l'incubation, on a ajouté anti-Bp35 (5yjg/ml) à différents moments après l'incubation ; on a maintenu anti-Bp50 à une valeur constante puis, 5 plus tard, à différents moments, on y a ajouté anti-
Bp35 ; on a maintenu anti-Bp35 à une valeur constante puis, à différents moments, on a ajouté anti-Bp50 à des cultures. Au cours des 10 dernières heures, <3 on a ajouté la H-thymidine et on a mesuré son incor-10 poration.
Figure 6. Comparaison de l'aptitude d'anti-Bp35. et d'anti-Bp50 à amene-r de s lymphocytes B amygdaliens au repos à quitter le stade Gq du cycle cellulaire. Le jour 3 après le traitement, milieux uniquement 15 (_), anti-Bp35 uniquement (-----) ; et anti-Ig uniquement (.....), A, pas d'additifs supplémentaires ; B, on a ajouté anti-Bp50 (0,5 ^ig/ml) à chaque groupe ; C, on a ajouté 5% de BCGF à chaque groupe. Les données sont reprises sous forme de diagrammes du nombre rela- 20 tif de cellules vis-à-vis du logarithme de fluorescence rouge d'Orangé d'acridine (acide ribo-nucléique).
Figure 7. Cinétique de prolifération des lymphocytes B après stimulation avec anti-Bp50 vis-à-25 vis de BCGF. On a stimulé des lymphocytes B E- amygda-liens denses avec des milieux uniquement ; 10% de BCGF uniquement ; anti-Bp35 uniquement ; anti-Bp50 uniquement ; anti-Bp35 + 10% de BCGF ; anti-Bp35 + anti-Bp50 ; et anti-Bp35 + anti-Bp50 + 10% de BCGF.
30 On a mesuré la prolifération aux jours indiqués, par 3 une impulsion de 18 heures de H-thymidine. On a mesuré la prolifération en quadruplication et les erreurs types sont indiquées. Une expérience sur trois.
14 ί . » *
Figure 8. Temps s'écoulant après stimulation par anti-Bp35 lorsque anti-Bp50 (A) ou BCGF (B) augmente la prolifération de manière optimale. On a stimulé des lymphocytes B E- amygdaliens denses comme indiqué 5 et on a mesuré la prolifération par une impulsion 3 de 18 heures de H-thymidine le jour 3. Milieux ; anti-Bp35 uniquement ajouté aux temps indiqués ; anti-Bp50 ou BCGF uniquement ; anti-Bp35 ajouté au début de la culture, puis addition d'anti-Bp50 ou de BCGF 10 aux temps indiqués ; anti-Bp50 ou BCGF ajouté au début de la culture, puis addition d'anti-Bp35. Une expé--rience sur deux. On .a mesuré la prolifération en quadruplication et les erreurs types sont indiquées. Doses utilisées : anti-Bp35, 5 g/ml ; anti-Bp50, 15 0,2yjg/ml ; BCGF (faible) 5%. Les concentrations utilisées étaient les suivantes : anti-Bp35, 5 ^ig/ml ; anti-Bp50, 0,2yag/ml ; BCGF, 5%.
Figure 9. Anti-Bp50 et BCGF exercent des effets additifs sur la prolifération des lymphocytes B.
20 Des lymphocytes B E- amygdaliens denses ont été stimulé s avec des doses graduées de BCGF (faible) conjointement avec anti-Bp50 uniquement ; anti-Bp35 uniquement ; perles d'anti-Ig uniquement ; anti-Bp35 + anti-Bp50 ; ou anti-Bp50 + anti-Ig. La prolifération a 25 été mesurée le jour 3 après stimulation avec une 3 impulsion de 18 heures de H-thymidine. On a mesuré la prolifération en quadruplication et les erreurs types sont indiquées. Une expérience sur quatre.
6
Doses utilisées pour 10° cellules.: anti-Bp35, 5 ^ug/ml ; 30 anti-Bp50, 0,2^ug/ml ; perles d'anti-Ig, 50^ig/ml.
Figure 10. Effets comparatifs d'anti-Bp50 et de BCGF sur des lymphocytes B normaux et malins.
On a stimulé des lymphocytes B E-de sang périphérique (A) ou des lymphocytes B E- amygdaliens denses (C) 35 avec ou sans TPA (75 ng/ml) en présence de 10% de 15 c * K ** BCGF ou 1 yug/ml d'anti-Bp50. Deux lymphomes séparés de lymphocytes B (tableaux B et D) ont été stimulés de la même manière. On a mesuré la prolifération le 3 jour 3 par incorporation de H-thymidine au cours 5 d'une impulsion de 12 heures. On a mesuré la prolifération en quadruplication et les erreurs types sont indiquées.
5. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention concerne des coordinats 10 qui (a) se lient à Bp50, qui est un polypeptide superficiel spécifique aux lymphocytes B à 50 kDa, et qui (b) augmentent la prolifération de lymphocytes B activés. L'invention concerne également l'antigène Bp50 lui-même qui est défini par mAb G28-5 et qui agit dans 15 la prolifération des lymphocytes B. En outre, l'invention concerne des coordinats qui se lient à Bp50, mais qui n'exercent ni une fonction, ni un effet biologique tel que l'augmentation de la prolifération de lymphocytes B activé s.
20 Les coordinats de la présente invention englobent des molécules d'anticorps, des molécules d'anticorps monoclonaux et des fragments de ces molécules d'anticorps, qui contiennent le site de fixation de l'antigène venant se lier au récepteur 25 de Bp50, y compris les anticorps et les fragments modifiés chimiquement; ces fragments englobent, sans aucune limitation, Fv, Fab, F(ab')2, Fab' et analogues. En outre, les coordinats de la présente invention comprennent des lymphokines venant se lier au récepteur 30 de Bp50. Ces coordinats peuvent englober, sans aucune limitation, les BCGF, de même que des lymphokines modifiées chimiquement et analogues. Les coordinats de l'invention peuvent être utilisés sous leurs formes modifiées ou non pour assurer la modulation et la 35 régulation de réponses immunitaires, ainsi que dans la t * 16 thérapie de malignités exprimant l'antigène Bp50.
Ces utilisations sont décrites plus en détail dans le paragraphe 5.4 ci-après.
Lorsque le coordinat est un anticorps mono-5 clonal ou un fragment de cet anticorps, on peut préparer l'anticorps monoclonal contre Bp50 en adoptant n'importe quelle technique assurant la production de molécules d'anticorps par des lignées de cellules continues en culture. Par exemple, la technique aux 10 hybridomes initialement élaborée par Köhler et Milstein (1975, Nature 256:495-497), ainsi que d'autres techniques qui ont été mises plus récemment à disposition telles que la technique aux hybridomes des lymphocytes B humains (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) 15 et la technique aux EBV-hybridomes pour la production d'anticorps monoclonaux humains (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan. R.
Liss, Inc., pages 77-96) et analogues rentrent dans le cadre de la présente invention.
20 Des fragments d'anticorps contenant l'idiotype de la molécule pourraient être engendrés par des techniques connues. Par exemple, de tels fragments englobent, sans aucune limitation : le fragment F(ab')g qui peut être engendré en traitant la molécule 25 d'anticorps avec de la pepsine ; les fragments Fab' qui peuvent être engendrés en réduisant les ponts disulfures du fragment F(ab')2 ; le fragment F(ab')2 qui peut être engendré en traitant la molécule d'anticorps avec la papaïne ; et les fragments 2Fab ou Fab 30 qui peuvent être engendrés en traitant la molécule d'anticorps avec la papaïne et un agent réducteur pour réduire les ponts disulfures.
Lorsque le coordinat qui se lie à Bp50, est une lymphokine, celle-ci peut être obtenue à partir 35 de sources naturelles ou^si sa séquence d'amino-acides ί ‘ ' 4 * r 17 est connue ou déduite, la lymphokine peut être synthétisée par des méthodes de synthèses chimiques. En variante, si la séquence des gènes de la lymphokine est connue, on peut adopter des techniques à l'acide 5 désoxyribonucléique recombinant pour cloner le gène dans un vecteur d'expression assurant la transcription et la translation de la séquence de gènes dans une cellule hôte appropriée.
Suivant son utilisation envisagée, le coor-10 dinat ou des fragments appropriés du coordinat peuvent être modifiés chimiquement en fixant l'un ou l'autre composé faisant partie d'une variété au coordinat en adoptant des techniques de couplage connues. De telles techniques peuvent englober, sans aucune limi-15 tation, l'utilisation du carbodiimide, du bromure de cyanogène, de réactifs difonctionnels tels que le glutaraldéhyde, de 3-(2-pyridyldithio)propionate de N-succinimidyle (SPDP'), des réactions de bases de Schiff, la fixation à des fractions sulhydryle, 20 l'utilisation d'isothiocyanate de sodium ou une liaison enzymatique, pour n'en citer que quelques-uns. Lorsqu'un radioisotope doit être fixé au coordinat, on peut également recourir à des moyens enzymatiques, à une substitution oxydative, à une chélation, 25 etc. Pour obtenir un aperçu des réactifs chimiques que l'on peut utiliser pour la modification des protéines, on se référera à Lundblad et Noyés,
Chemical Reagents for Protein Modification, volume II, CRC Press, Inc., Boca Raton, Floride, chapitre 30 5, pages 123-139, 1984.
Le couplage ou la liaison chimique d'un composé au coordinat pourrait être dirigé vers un site du coordinat qui ne participe pas à la liaison à Bp50. A cet effet, on pourrait protéger le site 35 de fixation du coordinat avant d'effectuer la réaction w 18 * * ' * * de couplage. Par exemple, le coordinat peut être tout d'abord lié à Bp50 afin de protéger le site de fixation de Bp50, après quoi la réaction de couplage peut être effectuée pour relier le composé désiré 5 aux sites réactifs disponibles sur le complexe coor- dinat/Bp50. Dès que la réaction de couplage est achevée, le complexe peut être rompu, engendrant ainsi un coordinat modifié auquel le composé désiré est fixé, exerçant ainsi une influence minimale sur 10 le site de la molécule, sur lequel se fixe Bp50.
Lorsque le coordinat comprend un anticorps monoclonal tel que G28-5, dans lequel le domaine Fc de la molécule n'est pas requis pour que le coordinat exerce son effet (voir paragraphe 5.3.3 ci-après), il peut 15 être avantageux de diriger le couplage des composés désirés vers le domaine Fc de la molécule.
Les sous-paragraphes ci-après décrivent le nouveau marqueur superficiel de lymphocytes B à 50 kDa, à savoir Bp50, qui apparemment agit dans la prolifération 20 des lymphocytes B, ainsi que des coordinats qui se lient au nouveau récepteur à 50 kDa, ainsi que leurs utilisations. Pour donner un exemple des coordinats de la présente invention, on décrit également un anticorps monoclonal qui définit Bp50, ainsi que ses 25 fragments FCab')^ qui, tout comme BCGF, augmentent la prolifération des lymphocytes B. Contrairement à mAb anti-Bp35 qui peut amener des lymphocytes B au repos dans la phase Gq,ù entrer dans la phase G^, mAb anti-Bp50 n'active pas les lymphocytes B au 30 repos. Les mAb anti-Bp35 et anti-Bp50 ensemble, sans aucun signal exogène supplémentaire, provoquent une forte activation et une forte prolifération des lymphocytes B purifiés.
Les expériences décrites ci-après démontrent 35 également que l'activité anti-Bp50 ressemble à l'activité
4 X
’ i 19 BCGF, mais que anti-Bp50 est distinct d'un BCGF, étant donné qu'anti-Bp50 et BCGF de faible poids moléculaire sont nettement additifs et agissent différemment sur différents sous-ensembles ou malignités de lymphocytes 5 B. Bp50 peut être un récepteur pour un BCGF distinct ou pour un signal transmembrane qui module la production de BCGF ou l'expression du récepteur de BCGF.
5.1. METHODES ADOPTEES POUR CARACTERISER LE RECEPTEUR Bp50 10 Préparations de cellules. On a isolé des cellules mononucléaires de sang périphérique normal ou leucémique hépariné par des gradients de Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ). On a obtenu des cellules mononucléaires à partir de 15 tissus amygdaliens comme décrit par Clark et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 82:1766-1770. On a épuisé des lymphocytes T avec formation de rosettes d'érythrocytes de mouton traités par AET (bromhydrate de bromure d'amino-éthyl-isothiuronium) et par sépara-20 tion à gradient de Ficoll-Hypaque. Dans certaines expériences, des lymphocytes B du sang ont été enrichis en isolant des cellules adhérant à de la laine de nylon. On a éliminé les monocytes par incubation sur des boîtes de Petri en matière plastique une ou 25 deux fois à 37°C pendant 45 minutes, sauf indication contraire. On a isolé des fractions de lymphocytes B amygdaliens flottants ou denses par des gradients échelonnés de Percoll comme décrit par Clark et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 82:1766-1770. Des 30 préparations de lymphocytes B amygdaliens denses comportaient logiquement plus de 95% de cellules slg+ Bp35+. Des préparations enrichies de lymphocytes B du sang comportaient 60-85% de cellules slg+.
On a isolé des cellules lymphoïdes de lymphocytes 35 B en dissociant modérément des cellules lymphoïdes 20 - ; * en milieu, en procédant ensuite à une centrifugation à gradient de Ficoll-Hypaque.
Anticorps monoclonaux. On a engendré l'anticorps G28-5 dirigé contre Bp50 en immunisant des souris 5 BALB/c avec des lymphocytes E- amygdaliens humains et en fusionnant des cellules spléniques immunes avec le myélome NS-1 (Köhler et al., 1975, Nature 256:495-497 ; Ledbetter et al., 1979, Immunol. Rev.
47:63-82). Des cultures de cellules hybrides 10 sécrétant un anticorps réagissant avec des lymphocytes B amygdaliens et non avec des lymphocytes T ont été identifiées en utilisant l'immunofluorescence indirecte (IF) et une analyse avec un sélecteur de cellules FACS IV ; des cultures comportant un anticorps donnant 15 des tracés d'histogrammes semblables à ceux de mAb connus dirigés contre des pan-marqueurs de lymphocytes B (par exemple, Bp35) ont été clonées et sélectionnées pour des études complémentaires. Le clone de G28-5 a produit un mAb d'IgG1 qui a réagi uniquement avec 20 des lignées de lymphocytes B ou des lymphocytes B normaux ou malins. D’autres mAb utilisés lors de cette étude ont été décrits en détail par Clark et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 82:1766-1770 ;
Clark et al., 1986, Human Immunol. 16:100 ; Ledbetter 25 et al., 1986, Human Immunol. 15:30-44 ; Ledbetter et al., 1985, dans Perspectives in Immunogènetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, pages 325-340. Ces anticorps monoclonaux englobent 1F5 (lgG2a) anti-Bp35, HBlOa (lgG2a), anti-HLA-DR, 2C3 30 (lgG1) anti-chaîne yu, G19-4 (IgG^) anti-CD3, FC-2 (IgG2a) anti-récepteur de Fc CD16 et 9,6 (IgG2&) anti-CD2 (récepteur E) fournis par le Docteur Paul Martin (Martin et al., 1983, J. Immunol. 131:180).
On a purifié les mAb d'IgG^ par précipitation en 35 utilisant du sulfate d'ammonium saturé à 45 ou 50% Λ 1 21 ' J. *
J
et une chromatographie en colonne de DEAE-Sephacryl et l'on a purifié les mAb d'IgG2a en utilisant des colonnes de Sépharose enduit de Protéine A. On a préparé les fragments F(ab')2 de G28-5 par la méthode de 5 Parham (Parham, et al., 1983, J. Immunol. 131:2895), on les a purifiés dans une colonne de Sephacryl S200 de 2 mètres de long et on en a déterminé la pureté par SDS-PAGE (Ledbetter et al., 1985, J. Immunol. 135:1819). Le mAb 2C3 dirigé contre des chaînes yj 10 a été conjugué avec des perles de Sépharose 4B
(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suède) en utilisant un couplage au bromure de cyanogène.
Conjugaisons à la fluorescéine et à la phycoérythrine . Des mAb purifiés ont été soit directement 15 conjugués avec la fluorescéine en utilisant l'iso- thiocyanate de fluorescéine (FITC ; Molecular Probes) (vert) par la méthode de Goding (Goding, et al., 1976, J. Immunol. Meth. 13:215-226), soit conjugués à la R-phycoérythrine (PE) (rouge) en utilisant SPDP 20 (Pharmacia) selon une méthode que la Demanderesse a décrite en détail dans Ledbetter et al., 1985, dans Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI,'New York, 6, 119-129. On a incubé des cellules lymphoïdes dans des plaques de microtitrage 25 à fond rond pendant 30 minutes avec une dilution appropriée de mAb vert et/ou rouge, on les a lavées deux fois, puis on les a analysées dans un sélecteur de cellules FACS IV.
Immunofluorescence bicolore. On a pratiqué 30 des études bicolores avec un sélecteur de cellules activées par fluorescence (FACS IV: Becton-Dickinson, Mountain View, CA) en utilisant un miroir dichroïque à 560 nm pour diviser le faisceau et un filtre à passage long 580 et un filtre à passage court 540 35 (Ditric Optics, Hudson, MA) devant les tubes photo- t 1 • i 22 » multiplicateurs du rouge et du vert respectivement.
En outre, on a utilisé un compensateur bicolore (T. Nozaki, Stanford University) en vue de corriger les débordements mineurs des signaux verts et rouges.
5 Pour chaque coloration bicolore, on a recueilli des données de 40.000 cellules et on les a mémorisées sur des disques souples. Les données sont présentées sous forme d'un nombre de cellules (vertical) vis-à-vis du logarithme de fluorescence verte vis-à-vis 10 du logarithme de fluorescence rouge sur une grille à 64 x 64 points. Une valeur d'environ 4,5 points représente un doublage de fluorescence. Des cellules non colorées sont situées au coin arrière de la grille ; la fluorescence rouge est à droite et la 15 fluorescence verte, à gauche. Le système de cytométrie à écoulement pour l'immunofluorescence bicolore avec la fluorescéine et la phycoérythrine est décrit plus en détail par Ledbetter et al., 1985, dans Perspectives in Immunogènetics and Histocompatibility, 20 ASHI, New York, 6, 119-129 et 325-340.
Culture de cellules. On a cultivé des cellules lymphoïdes amygdaliennes ou du sang à 5-5 10 x 10 ml en quadruplication dans des plaques de microtitrage à 96 réservoirs contenant 200 yal de 25 milieu RPM1-1640 additionné de 15% de sérum bovin foetal, d'antibiotiques, de glutamine et de pyruvate (R15). Après 1 à 7 jours, on a pulsé des cellules 3 avec 0,5yaCi de H-thymidine par réservoir (New England Nuclear, 6,7 Ci/millimole ; 1 Ci = 37) pendant 30 18 heures. On a ensuite récolté les cellules sur des filtres en fibres de verre avec un récolteur et on a mesuré la radioactivité dans un compteur à scintillation. Dans certaines expériences, on a ajouté des anticorps ou des facteurs à différents moments 35 après le début des cultures ; au cours de ces expériences, * i 23 ' i * / on a mesuré la prolifération au jour 3.
Facteurs co-stimulants. On s'est procuré un BCGF purifié auprès de "Cytokine Technology" (Buffalo, New York), ne contenant aucune activité 5 détectable d'IL-1, d'IL-2 ou d'interféron. Ce BCGF a été préparé par le procédé de Maizel et ses collaborateurs (Maizel et al., 1982, Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 79:5998) qui ont démontré que l'activité majeure de BCGF dans cette matière résidait dans une espèce à 10 12 kDa appelée ci-après "BCGF (faible)" (Mehta et al., 1985, J. Immunol. 135:3298). Les étapes de purification comportaient une chromatographie d'affinité de DEAE à l'échelle de préparation, suivie d'une chromatographie en colonne d'hydroxylapatite. IL-1 15 à l'état pur jusqu'à homogénéité a été le don généreux du Docteur Steven Dower (Dower, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:501). IL-2 recombinant a été aimablement -fourni par "Cetus Corporation". TPA (acétate de 12-0-tétradécanoyl-phorbol-13) a été fourni par 20 "Sigma".
Détection de l'activation des cellules.
On a mesuré des changements provoqués dans le volume des cellules par mAb et/ou des facteurs en utilisant un sélecteur de cellules et un détecteur à spot 25 mobile à angle en avant. On a mesuré des changements de cycle cellulaire dans des teneurs en acide ribo-nucléique et en acide désoxyribonucléique cellulaires en colorant des cellules activées avec de l'Orangé d'acridine et en mesurant les teneurs relatives en 30 acide ribonucléique (rouge) et en acide désoxyribo nucléique (vert) cellulaires avec un sélecteur de cellules selon la méthode de Darzynkiewicz et al. (Darzynkiewicz, et al., 1980, Proc. Nat. Acad. Sei.
EUA 77:6697-6702). Les changements intervenant dans 35 les teneurs relatives d'antigènes superficiels de
L X
24 ' * '*
J
cellules ont été contrôlés en utilisant un mAb directement conjugué avec la fluorescéine, puis on les a quantifiés par des teneurs d'immunofluorescence directe avec un sélecteur de cellules Epies V.
5 Caractérisation biochimique de Bp50. L'im munoprécipitation de Bp50 hors de cellules amygdalien-nes marquées en surface a été effectuée comme décrit par
Ledbetter et al., 1985, J. Immunol. 134:4250-4254.
On a soumis des antigènes isolés à une électrophorèse 10 sur des gels en plaques de SDS à 10%/polyacrylamide sans réduction. Les gels ont été visualisés en recourant à une autoradiographie à -70°C et des écrans d'allègement plus renforcement Cronex (Dupont).
5.2. CARACTERISATION DU RECEPTEUR Bp50 15 Les sous-paragraphes ci-après décrivent les résultats des expériences effectuées en adoptant les méthodes décrites ci-dessus.
5.2.1. IDENTIFICATION D'UN MARQUEUR SUPERFICIEL DE CELLULES à 50 kDa,SPECIFIQUE AUX LYMPHOCYTES 2° B, Bp50
On a élevé un anticorps mAb dirigé contre Bp50 en immunisant des souris BALB/c avec des lymphocytes amygdaliens humains et en fusionnant des cellules spléniques immunes avec le myélome de NS-1. Un 25 clone, G28-5, a produit un mAb d'IgG^ qui ne contenait pas la chaîne légère de NS-1. Lors d'un examen minutieux pratiqué par analyse d'immunofluorescence, on a trouvé que G28-5 réagissait uniquement avec des lignées de lymphocytes B ou des lymphocytes B normaux 30 ou malins. Une très large sélection de tissus normaux par des méthodes établies (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 82:1766-1770 ; Ledbetter et al., 1986, Human Immunol. 15:30-44 ; Ledbetter, 1985, dans Perspectives in Immunogènetics and Histocompatibility, 35 ASHI, New York, 6, pages 325-340) a révélé que l'anti- 25 > * corps G28-5 réagissait avec des cellules négatives formant des rosettes E (Er-) provenant du sang ou des amygdales, mais non avec des lymphocytes T n'adhérant pas à la laine de nylon, des blastes de 5 lymphocytes T provoqués par PHA (= phytohémagglutinine) ou avec des granulocytes du sang, des monocytes, des globules rouges ou des plaquettes. Il a réagi fortement avec toutes les sept lignées de cellules lymphoblastoïdes B soumis à l'essai et avec trois 10 lignées de lymphomes de Burkitt (Raji, Daudi, Namalwa), mais non avec quatre lignées de lymphocytes T (CEM, HSB-2, JURKAT et HPB-ALL). Toutes les leucémies lymphocytiques chroniques soumises à l'essai (3/3) et 90% (9/10) de lymphomes B soumis à l'essai ont 15 exprimé le marqueur Bp50, tandis que 28% (2/7) seulement de leucémies lymphocytiques aiguës non T, non B CALLA+ ont exprimé Bp50.
La répartition restreinte de Bp50 sur des tissus normaux a été confirmée davantage par des 20 analyses quantitatives d'immunofluorescence bicolore (IF bicolore). En utilisant un anticorps (rouge) conjugué à la R-phycoérythrine (PE) et dirigé contre le pan-antigène Bp35 de lymphocytes B (Bl, CD20) et l'anticorps (vert) anti-Bp50 conjugué à la fluorescéine, 25 la Demanderesse a trouvé que Bp50 était exprimé uniquement sur des lymphocytes B Bp35+ (figure 1) dans le sang ou les amygdales. Les lymphocytes B du sang ont exprimé logiquement Bp50 à des concentrations quelque peu inférieures à celles de lymphocytes 30 B amygdaliens, ce qui est semblable à l'expression de HLA-DR (Ledbetter et al., 1986, Human Immunol. 15:30-44) et à l'expression de gp54 (Wang, et al., 1979, J. Exp. Med. 149:1424-1433), qui sont également plus faibles sur les lymphocytes B du sang. Bp50 35 a été exprimé à des concentrations semblables sur i > 26 * des sous-populations de lymphocytes B amygdaliens séparées sur des gradients de Percoll en fractions flottantes et denses. En utilisant le mAb conjugué à PE et dirigé contre le marqueur de lymphocytes T, 5 CD3(T3) et le marqueur associé aux ' cellules NK, CD16(récepteur de Fc) (Ledbetter, et al., 1979,
Immunol. Rev. 47:63-82), la Demanderesse a trouvé que Bp50 n’était pas exprimé sur les lymphocytes T ou les cellules NK. En faisant appel à 1’immuno-10 fluorescence bicolore, la Demanderesse a également trouvé que des blastes de CD3+ PHA qui ont exprimé des concentrations élevées de récepteurs d’IL-2, n’exprimaient pas Bp50.
L’anticorps G28-5 a réagi avec un seul 15 polypeptide sur des lymphocytes amygdaliens qui ont migré à environ 50 Kd dans des conditions non réductrices (figure 2A). Cette molécule est plus grosse que celle des marqueurs de lymphocytes B mentionnés précédemment, dans le même intervalle de poids molé-20 culaires, tels que Bp39 ou Bp45 (Zipf, et al. 1983, J. Immunol. 131:3064-3072 ; Kitner, et al., 1981,
Nature 294, 458-460 ; Clark, et al., 1986, dans Leukocyte Typing .II, eds. Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlin, chapitre 12, volume 2, 155-167 ;
25 Slovin, et al., 1982, Proc. Nat. Acad. Sei. EUA
79:2649-2653 ; Thorley-Lawson, et al., 1985, J. Immunol. 134:3007-3012, et figure 2B). Le temps d’exposition pour ce gel a été sélectionné de telle sorte que les poids moléculaires des autres marqueurs de lymphocytes 30 B puissent être comparés aisément avec Bp50. Contrai tement à Bp50, le marqueur Bp39 est exprimé sur des granulocytes et, contrairement à Bp50, Bp45 est restreint aux blastes de lymphocytes B. Des anticorps dirigés contre Bp39 (41-H16) et Bp45 (MNM6, blaste-1, 35 blaste-2) fournis par un groupe de travail international
Jl * 27 . * (Clark, et al., 1986, dans Leukocyte Typing II, eds. Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlin, chapitre 12, volume 2, 155-167) n'ont pas bloqué la liaison d'anticorps anti-Bp50 traités à la fluorescéine, à 5 des lymphocytes B. Dès lors, sur la base de la répartition des tissus, de l'analyse biochimique et d'études de blocage, l'anticorps monoclonal G28-5 reconnaît une structure à 50 Kd distincte de celle d'autres antigènes connus de lymphocytes B.
10 5.2.2. L'EXPRESSION DE Bp50 EST RESTREINTE
AUX LYMPHOCYTES B.
Des études de répartition de lignées de cellules et de tissus hématopoïétiques, ainsi que des analyses cytométriques détaillées à écoulement bicolore ont 15 révélé que Bp50 était exprimé uniquement sur des lymphocytes B. Comme illustré en figure 3, Bp50 est exprimé sur un petit sous-ensemble de lymphocytes du sang et sur une grande population de lymphocytes amygdaliens. Pratiquement tous les lymphocytes Bp50+ 20 à la fois du sang et des amygdales ont également exprimé Bp35 et HLA-DR, mais ils n'ont pas exprimé les molécules de lymphocytes T, CD2 (figure 1) ou CD3, non plus que les récepteurs Fc d'IgG qui se trouvent sur les cellules NK. De plus, des blastes 25 de lymphocytes T CD3+ activés par ConA ont exprimé des récepteurs d'IL-2, mais non Bp50,
Des analyses cytométriques à écoulement bicolore permettent la mesure quantitative de la relation de densité entre deux antigènes superficiels.
30 La Demanderesse a indiqué précédemment que les lymphocytes B denses au repos situés dans la zone périphérique de follicules secondaires exprimaient IgM et de faibles concentrations de Bp35, tandis que les lymphocytes B activés flottants se trouvant dans le centre germinatif 35 sont IgM-négatifs et expriment des concentrations 28
J
' l '* élevées de Bp35 (Ledbetter, et al., Human Immunol. 15:30). La figure 3 montre qu'à la fois des sous-ensembles de lymphocytes B IgM-positifs et IgM-néga-tifs ont exprimé Bp50 en quantités égales, indiquant 5 ainsi que Bp50 est exprimé à la fois sur des lympho cytes B au repos et des lymphocytes B activés in vivo.
5.3. AUGMENTATION DE LA PROLIFERATION DES LYMPHOCYTES B AVEC L'ANTICORPS ANTI-Bp50.
Ainsi qu'on l'a exposé précédemment, des 10 lymphocytes B peuvent être activés avec de faibles doses d'anticorps spécifiques aux chaînes anti-ya. Récemment, la Demanderesse a découvert que le marqueur Bp35 (Bl) spécifique aux lymphocytes B, à savoir un polypeptide à 35 kDa, pouvait également remplir sa 15 fonction lors de l'activation précoce des lymphocytes B : tout comme de faibles doses d'anticorps anti-ya, le mAb 1F5 dirigé contre Bp35 active les lymphocytes B de telle sorte que leur volume et leur teneur en acide ribonucléique augmentent et afin qu'ils devien-20 nent sensibles au BCGF (Clark, et al., 1985, Proc.
Nat. Acad. Sei. EUA 82:1766-1770 ; Gollay, et al., 1985, J. Immunol. 135:3795-3801). En conséquence, il a été intéressant de comparer l'effet du mAb anti-Bp50 dans la prolifération de lymphocytes B non traités 25 ou de lymphocytes B activés soit avec des anticorps anti-Bp35, soit avec des anticorps anti-ya (tableau 1). Dans des conditions appropriées uniquement, des anticorps anti-Bp35 en solution ou des anticorps anti-ya fixés à des perles de Sépharose pourraient stimuler 30 une certaine prolifération de lymphocytes B (tableau 1, ligne 1) ; en revanche, des anticorps anti-Bp50 seuls n'ont pas stimulé la prolifération (tableau 1, ligne 2). Toutefois, mAb anti-Bp50 a augmenté considérablement la prolifération lorsqu'il a été cultivé 35 avec des perles anti-ya ou avec anti-Bp35. A cet égard, - * Λ ι 29 anti-Bp50 ressemblait à BCGF (tableau 1, ligne 3).
Dès lors, il a été important de déterminer si anti-Bp50 et BCGF ensemble pouvaient provoquer la prolifération des lymphocytes B. Comme illustré dans le 5 tableau 1, ligne 4, anti-Bp50 et BCGF ensemble n'ont provoqué aucune prolifération, mais ils ont augmenté la prolifération de cellules activées par anti-yj ou anti-Bp35 à un degré quelque peu supérieur à l'un ou l'autre stimulant seul. Dans un intervalle à 10 trois logarithmes et lorsqu'il a été utilisé avec anti-Bp50 sans autres signaux, BCGF n'a eu aucun effet sur la prolifération de lymphocytes B denses, même lorsqu'on a utilisé anti-Bp50 à des doses se situant dans l'intervalle allant de 0,1 à 10yug/ml.
15 TABLEAU 1
Augmentation de la prolifération des lymphocytes B, provoquée par anti-Ig ou anti-Bp35, avec des anticorps anti-Bp50 20 Prolifération moyenne + erreur type de lymphocytes B cultivés avec :_
Lignée Co-sti- Perles Anti-Bp35 mulant Milieux anti-yu 25 1 Néant 1.212+547 10.219+462 5.539+308 2 Anti-Bp50 719+718 38.792+1.329 25.465+616 3 BCGF 456+217 14.217+445 9.443+343 4 Anti-Bp50 + BCGF 1.456+126 54.393+2.537 46.488+3.387 30 _
La prolifération de lymphocytes B amygdaliens Er-denses (95% de cellules IgM superficielles) a été mesurée le jour 3, comme décrit. En résumé, on a cultivé 2 x 105 cellules/réservoir de 200 yal en 35 quadruplication pendant 48 heures avec le milieu 30 • ti ί ' \ * RPMI 1640 contenant 15% de sérum bovin foetal plus des additifs sans anticorps, ou avec l'anticorps monoclonal 2C3 dirigé contre des chaînes ya, couplé à des perles de Sépharose ("perles anti-yj", 50yug/ml) 5 ou l'anticorps anti-Bp35 1F5 libre (5yjg/ml). Des cultures contenant des milieux, des "perles anti-ya" ou anti-Bp35 ont été cultivées seules ou avec BCGF (concentration finale : 5%, Cytokine Technology, Buffalo, New York ; aucune activité détectable d'IL-l 10 ou IL-2), avec anti-Bp50 (dilution 1:1.000 d'ascites) comme co-stimulants. Après 40 heures, on a pulsé 3 des cellules avec H-thymidine et l'on a mesuré les coups incorporés après 18 heures.
15 5.3.1. mAb ANTI-Bp50 AUGMENTE LA PROLIFERA
TION UNIQUEMENT APRES QUE LES LYMPHOCYTES B ONT ETE ACTIVES PAR DES ANTICORPS ANTI-Bp35 ou ANTI-yu.
Les résultats du tableau 1 suggèrent que mAb anti-Bp50 ne pourrait, en lui-même, provoquer 20 une prolifération. Comme indiqué en figure 4, des doses d'anti-Bp50 se situant entre 0,05 yug et 2,0 yag/ ml n'ont eu aucun effet sur la fixation de la ^H-thymidine. Toutefois, en présence de concentrations optimales de mAb anti-Bp35, une concentration aussi 25 faible que 0,1 à 0,5yug/ml d'anticorps anti-Bp50 a augmenté sensiblement la prolifération. Des valeurs aussi élevées que 50.000 à 70.000 coups par minute ont pu être détectées au moment optimum de la prolifération lorsque des lymphocytes B hautement purifiés 30 ont été cultivés uniquement avec anti-Bp35 plus anti-Bp50. Ainsi qu'on l'a observé logiquement, les doses supérieures d'anti-Bp50 (plus de 2-5yug/ml) ont été moins efficaces que des doses se situant dans l'intervalle de 100-200 ng.
35 Ces résultats ont suggéré que anti-Bp50 i t 31 - '» pouvait remplir sa fonction uniquement après l'activation des lymphocytes B par d'autres signaux. Les données de la figure 5 suggèrent que ceci est, en fait, le cas. Si les lymphocytes B étaient tout 5 d'abord activés avec anti-Bp35, anti-Bp50 pourrait être ajouté jusqu'à 24-48 heures plus tard en augmentant toujours la prolifération au jour 4. En revanche, lorsque les cellules ont tout d'abord été traitées avec anti-Bp50, anti-Bp35 n'a été efficace que lors-10 qu'il a été ajouté endéans quelques heures après le démarrage des cultures. On a trouvé des résultats semblables lorsqu'on a utilisé anti-yu plutôt qu'anti-Bp35.
5.3.2. LES mAb ANTI-Bp50 N'ACTIVENT PAS 15 LES LYMPHOCYTES B DE LA PHASE GQ, MAIS ILS AMENENT LES LYMPHOCYTES B ACTIVES A PROGRESSER A TRAVERS LE
CYCLE CELLULAIRE._
Antérieurement, la Demanderesse a trouvé que, tout comme de faibles doses d'anticorps anti-ya, 20 anti-Bp35 amenait des lymphocytes B amygdaliens au repos en phase GQ à s'agrandir (Clark, et al·., 1986, Leukocyte Typing II, eds., Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlin, volume 2, 455-462) et à entrer dans la phase G^ du cycle cellulaire (Gollay et al., 1985, 25 J. Immunol. 135:3795-3801). Dès lors, il a été intéressant de comparer les facultés de mAb anti-Bp50 et de mAb anti-Bp35 concernant leurs effets sur l'activation des lymphocytes B. Comme indiqué en figure 6A, même après 3 à 4 jours en culture, des 30 lymphocytes B amygdaliens denses non stimulés avaient un profil uniforme d'acide ribonucléique, caractéristique des cellules en phase G^ (Darzynkiewicz, 1980, Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 77:6697-6702). Toutefois, environ 15-30% de cellules stimulées avec 35 anti-Bp35 ou anti-ya avaient une plus forte teneur ' * 32 en acide ribonucléique, indiquant ainsi leur entrée dans la phase G1. En revanche, ni anti-Bp50 (figure 6B), ni BCGF (figure 6C) seuls n'ont pas amené des nombres importants de lymphocytes B à entrer 5 dans la phase G^. Par exemple, 2 jours après l'activation, des mAb anti-Bp35 et anti-Ig ont amené respectivement 13,5 et 20,9% de cellules amygdaliennes à entrer dans la phase , tandis que des cellules traitées uniquement avec anti-Bp50 (2,7%) ou BCGF 10 (3,2%) sont restées à des concentrations de milieux témoins (2,2%). Toutefois, lorsque anti-Bp50 ou BCGF a été ajouté conjointement avec des anticorps anti-Bp35 ou antiyi, la proportion de cellules entrant dans la phase G^ a augmenté considérablement. De 15 même, anti-Bp50 et BCGF seuls n'ont pas amené les lymphocytes B à entrer dans la phase S (tableau 2) mais, conjointement avec anti-Bp35 ou anti-^u, ils ont augmenté deux à trois fois le nombre de cellules en phase S.
< . t i 4 * 33 TABLEAU 2
Effet d1anti-Bp50 et de BCGF sur la progression du cycle cellulaire dans des lymphocytes amygdaliens.
5 Signal de Signal de Cellules, %
compétence progression GQ S/G2/M
Milieux Néant 89,9 7,1 2,5 anti-Bp35 " 80,4 14,5 3,7 10 anti-Ig " 65,6 27,6 5,7
Milieux anti-Bp50 83,6 12,0 3,3 anti-Bp35 " 54,1 35,5 9,7 anti-Ig " 43,6 36,2 16,2
Milieux BCGF 85,4 11,7 2,2 15 anti-Bp35 " 56,6 32,6 11,6 anti-Ig " 48,4 36,1 14,1
Pourcentage de cellules dans les phases Gq, G^ ou S et G2, déterminé en adoptant le procédé de 20 coloration à l'Orangé d'acridine (Darzynkiewicz, et al., 1980, Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 77:6697-6702) ; 0 1 x 10 lymphocytes amygdaliens denses avec anti-Bp35 (5yug/ml), anti-yu sur perles (50^ag/ml), anti-Bp50 (0,4^ig/ml), BCGF (5%) ou leurs combinaisons, comme 25 indiqué.
5.3.3. CONDITIONS OPTIMALES POUR AUGMENTER LA PROLIFERATION DES LYMPHOCYTES B AVEC DES ANTICORPS
ANTI-Bp50_ 30 En eux-mêmes, des anticorps dirigés contre
Bp50 ont peu ou pas d'effet détectable sur des lymphocytes B denses au repos (tableau 3). Toutefois, en présence d'agents qui peuvent activer des lymphocytes B, par exemple, anti-Ig, anti-Bp35 "et TPA, mAb anti-35 Bp50 a augmenté nettement la prolifération. Anti-Bp50 1 * 34 n'a pas provoqué de co-stimulation avec différentes interleucines, y compris IL-1 purifiée, IL-2 recombinante et BCGF (faible). Une comparaison des effets d'anti-Bp50 avec ceux de BCGF (faible) a révélé que 5 les mêmes agents qui étaient co-stimulants avec anti-Bp50, étaient également co-stimulants avec BCGF (faible) (tableau 3). Il a été particulièrement intéressant de découvrir que BCGF et anti-Bp50 ensemble n'étaient toujours pas co-stimulants pour des eellu-10 les au repos.
TABLEAU 3
Augmentation de la prolifération des lymphocytes B avec des anticorps anti-Bp50 ou un facteur de croissance de lymphocytes B
15 _
Prolifération moyenne + erreur type de lymphocytes B cultivés avec :
Co-stimulant Milieux Anti-Bp50 BCGF
20 _(200 ng/ml)_(5%)_ Néant 96 + 1 267 + 15 285 + 74
Anti-Ig 5.833+391 41.634+2.103 25.094+61
Anti-Bp35 (5 yjg/ml) 457 + 45 8.143 + 280 1.733 + 32 25 TPA (2 ng/ml) 7.361 + 537 21.163 + 871 13.064 + 1.030 IL-1 (10 U/ml) 264 + 2 308 + 23 221 + 8.
IL-2 (100 U/ml) 204 + 34 350 + 7 220 + 11 BCGF (5%) 220 + 7 851 + 28 270 + 18 20 Lymphocytes B Er- amygdaliens denses (plus de 95% de cellules sIgM+) cultivés pendant 48 heures à 2 x 10 cellules/réservoir, puis par impulsion 3 pendant 24 heures avec la H-thymidine avant le comptage.
35 35 * κχ *
La cinétique de prolifération augmentée par anti-Bp50 est illustrée en figure 7. Le pic de prolifération est apparu au jour 4, puis il a décliné, que les cellules ont été activées ou non avec 5 anti-Bp35 ou d'autres activateurs tels que anti-Ig ou TPA. La cinétique de prolifération augmentée par BCGF ou par anti-Bp50 était semblable.
Une quantité aussi faible que 0,05 yug d'anticorps anti-Bp50 a augmenté la prolifération.
10 Au cours d'études ultérieures, on a utilisé une dose optimale de 0,3^ug/ml. On a observé logiquement qu'en utilisant des molécules entières d'anticorps, des doses plus élevées d'anti-Bp50 (plus de 2-5 ^jg/ml) étaient moins efficaces que des doses se situant dans 15 l'intervalle allant de 0,1 à 0,5^ag/ml.
Les lymphocytes B humains sont extrêmement sensibles aux effets inhibiteurs provoqués par les récepteurs Fc d'anticorps venant se lier à Ig superficielle (Parker, 1980, Immunol. Rev. 52:115 ; 20 Bijsterbosch, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:1825).
Dès lors, il a été important de comparer l'efficacité de mAb anti-Bp50 entier avec celle de fragments F(ab')2 antl-Bp50. Dans un intervalle de dosage au centuple, des fragments F(ab')2 étaient manifeste-25 ment aussi efficaces, voire même plus efficaces qu'un anticorps entier concernant l'augmentation de la prolifération des lymphocytes B (tableau 4). Dès lors, le domaine Fc de mAb anti-Bp50 n'est pas requis pour que anti-Bp50 exerce son effet et il peut être 30 même inhibiteur. En d'autres mots, tout comme BCGF, anti~Bp50 peut apparemment agir comme médiateur soluble sans faire appel à la fonction cellulaire accessoire avec le récepteur Fc comme médiateur.
-Λ 4 ' 36 ‘ι TABLEAU 4
Le domaine Fc d'anticorps anti-Bp5Q n'est pas requis pour augmenter la prolifération des lymphocytes B
5 Prolifération moyenne des lymphocytes B cultivés avec : Anti-Bp50 Dose Milieux Anti-Bp35 (yjg/ml ) 10 Néant — 295 + 16 269 + 27
Ab entier 0,125 278 + 32 5.140 + 20 1,25 275 + 24 4.686 + 342 12.5 163 + 15 3.852 + 203 F ( ab ')2 0,125 594 + 21 10.635 + 449 15 1,25 531 + 3 10.893 + 575 12.5 279 + 8 9.411 + 870
Les conditions de culture des cellules étaient celles décrites dans le tableau 3.
20 _________
5.3.4. DIFFERENCES ENTRE L'ACTIVITE
D1ANTI-Bp50 ET DE BCGF (FAIBLE)._
Anti-Bp50 et BCGF (faible) exerçaient un effet semblable sur les lymphocytes B et ils étaient 25 co-stimulants avec les mêmes agents (tableau 3). Toutefois, plusieurs ordres de preuve indiquent qu'anti-Bp50 et le BCGF utilisés lors de cette étude, entrent manifestement en jeu à l'intervention de signaux différents. En premier lieu, contrairement aux récepteurs 30 de BCGF (faible) (Bijsterbosch, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:1825), les molécules de Bp50 sont exprimées sur des lymphocytes B au repos du sang (figure 3).
En second lieu, bien qu'à la fois anti-Bp50 et BCGF (faible) exercent le plus efficacement leur fonction 35 lorsqu'ils sont ajoutés après anti-Bp35 ou anti-Ig,
V
37 j r h * anti-Bp50 a exercé manifestement son effet optimum lorsqu'il a été ajouté 12 heures après que les cultures ont commencé (figure 8A). En revanche, BCGF (faible) a pu être ajouté au bout d'une période aussi longue 5 que 24 heures après le démarrage des cultures, tout en augmentant encore de manière optimale la prolifération (figure 8B). Ces expériences cinétiques, qui sont modelées sur la méthode de Howard et Paul (1983, Ann. Rev. Immunol. 1:307), suggèrent qu'un signal 10 dépendant de Bp50 peut normalement exercer son effet avant BCGF.
Anti-Bp50 et BCGF (faible) ont augmenté tous deux la prolifération des lymphocytes B activés avec anti-Bp35 ou anti-Ig (tableau 3). Toutefois, 15 les effets d'anti-Bp50 et de BCGF (faible) étaient additifs dans bon nombre d'expériences (figure 7).
La figure 9 illustre un titrage de BCGF (faible) au cours d'une expérience dans laquelle on a utilisé anti-Bp50 à sa concentration optimale (0,2 yjg/ml).
20 BCGF (faible) a pu augmenter davantage la prolifération de lymphocytes B au repos en présence d'anti-Bp50 après activation soit par anti-Ig, soit par anti-Bp35. Des concentrations optimales de BCGF (faible) étaient de 5-10%, tandis que des concentra-25 tions de 25% étaient inhibitrices. Dès lors, lorsqu'on a utilisé à la fois anti-Bp50 et BCGF (faible) à leurs concentrations optimales, ils ont toujours exercé des effets additifs sur la prolifération des lymphocytes B.
30 Enfin, à la fois les sous-ensembles de lymphocytes B normaux et de lymphocytes B malins se différencient par leur réponse à anti-Bp50 et à BCGF (faible). Par exemple, certains lymphocytes B du sang ont été sensibles à BCGF (faible), mais ils n'ont 35 pas répondu à anti-Bp50 (tableau 5). Un signal ' ·* 38 f d'activation supplémentaire tel qu'anti-Bp35 (tableau 5) ou TPA (figure 10) était logiquement nécessaire pour que les lymphocytes B du sang puissent répondre à anti-Bp50. Bien qu'en règle générale, des lympho-5 cytes B amygdaliens denses n'aient pas répondu soit à BCGF, soit à anti-Bp50, les lymphocytes B flottants ont répondu (tableau 5). Les malignités des lymphocytes B se différenciaient également par leur sensibilité à anti-Bp50 vis-à-vis de BCGF. Par exemple, 10 certains lymphomes de lymphocytes B ont répondu à TPA plus BCGF (faible), mais non à TPA plus anti-Bp50 G28-5 (figures 10B et D). En revanche, des lymphocytes B amygdaliens denses et des lymphocytes B de sang périphérique ont répondu à TPA plus BCGF 15 (faible) ou anti-Bp50 (figures 10A et C).
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Les coordinats de la présente invention peuvent être utilisés in vivo ou in vitro tant sous 5 leurs formes non modifiées que sous leurs formes modifiées, pour moduler des réponses immunitaires . Par exemple, les coordinats eux-mêmes peuvent être utilisés comme "adjuvants" afin d'augmenter une réponse immunitaire à un vaccin ou afin d'augmenter la réponse immunitaire 10 d'un individu atteint d'immunosuppression. En variante, si des cytotoxines ou des agents anti-prolifératifs sont couplés aux coordinats, ces coordinats modifiés peuvent être utilisés pour diminuer la réponse immunitaire, par exemple, dans une maladie auto-immune ou chez 15 des patients ayant reçu une transplantation afin d'éviter le rejet du greffon. Ces coordinats modifiés pourraient également être utilisés pour traiter des malignités où-interviennent des cellules ou des tumeurs qui expriment l'antigène Bp50, que la malignité trouve 20 son origine dans des lymphocytes B ou non.
Les coordinats de la présente invention et/ou Bp50 lui-même peuvent être utilisés in vitro.
De telles applications englobent des dosages in vitro tels que des immuno-dosages pour la détection de 25 cellules qui expriment l'antigène Bp50 et/ou pour la détection de l'antigène Bp50 éventuellement perdu dans les humeurs de l'organisme. Dans ce cas, le coordinat ou Bp50 pourrait être marqué avec un radio-marqueur, le fluor, une enzyme, un substrat d'enzyme, 30 un colorant, etc. En outre, les coordinats peuvent être utilisés pour séparer et/ou identifier des cellules qui expriment l'antigène Bp50, auquel cas le coordinat peut être couplé à un support immobile ou à un fluor qui peut être utilisé dans un FACS (sélecteur de 35 cellules activées par fluorescence).
4 - 41
Les différentes applications et utilisations des coordinats et de Bp50 de la présente invention sont décrites plus en détail ci-après.
5.4.1. RECEPTEUR Bp50 ET UTILISATIONS 5 DE COORDINATS TELS QUE ANTI-Bp50 POUR AUGMENTER LA
PROLIFERATION DES LYMPHOCYTES B.__
Des études antérieures ont suggéré que les facteurs impliqués dans l'induction de lymphocytes B de la phase Gq dans la phase du cycle cellulaire 10 étaient distincts des facteurs ou des conditions requises pour le transit dans la phase S. Ce modèle est basé, en principe, sur des études montrant que des agents tels que de faibles doses de facteurs d'activation de lymphocytes B anti-Ig;ou anti-Bp35 15 seul avaient peu ou pas d'effet sur la prolifération des lymphocytes B. Cependant, çes mêmes agents peuvent conduire des lymphocytes B vers un point d'activation où ils sont susceptibles aux facteurs de croissance.
Par contraste, des facteurs de croissance tels que 20 BCGF ou IL-2 seul n'ont aucun effet sur des lymphocytes B au repos, mais ils augmentent réellement la croissance de lymphocytes B activés.
Bien que la présente invention ne soit limitée à aucune théorie ni à aucune explication, les résultats 25 présentés ici étayent davantage un modèle de régulation distincte des étapes de croissance et d'activation des lymphocytes B. En l'occurrence, la Demanderesse a démontré que des signaux d'activation et de prolifération apparaissant dans des lymphocytes B humains 30 pouvaient être transmis par des structures superficielles cellulaires distinctes. Bien que mAb anti-Bp35 ait activé des lymphocytes B pour les faire entrer dans la phase G^ du cycle cellulaire, à lui seul, il provoque peu ou pas de prolifération. mAb anti-35 Bp50 a exercé l'effet opposé : il n'a pas pu activer : . -i t 42 des lymphocytes B mais, lorsqu'il a été ajouté même au terme d'une période aussi longue que 12-24 heures après l'activation, il a pu provoquer la croissance des lymphocytes B.
5 Comme on le présume, la molécule de Bp50 pourrait normalement se comporter comme un récepteur d'un coordinat tel qu'un facteur de croissance soluble ou pour un signal dont un contact cellule-cellule est le médiateur (c'est-à-dire un coordinat se trouvant 10 sur la surface d'une autre cellule). Des études antérieures ont permis d'identifier plusieurs BCGF dérivant de lymphocytes T qui, tout comme anti-Bp50, augmentent la prolifération des lymphocytes B. A la fois des formes de poids moléculaire élevé et des 15 formes de poids moléculaire faible de facteurs de croissance des lymphocytes B ont été identifiées et il a été démontré que différents types exerçaient des effets additifs (Kehrl, et al., 1984, Immunol.
Rev. 18:75-96 ; Kishimoto, 1985, Ann. Rev. Immunol.
20 3:133-157 ; Swain, et al. 1983, J. Exp. Med.
158:822-835 ; Howard et al., 1984, Immunol. Rev. 78:185-210 ; Ambrus, et al., J. Clin. Invest.
75:732-739 ; Ambrus, 1985, J. Exp. Med. 162:1319-1335). Dès lors, Bp50 pourrait être un récepteur pour un 25 de ces facteurs.
A l'exception des récepteurs d'IL-2 et du récepteur de C3d, les récepteurs se trouvant sur des lymphocytes B pour des signaux de croissance n'ont pas encore été identifiés. Le mAb AB-1 réagit avec 30 un marqueur de lymphocytes B exprimé uniquement sur des lymphocytes B activés et il bloque la prolifération dépendant de BCGF, si bien qu'il pourrait reconnaître le récepteur de BCGF ou une structure apparentée.
Bp50 semble être distinct du marqueur d!AB-l, étant 35 donné que le mAb AB-1 ne bloque pas la liaison de 4 -*1 43 l'anticorps anti-Bp50 G28-5 et que, contrairement à mAb G28-5, il réagit uniquement avec des lymphocytes B activés (Jung et al.. 1984, J. Exp. Med. 160:1919-1924). Bp50 se trouve sur tous les lymphocytes B 5 ce qui, sur la base d'une analyse par absorption et de dosages faisant appel à une liaison directe, ne semble pas être le cas pour les récepteurs de BCGF.
Les données dont dispose actuellement la Demanderesse, indiquent que Bp50 et le récepteur pour BCGF de faible 10 poids moléculaire sont des structures distinctes.
En utilisant un hétéro-antisérum de lapin, Wang et ses collaborateurs (Wang, 1979, J. Exp. Med. 149:1424-1433) ont décrit antérieurement une glycoprotéine à 54 kDa, gp54, qui, tout comme Bp50, est exprimée 15 sur tous les lymphocytes B, mais à des concentrations inférieures sur les lymphocytes B du sang que sur les lymphocytes B amygdaliens. Il est possible, mais improbable, que 1'hétéro-antisérum de lapin et anti-Bp50 reconnaissent les mêmes structures ou des struc-20 tures apparentées : à l'opposé de mAb anti-Bp50, l'antisérum de lapin dirigé contre gp54 seul a été suffisant pour stimuler la prolifération des lymphocytes B.
A l'inverse d'anti-Bp50, anti-Bp35 seul 25 peut activer des lymphocytes B de la phase Gq à la phase G1 et, dès lors, il peut être appelé "signal d'activation". On ne sait pas encore clairement si Bp35 entre en jeu ou non uniquement lors de l'activation précoce des lymphocytes B, car les anticorps 30 anti-Bp35 peuvent stimuler la division de certains lymphocytes B (Clark et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 82:1766-1770). De même, Bp50 ne peut pas strictement entrer en jeu uniquement comme "signal de croissance" : conjointement avec des signaux 35 d'activation (anti-Bp35 ou anti-ya) , les anticorps ; 4 » 44 i anti-Bp50 non seulement augmentent la prolifération, mais également le nombre total de lymphocytes B entrant dans la phase G1 (tableau 2). En d'autres mots, en tant que co-stimulant, anti-Bp50 agit pour 5 activer la progression à la fois des phases d'activation (de Gq à G^) et de croissance (G à S) du cycle cellulaire. Le BCGF utilisé au cours de ces études a également exercé une activité semblable (figure 6C).
Dès lors, anti-Bp35 et anti-Bp50 (ou BCGF) semblent 10 être essentiellement analogues aux facteurs de "compétence" et de "progression" décrits au cours des études effectuées sur la régulation de la croissance des fibroblastes. La façon dont les lymphocytes B réagissent à anti-Bp35 ou à anti-Bp50 peut clairement 15 dépendre de leur état de différentiation ou d'activation.
Il a été démontré ici que deux mAb, à savoir anti-Bp35 (signal de "compétence") et anti-Bp50 (signal de "progression") ensemble pouvaient provoquer une importante prolifération de lymphocytes B hautement 20 purifiés en absence d'antigène ou d'autres facteurs connus. Les coordinats naturels pour ces structures ne sont pas encore connus. Toutefois, étant donné que mAb dirigé contre des groupements antigéniques déterminants peut imiter à la fois des facteurs solu-25 blés et des signaux dont des interactions cellules-cellules sont les médiateurs, il peut être possible d'utiliser des combinaisons appropriées de mAb pour diriger et assurer la régulation de la prolifération ou de la différentiation de lymphocytes B humains 30 ce qui, à son tour, contribuera à concevoir des stratégies in vivo pour combattre des maladies humaines telles que les malignités des lymphocytes B, les déficits immunitaires et certaines maladies autoimmunes.
35 Le nouvel anticorps monoclonal, G28-5, qui
7 ' * J
45 réagit avec un polypeptide à une seule chaîne d'environ 50 Kd, exprimé sur la surface de lymphocytes B humains, n'est qu'une forme de réalisation particulière des coordinats de la présente invention, qui peuvent 5 augmenter la prolifération de lymphocytes B activés.
Etant donné que la prolifération des lymphocytes B humains peut être augmentée de la même manière par des BCGF dérivant de lymphocytes T, y compris les BCGF de faible poids moléculaire et de poids moléculaire 10 élevé, la Demanderesse a comparé l'activité de G28-5 anti-Bp50 avec celle d'une préparation de BCGF contenant principalement un BCGF de faible poids moléculaire.
G28-5 anti-Bp50 et BCGF (faible) étaient très semblables en ce sens qu'ils étaient co-stimulants avec les mêmes 15 agents d'activation (anti-Ig, anti-Bp35 et TPA), cependant qu'ils n'étaient pas co-stimulants l'un avec l'autre ou avec IL-1 ou encore IL-2. De plus, l'activité de G28-5 anti-Bp50 ne dépendait pas de son domaine Fc, étant donné que des fragments F(ab')2 de G28-5 20 étaient fonctionnellement actifs, ce qui donne à penser que, tout comme BCGF soluble, anti-Bp50 soluble ne nécessite pas des cellules accessoires portant un • récepteur Fc pour exercer un effet. De plus, anti-Bp50 et BCGF sont tous deux efficaces uniquement en 25 présence d'un stimulus d'activation. En d'autres mots, anti-Bp50 et BCGF ne sont pas des facteurs de "compétence", mais ils favorisent plutôt la "progression" des lymphocytes B à travers le cycle cellulaire.
Bien que, selon toute probabilité, Bp50 30 puisse entrer en jeu comme récepteur pour un coordinat tel qu'un facteur de croissance de lymphocytes B, plusieurs résultats donnent à penser que Bp50 n'est pas le récepteur, du moins pour le BCGF (faible) utilisé au cours de cette étude : il est exprimé sur 35 des lymphocytes B du sang, tandis que des récepteurs 4 46 de BCGF (faible) ne le sont apparemment pas. A l'opposé de Bp50, des structures candidates pour le récepteur de BCGF (faible) sont également exprimées uniquement sur des lymphocytes B activés. De plus, 5 des populations de lymphocytes B tant normaux que malins diffèrent par leur sensibilité à anti-Bp50 vis-à-vis de BCGF (faible) (tableau 5 et figure 10).
Par exemple, certains lymphomes B prolifèrent en réponse à BCGF (faible), mais non en réponse à anti-10 Bp50. Enfin, dans un certain nombre d'expériences, des concentrations optimales d'anti-Bp50 et de BCGF ont provoqué, ensemble, une plus forte prolifération qu'individuellement. Anti-Bp50 imite l'activité d'autres BCGF tels que des BCGF (élevé) qui sont co-15 stimulants avec anti-IgM (Ambrus, et al., 1985, J.
Exp. Med. 162:1319 ; Ambrus, et al., 1985, J. Clin. Invest. 75:732), ce qui donne à penser que Bp50 pourrait entrer en jeu comme récepteur pour BCGF (élevé).
20 Bien que Bp50 puisse être un récepteur pour un coordinat soluble, en variante, Bp50 peut jouer le rôle d'un récepteur pour un signal dont un contact cellule-cellule est le médiateur et qui assure la régulation des concentrations en récepteurs de BCGF 25 et/ou la production autocrine. La préséance d'antigènes de différentiation servant d'amplificateurs d'une voie de récepteurs autocrines provient d'études effectuées avec des lymphocytes T. mAb dirigé contre l'antigène leucocytaire commun Lp220 augmente la pro-30 lifération en élevant l'expression du récepteur d'IL-2 sur des lymphocytes T activés (Ledbetter, et al., 1985, J. Immunol. 135:1819). Un mécanisme analogue peut entrer en jeu avec anti-Bp50 et l'expression de certains récepteurs de BCGF. Apparemment, Bp50 35 et BCGF (faible) sont sous un certain contrôle coordiné A * ; 47 car, tout comme les récepteurs d’IL-1 et d'IL-2, BCGF augmente l'expression de Bp50 sur certaines cellules leucémiques. La molécule de Bp50 partage également des similitudes avec la molécule de Tp44 5 qui entre en jeu pour influencer la production d'IL-2. La Demanderesse et d'autres chercheurs ont démontré que l'anticorps 9.3 anti-Tp44 augmentait la prolifération de lymphocytes T activés par anti-CD3 ou TPA (Ledbetter, et al., 1985, J. Immunol.
10 135:2331 ; Hara, et al., 1985, J. Exp. Med. 161:1513).
De même, anti-Bp50 augmente la prolifération de lymphocytes B activés par anti-Bp35 ou TPA. Le signal Tp44 agit en stimulant la production d'IL-2 plutôt qu'en stimulant la croissance de lymphocytes T.
15 Probablement, le signal Bp50 pourrait agir d'une manière analogue en stimulant la production autocrine de lymphocytes B (Gordon, et al., 1984, Nature, Lond. 310:145)7 5.4.2. C00RDINATS MODIFIES UTILISES POUR 20 L'IMMUNOSUPPRESSION OU LE TRAITEMENT DE MALIGNITES.
Selon cette forme de réalisation, le coor-dinat de la présente invention peut être modifié par la fixation d'un agent antiprolifératif,de telle sorte que la molécule obtenue puisse être utilisée 25 pour tuer des cellules qui expriment l'antigène Bp50. De tels coordinats modifiés peuvent être utilisés dans le traitement de maladies auto-immunes, afin de supprimer la prolifération de lymphocytes B et supprimer ainsi la réponse auto-immunitaire. Ces 30 coordinats modifiés peuvent également être utilisés pour assurer l'immunosuppression chez un patient ayant reçu une transplantation afin d'empêcher le rejet d'un greffon. En conséquence, des agents cytotoxiques qui sont utilisés pour la suppression des réponses 35 immunitaires, peuvent être fixés aux coordinats de K * ι 48 l'invention. Lorsqu'on utilise des coordinats qui augmentent la prolifération des lymphocytes B, il doit en résulter un effet accru, puisqu'aussi bien le médicament sera dirigé vers les lymphocytes B en 5 prolifération.
Dans une autre forme de réalisation, les coordinats de la présente invention/qui sont modifiés par la fixation d'un agent antiprolifératif, peuvent être utilisés pour traiter des malignités dans les-10 quelles des tumeurs ou des cellules expriment l'antigène Bp50. La fixation de ces agents chimiothérapeu-tiques aux coordinats de l'invention doit assurer une plus grande spécificité du médicament pour les cellules malignes. De plus, un avantage particulier 15 devrait être obtenu lors du traitement d'une malignité des lymphocytes B avec un coordinat couplé à une cytotoxine qui est plus efficace pour tuer des cellules proliférantes que des cellules non proliférantes ; un traitement avec un tel coordinat devrait assurer 20 une potentialisation de l'action de la cytotoxine.
En conséquence, les agents chimiothérapeu-tiques ou les agents antiprolifératifs qui peuvent ê-tre couplés aux coordinats de la présente invention, englobent, sans aucune limitation, les agents énumérés 25 dans le tableau 6 ci-après qui provient de Goodman et Gilman, The Parmacological Basis of Therapeutics, 6e édition, MacMillan Publishing Co., Inc., New York, pages 1249-1313, 1980, dont il est fait mention ici à titre de référence.
- * » 49 TABLEAU 6
Agents chimiothérapeutiques qui peuvent être couplés à des coordinats d'anti-BpSO Classe Type Agent 5 Agent d'al- Moutarde Chlorméthine kylation azotée Cyclophosphamide
Melphalan Moutarde uracile Chlorambucil 10 Dérivés d'éthy- Thiotépa lène-imine
Sulfonates Busulfan d'alkyle
Nitroso-urées Carmustine 15 Lomustine Sémustine Streptozotocine Triazenres Dacarbazine
Antiméta- Analogues de Methotrexate 20 bolites l'acide folique
Analogues de la Fluorouracile pyrimidine Cytarabine
Azaribine
Analogues de Mercaptopurine 25 la purine Thioguanine
Produits Alcaloïdes Vinblastine naturels extraits de la Vincristine pervenche (Pervinca) 30 Antibiotiques Dactinomycine
Daunorubicine
Doxorubicine
Bléomycine
Mithramycine 35 Mitomycine - A. ♦ 50 TABLEAU 6 (suite)
Classe Type Agent
Enzymes L-asparaginase
Agents Complexes Cisplatine 5 divers coordinés de platine
Urée substi- Hydroxy-urée tuée Dérivé de Procarbazine 10 méthyl-hydra- zine
Suppresseur Mitotane corticosurrénal 15 Hormones et Cortico- Prednisone antagonistes stéroïdes
Progestines Caproate d'hydroxy- progestérone Acétate de médro- 20 progestérone
Acétate de mégestrol Oestrogènes Diéthyl-stilbestrol
Ethinyl-oestradiol Anti-oestrogène Tamoxifen 25 Androgènes Propionate de testo stérone
Fluoxymestérone
Isotopes Phosphore Phosphate de sodium 32P
radioactifs Iode Iodure de sodium 131I
30__
On peut adopter n'importe quelle méthode connue dans la technique pour coupler le coordinat à l'agent chimiothérapeutique ou antiprolifératif.
Des exemples de telles méthodes ont été énumérés 35 précédemment (voir paragraphe 5, ci-dessus).
A * 51 »
5.4.3. AUTRES UTILISATIONS DE COORDINATS
ET DE Bp50
Outre les applications thérapeutiques, les coordinats et Bp50 lui-même permettent d'autres appli-5 cations dans des dosages diagnostiques à la fois in vitro et in vivo, des schémas de séparation, etc.
Le récepteur Bp50 peut être utilisé pour la préparation et/ou la conception des coordinats de l'invention. Bp50 peut également être utilisé 10 avec les coordinats de l'invention dans des dosages in vitro qui nécessitent un étalon pour quantifier la quantité de Bp50 détectée dans une prise d'essai. Enfin, Bp50 lui-même peut être utile comme facteur soluble constituant un médiateur d'immunité, par 15 exemple, une lymphokine.
Outre le traitement thérapeutique et les dosages diagnostiques, les coordinats de la présente invention pourraient être utilisés pour identifier ou séparer des cellules qui expriment l'antigène 20 Bp50. En outre, si un composé opaque aux rayons X
ou un radio-marqueur approprié est relié au coordinat, celui-ci pourrait être utilisé pour la visualisation in vivo de tumeurs exprimant l'antigène Bp50. D'après la description ci-dessus, d'autres utilisations devront 25 être évidentes pour l'homme de métier.
6. DEPOT DE LIGNEES DE CELLULES
L'hybridome suivant a été déposé à 1'American Type Culture Collection", Rockville, MD, et il lui a été attribué le numéro d'ordre suivant :
30 Hybridome Numéro d'ordre ATCC
G28-5 HB9110
Le cadre de la présente invention n'est nullement limité par l'hybridome déposé, étant donné que le type déposé est donné simplement afin d'illus-35 trer un aspect de l'invention et que n'importe quelles - + * 52 lignées de cellules qui sont fonctionnellement équivalentes , rentrent dans le cadre de la présente invention. En fait, à la lecture de la description qui précède et au vu des figures annexées, l'homme de 5 métier reconnaîtra diverses modifications de l'invention en plus de celles illustrées et décrites dans la présente spécification. Il est entendu que ces modifications rentrent dans le cadre des revendications ci-après.
i * 4 4 53
TABLE DES MATIERES
Page 1. Introduction........................... 1 2. Fondement de l'invention............... 2 3. Sommaire de l'invention................ 5 5 3.1. Définitions...................... 10 4. Description des figures................ 11 5. Description détaillée de l'invention... 15 5.1. Méthodes adoptées pour caractériser le récepteur Bp50....... 19 10 5.2. Caractérisation du récepteur
Bp50.......................... 24 5.2.1. Identification d'un marqueur superficiel de cellules à 50 kDa 15 spécifique aux lymphocytes B, Bp50............ 24 5.2.2. L'expression de Bp50 est restreinte aux lymphocytes B.................. 27 20 5.3. Augmentation de la prolifération des lymphocytes B avec l'anticorps anti-Bp50.................. 28 5.3.1. mAb anti-Bp50 augmente la prolifération uniquement 25 après que les lymphocytes B ont été activés par des anticorps anti-Bp35 ou anti-^μ................... 30 5.3.2. Les mAb anti-Bp50 30 n'activent pas les lym phocytes B de la phase Gq, mais ils amènent les lymphocytes B activés à progresser à travers le 35 cycle cellulaire......... 31 54 * *
Page 5.3.3. Conditions optimales pour augmenter la prolifération des lymphocytes 5 B avec des anticorps anti-Bp50................ 33 5.3.4. Différences entre l'activité d'anti-Bp50 et de BCGF (faible)...... 36 10 5.4. Utilisations de coordinats anti-
Bp50 et de Bp50.................. 40 5.4.1. Récepteur Bp50 et utilisations de coordinats tels que anti-Bp50 pour 15 augmenter la prolifération des lymphocytes B........ 41 5.4.2. Coordinats modifiés utilisés pour l'immunosuppression ou le trai- 20 tement de malignités...... 47 5.4.3. Autres utilisations de coordinats et de Bp50..... 51 6. Dépôt de lignées de cellules............ 51

Claims (67)

1. Coordinat pratiquement pur qui (a) se lie à Bp50, à savoir un antigène superficiel des lymphocytes B à 50 kilodaltons, défini par l'anticorps 5 monoclonal G28-5, et qui (b) lors de sa liaison à un lymphocyte B activé, stimule le lymphocyte B activé pour l'amener à traverser le cycle cellulaire afin d'augmenter la prolifération de ce lymphocyte B.
2. Coordinat selon la revendication 1, 10 caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'anticorps ou une fraction Fv, Fab, F(ab')g ou Fab' de la molécule d'anticorps.
3. Coordinat selon la revendication 2, dans lequel la molécule d'anticorps comprend une 15 molécule d'anticorps monoclonal ou une fraction Fv, Fab, F(ab')2 ou Fab' de la molécule d'anticorps monoclonal .
4. Molécule d'anticorps monoclonal selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle comprend 20 G28-5 ou n'importe quelle fraction Fv, Fab, F(ab')2 ou Fab' de G28-5.
5. Molécule d'anticorps monoclonal selon la revendication 3, produite par une lignée de cellules d'hybridomes, déposée à 1'ATCC sous le numéro d'ordre 25 HB9110, ou un de ses mutants, un de ses recombinants * « 56 ou un de ses dérivés appartenant au génie génétique.
6. Coordinat selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une lymphokine.
7. Lymphokine selon la revendication 6, 5 caractérisée en ce qu'elle comprend un facteur de croissance de lymphocytes B.
8. Coordinat selon la revendication 6, dans lequel la lymphokine se trouve sur la surface d'une cellule.
9. Coordinat selon la revendication 1, 2 ou 6, caractérisé en ce qu'il comprend également un composé couplé pour être coordinat.
10. Coordinat selon la revendication 9, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend 15 un agent antiprolifératif.
11. Coordinat selon la revendication 9, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un agent d'alkylation.
12. Coordinat selon la revendication 9, 20 dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un antimétabolite.
13. Coordinat selon la revendication 9, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un antibiotique.
14. Coordinat selon la revendication 9, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un alcaloïde extrait de la pervenche (Pervinca).
15. Coordinat selon la revendication 9, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend 30 une enzyme.
16. Coordinat selon la revendication 9, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un complexe coordiné de platine.
17. Coordinat selon la revendication 9, 35 dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un * * 57 / radio-isotope .
18. Coordinat selon la revendication 9, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un composé fluorescent.
19. Coordinat pratiquement pur qui se lie à Bp50, à savoir un antigène superficiel de lymphocytes B à 50 kilodaltons, défini par l'anticorps monoclonal G28-5.
20. Coordinat selon la revendication 19, 10 caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'anticorps ou une fraction Fv, Fab, F(ab')2 ou Fab' de la molécule d'anticorps.
21. Coordinat selon la revendication 20, dans lequel la molécule d'anticorps comprend une 15 molécule d'anticorps monoclonal ou une fraction Fv, Fab, F(ab')2 ou Fab’ de la molécule d'anticorps monoclonal .
22. Coordinat selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend une lymphokine.
23. Lymphokine selon la revendication 22, caractérisée en ce qu'elle comprend un facteur de croissance de lymphocytes B.
24. Coordinat selon la revendication 19, 20 ou 22, caractérisé en ce qu'il comprend également 25 un composé couplé pour être coordinat.
25. Coordinat selon la revendication 24, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un agent antiprolifératif,
26. Coordinat selon la revendication 24, 30 dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un agent d'alkylation.
27. Coordinat selon la revendication 24, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un antimétabolite.
28. Coordinat selon la revendication 24, * * 58 dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un antibiotique.
29. Coordinat selon la revendication 24, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend 5 un alcaloïde extrait de la pervenche (Pervinca).
30 G28-5, de telle sorte que les lymphocytes B activés traversent le cycle cellulaire et que leur prolifération augmente.
30. Coordinat selon la revendication 24, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend une enzyme.
31. Coordinat selon la revendication 24, 10 dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un complexe coordiné de platine.
32. Coordinat selon la revendication 24, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un radio-isotope.
33. Coordinat selon la revendication 24, dans lequel le composé qui y est couplé, comprend un composé fluorescent.
34. Antigène superficiel de lymphocytes B à 50 kilodaltons, qui est défini par l'anticorps 20 monoclonal G28-5.
35. Antigène pratiquement pur à 50 kilodaltons selon la revendication 34, caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide.
36. Procédé en vue d'augmenter la prolifé- 25 ration des lymphocytes B, caractérisé en ce qu'il consiste à traiter des lymphocytes B activés,avec une dose efficace d'un coordinat qui se lie à Bp50, à savoir un antigène superficiel de lymphocytes B à 50 kilodaltons,défini par l'anticorps monoclonal
37. Procédé selon la revendication 36, dans lequel les lymphocytes B ont été activés par 35 traitement avec une dose efficace d'un second coor- 59 dinat qui se lie à Bp35, à savoir un antigène superficiel de lymphocytes B à 35 kilodaltons, de telle sorte que le lymphocyte B progresse de la phase GQ à la phase du cycle cellulaire.
38. Procédé selon la revendication 36 ou 37, caractérisé en ce qu'il est effectué in vivo.
39. Procédé selon la revendication 36 ou 37, caractérisé en ce qu'il est effectué in vitro.
40. Procédé selon la revendication 36 ou 10 37, dans lequel le coordinat comprend une molécule d'anticorps qui se lie à Bp50, ou une fraction Fv, Fab, F(ab')2 ou Fab' de la molécule d'anticorps,qui se lie à Bp50.
41. Procédé selon la revendication 36 ou 15 37, dans lequel le coordinat comprend une molécule d'anticorps monoclonal qui se lie à Bp50, ou une fraction Fv, Fab, F(ab')2 ou Fab' d'une molécule d'anticorps monoclonal,qui se lie à Bp50.
42. Procédé selon la revendication 41, 20 dans lequel la molécule d'anticorps monoclonal comprend G28-5 ou n'importe quelle fraction Fv, Fab, F(ab')2 ou Fab' de G28-5.
43. Procédé selon la revendication 41, dans lequel l'anticorps monoclonal est produit par 25 une lignée de cellules d'hybridomes, déposée à l'ATGG sous le numéro d'ordre HB9110, ou un de ses mutants, un de ses recombinants ou un de ses dérivés appartenant au génie génétique.
44. Procédé selon la revendication 36 ou 30 37, dans lequel le coordinat comprend une lymphokine.
45. Procédé selon la revendication 44, dans lequel la lymphokine comprend un facteur de croissance des lymphocytes B.
46. Procédé selon la revendication 44, 35 dans lequel la lymphokine se trouve sur la surface i 60 * * d'une cellule.
47. Procédé selon la revendication 37, dans lequel le second coordinat comprend une molécule d'anticorps qui se lie à Bp35.
48. Procédé selon la revendication 47, dans lequel l'anticorps qui se lie à Bp35, comprend encore un anticorps monoclonal.
49. Procédé selon la revendication 37, dans lequel les lymphocytes B activés sont traités 10 avec le coordinat qui se lie à Bp50, à peu près dans les 12 heures qui suivent l'activation par le second coordinat qui se lie à Bp35.
50. Procédé en vue de supprimer la prolifération des cellules qui expriment Bp50, à savoir 15 un antigène superficiel de lymphocytes B à 50 kilo-daltons, défini par l'anticorps monoclonal G28-5, caractérisé en ce qu'il consiste à traiter les cellules qui expriment Bp50, avec une dose efficace d'un coordinat qui se lie à Bp50, ce coordinat étant couplé 20. un agent antiprolifératif.
51. Procédé selon la revendication 50, dans lequel les cellules qui expriment Bp5Q, comprennent des- lymphocytes -B.
52. Procédé selon la revendication 50, 25 dans lequel les cellules qui expriment Bp50, comprennent des cellules malignes.
53. Procédé selon la revendication 50, caractérisé en ce qu'il est effectué in vivo.
54. Procédé selon la revendication 50, 30 caractérisé en ce qu'il est effectué in vitro.
55. Procédé selon la revendication 50, dans lequel le coordinat comprend une molécule d'anticorps ou une fraction Fv, Fab, F(ab')2 ou Fab' de la molécule d'anticorps. Λ * 61
56. Procédé selon la revendication 55, dans lequel la molécule d'anticorps comprend une molécule d'anticorps monoclonal ou une fraction Fv, Fab, FCab'ig ou Fab' de la molécule d'anticorps 5 monoclonal.
57. Procédé selon la revendication 56, dans lequel l'anticorps monoclonal comprend G28-5 ou n'importe quelle fraction Fv, Fab, Fiab')^ ou Fab' de G28-5.
58. Procédé selon la revendication 56, dans lequel l'anticorps monoclonal est produit par une lignée de cellules d'hybridomes, déposée' à l'ATCC sous le numéro d'ordre HB9110, ou l'un ou l'autre de ses mutants, de ses recombinants ou de 15 ses dérivés appartenant au génie génétique.
59. Procédé selon la revendication 50, dans lequel le coordinat comprend une lymphokine.
60. Procédé selon la revendication 59, dans lequel la lymphokine comprend un facteur de 20 croissance de lymphocytesB.
61. Procédé selon la revendication 50, 55 ou 59, dans lequel l'agent antiprolifératif comprend un agent d'alkylation.
62. Procédé selon la revendication 50, 25 55 ou 59, dans lequel l'agent antiprolifératif com prend un antimétabolite.
63. Procédé selon la revendication 50, 55 ou 59, dans lequel l'agent antiprolifératif comprend un antibiotique.
64. Procédé selon la revendication 50, 55 ou 59, dans lequel l'agent antiprolifératif comprend un alcaloïde extrait de la pervenche (Pervinca).
65. Procédé selon la revendication 50, 55 ou 59, dans lequel l'agent antiprolifératif com- 35 prend une enzyme. \ 62 A * (
66. Procédé selon la revendication 50, 55 ou 59, dans lequel l'agent antiprolifératif comprend un complexe coordiné de platine.
67. Procédé selon la revendication 50, 5 55 ou 59, dans lequel l'agent antiprolifératif com prend un radio-isotope.
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