SE504675C2 - Ligander för att öka B-Cell-Proliferation - Google Patents

Description

504 675 2 10 15 20 25 30 35 de sig uppenbarligen från vissa B-celltillväxtfaktorer. Så exempelvis blockerar monoklonala antikroppar (mAb) mot en murin BCGF (O Hara m.fl., 1985, Nature (LondJ 315:333) eller mot human BCGF (Ambrus m. fl., 1985, J. Exp. Med. 162:13l9) BCGF-aktivitet men ej IL-l- eller IL-2-aktivitet. Ehuru B-celltillväxt- faktorerna skiljer sig från IL-l eller IL-2 synes de själva vara heterogena baserat på biokemiska data och differentialaktivitetvid olika B-cellsubuppsåttningar eller sa mstimuleri ngsanalyser. Så exempelvis har man identifierat 60 kilodalton (kDa) högmolekylär human BCGF, BCGF (hög), som skiljer sig från en 12-kDa lågmole- kylär form, BCGF (låg) (Ambrus m. fl., 1985, J. Clin. Invest. 75:732). Den cDNA som kodar for en 20-kDa murin-BCGF, som preliminärt betecknas B-cellstimule- rande faktor pl (BSF-pl), har nyligen klonats och sekvensbestämts (Noma m. fl., 1986, Nature 319:640). Rekombinant-lymfokinen har ej endast BCGF-aktivitet utan kan även aktivera vilande B-cellenoch inducerar differentiering av IgGI- producerande celler; således skiljer den sig från human-BCGF (hög) och BCGF (låg) både när det gäller molekylvikten och dess aktivitetsintervall.

Dessa aktiverings- och tíllväxtsignaler reglerar förmodligen celler genom att vâxelverka med specifika B-cellytstrukturer. Förutom den antigenspecifika signalen genom yta lg har flera andra B-cellyte-polypeptidkandidater identifie- rats, vilka på något sätt kan utöva verkan vid aktivering eller tillväxt av B- celler. Så exempelvis har cellytereceptorer for IL-l (Dower m.fl., 1985, J. Exp.

Med. 160:510) och IL-2 (Robb mfl., 1984, J. Exp. Med. 160:1126) karaktäriserats och nyligen har funktionella IL-2-receptorer identifierats på B-celler (Zubler m. fl., 1984, J. Exp. Med. 16021170; Jung m. fl., 1984, J. Exp. Med. 160:1597; Muraguchi m. fl., 1985, J. Exp. Med. 161:181). Receptorer för B-celltillväxt- och -aktiveringsfaktorer måste fortfarande till fullo karaktäriseras. Flera B-cel1yte- polypeptidkandidater har identifierats, vilka på något sätt kan utöva verkan vid aktivering eller tillväxt av B-celler. Så exempelvis fann Subbarao and Mosier (Subbarao m. fl., 1983, Immunol. Rev. 69:81-97) att monoklonala antikroppar (mAb) mot murin-B-cellantigenet Lyb2 aktiverar B-celler och nyligen har bevis framkommit som antyder att Lyb2 kan vara receptorn för BSF-pl (Yakura, 1985, Fed. Proc. 4411532). Vi har likaledes funnit att en lämplig mAb (1F5) mot en 35 kDa polypeptid, Bp35, aktiverar human-B-celler från G0 till G1 (Clark m. fl., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 8221766-1770; Gollay m. fl., 1985, J. Immunol. 135:37 95-3801). Aggregerad C3d eller antikroppar mot 140 kDa C3d-receptorn,.

Bp140, orsakar proliferation av B-celler, som är T-cellberoende (Melchers m. fl., 1985, Nature 317:264-267; Nemerow m. fl., 1985, J. Immunol. 1353068-3073; 10 15 20 25 30 35 s 504 675 Frade m.fl., 1985, Eur. J. Immunol. 15:73-76). Ehuru B-celltillväxtfaktorer har identifierats både hos mus och människa har receptorerna for dessa faktorer hittills icke isolerats. Wang och medarbetare (Wang m. fl., 1979, J. Exp. Med. 149: 1424-1433) framställde ett polyklonat antiserum, som identifierade en 54-kDa polypeptid (gp54) på human-B-celler och visade att kaninantisera mot gp54 i nducerade tonsill-B-celler till delning. Nyligen isolerade Jung and Fu (Jung m.fl., 1984, J. Exp. Med. 160:1919-1924) mAb (AB-1) mot ett 55-kDa antigen, som var begränsat till aktiverade B-celler och blockerar BCGF-beroende proliferation.

Huruvida antingen anti-gp54 eller AB-1 känner igen en BCGF-receptor är emellertid ännu icke känt. 3. Sammanfattning av uppfinningen Föreliggande uppfinning avser en ligand, som utmârks av att den (a) binder till Bp50, ett 50 kilodalton B-cell-ytantigen, och definieras av den monoklonala anti kroppen G28-5; (b) vid bindning till en aktiverad B-cell stimulerar denna att genomlöpa cellcykeln så att proliferationen av B-cellen ökas; och (c) vid bindning till vilande B-celler, i frånvaro av andra faktorer, ej stimulerar proliferation, varvid liganden utgörs av en monoklonal antíkroppmolekyl eller ett Fv-, Fab-, F( ab ')2- eller Fab '-fragment av den monoklonala antíkroppmolekylen innehållande det antigenkombinerande ställe som binder till Bp50-receptorn, framställd medelst en hybridomcell-linje, som har deponerats hos ATCC under depositions- numret HB9110.

Liganderna enligt föreliggande uppfinning kan vara kemiskt modifierade, exempelvis genom länkning eller koppling av en förening till liganden. Dylika föreningar innefattar, men är ej begränsade till cytotoxiska medel, terapeutiska medel, kemoterapeutiska I medel, markörer såsom radiomarkörer, färgämnen, enzymer, radioopak-föreningar och liknande. Ligandema enligt föreliggande uppfinning kan i modifierad eller omodifierad form användas för att styra, reglera och modifiera human-B-cellproliferation och/eller -differentiering Föreliggande uppfinning baserar sig på den upptäckten att två human-B- celldifferentieringsantigener, Bp35 och det häri beskrivna B-cellantigenet Bp50, uppenbarligen spelar avgörande roller som signalreceptorer vid B-cellaktivering.

Monoklonala antikroppar (mAb) mot Bp35 och Bp50 avger båda positiva signaler till B-celler, vilka stimulerar deras övergång genom cellcykeln. MAb mot bp35 utövar i likhet med anti-Ig-antikroppar i huvudsak verkan for att aktivera vilande B-celler att bli kompetenta for att inträda i Gl-fasen av cellcykeln. I 504 675 4 10 15 20 25 30 35 motsats härtill utövar en häri beskriven monoklonal antikropp eller dess F(ab')2- fragment mot Bp50, en 50-kDa polypeptid uttryckt på alla B-celler, verkan for att stimulera aktiverade B-celler att genomlöpa cellcykeln och ökar proliferationen av aktiverade B-celler. Monoklonala antikroppar mot Bp35 aktiverar i likhet med anti-lg-antikroppar tonsill-B-celler och inducerar låga nivåer av B-cellprolifera- tion. I motsats härtill varken aktiverar monoklonal anti-Bp50-antikropp separat B-celler eller inducerar B-celler till proliferation men ökar tillsammans med anti- Bp35- eller anti-Ig-antikroppar B-cellproliferationen. I detta avseende liknar verkan av anti-Bp50-antikroppen aktiviteten hos B-celltillväxtfaktorer (BCGF).

Så lite som 0,05 pg/ml av anti-Bp5O krävs för att öka proliferationen och i likhet med BCGF är anti-Bp5O effektiv även vid tillsats av 12-24 timmar efter det att B-celler har aktiverats med anti-lg eller anti-Bp35. Utan ytterligare exogena signaler inducerar anti-Bp35- och anti-BpSO-antikroppar tillsammans kraftig proliferation -av renade vilande B-celler. Dessa resultat visar att Bp35- och Bp50- ytmolekyler utövar verkan för reglerande kontroll av B-cellaktivering och -progression genom cellcykeln. På grund av den betydelse anti-Bp35 och liknande molekyler har på effekten och verkan av liganderna enligt föreliggande upp- finning införlivas härmed Clark m. fl., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:1766- 1770) genom hänvisning därtill.

Ehuru aktiviteten hos anti-Bp5O liknar aktiviteten hos BCGF (låg) eftersom både anti-Bp5O och BCGF (låg) är samstimulerande med samma medel men ej med varandra och både anti-Bp5O och BCGF (låg) endast påverkar aktiverade B-celler och arbetar i en löslig form, kan aktiviteten hos anti-Bp5O särskiljas från aktiviteten hos BCGF (låg) eftersom proliferationen av B-celler, som har stimulerats med optimala mängder av anti-Bp5O och anti-Bp35 (eller anti-Ig), kan ökas ytterligare med BCGF (låg) och både blod-B-celler och vissa B- cell-lymfom svarar olika på anti-Bp5O kontra BCGF. För optimal aktivitet bör anti-Bp5O tillsättas inom 12 timmar efter B-cellaktivering, medan BCGF (låg) bibehåller optimal aktivitet även vid tillsats 24 timmar efter aktivering. Vidare uttrycks Bp5O på alla B-celler medan receptorer eller BCGF (låg) är begränsade till aktiverade B-celler. Således kan anti-Bp5O och BCGF (låg) samverkande reglera B-celltillväxten men gör uppenbarligen så via olika signaler.

Enligt en utforingsform av föreliggande uppfinning kan ligander, som binder till Bp5O och ökar proliferationen av aktiverade B-celler, användas för att öka ett immunsvar. Så exempelvis kan dessa ligander, som binder till Bp50, användas som "adjuvans" for att öka ett immunsvar mot ett vaccin. Alternativt 10 15 20 25 30 35 5 504 675 kan dessa ligander användas för att öka immunsvaret hos en individ med immunsuppression.

Enligt en annan utföringsform kan liganderna enligt uppfinningen kemiskt modifieras så att de ceUer till vilka liganderna binder dödas. Eftersom samtliga B-celler uttrycker Bp50-antigenet skulle denna metod kunna resultera i suppres- síon av immunsvaret. Så exempelvis kan ett cytotoxiskt läkemedel, som är kopplat till en ligand enligt föreliggande uppfinning, användas in viuo för att framkalla immunsuppression i syfte att passera histokompatibilitets-barriärer hos transplantatpatienter; alternativt kan dessa modifierade ligander användas för att kontrollera autoírnmunsjukdomar.

Enligt en annan utföringsform av föreliggande uppfinning kan maligna celler, såsom tumörceller, vilka uttrycker Bp50, behandlas under användning av en ligand enligt uppfinningen kopplad till ett kemoterapeutiskt medel, som är användbart för behandling av en dylik neoplastisk sjukdom. Dessa modifierade ligander kan användas in uiuo för att styra det kemoterapeutiska medlet mot varje typ av malign cell, som uttrycker Bp50-antigenet, innefattande celler som ej är B-celler men som uttrycker Bp50. Vid användning av liganderna enligt uppfinningen, vilka ökar B-cellproliferationen, kan en speciell fördel uppnås vid behandling av maligna B-celltillstånd, där det kemoterapeutiska medel som kopplas till liganden innefattar ett sådant som är effektivare när det gäller att döda proliferativa celler; i detta fall bör en potentiering av lâkemedelsverkan kunna uppnås.

Alternativt kan liganderna enligt uppfinningen användas in vitro för att identifiera eller separera celler, som uttrycker BpÖO-antigenet, och/eller för analys av kroppsvätskor med avseende på närvaron av Bp50-antigenet, vilken kropps- vätska eventuellt har avtappats. Vidare kan ligandema enligt uppfinningen användas in. vivo i syfte att avbilda celler eller tumörer, som uttrycker Bp50- antigenet.

Det renade Bp50-antigenet kan användas för framställning av antikroppar och för framställningeller konstruktion av andra ligander enligt uppfinningen.

Vidare kan Bp50-antigenet användas vid analyser såsom diagnostiska immun- analyser. Bp5O kan dessutom själv användas som mediator av cellimmunitet in viuo eller in vitro. 3.1. Definitioner De förkortningar som används i föreliggande sammanhang har följande 504 675 6 10 15 20 25 30 35 betydelser: AO = akridinorange BCGF = B-celltillvâxtfaktor BCGF (hög) = en 60 kDa human-BCGF BCGF (låg) = en 12 kDa human-BCGF Bp35 = en 35 kDa specifik B-cellyte-polypeptid (CDZO) definie- rad av mAb lF5 Bp50 = en 50 kDa specifik B-cellyte-polypeptid definierad av mAb G28-5 Fv = den variabla regionen eller antigenkombinerande stället hos en antikroppmolekyl. Denna kan vara vilket som. helst fragment som innehåller idiotypen av mole- kylen innefattande men ej begränsad till Fab F(ab')2, Fab' och liknande.

IF = immunfluorescens Ig = immunglobulin IL-l = interleukin 1 IL-2 = interleukin 2 kDa = kilodalton mAb = monoklonal antikropp SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gelelektrofores TPA = 12-O-tetradekanoylforbol-IB-acetat 4. Beskrivning av figurerna Fig. 1. Expression av Bp50 är begränsad till Bp35 i B-celler. Cytometrisk två färgsfl ödesanalys av 50.000 celler utfördes såsom beskrivits (Clark m. fl., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-17 70). Data avsett som celltal mot log av grön fluorescens och log av röd fluorescens, där 4-5 punkter representerar en ungefärli- gen fördubbling av fluorescensen. Data presenteras fór att visa autofluorescerande negativa celler. PE (röd)-anti-Bp35 (1F5)-färgníng kontra FITC (grön)-anti-Bp50 (G28-5)-f'ärgníng visar att samtliga Bp50+-celler även år Bp35 +.

Fig. 2. Biokemiskjämfórelse av Bp50-polypeptid med andra B-cellyteanti- gener. Immunprecipitation av Bp50 från 125 I-märkta tonsill-ytceller utfördes såsom beskrivits. Isolerade antigener underkastades elektrofores på 10% SDS- polya krylarnid-gelplattor utan reduktion. Gelerna visualiserades med autoradio- grafi och intensifierande skärmar. Panel A: spår 1, anti-Bp50 (G28-5); spår 2, anti- 10 15 20 25 30 35 7 504 675 Bp95 (G28-8); spår 3, sepharose-get-anti-mus-Ig enbart. Exponeringstid: 4 dagar.

Panel B: spår 1, anti-Bp5O (G28-5); spår 2, anti-Bp45 (BLAST-2); spår 3, anti-Bp39 (G28-1); spår 4, anti-Bp39 (41-H16); spår 5, sepharose-get-anti-mus-Ig enbart. En exponeringstid av två da gar valdes så att banden i spåren 2-4 ej överexponerades och lätt kunde särskiljas från Bp50. Ett av tre försök.

Fig. 3. Tvåfärgs-immunofluorescensanalys av Bp50-expression. Perifera blodceller eller enkärniga toncillceller isolerades genom centrifugering på Ficoll och färgades med PE (rödykonjugerade G28-5_(anti-Bp50)-antikroppar i kom- bination med fluorescein (grön)-konj ugerade referensantikroppar innefattande 2C3 (anti-IgM); (anti-Bp35); HBIOa (anti-DR); och 9,6 (anti-CD2, E-receptor). Celler analyserades med en FACS IV försedd med fyradekadig log-förstärkare i både röda och gröna dimensioner. Framåtriktat och högervridet spritt ljus användes för att spärra monocyter. Ofärgade celler är placerade på baksidan av gallret; röd fluorescens är till höger och grön fluorescens är till vänster.

Fig. 4. Dos-svarskurvor för ökning av proliferationen av täta tonsill-Er-B- celler med anti-Bp50-antikroppar såsom angivits; endast medium; anti-Bp5O enbart; anti-Bp35 (5 reg/ml enbart; BCGF enbart; anti-Bp35 plus BCGF; anti-Bp35 plus gra derade doser av anti-Bp50. Medelproliferation z standardfelet vid fyrdubbelprover uppmättes på dag 3.

Fig. 5. Anti-Bp50-mAb är synnerligen effektiva för att öka proliferationen vid tillsats efter en B-cellaktiveringssignal. Kompakta tonsill-Er-B-celler in- kuberades under 4 da gar med endast medium, anti-Bp5O (0,5 lig/ml) tillsatt vid olika tidpunkter efter inkuberingen, anti-Bp35 (5 leg/ml) tillsatt vid olika tid- punkter efter inkuberingen; anti-Bp5O i konstant halt till vilken sattes anti-Bp35 senare vid olika tidpunkter; anti-Bp35 i konstant halt till vilken sattes anti-Bp5O till kulturer vid olika tidpunkter. Under de sista 10 timmarna tillsattes 3H- tymidin och dess införlivande uppmättes.

Fig. 6. Jämförelse av förmågan hos anti-Bp35 och anti-Bp5O att inducera vilande tonsill-B-celler att lämna GO-stadiet i cellcykeln. Dag 3 efter behand- lingen endast medium ( ), endast anti-Bp35 (-); och endast Ig (.....), A, icke några tillsatta additiv; B, anti-Bp5O (0,5 leg/ml) tillsatt till varje grupp; C, 5% BCGF tillsatt till varje grupp. Data är avsatta som relativt celltal kontra log av AO röd fluorescens (RNA).

Fig. 7. Kinetíken hos B-cellproliferation efter stimulering med anti-Bp5O kontra BCGF. Kompakta tonsi ll-E-B-celler stimulerades med medium enbart; 10% BCGF enbart; anti-Bp35 enbart; anti Bp5O enbart; anti-Bp35 plus 10% BCGF; 504 675 8 5 10 15 20 25 30 35 anti-Bp35 plus anti-BpöO; och anti-Bp35 plus anti-Bp5O plus 10% BCGF. Pro- líferatíonen uppmättes på de angivna dagarna medelst en 18-timmars puls av 3H- tymidin. Proliferationen uppmättes i fyrdubbla prover och standardfelen visas.

Ett av tre försök.

Fig. 8. Tidpunkter efter anti-Bp35-stimulering vid optimal anti-Bp50(A)- eller BCGF'(B)-ökning av proliferationen. Kompakta tonsill-E-B-celler stimulera- des såsom visas och proliferationen uppmättes medelst en 18-timmars puls av 3H- tymidin på dag 3. Medium; anti-Bp35 enbart tillsatt vid angivna tidpunkter; anti- Bp50 el ler BCGF enbart; anti-Bp35 tillsatt vid odlingens början följt av en tillsats av anti-Bp5O eller BCGF vid angivna tidpunkter; anti-Bp5O eller BCGF tillsatt vid odlingens början följt av anti-Bp35. Ett av två försök. Proliferationen upp- mättes i fyrdubbla prover och standardfelen visas. Använda doser: anti-Bp35, 5 /cg/ml; anti-Bp50, 0,2 /eg/ml; BCGF (låg) 5%. Använda koncentrationer var följande: anti-Bp35, 5 jeg/ml; anti-BpöO, 0,2 pg/ml; BCGF, 5%.

Fig. 9. Anti-Bp5O och BCGF har additiva effekter på B-cellproliferationen.

Kompakta tonsill-E-B-celler stimulerades med graderade doser av BCGF (låg) tillsammans med anti-Bp50 enbart; anti-Bp35 enbart; anti-Ig-kulor enbart; anti- Bp35 plus anti-Bp50; eller anti-Bp50 plus anti-Ig. Proliferationen uppmättes på dag 3 efter stimulering med en 18-timmars puls av aH-tymidin. Proliferationen uppmättes i fyrdubbla prover och standardfelen visas. Ett av fyra försök. Doserna utnyttjade 106 celler: anti-Bp35, 5 jag/ml; anti-Bp50, 0,2 yg/ml; anti-Ig-kulor, 50 /lg/ml.

Fig. 10. Jämförande effekter av anti-Bp5O och BCGF på normala och maligna B-celler. Perifera blod E-B-celler (A) eller kompakta tonsill E-B-celler (C) stimulerades med eller utan TPA (75 ng/ml) i närvaro av 10% BCGF eller 1 yg/ml anti-Bp50. Två separata lš-cell-lymfom (panelerna B och D) stimulerades på samma sätt. Proliferationen uppmättes på dag tre genom införlivande av 3H- tymidin under en 12-timmars puls. Proliferationen uppmättes i fyrdubbla prover och standardfelen visas. 5. Detaljerad beskrivning av uppfinningen Föreliggande uppfinning avser en ligand, som utmärks av att den (a) binder till Bp50, ett 50 kilodalton B-cell-ytantigen, och definieras av den monoklonala anti kroppen G28-5; (b) vid bindning till en aktiverad B-cell stimulerar denna att genomlöpa cellcykeln så att proliferationen av B-cellen ökas; och (c) vid bindning till vilande B-celler, i frånvaro av andra faktorer, ej stimulerar proliferation, 10 15 20 25 30 35 9 504 675 varvid liganden utgörs av en monoklonal antikroppmolekyl eller ett Fv-, Fab~, F(ab')2- ell er Fabïfragment av den monoklonala antikroppmolekylen innehållande det antigenkombinerande ställe som binder till Bp50-receptorn, framställd medelst en hybridomcell-linje, som har deponerats hos ATCC under depositions- numret HB9110.

Liganderna enligt föreliggande uppfinning innefattar monoklonala anti kroppmolekyler och fragment av dessa antikroppmolekyler, som innehåller det antigenkombinerande ställe som binder till Bp50-receptorn, inklusive kemiskt modifierade antikroppar och fragment; dylika fragment innefattar Fv, Fab, F(ab')2 och Fabï Liganderna enligt uppfinningen kan användas i sin modifierade eller omodifierade form för att modulera och reglera immunsvar och vid terapi av maligna tillstånd, som uttrycker Bp50-antigenet. Dessa användningar diskuteras närmare i detalj i avsnitt 5.4 nedan. \ Når liganden är en monoklonal antikropp eller ett fragment därav kan den monoklonala antikroppen framställas mot Bp5O under användning av vilken som helst teknik som medger framställning av antikroppmolekyler genom kontinuerli- ga cellinjer i odling. Så exempelvis faller inom ramen för föreliggande uppfinning den hybridomteknik som ursprungligen utvecklades av Kohler och Milstein (1975, Nature 256:495-497) liksom annan teknik, som mera nyligen har blivit tillgäng- lig, såsom human-B-cell-hybridomtekniken (Kozbor m. fl., 1983, Immunology 'Today 4:72) och EBV-hybridomtekniken för framställning av monoklonala humanantikroppar (Cole m. fl., 1985, Monoclonal Antíbodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., sid. 77-96) och liknande.

Antikroppfragment, som innehåller idiotypen av molekylen, kan alstras medelst känd teknik. Så exempelvis innefattar dylika fragment: F(ab')2-fragrnen- tet, som kan alstras genom att man behandlar antikroppmolekylen med pepsin; Fabïfragmen-ten, som kan alstras genom att man reducerar disulfidbryggorna i F(ab')2-frag1nentet; F(ab')2-fragrnentet, som kan alstras genom att man behandlar antikroppmolekylen med papain; och 2Fab- eller Fab-fragmenten, som kan alstras genom att man behandlar antikroppmolekylen med papain och ett reduktions- medel fór att reducera disulfidbryggorna.

Beroende på den avsedda användningen kan liganden eller lämpliga fragment av liganden kemiskt modifieras genom koppling till liganden av någon av en mångfald föreningar under användning av inom tekniken känd kopp- lingsteknik. Dylik teknik kan innefatta, men är ej begränsad till användningen av ka rbodiimid, cyanogenbromid, bifunktionella reagens såsom glutaraldehyd, N- 504 675 10 10 15 20 25 30 35 succinimidyl-B-(Z-pyri dylditio)-propionat(SPDP), Schiffskabasreaktioner, koppling till sulfhydrylgrupper, användningen av natriumisotiocyanat eller enzymtisk koppling, för att nämna några få. När en radioisotop skall kopplas till liganden kan detta även åstadkommas på enzymatisk väg, genom oxidativ substituering, komplexbildning etc. För en sammanfattning av de kemiska reagens som kan användas för proteinmodifiering hänvisas till Lundblad och Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification, Vol II, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, kap. 5, sid 123-139, 1984.

Den kemiska länkningen eller kopplingen av en förening till liganden kan dirigeras till ett ställe på liganden som ej deltar i bindningen till Bp50. Detta kan åstadkommas genom att man skyddar bindningsstâllet i liganden innan man utför kopplingsreaktionen. Så exempelvis kan liganden först bindas till Bp5O i syfte att skydda Bp5O bindningsstället bch därefter kan kopplingsreaktionen utföras för att länka den önskade föreningen till tillgängliga reaktiva ställen på ligand-Bp50-komplexet. Då kopplingsreaktionen är fullbordad kan komplexet sönderdelas och därvid alstra en modifierad ligand, till vilken den önskade föreningen är kopplad, så att BpSO-bindningsstället i molekylen påverkas till ett minimum. Når liganden innefattar en monoklonal antikropp, såsom G28-5, i vilken Fc-domänen i molekylen ej krävs för att liganden skall utöva sin verkan (se avsnitt 5.3.3 nedan), kan det vara fördelaktigt att dirigera kopplingen av de önskade föreningarna till molekylen Fc-domän.

Underavsnitten nedan beskriver den nya 50-kDa B-cellytmarkören, Bp50, som uppenbarligen utövar verkan vid B-cell-proliferation, liksom ligander som binder till den nya 50kDa-receptorn och deras anvândningar. Som exempel på ligander enligt föreliggande uppfinning beskrivs även en monoklonal antikropp, som definierar Bp50, och dess F(ab')2-frag1nent, som i likhet med BCGF ökar B- cell proliferationen. I motsats till anti-Bp35 mAb, som kan inducera vilande B- celler i G0 att inträda i G1, aktiverer ej anti-Bp5O mAb vilande B-celler. Anti- Bp35 och anti-Bp5O mAb inducerar tillsammans, utan några ytterligare exogena signaler, kraftig aktiyering och proliferation av renade B-celler.

De försök som beskrivs nedan visar även att anti-Bp50-aktiviteten liknar BCGF-aktiviteten men att anti-Bp5O skiljer sig från en BCGF, eftersom anti-Bp5O och lågmolekyl är BCGF är klart additiva och verkar olika på olika B-cell- subuppsättningar eller maligna B-cell-tillstånd. Bp5O kan vara en receptor för en distinkt BCGF eller för en transmembransignal, som modulerar BCGF-produktion el ler BCGF-receptorexpression. 10 15 20 25 30 35 11 _ 5 Û 4 6 7 5 5.1. Metoder använda för att karaktärisera BQEO-recegtorn Cellpreparat. Enkärniga celler isolerades från normalt eller leukemiskt hepariniserat perifert blod medelst Ficoll-Hypaque-gradienten (Pharmacia, Piscataway, NJ). Enkärniga celler erhölls från tonsillvåvnad såsom beskrivits (Clark m. fl., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770). T-celler fórbrukades med AET-beha ndladfårerytrocyt-rosettering och Ficoll-Hypaque gradientsepara- tion. Vid vissa försök anrikades blod-B-celler genom "isolering av nylonull- vidhäftande celler. Monocyter avlägsnades genom inkubering i plastpetriskålar en eller två gånger vid 37° under 45 minuter, om ej annat anges. Flytande eller kompakta tonsill-B-cel lfraktioner isolerades medelst Percoll-steggradienter såsom beskrivits (Clark m.fl., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 8221766-1770). Kompakta tonsill-B-cellpreparat hade genomgående mer än 95% sIg+ Bp35 +-celler. Blod-B- cellanrikade preparat hade 60-857: sigi-celler. B-cell-lymfomceller isolerades genom att 'man försiktigt "retade" lymfomceller i medium följt av Ficoll-Hypaque gradientcentrifugering.

Monoklonala antikroppar. G28-5-antíkroppen mot Bp5O alstrades genom att man immunicerade BALB/c-möss med E-humantonsillymfocyter och fusionera- de immuna rniältceller med NS-l-myelom (Kohler m. fl., 1975, Nature 256495- 497; Ledbetter m. fl., 19.79, Immunol. Rev. 47:63-82). Hybridcellkulturer, som avsöndrade antikropp som var reaktiv med tonsill-B-celler och ej med T-celler, identifïerades genom användning av indirekt immunfluorescens (IF) och analys med en FACS IV-cellsorterare; kulturer med antikropp, som gav histogram- mönster liknande känd mAb mot pan-B-cellmarkörer (exempelvis Bp35) klonades och utvaldes fór vidare undersökning. G28-5-klonen producerade en IgG1-mAb, som reagerade endast med normala eller maligna B-celler eller B-cellinj er. Andra mAb som användes vid denna undersökning har beskrivits i detalj (Clark m. fl., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 821766-1770; Clark m. fl., 1986, Human Immunol, 16:100; Ledbetter m. fl., 1986, Human Immunol. 15:30-44; Ledbetter m. fl., 1985, i Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, sid. 325-340). Dessa innefattar 1F5 (lgGza) anti-Bp35, HB10a (lgGga), anti-HLA-DR, 2C3, (IgGI) anti-u-kedja, G19-4 (lgGl) anti-CD3, FC-2 (lgGza) anti- Fc-receptor CD16 och 9,6 (lgGza) anti-CD2 (E-receptor) tillhandahållen av Dr.

Paul Martín (Martin m. fl., 1983, J. Immunol. 131:180). IgGI-mAb renades genom precipitation Linder användning av 45%-i gt eller 50%-igt mättat ammoniumsulfat och DEAE-Sephacryl-kolonnkromatografering och IgG2a-mAb renades genom användning av protein A-Sepharose-kolonner. F(ab')2-fragxnenten av G28-5 504 675 H 10 15 20 25 30 35 framställdes medelst en av Parham angivna metoden (Parham m. fl., 1983, J.

Immunol. 131:2895), som renades på en 2 meter lång Sephacryl S200-kolonn och analyserades med avseende på renheten medelst SDS-PAGE (Ledbetter m. fl., 1985, J. Immunol. 135:1819). 2C3-mb mAb mot u-kedjor konjugerades till Sepharose 4B-kulor (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala) under användning av cyanogenbromid-koppling.

Fluorescein- och fykoerytrin-konjugationer. Renad mAb konjugerades antingen direkt med fluorescein under användning av fluorescein-isotiocyanat (FlTC; Molecular Probes) (grönt) medelst den av Goding angivna metoden (Goding m. fl., 1976, J. Immunol. Meth. 131215-226) eller konjugerades till R-fykoerytrin (PE) (rött) genom användning av SPDP (Pharmacia) medelst den metod som vi i detalj har beskrivit i Ledbetter m. fl., 1985, i Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6,\119-129. Lymfoidceller inkuberades i rundbottnade mikrotiterplattor under 30 minuter med lämplig spädning av grön och/eller röd mAb, tvättades två gånger och analyserades därefter på en FACS IV-cellsortera re.

Tvåfärgsimmunofluorescens. Tvåfärgsundersökningar utfördes med en fluore- scens-aktiverad cellsorterare (FACS IV: Becton-Dickinson-Mountain view, CA) genom användning av en 560 nm dikroisk spegel för uppspjälkning av strålen och ett 580 långpassage-filter och ett 540 kortpassage-filter (Ditric Optics, Hudson, MA) framför det röda respektive gröna fotomultiplikatorröret. Vidare användes en tvâfärgskompensator (T. Nozaki, Stanford University) fór att korrigera för mindre överskott av gröna och röda signaler. För varje tvåfárgad fläck uppsam- lades data från 40.000 celler och förvarades på disketter. Data anges som celltal (vertikalt) kontra log grön. fluorescens kontra log röd fluorescens på ett 64 x 64- punktersraster. Cirka 4,5 punkter representerar en fördubbling av fluorescensen.

Ofärgade celler är lokaliserade vid det bakre hörnet av rastret; röd fluorescens är till höger och grön fluorescens är till vänster. Vårt flödescytometrisystem för tvåFárgs-IF med fluorescein och fykoerytrin beskrivs närmare i detalj (Ledbetter m. fl., 1985, i Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, 119-129 och 325-340).

Cellodling. Blod- eller tonsillymfoidceller odlades vid 5-10 x 105 ml i fyrdubbla prover i mikrotiterplattor med 96 fack innehållande 200 ul RPMI-1640- medium, kompletterat med 15% bovinfetalserum, antibiotika, glutamin och pyruvat (R15). Efter 1-7 dagar pulsades cellerna med 0,5 yCi av sH-tymidin per 10 15 20 25 30 13 504 675 fack (New England Nuclear, 6,7 Ci/mmol; 1 ci=37) under 18 timmar. Cellerna skördades därefter på glasfiberfilter med en cellskördare och radioaktiviteten uppmättes i en scintillationsräknare. Vid vissa försök tillsattes antikroppar eller faktorer vid olika tidpunkter efter odlingsstarten; proliferationen vid dessa försök uppmättes på dag 3.

Samstimulerande faktorer. Renad BCGF köptes från Cytokine Technology (Buffalo, New York) och innehöll icke någon påvisbar IL-1-, Il-2- eller interferon- aktivitet. Denna BCGF framställdes medelst den metod som har angivits av Maizel och medarbetare (Maizel m. fl., 1982, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 7915998), som har visat att BCGF-huvudaktiviteten i detta material är att hänföra till ett IZ-kDa-fragment, som i det följande betecknas "BCGF (låg)" (Metha m. fl., 1985, J. Immunol. 1353298). Reningsstegen innefattade DEAE-affinitetskromatografi i preparatív skala, följt av hydroxylapatid-kolonnkromatografi. IL-l renad till homogenitet utgjorde en generös gåva från Dr. Steven Dower (Dower m. fl., 1985, J. Exp. Med. 162:501). Rekombinant IL-2 tillhandahölls välvilligt av Cetus Corporation. TPA (12-O-tetradekanoylforbol-13-acetat) köptes från Sigma.

Påvisande av cellaktivering. Förändringar i cellvolym inducerade av mAb och/eller andra faktorer uppmättes under användning av en cellsorterare och framvinkelljusspridare. Cellcykeländringar på cellulär RNA- och DNA-nivå uppmättes genom färgning av aktiverade celler med akridinorange och uppmät- ning av den relativa cellulära RNA(röd)- och DNA(grön)-halten med en cellsor- terare enligt den metod som har angivits av Darzynkiewicz m. fl., (Darzynkiewicz m. fi., 1980, Proc. Nat. Arari. sei. UsA vvreesv-svoz). Ändringar i relativa nivåer av cellyteantigener övervakades genom användning av mAb direkt konjugerad med fluorescei n och kvantifierades därefter medelst direkta IF-fluorescensnivåer med en Epícs V cellsorterare.

Biokemisk karaktârisering av Bp50. Immunprecipitation av Bp50 från 1251- ytmärkta tonsillceller utfördes såsom beskrivits (Ledbetter m. fl., 1985, J.

Immunol. 134:4250-4254). Isolerade antigener underkastades elektrofores på 10% SDS-polyakrylamid-gelplattor utan reduktion. Gelerna visualiserades under användning av autoradiografi vid -70°C och Cronex ljusgivande samt intensifie- rande skärmar (Dupont). 504 675 14 10 15 20 25 30 35 5.2. Karaktärisering av BQEO-recegtorn Underavsnitten nedan beskriver resultaten av de försök som utfördes under användning av ovan beskrivna metoder. 5.2.1. Identifiering av en specifik 50 kDa-B-cellyt_emarkör, Bp5O En mAb mot Bp5O framställdes genom immunisering av BALB/c-möss med humantonsillymfocyter och fusionering av immuna mjåltceller med NS-a myelo- met. En klon, G28-5, producerade en IgGI-mAb, som icke innehöll den lätta NS-l- kedjan. Vid noggrann undersökning medelst IS-analys visade sig G28-5 reagera endast med normala eller maligna B-celler eller B-cellinjer. En omfattande screening av normala vävnader medelst vedertagna metoder (Clark m. fl., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 8211766-1770; Ledbetter m. fl., 1986, Human Immunol. 15:30-44; Ledbetter, 1985, i Perspectives iri Immunogenetics and Histocompatibili- ty, ASHI, New York, 6, sid. 325-340) avslöjade att G28-5-antikroppen reagerar med E-rosettnegativa (Dr-) celler från blod eller tonsiller men ej med icke- nylonullvidhäftande T-celler, PHA-inducerade T-cellblaster eller med blodgranulo- cyter, monocyter, röda celler eller blodplättar. Den reagerade kraftigt med samtliga testade sju B-lymfoblastoidcellinjer och med tre Burkitts lymfomlinjer (Raji, Daudi, Namalwa) men ej med fyra T-cellinjer (CEM, HSB-2, JURKAT och HPB-ALL). Alla testade kroniska lymfocytiska leukemier (3/3) och 90% (9/ 10) av testade B-lymfom uttryckte Bp50-markören medan endast 28% (2/7) av akuta lymfocytiska icke-T-, icke-B-CALLA+-leukemier uttryckte Bp50.

Den begränsade fördelning av Bp5O i normala vävnader har ytterligare bekräftats genom kvantitativ tvåfärgs-immunofluorescensüvåfärg-IF)-analyser.

Under användning av en R-fykoerytrin(PE)-konjugerad antikropp (röd) mot pan-B- cellantigenet Bp35 (B1, CD20) och fluorescein-konjugerad anti-Bp50-antikropp (grön) har vi funnit att Bp5O uttrycktes endast i Bp35+ B-celler (Fig. 1) i blod eller tonsiller. Blod-B-celler uttryckte genomgående något lägre nivåer av Bp5O än tonsill-B-celler; detta liknar HLA-DR-expression (Ledbetter m. fl., 1986, Human Immunol. 1530-44) och gp54-expression (Wang m. fl., 1979, J. Exp. Med. 1491424-1433), som även är lägre i blod-B-celler. Bp5O uttrycktes på liknande nivåer på tonsil1-B-cellsubpopulationer separerade med Percoll-gradienter i flytande och kompakta fraktioner. Under användning av vår PE-konjugerade mAb mot T-cellmarkören, CDS (T3), och den NK-cellassocierade markören, CD16 (Fc-receptor) (Ledbetter m. fl., 1979, Immunol. Rev. 47 :63-82), har vi funnit att Bp5O ej uttrycks på T-celler eller N K-celler. Under användning av tvåFärgs-IF har 5 10 15 20 25 30 35 15 504 675 vi även funnit att CD3 + PHA-blaster, som uttryckte höga nivåer av IL-Z-recepto- rer, ej uttryckte Bp50.

G28-5-antikroppen reagerade med en enda polypeptid på tonsill-lymfocyter, som migrerade vid cirka 50 Kd under icke-reducerande betingelser (Fig. 2A).

Denna molekyl är större än tidigare rapporterade B-cellmarkörer inom samma molekylviktsintervall, såsom Bp39 eller Bp45 (Zipf m. fl., 1983, J. Immunol. 13113064-3072; Kitner m. fl., 1981, Nature 294, 458-460; Clark m. fl., 1986, i Leukocyte Typing II, red. Reinherz m. fl., Springer Verlag, Berlin, kap. 12 vol. 2, 155-167; Slovin m. fl., 1982, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79:2649-2653; Thorley- Lawson m. fl., 1985, J. Immunol. 134:3007-3012 och Fig. 2B). Exponeringstiden för denna gel valdes så att molekylvikterna fór de andra B-cellmarkörerna lätt kunde _iämföras med Bp50. Bp39-markören uttrycks i motsats till Bp5O på granulocyter och Bp45 år i motsats till Bp5O begränsad till B-cellblaster. Anti- kroppar mot Bp39 (41-H16) och Bp45 (MNM6, Blast-1, Blast-2), som har gjorts tillgängliga via en internationell arbetsgrupp (Clark m. fl., 1986 i Leukocyte Typing II, red. Reinherz m. fl., Springer Verlag, Berlin, kap. 12 vol. 2, 155-167), blockerade ej bindningen av fluoresceínerade anti-Bp50-antikroppar mot B-celler.

Baserat på vävnadsffórdelning, biokemisk analys och blockeringsstudier känner således den monoklonala antikroppen G28-5 igen en 50-Kd-struktur som skiljer sig från andra kända B-cellantigener. 5.2.2. Egression av ßgäfl är begränsad till B-celler Både hematopoi etiska vävnads- och cellinjefördelningsstudier och detaljera- de tvåiärgs-flödescytometriska analyser har avslöjat att Bp5O uttrycks endast på B-lymfocyter. Såsom åskådliggörs i Fig. 3 uttrycks Bp5O på en liten underupp- såttning av blodlymfocyter och på en stor population av tonsillymfocyter. Prak- tiskt taget alla Bp50+-celler i både blod och tonsiller uttryckte även Bp35 och HLA-DR men uttryckte ej CD2 (Fig. 1) eller CD3, T-cellmolekyler eller de IgG FC- receptorer som återfinns på N K-celler. Vidare uttryckte ConA-aktiverade CD3 +- T-cellblaster IL-Z-receptorer men uttryckte ej Bp50.

Cytometriska tvåfärgsflödesanalyser medger kvantitativ bestämning av täthetsförhållandet mellan två yta ntigener. Vi har tidigare visat att de kompakta vilande B-cellerna i mantelzonen av sekundära follikler uttrycker IgM och låga nivåer av Bp35 medan de flytande aktiverade B-cellerna i det germinala centret är IgM-negativa och uttrycker förhöjda nivåer av Bp35 (Ledbetter m. fl., Human Immunol. 15:30). Figur 3 visar att både IgM-positiva och IgM-negativa B-cell- 504 675 16 10 15 20 25 underuppsättningar uttryckte Bp50 i lika mängder, vilket antyder att Bp50 uttrycks både på vilande B-celler och B-celler aktiverade in viuo. 5.3. Ökning av B-cellgroliferationen med anti-Bgöfl-antikrogg Såsom tidigare förklarats kan B-celler aktiveras med låga doser av specifika antí-u-kedje-antikroppar. Vi har nyligen funnit att den B-cellspeciñka markören Bp35 (Bl), en 35-kDa-polypeptid, även kan utöva verkan vid tidig B- cellaktivering: 1F5-mAb mot Bp35 aktiverar i likhet med låga doser av anti-u- antikropp B-celler till att öka i cellvolym och i RNA-halt och att svara på BCGF (Clark m. fl., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770; Gollay rn. fl., 1985, J. Immunol. 135:3795-3801). Därför var det av intresse att jämföra verkningarna av anti-Bp50-mAb vid proliferationen av obehandlade B-celler eller B-celler aktivera de med antingen anti-Bp35- eller ahti-u-antikroppar (Tabell 1). Anti-Bp35 i lösning eller anti-u-antikroppar bundna till Sepharose-kulor, kunde under lämpliga betingelser separat stimulera viss B-cellproliferation (Tabell 1, rad 1); i motsats härtill stimulerade ej anti-Bp50-antikroppar separat proliferation (Tabell 1, rad 2). Emellertid ökade anti-Bp50-mAb proliferationen avsevärt vid odling med anti-u-kulor eller med anti-Bp35. I detta avseende liknade anti-Bp50- BCGF (Tabell 1, rad 3). Det var således väsentligt att fastställa huruvida anti- Bp50 och BCGF tillsammans kunde inducera B-cellproliferation. Såsom åskåd- liggörs i Tabell 1, rad 4, inducerade anti-Bp50 och BCGF tillsammans icke någon proliferation men ökade proliferationen av antingen anti-u- eller anti-Bp35- aktiverade celler något mera än endera stimuleringsmedlet enbart. BCGF hade inom ett trelog-intervall vid användning med anti-Bp50 utan andra signaler icke någon verkan på proliferationen av kompakta B-celler, icke ens när anti-Bp50 användes i doser varierande från 0,1 till 10 lag/ml.

Tabell I Ökning av anti-Ig- eller anti-BpBS-inducerad B-cellproliferation med anti-Bp50- antikroppar . 10 15 20 25 30 17 V 504 675 Medelproliferation i standardfel for B-celler odlade med: Linje Samstimul. Medium Anti-u-pärlor Anti-Bp35 medel 1 ingen 1212 1547 10219:462 55391308 2 anti-Bp50 7191718 3879211329 25465:616 3 BCGF 456 *_- 217 14217 *_- 445 9443 r 343 4 anti-Bp50 + BCGF 1456: 126 543931-2537 46488:3387 \ Proliferation av kompakta Er-tonsill-B-celler (95% IgM + -ytceller) uppmättes på dag 3 såsom beskrivits. I korthet innebär detta att 2 x 105 celler/200 irl-fack odlades i fyrdubbla prover under 48 timmar med RPMI 1640-medium innehållan- de 15% bovinfetalserum plus additiv utan antikropp eller med antingen mono- klonal 2C3-antikropp mot u-kedjor kopplade till Sepharose-kulor ("anti-u-kulor", 50 icg/ml) eller fri 1F5-anti-Bp35-antikropp (5 pg/ml). Kulturer innehållande medium, "anti-u-kulor" eller anti-Bp35 odlades separat eller med BCGF (5% slutkoncentration, Cytokine Technology, Buffalo, New York; har icke någon påvísbar IL-l- eller IL-2-aktivitet) med anti-Bp50 (1:1000 utspädning av ascites) som samstimulerande medel. Efter 40 timmar pulsades cellerna med ßH-tymidin och införlivade pulstal uppmättes efter 18 timmar. 5.3.1. Anti-Bg50-mAb ökar groliferationen endast efter det att B-celler har aktiverats med anti-Bg35- eller anti-Wang' oggar Resultaten i Tabell 1 visar att anti-Bp50-mAb ej kunde inducera pro- liferatíoni sig. Såsom visas i Fig. 4 hade doser av anti-Bp50 varierande från 0,05 ,ug till 2,0 leg/ml icke någon effekt på aH-tymidinupptagningen. I närvaro av optimala nivåer av anti-Bp35-mAb ökade emellertid så liten mängd som O,1-0,5 pg/ml av anti-Bp50-antikroppar proliferationen väsentligt. Så mycket som 50.000- 70.000 pulser per minut kunde påvisas vid den optimala proliferationstiden när högrenade B-celler odlades endast med anti-Bp35 plus anti-Bp50. En genom- gående observation var att högre doser av anti-Bp50 (över 2-5 yg/ml) var mindre effektiva än doser inom intervallet 100-200 ng. 504 675 w 10 15 20 Dessa resultat visade att anti-Bp50 kan utöva verkan endast efter det att B-celler har aktiverats med andra signaler. Data i Fig. 5 visar att detta verkligen är fallet. Om B-cellerna först har aktiverats med anti-Bp35 kunde anti-Bp50 tillsättas så sent som 24-48 timmar senare och fortfarande öka proliferationen på dag 4. När celler först behandlades med anti-Bp50 vari motsats härtill anti-Bp35 endast effektiv om _ den tillsattes inom några timmar efter odlingsstarten.

Liknande resultat erhölls när anti-u i stället för anti-Bp35 användes. 5.3.2. Anti-Bg50-mAb aktiverar ej B-celler ut från Go men inducerar aktiverade B-celler att gå igenom cellcykeln Vi har tidigare funnit att anti-Bp35, i likhet med låga doser av anti-u- antíkroppar, inducerar vilande tonsill-B-celler i G0 att förstora sig (Clark m. fl., 1986, Leukocyte Typing II red., Reinherzl m. fl., Springer Verlag, Berlin, vol. 2, 455-462) och-att inträda i cellcykelns Gl-fas (Gollay m. fl., 1985, J. Immunol. 13513795-3801). Det var således av intresse att jämföra förmågan hos anti-Bp50- mAb och hos anti-BpRS-mAb att utöva verkan på B-cellaktivering. Såsom visas i Fig. 6A hade icke-stimulerade kompakta tonsill-B-celler även efter 3-4 dagars odling enjämn RNA-profilka raktäristik av celler i G0 (Darzynkiewicz, 1980, Proc.

Nat. Acad. Sci. USA 7 7 :6697-6702). Cirka 15-30% av de celler som hade stimule- rats med anti-Bp35 eller anti-u hade emellertid ökad RNA-halt, vilket tydde på inträde i G1. I motsats härtill inducerade varken anti-Bp50 (Fig. 6B) eller BCGF (Fig. 6G) separat något signifikant antal B-celler att inträda i G1. Så exempelvis inducerade anti-Bp35 och anti-Ig-mAb 2 dagar efter aktivering 13,5 respektive 20,97: av tonsil lceiler att inträda i G1, medan celler behandlades med endast anti- Bp50 (2,7°7r) eller BCGF (3,2%) förblev på mediumkontrollnivåer (2,2%). När endera anti-Bp5O eller BCGF emellertid tillsattes tillsammans med anti-Bp35- eller anti-u-antikroppar ökade drastiskt antalet celler som inträdde i G1. Lika- ledes inducerade ej anti-BpSO och BCGF separat B-celler att inträda i S-fasen (Tabell 2) men tillsammans med antingen anti-Bp35 eller anti-u ökades antalet S-fasceller 2- till S-faldigt. 5 10 20 25 30 ,, 504 675 Tabell 2 Effekt av anti-Bp5O och BCGF på cellcykelprogression i tonsill-lymfocyter Kompetens- Progressions- % celler S/Gz/M signal signal GO G1 medium ingen 89,9 7,1 2,5 anti-Bp35 ingen 80,4 14,5 3,7 anti-Ig ingen 65,6 27,6 5,7 medium anti-Bp5O 83,6 12,0 3,3 antí-Bp35 anti-Bp5O - 54,1 35,5 9,7 anti-lg anti-Bp5O 43,6 36,2 16,2 medium BCGF 85,4 11,7 2,2 anti-Bp35 BCGF 56,6 32,6 11,6 anti-Ig BCGF 48,4 36,1 14,1 Procentuella andelen celler i G0, G1 eller S och G2 bestämdes med an- vändning av akridinorange-färgningsfórfarandet (Darzynkiewicz m. fl., 1980, Proc.

Nat. Acad. Sci. USA 7 7:6697-6702); 1 x 106 kompakta tonsill-lymfocyter med anti- Bp35 (5 /eg/ml), anti-u på kulor (50 pg/ml), anti-Bp5O (0,4 gig/ml), BCGF (5%) eller kombinationer såsom visas. 5.3.3. Optímala betingelser för att öka B-cellgroliferationen med anti-Bp50- antikroggar Antikroppar mot Bp5O har som sådana ringa eller ingen påvisbar effekt på kompakta vilande B-celler (Tabell 3). I närvaro av medel, som kan aktivera B- celler, såsom anti-Ig,-anti-Bp35 och TPA, ökar emellertid antí-Bp50-mAb klart proliferationen. Anti-Bp5O utövar icke samstimulerande verkan med flera interleukiner, innefattande renad IL-1, rekombinant IL-2 och BCGF (låg). En jämförelse av effekten av anti-Bp5O med effekten av BCGF (låg) visade att samma medel som utövade samstimulerande verkan med anti-Bp5O även utövade samstimulerande verkan med BCGF (låg) (Tabell 3). Av speciellt intresse var upptäckten att BCGF och anti-Bp5O tillsammans fortfarande icke utövade någon 'so4 675 20 10 15 20 25 30 samstimulerande verkan på vilande celler.

Tabell 3 Ökning av B-cellproliferationen med anti-Bp50-antikroppar eller B-celltillväxt- faktor Medelproliferation 1 standardfel för B-celler odlade med: Samstimulera nde Medium Anti-Bp50_ BCGF medel (200 ng/ml) (5%) inget 9611 267115 285174 anti-Ig 58331391. 4163412103 25094161 anti-Bp35 l (5 pg/ml) ' 457 1 45 8143 1280 1733 1 32 'FPA (2 ng/ml) 73611537 211631871 1306411030 IL-l (10 U/ml) 26412 308123 22118 IL-2 (100 U/ml) 204134 35017 2201 11 BCGF (5%) 22017 851128 270118 Kompakta Er-tonsill-B-celler (mer än 95% sIgM+-cel1er) odlade 48 timmar med 2 x 105 celler/fack följt av 24 timmars pulsning med 3H-tymidin före puls- räkning.

Kinetiken för den proliferation som ökades med anti-Bp50 visas i Fig. 7.

Proliferationstoppen inträdde på dag 4 och avtog därefter vare sig eller ej cellerna aktiverades med anti-Bp35 eller andra aktivatorer såsom anti-Ig eller TPA.

Kinetiken för 'den proliferation som ökades av BCGF eller av anti-Bp50 var lika.

Så liten mängd som 0,05 pg av anti-BpSO-antikroppar ökade proliferatio- nen. En optimal dos av 0,3 /Ig/ml användes i efterföljande undersökningar. En genomgående observation var att vid användning av hela antikroppmolekyler högre doser av anti-Bp50 (större än 2-5 pcg/ml) var mindre effektiva än doser inom intervallet 0,1-0,5 yg/ml.

Humana B-celler är utomordentligt känsliga för inhiberande effekter som förmedlas av Fc-receptorerna hos antikroppar som binder till yt-Ig (Parker, 1980, Immunol. Rev. 522115; Bijsterbosch m. fl., 1985, J. Exp. Med. 162:1825). Det var således väsentligt att jämföra effektiviteten hos hel anti-Bp50-mAb med effektivi- 10 15 20 25 30 21 5 0 4 6 7 5 teten hos anti-Bp50-F(ab')2-fra gment. Inom ett 100-faldigt dosintervall var F(ab')2- fragmenten klart lika effektiva som eller effektivare än hel antikropp när det gällde att öka B-cellproliferationen (Tabell 4). Således krävs icke Fc-domänen av anti-Bp50-mAb för att anti-Bp50 skall utöva sin verkan och kan eventuellt vara inhiberande. Med andra ord kan anti-Bp50 i likhet med BCGF uppenbarligen tjäna som en löslig mediator utan medverkan av Fc-receptormedierad tillhörande cellfunktion.

Tabell 4 Fc-domänen av anti-BpSO-antikroppar krävs ej för att öka B-cellproliferation Medelproliferation hos B-celler odlade med: \ Anti-Bp50' Dos Medium Anti-Bp35 (u g/ ml) Ingen -- 295 1 16 269 1 27 Hel Ab % 0,125 278132 5140120 1,24 275124 46861342 12,5 1631 15 38521203 F(ab')2 0,125 594 121 10635 1449 1,25 53113 108931575 12,5 27918 94111870 Cellodlingsbetingelserna var de som har beskrivits i Tabell 3. 5.3.4. Skillnader mellan anti-Bp50- och BCGFQågLaktivitet Anti-Bp50 och BCGF (låg) hade liknande effekt på B-celler och var samsti- mulerande med samma medel (Tabell 3). Flera indicier antyder emellertid att anti-Bp50 och den BCGF som användes vid denna undersökning uppenbarligen arbetar via olika signaler. För det forsta uttrycks Bp50-molekyleri motsats till BCGF(låg)-receptorer (Bijsterbosch m. fl., 1985, J. Exp. Med. 162: 1825) på vilande blod-B-celler (Fig. 3). För det andra var anti-Bp50 klart optimalt effektiv vid tillsats 12 timmar efter odlingsstarten (Fig. 8A) ehuru både anti-Bp50 och BCGF (låg) utövar sin verkan synnerligen effektivt vid tillsats efter anti-Bp35 eller anti- 504 .675 22 10 15 20 25 Ig. I motsats hårtill kunde BCGF (låg) tillsättas så sent som 24 timmar efter odlingsstarten och fortfarande optimalt öka proliferationen (Fig. 8B). Dessa kinetikförsök, som bygger på en modell enligt Howard och Paul (1983, Ann. Rev.

Immunol. 1:307), visar att en Bp50-beroende signal normalt kan utöva sin verkan före BCGF.

Både anti-Bp50 och BCGF (låg) ökade proliferationen av B-celler aktiverade med anti-Bp35 eller anti-lg (Tabell 3). Effekten av anti-Bp50 och BCGF (låg) var emellertid additiv vid många försök (Fig. 7). Fig. 9 visar en titrering av BCGF (låg) vid ett försök, där anti-Bp50 användes i sin optimala koncentration (0,2 pg/ml). BCGF (låg) kunde ytterligare öka proliferationen av vilande Bfceller i närvaro av anti-Bp50 efter aktivering med antingen anti-Ig eller med anti-Bpßö.

Optimala koncentrationer av BCGF (låg) var 5-10%, medan 25% var inhiberande.

När således anti-Bpöf) och BCGF (låg) båda användes i sina optimala koncentra- ti oner iippvisade de fortfarande additiva effekter på B-cellproliferationen.

Slutligen skilde sig både normala och maligna B-cellunderuppsättningar åt när det gällde deras svar på anti-Bp5O och på BCGF (låg). Så exempelvis svarade vissa blod-B-celler på BCGF (låg) men svarade ej på anti-Bp5O (Tabell 5).

En ytterligare aktiveringssignal, såsom anti-Bp35 (Tabell 5) eller TPA (Fig. 10), var genomgående nödvändig för att få blod-B-celler att svara på anti-Bp50. Medan kompakta tonsill-B-cel ler i allmänhet ej svarade på varken BCGF eller anti-Bp50, svarade flytande B-celler (Tabell 5). Maligna B-celltillstånd skilde sig även åt när det gällde deras svar på anti-Bp5O kontra BCGF. Så exempelvis svarade vissa B- cell-lymfom på TPA plus BCGF (låg) men ej på TPA plus G28-5-anti-Bp5O (Fig.

IOB och D). I motsats härtill svarade kompakta tonsill-B-celler och perifera blod- B-celler på TPA plus antingen BCGF (låg) eller anti-Bp50 (Fig. 10A och C). 23 504 675 .^Nm. ummcficuuwwmmflumflcs __ cofluxmuuv møcmuæfim umafim Aumfifimmv muxmmsox HHHH Hmucmwwmumsflfiooumm m:Hcwcm>:m uwwcfl mmwmuwcoHuxßuw umuæoouëæfl |um|HHHm:oB .m:HumHsEHum wunw mEEHu _ umfimxmummfim wa mcHumn:x:H Eocmw uwuæoocøë :www umu>oøwE>H|m|@0Hn mmflmwuwmn m xßmunm H .Am xmmuæm :oo _ xmmummv :wm:HuwHsEHum mumw cmuum: um>m umfiwxmummfim wa m:Huwnsx:H Eocmm umuæuocoë cwum mmvmHHwwA .uwuæoocoë msfim umfifimunmv uwu>o0wE>H©0HQ wflcmuumn©H>HH::oH>z ._ Hfimnmæ H muH>Huxmwn Eowwm ummHmmcHumnmm:HHwoHHwo +I _N mmæ N m_ H NHN _ m__ H MHN N 11 || Nøum + ommm-H»=~ @N_ H MHN N mmm _ H mmm wm mmm H Nww m_ www H HNN N_ || mNmm|H»=~ . + °mmm|H»=~ Nm H NN_ _ oæ H m_« N m__ H www NN H m«w om H qmm .Ns\@= m. mNmm|H»=~ ON H Nvm _ N H NNN _ NN H _m_ _ _m H N_° _ NN H N_m .He\@= m_Q_ , _ .ommm|H»=m Nm H _m« _ NN H NNN «__ H NQNN NNO N W Hmm NN NNQ _ H @_N ~_ .Nm_ Nwum N_ H Nwm _ NH H mwm @°_ H wow NN_ + mmm GN H »Nm . =@m=H wu=m»>Nm mßxmmsox N xwmumm N xwmuwm __ xmmumm m=H~wH=eH»m ~wH__m=oa . uoHm cmuw umuæuowäæfi Hmm Afiwwwumwcmum HV :oHumumuHHoumHwum2 mUUm Hwflflw ommm|Hucm wm um>m mcHm H um mHm umfifiwxw um@cHcuuwmmmsHwflc:|HHmuzm m Admmdë 504 675 24 10 15 20 25 30 35 5.4. Användning av anti-Bgöfl-liggnder och Bp5O Liganderna enligt föreliggande uppfinning kan användas in uíuo eller in uitro i deras omodifierade eller modifierade former för att modulera immunsvar.

Så exempelvis kan liganderna som sådana användas som ett "adjuvans" för att öka ett immunsvar mot ett vaccin eller för att öka immunsvaret hos en immuno- suppressiv individ. Alternativt kan, om cytotoxiner eller anti-proliferativa medel kopplas till liganderna, dessa modifierade ligander användas för att minska ett immunsvar, exempelvis vid autoimmunsjukdom eller hos transplantat-patienter för att undvika avstötning. Dessa modifierade ligander skulle även kunna användas för att behandla maligna tillstånd, som innefattar celler eller tumörer, som uttrycker Bp50-antigenet, vare sig maligniteten liggeri den ursprungliga B- cellen eller ej.

Både liganderna enligt föreliggande uppfinning och/eller Bp5O som sådan kan användas in uitro. Dylika applikationer innefattar analyser in uitro, såsom immuna nalyser för att påvisa celler, som uttrycker Bp50-antigenet, och/eller för att påvisa eventuellt utsöndrat Bp50-antigen i kroppsvätskor. I detta fall skulle liga nden eller Bp5O kunna märkas med en radiomarkör, fluor, enzym, enzymsub- strat, fårgämne, etc. Vidare kan liganderna användas för att separera och/eller identifiera celler, som uttrycker Bp50-antigenet, i vilket fall liganden kan kopplas till en icke-mobil bära re eller till fluor, som kan användas i en FACS (fluorescens- aktiverad cellsorterare).

De olika applikationerna och användningama av liganderna och Bp5O enligt föreliggande uppfinning diskuteras närmare nedan. 5.4.1. Bpäß-recegtor och :invändningar av ligander såsom anti-B 250 för att öka B-cellgroliferation Tidigare undersökningar har visat att de faktorer som är involverade vid índuktionen av B-celler från G0- till Gl-fasen av cellcykeln skiljer sig från de faktorer som krävs för inträde i S-fasen. Denna modell baserar sigi huvudsak på undersökningar, som..visar att sådana medel som låga doser av anti-Ig-B-cellakti- veringsfaktorer eller anti-Bp35 separat har ringa eller ingen verkan på B- cellproliferation. Ändock kan samma medel driva B-cellerna till ett stadium i cellaktiveringen där de är känsliga för tillväxtfaktorer. I motsats härtill har sådana tillväxtfaktorer som BCGF eller IL-2 enbart icke någon effekt på vilande B-celler men ökar tillväxten av aktiverade B-celler.

Ehuru föreliggande uppfinning icke är begränsad till någon speciell teori 10 15 20 25 30 35 25 , 504 675 eller förklaring ger de häri framkomna resultaten ytterligare belägg för en modell med specifik reglering av B-cellaktiverings- och tillväxtsteg. Vi har här visat att aktiverings- och proliferationssignaler i human-B-celler kan överföras via specifika cellytestrukturer. Ehuru anti-Bp35-mAb aktiverade B-celler till att inträda i Gl-fasen av cellcykeln separat, inducerade den ringa eller ingen proliferation. Anti-Bp-SO-mAb hade motsatt verkan; den kunde ej aktivera B-celler men vid tillsats till och med så sent som 12-24 timmar efter aktivering kunde den inducera B-celltíllväxt. _ Bp50-molekylen skulle förmodligen normalt kunna utöva verkan som antingen en receptor för en ligand, såsom en löslig tillväxtfaktor, eller för en signal förmedlad genom cell-cell-kontakt (dvs. en ligand funnen på ytan av en annan cell). Tidigare undersökningar har identifierat flera T-cellhårrörande B- celltillväxtfaktorer, vilka i likhet med anti-Bp50 ökar B-cellproliferation. Både högmolekylära och lågmolekylära former av B-celltillväxtfaktorer har identifie- rats och olika typer har visat sig ha additiva effekter (Kehrl m. fl., 1984, Immu- nol. Rev. 18175-96; Kishimoto, 1985, Ann. Rev. Immunol. 3133-157; Swain m. fl., 1983, J. Exp. Med. 158:822-835; Howard m. fl., 1984, Immunol. Rev. 78:185-210; Ambrus m. fl., J. Clin. Invest. 75:732-739; Ambrus, 1985, J. Exp. Med. 16211319- 1335). Således kan Bp50 vara en receptor för en av dessa faktorer.

Med undantag av lL-Z-receptorer och C3d-receptorerna har receptorer på B-celler för tillväxtsignaler ännu icke identifierats. mAb-Ab-1 reagerar med en B-cellmarkör, som endast uttrycks på aktiverade B-celler och blockerar BCGF- beroende proliferation och således skulle kunna känna igen BCGF-receptorn eller en besläktad struktur. Bp50 synes skilja sig från AB-1-markören eftersom AB-l- mAb ej blockerar bindningen av G28-5-anti-Bp50-antikroppen och i motsats till G28-5-mAb endast reagerar med aktiverade B-celler (Jung m. fl., 1984, J. Exp.

Med. 1601919-1924). Bp50 finns på alla B-celler, vilket baserat på absorptions- analys och direktbindníngsanalys icke synes vara fallet för BCGF-receptorer.

Våra nuvarande data antyder att Bp50 och receptorn för lågmolekylär BCGF är olika strukturer. Under användning av ett kanin-heteroantiserum har tidigare Wang och medarbetare (Wang, 1979, J. Exp. Med. 149:1424-1433)beskrivit ett 54- kDa glykoprotein, gp54, som i likhet med Bp50 uttrycks på alla B-celler men på lägre nivåer på blod-B-celler än på tonsill-B-celler. Det är möjligt, men ej troligt, att kaninheteroantiserumet och anti-Bp50 känner igen samma eller besläktade strukturer: i motsats till anti-Bp50-mAb var kaninantiserumet mot gp54 enbart tillräckligt för att stimulera B-cellproliferation. 504 675 26 10 15 20 25 30 35 Anti-Bp35 kan enbart, i motsats till anti-Bp50, aktivera B-celler från G0 till G1 och kan således betecknas som en "aktiverings"-signal. Huruvida Bp35 utövar verkan endast vid tidig B-cellaktivering eller ej är ännu icke klarlagt, eftersom anti-Bp35-antikroppar kan stimulera vissa B-celler till delning (Clark m. fl., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 8221766-1770). Likaledes kan Bp50 icke strikt utöva verkan endast som en "tillväxt"-signal: anti-Bp50-antikroppar tillsammans med aktiveringssignaler (anti-Bp35 eller anti-u) icke endast ökar proliferationen utan ökar även det totala antalet B-celler som inträder i G1 (Tabell 2). Med andra ord verkar anti-Bp50 som samstimulerande medel för att befrämja progressionen av både aktiveringsiGo till G1)- och ti1lväxt(G till S)- faserna av cellcykeln. Den BCGF som användes vid dessa undersökningar hade även liknande aktivitet (Fig. -6C). Således synes anti-Bp35 och anti-Bp50 (eller BCGF) vara synnerligen analoga med de "kompetens"- och "progessions"-faktorer som har beskrivits vid undersökningar av fibroblasttillväxtreglering. Hur B-celler svarar på anti-Bp35 eller anti-Bp50 kan uppenbarligen bero på deras tillstånd av differentering eller aktivering, Här har vi visat att två mAb, anti-Bp35 (en "kompetens"-signal) och anti- Bp50 (en "progressions"-signal) tillsammans kan inducera väsentlig proliferation av högrenade B-celler i frånvaro av antigen eller andra kända faktorer. De naturliga liganderna för dessa strukturer är ännu icke kända. Eftersom emeller- tid mAb för lämpliga epitoper kan härma både lösliga faktorer och signaler förmedlade genom cell-cell-växelverkningar, kan det vara möjligt att använda lämpliga kombinationer av mAb för att styra och reglera human-B-cellprolifera- tion eller -differentiering Detta i sin tur kommer att medverka till att anvisa strategier in. uiuo för kontroll av humansjukdomar såsom maligna B-celltillstånd, i mmunbristsjukdomar och vissa autoimmunsjukdomar.

Den nya monoklonala antikroppen, G28-5, som reagerar med en enkelked- jig polypeptid om cirka 50 Kd uttryckt på ytan av human-B-celler, är endast en speciell utföringsform av liganderna enligt föreliggande uppfinning, vilka kan öka proliferationen av aktiverade B-celler. Eftersom human-B-cellproliferatíon likaledes kan ökas med T-cellhärrörande B-celltillvâxtfaktorer innefattande låg- och högmolekylär BCGF, har vi jämfört aktiviteten hos anti-Bp50-G28-5 med aktiviteten hos ett BCGF-preparat innehållande i huvudsak lågmolekylär BCGF.

Anti-Bp50-G28-5 och BCGF (låg) var mycket lika genom att de utövade samstimu- lerande verkan med samma aktiveringsmedel (anti-lg, anti-Bp35 och TPA) men ej utövade samstimulerande verkan med varandra eller med IL-l eller Ilf2. 5 10 15 20 25 30 35 27 _ 504 675 Vidare var aktiviteten hos anti-Bp50-G28-5 ej beroende av dess Fc-domän eftersom Ffabïz-fragment av G28-5 var funktionellt aktiva. Detta antyder att löslig anti-Bp50, i likhet med löslig BCGF, ej kräver Fc-receptorbärande till- kommande celler för att utöva verkan. Vidare är både anti-Bp5O och BCGF effektiva endast i närvaro av ett aktiveringsstimulerande medel. Med andra ord är anti-Bp5O och BCGF icke "kompetens"-faktorer utan befrämjar istället "progressionen" av B~celler genom cellcykeln.

Ehuru det är möjligt att Bp5O kan utöva verkan som receptor för en sådan ligand som en B-celltillväxtfaktor, antyder flera resultat att Bp5O ej är receptorn åtminstone för den BCGF (låg) som användes vid denna undersökning: den uttrycks på blod-B-celler medan BCGF(låg)-receptorer uppenbarligen icke gör så.

Kandiderande strukturer för BCGF(låg)-receptorn uttrycks, i motsats till Bp50, även endast på aktiverade B-celler. Vidare skiljer sig både normala och maligna B-cellpopulationer åt vad gäller deras svar på anti-Bp5O kontra BCGF (låg) (Tabell 5 och Fig. 10). Så exempelvis förökar sig vissa B-lymfom som svar på BCGF (låg) men ej som svar på anti-Bp50. Slutligen inducerade vid ett antal försök optimala koncentrationer av anti-Bp5O och BCGF tillsammans mera proliferation än endera av dessa separat. Anti-Bp5O immiterar aktiviteten hos annan BCGF, såsom BCGF (hög), som utövar samstimulerande verkan med anti- IgM (Ambrus m. fl., 1985, J. Exp. Med. 162:1319; Ambrus m. fl., 1985, J. Clin.

Invest. 75:7 32). Detta antyder att Bp5O skulle kunna utöva verkan som receptor för BCGF (hög).

Ehuru Bp5O kan vara receptor för en löslig ligand kan alternativt Bp5O utöva verkan som receptor för en cell-cell-medierad signal, som reglerar BCGF- receptornivåer och/eller autokrin produktion. Företräde för differentieringsanti- gener, som tjänar som förstärkare av en autokrin-receptor-väg, kommer från undersökningar med T-celler. MAb mot det vanliga leukocytantigenet Lp22O ökar proliferation genom att höja IL-Z-receptorexpression på aktiverade T-celler (Ledbetter, m.fl., 1985, J. Immunol. 135:1819). En analog mekanisk kan äga rum med anti-Bp5O och expression av vissa BCGF-receptorer. Bp5O och BCGF (låg) år uppenbarligen under någon koordinatkontroll eftersom BCGF i likhet med IL-l- och IL-Z-receptorer ökar expressionen av Bp5O på vissa leukemiska celler. Bp50- molekylen uppvisar även likheter med Tp44-molekylen, som utövar verkan på IL- Z-produktion. Vi och andra har visat att 9zß-anti-Tp44-antikroppen ökar prolifera- tionen av T-celler aktiverade av anti-CD3 eller TPA (Ledbetter, mfl., 1985, J.

Immunl. 1352331; Hara, mfl., 1985, J. Exp. Med. 161:1513). Likaledes ökar anti- 504 675 28 10 15 20 25 30 Bp5O prolifera tionen av B-celler aktiverade av anti-Bp35 eller TPA. Tp44-signalen utövar verkan genom att stimulera IL-Z-produktion i stället för att stimulera T- cell-tillväxt. Bp50-signalen skulle förmodligen kunna utöva verkan på ett analogt sätt genom att stimulera autokrin B-cellproduktion (Gordon, m.fl., 1984, Nature, rang. 3101145). 5.4.2. Modifierade liganden' använda för immunsuggression eller behand- ling av maligna tillstånd Enligt denna utföringsform kan liganden enligt föreliggande uppfinning modifieras genom tillkoppling av ett antiproliferatívt medel så att den resulte- rande molekylen kan användas för att döda celler som uttrycker Bp50-antigenet.

Dylika modifierade ligander .kan användas vid behandling av autoimmunsjuk- domar i syfte att undertrycka proliferatiönen av B-celler och därigenom under- trycka autoimmunsvaret. Dessa modifierade ligander kan även användas för ímmunsuppression av en transplantatpatient för att förhindra bortstötning av ett transplantat. Följaktligen kan cytotoxiska medel, som används för suppression av immunsvar, kopplas till liganderna enligt uppfinningen. Vid användning av ligander, som ökar proliferationen av B-celler, bör en ökad effekt erhållas eftersom läkemedlet riktas mot prolifererande B-celler.

Enligt en annan atföringsform kan liganderna enligt föreliggande uppfin- ning, vilka modifieras genom tillkoppling av ett antiproliferativt medel, användas för att behandla maligna tillstånd där tumörer eller celler uttrycker Bp50- antigenet. Kopplingen av dessa kemoterapeutiska medel till liganderna enligt uppfinningen bör resultera i en större specificitet hos läkemedlet med avseende på de maligna cellerna. Vidare bör en speciell fördel uppnås vid behandling av ett malignt B-cell-tillstånd med en ligand, som är kopplad till ett cytotoxin, som är mera effektivt när det gäller att döda prolifererande celler än icke-prolifere- rande celler; behandling med en dylik ligand bör resultera i en potentiering av cytotoxinets verkan.

Följaktligen innefattar de kemoterapeutiska medel eller antiproliferativa medel som kan kopplas till liganderna enligt föreliggande uppfinning de medel som anges i Tabell 6 nedan, som härrör från Goodnab och Gilman, The Pharmaco- logícal Basis of Therapeiitics, 6:e upplagan, MacMillan Publishing Co., Inc, New York, sid. 1249-1313, 1980, som införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill. 10 15 20 25 30 Tabell 6 29 504 675 Kemoterapeutiska medel som kan kopplas till anti-BQSO-ligander Klass Alkyleringsmedel Antimetaboliter Naturprodukter Olika medel TYP Kvä vesenap Etylenimin-derivat Alkylsulfonater Nitrosokarbamíder Triazener Folsyra-analoger "' Pyrimidin-analoger Purin-analoger Vinka-alkaloider Antibiotika Enzyrner Platinakoordinerade komplex Substituerad karbamid Metylhydrazin-derivat Medel Mek] oretamin Cyklofosfamid Melfalan Uracil/senap Klorambucil Tiotepa Busulfan Karmustin Lomustin Semustin Streptozocin Dakarbazin Metotrexat Fluoruracil Cytarabin Azaribin Merkaptopurin Tioguanin Vinblastin Vinkristin Daktinomycin Daunorubicin Doxorubicin Bleomycin Mitramycin Mitomycin L-asparaginas Cisplatin Hydroxiurea Prokarbazin 10 15 20 25 30 5 0 4 6 7 5 30 i Adrenokortikala Mitotan suppressionsmedel Hormoner och Adrenokortiko- Prednison antagonister steroider Progestiner Hydroxiprogesteronkaproat Medroprogesteronacetat Megestrolacetat Östrogener Dietylstilbestrol Etinylestradiol Antiöstrogen Tamoxifen Androgener Testosteronpropionat Fluoxmesteron Radioaktiva isotoper Fosfor \ Natriumfosfat 32P Jod Natrimmodid 1311 Vilken som helst känd metod inom tekniken kan användas för att koppla liganden till det kemoterapeutiska eller antiproliferativa medlet. Exempel på dylika metoder har tidigare uppräknats (se avsnitt 5 ovan). 5.4.3. Andra :invändningar av ligagder och BQO Förutom de terapeutiska applikationerna har liganderna och Bp5O som sådant andra tillämpningar vid diagnostiska analyser, separationsschema, etc. både in. uitro och in uivo.

Bp50-receptorn kan användas fór att framställa och/eller utforma ligan- derna enligt uppfinningen. Bp5O kan även användas med liganderna enligt uppfinningen- vid analysmetoder in vitro, som kräver en standard för att kvanti- fiera den mängd Bp5O som påvisas i ett prov. Slutligen kan Bp5O som sådant vara användbart som löslig faktor, som medierar immunitet, exempelvis en lymfokin. _ Förutom för terapeutisk behandling och diagnostiska analyser skulle liga nderna enligt föreliggande uppfinning kunna användas fór att identifiera eller separera celler, som uttrycker Bp50-antigenet. Om en lämplig radiomarkör eller radioopak förening kopplas till liganden skulle vidare liganden kunna användas fór bildåtergivning in vivo av tumörer, som uttrycker BpÖO-antigenet. Andra användningsområden år uppenbara för fackmannen med ledning av beskriv- 10 M 504 675 ningen ovan. 6. Deposition av cell-linjer Följande hybridom har deponerats hos American Type Culture Collection, Rockville, MD och har fórlänats nedan angivna depositionsnummer: Hybridom ATCC-depositionsnummer G28-5 HB91 10 Föreliggande uppfinning är icke begränsad till omfånget av det deponerade hybridomet eftersom den deponerade utfóringsfonnen är avsedd som en enstaka illustration av en aspekt av uppfinningen och vilka som helst cell-linjer som är funktionellt ekvivalenta faller inom ramen for denna uppfinning. I själva verket är talrika modifikationer av uppfinningen, förutom de som har beskrivits och visats ovan, uppenbara for fackmannen med ledning av föregående beskrivning och bifogade ritningar. Dylika modifikationer år avsedda att falla inom ramen får de bifogade patentkraven.

Claims (3)

'so4 675 32 10 15 PATENTKRAV

1. Väsentli gen ren ligand, kännetecknad därav, att den (a) binder till Bp50, ett 50 kil odalton B-cell-ytantigen, och definieras av den monoklonala antikroppen G28-5; (b) vid bindning till en aktiverad B-cell stimulerar denna att genomlöpa cellcykeln så att proliferationen av B-cellen ökas; och (c) vid bindning till vilande B-celler, i frånvaro av andra faktorer, ej stimulerar proliferation, varvid liganden utgörs av en monoklonal antikroppmolekyl eller ett Fv-, Fab-, F(ab')2- eller Fab'- fragment av den monoklonala antikropprnolekylen innehållande det antigen- kombinerande ställe som binder till Bp50-receptorn, framställd medelst en hybridomcell-linje, som har deponerats hos ATCC under depositionsnumret HB9110.

2. Li ganden enligt krav 1, kânnetecknad därav, att den dessutom innefattar en förening, kopplad till liganden.

3. Liganden enligt krav 2, kânnetecknad därav, att den till liganden kopplade föreningen är ett antiproliferativt medel, ett alkyleringsmedel, en antimetabolit, en antibiotikum, en vinka-alkaloid, ett enzym, ett platina-koordi- nerat komplex, en radioisotop eller en fluorescerande förening.