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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung eines im wesentlichen reinen
Liganden, der sich an Bp50, ein 50 Kilodalton B-Zellen-Oberflächenantigen bindet, sowie ein Verfahren zur
Unterdrückung der Proliferation von Bp50 exprimierenden Zellen.
Als Liganden werden allgemein im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Antikörpermoleküle oder
Fragmente von Antikörpermolekülen oder andere Liganden, wie Lymphokine, verstanden, die sich an einen B-Zellen-Oberflächenmarker mit 50 kD binden, der in der Folge als Bp50 bezeichnet wird und der bei der
Proliferation der B-Zellen, nicht jedoch bei der frühen Aktivierung der B-Zellen in Funktion tritt.
Das Bp50 Antigen ist durch einen neuen monoklonalen Antikörper G28-5 definiert, dessen Herstellung beschrieben wird.
Die genannten Liganden können zur Lenkung und Steuerung der Proliferation und/oder Differenzierung humaner B-Zellen verwendet werden. Ausserdem können diese Liganden durch Anhängen anderer Verbindungen modifiziert werden, die zur Behandlung und/oder Feststellung maligner Bp50 exprimierender Zellen verwendet werden.
Gemäss einem unveröffentlichten Vorschlag werden derartige Liganden zur Verstärkung der Proliferation von B-Zellen verwendet, indem aktivierte B-Zellen mit einer wirksamen Dosis eines solchen Liganden behandelt werden.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Unterdrückung der Proliferation von Bp50 exprimierenden Zellen durch Behandlung der Zellen mit einem entsprechend modifizierten Liganden der oben genannten Art.
Die Aktivierung ruhender B-Zellen aus der Go- in die Gi-Phase des Zellzyklus und die anschliessende Anregung der aktivierten B-Zellen zur Proliferation sind getrennte Stufen, die unterschiedliche Regulationsmechanismen erfordern. Manche Stoffe, wie der murine B-Zellen-Stimulierungsfaktor p1 (BSF-p1) (Rabin et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 2935-2939) oder geringe Dosen Antiimmunoglobulin (anti-IG) (DeFranco et al., 1985, J. lmmunol. 135 : 87-94 ; Wetzei, et. al. 1984. J. lmmunol. 133 : 2327-2332 ; DeFranco, et. aI. 1982, J. Exp.
Med. 155 : 1523-1536 ; Muraguchi, et. al., 1984, J. lmmunol. 132 : 176-180) sind "Aktivlerungs-" oder"Kompetenz-"Faktoren. Das heisst, dass sie die B-Zellen dazu veranlassen, grösser zu werden, mehr RNA zu produzieren und in G, einzutreten, dass sie jedoch allein nicht die DNA-Synthese in den B-Zellen induzieren. Andere"Wachstums-"Faktoren, wie der humane B-Zellen-Wachstumsfaktor (BCGF) und das Interleukin-2 (IL-2) veranlassen die aktivierten B-Zellen, durch den Zellzyklus hindurchzugehen und in die SPhase einzutreten, regen jedoch die ruhenden B-Zellen nicht an (Kehrl, et. al. 1984, Immunol. Rev. 18 : 75-96 ; Muraguchi, et. al., 1984, J. lmmunol. 132 : 176-180 ; Zubler, et. al. 1984, J.
Exp. Med. 160 : 1170-1183 ; Jung, et. al., 1984, J. Exp. Med. 160-1597-1604).
Von Forschern sowohl muriner als auch humaner Systeme wurden zahlreiche Faktoren beschrieben, die das Wachstum von B-Zellen promovieren. Unter diesen sind B-Zellen-Wachstumsfaktoren (BCGF), die von verschiedenen unterschiedlichen Quellen stammen, wie von T-Zellinien oder Hybridomen, B-Zellinien oder dendritischen Zellen. Obwohl für Interleukin-1 (IL-1) ebenso wie für Interleukin-2 (IL-2) gezeigt wurde, dass sie das B-Zellen-Wachstum verstärken, unterscheiden sie sich offensichtlich von bestimmten BCGFs. Beispielsweise blockieren monoklonale Antikörper (MAb) für einen murinen BCGF (O-Hara et al., 1985, Nature (London) 315 : 333) oder einen humanen BCGF (Ambrus et al, 1985, J. Exp.
Med. 162 : 1319) die
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sind, scheinen die BCGFs selbst heterogen zu sein in bezug auf biochemische Daten und die unterschiedliche Wirkung auf verschiedene B-Zellen-Untergruppen oder Costimulierungsassays. Beispielsweise wurde
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(niedrig),319 : 640). Das rekombinante Lymphokin hat nicht nur BCGF-Wirkung, sondern kann auch ruhende B-Zellen aktivieren und die Differenzierung von 1gag, produzierenden Zellen induzieren ; so unterscheidet es sich von humanem BCGF (hoch) und BCGF (niedrig) sowohl in seinem Molekulargewicht als auch in seinem Wirkungsbereich.
Diese Aktivierungs- und Wachstumssignale regulieren die Zellen wahrscheinlich durch die Wechselwirkung mit spezifischen Oberflächenstrukturen der B-Zellen. Zusätzlich zu dem antigenspezifischen Signal über das Oberflächen-Ig wurden verschiedene andere konkurrierend Oberflächen polypeptide von B-Zellen
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: 501) und IL-2Zellen-Wchstums- und Aktivierungsfaktoren noch vollständig charakterisiert werden. Verschiedene konkurrierende B-Zellen-Oberflächenpolypeptide wurden identifiziert, die in gewisser Weise auf die Aktivierung oder das Wachstum von B-Zellen wirken. Beispielsweise haben Subbarao und Mosier (Subbarao, et al., 1983, Immunol.
Rev. 69 : 81-97) gefunden, dass monoklonale Antiköper (mAb) für murines B-Zellen-Antigen Lyb2 B-Zellen aktivieren und vor kurzem wurden Arbeiten vorgelegt. in denen Lyb2 als Rezeptor für BSF-
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Obwohl BCGFs sowohl In Mäusen als auch in Menschen identifiziert worden waren, wurden die Rezeptoren für diese Faktoren noch nicht isoliert. Wang und Mitarbeiter (Wang et al. 1979, J. Exp. Med. 149 : 1424-1433) stellten ein polyklonales Antiserum dar, das ein 54 kDa Polypeptid (gp54) auf humanen B-Zellen identifizierte, und zeigten. dass das Kaninchen-Antiserum für gp54 tonsillare B-Zellen zur Teilung veranlasste. Vor kurzem isolierten Jung und Fu (Jung, et al., 1984, J.
Exp. Med. 160 : 1919-1924) einen mAb (AB-1) für ein auf aktivierte B-Zellen beschränktes 55 kDa-Antigen, der die BCGF-abhängige Proliferation blockiert. Es ist jedoch noch nicht bekannt, ob entweder anti-gb54 oder AB-1 einen BCGF-Rezeptor erkennen oder nicht.
Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Gewinnung eines im wesentlichen reinen Liganden, der sich an Bp50, ein 50 Kilodalton B-Zelien-Oberflächenantigen bindet, weiches Verfahren dadurch gekennzeichnet 1St, dass entweder aus einem Hybridom, das aus der Reaktion auf die Immunisierung durch das B-Zellen-Oberflächenantigen Bp50 stammt, welches Oberflächenantigen durch den von der Hybridom-Zellinie mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB9110 oder einer Mutanten, Rekombinanten oder einem durch gentechnische Massnahmen erhaltenen Derivat derselben produzierten monoklonalen Antikörper G28-5 definiert ist, oder aus natürlichen Quellen, wie Blutzellen, Serum oder anderen Körperflüssigkeiten.
-abscheidungen oder -ausscheidunge, der Ligand in Form eines Antikörpers, monoklonalen Antikörpers, insbesondere des monoklonalen Antikörpers G28-5, oder eines Fv-, Fab-, F (ab') 2- oder Fab'-Teiles desselben, gegebenenfalls in Kombination mit einem Lymphokin, isoliert und mit einer antiproliferativen Substanz gekuppelt wird.
Die Kupplung mit der antiprolifertiven Substanz erfolgt erfindungsgemäss mit dem Zweck, derartige Liganden zur Unterdrückung der Proliferation von Bp50 exprimierenden Zellen verwenden zu können.
Die neuen Liganden In Ihrer ungekuppelten Form umfassen Antikörper-Moleküle, monoklonale Antikörper-Moleküle und Fragmente dieser Antikörpermoleküle, die die Ant ! genbindungssteiie enthalten, oder chemisch modifizierte Antikörper und Fragmente : derartige Fragmente umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Fv, Fab, F (ab') 2, Fab'und dergl. Zusätzlich dazu sind in den Liganden der vorliegenden Erfindung gegebenenfalls auch Lymphokine enthalten, die humane B-Zellen-Wachstumsfaktoren ebenso wie chemisch modifizierte Lymphokine umfassen, jedoch nicht auf sie beschränkt sind. Die neuen Liganden können beispielsweise durch Verknüpfung oder Kupplung einer Verbindung an den Liganden chemisch modifiziert sein.
Solche Verbindungen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf cytotoxische, therapeutische, chemo-
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und dergl..
Im Laufe der Untersuchungen hat sich herausgestellt, dass zwei humane B-Zellen-Differentlatonsantlge- ne, Bp35 und das hier beschriebene B-Zellen-Antigen Bp50 offensichtlich eine unterschiedliche Rolle als Signalrezeptoren bei der B-Zellen-Aktlvierung spielen Belde monoklonalen Antikörper (mAb) für Bp35 und Bp50 liefern positive Signale für B-Zellen, die deren Durchgang durch den Zellzyklus stimulieren.
Der mAb
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wiePolypeptid, als Stimulierung für die aktivierten B-Zellen zum Durchgang durch den Zellzyklus und erhöht die Proliferation der aktivierten B-Zellen Monoklonale Antikörper für Bp35 aktivieren, wie die antl-Ig- Antikörper, die tonsillaren B-Zellen und induzieren in geringem Ausmass eine B-Zellen-Proliferation Im Gegensatz dazu aktiviert der monoklonale antl-Bp50-Antlkörper allein weder die B-Zellen, noch induziert er
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!-Bp35- oder antl-ig-AntikörpernZellen-Proliferation.
In dieser Hinsicht gleicht die Wirkung des antl-Bp50-Antikörpers der Wirkung des BZellen-Wachstumsfaktors (BCGF) So gennge Mengen wie 0, 05 um ml antl-Bp50 werden zur Verstärkung der Proliferation gebraucht und, wie BCGF. wirkt anti-Bp50, selbst wenn es 12 bis 24 Stunden nach der Aktivierung der B-Zellen mit antl-Ig oder anti-Bp35 zugesetzt wird.
Ohne zusätzliche exogene Signale
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induzieren anti-Bp35- und anti-Bp50-Antikörper gemeinsam eine starke Proliferation von gereinigten ruhen- den B-Zellen. diese Resultate deuten darauf hin, dass die Bp35-und Bp50-0berf) ächenmo) ekü) e eine
Funktion in der regulatorischen Kontrolle der B-Zellen-Aktivierung und der Progression durch den Zellzyklus hat. Hinsichtlich der Signifikanz, die die anti-Bp35- und ähnlichen Moleküle auf die Wirkung der neuen
Liganden haben, wird hier auf Clark et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 82 : 1766-1770 Bezug genommen.
Obwohl die Wirkung von anti-Bp50 oder von BCGF (niedrig) ähnlich ist, da sowohl anti-Bp50 als auch BCGF (niedrig) costimulierend mit den gleichen Substanzen jedoch nicht miteinander sind und sowohl anti-
Bp50 als auch BCGF (niedrig) nur die aktivierten B-Zelen beeinflussen und in löslicher Form wirken, kann die Wirkung von anti-Bp50 von der Wirkung von BCGF (niedrig) unterschieden werden, da die durch optimale Mengen anti-Bp50 und anti-Bp35 (oder anti-Ig) stimulierte Proliferation der B-Zellen weiter durch
BCGF (niedrig) verstärkt werden kann und sowohl Blut-B-Zellen als auch bestimmte B-Zellen-Lymphome unterschiedlich auf anti-Bp50 im Verhältnis zu BCGF reagieren.
Zur Erzielung der optimalen Wirkung sollte anti-Bp50 innerhalb von 12h nach der B-Zellen-Aktivierung zugegeben werden, während BCGF (niedrig) die optimale Wirkung auch bei Zusatz 24h nach der Aktivierung beibehält. Ausserdem wird Bp50 an allen B-
Zellen exprimiert, während die Rezeptoren oder BCGF (niedrig) auf aktivierte B-Zellen beschränkt sind.
Somit können anti-Bp50 und BCGF (niedrig) das B-Zellen-Wachstum koordiniert regulieren, tun dies jedoch offensichtlich über unterschiedliche Signale.
Abgesehen von der bereits erwähnten Verwendung derartiger Liganden zur Verstärkung der Proliferation von B-Zellen kann nun aber auch erfindungsgemäss die Proliferation von Bp50 exprimierenden Zellen unterdrückt werden, indem die genannten Liganden mit einer antiproliferativ wirkenden Substanz gekuppelt und die Zellen mit einer wirksamen Dosis derart modifizierter Liganden behandelt werden.
Ziel der Erfindung ist es dabei, die Zellen, an die sich die Liganden zu binden. abzutöten. Da alle BZellen das Bp50 Antigen exprimieren, würde diese Arbeitsweise zur Unterdrückung der Immunreaktion führen. Beispielsweise kann eine an einen genannten Liganden gebundende cytotoxische Substanz In vivo zur Hervorrufung der Immunsuppression verwendet werden, um die Histokompatibilitätsschranken bei Transplantationspatienten zu überwinden, andererseits können diese modifizierten Liganden zur Bekämpfung von Autoimmunkrankheiten dienen.
Bei einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können maligne Erscheinungen wie Tumorzellen, die Bp50 exprimieren, durch Verwendung eines erfindungsgemäss hergestellten Liganden, der an ein zur Behandlung dieser neoplastischen Krankheit geeignetes chemotherapeutisches Mittel gebunden ist, behandelt werden. Diese modifizierten Liganden können in vivo dazu verwendet werden, das Chemotherapeutikum an jede Art maligner Zellen, die das Bp50 Antigen exprimieren, inklusive jener Zellen, die keine B-Zellen sind, aber Bp50 exprimieren, heranzubringen.
Andererseits können die erfindungsgemäss hergestellten Liganden in vitro zur Identifizierung oder Trennung von Zellen verwendet werden, die das Bp50-Antigen exprimieren, und/oder es können Körperflüssigkeiten auf die Anwesenheit von gegebenenfalls vorhandenem Bp50-Antigen geprüft werden. Zusätzlich dazu können die Liganden in vivo zur Abbildung von Zellen oder Tumoren, die das Bp50 Antigen exprimieren, verwendet werden.
Das gereinigte Bp50-Antigen kann zur Herstellung von Antikörpern und zur Herstellung oder Konstruk- tion anderer Liganden verwendet werden. Ausserdem könnte das Bp50-Antigen in Assays, wie diagnostischen Immunoassays, verwendet werden. Weiters kann das Bp50 selbst als Vermittler von Zellimmunität in VIVO oder In vitro dienen.
Die folgenden hier verwendeten Abkürzungen haben die angegebene Bedeutung : AO - Acridinorange BCGF-B-Zetten-Wachstumsfaktor
BCGF (hoch)-ein humaner BCGF mit 60 kDa BCGF (niedrig)-ein humaner BCGF mit 12 kDA
Bp35 - 35 kDa B-Zellen-spezifisches Oberflächenpolypeptid (CD20), das durch den mAb
1 F5 definiert Ist, Bp50 - ein 50 kDa B-Zellen-spezifisches Oberflächenpolypeptid, das durch den mAb G28-5 definiert ist, Fv - die variable Region oder die antigen-bindende Stelle eines Antikörpermoleküls.
Diese kann jedes Fragment sein, das den Idiotyp des Moleküls enthält, inklusive Fab,- (F (ab') 2, Fab'und dergI., worauf sie jedoch nicht beschränkt ist ;
IF - Immunofluoreszenz
Ig - Immunoglobulin ) Interleukin-1
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IL-2 - Interleukin-2 kDa - Kilodalton mAb - monoklonaler Antikörper
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Beschreibung der Figuren
Figur 1 : Die Expression von Bp50 ist auf Bp35 B-Ze ! ! en beschränkt. Eine zytometrische Zweifarbenstromanalyse wurde nach der Beschreibung von Clark et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82 : 1766-1770 vorgenommen.
Die Ergebnisse sind als Zellanzahl gegen den Logarithmus der Grünfluoreszenz und den Logarithmus der Rotfluoreszenz aufgetragen, wobei 4-5 Punkte etwa eine Verdopplung der Fluoreszenz angeben. Die Ergebnisse sind dargestellt, um autofluoreszenz-negative Zellen darzustellen. Eine PE (rot)-
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(1F5)sind.
Figur 2 : Biochemischer Vergleich von Bp50 Polypeptid mit anderen B-Zellen-Oberflächenantigenen. Die
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Sepharose-Ziege anti-Maus lg allein. Es wurde eine Belichtungszelt von 2 Tagen ausgewählt, sodass die Banden in Streifen 2 und 4 nicht überbelichtet waren und klar In bezug auf Bp50 unterschieden werden konnten. Eines von drei Experimenten.
Figur 3 : Zwei-Farben-Immunofluoreszenz-Analyse der Bp50-Expression. Mononucleare periphere Blutzellen oder mononucleare tonsillare Zellen wurden durch Ficoll-Zentrifugieren isoliert und gefärbt mit PE (rot)-konjugiertes G28-5 (anti-Bp50) in Kombination mit Fluorescein (grün)-konjugierte Vergleichsantikörper, inklusive 2C3 (anti-IgM); 1F5 (anti-Bp35);HB10a (anti-DR); und 9, 6 (anti-CD-2, E-Rezeptor). Die Zellen wurden mit einem FACS IV, ausgestattet mit einem 4-Dekaden-Log-Amplifier sowohl in der roten als auch in der grünen Dimension, analysiert. Die gerade und rechtwinkelige Lichtstreuung wurde zur Ausscheidung der Monozyten verwendet. Die ungefärbten Zellen werden hinten am Gitter angeordnet, rote Fluoreszenz ist rechts und grüne Fluoreszenz ist links.
Figur 4 : Dosisabhängige Kurven für die Proliferationszunahme von dichten tonsillaren Er- B-Zellen durch anti-Bp50 Antikörper wie angegeben :
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wurden am 3. Tag gemessen.
Figur 5 : Anti-Bp50 mAb verstärken die Proliferation am meisten, wenn sie nach einem B-Zellen- Aktivierungssignal zugesetzt werden. Dichte tonsillare Er- B-Zellen wurden 4 Tage lang nur mit Medium allein inkublert, anti-Bp50 (0, 5ug/ml) zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Inkubation zugesetzt ; antiBp35 (5ug/ml) wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Inkubation zugesetzt ; anti-Bp50 wurde konstant gehalten, wobei anti-Bp35 später zu verschiedenen Zeiten zugesetzt wurde ; anti-Bp35 wurde konstant gehalten, wobei anti-Bp50 zu verschiedenen Zeiten zu den Kulturen zugesetzt wurde. Während der letzten 10h wurde 3H-Thymidin zugesetzt und sein Einbau gemessen.
Figur 6 : Vergleich der Fähigkeit von anti-Bp35 und anti-Bp50, ruhende tonsillare B-Zellen zu veranlassen, den Go-Zustand des Zellzyklus zu verlassen. 3 Tage nach der Behandlung mit Medium allein
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gegen den Log von AO rote Fluoreszenz (RNA) aufgetragen.
Figur 7 : Kinetische Werte der B-Zell-Proliferation nach der Stimulierung mit anti-Bp50 gegen BCGF.
Dichte tonsillare E- B-Zellen wurden mit Medium allein stimuliert ; 10% BCGF allein ; anti-Bp35 allein ; antiBp50 allein ; anti-Bp35 + 10% BCGF ; anti-Bp35 + anti Bp50 ; und anti-Bp35 + 10% BCGF. Die Proliferation wurde an den durch einen 18h - Puls von von 3H-Thymidin angegebenen Tagen gemessen. Die Proliferation wurde vierfach gemessen und die Standardfehler sind aufgezeigt. Einer von drei Versuchen.
Figur 8 : Zeiten nach der Stimulierung mit anti-Bp35, wenn antl-Bp50 (A) oder BCGF (B) die Proliferation optimal verstärken. Dichte tonsillare E- B-Zellen wurden in gezeigter Welse stimuliert und die Proliferation wurde durch einen 18h- Puls von 3H-Thymidin am 3. Tag gemessen. Medium ; antl-Bp35 allem zu den
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angegebenen. Zeiten zugesetzt ; anti-Bp50 oder BCGF allein ; anti-Bp35 zu Beginn der Kultur zugesetzt und anschliessend Zusatz von anti-Bp50 oder BCGF an den angegebenen Zeiten ; anti-Bp50 oder BCGF zu Beginn der Kultur zugesetzt, gefolgtvon anti-Bp35. Einer von zwei Versuchen.
Die Proliferation wurde vierfach gemessen und die Standardfehler sind aufgezeigt. Verwendete Dosen : anti-Bp35,5 ug/ml ; anti-Bp50 0, 2 Ilg/ml ; BCGF (niedrig) 5%. Die verwendeten Konzentrationen waren folgende : anti-Bp35 5ug/mi ; anti-Bp50 0, 2 Ilg/ml ; BCDF 5%.
Figur 9 : Antl-Bp50 und BCGF haben zusätzliche Wirkungen auf die B-Zellen-Proliferation. Dichte tonsillare E- B-Zellen wurden mit abgestuften Dosen von BCGF (niedrig) gemeinsam mit anti-Bp50 allein stimuliert ; anti-Bp35 allein ; anti-) g-Perlen-allein ; anti-Bp35 + anti-Bp50 ; oder anti-Bp50 + anti-lg. Die Proliferation wurde am 3. Tag nach der Stimulierung mit einem 18h Puls von 3H-Thimidin gemessen. Die Proliferation wurde vierfach gemessen und die Standardfehler sind aufgezeigt. Einer von vier Versuchen.
Verwendete Dosen : 106 Zellen, anti-Bp35 5 Ilg/ml ; anti-Bp50 0, 2ug/ml ; anti-Ig-Perlen 50ug/ml.
Figur 10 : Vergleichende Wirkungen von anti-Bp50 und BCGF auf normale und maligne B-Zellen.
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Lymphome (Platten B und D) wurden in gleicher Weise stimuliert. Die Proliferation wurde am Tag 3 durch
Einbau von 3H-Thymidin während eines 12-h-Pulses gemessen. Die Proliferation wurde vierfach gemessen und die Standardfehler sind aufgezeigt.
Im folgenden werden weitere Details der vorliegenden Erfindung angegeben.
Wenn der Ligand ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment desselben ist, kann der monoklonale
Antikörper gegen Bp50 nach jedem Verfahren zur Schaffung von Antikörper-Molekülen durch kontinuierli- che Zellinie in Kultur hergestellt werden. Beispielsweise kann die ursprünglich von Köhler und Miistein (1975, Nature 256 : 495-497) entwickelte Methode ebenso wie andere Verfahren verwendet werden, die In jüngerer Zeit bekannt wurden, wie das Verfahren der humanen B-Zell-Hybridome (Kozbor et al., 1983,
Immunology Today 4 : 72) und das EBV-Hybndom-Verfahren zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. S. 77-96) sowie ähnliche, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegen.
Antikörper-Fragmente, die den Idiotyp des Moleküls enthalten, können auf bekannte Weise hergestellt werden. Beispielsweise können solche Fragmente folgendesenthalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt : das F (ab') 2-Fragment, das durch Behandlung des Antikörper-Moleküls mit Pepsin erzeugt werden kann ; die Fab'-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken des F (ab') 2- Fragmentes erzeugt werden können ; das F (ab') 2-Fragment, das durch Behandlung des Antikörper-Moleküls mit Papain erzeugt werden kann ; und die 2Fab-oder Fab-Fragmente, die durch Behandlung des Antikörper-Moleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel zur Reduktion der Disulfidbrücken erzeugt werden können.
Wenn der sich an Bp50 bindende Ligand ein Lymphokin ist, kann dasselbe aus natürlichen Quellen erhalten werden oder, wenn seine Aminosäuresequenz bekannt oder abgeleitet ist, kann das Lymphokin über chemische Syntheseverfahren gewonnen werden. Anderserselts können, wenn die Gensequenz des Lymphokins bekannt ist, rekombinante DNA-Verfahren zur Klonierung des Gens in einem Expressionsvektor verwendet werden, wodurch die Transkription und Translation der Gensequenz in einer geeigneten Wirtszelle vor sich geht.
Je nach dem Verwendungszweck können der Ligand oder die geeignetenFragmente desselben chemisch durch Anhängen irgendeiner von vielen Verbindungen an den Ligand nach irgend einem an sich bekannten Kupplungsverfahren chemisch modifiziert werden. Derartige Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf die Verwendung von Carbodiimid, Cyanbromid, bifunktionellen Reagentien, wie Glutaraldehyd, N-Succinimidyl-3- (2-pyridyidithio)-propionat (SPDP), Reagentien der Schiff'schen Basen, Anhängen von Sulfhydrylgruppierungen, die Verwendung von Natrium-Isothiocyanat oder enzymatische Verknüpfung, um nur wenige zu nennen. Wenn ein Radioisotop an den Ligand geknüpft wird, kann dies auch auf enzymatische Weise, durch oxidative Substitution, Chelatbildung, etc. vor sich gehen.
Als Überblick über die zur Proteinmodifizierung verwendbaren Reagentien vgl. Lundblad und Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification, Volume 11, CRC Press, lnc. Boca Raton, Flonda, Ch. 5 S. 123-139,1984).
Die chemische Verknüpfung oder Kupplung einer Verbindung an den Liganden kann an eine Stelle des Liganden gerichtet werden, die an der Bindung mit Bp50 nicht teilhat. Das könnte durch Schutz dieser Bindungsstelle des Liganden vor der Durchführung der Kupplungsreaktion erfolgen. Beispielsweise kann der Ligand zuerst an Bp50 gebunden werden, um die Bp50-Bindungsstelle zu blockieren, dann kann die Kupplungsreaktion zur Bindung der gewünschten Verbindung an die verfügbaren reaktiven Stellen am Ligand -Bp50-Komplex erfolgen. Wenn die Kupplungsreaktion vollendet ist, kann der Komplex zerlegt werden, wobei ein modifizierter Ligand entsteht, an welchen die gewünschte Verbindung geknüpft ist, sodass die Bp50-Bindungsstelle des Moleküls minimal beeinflusst wird.
Wenn der Ligand einen monoklonalen
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Antikörper, wie G28-5, enthält, in welchem der Fc-Bereich des Moleküls für die Ausübung der Wirkung des Liganden nicht erforderlich ist (vgl. den später folgenden Abschnitt 5. 3. 3.), kann es von Vorteil sein, die Kupplung der gewünschten Verbindungen an den Fc-Bereich des Moleküls zu lenken.
Die folgenden Ausführungen beschreiben den neuen 50 kDa B-Zellen-Oberflächenmarker Bp50, der offensichtlich eine Funktion bei der B-Zellen-Proliferation hat, ebenso wie die Liganden, die sich an den neuen 50 kDa Rezeptor binden, sowie ihre Verwendungen. Als Beispiel der neuen Liganden werden auch ein monoklonaler Antikörper, der Bp50 definiert, und ebenso dessen F (ab') 2-Fragmence beschrieben, die wie BCGF die Zellen-Proliferation verstärken. Zum Unterschied von anti-Bp35 mAb, der die ruhenden BZellen in Go zum Eintritt in G, veranlassen kann, aktiviert anti--Bp50 mAb die ruhenden B-Zellen nicht. AntiBp35 und anti-Bp50 mAb gemeinsam bewirken jedoch ohne zusätzliche äussere Signale eine starke Aktivierung und Proliferation der gereinigten B-Zellen.
Die im folgenden beschriebenen Versuche zeigen, dass die Wirkung von anti-Bp50 der Wirkung von BCGF ähnlich ist, dass sich jedoch anti-Bp50 von einem BCGF unterscheidet, da anti-Bp50 und niedrigmolekulares BCGF deutlich additiv sind und unterschiedlich auf verschiedene B-Zell-Untergruppen oder malinge Zustande wirken. Bp50 kann ein Rezeptor für einen unterschiedlichen BCGF oder für ein Transmembransignal sein, das die BCGF-Produktion oder die BCGF-Rezeptorexpression moduliert.
Zellzubereltungen. Mononukleare Zellen wurden auf normalem oder leukämisch heparinisiertem penphe-
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wurden aus Tonsillargeweben nach der Beschreibung (Clark et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82 : 1766- 1770) erhalten.
T-Zellen wurden durch AET-behandelte Schaf-Erythrozyten-Rosettierung und Ficoll-Hypaque-Gradienten- Trennung abgereichert Bel manchen Versuchen werden die B-Zellen des Blutes durch Isolierung von an Nylonwolle haftenden Zellen angereichert. Die Monozyten wurden durch ein-oder zweimalige Inkubation in Kunststoff-Petrischalen bel 37. C während 45 min entfernt, wenn nicht anders angegeben. Schwimmende oder dichte tonsillare B-Zell-Fraktionen wurden durch Percoll-Stufengradienten nach der Beschreibung von Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82 : 1766-1770 isoliert. Dichte-tonsillare B-Zell-Präparationen hatten übereinstimmend mehr als 95% sig + Bp35 + Zellen.
Mit Blut-B-Zellen angereichterte Präparationen hatten 60-80% s) G+Zeiten. Die B-Zellen-Lymphomzellen wurden durch vorsichtiges Zerlegen von Lymphomzellen in Medium and anschliessende Ficoll-Hypaque-Gradienten-Zentrifugierung isoliert.
Monoklonale Antikörper. Der G28-5 Antikörper für Bp50 wurde durch Immunisierung von BALB/cMäusen mit menschlichem tonsillaren E-Leukozyten und Fusionierung der immunen Milzzellen mit NS-1Myelom erzeugt (Köhler, et al., 1975, Nature 256 : 495 : 497 ; Ledbetter, et al., 1979, Immunol. Rev. 47 : 63-82) Kulturen hybrider Zellen, die den mit tonsillaren B-Zellen, jedoch nicht mit T-Zellen reaktiven Antikörper abgeben, wurden durch Verwendung der indirekten Immunofluoreszenz (IF) und Analyse mit einem FACS IV Zellsortierer identifiziert ; Kulturen mit einem Antikörper, dessen Histogramm-Muster ähnlich dem des bekannten mAb für Pan-B-Zellen-Marker (z. B. Bp35) ist, wurden geklont und für weitere Studien ausgewählt.
Der G28-5-Klon produzierte einen gGi-mAb, der nur mit normalen oder malignen B-Zellen oder BZellinie reagierte. Andere bel dieser Studie verwendete mAb wurden detalliert beschrieben (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82 : 1766-1770 ; Clark et al., 1986, Human Immunol. 16-100 ; Ledbetter, et al., 1986, Human Immunol. 15 : 30-44 ; Ledbetter, et al., 1985, in Perspectives in Immunogenetics and
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gGza)HLA-DR, 2C3 (lgG1) anti-u Kette, G19-4 (igGi). anti-CD3, FC-2 (igGza) anti-Fc Rezeptor CD16 und 9. 6 (IgG2a) anti-CD2 (E Rezeptor), die von Dr.
Paul Martin (Martin et al, 1983, J. lmmunol. 131 : 180) zur Verfügung gestellt wurden. Die 1gag, mAbs wurden durch Ausfällung mit 45-50%gem gesättigtem Ammoniumsulfat und Säulenchromatographie über DEAE Sephacryl gereinigt und die IgG2a mAbs wurden unter Verwendung von Protein A Sepharose-Säulen gereinigt. Die F (ab') 2-Fragmente von G28-5 wurden nach
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Schweden) unter Verwendung der Bromcyan-Kupplung gekuppelt.
Fluorescem- und Phycoerythrin-Konjugationen. Geremigte mAb wurden entweder direkt mit Fluorescein unter Verwendung von Fluorescem-Isothiocyanat (FITC ; Molekularsonden) (grün) nach dem Verfahren von Godmg (Goding et al., 1976, J Immunol. Meth. 13215-226) oder an R-Phycoerythnn (PE) (rot) unter Verwendung von SPDP (Pharmacia) nach einem Verfahren, das detailliert In Ledbetter et al., 1985, Perspectives In Immunogenetlcs and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, 119-129 beschrieben) ist, konjugiert.
Die Lymphoidzellen wurden in rundbödigen Mikrotiter-Platten 30 min mit einer geeigneten Verdünnung von grünem und/oder rotem mAb inkubiert, zweimal gewaschen und dann mit einem PACS IV Zellsortierer analysiert.
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Zweifarben-Immunofluoreszenz. Zweifarben-Studien wurden mit einem fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS IV : Becton-Dickinson, Mountain View, CA) unter Verwendung eines 560-nm Dichroidspiegels zur Aufspaltung des Strahls und eines 580 Longpass-Filters sowie eines 540 Kurzpass-Filters (Ditric Optics, Hudson MA) vor der roten bzw. grünen Photomultiplier-Röhre vorgenommen. Ausserdem wurde ein Zweifarben-Kompensator (T. Nozaki, Stanford University) zur Korrektur eines geringen Spill-over von grünen und roten Signalen verwendet. Für jeden Zweifarben-Fleck wurden Daten von 40 000 Zellen aufgenommen und auf Floppy Disks gespeichert. Die Daten sind als Zellanzahl (vertikal) gegen den Logarithmus der grünen Fluoreszenz gegen den Logarithmus der roten Fluoreszenz auf einem 64 x 64 Punktgitter dargestellt. Etwa 4, 5 Punkte stellen eine Verdopplung der Fluoreszenz dar.
Ungefärbte Zellen sind in der hinteren Ecke des Gitters angeordnet ; die rote Fluoreszenz ist rechts, die grüne Fluoreszenz links. Das cytomethrische Fliesssystem für Zweifarben-IF mit Fluorescein und Phycoerythrin ist detailliert von (Ledbetter, et al., 1985,
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beschrieben.
Zellkultur. Blut- oder Tonsillar-Lymphoidzellen wurden vierfach in einer Menge von 5-10 x 105/ml in 96 Mulden-Mikrotiterplatten ge - züchtet, die 200 ni 1 RPM1-1640-Medium, ergänzt mit 15% fötalem Rinderserum, Antibiotika, Glutamin und Pyruvat (R15), enthielten. Nach 1 bis 7 Tagen wurden die Zellen mit 0, 5 uCi 3H-Thymidin pro Mulde (New England Nuclear, 6, 7 Ci/mMol ; 1 Ci = 37) während 18h pulsiert. Die Zellen wurden auf Glasfaser-Filtern in einem Zellernter geerntet, die Radioaktivität in einem Scintillationszähler gemessen. Bei manchen Versuchen wurden Antikörper oder Faktoren zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Beginn der Züchtung zugesetzt ; die Proliferation bei diesen Versuchen wurde am 3. Tag gemessen.
Costimulatlonsfaktoren. Von Cytokine Technology (Buffalo, New York) wurde gereinigter BCGF besorgt, der keine feststellbare IL-1-, IL-2- oder Interferon-Wirkung hatte. Dieser BCGF wurde nach dem Verfahren
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hatten, dass die hauptsächliche BCGF-Wirkung in diesem Material in einer 12 kDa-Spezies liegt, die im Folgenden als BCGF (niedrig) bezeichnet wird (Metha et al., 1985, J. Immunol. 135 : 3298). Die Reinigungsstufen umfassten eine DEAE Affinitätschromatographie im präparativen Massstab und anschliessend eine Chromatographie über eine Hydroxylapatit-Säule. Bis zur Homogenität gereinigter IL-1 war das grosszügige Geschenk von Dr. Steven Dower (Dower et al., 1985, J. Exp. Med. 162 : 501). Rekombinantes IL-2 wurde freundlicherweise von der Cetus Corporation zur Verfügung gestellt.
TPA (12-0-Tetradecanoyl-phorbol-13- acetat) wurde bei Sigma besorgt.
Feststellung der Zellaktivierung. Änderungen im Zellvolumen, die durch mAb und/oder Faktoren hervorgerufen werden, wurden unter Verwendung eines Zellsortierers und eines Lichtstreuers mit Vorwärtswinkel gemessen. Änderungen des Zellzyklus in den zellulären Niveaus von RNA und DNA wurden durch Färben der aktivierten Zellen mit Acridinorange und Messen der relativen RBA- (rot)-und DNA- (grün)- Zellgehalte mit einem Zellsortierer nach dem Verfahren von Darzynkiewicz et al (Darzynkiewicz et al., 1980, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77 : 6697-6702) gemessen. Änderungen im relativen Ausmass der Zelloberflächen- antigene wurden durch Verwendung von direkt mit Fluorescein konjugiertem mAb überwacht und dann anhand der direkten IF Fluoreszenz-Niveaus mit einem Epics V Zellsortierer quantitativ bestimmt.
Biochemische Kennzeichnung von Bp50. Die Immunopräzipitation von Bp50 aus oberflächlich sj. markierten Tonsillarzellen wurde nach der Beschreibung von Ledbetter et al., 1985, J. lmmunol. 134 : 4250- 4254 durchgeführt. Die isolierten Antigene wurden einer Elektrophorese auf 10% SDS PolyacrylamidPlattengelen ohne Reduktion unterworfen. Die Gele wurden durch Autoradiographie bei -700 C und Cronex Belichtung mit Verstärkungs-Screens (Dupont) sichtbar gemacht.
Kennzeichnung des Bp50 Rezeptors.
Die folgenden Kapitel beschreiben die Ergebnisse der unter Anwendung der obigen Verfahren durchgeführten Versuche.
Identifizierung eines B-Zellen-spezifischen 50 kDa Zelloberflächenmarkers, Bp50.
Ein mAb für Bp50 wurde durch Immunisierung von BALB/c Mäusen mit humanen Tonsillarylmphozyten und Fusion der immunen Milzzellen mit dem NS-1-Myelom gewonnen. Ein Klon, G28-5, produzierte einen IgG, mAb, der keine leichte NS-1-Kette enthielt. Durch sorgfältige IF-Analyse wurde gefunden, dass G28-5 nur mit normalen oder malignen B-Zellen oder B-Zellinien reagierte Eine umfassende Sichtung der
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Nat.1770 ; Ledbetter et al., 1986, Human Immunol. 15 :
30-44 ; Ledbetter, 1985, in Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASH, New Nork, 6, S. 325-340) zeigte, dass der G28-5 Antikörper mit E-Rosetten-
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untersuchten chronischen Lymphozyten-Leukämien (3/3) und 90% (9/10) der untersuchten B-Lymphome exprimierten den Bp50-Marker, während nur 28% (2/7) von nicht T-, nicht B CALLA+-akuten lymphozytischen Leukämien Bp50 exprimierten.
Die beschränkte Verteilung von Bp50 auf normalen Geweben wurde weiters durch quantitative Zweifar- ben-lmmunofluoreszenz- (2 Farben-) F)-Analysen bestätigt. Bei Verwendung eines R-Phycoerythrin (PE)konjugierten Antikörpers (rot) für das Pan-B-Zellantigen Bp50 (B1, CD20) und der Fluorescein-konjugierten anti-Bp50 Antikörper (grün) wurde gefunden, dass Bp50 nur an Bp35 + B-Zellen (Fig. 1) in Blut oder Tonsillen exprimiert wurde. Blut-B-Zellen exprimierten übereinstimmend etwas geringere Ausmasse an Bp50 als tonsillare B-Zellen ; das ist ähnlich der HLA-DR Expression (Ledbetter et al., 1986 Human Immunol. 15 : 30-44) und der gp54 Expression (Wang et al., 1979, J. Exp. Med. 149 : 1424-1433) die ebenfalls bei Blut-B-Zellen niedriger sind.
Bp50 wurde an Tonsillar-B-Zell-Subpopulationen, die über Percoll-Gradienten in schwimmende und dichte Fraktionen aufgetrennt waren, in gleichem Ausmass exprimiert. Bei Verwendung des PE-konjugierten mAb für den T-Zell-Marker CD3 (T3) und den NK-Zellenassoziierten Marker CD16 (Fc-Rezeptor) (Ledbetter et alu 1979, Immunol. Rev. 47 : 63-82) wurde gefunden, dass Bp50 an T-Zellen oder NK-Zellen nicht exprimiert wurde. Bei Verwendung von 2Farben-IF wurde auch gefunden, dass CD3+ PHA Blasten, die hohe Mengen IL-2-Rezeptoren exprimierten, Bp50 nicht exprimierten.
Der G28-5 Antikörper reagierte mit einem einzigen Polypeptid an tonsiliaren Lymphozyten, die bei etwa 50 Kd unter nicht reduzierenden Bedingungen wanderten (Fig. 2). Dieses Molekül ist grösser als ursprünglich bekannt gewordene B-Zell-Marker im gleichen Molekulargewichtsbereich, wie Bp39 oder Bp45, (Zipf, et
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Leukocyte Typing 11, eds. Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlin, Chap, 12 Vol. 2, 155-167 ; Slovin, et al.,
1982, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 79 : 2649-2653 ; Thorley-Lawson, et al., 1985 J. Immunol. 134 : 3007-3012 und Fig. 2B). Die Belichtungszeit dieses Gels wurde so ausgewählt, dass die Molekulargewichte anderer BZell-Marker leicht mit Bp50 verglichen werden konnten. Der Bp39-Marker wird ungleich dem Bp50 an Granulozyten exprimiert und Bp45 ist ungleich Bp50 auf B-Zell-Blasten beschrankt.
Antikörper für Bp39 (41H16) und Bp45 (MNM6, Blast-1, Blast-2) die durch ein Internationales Workshop erhältlich waren (Clark, et al., 1986, in Leukocyte Typing 11, eds. Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlin, Chap. 12 Vol. 2,155-167) blockierten nicht die Bindung von fluoresceinierten anti-Bp50 Antikörpern für B-Zellen. Basierend auf Gewebeverteilung, biochemischer Analyse und Blockierungsstudien unterscheidet der G28-5 monoklonale Antikörper eine 50 Kd Struktur deutlich von anderen bekannten B-Zell-Antigenen.
Die Expression von Bp50 ist auf B-Zellen beschränkt.
Sowohl hämatopoethische Gewebe- und Zellinien-Verteilungs-Studien als auch detaillierte cytometrische 2-Farben-Strömungsanalysen zeigten, dass Bp50 nur an B-Lymphozycten exprimiert wird. Wie in Fig. 3 erläutert, wird Bp50 an einer kleinen Untergruppe von Blutlymphozyten und einer grossen Population von Tonsillarlymphozyten exprimiert. Praktisch alle Bp50 + Zellen sowohl in Blut als auch in Tonsillen exprimierten Bp35 und HLA-DR, exprimierten jedoch nicht CD2 (Fig. 1) oder CD3, T-Zell-Moleküle oder die IgG Fc Rezeptoren, die an NK-Zellen gefunden wurden. Weiters exprimierten ConA-aktivierte CD3 + T-Zell-Blasten IL-2-Rezeptoren, jedoch nicht Bp50.
Cytometrische 2-Farben-Strömungsanalysen erlauben die quantitative Messung der Dichtebeziehung zwischen zwei Oberflächenantigenen. Es konnte früher gezeigt werden, dass die dichten ruhenden B-Zellen in der Mantelzone sekundärer Fottiket tgM und niedrige Mengen Bp35 exprimieren, während schwimmende aktivierte B-Zellen im Keimzentrum IgM-negativ sind und erhöhte Mengen Bp35 exprimieren (Ledbetter et al., Human Immunol. 15 : 30). Fig. 3 zeigt, dass sowohl IgM-positive als auch IgM-negat ! ve B-Zellen- Untergruppen Bp50 in gleichen Mengen exprimierten, was darauf hindeutet, dass Bp50 sowohl an ruhenden B-Zellen als auch an In-vivo-aktivierten B-Zellen exprimiert wird.
Unterschiede zwischen der Wirkung von Anti-Bp50 und von BCGF (niedng) Ant'-Bp50 und BCGF (niedrig) hatten eine ähnliche Wirkung auf die B-Zellen und waren costimullerend mit den gleichen Substanzen (Tabelle 3). Verschiedene Beweisführungen deuten jedoch darauf hin, dass anti-Bp50 und der In diesem Versuch verwendete BCGF über verschiedenen Signale arbeiten. Erstens
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werden Bp50 Moleküle zum Unterschied von BCGF (niedrig)-Rezeptoren (Bijsterbosch et al., 1985, J. Exp.
Med. 162 : 1825) an ruhenden Bfut-B-Zellen exprimiert (Fig. 3). Zweitens war anti-Bp50 eindeutig optimal wirksam, wenn es 12hnach Beginn der Kultur zugesetzt war (Fig. 8A), auch wenn sowohl anti-Bp50 als auch BCGF (niedrig) am wirksamstem sind, wenn sie nach anti-Bp35 oder anti-tg zugesetzt werden. Im Gegensatz dazu konnte BCGF (niedrig) sogar 24h nach Beginn der Kultur zugesetzt werden und immer noch optimal die Proliferation verstärken (Fig. 8B). Diese kinetischen Experimente, die nach den Angaben von Howard und Paul (1983, Ann. Rev. Immunol. 1 : 307) durchgeführt wurden, legen nahe, dass ein Bp50-abhängiges Signal diese Wirkung normalerweise vor BCGF ausübt.
Sowohl anti-Bp50 als auch BCGF (niedrig) verstärken die Proliferation von B-Zellen, die mit anti-Bp35 oder anti-Ig aktiviert waren (Tabelle 3). Die Wirkungen von anti-Bp50 und BCGF (niedrig) waren jedoch in vielen Fällen additiv (Fig. 7). Fig. 9 zeigt eine Titration von BCGF (niedrig) in einem Versuch, bei dem antiBp50 bei seiner optimalen Konzentration (0, 2 uglml) eingesetzt wurde. BCGF (niedrig) konnte weiters die Proliferation von ruhenden B-Zellen in Gegenwart von anti-Bp50 nach der Aktivierung entweder durch anti- lu oder durch anti-Bp35 verstärken. Optimale Konzentrationen von BCGF (niedrig) waren 5-10%, während
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anti-Bp50 und BCGF (niedrig).
Beispielsweise reagierten einige Blut-B-Zellen auf BCGF (niedrig), reagierten jedoch nicht auf anti-Bp50 (Tabelle 5). Übereinstimmend war ein zusätzliches Aktivierungssignal wie antiBp35 (Tabelle 5) oder TPA (Fig. 10) notwendig, um eine Blut-B-Zellen-Reaktion auf anti-Bp50 hervorzurufen. Während dichte TonsillarB-Zellen Im allgemeinen nicht auf BCGF oder anti-Hp50 reagierten, taten dies schwimmende B-Zellen doch (Tabelle 5). Maligne B-Zell-Zustände unterschieden sich auch in ihrer Reaktivität auf antl-Bp50 im Vergleich zu BCGF. Beispielsweise reagierten manche B-Zell-Lymphome auf TPA plus BCGF (nledng), jedoch nicht auf TPA plus G28-5 anti-Bp50 (Fig 10B und D).
Im Gegensatz dazu reagierten dichte Tonsillar-B-Zellen und periphere Blut-B-Zellen auf TPA plus entweder BCGF (nledng) oder anti-Bp50 (Fig. 10A und C).
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<tb>
<tb> Mittlere <SEP> Proliferation <SEP> von <SEP> Lymphozyten <SEP> aus
<tb> Blut <SEP> Tonsillen
<tb> Stimulierung <SEP> Vers. <SEP> 1 <SEP> :
<SEP> Vers. <SEP> 2 <SEP> Vers.3 <SEP> dicht <SEP> schwimmend
<tb> keine <SEP> 527 <SEP> ¯ <SEP> 70 <SEP> 659 <SEP> ¯ <SEP> 133 <SEP> 906 <SEP> ¯ <SEP> 106 <SEP> 385¯ <SEP> 43 <SEP> 387¯ <SEP> 12
<tb> BCGF <SEP> (5%) <SEP> 13,918¯1,082 <SEP> 37,594¯2,093 <SEP> 3,347¯174 <SEP> 332¯33 <SEP> 1,451¯37
<tb> anti-Sp50 <SEP> (0.5 <SEP> ug/ml) <SEP> 519¯28 <SEP> 1,013¯81 <SEP> 1,151¯28 <SEP> 472¯8 <SEP> 1,543¯28
<tb> anti-Sp35 <SEP> (5 <SEP> ug/ml) <SEP> 554¯90 <SEP> 645¯89 <SEP> 665¯113 <SEP> 2,415¯89 <SEP> 1,129¯68
<tb> anti-Sp50 <SEP> + <SEP> anti-Sp35 <SEP> -- <SEP> 12,274¯546 <SEP> 15,667¯333 <SEP> 36,589¯1,333 <SEP> 4,843¯836
<tb> anti-Sp50, <SEP> SCGF <SEP> --. <SEP> -- <SEP> 3,943¯113 <SEP> 1,342¯19 <SEP> 2,899¯91
<tb>
Zellkulturbedingungen wie in Tabelle 1 beschrieben.
An Nylonwolle adherente Blutlymphozyten (B-Zellen plus Monozyten) wurden durch Ikubation auf Kunststoffschalen über Nacht vor der Stimulierung von den Monozyten be-freit (Vers. l und2). In Vers. 3 wurden Blut-E-Lymphozyten durch Inkubation auf Kunststoffschalen 1 n vor der Stimulierung von den Monozyten befreit.
Tonsillar-Er- ymphocyten wurden durch Verwendung von Percoll-Gradienten i n dichte (Pellet) oder lockere (Fraktion Untergruppen (32) fraktioniert.
Verwendung von Anti-Bp50 Liganden und Bp50.
Die erfindungsgemäss hergestellten Liganden, bei denen Cytotoxine oder antiproliferative Mittel an die Liganden gebunden sind, können zur Herabsetzung einer Immunreaktion, beispielsweise bei Autoimmunkrankheiten oder bei Transplantationspatienten zur Verhinderung der Organabstossung verwendet werden.
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Diese modifizierten Liganden können auch zur Behandlung maligner Zustande verwendet werden, bei denen Zellen oder Tomore auftreten, die das Bp50 Antigen exprimieren, unabhängig davon, ob der maligne
Zustand nun von der B-Zelle stammt oder nicht.
Sowohl die erfindungsgemäss hergestellten Liganden als auch Bp50 können allein oder gemeinsam in vitro verwendet werden. Derartige Anwendungen umfassen in vitro-Assays, wie Immunoassays zur Feststel- lung von Zellen, die das Bp50 Antigen exprimieren, und/oder zur Feststellung einer Ausschüttung von Bp50 Antigen in Körperflüssigkeiten sofern dies der Fall ist. Für diesen Zweck kann der Ligand oder das Bp50 mit einer Radiomarkierung, fluoreszierenden Stoffen, einem Enzym, Enzymsubstrat, Farbstoff etc. markiert werden. Zusätzlich dazu können die Liganden zur Auftrennung und/oder Identifizierung von Zellen verwendet werden, die das Bp50 Antigen expnmieren, in welchem Fall der Ligand an einen immobilen Träger oder an einen fluoreszierenden Stoff gekuppelt wird, der dann in einem FACS (Fluoreszenzaktivierter Zellsortierer) verwendet werden kann.
Die verschiedenen Anwendungen und Einsatzmöglichkeiten der Liganden und von Bp50 gemäss der vorliegenden Erfindung werden im folgenden detaillierter besprochen.
Modifizierte Liganden, die zur Immunsupression oder zur Behandlung maligner Zustände verwendet werden.
Gemäss der Erfindung können die genannten Liganden durch Anhängen einer antiproliferativen Substanz modifiziert werden, sodass das entstehende Molekül zur Abtötung von Bp50-Antigen exprimierenden Zellen verwendet werden kann. Derartige modifizierte Liganden können zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten zur Unterdrückung der Proliferation von B-Zellen und der gleichzeitigen Unterdrückung der Autoimmunreaktion verwendet werden. Diese modifizierten Liganden können auch zur Immunosupression eines Transplantationspatienten zur Verhinderung der Organabstossung verwendet werden. Dementsprechend können cytotoxische Substanzen, die zur Unterdrückung der Immunoreaktion einsetzbar sind, an die Liganden geknüpft werden.
Gemäss einer anderen Ausführungsform können die neuen Liganden, die durch Verknüpfung mit einer antiproliferativen Substanz modifiziert wurden, zur Behandlung von malignen Zuständen verwendet werden, bei denen Tumore oder Zellen das Bp50 Antigen exprimieren. Ein Binden dieser chemotherapeutischen Mittel an die neuen Liganden sollte zu einer grösseren Spezifität des Medikamentes für maligne Zellen führen. Ausserdem könnte ein besonderer Vorteil erreicht werden, wenn ein maligner B-Zell-Zustand mit einem Liganden behandelt wird, der an ein Cytotoxin gekuppelt ist, das zur Abtötung proliferierender Zellen wirksamer ist als bei nichtproliferierenden Zellen ; die Behandlung mit einem solchen Liganden sollte zu einer Potenzierung der Wirkung des Cytotoxins führen.
Demzufolge umfassen die chemotherapeutischen oder antiproliferativen Substanzen, die mit den neuen Liganden gekuppelt werden können, die in der folgenden Tabelle 2 aufgelistete Stoffe, ohne auf dieselben beschränkt zu sein. Die Tabelle stammt aus Goodman und Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 6. Ausg., MacMillan Publishing Co., Inc. New York, S. 1249-1313, 1980, auf welche Veröffentlichung hier bezug genommen wird.
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<tb>
<tb>
Tabelle <SEP> 2
<tb> Chemotherapeutische <SEP> Substanzen, <SEP> die <SEP> mit <SEP> anti-Bp50-Liganden <SEP> gekuppelt <SEP> werden <SEP> können
<tb> Klasse <SEP> Typ <SEP> Substanz
<tb> Alkylierungs- <SEP> Stickstoffsenf <SEP> Mechlorethamin
<tb> mittel <SEP> Cyclophosphamid
<tb> Mephalan
<tb> Uracil-Senf
<tb> Chlorambucil
<tb> Ethylenimin- <SEP> Thiotepa <SEP>
<tb> Derivat
<tb> Alkylsulfonat <SEP> Eisulfan
<tb> Nitrosoharnstoffe <SEP> Carmustin
<tb> Lomustin
<tb> Semustin
<tb> Streptozocin
<tb> Triazenres <SEP> Dacarbazin
<tb> Antimetabolit <SEP> Folsäure-Methotrexat
<tb> Analoga
<tb> Pyrimidin- <SEP> fluorouracil
<tb> Analoga <SEP> Cytarabin
<tb> Azaribin
<tb> Purin-Analoga <SEP> Mercaptopurin <SEP>
<tb> Thioguanin
<tb> Naturprodukte <SEP> Vinca-Alkaloide <SEP> VinblastinVincristin
<tb> Antibiotika <SEP> Dactinomycin
<tb> Daunorubicin
<tb> Doxorubicin
<tb> Bleomycin
<tb>
Mithramycin
<tb> Mitomycin
<tb> Enzyme <SEP> L-Asparaginase
<tb>
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<tb>
<tb> Verschiedene <SEP> Platin-koordina- <SEP> Cisplatin
<tb> i-ii <SEP> tte <SEP> 1 <SEP> tionskomplexe <SEP>
<tb> Substituierter <SEP> Hydroxyharnstoff <SEP>
<tb> Harnstoff
<tb> Methyl-Procarbazin
<tb> HydrazinDerivate
<tb> Adrenocortical-Mitotan
<tb> Suppressoren
<tb> Hormone <SEP> und <SEP> Adrenocorti-Prednison
<tb> Antagonisten <SEP> costeroide
<tb> Progestine <SEP> Hydroxyprogesteroncaproat
<tb> Medroprogesteronacetat
<tb> Megestrolacetat
<tb> Estrogene <SEP> Diethylstilbestrol
<tb> Ethinyl <SEP> estradiol
<tb> Antiestrogen. <SEP> Tamoxifen
<tb> Androgene <SEP> Testosteronpropionat
<tb> Fluoxymest.
<SEP> eron <SEP>
<tb> Radioaktive <SEP> Phosphor <SEP> Natriumphosphat <SEP>
<tb> Isotope <SEP> 32- <SEP>
<tb> lod <SEP> Natriumjodid
<tb> 131r
<tb>
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schen oder antiproliferativen Substanz dienen. Beispiele solcher Verfahren wurden bereits oben genannt (s. o. Abschmtt 5).
Andere Verwendungsmöglichkeiten der Liganden und von Bp50 Zusätzlich zu den therapeutischen Verwendungsmöglichkeiten der Liganden und von Bp50 selbst finden diese noch weitere Anwensungsmöglichkeiten sowohl in vitro als auch in vivo bei diagnostischen Assays, in Auftrennungsschemata und dergl.
Der Bp50 Rezeptor kann zur Herstellung und/oder Entwerfung erfindungsgemasser Liganden eingesetzt werden. Bp50 kann auch mit den neuen Liganden in vitro in Assays eingesetzt werden, die einen Standard zur Quantifizierung der in einer Probe festgestellten Menge an Bp50 brauchen Schliesslich kann Bp50 selbst als löslicher Faktor der immumtät, der z. B. on Lymphokin medilert, nützlich sein.
Zusätzlich zur therapeutischen Behandlung und den diagnostischen Assays können die neuen Liganden zur Identifizierung oder Trennung von Zellen verwendet werden, die das Bp50 Antigen exprimieren.
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Ausserdem kann der Ligand, wenn an Ihn eine geeignete radioaktive Markierung oder eine radiopake Verbindung gebunden Ist ; zur in vivo-Abbildung von das Bp50-Antigen exprimierenden Tumoren verwendet werden. Andere Verwendungszwecke sind aus der vorhergehenden Beschreibung für jeden Fachmann zu entnehmen.
Hinterlegung von Zell-Linien.
Das folgende Hybridom wurde bei der Amencan Type Culture Collecton, Rockville, MD hinterlegt und hat die angegebene Hinterlegungsnummer :
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<tb>
<tb> Hybridom <SEP> ATCC <SEP> Hinterlegungsnummer <SEP>
<tb> G28-5 <SEP> HB9110
<tb>
Die vorliegende Erfindung ist nicht beschränkt auf das hinterlegte Hybridom, da die hinterlegte Ausführungsform nur als einzige Erläuterung eines Aspekts der Erfindung gedacht ist und jede funktionell äquivalente Zellinie Innerhalb des Rahmens der Erfindung liegt. Tatsächlich gehen aus der vorhergehenden Beschreibung und den angeschlossenen Zeichnungen zusätzlich zu den gezeigten und beschriebenen Modifikationen der Erfindung für den Fachmann noch zahlreiche andere hervor. Derartige Modifikationen liegen ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung.