DD272471B3

DD272471B3 - Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen den IL-2-Rezeptor humaner T-Lymphozyten

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Publication number: DD272471B3
Authority: DD
Publication date: 1992-07-30

Description

Die monoklonalen Antikörper sollen eine hohe Affinität besitzen und mit verschiedenen Epitopen des IL-2-Rezeptors reagieren,

der vorzugsweise auf aktivierten T-Lymphozyten exprimiert wird, und sie sollen sich zur qualitativen und quantitativen durchflußzytömetrischen Analyse sowie zur Eliminierung von normalen und neoplastischen T-Zellen aus

Lymphozytenpräparationen eignen. Die monoklonalen Antikörper sollen stabil und lagerfähig sein. SIo sollen sich auch zur direkten Kopplung mit Fluoreszenzfarbstoffen eignen. Durch die Bereitstellung solcher monoklonalen Antikörper soll die medizinische Diagnostik von aktivierten hi/manen T-Lymphozyten qualifiziert werden. Darlegung des Wesens der Erfindung Der Erfindung Hegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunächst Hybridoma

erzeugt werden, die leicht und unaufwendig ha'.dhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter

Weise möglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridome sollen in anschließenden Verfahrensschritten monoklonal Antikörper

erzeugt werden, die mit dem IL-2-Rezeptor, einem 55kDa-Glykoprotein, der aktivierten humanen T-Zellen reagieren.

Die Aufgabd wird dadurch gelöst, daß zunächst nach den bekannten Verfahren der Dichtegradientenzentrif ugatlon Lymphozyten

aus dem perpheren Blut von gesunden Spendern isoliert werden. Diese Lymphozyten werden durch Mitogene, wie z. B. Con A oder PHA, oder durch einen monoklonalen Antikörper gegen den T-Zellrezeptor/CD3-Komplex, wie z. B. BL-TRec, stimuliert. Für die Immunisierung werden aktivierte T-Lymphozyten nach 2- bis 3tätiger Kultur verwendet.

Mit in der vorangehend beschriebenen oder auf eine andere ähnliche Weise gewonnen aktivierten humanen T-Lymphozyten

werden Mäuse immunisiert. Vorzugsweise werden 6-8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens.

Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert. Die geeigneten Maus-Myelomzellen P3-X63 Ag 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, [1979], S. 1548) werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS)

gehalten.

In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (UTTLEFIELD, Science 145, (1964], S.709),

werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Zeilklone selektiert, die Antikörper der gewünschten Spezifität und der anderen in der Zielstellung genannten Eigenschaften sezernieren.

Die Selektion der Hybridome erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten

200-pl-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die

Anwesenheit von Antikörpern getestet, die mit Zelloberflächenantigenen von aktivierten humanen T-Lymphozyten, nicht jedoch

mit ruhenden T-Lymphozyten reagieren. Hierzu werden alle Kulturüberstände, die mit aktivierten humanen T-Lymphozyten reagieren, mit ruhenden humanen T- und B-Lymphozyten getestet. Nur diejenigen Kulturen werden weiter verwendet, deren

Antikörper nicht mit ruhenden T- und B-Lymphozyten, wohl aber mit der großen Mehrheit der aktivierten Lymphozyten

reagieron. Die Testung der Kulturüberstände mit den entsprechenden Zellen kann sowohl durch indirekte Radiobindungstechnik als auch durch indirekte Immunfluoreszenz erfolgen.

So selektierte Kulturen müssen ab dieser Stufe jedoch auf jeden Fall mit der indirekten Immunfluoreszenztechnik überprüft

werden. Dadurch wird ausgeschlossen, daß Hybridome weitergezogen werden, deren Antikörper mit Monozyten, Granulozyten,

Thrombozyten und Erythrozyten reagieren. In einem weiteren Selektionsschritt werden dann nur Hybridome weitergezogen, deren monoklonale Antikörper von den Oberflächen von aktivierten T-Lymphozyten ein Antigen isolieren, welches ein apparentes Molekulargewicht von ca. 55kDa

besitzt.

Zur Bestimmung das Molekulargewichtes werden die Oberflächenproteine von aktivierten humanen T-Lymphozyten nach der Laktoperoxidasemethode radioiodiert (125-lod) oder anderweitig markiert. Die Triton X-100-lysate solcher, markierten T-Zellen

werden mit den zu untersuchenden Hybridomüberständen inkubiert und anschließend diese Mausantikörper durch Zugabe von

Anti-Mausimmunglobulin-Serum präzipitiert. Die von unspezifischen Komponenten freigewaschenen Präzipitate werden in Natriumdodecylsulfat-Puffer aufgelöst und

anschließend einer NDS-Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen (5-10%) unterzogen. An Hand von Referenzproteinen wird das apparente Molekulargewicht der radioiodierten, durch den entsprechenden monoklonalen Antikörper spezifisch abgetrennten

Oberflächenantigene der aktivierten T-Zellen bestimmt. Es werden solche Hybridome ausgewählt, deren monoklonale Antikörper mit Zelloberflächenantigenen von aktivierten humanen T-Zellen reagieren, die im reduzierten Zustand ein apparentes Molekulargewicht von 55kDa aufweisen. In einem anschließendem Selektionsschritt werden davon alle die Hybridome weiterkultiviert, deren Antikörper aktivierte

humane T-Lymphozyten nach indirekter Markierung ausreichend stark anfärben, so daß die monoklonalen Antikörper sowohl zur qualitativen als auch zu quantitativen Analyse in durchflußzytometrischen Verfahren, wie z. B. der Analyse mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS 440), eingesetzt werden können.

In einem weiteren Selektionsschritt werden die selektierten Hybridome überprüft, ob sie sich für die Markierung von aktivierten T-Zellen in Kryostatschnitten lymphoider Gewebe eignen und daß sie keine Nebenreaktionen mit anderen Geweben aufweisen. Die durch eine derartige Selektion erhaltenen Hybridome werden rekloniert und hochproduktive Subklone selektiert, die die

gewünschten monoklonalen Antikörper stabil sezernieren. Die so erhaltenen Hybridome werden als H-BL-TAC/1 und

H-BL-TAC/2 bezeichnet. Die Herstellung der monoklonalen Antikörper BL-TAC/1 und BL-TAC/2 basiert auf einem Verfahren, welches auf die In-vitro-

oder In-vivo-Kultur der Hybridome H-BL-TAC/1 und H-BL-TAC/2 ausgerichtet ist. Die Hybridome H-BL-TAC/1 und H-BL-TAC/2 werden an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig kultiviert bzw. liegen kryokonserviert vor und sind

Interessenten zugänglich. Die monoklonalen Antikörper BL-TAC/1 und BL-TAC/2 haben die Registriernummern ZIM-0157 und ZIM-0262 im Zentralinstitut für Molekularbiologie der AdW der DDR erhalten. Die durch In-vltro- oder In-vlvo-Kultur erhaltenen monoklonale Antikörper BL-TAC/1 und BL-TAC/2 reagieren mit aktivierten

Τ-ΖθΙΙβη, Leukozyten, anderen Blutzellen sowie lympholden Zellen aus verschiedenen Organen in der in Tabelle 1 dargestellten Weise.

Das Reaktionsmuster des monoklonalen Antikörpers mit permanent wachsenden Zell-Linien ist in Tabelle 2 aufgeführt. Die monoklonalen Antikörper BL-TAC/1 und BL-TAC/2 können nach den üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren mit FITC, TRITC, Phycoerythrin und Biotin gekoppelt werden. Diese direkv markierten Präparate zolgen eine starke Markierung der

aktivierten humanen T-Zellen.

Der monok'onale Antikörper BL-TAC/2 gehört der IgGi-Subklasse an, während der BL-TAC/1 überraschenderweise dem

lgG3-lsotyp angehört. Dieser monoklonale Antikörper ist dabei besonders interessant, weil humane NK-Zellen einen Fc-Rezeptor besitzen, der auch Mauslmmunglobulin der lgG3-Klasse bindet.

Additionsexperimente und Kreuzblockungsexperimente ergaben überraschenderweise, daß BL-TAC/1 und BL-TAC/2 an

unterschiedliche Epitope des IL-2-Rezeptors binden.

Ausführungsbelsplel Selektion von BL-TAC/1 und 2 Aus dem Blut gesunder Spender werden in der üblichen Weise mononukloäre Zellen gewonnen und in einer Dichte

von 1 χ 10*/ml in Plastkuiturschfllen, die mit dem Anti-T-Zellrezeptor/CDS-Komplex-Antikörper BL-TRec/1 (20pg/ml) beschichtet worden sind, für 48h kultiviert.

Die aktivierten Lymphozyten werden mehrfach gewaschen und 6 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäjse durch i.p. Applikation

von 1 x 10⁷ Zellen immunisiert. Fünf Wochen später erhalten die Mäuse im wöchentlichen Abstand 4 weitere Antigengaben (i.p.). Vier Tage vor der Fusion erhalten sie eine Injektion (i.v.) von 6x10* aktivierten Lymphozyten.

Aus den Milzen derart hyperlmmunisierter Mause werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen mittels Behandlung mit 50%igem Polyethylenglykol fusioniert. Die geeigneten Maus-Myelomzellen P3-X63 Ag 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, [1979], S. 1548) werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserrum (FKS) gehalten. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (LITTLEFIELD, Science 145, (1964), S.709),

werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt.

Die Selektion der Hybridome erfolgt in der Welse, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten

Anwesenheitvon Antikörpern getestet, die mit Zelloberflächenantigenen von aktivierten humanen T-Lymphozyten, nicht jedoch

reagieren. Die Testung der Kulturüberstände mit den entsprechenden Zellen erfolgt durch indirekte Immunfluoreszenz. Dadurch wird ausgeschlossen, daß Hybridome weitergezogen werden, deren Antikörper mit Monozyten, Granulozyten, Thrombozyten und Erythrozyten reagieren.

Die zur Testung eingesetzten aktivierten Lymphozyten werden durch Behandlung von mononukleären Zellen mit Mitogenen

(PHA, Con A, PWM), Anti-T-Zellrezeptor-Antikörper (BL-TRec/1) oder CD3-Antikörpern erzeugt.

In einem weiteren Selektionsschritt werden dann nur Hybridome weitergezogen, deren monoklonale Antikörper von den Oberflächen aktivierter T-Lymphozyten ein Antigen isolieren, welches ein apparentes Molekulargewicht von ca. 55kDa besitzt. Zur Bestimmung des Molekulargewichtes werden die Oberflächenproteine von aktivierten humanen T-Lymphozyten nach der Laktoperoxidasemethode radioiodiert (125-lod). Die Triton X-100-Lysate solcher markierten T-Zellen werden mit den zu

untersuchenden Hybridomüberständen inkubiert und anschließend diese Mausantikörper durch Zugabe von Anti-

Mausimmunglobulin-Serum präzipitiert. Die von unspezifischen Komponenten freigewaschenen Precipitate werden in Natriumdodecylsulfat-Puffer aufgelöst und

anschließend einer NDS-Elektrophorese auf Polyacrylamidgeleti (5-10%) unterzpgen. An Hand von Referenzproteinen wird das apparente Molekulargewicht der radioiodierten, durch den entsprechenden monoklonalen Antikörper spezifisch abgetrennten

humane T-Lymphozyten nach indirekter Markierung ausreichend stark anfärben, so daß die monoklonalen Antikörper sowohl zur qualitativen als auch zur quantitativen Analyse in durchflußzytometrischen Verfahren, wie z. B. der Analyse mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS 440), eingesetzt werden können.

oder In-vivo-Kultur der Hybridome H-BL-TAC/1 und H-BL-TAC/2 ausgerichtet ist.

Gewinnung der monokionaien Antikörper BL*TAC/1 und 2 durch In-vltro-Kultur

Jeweils 2 χ 10*Zellen der auf flüssigem Stickstoff gelagerten Hybridome werden aufgetaut und nach zweimaliger Waschung in jeweils 4ml Ri¹MI 1640-ZellkulUirmedium mit 10% fetalem Kälberserum aufgenommen. Von jedem werden vier separate 1-ml-Kulturen In Gewebekulturplatten aus Polystyren angelegt.

Nach Vermehrung der Zeilen werden davon sukzessiv 6-rnl-, 20-ml· und 50-ml-Kulturen in Gewebekulturflaschen angelegt.

Die zellfreien Kulturüberetände enthalten den jeweiligen monokionaien Antikörper BL-TAC/1 oder BL-TAC/2. Die monokionaien Antikörper können nach einem üblichen Verfahren isoliert oder angereichert werden.

Tabelle 1

Reaktionsmuster der monokionaien Antikörper BL-TAC/1 und 2 mit humanen Blutzellen, aktivierten Zellen und Zellen aus lymphoiden Organen

Zelltyp Markierte Zellen (%)

BL-TAC/1 BL-TAC/2

PBL	0-10	0-10
T-Lymphozyten	0-10	0-10
B-Lymphozyten	<3	<3
LGL(NX)	<5	<5
Monozyten	0	0
Granulozyten	0	0
Erythrozyten	0	0
Lymphoblasten (PHA-stim.)	>95	>95
Lymphoblasten (Con A-stim.)	>95	>95
Lymphoblasten (PWM-stim.)	>80	>80
Lymphoblasten (CD3-stim.)	>95	>95
Lymphoblasten (BL-TRec-stim.)	>95	>95
Thymozyten	&-30	&-20
Tonsillenlymphozyten	5-10	5-10

Tabelle 2

Bindungsmuster der monokionaien Antikörper BL-TAC/1 und 2 mit permanent wachsenden humanen Zell-Linien

Zeil-Linie Reaktion mit den Zellen BL-TAC/1 BL-TAC/2 T-Zellen:

MOLT-3 MOLT-4

JURKAT + +

HUT-102 T-Zellklone(IL-2 abhängig)

KT-2 B-Zellen:

HMy-2 Myeloide Linie:

U-937 Erythroide Linie:

K-562 -_

Nachweis durch Indirekte Immunfluoreszenz:

+++; 100% stark markiert.

++; 100 %8chwach markiert.

+ ; <100>26%.

-; unmarkiert.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen den IL-2-RezeptorhumanerT-Lymphozyten durch Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit aktivierten humane.n T-Lymphozyten, Fusion von aus den Milzen solcher Mäuse gewonnenen B-Lymphozyten mit murinen Myelomzellen, Selektion von Hybridomen, die monoklonalo Antikörper mit Spezifität für aktivierte T-Zellen sezernieren, dadurch gekennzeichnet, daß Hybridome, deren monoklonale Antikörper mit dem IL-2-Rezeptor der T-Lymphozyten, einem Glykoprotein von ca. 55 kDa, spezifisch reagieren, dergestalt selektiert werden, daß zuerst Klone ausgewählt werden, die mit aktivierten T-Lymphozyten stark, nicht jedoch mit ruhenden T-Zellen reagieren, in einem weiteren Selektionsschritt Hybridome ausgewählt werden, deren monoklonale Antikörper mit einem radiomarkierten, durch Detergensbohandlung von T-Zellblasten solubilisierten Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von ca. 55 kDa reagieren, selektiert werden, wobei in einem dritten Selektionsschritt nur diejenigen monoklonalen Antikörper berücksichtigt worden, die bei indirekter Immunfluoreszenz und durchflußzytometrischer Auswertung eine für die stabile Markierung ausreichend hohe Affinität zu dem IL-2-Rezeptor der humanen T-Lymphoblasten aufweisen, daß die so determinierten Hybridome H-BL-TAC/1 (Registrier-Nr. ZIM-0157) und H-ßL-TAC/2 (ZIM-0262) in an sich bekannter Weise kultiviert werden und die sezernierten monoklonalen Antikörper BL-TAC/1 und BL-TAC/2 isoliert, angereichert und gegebenenfalls mit Markern oder an feste Phasen gekoppelt werden.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die mit dem IL-2-Rezeptor humaner T-Lymphozyten reagieren. Dadurch ist dieser monoklonale Antikörper als Nachweisreagens für aktivierte humane T-Lymphozyten, die bei verschiedenen Krankheiten mit immun' Ogischen Komponenten, bei Infektionskrankheiten, bei Neoplasien des lymphozytären Systems sowie bei Transplantationskrisen auftreten, geeignet. Die monoklonalen Antikörper können zur medizinischen Diagnostik und zur Eliminierung von aktivierten und neoplastischen humanen T-Lymphozyten eingesetzt werden.

Charakterisierung der bekannten technischen Lösungen

Die Fortschritte der Differenzierung von Lymphozyten, die unterschiedliche Funktionen erfüllen, durch monoklonale Antikörper (Leukocyte Typing II. Vol. 1-3, Hrsg.: E. L.REINHERZ et al.: Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986) haben die Diagnostik von Krankheiten mit immunologischer Komponente, von Neoplasien des Immunsystems und die Überwachung von Transplantationen deutlich verbessert. Es hat sich jedoch gezeigt, daß Veränderungen der Anteile von funktioneilen Subpopulationen im peripheren Blut nur be! sehr drastischen Störungen und Reaktionen des Immunsystems erfolgen, so daß immunologische Reaktionen, soweit sie in der normalen physiologischen Schwankungsbreite liegen, nicht sicher mit Anti-Subpopulations-Antikörpern erfaßt werden können.

Lymphozyten, die durch Antigene, Mitogene oder monoklonale Antikörper gegen bestimmte Zelloberlfächenantigene aktiviert werden, verändern im Gefolge dieser Aktivierung qualitativ und quantitativ ihr Zelloberflächenantigenmuster. Der durch die Aktivierung ausgelöste Eintritt in den Zellzyklus erfordert die Einstellung der Zelle auf neue physiologische'Leistungen. Es werden z. B. Rezeptoren für Hormone, Interleukine, wie z., B. IL-2, aber auch für Nährstoffe entweder neu oder verstärkt exprimiert. Diese Veränderungen sind die Voraussetzung für die DNA-Synthese, Mitose, Proliferation und funktioneile Enddifferenzierung.

Die Aufklärung der Veränderungen des Zelloberflächenmusters steht erst am Anfang. Einige der Veränderungen konnten schon durch die Markierung der neu auftretenden Antigene mit monoklonalen Antikörpern erfaßt werden. So ist der monoklonale Antikörper OKT9 (US-PS 4624925) gegen den Transferrinrezeptor gerichtet. Auch der monoklonale Antikörper OKT10 (EP 0030815) reagiert mit aktivierten T-Lymphozyten. Gegen solche in ihrer Funktion noch nicht bekannten Antigene sind weitere monoklonale Antikörper beschrieben worden. Dazu gehören die Antigene, die durch die monoklonalen Antikörper 4F2 (Mol.-Gew. 80/4OkDa: HAYNES et al: J. Immunol. 126, (1981), 1409), die CDw26-Gruppe(Mol.-Gew.: 120 u. 20OkDa: Leukocyte Typing II, Vol. 1, Hrsg.. E.L. REINHERZ et al.; Springer Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986) und die CD30-Gruppe (Leucocyte Typing III, Hrsg.: A. J. McMICHAEL et al., Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo 1987) erkannt werden. Von besonderer Bedeutung ist der monoklonale Anti-Tac, der mit dem IL-2-Rezeptor reagiert (WALDMANN: Science 232, (1986) 727-732). Weitere Antikörper dieses Typs sind im Rahmen des III. Workshops über Leukozytendifferenzierungsantigene (Leucocyte Typing III, Hrsg.: A. J. McMICHAEL et al.; Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo 1987) beschrieben worden.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörper für den IL-2-Rezeptor (Glykoprotein, 55kDa) der humanen T-Lymphozyten gestattet.