DD272471A1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen den il-2-rezeptor humaner t-lymphozyten - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen den IL-2-Rezeptor humaner T-Lymphozyten. Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung von entsprechenden monoklonalen Antikoerpern anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen dieser Antikoerper erlaubt. Die monoklonalen Antikoerper sollen eine hohe Spezifitaet und Affinitaet, die ihren Einsatz in der Durchflusszytometrie gestatten, aufweisen. Dazu werden in bekannter Weise Hybridzellen von B-Lymphozyten immunisierter BALB-c-Maeuse erzeugt und Hybridomzellen selektiert, deren monoklonale Antikoerper die gewuenschten Eigenschaften aufweisen. Das Selektionsverfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass in einem mehrstufigen Selektionssystem Hybridome erzeugt und kultiviert werden, deren monoklonale Antikoerper mit dem IL-2-Rezeptor reagieren und dadurch zum Nachweis aktivierter T-Lymphozyten geeignet sind. Der monoklonale Antikoerper BL-TAC/1 des Hybridoms H-BL-TAC/1 zeichnet sich durch eine besonders hohe Affinitaet aus und fuehrt aufgrund dessen zu starken Markierungen der IL-2-Rezeptor tragenden Zellen. Besonders bemerkenswert ist der IGG3-Isotyp dieses monoklonalen Antikoerpers. Der monoklonale Antikoerper hat die Registriernummer ZIM-0157. Der monoklonale Antikoerper BL-TAC/2 bindet an einen anderen Epitop des gleichen Antigens bzw. Antigenkomplexes ohne die Bindung von BL-TAC/1 zu behindern. BL-TAC/2 gehoert dem IgG1-Isotyp an und hat die Registriernummer ZIM-0262. Das Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikoerper beruht auf der In-vitro- oder In-vivo- Kultivierung der entsprechenden Hybridome H-BL-TAC/1 bzw. H-BL-TAC/2 und der Abtrennung der monoklonalen Antikoerper. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.
Description
Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen den IL-2 - Rezeptor humaner T-Lymphozyten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die mit dem IL-2 - Rezeptor.humaner T-Lymphozyten reagieren. Dadurch ist dieser monoklonal θ Antikörper als Nachweisreagens für aktivierte humane T-Ly.nphozyten, die bei verschiedenen Krankheiten mit immunologischen Komponenten, bei Infektionskrankheiten, bei Neoplasien des lymphozytären Systems sowie bei Transplantationskrisen auftreten, geeignet. Die monoklonalen Antikörper können zur medizinischen Diagnostik und zur Eliminierung von aktivierten und neoplastischen humanen T-Lymphozyten eingesetzt werden.
Die Fortschritte der Differenzierung von Lymphozyten, die unterschiedliche Funktionen erfüllen, durch monoklonale Antikörper (Leukocyte Typing II. Vol.1-3, Hrsg.: E.L.REINHERZ et al.: Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986) haben die Diagnostik von Krankheiten mit immunologischer Komponente, von Neoplasien des Immunsystems und die Überwachung von Transplantationen deutlich verbessert. Es hat sich Jedoch gezeigt, daß Veränderungen der Anteile von funktioneilen Subpopulationen im peripheren Blut nur bei sehr drastischen Störungen und Reaktionen des Immunsystems erfolgen, so daß immunologische Reaktionen, soweit sie in der normalen physiologischen Schwankungsbreite liegen, nicht sicher mit Anti-Subpopulations-Antikörpern erfaßt werden können.
Lymphozyten, die durch Antigene, Mitogene oder monoklonale Antikörper gegen bestimmte ZeIloberflächenantigene aktiviert werden, verändern im Gefolge dieser Aktivierung qualitativ und quantitativ ihr,ZeIloberflächenantigenmuster. Der durch die
Aktivierung ausgelöste Eintritt in den Zellzyklus erfordert die Einstellung der Zelle auf neue physiologische Leistungen. Es werden z.B. Rezeptoren für Hormone, Interleukine, wie z.B. IL-2, aber auch für Nährstoffe entweder neu oder verstärkt exprimiert. Diese Veränderungen sind die Voraussetzung für die DNA-Synthese, Mitose, Proliferation und funktionelle Enddifferenzierung.
Die Aufklärung der Veränderungen des Zeiloberflächenmusters steht erst am Anfang. Einige der Veränderungen konnten schon durch die Markierung der neu auftretenden Antigene mit monoklonalen Antikörpern erfaßt werden. So ist der monoklonale Antikörper OKT (US-PS 4 624 925) gegen den Transferrinrezeptor gerichtet. Auch der monokonale Antikörper OKT 10 (EP 0 030 815) reagiert mit aktivierten T-Lymphozyten. Gegen solche in ihrer Funktion noch nicht bekannten Antigene sind weitere monoklonale Antikörper beschrieben worden. Dazu gehören die Antigene, die durch die monoklonaien Antikörper 4F2 (Mol.-Gew. 80/40 kDa: HAYNES et al.: J. Immunol. 126,(1981), 1409), der CDw26-Gruppe (Mol.-Gew.:120 u. 200 kDa: Leukocyte Typing II, VoI.1, Hrsg.: E.L.REINHERZ et al.; Springer Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986) und der CD 30-Gruppe (Leucocyte Typing III, Hrsg.: A.J.McMICHAEL et al., Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo 1987) erkannt werden. Von besonderer Bedeutung ist der monoklonale Anti-Tac, der mit dem IL-2 - Rezeptor reagiert (WALDMANN: Science 232, (198G) 727-732). Weitere Antikörper dieses Typs sind im Rahmen des III.' Workshops über Leukozytendifferenzierungsantigene (Leucocyte Typing III, Hrsg.: A.J.McMICHAEL et al.; Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo 1987) beschrieben worden.
Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörper für den IL-2 - Rezeptor (Glykoprotein, 55 kDa) der humanen T-Lymphozyten gestattet.
Die monoklonalen Antikörper sollen eine hohe Affinität besitzen und mit verschiedenen Epitopen des IL-2 - Rezeptors reagieren, der vorzugsweise auf aktivierten T-Lymphozyten exprimiert wird, und
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sie sollen sich zur qualitativen und quantitativen durchflußzytometrischen Analyse sowie zur Eliminierung von normalen und neoplastischen T-ZeI lan aus Lymphozytenpräparationen eignen.
Die monoklonalen Antikörper sollen stabil und lagerfähig sein. Sie sollen sich auch zur direkten Kopplung mit Fluoreszenzfarbstoffen eignen.
Durch die Bereitstellung solcher monoklonalen Antikörper soll die medizinische Diagnostik von aktivierten humanen T-Lymphozyten qualifiziert ».erden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunächst Hybridoma erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridoma sollen in anschließenden Verfahrensschritten monoklonale Antikörper erzeugt werden, die mit dem IL-2 - Rezeptor, einem 55 kDa - Glykoprotein, der aktivierten humanen T-Zellen reagieren.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst,daß zunächst nach den bekannten Verfahren der Dichtegradientenzentrifugation Lymphozyten aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern isoliert werden. Diese Lymphozyten werden durch Mitogene, wie z.B.' Con A oder PHA, oder durch einen monoklonalen AntiKörper gegen den T-Zellrezeptor/CD 3 - Komplex, wie z.B. BL-TRec, stimuliert. Für die Immunisierung werden aktivierte T-Lymphozyten nach 2- bie 3-tägiger Kultur verwendet.
Mit in der vorangehend beschriebenen oder auf eine andere ähnliche Weise gewonnen aktivierten humanen T-Lymphozyten werden Mäuse immunisiert. Vorzugsweise werden 6-8 Wochen alte weibliche BALB/c - Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens.
Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert.
Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert. Die geeigneten Maus-Myelomzellen P3-X63 Ag 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol.123, (1979), S.1548)
2 7247 J
5 werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gehalten.
In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält <LITTLEFIELD, Science 145, (1964), S.709), werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt .nd erfindungsgemäß Zellklone selektiert, die Antikörper der gewünschten Spezifitat und der anderen in der Zielstellung genannten Eigenschaften sezernieren.
Die Selektion der Hybridorne erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200 μΐ - Kulturen aufgeteilt werden Die überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern getestet, die mit Zelloberflächenantigenen von aktivierten humanen T-Lymphozyten, nicht jedoch mit ruhenden T-Lymphozyten reagieren. Hierzu werden alle Kulturüberstände, die mit aktivierten humanen T-Lymphozyten reagieren, mit ruhenden humanen T- und B-Lymphozyten getestet. Nur diejenigen Kulturen werden weiter verwendet, deren Antikörper nicht mit ruhenden T-. und B-Lymphozyten, wohl aber mit der großen Mehrheit der aktivierten Lymphozyten reagieren. Di-3 Testung der Kulturüberstände mit den entsprechenden Zellen kann sowohl durch indirekte Radiobindungstechnik als auch durch indirekte Immunfluoreszenz erfolgen.
So selektierte Kulturen müssen ab dieser Stufe jedoch auf jeden Fall mit der indirekten Immunfluoreszenztechnik überprüft werden. Dadurch wird ausgeschlossen, daß Hybridorne weitergezogen werden, deren Antikörper mit Monozyten, Granulozyten, Thrombozyten und Erythrozyten reagieren.
In einem weiteren Selektionsschritt werden dann nur Hybridome weitergezogen, deren monoklonale Antikörner von den Oberflächen von aktivierten T-Lymphozyten ein Antigen isolieren, welches ein apparentes Molekulargewicht von ca. 55 küa besitzt.
Zur Bestimmung des Molekulargewichtes werden die Oberflächenproteine von aktivierten humanen T-Lymphozyten nach der Laktoperoxidasemethode radioiodiert (125-Iod) oder anderweitig markiert. Die Triton X-100 - Lysate solcher markierten T-ZeIlen werden mit den zu untersuchenden Hybridomüberständen inkubiert und anschließend diese Mausantikörper durch Zugabe von Anti-Mausimmunglobulin-Serum präzipitiert.
Die von unspezifischen Komponenten freigewaschenen Präzipitate
werden in Natriumdodecylsulfat-Puffer aufgelöst und anschließend einer NDS-Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen (5-10 54) unterzogen. An Hand von Referenzproteinen wird das apparente Molekulargewicht der radioiodierten, durch den entsprechenden monoklonalen Antikörper spezifisch abgetrennten Oberflachenanti gene der aktivierten T-Zeilen bestimmt. Es werden solche Hybridome ausgewählt, deren monoklonale Antikörper mit ZeIloberflächenantigenen von aktivierten humanen T-Zellen reagieren, die im reduzierten Zustand ein apparentes Molekulargewicht von 55 kDa aufweisen.
In einem anschließendem Selektionsschritt werden davon alle die Hybridome weiterkultiviert, deren Antikörper aktivierte humane T-Lymphozyten nach indirekter Markierung ausreichend stark anfärben, so daß die monoklonalen Antikörper sowohl zur qualitativen als auch zur quantitativen Analyse in durchflußzytometrischen Verfahren, wie z.B. der Analyse mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS 440), eingesetzt werden können.
In einem.weiteren Selektionsschritt werden die selektierten Hybridome überprüft, ob sie sich für die Markierung von aktivierten T-Zellen in Kryostatschnitten lymphoider Gewebe eignen und daß sie keine Nebenreaktionen mit anderen Geweben aufweisen.
Die durch eine derartige Selektion erhaltenen Hybridome werden rekloniert und hochproduktive Subklone selektiert, die die gewünschten monoklonalen Antikörper stabil sezernieren.Die so * erhaltenen Hybridome werden als H-BL-TAC/1 und H-BL-TAC/2 / bezeichnet
, Die Herstellung der monoklonalen Antikörper BL-TAC/1 und
BL-TAC/2 basiert auf einem Verfahren, welches auf die In-vitro- oder /n-vjvo-Kultür der Hybridome H-BL-TAC/1 und H-BL-TAC/2 ausgerichtet ist. Die Hybridome H-BL-TAC/1 und H-BL-TAC/2 werden an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Univeroität Leipzig kultiviert bzw. liegen kryokonserviert vor und sind Interessenten zugänglich. Die monoklonalen Antikörper BL-TAC/1 und BL-TAC/2 haben die Registriernummern ZIM-0157 und ZIM-0262 im Zentralinstitut für Molekularbiologie der AdW der DDR erhalten.
Die durch Iη-vitro- oder In-vivo-Kultür erhaltenen monoklonale Antikörper BL-TAC/1 und BL-TAC/2 reagieren'mit aktivierten T-Zellen, Leukozyten, anderen Blutzellen sowie lymphoiden Zellen » aus verschiedenen Organen in der in Tabelle 1 dargestellten Weise.
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Das Reaktionr.muster des monoklonal en Antikörpers mit permanent wachsenden Zell-Linien ist in Tabelle 2 aufgeführt.
Die monoklonalen Antikörper BL-TAC/1 und BL-TAC/2 können nach den üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren mit FITC, TRITC, Phycoerythrln und Biotin gekoppelt werden. Diese direkt markierten Präparate zeigen eine starke Markierung der aktivierten humanen T-Zellen.
Der monoklonale Antikörper BL-TAC/2 gehört der IgGl-Subklaese an, während der BL-TAC/1 überraschenderweise dem IgG3-Isotyp angehört. Dieser monoklonale Antikörper ist dabei besonders interessant, weil humane NK-ZeIlen einen Fc-Rezeptor besitzen, der auch Mausimmunglobulin der IgG3-Klasse bindet.
Additionsexperimente und Kreuzblockungsexperimente ergaben überraschenderweise, daß BL-TAC/1 und BL-TAC/2 an unterschiedliche Epitope des IL-2 - Rezeptors binden.
1. Ausführungsbeispiel Selektion von BL-TAC/1 und 2
Aus dem Blut gesunder Spender werden in der üblichen Weise mononukleäre Zellen gewonnen und in einer Dichte von 1 χ lo*/ml in Plastkulturschalen, die mit dem
Anti-T-Zellrezeptor/CD3-Komplex-Antikörper BL-TRec/1 <20 Mg/ml) beschichtet worden sind, für 48 h kultiviert.
Die aktivierten Lymphozyten werden mehrfach gewaschen und 6 Wochen alte weibliche BALB/c - Mäuse durch i.p. Applikation von 1 χ 10;" Zellen immunisiert. Fünf Wochen später erhalten die Mäuse im wöchentlichen Abstand 4 weitere Antigengaben <i.p.). Vier Tage vor der Fusion erhalten sie eine Injektion <i.v.) von 5 χ 10* aktivierten Lymphozyten.
Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert.
Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen mittels Behandlung mit 50 %igem Polyethylenglykol fusioniert. Die geeigneten Maus-Myelomzellen P3-X63 Ag 8.653 (KEARNEY ot al., J. Immunol.123, (1979), S.1548) werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gehalten.
,j 2 72 4 7 f '
θ 1
Thymidin enthält (LlTTLEFIELD, Science 145, (1964), S.709), werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt.
Die Selektion der Hybridome erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 2<όΌ μΐ - Kulturen aufgeteilt werden. Die überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern getestet, die mit ZeIloberflächenantigenen von aktivierten humanen T-Lymphozvten, nicht jedoch mit ruhenden T-Lymphozyten reagieren. Hierzu werden alle Kulturüberstände, die mit aktivierten humanen T-Lymphozyten reagieren, mit ruhenden humanen T- und B-Lymphozyten getestet. Nur diejenigen Kulturen werden weiter verwendet, deren Antikörper nicht mit ruhenden T- und B-Lymphozyten, wohl aber mit der großen Mehrheit der aktivierten Lymphozyten reagieren. Die Testung der Kulturüberstände mit den entsprechenden Zellen erfolgt durch indirekte Immunfluoreszenz. Dadurch wird ausgeschlossen, daß Hybridome weitergezogen werden, deren Antikörper mit Monozyten, Granulozyten, Thrombozyten und Erythrozyten reagieren.
Die zur Testung eingesetzten aktivierten Lymphozyten werden durch Behandlung von mononukleären Zellen mit Mitogenen (PHA, Con A, PWM), Anti-T-Zellrezeptor - Antikörper (BL-TRec/1) oder CD 3 -Antikörpern erzeugt.
In einem weiteren Selektionsschritt werden dann nur Hybridome / weitergezogen, deren monoklonalθ Antikörper von den Oberflächen v aktivierter T-Lymphozyten ein Antigen isolieren, welches ein apparentes Molekulargewicht von ca. 55 kDa besitzt.
Zur Bestimmung des Molekulargewichtes werden die Oberflächenproteine von aktivierten humanen T-Lymphozyten nach der Laktoperoxidasemethode radioiodiert (125-Iod). Die Triton X-100 - Lysate ι solcher markierten T-ZeIlen werden mit den zu untersuchenden Hybridomüberständen inkubiert und anschließend diese Mausantikörper durch Zugabe von Anti-Mausimmunglobulin-Serum präzipitiert.
Die von unspezifischen Komponenten frei gewaschenen Präzipitate werden in Natriumdodecyisulfat-Puffer aufgelöst und anschließend einer NDS-Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen (5-10 54) unterzogen. An Hand von Referenzproteinen wird das apparente Molekular-
gewicht der radioiodierten, durch den entsprechenden monoklonalen Antikörper spezifisch abgetrennten Oberflächenantigene der aktivierten J-Ze 11 en bestimmt. Es werden solche Hybridorne ausgewählt, deren mnnoklonale Antikörper mit Zelloberflächenantigenen von aktivierten humanen T-ZeIlen reagieren, die im reduzierten Zustand ein apparentes Molekulargewicht von 55 kOa aufweisen.
In einem anschließendem Selektionsschritt werden davon alle die Hybridome weiterkultiviert, deren Antikörper aktiviert*« lumane T-Lymphozyten nach indirekter Markierung ausreichend stark anfärben, so daß die monoklonalen Antikörper sowohl zur qualitativen als auch zur quantitativen Analyse in durchflußzytometrisehen Verfahren, wie z.B. der Analyse mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS 440), eingesetzt werden können.
In einem weiteren Selektionsschritt werden die selektierten Hybridome überprüft, ob sie sich für die Markierung von aktivierten T-ZeIlen in Kryostatschnitten lymphoider Gewebe eignen und daß sie keine Nebenreaktionen mit anderen Geweben aufweisen.
Die durch eine derartige Selektion erhaltenen Hybridome werden rekloniert und hochproduktive Subklone selektiert, die die gewünschten monoklonalen Antikörper stabil sezernieren.Die so erhaltenen Hybridome werden als H-BL-TAC/1 und H-BL-TAC/2 bezeichnet.
Die Hersteilung der monoklonalen Antikörper BL-TAC/1 und BL-TAC/2 basiert auf einem Verfahren, welches auf die In-vitro- ( oder In-vi vo-Ku.l tür de Hybridome H-BL-TAC/1 und H-BL-TAC/2 ( ausgerichtet ist.
2. Ausführungsbeispiel
Gewinnung der monoklonalen Antikörper BL-TAC/1 und 2 durch
In-vi
tro-Kultür
Jeweils 2 χ 10G Zellen der auf flüssigem Stickstoff gelagerten Hybridome werden aufgetaut und nach zweimaliger Waschung in jeweils 4 ml .RPMI 1640 - Zellkulturmedium mit 10 % fetalem Kälberserum aufgenommen. Von jedem werden vier separate 1 ml Kulturen in Gewebekulturplatten aus Polystyren angelegt.
10
Nach Vermehrung der Zellen werden davon eukzeeeiv 5 ml - , ml - und 50 ml - Kulturen In Qewebekulturflaschen angelegt.
Die zellfreien KulturOberstände enthalten den jeweiligen monoklonal en Antikörper BL-TAC/1 oder BL-TAC/2. Die monoklonalen Antikörper können nach einem üblichen Verfahren isoliert oder angereichert werden.
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11 Tabelle 1
Reaktionsmuster der monoklonalen Antikörper BL-TAC/1 und 2 mit humanen Blutzellen, aktivierten Zellen und Zellen aus lymphoiden Organen
2elltyp Markierte Zellen C%]
| PBL | 0 | 5 | - 10 | 0 | 5 | - 10 |
| T-Lymphozyten | 0 | 5 | - 1.5 | 0 | 5 | - 10 |
| B-Lymphozyten | < 3 | < 3 | ||||
| LGL (NK) | < 5 | < 5 | ||||
| Monozyten | 0 | e | ||||
| Granulozyten | 0 | 0 | ||||
| Erythrozyten | 0 | 0 | ||||
| Lymphoblasten (PHA-stim.) | > 95 | > 95 | ||||
| Lymphoblasten (Con A-stim.) | > 95 | > 95 | ||||
| Lymphoblasten (PWM-stim.) | > 80 | > 80 | ||||
| Lymphoblasten (CD 3-stim.) | > 95 | > 95 | ||||
| Lymphoblasten '3L-TReC-StIm.) | > 95 | > 95 | ||||
| Thymozyten | - 30 | - 20 | ||||
| Tonsi1lenlymphozyten | - 10 | - 10 |
BlndungsmuBter der monoklonalen Antikörper BL-TAC/1 und 2 mit permanent wacheenden humanen Zell-Linien
Zeil-Linie Reaktion mit den Zellen
T-ZeIlen:
CEM
MOLT-3
MOLT-4
JURKAT
HSB-2
SKW-3
HUT-102
T-Zellklone <IL-2 abhängig) AK-15
KT-2
B-ZeIlen:
REH
RAJI IM-09
/ GM-607
HMy-2
Myeloide Linie: U-937
Erythroide Linie: K-562
Nachweis durch indirekte Immunfluoreszenz +++; 100 % stark markiert ++, 100 % schwach markiert +; < 100 > 25 % +/-; < 25 '/. -; unmarkiert
Claims (1)
- R s> -fc e> η -t st r-> is p> Jr »_i cz \n :Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen den IL-2 - Rezeptor humaner T-Lymphozyten durch Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit aktivierten humanen T-Lymphozyten, Fusion von aus den Milzen solcher Mäuse gewonnenen B-Lymphozyten mit murinen Myelomzellen, Selektion von Hybridomen, die monoklonale Antikörper mit Spezifitat für aktivierte T-Zellen sezernieren, dadurch gekennzeichnet,daß Hybridome, deren monoklonale Antikörper mit dem IL-2 Rezeptor der T-Lymphozyten, einem Glykoprotein von ca. 55 kDa, spezifisch reagieren, dergestalt selektiert werden,daß zuerst Klone ausgewählt werden, die mit aktivierten T-Lymphozyten stark, nicht'jedoch mit ruhenden T-Zellen reagieren,in einem weiterem Selektionsschritt Hybridome ausgewählt werden, deren monoklonale Antikörper mit einem radiomarkierten, durch Detergensbehandlung von T-ZeIIbIasten solubilisierten Oberf lächenan'tigen mit einem Molekulargewicht von ca. 55 kDa reagieren, selektiert werden,wobei in einem dritten Selektionssschritt nur diejenigen monoklonal en Antikörper berücksichtigt werden, die bei indirekter Immunfluoreszenz und durchflußzytometrischer Auswertung eine für die stabile Markierung ausreichend hohe Affinität zu dem IL-2 Rezeptor der humanen T-Lymphoblasten aufweisen,daß die so determinierten Hybridome H-BL-TAC/1 <Registrier-Nr. ( ZIM-0157) und H-BL-TAC/2 (ZIM-0262) in vitro und in vivo V kultiviert werden und die sezernierten monoklonalen Antikörper BL-TAC/1 und BL-TAC/2 isoliert, angereichert und gegebenenfalls mit Markern oder an feste Phasen gekoppelt werden.
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|---|---|---|---|
| DD31669788A DD272471A1 (de) | 1988-06-13 | 1988-06-13 | Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen den il-2-rezeptor humaner t-lymphozyten |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| DD31669788A DD272471A1 (de) | 1988-06-13 | 1988-06-13 | Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen den il-2-rezeptor humaner t-lymphozyten |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8182812B2 (en) | 2002-11-15 | 2012-05-22 | Genmab A/S | Human monoclonal antibodies against CD25 |
-
1988
- 1988-06-13 DD DD31669788A patent/DD272471A1/de not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8182812B2 (en) | 2002-11-15 | 2012-05-22 | Genmab A/S | Human monoclonal antibodies against CD25 |
| US8961968B2 (en) | 2002-11-15 | 2015-02-24 | Genmab A/S | Human monoclonal antibodies against CD25 |
| US9598493B2 (en) | 2002-11-15 | 2017-03-21 | Genmab A/S | Human monoclonal antibodies against CD25 |
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