DD272471A1 - PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST THE IL-2 RECEPTOR OF HUMAN T-LYMPHOCYTES - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen den IL-2-Rezeptor humaner T-Lymphozyten. Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung von entsprechenden monoklonalen Antikoerpern anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen dieser Antikoerper erlaubt. Die monoklonalen Antikoerper sollen eine hohe Spezifitaet und Affinitaet, die ihren Einsatz in der Durchflusszytometrie gestatten, aufweisen. Dazu werden in bekannter Weise Hybridzellen von B-Lymphozyten immunisierter BALB-c-Maeuse erzeugt und Hybridomzellen selektiert, deren monoklonale Antikoerper die gewuenschten Eigenschaften aufweisen. Das Selektionsverfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass in einem mehrstufigen Selektionssystem Hybridome erzeugt und kultiviert werden, deren monoklonale Antikoerper mit dem IL-2-Rezeptor reagieren und dadurch zum Nachweis aktivierter T-Lymphozyten geeignet sind. Der monoklonale Antikoerper BL-TAC/1 des Hybridoms H-BL-TAC/1 zeichnet sich durch eine besonders hohe Affinitaet aus und fuehrt aufgrund dessen zu starken Markierungen der IL-2-Rezeptor tragenden Zellen. Besonders bemerkenswert ist der IGG3-Isotyp dieses monoklonalen Antikoerpers. Der monoklonale Antikoerper hat die Registriernummer ZIM-0157. Der monoklonale Antikoerper BL-TAC/2 bindet an einen anderen Epitop des gleichen Antigens bzw. Antigenkomplexes ohne die Bindung von BL-TAC/1 zu behindern. BL-TAC/2 gehoert dem IgG1-Isotyp an und hat die Registriernummer ZIM-0262. Das Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikoerper beruht auf der In-vitro- oder In-vivo- Kultivierung der entsprechenden Hybridome H-BL-TAC/1 bzw. H-BL-TAC/2 und der Abtrennung der monoklonalen Antikoerper. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.The invention relates to a method for producing monoclonal antibodies against the IL-2 receptor of human T-lymphocytes. The object of the invention is to provide a process for the production of corresponding monoclonal antibodies, which allows the production of relatively large quantities of these antibodies in an easily controllable manner. The monoclonal antibodies should have high specificity and affinity allowing their use in flow cytometry. For this purpose, hybrid cells of B-lymphocytes of immunized BALB-c mice are produced in known manner and hybridoma cells are selected whose monoclonal antibodies have the desired properties. The selection method is characterized in that hybridomas are generated and cultured in a multistage selection system whose monoclonal antibodies react with the IL-2 receptor and are therefore suitable for the detection of activated T lymphocytes. The monoclonal antibody BL-TAC / 1 of the hybridoma H-BL-TAC / 1 is characterized by a particularly high affinity and as a result leads to strong labeling of the cells carrying IL-2 receptor. Particularly noteworthy is the IGG3 isotype of this monoclonal antibody. The monoclonal antibody has the registration number ZIM-0157. The monoclonal antibody BL-TAC / 2 binds to another epitope of the same antigen or antigen complex without hindering the binding of BL-TAC / 1. BL-TAC / 2 belongs to the IgG1 isotype and has the registration number ZIM-0262. The method for producing the monoclonal antibodies based on the in vitro or in vivo cultivation of the corresponding hybridomas H-BL-TAC / 1 and H-BL-TAC / 2 and the separation of the monoclonal antibodies. The field of application of the invention is medical diagnostics.
Description
Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen den IL-2 - Rezeptor humaner T-LymphozytenProcess for the preparation of monoclonal antibodies against the IL-2 receptor of human T-lymphocytes
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die mit dem IL-2 - Rezeptor.humaner T-Lymphozyten reagieren. Dadurch ist dieser monoklonal θ Antikörper als Nachweisreagens für aktivierte humane T-Ly.nphozyten, die bei verschiedenen Krankheiten mit immunologischen Komponenten, bei Infektionskrankheiten, bei Neoplasien des lymphozytären Systems sowie bei Transplantationskrisen auftreten, geeignet. Die monoklonalen Antikörper können zur medizinischen Diagnostik und zur Eliminierung von aktivierten und neoplastischen humanen T-Lymphozyten eingesetzt werden.The invention relates to a process for the production of monoclonal antibodies which react with the IL-2 receptor human T lymphocytes. As a result, this monoclonal antibody is useful as a detection reagent for activated human T lymphocytes which are found in various diseases involving immunological components, infectious diseases, lymphocytic neoplasia and transplantation crises. The monoclonal antibodies can be used for medical diagnostics and elimination of activated and neoplastic human T lymphocytes.
Die Fortschritte der Differenzierung von Lymphozyten, die unterschiedliche Funktionen erfüllen, durch monoklonale Antikörper (Leukocyte Typing II. Vol.1-3, Hrsg.: E.L.REINHERZ et al.: Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986) haben die Diagnostik von Krankheiten mit immunologischer Komponente, von Neoplasien des Immunsystems und die Überwachung von Transplantationen deutlich verbessert. Es hat sich Jedoch gezeigt, daß Veränderungen der Anteile von funktioneilen Subpopulationen im peripheren Blut nur bei sehr drastischen Störungen und Reaktionen des Immunsystems erfolgen, so daß immunologische Reaktionen, soweit sie in der normalen physiologischen Schwankungsbreite liegen, nicht sicher mit Anti-Subpopulations-Antikörpern erfaßt werden können.The progress of differentiation of lymphocytes that perform different functions by monoclonal antibodies (Leukocyte Typing II. Vol.1-3, ed .: ELREINHERZ et al .: Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986) significantly improves the diagnosis of diseases with immunological components, neoplasms of the immune system and the monitoring of transplants. It has been found, however, that changes in the proportions of functional subpopulations in peripheral blood occur only in very drastic disorders and reactions of the immune system, so that immunological reactions, as far as they are within the normal physiological range of variation, are not reliably detected by anti-subpopulation antibodies can be.
Lymphozyten, die durch Antigene, Mitogene oder monoklonale Antikörper gegen bestimmte ZeIloberflächenantigene aktiviert werden, verändern im Gefolge dieser Aktivierung qualitativ und quantitativ ihr,ZeIloberflächenantigenmuster. Der durch dieLymphocytes activated by antigens, mitogens or monoclonal antibodies against certain cell surface antigens qualitatively and quantitatively alter their cell surface antigenic pattern as a result of this activation. The one by the
Aktivierung ausgelöste Eintritt in den Zellzyklus erfordert die Einstellung der Zelle auf neue physiologische Leistungen. Es werden z.B. Rezeptoren für Hormone, Interleukine, wie z.B. IL-2, aber auch für Nährstoffe entweder neu oder verstärkt exprimiert. Diese Veränderungen sind die Voraussetzung für die DNA-Synthese, Mitose, Proliferation und funktionelle Enddifferenzierung.Activation triggered entry into the cell cycle requires the adjustment of the cell to new physiological benefits. There are e.g. Receptors for hormones, interleukins, e.g. IL-2, but also expressed for nutrients either new or enhanced. These changes are the prerequisite for DNA synthesis, mitosis, proliferation and functional end-differentiation.
Die Aufklärung der Veränderungen des Zeiloberflächenmusters steht erst am Anfang. Einige der Veränderungen konnten schon durch die Markierung der neu auftretenden Antigene mit monoklonalen Antikörpern erfaßt werden. So ist der monoklonale Antikörper OKT (US-PS 4 624 925) gegen den Transferrinrezeptor gerichtet. Auch der monokonale Antikörper OKT 10 (EP 0 030 815) reagiert mit aktivierten T-Lymphozyten. Gegen solche in ihrer Funktion noch nicht bekannten Antigene sind weitere monoklonale Antikörper beschrieben worden. Dazu gehören die Antigene, die durch die monoklonaien Antikörper 4F2 (Mol.-Gew. 80/40 kDa: HAYNES et al.: J. Immunol. 126,(1981), 1409), der CDw26-Gruppe (Mol.-Gew.:120 u. 200 kDa: Leukocyte Typing II, VoI.1, Hrsg.: E.L.REINHERZ et al.; Springer Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986) und der CD 30-Gruppe (Leucocyte Typing III, Hrsg.: A.J.McMICHAEL et al., Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo 1987) erkannt werden. Von besonderer Bedeutung ist der monoklonale Anti-Tac, der mit dem IL-2 - Rezeptor reagiert (WALDMANN: Science 232, (198G) 727-732). Weitere Antikörper dieses Typs sind im Rahmen des III.' Workshops über Leukozytendifferenzierungsantigene (Leucocyte Typing III, Hrsg.: A.J.McMICHAEL et al.; Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo 1987) beschrieben worden.The elucidation of the changes of the Zeiloberflächenmusters is only at the beginning. Some of the changes could already be detected by labeling the emerging antigens with monoclonal antibodies. Thus, the monoclonal antibody OKT (US Pat. No. 4,624,925) is directed against the transferrin receptor. The monoclonal antibody OKT 10 (EP 0 030 815) also reacts with activated T lymphocytes. Other such monoclonal antibodies have been described against such unknown antigens in their function. These include the antigens expressed by the monoclonal antibodies 4F2 (mole wt 80/40 kDa: HAYNES et al .: J. Immunol., 126, (1981), 1409), the CDw26 group (mol.wt. : 120 and 200 kDa: Leukocyte Typing II, VoI.1, ed .: ELREINHERZ et al., Springer Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986) and the CD 30 group (Leucocyte Typing III, ed. : AJMmICHAEL et al., Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo 1987). Of particular importance is the monoclonal anti-Tac that reacts with the IL-2 receptor (WALDMANN: Science 232, (198G) 727-732). Further antibodies of this type are in the context of III. ' Workshops on leukocyte differentiation antigens (Leucocyte Typing III, ed .: A. J. M. MICHAEL et al .; Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo 1987).
Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörper für den IL-2 - Rezeptor (Glykoprotein, 55 kDa) der humanen T-Lymphozyten gestattet.The object of the invention is to provide a process for producing monoclonal antibodies which allows, in an easily controllable manner, the cost-effective production of larger quantities of specific antibodies for the human T-lymphocyte IL-2 receptor (glycoprotein, 55 kDa).
Die monoklonalen Antikörper sollen eine hohe Affinität besitzen und mit verschiedenen Epitopen des IL-2 - Rezeptors reagieren, der vorzugsweise auf aktivierten T-Lymphozyten exprimiert wird, undThe monoclonal antibodies are said to have a high affinity and to react with different epitopes of the IL-2 receptor, which is preferably expressed on activated T lymphocytes, and
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sie sollen sich zur qualitativen und quantitativen durchflußzytometrischen Analyse sowie zur Eliminierung von normalen und neoplastischen T-ZeI lan aus Lymphozytenpräparationen eignen.they should be suitable for qualitative and quantitative flow cytometric analysis as well as for the elimination of normal and neoplastic T-cell from lymphocyte preparations.
Die monoklonalen Antikörper sollen stabil und lagerfähig sein. Sie sollen sich auch zur direkten Kopplung mit Fluoreszenzfarbstoffen eignen.The monoclonal antibodies should be stable and storable. They should also be suitable for direct coupling with fluorescent dyes.
Durch die Bereitstellung solcher monoklonalen Antikörper soll die medizinische Diagnostik von aktivierten humanen T-Lymphozyten qualifiziert ».erden.The provision of such monoclonal antibodies is intended to qualify the medical diagnosis of activated human T-lymphocytes.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunächst Hybridoma erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridoma sollen in anschließenden Verfahrensschritten monoklonale Antikörper erzeugt werden, die mit dem IL-2 - Rezeptor, einem 55 kDa - Glykoprotein, der aktivierten humanen T-Zellen reagieren.The invention has for its object to provide a comprehensible method, in the course of which hybridoma are first generated, which are easy and inexpensive to handle and their cultivation is possible in a technically and economically advantageous manner. Using these hybridomas, subsequent monoclonal antibodies are to be generated which react with the IL-2 receptor, a 55 kDa glycoprotein, of activated human T cells.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst,daß zunächst nach den bekannten Verfahren der Dichtegradientenzentrifugation Lymphozyten aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern isoliert werden. Diese Lymphozyten werden durch Mitogene, wie z.B.' Con A oder PHA, oder durch einen monoklonalen AntiKörper gegen den T-Zellrezeptor/CD 3 - Komplex, wie z.B. BL-TRec, stimuliert. Für die Immunisierung werden aktivierte T-Lymphozyten nach 2- bie 3-tägiger Kultur verwendet.The object is achieved by first isolating lymphocytes from the peripheral blood of healthy donors by the known methods of density gradient centrifugation. These lymphocytes are produced by mitogens, such as' Con A or PHA, or by a monoclonal antibody to the T cell receptor / CD 3 complex, e.g. BL-TRec, stimulated. For immunization, activated T lymphocytes are used after 2 to 3 days of culture.
Mit in der vorangehend beschriebenen oder auf eine andere ähnliche Weise gewonnen aktivierten humanen T-Lymphozyten werden Mäuse immunisiert. Vorzugsweise werden 6-8 Wochen alte weibliche BALB/c - Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens.Mice are immunized with human T lymphocytes activated in the manner previously described or otherwise obtained. Preferably, 6-8 week old female BALB / c mice are used. The immunization is carried out by repeated application of the antigen.
Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert.From the spleens of such hyperimmunized mice, the lymphocytes are separated in a conventional manner.
Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert. Die geeigneten Maus-Myelomzellen P3-X63 Ag 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol.123, (1979), S.1548)The B lymphocytes of this cell mixture are fused with mouse B myeloma cells. The appropriate mouse myeloma cells P3-X63 Ag 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, (1979), p.1548)
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5 werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gehalten. 5 are maintained in RPMI-1640 with 10% fetal calf serum (FCS).
In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält <LITTLEFIELD, Science 145, (1964), S.709), werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt .nd erfindungsgemäß Zellklone selektiert, die Antikörper der gewünschten Spezifitat und der anderen in der Zielstellung genannten Eigenschaften sezernieren.In a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine <LITTLEFIELD, Science 145, (1964), p.709), the hybrid cells formed are separated from the unfused myeloma cells and according to the invention cell clones are selected, the antibodies of the desired specificity and the others secrete properties mentioned in the objective.
Die Selektion der Hybridorne erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200 μΐ - Kulturen aufgeteilt werden Die überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern getestet, die mit Zelloberflächenantigenen von aktivierten humanen T-Lymphozyten, nicht jedoch mit ruhenden T-Lymphozyten reagieren. Hierzu werden alle Kulturüberstände, die mit aktivierten humanen T-Lymphozyten reagieren, mit ruhenden humanen T- und B-Lymphozyten getestet. Nur diejenigen Kulturen werden weiter verwendet, deren Antikörper nicht mit ruhenden T-. und B-Lymphozyten, wohl aber mit der großen Mehrheit der aktivierten Lymphozyten reagieren. Di-3 Testung der Kulturüberstände mit den entsprechenden Zellen kann sowohl durch indirekte Radiobindungstechnik als auch durch indirekte Immunfluoreszenz erfolgen.The selection of the hybrid beads is done by dividing the cells immediately after the fusion into a plurality of separate 200 μΐ cultures. The supernatants of the cultures containing the growing hybrid cells are assayed for the presence of antibodies bound with activated human T cell surface antigens Lymphocytes, but not react with resting T lymphocytes. For this purpose, all culture supernatants which react with activated human T lymphocytes are tested with resting human T and B lymphocytes. Only those cultures will continue to be used whose antibodies are not quiescent T-. and B lymphocytes, but respond to the vast majority of activated lymphocytes. Di-3 testing of the culture supernatants with the respective cells can be carried out both by indirect radio-binding technique and by indirect immunofluorescence.
So selektierte Kulturen müssen ab dieser Stufe jedoch auf jeden Fall mit der indirekten Immunfluoreszenztechnik überprüft werden. Dadurch wird ausgeschlossen, daß Hybridorne weitergezogen werden, deren Antikörper mit Monozyten, Granulozyten, Thrombozyten und Erythrozyten reagieren.In any case, cultures selected in this way must be checked with the indirect immunofluorescence technique. This precludes the extension of hybrid beads whose antibodies react with monocytes, granulocytes, platelets and erythrocytes.
In einem weiteren Selektionsschritt werden dann nur Hybridome weitergezogen, deren monoklonale Antikörner von den Oberflächen von aktivierten T-Lymphozyten ein Antigen isolieren, welches ein apparentes Molekulargewicht von ca. 55 küa besitzt.In a further selection step, only hybridomas are then transferred whose monoclonal antibodies isolate an antigen from the surfaces of activated T lymphocytes which has an apparent molecular weight of about 55 ku.
Zur Bestimmung des Molekulargewichtes werden die Oberflächenproteine von aktivierten humanen T-Lymphozyten nach der Laktoperoxidasemethode radioiodiert (125-Iod) oder anderweitig markiert. Die Triton X-100 - Lysate solcher markierten T-ZeIlen werden mit den zu untersuchenden Hybridomüberständen inkubiert und anschließend diese Mausantikörper durch Zugabe von Anti-Mausimmunglobulin-Serum präzipitiert.To determine the molecular weight, the surface proteins of activated human T-lymphocytes are radioiodinated (125-iodine) or otherwise labeled by the lactoperoxidase method. The Triton X-100 lysates of such labeled T cells are incubated with the hybridoma supernatants to be examined and subsequently these mouse antibodies are precipitated by addition of anti-mouse immunoglobulin serum.
Die von unspezifischen Komponenten freigewaschenen PräzipitateThe precipitates freed from unspecific components
werden in Natriumdodecylsulfat-Puffer aufgelöst und anschließend einer NDS-Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen (5-10 54) unterzogen. An Hand von Referenzproteinen wird das apparente Molekulargewicht der radioiodierten, durch den entsprechenden monoklonalen Antikörper spezifisch abgetrennten Oberflachenanti gene der aktivierten T-Zeilen bestimmt. Es werden solche Hybridome ausgewählt, deren monoklonale Antikörper mit ZeIloberflächenantigenen von aktivierten humanen T-Zellen reagieren, die im reduzierten Zustand ein apparentes Molekulargewicht von 55 kDa aufweisen.are dissolved in sodium dodecyl sulfate buffer and then subjected to NDS electrophoresis on polyacrylamide gels (5-10 54). Reference proteins are used to determine the apparent molecular weight of the radioiodinated surface antigens specifically separated by the corresponding monoclonal antibody of the activated T cells. Those hybridomas are selected whose monoclonal antibodies react with cell surface antigens of activated human T cells which, when reduced, have an apparent molecular weight of 55 kDa.
In einem anschließendem Selektionsschritt werden davon alle die Hybridome weiterkultiviert, deren Antikörper aktivierte humane T-Lymphozyten nach indirekter Markierung ausreichend stark anfärben, so daß die monoklonalen Antikörper sowohl zur qualitativen als auch zur quantitativen Analyse in durchflußzytometrischen Verfahren, wie z.B. der Analyse mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS 440), eingesetzt werden können.In a subsequent selection step, all of the hybridomas whose antibodies stain activated human T-lymphocytes sufficiently strongly by indirect labeling are further cultured therefrom, so that the monoclonal antibodies are used for both qualitative and quantitative analysis in flow cytometric methods, e.g. analysis with a fluorescence activated cell sorter (FACS 440).
In einem.weiteren Selektionsschritt werden die selektierten Hybridome überprüft, ob sie sich für die Markierung von aktivierten T-Zellen in Kryostatschnitten lymphoider Gewebe eignen und daß sie keine Nebenreaktionen mit anderen Geweben aufweisen.In a further selection step, the selected hybridomas are checked whether they are suitable for the labeling of activated T cells in cryostat sections of lymphoid tissue and that they have no side reactions with other tissues.
Die durch eine derartige Selektion erhaltenen Hybridome werden rekloniert und hochproduktive Subklone selektiert, die die gewünschten monoklonalen Antikörper stabil sezernieren.Die so * erhaltenen Hybridome werden als H-BL-TAC/1 und H-BL-TAC/2 / bezeichnetThe hybridomas obtained by such selection are recloned and highly productive subclones are stably secreting the desired monoclonal antibodies. The hybridomas thus obtained are designated H-BL-TAC / 1 and H-BL-TAC / 2 /
, Die Herstellung der monoklonalen Antikörper BL-TAC/1 und , The preparation of the monoclonal antibodies BL-TAC / 1 and
BL-TAC/2 basiert auf einem Verfahren, welches auf die In-vitro- oder /n-vjvo-Kultür der Hybridome H-BL-TAC/1 und H-BL-TAC/2 ausgerichtet ist. Die Hybridome H-BL-TAC/1 und H-BL-TAC/2 werden an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Univeroität Leipzig kultiviert bzw. liegen kryokonserviert vor und sind Interessenten zugänglich. Die monoklonalen Antikörper BL-TAC/1 und BL-TAC/2 haben die Registriernummern ZIM-0157 und ZIM-0262 im Zentralinstitut für Molekularbiologie der AdW der DDR erhalten.BL-TAC / 2 is based on a method which is directed to the in vitro or in vivo culture of hybridomas H-BL-TAC / 1 and H-BL-TAC / 2. The hybridomas H-BL-TAC / 1 and H-BL-TAC / 2 are cultivated at the Biosciences Section of the Karl-Marx-University Leipzig or are cryopreserved and are accessible to interested parties. The monoclonal antibodies BL-TAC / 1 and BL-TAC / 2 have received the registration numbers ZIM-0157 and ZIM-0262 at the Central Institute for Molecular Biology of the AdW of the GDR.
Die durch Iη-vitro- oder In-vivo-Kultür erhaltenen monoklonale Antikörper BL-TAC/1 und BL-TAC/2 reagieren'mit aktivierten T-Zellen, Leukozyten, anderen Blutzellen sowie lymphoiden Zellen » aus verschiedenen Organen in der in Tabelle 1 dargestellten Weise.The monoclonal antibodies BL-TAC / 1 and BL-TAC / 2 obtained by in vitro or in vivo administration react with activated T cells, leucocytes, other blood cells and lymphoid cells of various organs in the Table 1 illustrated manner.
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Das Reaktionr.muster des monoklonal en Antikörpers mit permanent wachsenden Zell-Linien ist in Tabelle 2 aufgeführt.The reaction pattern of the monoclonal antibody with permanently growing cell lines is shown in Table 2.
Die monoklonalen Antikörper BL-TAC/1 und BL-TAC/2 können nach den üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren mit FITC, TRITC, Phycoerythrln und Biotin gekoppelt werden. Diese direkt markierten Präparate zeigen eine starke Markierung der aktivierten humanen T-Zellen.The monoclonal antibodies BL-TAC / 1 and BL-TAC / 2 can be coupled to FITC, TRITC, phycoerythrin and biotin by the usual methods known to those skilled in the art. These directly labeled preparations show strong labeling of the activated human T cells.
Der monoklonale Antikörper BL-TAC/2 gehört der IgGl-Subklaese an, während der BL-TAC/1 überraschenderweise dem IgG3-Isotyp angehört. Dieser monoklonale Antikörper ist dabei besonders interessant, weil humane NK-ZeIlen einen Fc-Rezeptor besitzen, der auch Mausimmunglobulin der IgG3-Klasse bindet.The monoclonal antibody BL-TAC / 2 belongs to the IgGl subclass, while the BL-TAC / 1 surprisingly belongs to the IgG3 isotype. This monoclonal antibody is particularly interesting because human NK cells have an Fc receptor that also binds mouse immunoglobulin of the IgG3 class.
Additionsexperimente und Kreuzblockungsexperimente ergaben überraschenderweise, daß BL-TAC/1 und BL-TAC/2 an unterschiedliche Epitope des IL-2 - Rezeptors binden.Addition experiments and cross-blocking experiments surprisingly revealed that BL-TAC / 1 and BL-TAC / 2 bind to different epitopes of the IL-2 receptor.
1. Ausführungsbeispiel Selektion von BL-TAC/1 und 21st Embodiment Selection of BL-TAC / 1 and 2
Aus dem Blut gesunder Spender werden in der üblichen Weise mononukleäre Zellen gewonnen und in einer Dichte von 1 χ lo*/ml in Plastkulturschalen, die mit demFrom the blood of healthy donors mononuclear cells are obtained in the usual way and in a density of 1 χ lo * / ml in plastic culture dishes, with the
Anti-T-Zellrezeptor/CD3-Komplex-Antikörper BL-TRec/1 <20 Mg/ml) beschichtet worden sind, für 48 h kultiviert.Anti-T cell receptor / CD3 complex antibody BL-TRec / 1 <20 mg / ml), cultured for 48 h.
Die aktivierten Lymphozyten werden mehrfach gewaschen und 6 Wochen alte weibliche BALB/c - Mäuse durch i.p. Applikation von 1 χ 10;" Zellen immunisiert. Fünf Wochen später erhalten die Mäuse im wöchentlichen Abstand 4 weitere Antigengaben <i.p.). Vier Tage vor der Fusion erhalten sie eine Injektion <i.v.) von 5 χ 10* aktivierten Lymphozyten.The activated lymphocytes are washed several times and 6 weeks old female BALB / c mice by ip administration of 1 × 10 ; "Cells immunized five weeks later mice receive 4 more antigens <ip <at weekly intervals. </ P><4><4><4><4><4> of activated lymphocytes four days before fusion.
Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert.From the spleens of such hyperimmunized mice, the lymphocytes are separated in a conventional manner.
Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen mittels Behandlung mit 50 %igem Polyethylenglykol fusioniert. Die geeigneten Maus-Myelomzellen P3-X63 Ag 8.653 (KEARNEY ot al., J. Immunol.123, (1979), S.1548) werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gehalten.The B lymphocytes of this cell mixture are fused with mouse B myeloma cells by treatment with 50% polyethylene glycol. The appropriate mouse myeloma cells P3-X63 Ag 8.653 (KEARNEY ot al., J. Immunol. 123, (1979), p.1548) are maintained in RPMI-1640 with 10% fetal calf serum (FCS).
,j 2 72 4 7 f ', j 2 72 4 7 f '
θ 1θ 1
Thymidin enthält (LlTTLEFIELD, Science 145, (1964), S.709), werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt.Thymidine contains (LITTENFIELD, Science 145, (1964), p.709), the hybrid cells formed are separated from the unfused myeloma cells.
Die Selektion der Hybridome erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 2<όΌ μΐ - Kulturen aufgeteilt werden. Die überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern getestet, die mit ZeIloberflächenantigenen von aktivierten humanen T-Lymphozvten, nicht jedoch mit ruhenden T-Lymphozyten reagieren. Hierzu werden alle Kulturüberstände, die mit aktivierten humanen T-Lymphozyten reagieren, mit ruhenden humanen T- und B-Lymphozyten getestet. Nur diejenigen Kulturen werden weiter verwendet, deren Antikörper nicht mit ruhenden T- und B-Lymphozyten, wohl aber mit der großen Mehrheit der aktivierten Lymphozyten reagieren. Die Testung der Kulturüberstände mit den entsprechenden Zellen erfolgt durch indirekte Immunfluoreszenz. Dadurch wird ausgeschlossen, daß Hybridome weitergezogen werden, deren Antikörper mit Monozyten, Granulozyten, Thrombozyten und Erythrozyten reagieren.The selection of the hybridomas takes place in such a way that the cells are split up immediately after the fusion in a multiplicity of separate 2 <όΌ μΐ - cultures. The supernatants of cultures containing the mature hybrid cells are tested for the presence of antibodies that react with cell surface antigens of activated human T lymphocytes, but not resting T lymphocytes. For this purpose, all culture supernatants which react with activated human T lymphocytes are tested with resting human T and B lymphocytes. Only those cultures are still used whose antibodies do not react with dormant T and B lymphocytes, but with the great majority of activated lymphocytes. The testing of the culture supernatants with the corresponding cells is carried out by indirect immunofluorescence. This excludes the possibility of further hybridomas, whose antibodies react with monocytes, granulocytes, platelets and erythrocytes.
Die zur Testung eingesetzten aktivierten Lymphozyten werden durch Behandlung von mononukleären Zellen mit Mitogenen (PHA, Con A, PWM), Anti-T-Zellrezeptor - Antikörper (BL-TRec/1) oder CD 3 -Antikörpern erzeugt.The activated lymphocytes used for testing are produced by treatment of mononuclear cells with mitogens (PHA, Con A, PWM), anti-T cell receptor antibodies (BL-TRec / 1) or CD 3 antibodies.
In einem weiteren Selektionsschritt werden dann nur Hybridome / weitergezogen, deren monoklonalθ Antikörper von den Oberflächen v aktivierter T-Lymphozyten ein Antigen isolieren, welches ein apparentes Molekulargewicht von ca. 55 kDa besitzt.Then, in a further selection step only hybridomas / pulled further, the monoklonalθ antibodies isolated from the surfaces of activated T lymphocytes v an antigen which has an apparent molecular weight of approximately 55 kDa.
Zur Bestimmung des Molekulargewichtes werden die Oberflächenproteine von aktivierten humanen T-Lymphozyten nach der Laktoperoxidasemethode radioiodiert (125-Iod). Die Triton X-100 - Lysate ι solcher markierten T-ZeIlen werden mit den zu untersuchenden Hybridomüberständen inkubiert und anschließend diese Mausantikörper durch Zugabe von Anti-Mausimmunglobulin-Serum präzipitiert.To determine the molecular weight, the surface proteins of activated human T-lymphocytes are radioiodinated according to the Lactoperoxidasemethode (125-iodine). The Triton X-100 lysates of such labeled T cells are incubated with the hybridoma supernatants to be examined, and then these mouse antibodies are precipitated by addition of anti-mouse immunoglobulin serum.
Die von unspezifischen Komponenten frei gewaschenen Präzipitate werden in Natriumdodecyisulfat-Puffer aufgelöst und anschließend einer NDS-Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen (5-10 54) unterzogen. An Hand von Referenzproteinen wird das apparente Molekular-The precipitates washed free of unspecific components are dissolved in sodium dodecyl sulfate buffer and then subjected to NDS electrophoresis on polyacrylamide gels (5-10 54). By reference proteins, the apparent molecular weight
gewicht der radioiodierten, durch den entsprechenden monoklonalen Antikörper spezifisch abgetrennten Oberflächenantigene der aktivierten J-Ze 11 en bestimmt. Es werden solche Hybridorne ausgewählt, deren mnnoklonale Antikörper mit Zelloberflächenantigenen von aktivierten humanen T-ZeIlen reagieren, die im reduzierten Zustand ein apparentes Molekulargewicht von 55 kOa aufweisen.Weight of the radioiodinated surface antigens of the activated J-Ze 11en specifically separated by the corresponding monoclonal antibody. Those hybridomas are selected whose mRNAs react with cell-surface antigens of activated human T-cells which, when reduced, have an apparent molecular weight of 55 kOa.
In einem anschließendem Selektionsschritt werden davon alle die Hybridome weiterkultiviert, deren Antikörper aktiviert*« lumane T-Lymphozyten nach indirekter Markierung ausreichend stark anfärben, so daß die monoklonalen Antikörper sowohl zur qualitativen als auch zur quantitativen Analyse in durchflußzytometrisehen Verfahren, wie z.B. der Analyse mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS 440), eingesetzt werden können.In a subsequent selection step, all of the hybridomas are further cultivated, the antibodies of which activate sufficiently strong luminescent T lymphocytes after indirect labeling, so that the monoclonal antibodies can be used both for qualitative and quantitative analysis in flow cytometry methods, e.g. analysis with a fluorescence activated cell sorter (FACS 440).
In einem weiteren Selektionsschritt werden die selektierten Hybridome überprüft, ob sie sich für die Markierung von aktivierten T-ZeIlen in Kryostatschnitten lymphoider Gewebe eignen und daß sie keine Nebenreaktionen mit anderen Geweben aufweisen.In a further selection step, the selected hybridomas are checked whether they are suitable for the labeling of activated T cells in cryostat sections of lymphoid tissue and that they have no side reactions with other tissues.
Die durch eine derartige Selektion erhaltenen Hybridome werden rekloniert und hochproduktive Subklone selektiert, die die gewünschten monoklonalen Antikörper stabil sezernieren.Die so erhaltenen Hybridome werden als H-BL-TAC/1 und H-BL-TAC/2 bezeichnet.The hybridomas obtained by such selection are recloned and highly productive subclones are stably secreting the desired monoclonal antibodies. The hybridomas thus obtained are designated H-BL-TAC / 1 and H-BL-TAC / 2.
Die Hersteilung der monoklonalen Antikörper BL-TAC/1 und BL-TAC/2 basiert auf einem Verfahren, welches auf die In-vitro- ( oder In-vi vo-Ku.l tür de Hybridome H-BL-TAC/1 und H-BL-TAC/2 ( ausgerichtet ist.The production of the monoclonal antibodies BL-TAC / 1 and BL-TAC / 2 is based on a method which is applicable to the in vitro ( or in vivo) of hybridomas H-BL-TAC / 1 and H -BL-TAC / 2 (aligned.
2. Ausführungsbeispiel2nd embodiment
Gewinnung der monoklonalen Antikörper BL-TAC/1 und 2 durchObtaining the monoclonal antibodies BL-TAC / 1 and 2 by In-viIn-vi tro-Kultürtro-Kultür
Jeweils 2 χ 10G Zellen der auf flüssigem Stickstoff gelagerten Hybridome werden aufgetaut und nach zweimaliger Waschung in jeweils 4 ml .RPMI 1640 - Zellkulturmedium mit 10 % fetalem Kälberserum aufgenommen. Von jedem werden vier separate 1 ml Kulturen in Gewebekulturplatten aus Polystyren angelegt.In each case 2 × 10 G cells of the hybridomas stored on liquid nitrogen are thawed and, after washing twice, taken up in 4 ml of .RPMI 1640 cell culture medium containing 10% fetal calf serum. Each is made up of four separate 1 ml cultures in polystyrene tissue culture plates.
1010
Nach Vermehrung der Zellen werden davon eukzeeeiv 5 ml - , ml - und 50 ml - Kulturen In Qewebekulturflaschen angelegt.After proliferation of the cells, 5 ml, 50 ml, and 50 ml cultures thereof are cultivated in culture bottles.
Die zellfreien KulturOberstände enthalten den jeweiligen monoklonal en Antikörper BL-TAC/1 oder BL-TAC/2. Die monoklonalen Antikörper können nach einem üblichen Verfahren isoliert oder angereichert werden.The cell-free culture supernatants contain the respective monoclonal antibody BL-TAC / 1 or BL-TAC / 2. The monoclonal antibodies can be isolated or enriched by a conventional method.
27247f27247f
11 Tabelle 111 Table 1
Reaktionsmuster der monoklonalen Antikörper BL-TAC/1 und 2 mit humanen Blutzellen, aktivierten Zellen und Zellen aus lymphoiden OrganenReaction pattern of monoclonal antibodies BL-TAC / 1 and 2 with human blood cells, activated cells and cells from lymphoid organs
2elltyp Markierte Zellen C%]2elltyp labeled cells C%]
BlndungsmuBter der monoklonalen Antikörper BL-TAC/1 und 2 mit permanent wacheenden humanen Zell-LinienBlendungsmuBter the monoclonal antibodies BL-TAC / 1 and 2 with permanent awake human cell lines
Zeil-Linie Reaktion mit den ZellenZeil line reaction with the cells
T-ZeIlen:T-lines:
CEMCEM
MOLT-3MOLT-3
MOLT-4MOLT-4
JURKATJURKAT
HSB-2HSB-2
SKW-3SKW-3
HUT-102HUT-102
T-Zellklone <IL-2 abhängig) AK-15T cell clones <IL-2 dependent) AK-15
KT-2KT-2
B-ZeIlen:B-lines:
REHDEER
RAJI IM-09RAJI IM-09
/ GM-607/ GM-607
HMy-2HMY-2
Myeloide Linie: U-937Myeloid line: U-937
Erythroide Linie: K-562Erythroid line: K-562
Nachweis durch indirekte Immunfluoreszenz +++; 100 % stark markiert ++, 100 % schwach markiert +; < 100 > 25 % +/-; < 25 '/. -; unmarkiertDetection by indirect immunofluorescence +++; 100% strongly marked ++, 100% weakly marked +; <100> 25% +/-; <25 '/. -; unmarked
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Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DD31669788A DD272471A1 (en) | 1988-06-13 | 1988-06-13 | PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST THE IL-2 RECEPTOR OF HUMAN T-LYMPHOCYTES |
Applications Claiming Priority (1)
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| DD31669788A DD272471A1 (en) | 1988-06-13 | 1988-06-13 | PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST THE IL-2 RECEPTOR OF HUMAN T-LYMPHOCYTES |
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| DD272471A1 true DD272471A1 (en) | 1989-10-11 |
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ID=5599979
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| DD31669788A DD272471A1 (en) | 1988-06-13 | 1988-06-13 | PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST THE IL-2 RECEPTOR OF HUMAN T-LYMPHOCYTES |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8182812B2 (en) | 2002-11-15 | 2012-05-22 | Genmab A/S | Human monoclonal antibodies against CD25 |
-
1988
- 1988-06-13 DD DD31669788A patent/DD272471A1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8182812B2 (en) | 2002-11-15 | 2012-05-22 | Genmab A/S | Human monoclonal antibodies against CD25 |
| US8961968B2 (en) | 2002-11-15 | 2015-02-24 | Genmab A/S | Human monoclonal antibodies against CD25 |
| US9598493B2 (en) | 2002-11-15 | 2017-03-21 | Genmab A/S | Human monoclonal antibodies against CD25 |
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