DE69633717T2

DE69633717T2 - Monoklonale anti-cd6 antikörper zur behandlung und diagnose von psoriasis

Info

Publication number: DE69633717T2
Application number: DE69633717T
Authority: DE
Inventors: Jose Enrique La Lisa MONTERO CASIMIRO; Josefa 10 de Octubre LOMBARDERO VALLADARES; Rolando 10 de Octubre PEREZ RODRIGUEZ; Patricia Sierra Blazquez; Blanca Rosa La Lisa TORMO BRAVO
Original assignee: Centro de Immunologia Molecular
Current assignee: Centro de Immunologia Molecular
Priority date: 1995-11-17
Filing date: 1996-11-18
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2016-11-19
Also published as: CN1175957A; EP0807125B1; WO1997019111A2; AU7690596A; PT807125E; US6572857B1; AU722882B2; DK0807125T3; ES2231826T3; EP0807125A2; WO1997019111A3; BR9607171A; JPH11506017A; JP4113929B2; MX9705445A; ATE280783T1; CN1222540C; CU22584A1; KR19980701502A; BRPI9607171B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Immunologie und insbesondere die Gewinnung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen monoklonalen Antikörper enthält, der das Leukocytendifferenzierungs-Antigen CD6 erkennt.
Beschreibung des einschlägigen Standes der Technik
Monoklonale Antikörper (mAb) haben die Kennzeichnung von Molekülen mit physiologischer Bedeutung ermöglicht, die auf der Zelloberfläche ausgeprägt werden. In den Zellen des Immunsystems sind die "Leukocytendifferenzierungs-Cluster" oder -Antigene (CD) definiert worden (Scholossman, S. F. et al. (1994) Immunol. Today 15 (3): 98). Die Definition der Rolle der CD bei der Differenzierung und Reifung der Lymphoidzellen während ihrer ontogenen Entwicklung, bei den Mechanismen der Zellerkennung und -adhäsion und bei den Mechanismen der Aktivierung und Proliferation während der Immunreaktion wurden mit vielversprechenden Ergebnissen für die Verwendung ihrer entsprechenden mAb bei der Diagnose und Immuntherapie durchgeführt (Dantal, J. et al. (1991) Curr. Opin. Immunol. 3: 740).
Die mAb der Maus, die sich gegen Moleküle richten, die auf der Zellmembran von Human-T-Lymphocyten ausgeprägt worden sind, haben dazu beigetragen, die Diagnose klinischer Krankheitsbilder zu verbessern, bei denen es eine Fehlfunktion dieser Zellen gibt. Außerdem wurden sie verwendet, um neue therapeutische Methoden mit dem Zweck der Anpassung ihrer funktionellen Aktivität zu erforschen – wie in den Fällen einer Transplantatabstoßung, einer "Transplantat-contra-Wirt"-Erkrankung (GvHD) und von Autoimmunerkrankungen (Waldman, T. A. (1991) Science 252: 1657; Waldman, T. A. (1992) Annu. Rev. Immunol. 10: 675).
CD6 ist ein noch nicht ausreichend charakterisiertes Molekül. Es ist bekannt, daß es ein Glycoprotein ist, das in zwei Molekülformen existiert, die in einem dynamischen Gleichgewicht gehalten werden und sich nur durch den Phosphorylierungsgrad unterscheiden. In den ruhenden T-Lymphocyten ist es ein phosphoryliertes Molekül mit 105 kDa, wohingegen es in den aktivierten Zellen eine hyperphosphorylierte Form mit 130 kDa (Cárdenas, L. et al. (1990) J. Immunol. 145: 1450; Swack, J. A. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 7137), ein Mitglied einer Gruppe von Membranrezeptoren und Sekretionsproteinen mit einer charakteristischen Struktur ist (Kodama, T. et al. (1990) Nature 343: 531: Aruffo, A. et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 949). Es wird auf der Oberfläche von reifen Human-Thymocyten, in T-Lymphocyten von peripherem Blut, wobei es den größten Teil der Zellpopulation CD3+ bildet, in einer Unterart von B-Lymphocyten und in den Neuronen der Hirnrinde ausgeprägt. In den T-Lymphocyten des peripheren Bluts nimmt es an den Mechanismen der Zellaktivierung teil (Reinhertz, E. L. et al. (1982) Cell 30: 735; Kamoun, M. et al. (1981) J. Immunol. 127: 987; Mayer, B. et al. (1390) J. Neuroimmunol. 29: 193; Rasmussen, R. A. et al. (1994) J: Immunol. 152: 527).
Die Rolle des Moleküls CD6 bei der Ontogenese der T-Zellen sowie auch seine mögliche Rolle bei der Physiopathologie von Erkrankungen mit unterschiedlicher Ätiologie ist unbekannt.
Kürzlich wurde ein CD6-Ligand identifiziert und charakterisiert, der in normalen Geweben, wie Thymus, Milz, Lymphknoten und Haut, eine extensive zelluläre Verteilung aufweist (Dhavalkumar, D. P. et al. (1995) J. Exp. Med. 181: 1563). Dieses Molekül, das aufgrund seiner Expression in aktivierten T- und B-Lymphocyten als auch Monocyten als ALCAM (aktiviertes Leukocyten-Zell-Adhäsionsmolekül) bezeichnet wird, ist ein Membranglycoprotein vom Typ I mit einem Molekulargewicht von 100 kDa mit fünf extrazellulären Domänen, die denen von Immunglobulinen ähnlich sind. Es kann unterschiedliche Aktivierungswerte zeigen, wobei dies von zweiwertigen Kationen abhängt, und kann heterophile und homophile Wechselwirkungen vermitteln (Bowen, M. A. et al. (1995) J. Exp. Med. 181: 2213).
In der klinischen Forschung wurden verschiedene Anti-CD6 mAb für die Verhinderung einer Abstoßungskrise bei der Organtransplantation (Kirkman, R. L. et al. (1983) Transplantation 36: 620) und für die Verringerung von Lymphocyten bei Knochenmarktransplantaten verwendet, um eine "Transplantat-contra-Wirt"-Erkrankung (GvHD) zu verhindern (Soiffer, R. J. et al. (1992) J. Clin. Oncol. 10: 1191). Der ior t1 mAb befindet sich in einem Klinikversuch in der Phase II zur Behandlung von T-Zell-Lymphomen der Haut (Garcia, C. A. et al. (1990) Biotecnologia Aplicada 7(2): 176; Faxas, M. E. et al. (1993), Biotecnologia Aplicada 10(1): 20).
Der monoklonale Antikörper ior t1 vom IgG2a-Isotyp wurde beim IV. International Workshop of Leukocyte Differentiation Antigens, Wien (1989) als Anti-CD6 klassifiziert. Dieser mAb definiert ein Epitop, das sich von denen unterscheidet, die von anderen Anti-CD6 mAb erkannt werden. Das Epitop weist eine stabile Konformation auf und ist gegenüber Reduktionsmitteln unempfindlich, wobei es sich möglicherweise in der primären Struktur des Moleküls CD6 befindet (Osorio, L. M. et al. (1994) Cell Immunol. 154: 123).
Bei diesem monoklonale Antikörper ist die Erkennung in peripheren einkernigen Zellen gesunder Spender schwächer als bei anderen CD6 mAb. Dieses Erkennungsmuster von ior t1 mAb in Human-Zellkulturlinien, die von T-Lymphocyten stammen, beträgt in Jurkat-Zellen 47%, in Molt-4-Zellen 23% und bei CCRF-CEM-Zellen keine Erkennung; bei von B-Lymphocyten stammenden in Raji 9%, bei von Erythroblasten stammenden in K-562 12% und bei von Myelomonocyten stammenden in U-937 9%. Er erkennt auch periphere einkernige Zellen der chronischen B-Lymphocyten-Leukämie (89 ± 4%) (Garcia C. A. et al. 1992) Biotecnologia Aplicada 9(1): 70) und Lymphocyten von Hautschäden bei Patienten mit T-Zell-Lymphomen der Haut (Rodriguez, T. et al. (1985) Interferón y Biotec. 2(1): 41).
Der ior t1 mAb hemmt die Antigen-spezifische Zellzytotoxizität in vitro nicht (Faxas, M. E. et al. (1993) Biotecnologia Aplicada 10(1): 47). Er kann T-Lymphocyten im peripheren Blut von gesunden Spendern in vitro aktivieren. Bei Konzentrationen von OKT3 (Anti-CD3) unter dem Optimum ruft die Vernetzung mit ior t1 stärkere Reaktionen als die hervor, die mit anderen Anti-CD6 mAb erreicht werden (Osorio, L. M. Et al. (1994) Cell Immunol. 154: 123). Garcia et al., J. Cell. Biochem., Suppl., Bd. 0(18), Teil D, 1994, S. 106 beschreiben einen Klinikversuch in der Phase I, der den ior t1 mAb bei Patienten mit T-Zell-Lymphomen benutzt. Es wird offenbart, daß 40 der Patienten nach einer 20-tätigen Behandlung Human-Anti-Maus-Antikörper entwickelten.
Limonta et al., Immunotechnology 1(2), August 1995, 107–113 beschreiben eine chimäre Version des ior-t1 mAb der Maus und deren Expression in der Milch von transgenen Mäusen.
Psoriasis ist eine Erkrankung, deren Physiopathologie noch nicht definiert worden ist (Hunziker, T. et al. (1993) Ther. Umsch. 50(2): 110; Elder, J. T. et al. (1994) J. Invest. Dermatol. 102(6): 24S). Sie ist dadurch gekennzeichnet, daß im Zielorgan ein eine Entzündung betreffendes Infiltrat mit vorherrschenden aktivierten T-Lymphocyten der Phenotypen CD4+ und CD8+ (Chang, J. C. C. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9282) sowie auch eine starke Oligoklonalität der T-Zellrezeptoren präsentiert wird, wobei die Zellen anscheinend eine deutliche Neigung zeigen, zur Haut zu wandern (Einnisten) (Baker, J. N. W. N. et al. (1992) Br. J. Dermatol. 127: 205; Menssen, A. et al. (1995) J. Immunol. 155: 4078; Valdimarsson, H. et al. (1995) Immunol. Today 16(3): 145).
Die spontane Remission von Psoriasis kann vorhergesagt werden, wenn die Anzahl der T-Zellen in der Haut abnimmt. Somit wird vermutet, daß sie bei der Fortdauer der Erkrankung eine wichtige Rolle spielen, indem sie lösliche Mediatoren der Immunreaktion freisetzen, die die Proliferation von Keratinocyten einleiten können, die für klinische Manifestationen der Erkrankung verantwortlich sind (Griffiths und Voorhees, J. Royal Soc. Med. 89, 1996, 315–319).
Diese Ansichten werden von Tatsachen gestützt, wie dem Heilen oder der Erkrankung nach einer allogenen Knochenmarkstransplantation, der möglichen HLA-Assoziation, der Besserung, mit Steroiden und insbesondere mit Immunsupressoren, wie Cyclosporin, und der klinischen Besserung, obwohl reversibel, mit therapeutischen monoklonalen Antikörpern für T-Zellen (Griffiths, C. E. M. et al. (1992) Springer Semin Immunopathol. 13: 441; Nanney, L. B. et al. (1986) J. Invest. Dermatol. 86(3): 260; Picassia, D. D. et al. (1987) J. Am. Acad. Dermatol 17)3: 408; Schopf, R. E. et al. (1986) Arch. Dermatol. Res. 279(2): 89; van de Kerkhof, P. C. et al. (1987) Dermatologica 174(5): 224).
Der Erfolg der Immuntherapie mit monoklonalen Antikörpern hängt von der Auswahl des Zielmoleküls ab, das an wichtigen Zellfunktionen oder der Auswahl des mAb teilnehmen sollte (Dantal, J. et al. (1991) urr. Opin. Immunol. 3: 740). Die bei Psoriasis ausgewerteten mAb, die sich gegen CD3 (Weinshenker, B. G. et al. (1989) J. Am. Acad. Permatol. 20: 1132) und gegen CD4 richteten (Poizot-Martin, I. et al. (1991) Lancet 337: 1477; Prinz J. et al. (1991) Lancet 338: 320; Nicolas, J. F. et al. (1991) Lancet 338: 321), haben bei Patienten nach mehreren endovenösen Anwendungen in hoher Dosis eine klinische Besserung erreicht, in allen Fällen mit teilweisen Remissionen von kurzer Dauer und einem frühen Wiederauftreten der Symptome und Anzeichen der Erkrankung.
Die therapeutische Anwendung von mAb der Maus in mehreren Dosen ist mit einigen Nebenwirkungen und einer begrenzten klinischen Verwendbarkeit bei den Patienten verbunden, diese stehen mit der Xenogenizität von Proteinen der Maus in Zusammenhang, die eine Human-Anti-Maus-Antikörperreaktion (HAMA) hervorrufen; humanisierte Antikörper, die durch Konstruktion von Proteinen erzeugt wurden, haben eine geringere Immunogenität, eine verbesserte Pharmakokinetik und einen klinischen Vorteil (Winter, G. et al. (1993) Trends-Pharmacol-Sci. 14(5): 139).
Bis heute wurde weder von einer früheren Untersuchung, die die Expression des Moleküls CD6 in T-Lymphocyten des eine Entzündung betreffenden Infiltrats der Haut bei Psoriasis beschreibt, noch von der möglichen Verbindung dieses Moleküls mit der Ausbildung der Erkrankung berichtet. Außerdem ist die therapeutische Verwendung eines Anti-CD6 mAb bei dieser Erkrankung bisher nicht ausgewertet worden.
Die Neuheit der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von topischen und systemischen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die einen monoklonalen Antikörper für CD6 enthalten, und der Gewinnung eines humanisierten monoklonalen Antikörpers für CD6 für dessen Verwendung bei Patienten mit Psoriasis vulgaris unter Anwendung unterschiedlicher Verabreichungswege und bei unterschiedlichen klinischen Formen der Erkrankung.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen angegebenen Gegenstand.
ERHALT DES MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS
Reinigen des monoklonalen Antikörpers der Maus
Der monoklonale Antikörper für CD6 (mAb) kann durch Protein A-Sepharose, verdünnt mit dem gleichen Volumen eines Glycin-Puffers, 1,5 m, 3 m NaCl, pH = 8,9, aus dem Bauchwasser gereinigt werden, wobei die Matrix mit dem gleichen Puffer ausgeglichen wird. Unter Anwendung gleicher Volumina von Bauchwasser und Puffer sollte die Elution bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 50 ml/h erfolgen. Die Säule wird über Nacht mit dem gleichen Anwendungspuffer bis zur Grundlinie Null gewaschen.
Danach wird die Säule mit Zitronensäure-Puffer, 0,1 m, pH = 6, um die Immunglobuline IgG1 zu eliminieren, mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 50 ml/h (2 bis 5 Volumina der Säule, etwa 2 Stunden) gewaschen, bis die Grundlinie Null erreicht. Der Zitronensäure-Puffer, 0,1 m, pH = 5, wird verwendet, um die Immunglobuline IgG2a zu eluieren (ior t1).
Humanisieren des monoklonalen Antikörpers der Maus
Mit gentechnischen Verfahren können Varianten der Anti-CD6-mAb der Maus, wie chimäre und humanisierte Antikörper, aus den variablen Regionen der leichten und schweren Ketten des Antikörpers der Maus konstruiert werden (Takashi, N. et al. (1982) Cell 29: 718; Hieter, P. A. et al. (1980) Cell 29: 718).
Beschreibung des Humanisierungsverfahrens des monoklonalen Antikörpers der Maus ior t1
Ein Subklon ior t1A wurde aus den parenteralen, ior t1 ausscheidenden Hybridomzellen der Maus erhalten, der das gleiche Epitop auf dem Molekül CD6 erkennt.
ior t1A wurde nach einem Verfahren modifiziert, wie es in EP 0 699 755 A2 beschrieben ist, um dessen Immunogenität zu verringern. Das verringert gleichzeitig die Immunogenität monoklonaler Antikörper von Nagern, wobei dessen Ligandenbindendungseigenschaften gänzlich erhalten bleiben. Da die Antigenität eines Immunglobulins vom Vorhandensein von für T-Zellen antigenen Peptiden in deren Sequenz abhängt, kann die Immunogenität eines xenogenen oder allogenen Antikörpers verringert werden, wenn die in den für T-Zellen antigenen Sequenzen enthaltenen Reste ersetzt werden, die sich von denen unterscheiden, die gewöhnlich in anderen Antikörpern von Säugerspezies vorkommen. Der Austausch von Resten schließt natürlich jene nicht ein, die an den kanonischen Strukturen oder der Vernier- Zone beteiligt sind. Dieser wohlüberlegte Austausch von Resten hat keinen Einfluß auf die Strukturdeterminanten oder auf die Kontakte zwischen den Domänen, folglich sollten die Ligandenbindungseigenschaften nicht durch Änderungen beeinflußt werden, die auf Framework-Reste der variablen Region begrenzt sind.
Analyse der Homologie der variablen Regionen
Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt die verfügbaren Sequenzdaten für die variablen Domänen eines Human-Antikörpers aus, die von Kabat et al., "Sequences of proteins of Immunological Interest" 5. Aufl., Bethesda, Maryland; National Inst. of Health, 1994 zusammengestellt worden sind.
Im ersten Schritt werden die variablen Domänen der schweren oder leichten Kette von ior t1 der Maus mit den entsprechenden variablen Domänen der Human-Sequenzen verglichen.
Der Vergleich erfolgt nach einem automatisierten-computergesteuerten Verfahren (PC-DOS HIBIO PROSIS 06-00, Hitachi). Die variablen Human-Regionen mit der stärksten Homologie werden dann Rest für Rest mit den entsprechenden Regionen der Maus verglichen. Dies definiert auch die Human-Untergruppe, der jede Sequenz der Maus am meisten ähnelt.
– Vorhersage der T-Epitope
Im zweiten Schritt werden die beiden homologen Sequenzen der variablen Region, Maus und Human, für die Vorhersage von T-antigenen Sequenzen analysiert.
Der Algorithmus AMPHI (Bersofsky et al., (1987) J. Immunol. 138: 2213) sagt eine helikale Sequenz vorher. Der Algorithmus SOHHA sagt den Streifen der Helixhydrophobie vorher (Elliott et al., (1987), J. Immunol. 138: 2949). Diese Algorithmen sagen die T-Zellen präsentierenden Fragmente von antigenen Proteinen vorher.
– Analyse zur Verminderung der Immunogenität
Jene Reste im Framework der Maus, die sich von ihrem Human-Gegenstück unterscheiden, werden durch die im Human-Gegenstück vorhandenen Reste ersetzt. Dieses Switching erfolgt nur bei den Resten, die an den T-antigenen Sequenzen vorliegen.
Schließlich kann der Ersatz jener Reste, die für die kanonischen Strukturen verantwortlich sind, oder jener, die an der Vernier-Zone beteiligt sind, einen signifikanten Einfluß auf die Tertiärstruktur haben. Folglich können sie nicht am Austausch beteiligt sein. Eine weitere Information über den Einfluß des vorgeschlagenen Austauschs auf die Tertiärstruktur oder den Bindungsort kann aus einem Molekülmodell der variablen Regionen gewonnen werden.
– Verfahren zum Konstruieren und zur Expression des geänderten Antikörpers
Die folgenden Verfahren dienen der Herstellung rekombinanter DNA-Sequenzen, die das Komplement bestimmende Regionen (CDR) des mAb der Maus, sowohl leichte als auch schwere Ketten, in Human-Frameworks (FR) einführen, die zur Transfektion von Mammaliazellen für die Expression eines weniger immunogenen rekombinanten Antikörpers und mit der Antigenspezifität des monoklonalen Antikörpers des Tiers verwendet werden können:

a) Mutagenese und Zusammenstellung von Domänen der variablen Region, einschließlich der Regionen CDR und FR. Das PCR-Mutageneseverfahren (Kamman et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17: 5404) dient vorzugsweise der Einführung dieser Änderungen an unterschiedlichen Positionen.
b) Herstellung eines Expressionsvektors, der eine variable Region und die entsprechende konstante Human-Region einschließt, die nach der Transfektion in Zellen zur Ausscheidung eines Proteins führt, das für Bestimmungen der Affinität und Spezifität ausreicht.
c) Die Cotransfektion von Expressionsvektoren der schweren und der leichten Kette in geeignete Zellinien.

Nach etwa 2 Wochen werden die Überstände der Zellen durch ELISA auf die Erzeugung von Human-IgG analysiert. Die Proben werden dann nach irgendeinem Verfahren auf Human-IgG analysiert, das bestimmte Antigene binden kann.
Formulierung für die Durchführung von diagnostischen Untersuchungen in vitro und in vivo
Die Anti-CD6 mAb können für diagnostische Zwecke in vitro und in vivo bei unterschiedlichen klinischen Formen von Psoriasis, für die Überwachung von Patienten nach topischen oder systemischen Behandlungen, sowie auch für die Vorhersage von Rückfällen verwendet werden.
Diese mAb, gereinigt und in Pufferlösung gelöst (pH = 7,0 ± 0,5), die Natriumazid (0,01 bis 0,2%) und Rinderserumalbumin (0,05 bis 0,2%) enthält, können verwendet werden, um die CD6+ T-Lymphocyten und/oder die Expression dieses Moleküls auf der Oberfläche von Lymphoidzellen in biologischen Fluiden mengenmäßig zu erfassen (das heißt Blut, Kephaloaquidium-Flüssigkeit, Synovia-Flüssigkeit), wobei 50 bis 200 ml der Probe 20 bis 30 Minuten bei 4°C in Konzentrationen von 0,1 und 3 mg/ml mit 10 bis 30 ml des mAb inkubiert werden. Darauf folgen das Waschen mit Pufferlösung und das Inkubieren mit Immunglobulinen einer anderen Tierspezies, die mit fluoreszierenden Substanzen (das heißt Fluorescein, Phycoerythrin) konjugiert sind. Die Anti-CD6 mAb können nach unterschiedlichen Verfahren direkt mit fluoreszierenden Substanzen konjugiert werden (Coligan, J. E. et al. (Herausgeber) Current Protocols in Immunology, National Institutes of Health. Bd. I: 5.3.2. Wiley Interscience) und in Konzentrationen von 5 bis 30 mg/ml zu ähnlichen Zwecken verwendet werden, wie sie bereits beschrieben worden sind.
Immunhistochemie-Auswertung der Schädigungen von Patienten mit Psoriasis
Die immunhistochemische Untersuchung von Hautschäden oder anderen angegriffenen Geweben (das heißt Gelenke) von Patienten mit Psoriasis vulgaris können bei Kryostat-Gewebeschnitten (das heißt der Haut) durchgeführt werden, die in kaltem Aceton fixiert sind oder auch nicht, wobei der Anti-CD6 mAb für 30 Minuten inkubiert wird, der in 3 bis 10 mg/ml Pufferlösung (pH = 7,0 ± 0,5) gelöst ist, die Natriumazid (0,05 bis 0,2%) und Rinderserumalbumin (0,05 bis 0,2%) enthält. Es folgt ein 30-minütiges Inkubieren dieser Gewebeschnitte bei Raumtemperatur mit biotinylierten Anti-Maus-Immunglobulinen (das heißt vom Schaf, DAKO) und einem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (das heißt DAKO). Schließlich wird die Reaktion hervorgerufen, wobei 3-Amino-9-ethylcarbazol (Sigma) als Chromogen verwendet wird (Hsu, S. M. et al. (1981) J. Histochem. Cytochem. 29: 577). Die Biopsie muß von zwei Spezialisten geprüft werden, und die Auswertung der CD6 wird auf einer Skala mit den Punkten < 10% (+/–), 10 bis 25% (+), 25 bis 50% (++), 50 bis 90% (+++), 90 bis 100% (++++) eingeordnet.
Es können unterschiedliche Antikörper für die CD der T-Lymphocyten verwendet werden, Anti-CD3 (ior t3), Anti-CD4 (ior t4), Anti-CD8 (ior t8) und ein Anti-CD45 (ior L3), sowie auch ein mAb für den Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors (ior egf/r3) als Marker der Aktivierung von Keratinocyten (Mozzanica, N. et al. (1994) Acta Derm. Venereol. Suppl. Stockh. 186: 171), was im Verlauf der Behandlung der Erkrankung eine Auswertung von Einzelheiten der Eigenschaften des eine Entzündung betreffenden Infiltrats bei Schädigungen ermöglicht.
Immunhistochemie-Überwachung der Schädigungen von behandelten Patienten
Bei mit den monoklonalen Antikörpern für CD6 behandelte Patienten können Biopsien der Schädigungen vorliegen, die bereits vor Beginn der Behandlung, im Verlauf der Behandlung und nach Abschluß der Behandlung immer in dem Bereich durchgeführt wurden, der der ersten Biopsie am nächsten ist, um die therapeutische Wirksamkeit der Zusammensetzungen bei einer topischen oder systemischen Anwendung auszuwerten. Die Skala zur Klassifizierung der Reaktion auf die Behandlung kann qualitativ in Prozent sein und wird durch den Index der CD6⁺-Zellen gegenüber den gesamten CD45⁺-Zellen angegeben, die bei jeder Biopsie ausgewertet werden.
Der Index der CD3⁺-Zellen, der CD4⁺-Zellen und der CD8⁺-Zellen gegenüber den gesamten CD45⁺-Zellen und der Index der CD4+ und CD8+ gegenüber den gesamten CD6⁺-Zellen können ebenfalls erstellt werden.
Immunszintigraphie-Überwachung der behandelten Patienten
Eine andere Form der Auswertung des Effektes der Behandlung mit dem Anti-CD6 mAb kann die Immunszintigraphie-Untersuchung der Ausprägung und Verteilung der CD6+-Zellen beim Patienten im Verlauf der Behandlung sein, wobei 1 bis 5 mg des gleichen mAb verwendet werden, der mit radioaktiven Isotopen, wie 99 m Technetium konjugiert ist, wobei ein Konjugationsverfahren angewendet wird, das dem bei Mathers, S. J. et al. (1990) J. Nucl. Med. 31(5): 692 beschriebenen ähnlich ist.
Erhalt von therapeutischen Formulierungen für die topische und systemische Anwendung
Die Anti-CD6 mAb können entsprechend der Schwere der Erkrankung für therapeutische Zwecke bei unterschiedlichen klinischen Formen von Psoriasis, sowohl mit topischen als auch systemischen Formulierungen, in einer einzigen oder in mehreren Dosen in einem oder verschiedenen Behandlungszyklen verwendet werden.
Die topischen therapeutischen Formulierungen mit dem Anti-CD6 mAb können aus halbfesten Systemen in einer oder zwei Phasen bestehen, hauptsächlich bei hydrophilen Formulierungen, die die Einführung des mAb ermöglichen, der in Dosen von 0,1 bis 5 mg auf jedes Gramm des Produktes in einer sterilen Pufferlösung (pH = 7,0 ± 0,5) gelöst ist. Die Formulierungen können als Gele, Gelee, Salbe, Lotionen und Cremes mit einer flüssigen Matrix (das heißt Wasser) aufbereitet werden, mit Gelatine, Carboxymethylcellulose oder ähnlichen Substanzen und Basen, die Glycerin, Calcium, enthalten, formuliert werden; außerdem können die Zusammensetzungen Konservierungsmittel (das heißt p-Hydroxybenzoat) enthalten, um eine Verschmutzung zu vermeiden. Der pH-Wert muß physiologisch sein, so daß die Eigenschaften des mAb nicht beeinflußt werden. Diese therapeutischen Zusammensetzungen sollten das Freisetzen und das mögliche Eindringen des mAb in die Haut erlauben.
Die topische Behandlung sollte zwischen einmal und dreimal am Tag auf den Schädigungen, die bedeckt werden oder auch nicht, erfolgen und kann mit einer systemischen Anwendung (hauptsächlich endovenös) des gleichen mAb in Dosen von 0,1 bis 1 mg/kg Körpergewicht des Patienten kombiniert werden: Er sollte für die endovenöse Anwendung in einer physiologischen Lösung verdünnt und langsam verabreicht werden. Die endovenöse Behandlung kann unabhängig von der topischen Verabreichung erfolgen.
Klinische Nachuntersuchung der behandelten Patienten
Die klinische Auswertung der Schädigungen kann als Hauptkriterium für die Auswertung der therapeutischen Wirksamkeit dienen.
Die wichtigsten Variablen der Reaktionen, die für die Messung der Effekte der Behandlung verwendet wurden, können die Verbesserung der klinischen Merkmale der Schädigungen (Infiltration, Schuppen, Rötung) und eine Verringerung der Fläche der Schädigungen sein.
Der Schweregrad der Anzeichen der Krankheit (Infiltration, Schuppen und Rötung) kann zwischen den Werten 0–1–2 festgelegt werden.
0 – keine Anzeichen.
1 – kaum vorhanden.
2 – intensives Vorhandensein.
Es sollte auch die Ausdehnung der behandelten Schuppen in Betracht gezogen werden, wobei bei Zweien der Durchmesser gemessen und der Bereich der Schädigung berechnet wird, indem das Produkt der Verhältnisse (in Zentimeter) mit p (3,14) multipliziert wird. Die Abmessung der Schuppe zum Zeitpunkt 0 entspricht 100%, und bei den anschließenden Auswertungen wird der Prozentsatz der Abmessung der Schuppe proportional bestimmt.
Die Bewertung der Schwere der Psoriasis (PSS), die dem PASI (Index der Fläche und der Schwere der Psoriasis) ähnlich ist (Fredriksson, T. et al. (1978) Dermatologica 157: 238), wird mit der Formel erhalten:
Die Reaktion auf die Behandlung wird entsprechend der Änderungen der PSS eingeordnet, wenn die Auswertungszeiten abgeschlossen sind, wobei die folgenden Kategorien erstellt wurden (Perkins, W. et al. (1993), Br. J. Dermatol. 129: 584):

- rein (> 90%-ige Verbesserung der PSS)
– auf die Behandlung ansprechende Personen (> 50%-ige Verbesserung der PSS)
– nicht auf die Behandlung ansprechende Personen (< 50%-ige Verbesserung oder Beeinträchtigung der PSS)
– Verschlechterung (> 50%-ige Zunahme der PSS)

Die Auswertungszeiten der Reaktion können bis zu 12 Wochen ab dem Datum des Beginns der Anwendung der Behandlung angenommen werden (Vorbehandlung, Wochen 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12).
BEISPIEL 1: DNA-Sequenzanalyse der variablen Region des monoklonalen Antikörpersi t1A der Maus
RNA des Cytoplasmas wurde aus etwa 10⁶ ior t1A-Hybridomzellen extrahiert, wie es bei Faloro et al. beschrieben ist (Faloro, J. et al. (1989) Methods in Enzimology 65: 718).
Die cDNA-Synthesereaktion bestand aus 5 μg RNA, 50 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 75 mM KCl, 10 mM DTT, 3 mM MgCl₂, 25 pMol des Primers CG2AFOR
(5' GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG 3') für die variable Region der schweren Kette (VH) oder CK2FOR
(5' GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC 3') für die variable Region der leichten Kette (VK), jeweils 250 μM von dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 15 u Ribonuclease-Inhibitor (RNA-Guard, Pharmacia) in einem Gesamtvolumen von 50 μl.
Die Proben wurden 10 Minuten bei 70°C erhitzt und innerhalb eines Zeitraums von 30 Minuten langsam auf 37°C abgekühlt. Dann wurden 100 Einheiten MMLV-Umkehrtranskriptase (BRL) zugesetzt, und das Inkubieren bei 37°C wurde für 1 Stunde fortgesetzt.
Die cDNA der VH und VK wurden unter Anwendung der PCR amplifiziert, wie es bei Orlandi et al. (Orlandi, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833–3837, (1989)) beschrieben ist. Für die PCR-Amplifikation der VH bestanden die DNA/Primer-Gemische aus 5 μl cDNA, 25 pMol der Primer CG2AFOR
(5' GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG 3') und VH1BACK
(5' AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG 3').
Für die PCR-Amplifizierung von VK bestanden die DNA/Primer-Gemische aus 5 μl cDNA, 25 pMol der Primer CK2FOR
(5' GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC 3') und VK10BACK
(5' TTGAATTCCAGTGATGTTTTGATGACCCA 3').
Diesen Gemischen wurden jeweils 2,5 mM dATP, dCTP, dTTP und dGTP, 5 μl Bestandteile des 10 × Puffers Thermolase und 1 Einheit Thermolase (IBI) in einem Endvolumen von 50 μl zugesetzt. Die Proben wurden 25 Wärmezyklen mit 94°C, 30 s; 50°C, 30 s; 72°C, 1 min und einem letzten Inkubieren für 5 Minuten bei 72°C unterzogen. Die amplifizierten DNA der VH und VK wurden mit einem Reinigungs-Kit Prep. A. Gene (BioRad) gereinigt.
Die gereinigten DNA der VH und VK wurden in den Vektor M13 geklont. Die Sequenz der Klone wurde nach dem Didesoxy-Verfahren analysiert, wobei T7 DNA Pol (Pharmacia) verwendet wurde. Siehe 1 und 2.
BEISPIEL 2: Modifizierung der Sequenzen der variablen Domäne des monoklonalen Antikörpers ior t1A der Maus, um die vorhergesagten antigenen Sequenzen für T-Zellen zu humanisieren
Die Sequenzen der variablen Region der schweren und leichten Ketten von ior t1A wurden auf die antigenen Sequenzen für T-Zellen analysiert. Das erfolgte unter Anwendung des Computer-Algorithmus AMPHI, der Segmente der Sequenzen mit einer Länge von 11 Aminosäuren mit einer amphipatischen Helixstruktur vorhersagt, die eine hydrophobe Seite und eine hydrophile Seite haben, die sich mit den MHC II-Molekülen binden kann.
Für die Sequenz der variablen Domäne der schweren Kette wurden drei Segmente vorhergesagt, die wie folgt sind (es wird die Numerierung gemäß Kabat angewendet).

1. FR1 zwischen den Aminosäuren 2–21.
2. CDR1 und FR2 zwischen den Aminosäuren 29–43.
3. CDR3 und FR4 zwischen den Aminosäuren 95–111.

1 zeigt die Sequenzen, die der schweren Kette entsprechen.
Diese Sequenz der Maus wird mit den Immunglobulinsequenzen verglichen, die in der GeneBank und der EMBL-Datenbank enthalten sind. Die Human-Sequenz der variablen Region mit der stärksten Homologie wird bestimmt, und es wird auch die Human-Untergruppe definiert, der die Sequenz der Maus am stärksten ähnelt. In diesem Fall war die festgestellte Human-Sequenz ein IgM, das zur Untergruppe III von Kabat gehört.
Beide Sequenzen der variablen Region, Human und Maus, werden dann Rest für Rest verglichen, und es werden die Reste in FR-Regionen ausgewählt, die nicht an der Vernier-Zone oder den kanonischen Strukturen beteiligt sind. Folglich können sie durch jene Reste in der gleichen Position in der Human-Sequenz ausgetauscht werden. Die Positionen 13 und 19 sind nicht modifiziert, da die Aminosäure Lys in anderen Human-Immunglobulinen in der gleichen Position vorliegt, die zur gleichen Untergruppe gehören.
Für die schwere Kette des ior t1A der Maus wurden vier Auswechslungen vorgeschlagen:

1. THR in der Position 40 durch ALA.
2. GLU in der Position 42 durch GLY.
3. THR in der Position 108 durch LEU.
4. LEU in der Position 109 durch VAL.

Das gleiche Verfahren bei der leichten Kette angewendet (2) ergab einen Satz von überlappenden Segmenten von der Aminosäure 2 bis zur Aminosäure 69.
Nach der Analyse haben wir sieben Auswechslungen in den FR1 und 2 in den Positionen 3, 11, 12, 15, 17, 41 und 43 vorgeschlagen.

1. LYS in der Position 3 durch GLN
2. MET in der Position 11 durch LEU
3. TYR in der Position 12 durch SER
4. LEU in der Position 15 durch VAL
5. GLU in der Position 17 durch ASP
6. TRP in der Position 41 durch GLY
7. SER in der Position 43 durch ALA

BEISPIEL 3: Konstruktion einer mutanten variablen Region der schweren und der leichten Kette von ior t1A durch PCR-Mutagenese
Die Änderungen der Aminosäuren der mutanten variablen Region der schweren und der leichten Kette wurden unter Anwendung der PCR-Mutagenese konstruiert (Kammann, M. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 4220).
Kurz zusammengefaßt: zwei Amplifikationen durch PCR: das Reaktionsgemisch lautete: 0,5 μl der VH einer einsträngigen DNA, in M13 geklont, 25 pMole der mutagenen Primer Oligo 1 oder 2, 25 pMole der mutagenen Primer Oligo 3 oder 4 (die Sequenzen der Primer siehe nachstehend). Diesen Gemischen wurden jeweils 2,5 mM dATP, Dttp, dCTP und dGTP, 5 μl Bestandteile des 10 × Puffers Vent Polymerase (NEB) und 1 Einheit Vent-DNA-Polymerase (NEB) in einem Endvolumen von 50 μl zugesetzt. Die Proben wurden 12 bis 15 Wärmezyklen mit 94°C, 30 s; 50°C, 30 s; 75°C, 1 min und einem letzten 5-minütigen Inkubieren bei 75°C unterzogen. Die Produkte beider PCR werden in einer zweiten PCR vereinigt, wobei nur die äußeren Primer (3 und 4) verwendet wurden. Die amplifizierte VH-DNA wurde mit dem Reinigungs-Kit Prep. A Gene (BioRad) gereinigt.
Für die Auswechslungen in der schweren Kette, FR1 in den Positionen 5, 7, 11, 12 und 13, lauteten die verwendeten Primer:
Diese Primer werden in einer PCR vereinigt.
Diese Primer werden in einer PCR vereinigt. Dann werden die Produkte beider PCR in einer PCR vereinigt, wobei die Primer 3 und 4 verwendet werden.
Für die Auswechslungen in der Position 108 und 109 lauteten die gestalteten Primer wie folgt:
Diese Primer werden in einer PCR vereinigt.
Primer 2
Diese Primer werden in einer PCR vereinigt. Dann werden die Produkte beider PCR in einer PCR vereinigt, wobei die Primer 3 und 4 verwendet werden.
In der leichten Kette wurden die Primer für den Austausch im FR1 in den Resten 3, 11, 12, 15 und 17 im FR1 wie folgt gestaltet:
Diese Primer werden in einer PCR vereinigt.
Diese Primer werden in einer PCR vereinigt.
Die Produkte beider PCR werden in einer PCR vereinigt, wobei die Primer 3 und 4 verwendet werden.
Für Auswechslungen in den Resten 41 und 43 im FR2 lauteten die Primer:
Diese Primer werden in einer PCR vereinigt.
Diese Primer werden in einer PCR vereinigt.
Die Produkte beider PCR werden zu einem vereinigt, wobei die Primer 3 und 4 verwendet werden.
BEISPIEL 4: Pharmazeutische Formulierung für die topische Anwendung bei Hautschäden von Patienten mit Psoriasis vulgaris
Der ior t1 mAb wurde gereinigt und in steriler Pufferlösung (10 ml, pH = 7,0 ± 0,5) gelöst (50,00 mg), die 4,50 mg einwertiges Natriumphosphat, 18,00 mg zweiwertiges Natriumphospat, 86,00 mg Natriumchlorid, 1,852 μl Polysorbat 80, Wasser für die Injektion enthielt. Die den mAb enthaltende Lösung wurde einem Gelgrundstoff zugesetzt.
Das therapeutische Gel wurde mit einer Pufferlösung aufbereitet, die eine Zusammensetzung aufweist, die der für den mAb beschriebenen ähnlich ist (pH = 7,0 ± 0,5).
BEISPIEL 5: Histologische Untersuchung von Hautschäden bei Patienten mit Psoriasis vulgaris
Die immunhistochemische Untersuchung von Hautschäden von Patienten mit Psoriasis vulgaris wurde bei Kryostat-Schnitten von Hautgewebe durchgeführt, wobei der mAb ior t1 parallel mit verschiedenen mAb verwendet wurde, die gegen CD von T-Lymphocyten gerichtet sind. Es wurden die mAb ior t3 (Anti-CD3), ior t4 (Anti-CD4), ior t8 (Anti-CD8), ior L3 (Anti-CD45) und DAKO CD6 (Anti-CD6), als Kontrolle, sowie auch ior egf/r3 (für den Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors) verwendet. Es folgte das Inkubieren der Gewebeschnitte mit biotinylierten Anti-Maus-Immunglobulinen (das heißt vom Schaf, DAKO) und einem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (das heißt DAKO). Die Umsetzung wird schließlich mit 3-Amino-9-ethylcarbazol (Sigma) als Chromogen eingeleitet. Die Biopsien wurden von zwei Spezialisten geprüft, und die Auswertung der CD6 wurde nach der Punkteskala < 10 % (+/–), 10 bis 25% (+), 25 bis 50% (++), 50 bis 90% (+++), 90 bis 100% (++++) eingeordnet.
Bei mit den monoklonalen Antikörpern für CD6 behandelte Patienten gab es Biopsien der Schädigungen, die vorher vor Beginn der Behandlung und am Ende der dritten Behandlungswoche in dem Bereich erfolgt waren, der der ersten Biopsie am nächsten ist. Die Skala für die Klassifizierung der Reaktion auf die Behandlung war qualitativ in Prozent und wurde durch den Index der CD6⁺-Zellen gegenüber den gesamten CD45⁺-Zellen festgesetzt, der bei jeder Biopsie ausgewertet wurde. Es wurden der Prozentsatz der Expression des Anti-Rezeptors für den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF-R) in den unterschiedlichen Hautschichten sowie auch die Modifikationen der histologischen Merkmale bestimmt, die für diese Erkrankung typisch sind.

– Im eine Entzündung betreffenden Infiltrat, das für Psoriasis vulgarisis charakteristisch ist, wurde festgestellt, daß es eine bedeutende Expression (+++) des CD6+ T-Lymphoid-Phenotyps gibt.
– Die CD3⁺-Lymphocyten stellen etwa 100% der CD45⁺-Zellen dar.
– Die CD6⁺-Zellen stellen etwa 60 bis mehr als 90% der CD3⁺-Zellen dar.
– Die CD6⁺-Zellen (ior t1) stellen etwa 30 bis 50% der CD6⁺-Zellen dar (DAKO CD6).
– Die Expression von EGF-R in Keratinocyten war erhöht, wobei sie ein retikuläres Muster zeigte.

Das Vorherrschen der Expression des Moleküls CD6 in T-Lymphocyten des eine Entzündung betreffenden Infiltrats ist ein signifikantes Ergebnis, da es ein Molekül ist, das für aktivierte T-Lymphocyten charakteristisch ist. Dadurch glauben wir, daß dies ein Leukocyten-Adhäsionsmolekül von T-Lymphocyten sein könnte, das durch das Eindringen von exogenen Antigenen oder modifizierten Eigengenen in der Haut zum ersten Mal aktiviert wird. Das ist für die Wechselwirkung mit bestimmten Zelldeterminanten der Haut erforderlich, die während der Reaktion auf diese Antigene aktiviert werden.
BEISPIEL 6: Klinische Reaktion von Patienten mit Psoriasis vulgaris auf die topische Therapie mit ior t1 mAb
Es wurde ein klinischer Versuch bei Patienten mit der Diagnose Psoriasis vulgaris mit einem Rückfall mit einer Schädigung durchgeführt, der für diese Erkrankung charakteristisch ist. Die Untersuchung lief in zwei Gruppen mit 14 Patienten pro Gruppe ab, die entsprechend dem für die topische Behandlung erhaltenen Gel definiert wurde (ior t1 mAb oder Träger). Die topische therapeutische Formulierung entsprach einem Gelgrundstoff oder Träger (Natriumcarboxymethylcellulose V/V, Propylenglycol, Methylparabeno, Triethanolamin), in den mAb eingeführt worden war. Die Behandlung wurde für 21 Tage zweimal am Tag angewendet, ohne daß die behandelten Schädigungen abgedeckt wurden.
Schädigungen in Form eines psoriatischen Plaques wurden bei allen Patienten heller, die mit ior t1 mAb behandelt worden waren (4). Dieses Ergebnis entspricht einer Biopsie nach der Behandlung, die 21 Tage nach Beginn der Anwendung des mAb durchgeführt worden war. Es wurden eine Abnahme des T-Lymphocyten-Infiltrats und der Expression von EGF-R in Keratinocyten sowie auch eine Abnahme der histologischen Anzeichen beobachtet, die für diese Erkrankung charakteristisch sind.
BEISPIEL 7: Klinische Reaktion von Patienten mit Psoriasis vulgaris nach der schrittweisen Verringerung der topischen Behandlung mit dem monoklonalen Antikörper ior t1
Es wurde ein klinischer Pilotversuch mit 19 Patienten mit bestätigter lang andauernder Psoriasis vulgaris durchgeführt, bei denen mehr als 10 und weniger als 25% der Haut betroffen war. Drei unterschiedliche Gruppen mit 6, 7 und 6 Patienten erhielten eine topische therapeutische Formulierung, die 0,3, 1 bzw. 3 mg ior t1 mAb/g Gel in einem Trägergel enthielt, das aus Natriumcarboximethylcellulose A/V, Propylenglycol, Methylparaben, Propylparaben und Triethanolamin bestand. Die Patienten wurden für 21 Tage zweimal am Tag topisch behandelt.
Der PASI (Index der Fläche und der Schwere der Psoriasis) wurde bewertet und analysiert, und es wurde auch die Reaktion auf den Human-Anti-Maus-Antikörper (HAMA) in den Seren der Patienten untersucht. Die besten Ergebnisse bezüglich der klinischen Reaktion (PASI) und den erkrankungsfreien Zeitraum wurden bei der Gruppe erhalten, die mit der geringeren Menge von ior t1 mAb (0,3 mg) behandelt worden war, in dieser Gruppe waren auch die Titer des HAMA (Human-Anti-Maus-Antikörper) und die Menge der Patienten pro Gruppe, die diese ausbildeten, höher. Außerdem war das Vorhandensein von anti-idiotypischen Antikörpern in den Seren von Patienten, die mittels blockierender ELISA (enzymverbundene Immunadsorptionsbestimmung) und FACS (Apparat zur Aufteilung fluoreszierender aktivierender Zellen) untersucht wurden, bei den Patienten häufiger und viel stärker, die mit der geringeren Dosis von 0,3 mg pro Gramm Gel behandelt worden waren.
BEISPIEL 8: Klinische Reaktion einer Patientin mit einer schweren Form von allgemeiner Psoriasis auf die endovenöse Behandlung mit dem ior t1 mAb
Weibliche Patientin, 56 Jahre alt mit der Krankheitsgeschichte Psoriasis mit psoriatischer Arthropathie, die vor etwa 17 Jahren diagnostiziert worden war. In den letzten fünf Jahren litt die Patientin unter einer häufigen und intensiven Krise, die zu einer häufigen Aufnahme ins Krankenhaus führte. Die Krise begann mit allgemeinen Schädigungen mit geröteten Schuppen, Schmerzen in Gelenken und Muskeln, fiebrig, allgemeinen Ödemen und Mattigkeit. Dieser allgemeine Zustand dauerte an, und 21 Tage später traten im Achselbereich, Nacken und um die Brüste neue Schädigungen mit Geschwürbildung und der Sekretion von infizierter Serosa auf, was von Fieber begleitet war. Aufgrund der sehr langsamen Entwicklung der Erkrankung und der Intoleranz gegenüber allen bisherigen Behandlungen, einschließlich Steroidcremes, ist die Behandlung mit Methotrexat angezeigt, wobei drei Zyklen mit einer Gesamtdosis von 15 mg verabreicht wurden. Es wurde keine klinische Reaktion beobachtet.
Es wurde langsam eine einzige endovenöse Dosis von ior t1 mAb mit 0,6 mg/kg Körpergewicht, in 200 ml Kochsalzlösung 0,9% verdünnt, verabreicht.
Gleichzeitig wurde ein therapeutisches Gel, das ior t1 mAb in einer Konzentration von 3 mg mAb/g Gel enthielt, über zwei Tage zweimal täglich auf alle Schädigungen aufgetragen.
Etwa am sechsten Tag der Behandlung begannen sich der Allgemeinzustand und das dermatologische Bild der Patientin zu verbessern. Am Tag 21 wurde eine Auswertung vorgenommen, und 60% der Körperoberfläche waren ohne Schädigungen, und der Rest der Haut zeigte eine Verbesserung der klinischen Anzeichen der Erkrankung. Die Patientin benannte eine Verbesserung der Symptome in den Gelenken, wobei sie einen guten Allgemeinzustand, normale Lebenszeichen und routinemäßige Labortests zeigte.
Nach 30 Tagen behielt die Patientin eine vollständige Regression der Symptome der Krankheit bei.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 und 2
Analysen zur Modifizierung mittels Humanisierung der variablen Regionen der schweren und der leichten Ketten des monoklonalen Antikörpers ior t1A.
1: Sequenz der variablen Region der schweren Kette des monoklonalen Antikörpers ior t1A der Maus.
2: Sequenz der variablen Region der leichten Kette des monoklonalen Antikörpers ior t1A der Maus.

A. Sequenz der variablen Region der schweren Kette oder der leichten Kette des ior t1A maB der Maus.
B. Sequenz der variablen Region des Human-Immunglobulins mit der stärksten Homologie.
C. Sequenz der modifizierten variablen Region von ior t1A. Schattierung: vorhergesagte antigene Sequenzen für T-Zellen. Unterstrichene Aminosäurereste: An der Tertiärstruktur beteiligte Aminosäuren. Fettdruck: Das Komplement bestimmende Regionen. Aminosäurereste in Kästchen: vorgeschlagene Auswechslungen.

Die Beschreibung ist sowohl für schwere als auch leichte Ketten dieselbe.
3
Es sind die Ergebnisse der Expression der CD6-Antigene in Lymphocyten der eine Entzündung betreffenden Infiltrate dargestellte, die für Hautschäden bei Patienten mit Psoriasis vulgaris charakteristisch sind. Die Auswertung erfolgte bei der Biopsie von Kryostat-Schnitten einer durch Plaqueschäden angegriffenen Haut, die in den oberen und/oder unteren Gliedmaßen und/oder dem Thorax-Abdomen lokalisiert waren. Die histologische Auswertung erfolgte vor der immunhistochemischen Untersuchung.
4
Es wurde eine Auswertung der therapeutischen Wirksamkeit der mAb für CD6, die bei der Behandlung von Psoriasis benutzt wurden, in Hinblick auf die folgenden Variablen durchgeführt: Infiltration, Schuppen, Rötung und Größe der geschädigten Fläche. Die Stärke wurde zwischen den Werten 0–1–2 eingeschätzt. Die Ausdehnung der behandelten Plaques wurde eingeschätzt, indem deren Durchmesser gemessen wurden. Es wurde eine Auswertung der Schwere der Psoriasis (PSS) erhalten, die dem PASI (Index der Fläche und Schwere der Psoriasis) ähnlich ist, und die Reaktion auf die Behandlung wurde entsprechend der am Ende der bezeichneten Auswertungszeit geänderten PSS eingeteilt. Es wurden folgende Kategorien festgelegt: frei, ansprechende Personen, nicht ansprechende Personen und Verschlechterung.
5
Die klinische Reaktion von Patienten, die mit einer topischen Formulierung behandelt worden waren, die 0,3, 1 bzw. 3 mg ior t1 mAb/g Gel enthielt, wurde durch PASI (Index der Fläche und Schwere der Psoriasis) ausgewertet, und es wurde auch die Reaktion auf den Human-Anti-Maus-Antikörper (HAMA) in den Seren dieser Patienten untersucht. Die besten Ergebnisse in bezug auf die klinische Reaktion (PASI) und den erkrankungsfreien Intervall wurden bei der Gruppe erhalten, die mit der geringeren Menge an ior t1 mAb (0,3 mg) behandelt worden war, und in dieser Gruppe waren auch die Titer von HAMA und die Menge der Patienten pro Gruppe, die diesen ausbildeten, höher. Außerdem war das Vorhandensein von anti-idiotypischen Antikörpern in den Seren der Patienten bei den Patienten viel häufiger und viel stärker, die mit der geringeren Dosis von 0,3 mg pro Gramm Gel behandelt worden waren.
6
Die endovenöse Behandlung mit dem ior t1 mAb erfolgte bei einer 56 Jahre alten Patientin mit der Krankheitgeschichte Psoriasis, bei der vor etwa 17 Jahren eine psoriatische Arthropathie diagnostiziert worden war. Sie zeigte nun eine schwere Form von allgemeiner Psoriasis, die durch allgemeine Schädigungen in Form von geröteten Schuppen, Schmerzen in Gelenken und Muskeln, fiebrig, allgemeine Ödeme und Mattigkeit gekennzeichnet war. Dieser Allgemeinezustand sprach auf eine Behandlung, die Methotrexat einschließt, nicht an. Die Behandlung erfolgte mit einer einzigen langsam verabreichten endovenösen Dosis von ior t1 mAb mit 0,6 mg/kg Körpergewicht, in 200 ml Kochsalzlösung 0,9% verdünnt. Gleichzeitig wurde ein therapeutisches Gel, das ior t1 mAb in einer Konzentration von 3 mg mAb/g Gel enthielt, über zwei Tage zweimal täglich auf alle Schädigungen aufgetragen, insgesamt 224 g therapeutisches Gel. Die klinische Reaktion und die immunhistochemischen Laborergebnisse wurden wöchentlich ausgewertet. Es sind Photographien der Entwicklung der Hautschäden gezeigt (am Tag vor und 21 Tage nach der Behandlung).

Claims

Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der Human-CD6 erkennt, für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Psoriasis.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der monoklonale Antikörper ein MAb der Maus oder eine humanisierte Variante davon ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei der monoklonale Antikörper ein MAb der Maus der Unterklasse IgG2a mit den variablen Regionen der schweren und der leichten Kette ist, die in den 1 bzw. 2 in den mit "A" bezeichneten Zeilen angegeben sind.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei der monoklonale Antikörper ein humanisierter MAb der Unterklasse IgG1 mit den variablen Regionen der schweren und der leichten Kette ist, die in den 1 bzw. 2 in den mit "C" bezeichneten Zeilen angegeben sind.
Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der Human-CD6 erkennt, für die Herstellung eines reaktiven Mittels, das für die Diagnose von Psoriasis nützlich ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei der monoklonale Antikörper ein MAb der Maus oder eine humanisierte Variante davon ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei der monoklonale Antikörper ein MAb der Maus der Unterklasse IgG2a mit den variablen Regionen der schweren und der leichten Kette ist, die in den 1 bzw. 2 in den mit "A" bezeichneten Zeilen angegeben sind.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei der monoklonale Antikörper ein humanisierter MAb der Unterklasse IgG1 mit den variablen Regionen der schweren und der leichten Kette ist, die in den 1 bzw. 2 in den mit "C" bezeichneten Zeilen angegeben sind.
Monoklonaler Antikörper, der Human-CD6 erkennt, der für die Behandlung oder Diagnose von Psoriasis nützlich ist, wobei der monoklonale Antikörper ein MAb der Maus der Unterklasse IgG2a mit den variablen Regionen der schweren und der leichten Kette ist, die in den 1 bzw. 2 in den mit "A" bezeichneten Zeilen angegeben sind.
Monoklonaler Antikörper, der Human-CD6 erkennt, der für die Behandlung oder Diagnose von Psoriasis nützlich ist, wobei der monoklonale Antikörper ein humanisierter MAb der Unterklasse IgG1 mit den variablen Regionen der schweren und. der leichten Kette ist, die in den 1 bzw. 2 in den mit "C" bezeichneten Zeilen angegeben sind.