DE69117284T2

DE69117284T2 - Rekombinante antikörper gegen tnf-alpha

Info

Publication number: DE69117284T2
Application number: DE69117284T
Authority: DE
Inventors: John Robert High Wycombe Bucks Hp14 3Rn Adair; Diljeet Singh London Wc1 7Chx Athwal; Mark William South Hinksey Oxford Ox1 5As Bodmer; John Spencer Temple Marlow Bucks Sl7 1Sq Emtage
Original assignee: Celltech R&D Ltd
Current assignee: UCB Celltech Ltd
Priority date: 1990-12-21
Filing date: 1991-12-20
Publication date: 1996-09-05
Anticipated expiration: 2011-12-21
Also published as: NO20012882D0; JPH05507418A; JP2001114697A; AU669083B2; NO923231D0; DK0516785T3; ATE134387T1; AU657937B2; FI109800B; GB9217880D0; CA2129554C; DE4193302C2; ES2190434T3; GB9109645D0; HU211626A9; DE69117284D1; AU7772394A; BR9106232A; EP0626389B1; OA09666A

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft rekombinante, insbesondere humanisierte Antikörpermoleküle mit Spezifität für antigene Determinanten des Tumornekrosefaktors alpha (TNA-α), Verfahren zu deren Herstellung unter Verwendung der rekombinanten DNA- Technologie und deren therapeutische Verwendungen.
Für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung wird der Ausdruck "rekombinantes Antikörpermolekül" verwendet, um ein Antikörpermolekül zu beschreiben, das durch ein beliebiges Verfahren unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie hergestellt wurde, wobei beliebige Analoga natürlicher Immunglobuline oder Fragmente derselben umfaßt sind.
Ebenso für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung wird der Ausdruck "humanisiertes Antikörpermolekül" verwendet, um ein Molekül zu beschreiben, das eine Antigenbindungsstelle aus einem Immunglobulin von einer nicht-humanen Spezies und übrige von einem Immunglobulin stammende Teile des Moleküls, die von einem humanen Immunglobulin stammen, aufweist. Somit schließen die humanisierten Antikörpermoleküle humanisierte chimärische Antikörpermoleküle ein, die komplette Bereiche einer variablen Region einer nicht-humanen schweren und/oder leichten Kette, gebunden an Bereiche einer humanen konstanten Region umfassen. Humanisierte Antikörpermoleküle umfassen auch CDR-gepfropfte humanisierte Antikörpermoleküle, die eine oder mehrere CDRs aus einem nicht-humanen Antikörper, gepfropft in einen Rahmen einer humanen variablen Region einer leichten und/oder schweren Kette umfassen.
Die Antigen-Bindungsspezifität von Antikörpern wird durch deren komplementär determinierende Regionen (CDRs) bestimmt, die aus relativ kurzen Peptidsequenzen bestehen, die auf den Rahmenregionen der variablen Bereiche getragen werden. Fs gibt 3 CDRs (CDR1, CDR2 und CDR3) in jedem der drei variablen Bereiche der schweren und leichten Kette.
Die Abkürzung "MAb" wird verwendet, um einen monoklonalen Antikörper zu bezeichnen. Bei der vorliegenden Beschreibung wird auf eine Anzahl von Veröffentlichungen durch Nummern hingewiesen und diese Veröffentlichungen sind in numerischer Ordnung am Ende der Beschreibung aufgelistet.

Hintergrund der Erfindung

Seit vielen Jahren sind natürliche Immunglobuline bekannt, ebenso die verschiedenen Fragmente derselben, wie etwa die Fab-, Fv-, (Fab')&sub2;- und Fc-Fragmente, die durch enzymatische Spaltung aus denselben abgeleitet werden können. Natürliche Immunglobuline weisen ein im allgemeinen Y-förmiges Molekül auf, das eine Antigen- Bindungsstelle in Richtung zum Ende jedes oberen Armes besitzt. Der Rest der Struktur und insbesondere der Stamm des Y vermittelt die Effektor-Funktionen, die mit den Immunglobulinen in Zusammenhang stehen.
Natürliche Immunglobuline wurden in Assays, in der Diagnose und in begrenzterem Ausmaß in der Therapie eingesetzt. Jedoch wurden diese Verwendungen, insbesondere in der Therapie, bis vor kurzem durch die polyklonale Natur der natürlichen Immunglobuline behindert. Ein wesentlicher Schritt in Richtung auf die Verwendung des Potentials der Immunglobuline als therapeutische Mittel war die Entdeckung von Verfahren zur reproduzierbaren Herstellung monoklonaler Antikörper (MAbs) mit definierter Spezifität (1).
Die meisten MAbs werden jedoch durch Hybridome produziert, die Fusionen von Nagetier-Milzzellen mit Nagetier-Myelomzellen sind. Daher bestehen sie im wesentlichen aus Nagetier-Proteinen. Es gibt nur sehr wenige Berichte über die Herstellung humaner MAbs.
Da die meisten zur Verfügung stehenden MAbs von Nagetieren stammen, wirken sie natürlicherweise für Menschen als Antigen und können daher, wenn der MAb an einen Menschen verabreicht wird, Anlaß zu einer unerwünschten Immunantwort sein, die HAMA- (Human-Anti-Maus-Antikörper) -Reaktion genannt wird. Daher ist die Verwendung von Nagetier-MAbs als therapeutische Mittel bei Menschen inherent durch die Tatsache begrenzt, daß der menschliche Patient eine Immunreaktion gegen den MAb aufbauen wird und diesen entweder vollständig entfernt oder zumindest seine Wirksamkeit herabsetzt. In der Praxis können MAbs aus Nagetier-Quellen für nicht mehr als eine oder einige wenige Behandlungen bei Patienten verwendet werden, da sich rasch eine HAMA- Reaktion entwickelt, die den MAb unwirksam macht und ebenso Anlaß für unerwünschte Reaktionen ist. Zum Beispiel wurde OKT3, ein Maus IgG2a/k MAb, der ein Antigen in dem T-Zellrezeptor-CD3-Komplex erkennt, in vielen Ländern auf der ganzen Welt zur Verwendung als ein Immunsuppressionsmittel bei der Behandlung von akuter Allograft- Abstoßung zugelassen [Chatenoud et al. (2) und Jeffers etal. (3)]. Im Hinblick auf die Nagetier-Natur dieses und anderer solcher MAbs kann sich jedoch eine signifikante HAMA-Reaktion bei der Verwendung aufbauen, die eine größere Anti-Idiotyp-Komponente umfassen kann. Selbstverständlich wäre es äußerst wünschenswert, diese unerwünschte HAMA-Reaktion zu verringern oder zu vermeiden und auf diese Weise die Anwendungsbereiche solcher Antikörper zu erweitern.
Es wurden daher Vorschläge gemacht, nicht-humane MAbs für Menschen weniger antigen wirkend zu machen. Solche Verfahren können im allgemeinen als "Humanisierungs"-Verfahren bezeichnet werden. Diese Verfahren bedienen sich in der Regel der Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie zur Manipulation von DNA-Sequenzen, die für die Polypeptidketten des Antikörpermoleküls codieren.
Frühe Verfahren zur Humanisierung von MAbs bedienten sich der Produktion chimärischer Antikörper, in welchen eine Antigen-Bindungsstelle, die die vollständigen variablen Bereiche eines Antikörpers umfaßt, an die konstanten Bereiche, die von einem anderen Antikörper stammen, gebunden wird. Methoden zur Durchführung solcher Chimärisationsverfahren werden beschrieben in EPO120694 (Celltech Limited), EPO125023 (Genentech Inc. und City of Hope), EP-A-0 171496 (Res. Dev. Corp. Japan), EP-A-0 173 494 (Stanford University) und WO 86/01533 (Celltech Limited). Diese früheren Patentanmeldungen offenbaren im allgemeinen Verfahren zur Herstellung von Antikörpermolekülen mit den variablen Bereichen eines Maus-MAb und den konstanten Bereichen eines humanen Immunglobulins. Solche humanisierte chimärische Antikörper enthalten jedoch noch immer einen deutlichen Anteil nicht-humaner Aminosäuresequenz, d.h. die vollständigen nicht-humanen variablen Bereiche, und können daher immer noch eine gewisse HAMA-Reaktion hervorrufen, insbesondere, wenn sie über einen längeren Zeitraum hinweg verabreicht werden [Begent et al. (Lit. 4)].
Bei einem anderen Versuch, der in der EP-A-0239400 (Winter) beschrieben ist, wurden die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) eines Maus-MAb durch stellengelenkte Mutagenese auf die Rahmenregionen der variablen Bereiche eines humanen Immunglobulins unter Verwendung langer Oligonukleotide aufgepfropft. Es ist anzunehmen, daß solche CDR-gepfropften humanisierten Antikörper, im Hinblick auf den wesentlich geringeren Anteil an nicht-humaner Aminosäuresequenz, den sie enthalten, wesentlich weniger Anlaß zu einer HAMA-Reaktion geben als humanisierte chimärische Antikörper.
Die früheste Arbeit über die Humanisierung von MAbs durch CDR-Pfropfung wurde an MAbs durchgeführt, die synthetische Antigene, wie etwa die NP- oder NIP-Antigene, erkennen. Beispiele, in welchen ein Maus-MAb, der Lysozym erkennt, und ein Ratten-MAb, der ein Antigen auf humanen T-Zellen erkennt, durch CDR-Pfropfung humanisiert wurden, wurden jedoch von Verhoeyen et al. (5) bzw. Riechmann et al. (6) beschrieben. Die Herstellung eines CDR-gepfropften Antikörpers gegen das Antigen auf humanen T-Zellen ist auch in der WO 89/07452 (Medical Research Council) beschrieben.
In Riechmann et al./Medical Research Council wurde gefunden, daß die Übertragung der CDR-Regionen [wie sie durch die Literaturstellen Kabat (7) und (8) definiert sind) allein nicht ausreicht, um eine genügende Antigen-Bindungsaktivität in dem CDR-gepfropften Produkt zu schaffen. Riechmann et al. fanden, daß es notwendig war, einen Serin-Rest an der Position 27 der Sequenz der humanen schweren Kette in den entsprechenden Ratten-Phenylalaninrest umzuwandeln, um ein CDR-gepfropftes Produkt mit verbesserter Antigen-Bindungsaktivität zu erhalten. Dieser Rest an der Position 27 der schweren Kette liegt innerhalb der Strukturschleife im Anschluß an CDR1. Ein weiteres Konstrukt, das zusätzlich einen Austausch von humanem Serin gegen Ratten-Tyrosin an der Position 30 der schweren Kette enthielt, wies keine signifikant veränderte Bindungsaktivität gegenüber dem humanisierten Antikörper, bei dem nur der Austausch von Serin gegen Phenylalanin an der Position 27 stattgefunden hatte, auf Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, daß Veränderungen von Resten der humanen Sequenz außerhalb der CDR- Regionen, insbesondere in der Strukturschleife im Anschluß an CDR1 der schweren Kette, notwendig sein könnten, um wirksame Antigen-Bindungsaktivität für CDR- gepfropfte Antikörper, die komplexere Antigene erkennen, zu erzielen. Aber dennoch war die Bindungsaffinität der besten erhaltenen CDR-gepfropften Antikörper immer noch deutlich geringer als die von ursprünglichem MAb.
In neuerer Zeit beschrieben Queen et al. (9) die Herstellung eines humanisierten Antikörpers, der an einen Interleukin 2 Rezeptor bindet, wobei die CDRs eines murinen MAb (Anti-Tac) mit einem humanen Immunglobulin-Rahmen und konstanten Regionen kombiniert werden. Die humanen Rahmenregionen wurden ausgewählt, um die Homologie mit der Anti-Tac MAb-Sequenz zu maximieren. Zusätzlich dazu wurde mit Computer-Modellen gearbeitet, um die Aminosäurereste des Rahmens zu identifizieren, von denen angenommen werden konnte, daß sie mit den CDRs oder mit dem Antigen in Wechselwirkung treten, und es wurden Maus-Aminosäuren an diesen Positionen im humanisierten Antikörper verwendet.
In WO 90/07861 schlagen Queen et al. vier Kriterien zur Planung von humanisierten Immunglobulinen vor. Das erste Kriterium besteht darin, als den humanen Akzeptor den Rahmen aus einem speziellen humanen Immunglobulin, das unüblich homolog zu dem zu humanisierenden nicht-humanen Donor-Immunglobulin ist, oder einen Consensus-Rahmen aus vielen humanen Antikörpern zu verwenden. Das zweite Kriterium besteht in der Verwendung der Donor-Aminosäure anstelle des Akzeptors, wenn der humane Akzeptor-Rest unüblich und der Donor-Rest typisch für humane Sequenzen bei einem spezifischen Rest des Rahmens ist. Das dritte Kriterium ist die Verwendung des Donor-Rahmen-Aminosäurerestes statt des Akzeptors in Positionen unmittelbar angrenzend an die CDRs. Das vierte Kriterium ist die Verwendung des Donor-Aminosäurerestes an solchen Rahmenpositionen, an welchen vorhergesagt ist, daß die Aminosäure in einem dreidimensionalen Immunglobulin-Modell ein Seitenkettenatom innerhalb von etwa 3 Å von den CDRs aufweist und zur Wechselwirkung mit dem Antigen oder mit den CDRs des humanisierten Immunglobulins befähigt ist. Es wird vorgeschlagen, daß die Kriterien zwei, drei und vier zusätzlich mit oder alternierend zu Kriterium eins verwendet werden und einzeln oder in beliebiger Kombination zur Anwendung kommen können.
Die WO 90/07861 beschreibt detailliert die Herstellung eines Einzel-CDR- gepfropften humanisierten Antikörpers, eines humanisierten Antikörpers mit Spezifität für das P55 Tac Protein des IL-2 Rezeptors. Die Kombination aller vier Kriterien, die oben genannt sind, wurde zur Planung dieses humanisierten Antikörpers eingesetzt, wobei die Rahmen der variablen Region des humanen Antikörpers EU (7) als Akzeptor verwendet wurden. In dem entstehenden humanisierten Antikörper waren die Donor-CDRs so, wie sie von Kabat et al. (7 und 8) definiert wurden, und zusätzlich dazu wurden die murinen Donor-Reste anstelle der humanen Akzeptor-Reste an den Positionen 27, 30, 48, 66, 67, 89, 91, 94, 103, 104, 105 und 107 in der schweren Kette und an den Positionen 48, 60 und 63 in der leichten Kette der Rahmen der variablen Region verwendet. Von dem gewonnenen humanisierten Anti-Tac Antikörper wird berichtet, daß er eine Affinität für p55 von 3 x 10&sup9; M&supmin;¹ aufweist, was etwa einem Drittel der des murinen MAb entspricht.
Wir haben die Herstellung von CDR-gepfropften humanisierten Antikörpermolekülen weiter untersucht und haben eine Hierarchie von Positionen innerhalb des Rahmens der variablen Regionen identifiziert (d.h. außerhalb sowohl der Kabat- CDRs als auch der Strukturschleifen der variablen Regionen), an welchen die Aminosäure-Identitäten der Reste für die Gewinnung von CDR-gepfropften Produktion mit zufriedenstellender Bindungsaffinität wesentlich sind. Das hat uns die Möglichkeit gegeben, ein Protokoll zur Gewinnung zufriedenstellender CDR-gepfropfter Produkte zu erstellen, das unabhängig von dem Ausmaß der Homologie zwischen dem Donor-Immunglobulin und dem Akzeptor-Rahmen sehr weitgehend angewendet werden kann. Die Gruppe der Reste, die wir als solche mit kritischer Bedeutung identifiziert haben, überlappt die von Queen et al. (9) identifizierten Reste, fällt jedoch nicht mit ihnen zusammen. Unsere schwebende Internationale Patentanmeldung WO91/09967 beschreibt dieses Protokoll für die Herstellung von CDR-gepfropften, insbesondere humanisierten schweren und leichten Antikörperketten und kompletten Molekülen beliebiger gewünschter Spezifität Die volle Offenbarung der Internationalen Patentanmeldung WO91/09967 wird in die vorliegende Beschreibung als Referenz aufgenommen.
Tempest et al. (10) haben in letzter Zeit die Herstellung eines umgeformten humanen monoklonalen Antikörpers beschrieben, der in vivo zur Inhibierung einer Infektion durch das humane Respiratorische Synzytialvirus (RSV) verwendet wird. Dieser umgeformte Antikörper wurde durch Pfropfen von synthetischen Oligonukleotiden, die für die CDRs eines murinen MAb codieren, der eine RSV-Infektion neutralisiert, durch stellengelenkte Mutagenese in eine DNA, die für die Rahmen eines humanen IgG1, eines monoklonalen Antikörpers codiert, hergestellt. Der einfache, umgeformte Antikörper, in welchem die CDRs allein zwischen murinen und humanen Antikörpern übertragen worden waren, hatte nur eine sehr schwache Bindung für RSV, die sich vom Hintergrund nicht signifikant unterschied. Um die Bindungsfähigkeit teilweise wiederherzustellen, erwies es sich als notwendig, zusätzlich humane Reste in Mausreste in einer Rahmenregion im Anschluß an CDR3 der schweren Kette umzuwandeln. Tempest et al. wandelten keine humanen Reste in Mausreste an wichtigen, in dem Protokoll von WO91/09967 identifizierten Positionen um.
TNFα ist ein Zytokin, das von den Zellen des Immunsystems freigesetzt wird und mit diesen in Wechselwirkung tritt. Somit wird TNFα von Makrophagen freigesetzt, die durch ein Lipopolysaccharid (LPS) von Gram-negativen Bakterien aktiviert worden waren. Als solcher scheint TNFα ein endogener Mediator von zentraler Bedeutung zu sein, der an der Entwicklung und Pathogenese von endotoxischem Schock, der bei bakterieller Sepsis auftritt, beteiligt ist. Die Antikörper gegen TNFα wurden zur Prophylaxe und Behandlung von endotoxischem Shock vorgeschlagen (Beutler et al. (11)). Die Antikörper gegen TNFα, die zur Verwendung bei einer solchen Behandlung üblicherweise erhältlich sind, sind in der Regel murine MAbs. Als solche sind diese murinen MAbs nur von begrenzter Verwendung zur Behandlung von Menschen im Hinblick auf die unerwünschte HAMA- (Human-Anti-Maus-Antikörper) -Reaktion, die sie hervorrufen können, wenn sie für mehr als eine oder einige wenige Behandlungen verwendet werden. Somit ist es ein höchst wünschenswertes Ziel, humanisierte Anti-TNFα-Produkte für die Verwendung in der Humantherapie herzustellen.
Unser schwebende Internationale Patentanmeldung W091/09967 beschreibt unter anderem die Herstellung von humanisierten CDR-gepfropften Antikörperprodukten, die Spezifität für TNFα aufweisen. Insbesondere beschreibt die WO91/09967 in Beispiel 5 die Herstellung von spezifischen humanisierten CDR-gepfropften Antikörpern gegen humanen TNFα, die von den murinen Antihuman-TNFα MAbs, die als 61E71 (andererseits auch bekannt als CB0006), hTNF1 (andererseits auch bekannt als CB0010), hTNF3 und 101.4 identifiziert sind, stammen. Die vorliegende Anmeldung betrifft speziell rekombinante, insbesondere humanisierte Antikörper gegen humanen TNFα, inklusive jenen, die in der WO91/09967 beschrieben sind, und betrifft weiters verbesserte humanisierte CDR-gepfropfte Antikörper für humanen TNFα auf der Basis von hTNF1 (CB0010) und murinem MAb 101.4. Weitere Untersuchungen verschiedener muriner Anti-human TNFα MAbs zeigten, daß hTNF1 und 101.4 besonders wünschenswerte Eigenschaften zur Verwendung bei einer Anti-TNF-Therapie besitzen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Antikörpermolekül zur Verfügung, das Spezifität für humanen TNFα aufweist und eine zusammengesetzte schwere Kette und eine komplementäre leichte Kette umfaßt, wobei die zusammengesetzte schwere Kette einen variablen Bereich hat, der hauptsächlich Rahmenreste einer schweren Kette eines humanen Akzeptor-Antikörpers und Antigenbindungsreste einer schweren Kette eines Donor-Antikörpers umfaßt, wobei der Donor-Antikörper Spezifität für den humanen TNFα hat, und wobei, gemäß dem Kabat-Numerierungssystem in der genannten zusammengesetzten schweren Kette zumindest die Aminosäurereste 23, 24, 31 bis 35, 49 bis 65 und 95 bis 100 Donor-Reste sind.
Vorzugsweise sind in dem Antikörpermolekül die Aminosäurereste 71, 73 und 78 in der genannten zusammengesetzten schweren Kette zusätzlich Donor-Reste.
Gewünschtenfalls sind in dem Antikörpermolekül die Aminosäurereste 6, 37, 48 und 94 zusätzlich Donor-Reste.
Wenn es weiters gewünscht ist, sind in dem Antikörpermolekül die Aminosäurereste 2, 4, 25, 36, 39, 47, 93, 103, 104, 106 und 107 zusätzlich Donor-Reste.
Gegebenenfalls sind in dem Antikörpermolekül die Aminosäurereste 26 bis 30 zusätzlich Donor-Reste.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Antikörpermolekül mit Spezifität für humanen TNFα zur Verfügung, das eine zusammengesetzte leichte Kette und eine komplementäre schwere Kette umfaßt, wobei die zusammengesetzte leichte Kette einen variablen Bereich hat, der hauptsächlich Rahmenreste einer leichten Kette eines humanen Akzeptor-Antikörpers und Antigenbindungsreste einer leichten Kette eines Donor-Antikörpers umfaßt und der Donor-Antikörper Spezifität für den humanen TNFα hat, wobei gemäß dem Kabat-Numerierungssystem in der genannten zusammengesetzten leichten Kette zumindest die Aminosäurereste 24 bis 34, 46, 47, 50 bis 56 und 89 bis 97 Donor- Reste sind.
Die vorliegende Erfindung stellt weiters ein Antikörpermolekül mit Spezifität für humanen TNAα zur Verfügung, das eine zusammengesetzte leichte Kette und eine komplementäre schwere Kette umfaßt, wobei die zusammengesetzte leichte Kette einen variablen Bereich hat, der hauptsächlich Rahmenreste einer leichten Kette eines humanen Akzeptor-Antikörpers und Antigenbindungsreste einer leichten Kette eines Donor-Antikörpers umfaßt und wobei der Donor-Antikörper Spezifität für den humanen TNFα hat, wobei gemäß dem Kabat-Numerierungssystem in der genannten zusammengesetzten leichten Kette zumindest die Aminosäurereste 24 bis 34, 46, 48, 50 bis 56, 58, 71 und 89 bis 97 Donor-Reste sind.
In dem Antikörpermolekül gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung ist die komplementäre leichte Kette vorzugsweise eine zusammengesetzte leichte Kette, die einen variablen Bereich hat, der hauptsächlich Rahmenreste einer leichten Kette eines humanen Akzeptor-Antikörpers und Antigenbindungsreste einer leichten Kette eines Donor-Antikörpers umfaßt, wobei gemäß dem Kabat-Numerierungssystem in der genannten zusammengesetzten leichten Kette zumindest die Äminosäurereste 24 bis 34, 46, 47, 50 bis 56 und 89 bis 97 Donor-Reste sind.
In dem Antikörpermolekül gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung ist andererseits die komplementäre leichte Kette eine zusammengesetzte leichte Kette, die einen variablen Bereich hat, der hauptsächlich Rahmenreste einer leichten Kette eines humanen Akzeptor-Antikörpers und Antigenbindungsreste einer leichten Kette eines Donor-Antikörpers umfaßt, wobei gemäß dem Kabat-Numerierungssystem in der genannten zusammengesetzten leichten Kette zumindest die Aminosäurereste 24 bis 34, 46, 48, 50 bis 56, 58, 71 und 89 bis 97 Donor-Reste sind.
In dem oben definierten Antikörpermolekül sind vorzugsweise die Aminosäurereste 2, 4, 6, 35, 36, 38, 44, 47, 49, 62, 64 bis 69, 85, 87, 98, 99, 101 und 102 in der genannten leichten Kette zusätzlich Donor-Reste.
In dem oben definierten Antikörpermolekül sind gegebenenfalls die Aminosäurereste 1, 3, 10 bis 12, 21, 37, 40, 45, 60, 63, 70, 73, 83, 103 und 105 in der genannten leichten Kette zusätzlich Donor-Reste.
In dem oben definierten Antikörpermolekül ist der Donor-Antikörper vorzugsweise ein muriner monoklonaler Antikörper, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CB006 (andererseits bekannt als 61E71); CB0010 (andererseits bekannt als hTNF1); hTNF3; und 101.4.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine therapeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die das Antikörpermolekül nach obiger Definition in Kombination mit einem pharmazeutisch verwendbaren Träger umfaßt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch das Antikörpermolekül oder die therapeutische Zusammensetzung nach obiger Definition zur Verwendung in einem therapeutischen Verfahren zur Verfügung, bei welchem der Antikörper in einer zur Neutralisation von TNFα wirksamen Menge an einen Menschen verabreicht wird.
Die vorliegende Erfindung stellt auch das Antikörpermolekül oder die therapeutische Zusammensetzung nach obiger Definition zur Verwendung bei der Behandlung von rheumatoider Arthritis zur Verfügung.
Die rekombinanten Antikörpermoleküle gemäß der Erfindung sind vorzugsweise solche, die TNFα neutralisieren, d.h. imstande sind, eine biologische Aktivität von humanem TNFα, wie sie durch einen Test in vitro oder in vivo gemessen wird, herabzusetzen oder zu inhibieren.
Vorzugsweise umfassen die Antigen-Bindungsregionen des variablen Bereichs der schweren Kette CDRs, die den Kabat CDRs bei CDR2 Reste 50-65) und CDR3 (Reste 95-102) entsprechen, sowie eine Zusammensetzung der Kabat- und Strukturschleifen-CDRs bei CDR1 (Reste 26-35), d.h. die Reste 26-30 sind innerhalb von CDR1 eingeschlossen.
Die Restebezeichnungen, die oben angegeben und an anderer Stelle in der vorliegenden Anmeldung aufgezeigt sind, erfolgen gemäß der Kabat-Numerierung [Lit. (7) und (8)]. Daher entsprechen die Bezeichnungen der Reste nicht immer direkt der linearen Numerierung der Aminosäurereste. Die tatsächliche lineare Aminosäuresequenz kann weniger oder zusätzliche Aminosäuren enthalten als in der strikten Kabat-Numerierung, was einer Verkürzung der Strukturkomponente oder einer Insertion in dieselbe entspricht, je nach Rahmen oder CDR der Struktur des grundlegenden variablen Bereichs. Zum Beispiel enthält die variable Region der schweren Kette des von Queen et al. (9) beschriebenen Anti-Tac Antikörpers ein einziges Aminosäure-Insert (Rest 52a) hinter dem Rest 52 von CDR2 und ein Insert aus drei Aminosäuren (Reste 82a, 82b und 82c) hinter dem Rahmenrest 82 in der Numerierung nach Kabat. Die korrekte Kabat-Numerierung der Reste kann für einen gegebenen Antikörper durch Abgleichung von Homologieregionen der Sequenz des Antikörpers mit einer nach Kabat numerierten "Standard"-Sequenz bestimmt werden.
Es ist ersichtlich, daß, wenn die erfindungsgemäßen Antikörpermoleküle gemäß obiger Beschreibung und gemäß anderen Stellen in der vorliegenden Beschreibung für ein spezielles Paar von Donor-/Akzeptor-Antikörpem verwendet werden, in manchen Fällen die Donor- und Akzeptor-Aminosäurereste identisch sein können an einer speziellen Position, die für den Wechsel zu dem Donor-Rest identifiziert ist, und daß somit kein Wechsel eines Akzeptor-Rahmenrestes erforderlich ist.
Die Antigen-Bindungsregionen des variablen Bereichs der zusammengesetzten leichten Kette umfassen CDRs, die den Kabat CDRs bei CDR1 (Reste 24-34), CDR2 (Reste 50-56) und CDR3 (Reste 89-97) entsprechen.
Vorzugsweise umfaßt der variable Bereich der schweren Kette einen humanen Akzeptor-Rahmen (insbesondere humanen EU-Akzeptor-Rahmen) und hTNF1 Donor-Antigenbindungsregionen, wobei der Rahmen hTNF1 Donor-Reste an den Positionen 12, 27, 30, 38, 46, 48, 66, 67, 69, 71, 73, 76, 83, 89, 91 und 94 umfaßt.
Der schwere EU-Rahmen hat Reste im Rahmen 4 (FR4) der schweren Kette, die für Rahmen von humanen schweren Ketten anomal sind. Somit werden vorzugsweise humane Consensus-Reste anstelle von EU-Resten in FR4 der schweren Kette verwendet. Insbesondere kann der humane Consensus-Rest Threonin (T) an der Position 108 verwendet werden. Zufällig ist der murine hTNF1-Rest an der Position 108 ebenfalls Threonin.
Vorzugsweise umfaßt der variable Bereich der leichten Kette einen humanen Akzeptor-Rahmen (insbesondere humanen EU-Akzeptor-Rahmen) und hTNF1 Donor-Antigenbindungsregionen, wobei der Rahmen hTNF1 Donor-Reste an den Positionen 3, 42 und 49 umfaßt.
Wenn der humane EU-Rahmen für die leichte Kette verwendet wird, ist es auch wünschenswert, Reste aus den EU-Resten an den Positionen 48, 83, 106 und 108 auszutauschen, da die EU-Reste an diesen Positionen für humane Antikörper anomal sind. Somit können die humanen Consensus-Reste an manchen oder vorzugsweise allen diesen Resten verwendet werden, d.h. Isoleucin Q) an der Position 48, Valin (V) an der Position 83, Isoleucin (I) an der Position 106 und Arginin (R) an der Position 108. Zufällig sind die murinen hTNF1-Reste die gleichen wie die humanen Consensus-Reste an den Positionen 48 (I), 106 (I) und 108 (R). Jedoch unterscheidet sich der humane Consensus-Rest Valin (V) an der Position 83 sowohl von dem EU-Rest (F) als auch von dem hTNF1-Rest an dieser Stelle.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Bereich der schweren Kette einen humanen Akzeptor-Rahmen (insbesondere humanen KOL Akzeptor-Rahmen) und 101.4 Donor-Antigenbindungsregionen, in welchen der Rahmen 101.4 Donor-Reste an den Positionen 4, 11, 23, 24, 28, 73, 77, 78, 79, 91, 93 und 94 umfaßt.
Der KOL-Rest Prolin (P) an der Position 108 der schweren Kette ist für humane Antikörper anomal. Somit ist vorzugsweise der humane Consensus-Rest Leucin (L) an dieser Position, wenn KOL als der humane Akzeptor-Rahmen verwendet wird. Zufällig hat der murine Antikörper 101.4 an dieser Stelle den humanen Consensus-Rest (L).
Vorzugsweise umfaßt bei diesem anderen Aspekt der variable Bereich der leichten Kette einen humanen Akzeptor-Rahmen (insbesondere humanen REI Akzeptor- Rahmen) und 101.4 Donor-Reste an den Positionen 1, 3, 4 und 73.
Der humane Rahmen der leichten Kette REI hat Reste, die für humane Antikörper anomal sind, an den Positionen 39 (Threonin, T), 104 (Leucin, L), 105 (Glutamin, Q) und 107 (Threonin, T). Wenn daher REI als der Rahmen der leichten Kette verwendet wird, werden humane Consensus-Reste an den Positionen 39 (Lysin, K), 104 (Valin, V), 105 (Glutaminsäure, E) und 107 (Lysin, K) verwendet. Zufällig sind die munnen 101.4 Reste die gleichen wie die humanen Consensus-Reste an den Positionen 39 (K), 105 (E) und 107 (K). Jedoch unterscheidet sich der humane Consensus-Rest an der Position 104 (V) von dem Leucin (L) REI und den murinen 101.4 Resten an dieser Stelle.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Antikörperfragmente, wie etwa ein Fab-, Fab'-, F(ab')&sub2;- oder Fv-Fragment.
Es können die Antikörpermoleküle der vorliegenden Erfindung auch ein Effektor- oder Reportermolekül an sich gebunden aufweisen. Zum Beispiel kann ein Makrozyklus, um ein Atom eines Schwermetalls als Chelat zu binden, oder ein Toxin, wie etwa Ricin, durch eine kovalente Brückenstruktur daran gebunden sein. Andererseits können die Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie zur Herstellung eines Immunglobulin-Moleküls verwendet werden, in welchem das Fc-Fragment oder der CH3- Bereich eines vollständigen Immunglobulin-Moleküls durch ein funktionelles Nicht- Immunglobulin-Protein, wie etwa ein Enzym- oder ein Toxinmolekül, ersetzt oder durch eine Peptidbindung an ein solches gebunden ist.
Die Aminosäuresequenzen der variablen Bereiche der schweren und leichten Kette von CB0010, 101.4, CB0006 und der murinen hTNF3 MAbs, der CDR- gepfropften Varianten derselben und der humanen Akzeptor-Antikörper sind in den angeschlossenen Diagrammen der Figuren 1, 2, 3 bzw. 4 angegeben. Die rekombinanten und humanisierten Antikörperprodukte gemäß der Erfindung können unter Verwendung von rekombinanten DNA-Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel im wesentlichen nach der Beschreibung der WO91/09967.
Es können beliebige geeignete humane Akzeptor-Rahmensequenzen der variablen Region je nach Klasse/Typ des Donor-Antikörpers, von welchem die Antigen- Bindungsregionen stammen, verwendet werden. Vorzugsweise ist der verwendete Typ von humanem Akzeptor-Rahmen von gleicher oder ähnlicher Klasse oder gleichem oder ähnlichem Typ wie der Donor-Antikörper. Geeigneterweise kann der Rahmen so gewählt werden, daß die Homologie mit der Donor-Antikörpersequenz, insbesondere an den Positionen nahe oder angrenzend an die CDRs, maximiert/optimiert wird. Jedoch ist ein hoher Grad an Homologie zwischen Donor- und Akzeptor-Sequenzen für die erfindungsgemäße Anwendung nicht wesentlich. Die vorliegende Erfindung identifiziert eine Hierarchie von Positionen der Rahmenreste, an welchen Donor-Reste von Bedeutung sind oder zur Gewinnung eines CDR-gepfropften Antikörperprodukts mit zufriedenstellenden Bindungseigenschaften wünschenswert sind. Die CDR-gepfropften Produkte haben in der Regel Bindungsaffinitäten von mindestens 10&sup5; M&supmin;¹, vorzugsweise von mindestens 10&sup8; M&supmin;¹, oder insbesondere solche im Bereich von 10&sup8;-10¹²M&supmin;¹. Im Prinzip ist die vorliegende Erfindung auf jede beliebige Kombination von Anti-hTNFα Donor- und humane Akzeptor-Antikörper anwendbar, unabhängig von dem Ausmaß der Homologie zwischen ihren Sequenzen. Beispiele von humanen Rahmen, die verwendet werden können, sind KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY und POM (Lit. 7 und 8) und dergleichen; zum Beispiel KOL und NEWM für die schwere Kette und REI für die leichte Kette und EU, LAY und POM sowohl für die schwere als auch für die leichte Kette.
Es können auch die Bereiche der konstanten Region der erfindungsgemäßen Produkte im Hinblick auf die vorgeschlagene Funktion des Antikörpers, insbesondere hinsichtlich der eventuell erforderlichen Effektor-Funktionen, ausgewählt werden. Zum Beispiel können die Bereiche der konstanten Region humane IgA, IgE, IgG oder IgM Bereiche sein. Insbesondere können die Bereiche von IgG humaner konstanter Region verwendet werden, vor allem der Isotypen IgG1 und IgG3, wenn das humanisierte Antikörpermolekül für therapeutische Zwecke in Betracht gezogen wird und Antikörper- Effektor-Funktionen erforderlich sind. Andererseits können IgG2 und IgG4 Isotypen verwendet werden, wenn das humanisierte Antikörpermolekül für therapeutische Zwecke in Betracht gezogen wird und Antikörper-Effektor-Funktionen nicht erforderlich sind, z.B. zur einfachen Blockierung der TNF-Aktivität.
Der Rest der Antikörpermoleküle muß jedoch nicht nur Proteinsequenzen aus Immunglobulinen umfassen. Zum Beispiel kann ein Gen konstruiert werden, in welchem eine für einen Teil einer humanen Immunglobulinkette codierende DNA-Sequenz an eine DNA-Sequenz füsioniert wird, die für die Aminosäuresequenz eines funktionellen Polypeptids, wie etwa eines Effektor- oder Reportermoleküls, codiert.
Die allgemeinen Verfahren, mit deren Hilfe Vektoren konstruiert werden können, die Transfektionsmethoden und die Züchtungsverfahren sind an sich allgemein bekannt. Derartige Verfahren sind zum Beispiel in den Literaturstellen 12 und 13 angegeben.
Die DNA-Sequenzen, die für die Aminosäuresequenzen eines Anti-hTNFα Antikörpermoleküls codieren, können durch an sich in der Fachwelt bekannte Verfahren gewonnen werden. Zum Beispiel können die für Anti-TNF codierenden Sequenzen durch genomisches Klonen oder durch cDNA-Klonierung aus geeigneten Hybridom-Zell- Linien, die Anti-hTNFα produzieren, gewonnen werden. Positive Klone können durch Verwendung geeigneter Sonden für die in Frage stehenden Gene der schweren und leichten Kette ausgesucht werden. Es kann auch PCR-Klonierung angewendet werden. Die DNA-Sequenz, die für einen Teil oder alle schweren und leichten Ketten des Antikörpers codiert, kann je nach Wunsch aus der festgestellten DNA-Sequenz oder auf der Basis der entsprechenden Aminosäuresequenz synthetisiert werden.
Die DNA, die für die Akzeptor-, z.B. humanen Akzeptor-Sequenzen, codiert, kann auf jede beliebige Weise gewonnen werden. Zum Beispiel sind DNA-Sequenzen, die für bevorzugte humane Akzeptor-Rahmen codieren, wie etwa KOL, REI, EU und NEWM, dem Fachmann auf diesem Gebiet allgemein zur Verfügung oder sie können leicht auf der Grundlage ihrer bekannten Aminosäuresequenzen synthetisiert werden (vgl. Lit 7 und 8).
Die Standardverfahren der Molekularbiologie können eingesetzt werden, um DNA-Sequenzen herzustellen, die für die chimärischen und CDR-gepfropften humanisierten Antikörperprodukte codieren. Gewünschte DNA-Sequenzen können vollständig oder teilweise durch Einsatz von Oligonukleotid-Syntheseverfahren synthetisiert werden. Stellengelenkte Mutagenese und Verfahren der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) können je nach Eignung angewendet werden. Zum Beispiel kann Oligonukleotid-gelenkte Synthese, wie sie von Jones et al. (Lit. 14) beschrieben wird, eingesetzt werden. Auch Oligonukleotid-gelenkte Mutagenese einer vorherbestehenden variablen Region, wie etwa zum Beispiel von Verhoeyen et al. (Lit. 5) oder Riechmann et al. (Lit. 6) beschrieben wurde, kann zur Anwendung kommen. Auch die enzymatische Auffüllung von Lücken in den Oligonukleotiden unter Verwendung von T&sub4; DNA-Polymerase, wie dies zum Beispiel von Queen et al. (Lit. 9) beschrieben wurde, kann eingesetzt werden.
Es kann jedes geeignete System aus Wirtszelle/Vektor zur Expression der für die rekombinanten, chimärischen und CDR-gepfropften schweren und leichten Ketten der humanisierten Antikörper codierenden DNA-Sequenzen verwendet werden. Bakterielle Systeme von z.B. E. coli sowie andere mikrobielle Systeme können insbesondere zur Expression von Antikörperfragmenten, wie etwa Fab und F(ab')&sub2; Fragmenten sowie insbesondere Fv-Fragmenten und Einzelketten-Antikörperfragmenten, z.B. Einzelketten Fvs, verwendet werden. Es können eukaryotische Expressionssysteme, wie z.B. solche mit Säugetier-Wirtszellen, zur Produktion größerer CDR-gepfropfter Antikörperprodukte, inklusive vollständiger Antikörpermoleküle, verwendet werden. Geeignete Säugetier-Wirtszellen umfassen CHO-Zellen und Myelom- oder Hybridom-Zell-Linien.
Die Erfindung umfaßt auch therapeutische und diagnostische Zusammensetzungen, die rekombinante und humanisierte erfindungsgemäße Antikörperprodukte enthalten, und betrifft auch die Verwendungen dieser Produkte und der Zusammensetzungen in Therapie und Diagnose.
Somit stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt eine therapeutische oder diagnostische Zusammensetzung zur Verfügung, die einen erfindungsgemäßen rekombinanten oder humanisierten Antikörper in Kombination mit einem pharmazeutisch verwendbaren Vehikel, Verdünnungsmittel oder Träger enthält.
Der rekombinante oder humanisierte Antikörper kann der einzige aktive Wirkstoff in der therapeutischen oder diagnostischen Zusammensetzung sein oder er kann von einem oder mehreren anderen aktiven Bestandteilen, inklusive anderen Antikörper- Bestandteilen, z.B. Anti-T-Zell-, Anti-IFN-gamma oder Anti-LPS-Antikörpern, oder Nicht-Antikörperbestandteilen, wie etwa Xanthinen, begleitet sein. Die therapeutischen und diagnostischen Zusammensetzungen können in einer Dosierungseinheitsform vorliegen, in welchem Fall jede Einheitsdosis eine wirksame Menge des erfindungsgemäßen rekombinanten oder humanisierten Antikörpers enthält.
Die Antikörper und die Zusammensetzungen können in jeder Therapie verwendet werden, wo es wünschenswert ist, den Gehalt an TNF, der in dem menschlichen oder tierischen Körper vorliegt, herabzusetzen. Der TNF kann in dem Körper zirkulieren oder er kann an einer bestimmten Stelle in dem Körper in einer unerwünscht hohen Menge lokalisiert vorliegen.
Zum Beispiel sind erhöhte Gehalte von TNF bei immunoregulatorischen und entzündlichen Störungen und bei septischem oder endotoxischem und kardiovaskulärem Schock beteiligt. Der Antikörper oder die Zusammensetzung kann bei der Therapie von Zuständen verwendet werden, die Sepsis, septischen oder endotoxischen Schock, Cachexie, das Respiratorische Distress-Syndrom bei Erwachsenen, Aids, Allergien, Psoriasis, Tuberkulose, entzündliche Knochenstörungen, Blutcoagulationsstörungen, Verbrennungen, Abstoßungsreaktionen im Anschluß an Organ- oder Gewebetransplantationen und Autoimmunerkrankungen, z.B. organspezifische Erkrankungen, wie etwa Thyroiditis, oder unspezifische Organerkrankungen, wie etwa rheumatoide und Osteo- Arthritis, umfassen.
Zusätzlich dazu kann der Antikörper oder die Zusammensetzung verwendet werden, um Nebenwirkungen, die im Zusammenhang mit der TNF-Bildung während einer neoplastischen Therapie stehen, zu verbessern und kann auch Schock-Symptome, die bei der Behandlung oder Verhinderung von Abstoßungen auftreten, zum Verschwinden bringen oder verbessern, indem ein antilymphozytischer Antikörper verwendet wird, oder sie können zur Behandlung von Multiorganversagen (MOF) eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten und humanisierten Antikörper und Zusammensetzungen dienen vorzugsweise zur Behandlung von Sepsis oder septischem/endotoxischem Schock.
Die Antikörper und Zusammensetzungen können in jeder geeigneten Form und Menge entsprechend der Therapie, für die sie eingesetzt werden, verabreicht werden. Das kann für prophylaktischen Einsatz sein, zum Beispiel unter Bedingungen, unter welchen eine Erhöhung des Gehalts an TNF zu erwarten ist, oder andererseits können sie zur Herabsetzung des Gehalts von TNF eingesetzt werden, nachdem dieser ein unerwünscht hohes Niveau erreicht hat oder wenn das Niveau im Anstieg begriffen ist.
Die therapeutische oder diagnostische Zusammensetzung kann in jeder zur Verabreichung geeigneten Form vorliegen und liegt vorzugsweise in einer Form vor, die für parenterale Verabreichung geeignet ist, wie durch Injektion oder Infusion, zum Beispiel durch Bolus-Injektion oder kontinuierliche Infusion. Wenn das Produkt für die Injektion oder Infusion bereitet wird, kann es die Form einer Suspension, einer lösung oder Emulsion in einem ligen oder wässerigen Träger annehmen und kann Formulierungsmittel, wie etwa Suspendiermittel, Konservierungsmittel, Stabilisatoren und/oder Dispergiermittel enthalten.
Andererseits kann der Antikörper oder die Zusammensetzung in trockener Form zur Rekonstitution vor der Verwendung mit einer geeigneten sterilen Flüssigkeit vorliegen.
Wenn der Antikörper oder die Zusammensetzung für die orale Verabreichung geeignet ist, z.B. im Fall von Antikörperfragmenten, kann die Formulierung zusätzlich zu dem Wirkstoff Additive enthalten, wie etwa: Stärke - z.B. Kartoffel-, Mais- oder Weizenstärke, oder Zellulose - oder Stärkederivate, wie etwa mikrokristalline Zellulose; Siliziumdioxid; verschiedene Zucker, wie etwa Lactose; Magnesiumcarbonat und/oder Kalziumphosphat. Es ist wünschenswert, wenn die Formulierung für eine orale Verabreichung gedacht ist, daß sie von dem Verdauungssystem des Patienten gut vertragen wird. Zu diesem Zweck kann es wünschenswert sein, Schleimbildner und Harze in die Fomulierung aufzunehmen. Es kann auch wünschenswert sein, die Verträglichkeit dadurch zu verbessern, daß der Antikörper oder die Zusammensetzungen in einer Kapsel formuliert werden, die in den Magensäften unlöslich ist. Ebenso kann es bevorzugt sein, den Antikörper oder die Zusammensetzung in einer Formulierung mit kontrollierter Abgabe aufzunehmen.
Die Antikörpermoleküle und Fragmente gemäß der vorliegenden Verbindung können in einem Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Patienten verwendet werden, der an einer Störung im Zusammenhang mit einem unerwünscht hohen Niveau von TNF leidet oder unter dem Risiko dafür steht, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge des Antikörpers oder der Zusammensetzung gemäß der Erfindung an den Patienten umfaßt. Insbesondere kann der menschliche oder tierische Patient an Sepsis oder septischem oder endotoxischem Schock leiden oder unter dem Risiko dafür stehen.
Die Dosis, mit welcher der Antikörper verabreicht wird, hängt ab von der Art des zu behandelnden Zustands, dem Grad, bis zu welchem der zu neutralisierende TNF über ein wünschenswertes Ausmaß hinweg angestiegen ist oder erwartungsgemäß ansteigen wird, und hängt davon ab, ob der Antikörper prophylaktisch oder zur Behandlung eines bestehenden Zustands verwendet werden soll. Auch wird die Dosis entsprechend dem Alter und der Verfassung des Patienten ausgewählt werden.
Somit liegen zum Beispiel dann, wenn das Produkt zur Behandlung oder der Prophylaxe von septischem Schock bestimmt ist, die Dosen des Antikörpers gegen den TNF im Bereich von 0,001-30 mg/kg/Tag, vorzugsweise 0,01-10 mg/kg/Tag und insbesondere vorzugsweise bei 0,1-2 mg/kg/Tag.
Die Antikörperprodukte können in der Diagnose verwendet werden, z.B. bei der in vivo Diagnose und der Sichtbarmachung von Krankheitszuständen, an denen erhöhte TNF-Gehalte beteiligt sind.
Die Erfindung wird weiters zum alleinigen Zweck der Erläuterung in den folgenden Beispielen beschrieben, die sich auf die angeschlossenen Diagramme, Figuren 1-6, beziehen.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt Aminosäuresequenzen für die variablen Bereiche von schweren und leichten Ketten für den humanen Akzeptor-Antikörper EU (1EU), den murinen MAb CB0010 (h t n f 1) sowie humanisierte CDR-gepfropfte leichte (gEU) und schwere (2hEUg) Ketten;
Figur 2 zeigt Aminosäuresequenzen für die Bereiche der variablen Region der humanen Akzeptor-Antikörper REI (1 r e i) für die leichte Kette und KOL (KOL) für die schwere Kette, der schweren und leichten Ketten des murinen MAb 101.4 (101/4) und humanisierter gepfropfter leichter und schwerer Ketten (beide mit der Bezeichnung g1014);
Figur 3 zeigt Aminosäuresequenzen für die Bereiche der variablen Region der humanen Akzeptor-Antikörper REI (REI) für die leichte Kette und KOL (KOL) für die schwere Kette, der schweren und leichten Ketten des murinen MAb CB0006 (CB6) und humanisierter gepfropfter leichter und schwerer Ketten (beide mit der Bezeichnung gCB6);
Figur 4 zeigt Aminosäuresequenzen für die Bereiche der variablen Region der humanen Akzeptor-Antikörper REI (REI) für die leichte Kette und KOL (KOL) für die schwere Kette, der schweren (HTNF3) und leichten (hTNF3) Ketten des murinen MAb hTNF3 und humanisierter gepfropfter leichter (gHTNF3) und schwerer (ghTNF3) Ketten;
Figur 5 zeigt eine graphische Darstellung, die die Fähigkeit von murinem CB0010 (hTNF1) und CDR-gepfropftem CB0010 (GrhTNF1; CDP571) in der Konkurrierung mit HRP-konjugiertem murinem hTNF1 um die Bindung an rekombinanten humanen TNFα zeigt, und
Figur 6 zeigt eine graphische Darstellung, die die Fähigkeit von murinem HTNF1 (CB0010) und CDR-gepfropftem HTNF1 (CP571) zur Neutralisation von rekombinantem TNFα in dem Bioassay L929 vergleicht.

Detaillierte Beschreibung der Ausführungformen der Erfindung

Beispiel 1

CDR-Pfropfung von murinen Anti-TNFα Antikörpern

Eine Anzahl muriner anti-human TNFα MAbs wurde im wesentlichen nach der detaillierten Beschreibung in WO91/09967 für die CDR-Pfropfung von murinem anti-CD3 Antikörper OKT3 CDR-gepfropft. Hier und in den anschließenden Beispielen wurden die chimärischen und CDR-gepfropften humanisierten Antikörper unter Verwendung der Bereiche der konstanten Region von humanem IgG4 im wesentlichen nach der Beschreibung der Herstellung von gamma4 chimärischen und CDR-gepfropften OKT3 Antikörpern in WO91/09967 hergestellt. Es ist jedoch ersichtlich, daß Bereiche humaner konstanter Regionen anderer Typen und Isotypen, z.B. IgG1, IgG2 und IgG3, ebenso verwendet werden hätten können, ohne daß die oben beschriebenen Verfahrensbedingungen wesentlich verändert würden.
Diese Anti-hTNFα Antikörper umfaßten die murinen MAbs mit der Bezeichnung CB0006 (auch bekannt als 61E71), CB0010 (auch bekannt als hTNF1), hTNF3 und 101.4. Eine kurze Zusammenfassung der CDR-Pfropfung jedes dieser Antikörper wird im folgenden angegeben.

CB0006

Eine ähnliche Analyse, wie sie in Beispiel 1, Abschnitt 12.1. der WO91/09967 beschrieben wurde, wurde für CB0006 durchgeführt und für die schwere Kette wurden 10 Rahmenreste an den Positionen 23, 24, 48, 49, 68, 69, 71, 73, 75 und 88 als Reste identifiziert, die möglicherweise als murin beizubehalten sind. Die humanen Rahmen, die zur CDR-Pfropfung dieses Antikörpers gewählt wurden, und die Antikörper hTNF3 und 101.4 waren RE1 für die leichte Kette und KOL für die schwere Kette. Die Aminosäuresequenzen der variablen Bereiche von murinem CB0006 (CB6) (schwer und leicht), REI (REI) leichte und KOL (KOL) schwere Kette sind in Figur 3 angegeben.
Es wurden drei Gene aufgebaut, von denen das erste für die Aminosäurereste 23, 24, 48, 49, 71 und 73 [gH341(6)] als murine Reste codierte. Die Aminosäuresequenz des von diesem ersten Gen codierten variablen Bereichs ist als gCB6 in der Zusammenfassung der schweren Kette in Figur 3 gezeigt. Auch das zweite Gen hatte Aminosäurereste 75 und 88 als murine Reste [gH341(8)], während das dritte Gen zusätzlich Aminosäurereste 68, 69, 75 und 88 als murine Reste [gH341(10)] aufwies. Jedes davon wurde mit gL221, der minimalen gepfropften leichten Kette (nur CDRs), dargestellt als gCB6 in der Zusammenfassung der schweren Kette in Figur 3, co-exprimiert. Die Antikörper gL221/gH341(6) und gL221/gH341(8) banden sowohl an TNF als auch an murinen 61E71. Der Antikörper gL221/gH341(10) exprimierte nicht und diese Kombination wurde nicht weiter verwendet.
Anschließend wurde der Antikörper gL221/gH341(6) in einem L929 Zellkompetitionsassay untersucht, in welchem der Antikörper mit dem TNF-Rezeptor an L929 Zellen um die Bindung an TNF in Lösung konkurriert. Bei diesem Assay war der Antikörper gL221/gH341(6) zu etwa 10 % so aktiv wie muriner CB0006.

CBOO10 (auch bekannt als hTNF1)

CB0010 ist ein monoklonaler Antikörper, der ein Epitop von humanem TNF-α erkennt. Der humane EU-Rahmen wurde zur CDR-Pfropfung sowohl der schweren als auch der leichten variablen Bereiche verwendet. Die Aminosäuresequenzen der schweren und leichten variablen Bereiche von EU (EU), CB0010 (h t n f 1) und der gepfropften Versionen von CB0010 (gEU, leicht; 2hEUg, schwer) sind in Figur 1 gezeigt.

Schwere Kette

In der CDR-gepfropften schweren Kette wurden murine CDRs an den Positionen 26-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) und 95-102 (CDR3) verwendet. Mausreste wurden auch in den Rahmen an den Positionen 48, 67, 69, 71, 73, 76, 89, 91, 94 und 108 verwendet. Ein Vergleich der TNF1 Maus- und EU humanen schweren Kettenreste zeigt, daß diese an den Positionen 23, 24, 29 und 78 identisch sind.

Leichte Kette

In der CDR-gepfropften leichten Kette wurden murine CDRs an den Positionen 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) und 89-97 (CDR3) verwendet. Zusätzlich wurden Mausreste in den Rahmen an den Positionen 3, 42, 48, 49, 83, 106 und 108 verwendet. Ein Vergleich der hTNF1 Maus- und EU humanen Leichtkettenreste zeigt, daß diese an den Positionen 46, 58 und 71 identisch sind.
Die gepfropfte CB0010 schwere Kette wurde mit der chimärischen leichten Kette co-exprimiert und die Bindungsfähigkeit des Produkts in einem TNF-Bindungsassay urde mit der des Produkts aus chimärischer leichter Kette/chimärischer schwerer Kette verglichen. Das gepfropfte Schwerkettenprodukt schien eine etwas bessere Bindungsfähigkeit für TNF als das vollständig chimärische Produkt zu besitzen.
In ähnlicher Weise wurde ein Produkt aus gepfropfter schwerer Kette/gepfropfter leichter Kette co-exprimiert und mit dem vollständig chimärischen Produkt verglichen und es zeigte sich, daß es mit dem letztgenannten Produkt sehr ähnliche Bindungseigenschaften aufwies. Wenn jedoch das gepfropfte Schwerketten/gepfropfte Leichtketten-Produkt in dem L929 Assay untersucht wurde (vgl. Beispiel 4), wurde gefunden, daß es nur die halbe Aktivität des chimärischen Produktes aufwies. Daher wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, weitere CDR-Pfropfversuche durchgeführt.

hTNF3

hTNF3 erkennt ein Epitop auf humanem TNF-α Die Sequenz des hTNF3 zeigt nur 21 Unterschiede im Vergleich zu CB0006 in den variablen Regionen von leichter und schwerer Kette, 10 in der leichten Kette (2 in den CDRs an den Positionen 50, 96 und 8 in dem Rahmen bei 1, 19, 40, 45, 46, 76, 103 und 106) und 11 in der schweren Kette (3 in den CDR-Regionen an den Positionen 52, 60 und 95 und 8 in dem Rahmen bei 1, 10, 38, 40, 67, 73, 87 und 105). Die Aminosäuresequenzen der variablen Bereiche der leichten und schweren Kette von hTNF3 (Htnf3, leicht; hTNF3, schwer), CDR-gepfropftem hTNF3 (gHTNF3, leicht; gHTNF3, schwer) und REI (REI, leicht) und KOL (KOL, schwer) sind in Figur 4 gezeigt. Die leichten und schweren Ketten der chimärischen Antikörper CB0006 und hTNF3 können ohne Verlust der Aktivität in dem direkten Bindungsassay ausgetauscht werden. CB0006 ist jedoch im Vergleich zu hTNF3 um eine Größenordnung weniger imstande, mit dem TNF Rezeptor an L929 Zellen um TNF-α zu konkurrieren. Auf der Basis der CB0006 CDR-Pfropfdaten wurden die Gene gL221 und gH341(+23, 24, 48, 49, 71 und 73 als Maus) für hTNF3 aufgebaut und untersucht und der entstehende gepfropfte Antikörper bindet gut an TNF-a, konkurriert jedoch nur sehr wenig im L929 Assay. Das gL221 Gen codiert für gHTNF3 und das gH341 etc. Gen codiert für die Sequenzen des ghTNF3 variablen Bereichs, wie in Figur 4 gezeigt ist. Es ist anzunehmen, daß in diesem Fall andere Rahmenreste ausgetauscht werden müssen, um die kompetitive Bindungsfähigkeit dieses Antikörpers zu verbessern.

101.4

101.4 ist ein weiterer muriner MAb, der imstande ist, humanen TNF-α zu erkennen. Die schwere Kette dieses Antikörpers zeigt gute Homologie mit KOL und so beruhte die CDR-Pfropfung auf RE1 für die leichte Kette und auf KOL für die schwere Kette. Die Aminosäuresequenzen des schweren und leichten variablen Bereichs von 101.4 (101/4) und eine CDR-gepfropfte Version von 101.4 (g1014) und die variablen Bereiche von REI leichter Kette (l r e i) und KOL schwerer Kette (KOL) sind in Figur 2 angegeben. Verschiedene gepfropfte Gene für schwere Ketten wurden mit konservativer Auswahl für die CDRs konstruiert (gH341) und haben einen oder eine geringe Anzahl von Nicht-CDR-Resten an den Positionen 73, 78 oder 77-79 inklusive als Maus-Aminosäuren. Diese wurden mit der chimärischen leichten Kette oder der Kabat CDR-gepfropften leichten Kette co-exprimiert. In allen Fällen wird eine Bindung an TNF, die dem chimänschen Antikörper äquivalent ist, beobachtet und bei Co-Expression mit cL sind die entstehenden Antikörper imstande, in dem L929 Assay gut zu konkurrieren. Mit gL221 sind die entstehenden Antikörper jedoch mindestens um eine Größenordnung weniger imstande, mit dem TNF-Rezeptor um TNF auf L929 Zellen zu konkurrieren.
Es wurde aufgezeigt, daß Mausreste an anderen Positionen in der schweren Kette, zum Beispiel bei 23 und 24 gemeinsam oder bei 76, keine Verbesserung in der kompetitiven Fähigkeit des gepfropften Antikörpers in dem L929 Assay ergaben.

Beispiel 2

Weitere CDR-Pfropfung der murinen anti-human TNFα Antikörper CB0010 und 101.4

Murine monoklonale anti-human TNFα Antikörper CB0010 und 101.4 wurden, im wesentlichen nach der Beschreibung in WO91/09667, weiter CDR-gepfropft.

CB0010

CB0010 ist ein monoklonaler Antikörper, der ein Epitop auf humanem TNF-α erkennt. Der humane EU Rahmen wurde für die CDR-Pfropfung der variablen Bereiche sowohl der schweren als auch leichten Kette verwendet.
Die Aminosäuresequenzen der variablen Bereiche der schweren und leichten Kette des EU Akzeptors, des murinen Donors CB0010 (h t n f 1) und der CDR- gepftopften Antikörper (gEU, leichte Kette und 2hEUg, schwere Kette) sind in Figur 1 angegeben.

Schwere Kette

In der CDR-gepfropften schweren Kette (2hEUg) wurden Maus-CDRs an den Positionen 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) und 95-102 (CDR3) verwendet.
Maus-Reste wurden auch in den Rahmen an den Positionen 12, 27, 30, 38, 46, 48, 66, 67, 69, 71, 73, 76, 83, 89, 91, 94 und 108 verwendet. Der Vergleich der Reste der schweren Kette von CB0010 Maus und EU human zeigt, daß diese an den Positionen 23, 24, 29 und 78 identisch sind.

Leichte Kette

In der CDR-gepfropften leichten Kette (gEU) wurden Maus-CDRs an den Positionen 24-34 (CDR1), 50-65 (CDR2) und 89-97 (CDR3) verwendet. Zusätzlich dazu wurden Maus-Reste in den Rahmen an den Positionen 3, 42, 48, 49, 106 und 108 verwendet. Der humane Consensus-Rest (Valin) wurde an der Position 83 verwendet. Ein Vergleich der Reste der leichten Kette von CB0010 Maus und EU human zeigt, daß diese an den Positionen 46, 58 und 71 identisch sind.
Die gepfropfte CB0010 schwere Kette wurde mit der chimärischen leichten Kette co-exprimiert und die Bindungsfähigkeit des Produkts wurde mit der des Produkts aus chimärischer leichter Kette/chimärischer schwerer Kette in einem TNF-Bindungs- assay verglichen. Das gepfropfte Schwerkettenprodukt schien eine Bindungsfähigkeit für TNF aulzuweisen, die geringfügig besser als die des vollständig chimärischen Produktes war.
In ähnlicher Weise wurde ein gepfropftes Schwerketten/gepfropftes Leichtketten-Produkt co-exprimiert und mit dem vollständig chimärischen Produkt verglichen und es zeigte sich, daß es mit dem letztgenannten Produkt ganz ähnliche Bindungseigenschaften aufwies. Die spezifische Kombination von gepfropfter leichter Kette (gEU) und gepfropfter schwerer Kette (2hEUg), wie sie in Figur 1 gezeigt ist, liefert den Antikörper, der als CDP571 bekannt ist. Der murine CB0010 (CB0010), der chimärische CB0010 (chimärischer CB0010) und das Produkt aus gepfropfter schwerer Kette/gepfropfter leichter Kette (CDP571) wurden in einem Standardassay hinsichtlich der Bindung an humanen TFNα verglichen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle, ausgedrückt als KD (pM), der für jeden Antikörper gemessen wurde, angegeben.
Antikörper KD (pM)
CB0010 80
Chimärischer CB0010 81
CDP571 87
Das vollständig gepfropfte Antikörperprodukt (CDP571) ist deizeit in vorklinischer Entwicklung zur Behandlung des Sepsis-Syndroms und der akuten Transplantatabstoßung.

101.4

101.4 ist ein weiterer muriner MAb, der imstande ist, humanen TFNα zu erkennen. Die schwere Kette dieses Antikörpers zeigt gute Homologie mit KOL und somit beruhte die CDR-Pfropfung auf REI für die leichte Kette und KOL für die schwere Kette. Es wurde ein verbessertes CDR-gepfropftes Produkt hergestellt. Die Aminosäuresequenzen der variablen Bereiche für REI (rei, leichte Kette), KOL (KOL, schwere Kette) murinen 101.4 (101/4, schwere und leichte Kette) und vollständig gepfropften Antikörper (g1014, schwere und leichte Kette) sind in Figur 2 dargestellt.

Schwere Kette

In der CDR-gepfroplten schweren Kette (g1014) wurden Maus-CDRs an den Positionen 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) und 95-102 (CDR3) verwendet. Maus- Reste wurden auch in dem Rahmen an den Positionen 4, 11, 23, 24, 28, 73, 77, 78, 79, 91, 93, 94 und 108 verwendet.

Leichte Kette

In der CDR-gepfropften leichten Kette (g1014) wurden Maus-CDRs an den Positionen 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) und 89-97 (CDR3) verwendet. Zusätzlich dazu wurden Maus-Reste in dem Rahmen an den Positionen 1, 3, 4, 39, 73, 105 und 107 verwendet. Der humane Consensus-Rest (Valin) wurde an der Position 104 verwendet.
Die vollständig gepfropften schweren und leichten Ketten (g1014) wurden co-exprimiert und ihre Bindung an TNF wurde mit murinem und chimärischem 101.4 und auch dem vollständig gepfropften CB0010 Antikörper (gEU/2hEUg, CDP571) verglichen. Es zeigte sich, daß der vollständig gepfropfte 101.4 Antikörper Bindungseigenschaften für humanen TNFα hatte, die ähnlich den murinen, chimärischen und gepfropften CB0010 Antikörpern waren.

Beispiel 3

In vitro Vergleich von murinen und CDR-gepfropften Antikörpern A. Affinitätsmessungen für murinen CB0010 und CDP571

Materialien und Verfahren

Materialien:

PBS/BSA: Dulbeccos PBS + 1 % (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin.
TNF: 50 nM rek. humaner TNF-α (Bissendorf Biochemicals), 0,85 µg/ml in PBS/BSA.
Ansatzlösung ¹²&sup5;I-TNF: 5 µCi, 185 kBq (Amersham International), gelöst in 500 µl Wasser und bei -70ºC aufbewahrt.
Arbeitslösung ¹²&sup5;I-TNF: -62 pM für die Titrationskurve und 124 pM fur die Scatchard- Analyse, in PBS/BSA.
Antikörper: Gereinigter muriner CB0010 (mHTNFI) und CDP571 wurden quantitativ bestimmt mit A280 nm (E&sub1; mg/ml, 280 nm=1.4) und auf eine Konzentration von 1 µg/ml zur Titration oder von 200 mg/ml für die Scatchard-Analyse verdünnt. Ziegen anti-murin IgG Ganzmolekül-Agarose oder Ziegen anti-human IgG Ganzmolekül-Agarose (Sigma) wurden unverdünnt verwendet.

Verfahren:

Antikörpertitration: mHTNF1 und CDP571 wurden in Doppelverdünnungen (jeweils 100 µl) titriert, um insgesamt 16 Proben zu ergeben, und es wurde ¹²&sup5;I-TNF (100 µl, 62pM) zugesetzt. Die endgültige obere Konzentration des Antikörpers betrug 500 ng/ml und ¹²&sup5;I-TNF betrug 31 pM. Kontrollröhrchen (8) enthielten jeweils nur ¹²&sup5;I-TNF und PBS/BSA. Die Proben wurden über Nacht zur Äquilibrierung bei Raumtemperatur unter Schütteln stehengelassen. Nach der Äquilibrierung wurden 25 µl Ziegen Anti-Maus- Agarose zu den mHTNF1 Proben zugesetzt und es wurden 50 µl Ziegen anti-human Perlen zu den CDP571 Proben zugesetzt, mit Ausnahme der totalen ¹²&sup5;I-TNF-Vergleiche. Unspezifische Absorption von ¹²&sup5;I-TNF an die Agaroseperlen wurde korrigiert, indem Perlen zu vier der Kontrollproben zugesetzt und die Zählwerte im Überstand für diese Proben mit jenen verglichen wurden, die PBS/BSA anstelle der Perlen enthielten. Nach einstündiger Äquilibrierung bei Raumtemperatur wurde PBS/BSA (0,5 ml) zugesetzt und die Proben wurden bei 1500 Upm 10 Min. bei 20ºC zentrifügiert. Der Überstand (0,5 ml) wurde abgetrennt und die Radioaktivität in einem Gammazähler bestimmt.
Die Bestätigung, daß sich ¹²&sup5;I-TNF in diesem Assay ähnlich verhielt wie das ungekennzeichnete Material, erfolgte durch Vornahme der Antikörpertitration in Gegenwart von Mischungen des ¹²&sup5;I-TNF mit ungekennzeichnetem TNF (zu 25 % und 75 % ¹²&sup5;I-TNF) mit der gleichen Gesamtkonzentration.
Scatchard-Analyse: Für beide Antikörper wurde ungekennzeichneter TNF (100µl, 50 nM) doppelt titriert in 13 Doppelverdünnungen. Eine Probe, die anstelle von TNF PBS/BSA enthielt, wurde für jeden Antikörper vorgesehen. ¹²&sup5;I-TNF (50 µl, 124pM) wurde zu jeder Probe zugesetzt. Anschließend wurde eine konstante Menge des Antikörpers, bestimmt aus der Titrationskurve (50 µl, 200 ng/ml) zugesetzt.
Dies ergab die folgenden endgültigen Konzentrationen: Antikörper 50 ng/ml; TNF 25 nM obere Konzentration; ¹²&sup5;I-TNF 31 pM. Die Proben wurden über Nacht äquilibrieren gelassen und dann genau so wie für die Proben der Antikörpertitration behandelt.

Berechnungen

Titrationskurven

Gebundener ¹²&sup5;I-TNFcpm = NSB cpm - Überstand cpm
Gebundener ¹²&sup5;I-TNF cpm
---- = BT
Gesamt ¹²&sup5;I-TNF
NSB = Blindprobe für unspezifische Absorption, Überstand cpm
Gesamt = Gesamtzähler für nur ¹²&sup5;I-TNF
B/T wurde gegen die Antikörperkonzentration aufgetragen und die geeignete Antikörper konzentration für die Verwendung in den Scatchard-Analysen wurde bei B/T = 0,6 gewählt.

Scatchard-Analyse

Es wurde durchwegs der Mittelwert von Doppelbestimmungen verwendet.
NSB = Gesamt cpm - NSB Überstand cpm
Freie cpm = Proben-cpm + NSB
Anteil an freiem TNF = Frei/Gesamt (F/T) =
Proben-cpm + NSB-cpm 1-F/T
---- = B/F = ----
Gesamt-cpm F/T
B/F wurde gegen den gebundenen TNF aufgetragen, um die Neigung von -1/Kd zu ergeben, aus welcher Kd berechnet wurde.

ERGEBNISSE

Dissoziationskonstanten für murinen CB0010 und CDP571

B. Konkurrenz von murinem CB0010 (Muhtnfl) und CDP571 (GrhTNF1) mit HRP konjugiert in murinem CB0010 um die Bindung an rhuTNF

Verfahren

Eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Nunc, Maxisorb) wurde mit 100 µl(Vertiefung TNF bei 0,5 µg/ml beschichtet.
Serienverdünnungen von murinem oder gepfropftem Antikörper wurden unter Verwendung des Verdünnungsmittels PBS/1 % BSA von 200 µg/ml bis 0,01 µl/ml hergestellt. Es wurden 50 µl Antikörper zu jeder Vertiefung und anschließend 50µl HRP- muriner CB0010 mit 3 Konzentrationen (0,625, 0,315 und 0,16µg/ml) zugesetzt. Die Platten wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Bewegung inkubiert, viermal mit PBS gewaschen und mit 100 µl TMB-Substrat versetzt.
Es wurde die optische Dichte gemessen und die Werte für OD gegen die Antikörperkonzentration aufgetragen.

Schlußfolgerungen

Die Kurven sowohl für murinen Antikörper (MuhTNF1) als auch gepfropften Antikörper (GrhTNF1) sind übereinander zu legen, was daraufhindeutet, daß beide Antikörper mit ähnlicher Affinität um die Bindung an TNF konkurrieren (vgl. Figur 5).

Beispiel 4 Vergleich von murinen CB0010 und CDR-gepfropften CDP571 Antikörpern im Bioassay und in Tier-Modellversuchen

A. Neutralisation von TNF durch CB0010 und CDP571 in dem L929 Assay

Die Fähigkeit des parenten murinen Antikörpers CB0010 (hTNF1) und des CDR-gepfropften Antikörpers CDP571 zur Neutralisation von rekombinantem humanem TNF wurde unter Verwendung des L929 Bioassays bestimmt. Der Assay verwendet die L929 Maus-Fibroblastoid-Zell-Linie, die durch TNF getötet wird. Der Assay wird in Gegenwart von 1 µg/ml Actinomycin D durchgeführt, welches die Zellen gegenüber TNF empfindlicher macht. Die Serienverdünnung der beiden Antikörper wurde mit einer konstanten Menge des rekombinanten humanen TNF (100 pg/ml) gemischt und zu einer Monoschicht von L929 in Platten mit 96 flachbödigen Vertiefungen zugesetzt. Nach einer Inkubationszeit von 16 Stunden wurden die Zellen, die durch den TNF nicht getötet wurden, festgestellt, wobei der Farbstoff Kristailviolett verwendet wurde. Die offensichtliche Menge des TNF, der nicht neutralisiert wurde (restlicher TNF) wurde durch Vergleich mit einer Standardkurve für rekombinanten TNF bestimmt. Die Ergebnisse eines repräsentativen Versuchs, wo restlicher TNF gegen die Antikörperkonzentration aufgetragen wurde, sind in Figur 6 dargestellt. Es ist ersichtlich, daß CB0010 und CDP571 ähnliche Neutralisationswirkungen aufweisen.

B. Wirkung von CDP571 im Pavian-Sepsis-Modell

Bei dieser Studie wurde die Wirkung der vorhergehenden Behandlung mit CDP571 auf die physiologischen Konsequenzen schwerer Sepsis (inklusive Tod) untersucht. Als relevante Spezies für diese Studie wurden Paviane ausgewählt, da es bekannt ist, daß CDP571 Pavian-TNF neutralisiert.
Männliche erwachsene Paviane, Papio ursinus, mit einem Gewicht von 20-25 kg wurden mit Ketamin-Hydrochlorid und Natrium-Pentaparbiton narkotisiert und für die Messung des Blutdrucks, des Cardialindex (durch Tilermoverdünnung), von ECG und rechten arteriellen Füllungsdrücken mit Instrumenten versehen. Eine Infusion mit Salzlösung allein oder mit Antikörper wurde dann während 120 Minuten mit einer Geschwindigkeit von 2,5 ml/kg/h verabreicht, worauf eine weitere 120 Minuten dauernde Infusion von lebendem E. coli mit der gleichen Infüsionsgeschwindigkeit verabreicht wurde. Der verwendete Bakterienstamm war der Stamm Hinshaw B7 ([086a:61], ATCC 33985), der während der logarithmischen Wachstumsphase mit einer Dosis von 2x10&sup9; CFU/kg verabreicht wurde und eine Plasmakonzentration von 2-2,5x10&sup5; CFU/ml am Ende der Infusion ergab. Im Anschluß an weitere 120 Minuten wurden die Tiere in ihre üblichen Käfige zurückgebracht, erhielten freien Zugang zu Nahrung und Wasser und wurden zweimal pro Tag 3 Tage lang auf cardiovaskuläre Veränderungen überwacht. Allen Tieren wurde eine konstante Fluidersatz-Infusion von 5 ml/kg/h verabreicht, die erforderlichenfalls eingestellt wurde, um die entsprechenden Füllungsdrücke am rechten Herzen aufrechtzuerhalten. Paviane, die während der Behandlung starben oder die 72 Stunden Versuchszeit überlebten und dann getötet wurden, wurden seziert. Alle größeren Organe wurden auf grobe makropathologische Schädigung nach einer semi-quantitativen Bestimmung untersucht (+++ ist am stärksten).
Die Tiere wurden nach dem Zufallsprinzip einer der vier Behandlungsgruppen zugeteilt;
-nur Salzlösung
-CDP571 0,1 mg/kg
-CDP571 1,0 mg/kg
-CB0010 0,1 mg/kg (parenter muriner Antikörper)
Die Mengen der Überlebenden und der kumulativen Organschädigung sind in Tabelle 1 angegeben. CDP571 mit 1,0 mg/kg verhinderte den Tod und setzte das Auftreten von Organschädigung in diesem M6dell signifikant herab (P< 0,005); außerdem waren diese Wirkungen dosisabhängig (P< 0,005). Zusätzlich dazu war die Überlebensrate und die Organschädigung, die bei CB0010 beobachtet wurde, ähnlich den Werten, die mit CDP571 bei der gleichen Dosis erhalten wurden, was auf eine aufrechterhaltene in vivo Potenz von CDP571 im Vergleich zu seinem parenten murinen Antikörper hindeutet. PAVIAN SEPSIS STUDIE ÜBERLEBEN NACH VERABREICHUNG VON 2X10&sup9; CFU E.Coli GEGEBEN IV 2H NACH SALZLÖSUNG ODER CDP 571 BEHANDLUNG NR TOT ÜBERLEBT PROZENT ÜBERLEBENDE ORGAN PATHOL. SALZLÖSUNG

Literaturstellen

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3. Jeffers et al. (1986), Transplantation, 41, 572-578.
4. Begent et al., Br. 3. Cancer 62: 487 (1990).
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7. Kabat, E.A., Wu, T.T., Reid-Miller, M., Perry, H.M., Gottesman, K.S., 1987, in "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health an Human Services, NIH, USA.
8. Wu, T.T., und Kabat, E.A., 1970, J. Exp. Med. 132, 211-250.
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10. Tempest et al. (1991), Biotechnology, 9, 266-271.
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13. Primrose und Old, "Principles of Gene Manipulation", Blackwell, Oxford, 1980.
14. Jones et al. (1986), Nature, 321, 522.

Claims

1. Ein Antikörpermolekül mit Spezifität für humanen TNFα, welches eine zusammengesetzte schwere Kette und eine komplementäre leichte Kette umfaßt, wobei die zusammengesetzte schwere Kette einen variablen Bereich hat, der hauptsächlich Rahmenreste einer schweren Kette eines humanen Akzeptor-Antikörpers und Antigenbindungsreste einer schweren Kette eines Donor-Antikörpers umfaßt und der Donor-Antikörper Spezifität für den humanen TNFα hat, in welchem Antikörpermolekül gemäß dem Kabat- Numerierungssystem in der genannten zusammengesetzten schweren Kette zumindest die Aminosäurereste 23, 24, 31 bis 35, 49 bis 65 und 95 bis 100 Donor-Reste sind.

2. Das Antikörpermolekül nach Anspruch 1, in welchem die Aminosäurereste 71, 73 und 78 in der genannten zusammengesetzten schweren Kette zusätzlich Donor-Reste sind.

3. Das Antikörpermolekül nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in welchem die Aminosäurereste 6, 37, 48 und 94 zusätzlich Donor-Reste sind.

4. Das Antikörpermolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in welchem die Aminosäurereste 2, 4, 25, 36, 39, 47, 93, 103, 104, 106 und 107 zusätzlich Donor-Reste sind.

5. Das Antikörpermolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in welchem die Aminosäurereste 26 bis 30 zusätzlich Donor-Reste sind.

6. Ein Antikörpermolekül mit Spezifität für humanen TNFα, das eine zusammengesetzte leichte Kette und eine komplementäre schwere Kette umfaßt, wobei die zusammengesetzte leichte Kette einen variablen Bereich hat, der hauptsächlich Rahmenreste einer leichten Kette eines humanen Akzeptor-Antikörpers und Antigenbindungsreste einer leichten Kette eines Donor-Antikörpers umfaßt und der Donor-Antikörper Spezifität für den humanen TNFα hat, in welchem Antikörpermolekül gemäß dem Kabat-Numerierungssystem in der genannten zusammengesetzten leichten Kette zumindest die Aminosäurereste 24 bis 34, 46, 47, 50 bis 56 und 89 bis 97 Donor-Reste sind.

7. Ein Antikörpermolekül mit Spezifität für humanen TNFα, das eine zusammengesetzte leichte Kette und eine komplementäre schwere Kette umfaßt, wobei die zusammengesetzte leichte Kette einen variablen Bereich hat, der hauptsächlich Rahmenreste einer leichten Kette eines humanen Akzeptor-Antikörpers und Antigenbindungsreste einer leichten Kette eines Donor-Antikörpers umfaßt und der Donor-Antikörper Spezifität für den humanen TNFα hat, in welchem Antikörpermolekül gemäß dem Kabat-Numerierungssystem in der genannten zusammengesetzten leichten Kette zumindest die Aminosäurereste 24 bis 34, 46, 48, 50 bis 56, 58, 71 und 89 bis 97 Donor-Reste sind.

8. Das Antikörpermolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in welchem die komplementäre leichte Kette eine zusammengesetzte leichte Kette ist, die einen variablen Bereich hat, der hauptsächlich Rahmenreste einer leichten Kette eines humanen Akzeptor-Antikörpers und Antigenbindungsreste einer leichten Kette eines Donor-Antikörpers umfaßt, in welchem Antikörpermolekül gemäß dem Kabat-Numerierungssystem in der genannten zusammengesetzten leichten Kette zumindest die Aminosäurereste 24 bis 34, 46, 47, 50 bis 56 und 89 bis 97 Donor-Reste sind.

9. Das Antikörpermolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in welchem die komplementäre leichte Kette eine zusammengesetzte leichte Kette ist, die einen variablen Bereich hat, der hauptsächlich Rahmenreste einer leichten Kette eines humanen Akzeptor-Antikörpers und Antigenbindungsreste einer leichten Kette eines Donor-Antikörpers umfaßt, in welchem Antikörpermolekül gemäß dem Kabat-Numerierungssystem in der genannten zusammengesetzten leichten Kette zumindest die Aminosäurereste 24 bis 34, 46, 48, 50 bis 56, 58, 71 und 89 bis 97 Donor-Reste sind.

10. Das Antikörpermolekül nach einem der Ansprüche 6 bis 9, in welchem die Aminosäurereste 2, 4, 6, 35, 36, 38, 44, 47, 49, 62, 64 bis 69, 85, 87, 98, 99, 101 und 102 in der genannten leichten Kette zusätzlich Donor-Reste sind.

11. Das Antikörpermolekül nach Anspruch 10, in welchem die Aminosäurereste 1, 3, 10 bis 12, 21, 37, 40, 45, 60, 63, 70, 73, 83, 103 und 105 in der genannten leichten Kette zusätzlich Donor-Reste sind.

12. Eine therapeutische Zusammensetzung, die das Antikörpermolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 11 in Kombination mit einem pharmazeutisch verwendbaren Träger umfaßt.

13. Das Antikörpermolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder die therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12 zur Verwendung in einem therapeutischen Verfahren, bei welchem der Antikörper in einer zur Neutralisation von TNFα wirksamen Menge an einen Menschen verabreicht wird.

14. Das Antikörpermolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder die therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12 zur Verwendung bei der Behandlung von rheumatoider Arthritis.