NL9120013A - Recombinant antilichamen die specifiek zijn voor tnf-alfa. - Google Patents

Description

RECOMBINANT ANTILICHAMEN DIE SPECIFIEK ZIJN VOOR TNF-Ot

De uitvinding heeft betrekking op recombinant antilichaammoleculen, in het bijzonder gehumaniseerde antilichaammoleculen, die specifiek zijn voor antigene determinanten van tumornecrosefactor α (TNF-α), op werkwijzen voor de vervaardiging daarvan onder toepassing van recombinant-DNA-techniek en op therapeutische toepassingen daarvan.

In de onderhavige beschrijving wordt de uitdrukking "recombinant antilichaammolecuul" gebruikt om een antilichaammolecuul te beschrijven dat geproduceerd is door een werkwijze welke de toepassing van recombinant-DNA-technieken omvat, met inbegrip van analoga van natuurlijke immunoglobulines of fragmenten daarvan.

In de onderhavige beschrijving wordt de uitdrukking "gehumaniseerd antilichaammolecuul" gebruikt om een molecuul te beschrijven dat een antigeen-bindingsplaats heeft afkomstig van een niet-menselijk immunoglobuline en waarvan de overige immunoglobuline-delen van het molecuul afkomstig zijn van een menselijk immunoglobuline. Gehumaniseerde antilichaammoleculen omvatten derhalve gehumaniseerde chimere antilichaammoleculen die bestaan uit volledige, niet-menselijke variabele gebieden van de zware en/of lichte keten, gekoppeld aan menselijke constante gebieden. Gehumaniseerde antilichaammoleculen omvatten ook CDR-geënte gehumaniseerde antilichaammoleculen die een of meer CDRs van een niet-menselijk antilichaam geënt in het raamwerk van een variabel gebied van de zware en/of lichte keten van de mens omvatten.

De bindingsspecificiteit van antilichamen voor antigeen wordt bepaald door hun complementariteit-bepalende gebieden ("complementarity determining regions"; CDRs) die relatief korte peptidesequenties zijn en aanwezig zijn op de raamwerkgebieden van de variabele gebieden. Er zijn drie CDRs (CDR1, CDR2 en CDR3) in elk van de variabele gebieden van de zware en lichte keten.

De afkorting "MAb" wordt gebruikt om een monoclo-naal antilichaam aan te geven. In de onderhavige beschrijving wordt verwezen naar een aantal publicaties, en een lijst van deze publicaties wordt aan het eind van de beschrijving gegeven.

Natuurlijke immunoglobulines zijn reeds vele jaren bekend, evenals de verschillende fragmenten daarvan, zoals de Fab-, Fv-, (Fab')2- en Fc-fragmenten, die verkregen kunnen worden door enzymatische splitsing. Natuurlijke immunoglobulines bestaan uit een in het algemeen Y-vormig molecuul met een antigeen-bindingsplaats aan het eind van elke arm. De rest van de structuur, en in het bijzonder de stam van de Y, speelt een rol bij de effector-functies die door immunoglobulines worden vervuld.

Natuurlijke immunoglobulines zijn gebruikt in bepalingsmethoden, bij diagnose en in beperkte mate bij therapie. Dergelijke toepassingen, in het bijzonder bij therapeutische toepassingen, werden tot kort geleden echter bemoeilijkt door de polyclonale aard van natuurlijke immunoglobulines. Een belangrijke stap naar de verwezenlijking van de mogelijkheden van immunoglobulines als therapeutische middelen was de ontdekking van methoden voor de reproduceerbare productie van monoclonale antilichamen (MAbs) met een gedefinieerde specificiteit (1).

De meeste MAbs worden echter geproduceerd door hybridoma's die fusies zijn van miltcellen van knaagdieren met myelomacellen van knaagdieren. Zij zijn dan ook in wezen proteïnes van knaagdieren. Er zijn zeer weinig rapporten over de productie van menselijke MAbs.

Aangezien de meeste beschikbare MAbs afkomstig zijn van knaagdieren, zijn zij van nature antigeen voor mensen en kunnen derhalve aanleiding geven tot een ongewenste immuunrespons welke wordt aangeduid als de HAMA- (Humane Anti-Muis Antilichaam)-respons wanneer het MAb wordt toegediend aan een mens. De toepassing van MAbs van knaagdieren als therapeutische middelen bij mensen wordt dan ook inherent beperkt door het feit dat de patiënt een immunologische respons op het MAb zal geven en ofwel het geheel zal verwijderen ofwel tenminste de effectiviteit daarvan zal verminderen. In de praktijk kunnen MAbs afkomstig van knaagdieren niet worden gebruikt in patiënten voor meer dan één of een paar behandelingen, aangezien een HAMA-respons zich spoedig ontwikkelt die het MAb ineffectief maakt en ook ongewenste reacties geeft. Zo is bijvoorbeeld 0KT3, een muize IgG2a/k Mab dat een antigeen herkent in het T-celreceptor-CD3-complex, goedgekeurd voor toepassing in vele landen als een immunosupressivum bij de behandeling van acute afstotingsreacties bij transplantaties [Chatenoud et al (2) en Jeffers et al (3)]. Echter, gezien het feit dat dit MAb en andere dergelijke MAbs afkomstig zijn van knaagdieren, kan bij toepassing daarvan een belangrijke HAMA-respons optreden die een belangrijke anti-idiotype component kan omvatten. Het is duidelijk zeer gewenst om deze ongewenste HAMA-respons te verminderen of daaraan volledig een eind te maken en zo het toepassingsgebied van dergelijke antilichamen te vergroten.

Voorstellen zijn dan ook gedaan om niet-menselijke MAbs minder antigeen voor mensen te maken. Dergelijke technieken kunnen in het algemeen worden aangeduid als "humaniserings"-technieken. Deze technieken omvatten kenmerkend de toepassing van recombinant-DNA-technieken om DNA-sequenties die coderen voor de polypeptideketens van het antilichaammolecuul te manipuleren.

De eerste methoden voor het humaniseren van MAbs omvatten de productie van chimere antilichamen waarbij een antigeen-bindingsplaats bestaande uit de volledige variabele gebieden van één antilichaam wordt gekoppeld aan constante gebieden afkomstig van een ander antilichaam. Werkwijzen voor het uitvoeren van dergelijke chimerisaties zijn beschreven in EP0120694 (Celltech Limited), EP0125023 (Genentech Ine. en City of Hope), EP-A-0 171496 (Res. Dev. Corp. Japan), EP-A-0 173 494 (Stanford University) en WO 86/01533 (Celltech Limited). Deze octrooiaanvragen beschrijven in het algemeen werkwijzen voor het vervaardigen van antilichaammoleculen die de variabele gebieden van een muize MAb en de constante gebieden van een menselijk immunoglobuline bevatten. Dergelijke gehumaniseerde chimere antilichamen bevatten echter nog steeds een belangrijk deel van een niet-menselijke aminozuursequentie, dat wil zeggen de volledige niet-menselijke variabele gebieden, en kunnen derhalve nog steeds een HAMA-respons opwekken, in het bijzonder indien ze gedurende een langere periode worden toegediend [Begent et al (ref. 4)].

In een alternatieve benadering, beschreven in EP-A-0 239400 (Winter), zijn de complementariteit-bepalende gebieden (CDRs) van een muize MAb geënt op de raamwerkge-bieden van de variabele gebieden van een menselijk immunoglobuline door plaatsgerichte mutagenese onder toepassing van lange oligonucleotiden. Dergelijke CDR-geënte gehumaniseerde antilichamen geven veel minder waarschijnlijk aanleiding tot een HAMA-respons dan gehumaniseerde chimere antilichamen gezien het veel geringere deel niet-menselijke aminozuursequentie dat zij bevatten.

Het vroegste werk op het gebied van humaniseren van MAbs door CDR-enten werd uitgevoerd met MAbs die synthetische antigenen herkennen, zoals de NP- of NIP-antigenen. Voorbeelden waarbij een muize MAb die lysozym herkent en een ratte MAb die een antigeen op menselijke T-cellen herkent, werden gehumaniseerd door CDR-enten, zijn echter beschreven door respectievelijk Verhoeyen et al (5) en Riechmann et al (6) . De vervaardiging van CDR-geënt antilichaam voor het antigeen op menselijke T-cellen is ook beschreven in WO 98/07452 (Medical Research Council).

In Riechmann et al/Medical Research Council werd gevonden dat de overdracht van de CDR-gebieden alleen [zoals gedefinieerd door Kabat, refs. (7) en (8)] niet voldoende was om een bevredigende antigeen-bindingsactivi- teit te geven in het CDR-geënte product. Riechmann c.s. vonden dat het noodzakelijk was om een serinerest op positie 27 van de sequentie van de menselijke zware keten om te zetten in de overeenkomstige fenylalaninerest van de rat ter verkrijging van een CDR-geënt product met een betere antigeen-bindingsactiviteit. Deze rest op positie 27 van de zware keten is gelegen binnen de structuurlus welke grenst aan CDR1. Een ander construct dat bovendien een verandering van het menselijke serine in het ratte tyrosine op positie 30 van de zware keten bevatte, had niet een significant gewijzigde bindingsactiviteit ten opzichte van het gehumaniseerde antilichaam waarvan enkel de serinerest was veranderd in een fenylalaninerest op positie 27. Deze resultaten gaven aan dat veranderingen van resten van de menselijke sequentie buiten de CDR-gebieden, in het bijzonder in de structuurlus naast CDR1 van de zware keten, nodig kunnen zijn om een doeltreffende antigeen-bindingsactiviteit te verkrijgen voor CDR-geënte antilichamen welke meer complexe antigenen herkennen. Zelfs zo was de bindingsactiviteit van de beste verkregen CDR-geënte antilichamen nog steeds belangrijk minder dan die van het oorspronkelijke MAb.

Onlangs hebben Queen c.s. (9) de vervaardiging van een gehumaniseerd antilichaam beschreven dat zich bindt aan een interleukine-2-receptor, door combinatie van de CDRs van een muize MAb (anti-Tac) met immunoglobuline raamwerk en constante gebieden van de mens. De menselijke raamwerk-gebieden werden zodanig gekozen dat homologie met de anti-Tac MAb-sequentie maximaal was. Daarnaast werd computermo-dellering gebruikt om aminozuurresten in het raamwerk te identificeren die waarschijnlijk een wisselwerking gaven met de CDRs of antigeen, en op deze posities in het gehumaniseerde antilichaam werden muize-aminozuren gebruikt.

In WO 90/07861 stellen Queen c.s. vier kriteria voor om gehumaniseerde immunoglobulines te ontwerpen. Het eerste kriterium is het gebruik als de humane acceptor van het raamwerk van een bepaald menselijk immunoglobuline dat ongebruikelijk homoloog is met het niet-menselijke donor-immunoglobuline dat gehumaniseerd moet worden, of het gebruik van een consensus raamwerk uit vele menselijke antilichamen. Het tweede kriterium is het gebruik van het donor-aminozuur in plaats van dat van de acceptor indien de menselijke acceptorrest ongebruikelijk is en de donorrest kenmerkend is voor menselijke sequenties op een specifieke rest van het raamwerk. Het derde kriterium is het gebruik van de aminozuurresten van het donorraamwerk in plaats van die van de acceptor op posities onmiddellijk naast de CDRs. Het vierde kriterium is het gebruik van de aminozuurresten van de donor op posities van het raamwerk waarbij volgens voorspelling het aminozuur een zijketenatoom heeft binnen ongeveer 3 A van de CDRs in een driedimensionaal immunoglo-bulinemodel en een wisselwerking kan hebben met het anti-geen of met de CDRs van het gehumaniseerde immunoglobuline. Volgens het voorstel kunnen de tweede, derde of vierde kriteria worden toegepast naast of in plaats van het eerste kriterium en kunnen zij alleen of in combinatie worden toegepast.

WO 90/07861 beschrijft in detail de vervaardiging van een met een enkel CDR geënt gehumaniseerd antilichaam, een gehumaniseerd antilichaam met specificiteit voor het p55 Tac-proteïne van de IL-2-receptor. De combinatie van alle vier bovengenoemde kriteria werd toegepast bij het ontwerpen van dit gehumaniseerde antilichaam, waarbij het raamwerk van het variabele gebied van het menselijke antilichaam EU (7) werd gebruikt als acceptor. In het verkregen gehumaniseerde antilichaam waren de donor-CDRs zoals gedefinieerd door Kabat c.s. (7 en 8) en daarnaast werden de muize-donorresten gebruikt in plaats van de resten van de menselijke acceptor op de posities 27, 30, 48, 66, 67, 89, 91, 94, 103, 104, 105 en 107 in de zware keten en op de posities 48, 60 en 63 in de lichte keten van het raamwerk van het variabele gebied. Vermeld wordt dat het verkregen gehumaniseerde anti-Tac-antilichaam een affiniteit voor p55 heeft van 3 x 109 M-1, ongeveer eenderde van die van het muize MAb.

De onderhavige uitvinders hebben de vervaardiging van CDR-geënte, gehumaniseerde antilichaammoleculen verder onderzocht en hebben een hiërarchie van posities binnen het raamwerk van de variabele gebieden geïdentificeerd (dat wil zeggen buiten zowel de Kabat CDRs alsook de structuurlussen van de variabele gebieden) waarbij de aminozuuridentiteit van de resten belangrijk is voor het verkrijgen van CDR-geënte producten met een bevredigende bindingsaffiniteit. Dit maakte het de onderhavige uitvinders mogelijk een protocol op te stellen voor het verkrijgen van bevredigende CDR-geënte producten die op een zeer breed terrein kunnen worden toegepast ongeacht de mate van homologie tussen het donorimmunoglobuline en het acceptorraamwerk. Het stel resten dat de onderhavige uitvinders hebben geïdentificeerd als zijnde van kritisch belang overlapt maar valt niet samen met de resten die geïdentificeerd zijn door Queen c.s. (9). De internationale octrooiaanvrage WO 91/09967 van aanvraagster beschrijft dit protocol voor de vervaardiging van CDR-geënte, in het bijzonder gehumaniseerde zware en lichte ketens van antilichamen en volledige moleculen van elke gewenste specificiteit. De volledige beschrijving van de internationale octrooiaanvrage WO/91/09967 is hierin bij referentie opgenomen.

Tempest c.s. (10) hebben zeer recent de vervaardiging beschreven van een gemodificeerd menselijk monoclonaal antilichaam ten gebruike voor het remmen van infectie door menselijk respiratoir syncytiaal virus (RSV) in vivo. Dit gemodificeerde antilichaam werd vervaardigd door enten van synthetische oligonucleotiden welke coderen voor de CDRs van een muize MAb, dat de RSV-infectie neutraliseert, door plaatsgerichte mutagenese in DNA dat codeert voor de raamwerken van een menselijk igGl monoclonaal antilichaam. Het eenvoudige gemodificeerde antilichaam waarin de CDRs alleen overgebracht waren tussen muize en menselijke antilichamen had echter een zeer slechte binding voor RSV

welke niet significant boven de achtergrond uitkwam. Teneinde het bindingsvermogen gedeeltelijk te herstellen bleek het noodzakelijk om bovendien menselijke resten om te zetten in muizeresten in een raamwerkgebied naast CDR3 van de zware keten. Tempest c.s. zetten geen menselijke resten om in muizeresten op belangrijke posities die geïdentificeerd zijn in het protocol van WO 91/09967.

TNFa is een cytokine dat wordt afgegeven door en een wisselwerking geeft met cellen van het immuunsysteem. Zo wordt TNFa afgegeven door macrofagen die geactiveerd zijn door lipopolysacchariden (LPS) van gramnegatieve bacteriën. Als zodanig lijkt TNFa een endogene mediator van centraal belang te zijn die betrokken is bij de ontwikkeling en pathogenese van endotoxische shock welke optreedt bij bacteriële sepsis. Antilichamen tegen TNFa zijn voorgesteld voor de profylaxe en behandeling van endotoxische shock (Beutler c.s. (11)). De antilichamen tegen TNFa die thans beschikbaar zijn voor toepassing bij een dergelijke behandeling zijn echter kenmerkend muize MAbs. Als zodanig zijn deze muize MAbs slechts van beperkt nut voor behandeling van mensen gezien de ongewenste HAMA-(Humaan Anti-Muis Antilichaam)-respons die zij kunnen opwekken indien zij voor meer dan één of een paar behandelingen worden gebruikt. Het is derhalve een zeer gewenst doel om gehumaniseerde anti-TNFa-producten te vervaardigen voor toepassing bij humane therapie.

De internationale octrooiaanvrage WO 91/09967 van aanvraagster beschrijft onder meer de vervaardiging van gehumaniseerde CDR-geënte antilichaamproducten die specifiek zijn voor TNFa. In het bijzonder beschrijft WO 91/-09967 in Voorbeeld 5 de vervaardiging van specifieke gehumaniseerde CDR-geënte antilichamen tegen menselijk TNFa uit de muize anti-menselijk TNFa MAbs geïdentificeerd als 61E71 (ook bekend als CB0006), hTNFl (ook bekend als CB0010), hTNF3 en 101.4. De onderhavige aanvrage heeft in het bijzonder betrekking op recombinant, in het bijzonder gehumaniseerde antilichamen tegen menselijk TNFa, met inbegrip van die welke beschreven zijn in WO 91/09967 en verder verbeterde gehumaniseerde, CDR-geënte antilichamen tegen menselijk TNFa gebaseerd op de hTNFl (CB0010) en 101.4 muize MAbs. Verder onderzoek van verschillende muize MAbs tegen menselijk TNFa heeft aan het licht gebracht dat hTNFl en 101.4 bijzonder gewenste eigenschappen hebben voor toepassing in anti-TNF-therapie.

De onderhavige uitvinding voorziet dienovereenkomstig in recombinant antilichaammoleculen die specifiek zijn voor menselijk TNFa.

De recombinant antilichaammoleculen volgens de uitvinding zijn bij voorkeur TNF-neutraliserend, dat wil zeggen dat zij een biologische activiteit van menselijk TNFa kunnen verminderen of remmen, gemeten met een in vitro- of in vivo-proef.

Bij voorkeur voor ziet de uitvinding in recombinant antilichaammoleculen met antigeen-bindingsplaatsen afgeleid van de muize MAbs CB0006, CB0010, hTNF3 of 101.4, in het bijzonder van de muize MAbs CB0010 of 101.4.

Bij voorkeur zijn de recombinant antilichaammoleculen volgens de uitvinding gehumaniseerde antilichaammoleculen, met inbegrip van zowel chimere gehumaniseerde antilichaammoleculen als CDR-geënte gehumaniseerde antilichaammoleculen .

In de onderhavige beschrijving omvat een "chimeer gehumaniseerd antilichaammolecuul" volledige niet-menselij-ke (muize MAb) variabele gebieden, gekoppeld aan menselijke constante gebieden, en omvat een "CDR-geënt gehumaniseerd antilichaammolecuul" een zware en/of lichte keten van een antilichaam met één of meer CDRs uit een niet-menselijk antilichaam (bijvoorbeeld een muize MAb) geënt in een raamwerk van een variabel gebied van een menselijke zware en/of lichte keten.

De CDR-geënte, gehumaniseerde antilichaamproducten tegen TNFa volgens de uitvinding omvatten zware en lichte ketens van antilichamen tegen menselijk TNFa en molecuul-producten zoals gedefinieerd in de eerste, tweede, derde en vierde aspecten van de uitvinding zoals beschreven in WO 91/09967.

In eerste voorkeursuitvoeringsvormen voorziet de uitvinding in een CDR-geënte, gehumaniseerde zware keten van antilichaam tegen hTNFa met een variabel gebied bestaande uit menselijke acceptorraamwerk en donor antigeen-bindingsgebieden, waarbij het raamwerk donorresten omvat op tenminste één van de posities 6, 23 en/of 24, 48 en/of 49, 71 en/of 73, 75 en/of 76 en/of 78 en 88 en/of 91.

Bij voorkeur omvat in deze eerste voorkeursuitvoeringsvormen het raamwerk van de zware keten donorresten op posities 23, 24, 49, 71, 73 en 78 of op posities 23, 24 en 49. De resten op posities 71, 73 en 78 van het raamwerk van de zware keten zijn bij voorkeur ofwel alle acceptorresten ofwel alle donorresten.

In het bijzonder omvat in deze eerste voorkeursuitvoeringsvormen het raamwerk van de zware keten bovendien donorresten op één, enige of alle posities 6, 37, 48 en 94. Ook verdient het bijzondere voorkeur dat resten op posities van het raamwerk van de zware keten die gewoonlijk geconserveerd zijn tussen verschillende soorten, dat wil zeggen de posities 2, 4, 25, 36, 39, 47, 93, 103, 104, 106 en 107, indien ze niet geconserveerd zijn tussen donor en acceptor, bovendien donorresten zijn. Met bijzondere voorkeur omvat het raamwerk van de zware keten bovendien donorresten op de posities 2, 4, 6, 25, 36, 37, 39, 47, 48, 93, 103, 104, 106 en 107.

Bovendien omvat het raamwerk van de zware keten eventueel donorresten op één, sommige of alle posities: 1 en 3, 72 en 76, 69 (indien 48 verschilt tussen donor en acceptor), 38 en 46 (indien 48 de donorrest is), 80 en 20 (indien 69 de donorrest is), 67, 82 en 18 (indien 67 de donorrest is), 91/ 88, en een of meer van de posities 9, 11, 41, 87, 108, 110 en 112.

In de onderhavige beschrijving is het donorantili-chaam kenmerkend een niet-menselijk antilichaam tegen hTNFa, zoals een MAb van een knaagdier, en is het acceptor-antilichaam een menselijk antilichaam.

In de CDR-geënte, gehumaniseerde antilichamen tegen hTNFa volgens de uitvinding omvat het donor antigeen-bindingsgebied kenmerkend tenminste één CDR van het donor antilichaam. Gebruikelijk omvat het donor antigeen-bin-dingsgebied tenminste twee en bij voorkeur alle drie de CDRs van elk van de variabele gebieden van de zware keten en/of lichte keten. De CDRs kunnen bestaan uit de CDRs van Kabat, de structuurlus-CDRs of een samenstel van de CDRs van Kabat en de structuurlus-CDRs en elke combinatie daarvan.

Bij voorkeur omvatten de antigeen-bindingsgebieden van het CDR-geënte variabele gebied van de zware keten CDRs die overeenkomen met de CDRs van Kabat bij CDR2 (resten 50-65) en CDR3 (resten 95-102) en een samenstel van de CDRs van Kabat en de structuurlus-CDRs bij CDR1 (resten 26-35). Deze bevoorkeurde CDR-aanduidingen worden bij voorkeur gebruikt voor de CDR-geënte zware ketens van de eerste voorkeursuitvoeringsvormen, dat wil zeggen de resten 26-30 worden omvat in CDR1.

De hierboven en elders in de aanvrage gegeven aanduidingen van de resten zijn genummerd volgens de Kabat-nummering [refs. (7) en (8)]. De aanduidingen van de resten komen derhalve niet altijd rechtstreeks overeen met de lineaire nummering van de aminozuurresten. De feitelijke lineaire aminozuursequentie kan minder of meer aminozuren bevatten dan in de strikte Kabat-nummering, wat overeenkomt met een verkorting van of insertie in een structuurbestand-deel, hetzij raamwerk hetzij CDR, van de variabele basisge-biedstructuur. Het variabele gebied van de zware keten van het anti-Tac antilichaam zoals beschreven door Queen c.s. (9) bevat bijvoorbeeld een enkel aminozuurinsert (rest 52a) na rest 52 van CDR2 en een drie-aminozuurinsert (resten 82a, 82b en 82c) na de raamwerkrest 82, in de nummering volgens Kabat. De juiste nummering van de resten volgens Kabat kan worden bepaald voor een gegeven antilichaam door bij gebieden van homologie de sequentie van het antilichaam op de juiste wijze te leggen naast een "standaard" volgens Kabat-genummerde sequentie.

Het zal duidelijk zijn, dat wanneer de uitvoeringsvormen volgens de uitvinding van de CDR-geënte, gehumaniseerde antilichaammoleculen, zoals hierboven en elders in de aanvrage beschreven, worden toegepast op een bepaald donor/acceptor antilichaampaar, in sommige gevallen de aminozuurresten van de donor en de acceptor identiek kunnen zijn op een bepaalde positie waarvan is aangegeven dat deze moet worden veranderd in de donorrest, waardoor geen verandering van de raamwerkrest van de acceptor nodig is.

De uitvinding voorziet ook volgens tweede voor-keursuitvoeringsvormen in een CDR-geënte, gehumaniseerde lichte keten van antilichaam tegen hTNFa met een variabel gebied dat bestaat uit menselijke acceptor raamwerk en donor antigeen-bindingsgebieden, waarbij het raamwerk donorresten omvat op tenminste één van de posities 1 en/of 3 en 46 en/of 47.

Bij voorkeur omvat de CDR-geënte lichte keten van de tweede voorkeursuitvoeringsvorm donorresten op de posities 46 en/of 47.

De uitvinding voorziet ook volgens derde voorkeursuitvoeringsvormen in een CDR-geënte, gehumaniseerde lichte keten van antilichaam tegen hTNFa met een variabel gebied dat bestaat uit menselijke acceptor raamwerk en donor antigeen-bindingsgebieden waarbij het raamwerk donorresten omvat op tenminste één van de posities 46, 48, 58 en 71.

In de derde voorkeursuitvoeringsvormen omvat het raamwerk bij voorkeur donorresten op alle posities 46, 48, 58 en 71.

In bijzondere voorkeursuitvoeringsvormen van de tweede en derde voorkeursuitvoeringsvormen omvat het raamwerk bovendien donorresten op de plaatsen 36, 44, 47, 85 en 87. Evenzo bestaan posities van het raamwerk van de lichte keten die gewoonlijk geconserveerd zijn tussen verschillende soorten, dat wil zeggen de posities 2, 4, 6, 35, 49, 62, 64-69, 98, 99, 101 en 102, indien zij niet geconserveerd zijn tussen donor en menselijke acceptor, bovendien uit donorresten. Met bijzondere voorkeur omvat het raamwerk van de lichte keten bovendien donorresten op de posities 2, 4, 6, 35, 36, 38, 44, 47, 49, 62, 64-69, 85, 87, 98, 99, 101 en 102.

Bovendien bevat het raamwerk van de tweede of derde voorkeursuitvoeringsvormen eventueel donorresten op één, sommige of alle posities: 1 en 3, 63, 60 (indien 60 en 54 een potentiële zoutbrug kunnen vormen), 70 (indien 70 en 24 een potentiële zoutbrug kunnen vormen), 73 en 21 (indien 47 verschilt tussen donor en acceptor), 37 en 45 (indien 47 verschilt tussen donor en acceptor), en één of meer van de posities 10, 12 40, 80, 103 en 105.

Bij voorkeur omvatten de antigeen-bindende gebieden van het CDR-geënte variabele gebied van de lichte keten, met inbegrip van die van de bovenbeschreven tweede en derde voorkeursuitvoeringsvormen, CDRs welke overeenkomen met de CDRs van Kabat bij CDR1 (resten 24-34), CDR2 (resten 50-56) en CDR3 (resten 89-97).

De uitvinding voorziet voorts volgens een vierde voorkeursuitvoeringsvorm in een CDR-geënt antilichaammole-cuul dat bestaat uit tenminste één CDR-geënte zware keten en tenminste één CDR-geënte lichte keten volgens de eerste en tweede of eerste en derde voorkeursuitvoeringsvormen van de uitvinding.

Volgens een eerste bijzondere voorkeursuitvoeringsvorm voorziet de uitvinding echter in een CDR-geënte, gehumaniseerde zware keten van een antilichaam met een variabel gebied dat bestaat uit menselijke acceptor raamwerk (in het bijzonder EU menselijke acceptor raamwerk) en hTNFl donor antigeen bindingsgebieden, waarbij het raamwerk hTNFl donorresten omvat op de posities 12, 27, 30, 38, 46, 48, 66, 67, 69, 71, 73, 76, 83, 89, 91 en 94.

Het EU-raamwerk van de zware keten heeft resten in raamwerk 4 (FR4) van de zware keten die afwijkend zijn voor menselijke raamwerken van een zware keten. Derhalve worden bij voorkeur menselijke consensusresten gebruikt in plaats van EU-resten in FR4 van de zware keten. In het bijzonder kan de menselijke consensusrest threonine (T) worden gebruikt op positie 108. Toevallig is de rest op positie 108 van muize hTNFl ook threonine.

Volgens een tweede bijzondere voorkeursuitvoeringsvorm voorziet de uitvinding in een CDR-geënte, gehumaniseerde lichte keten van een antilichaam met een variabel gebied dat bestaat uit menselijke acceptor raamwerk (in het bijzonder EU menselijke acceptor raamwerk) en hTNFl donor antigeen-bindingsgebieden, waarbij het raamwerk hTNFl donorresten op de posities 3, 42 en 49 omvat.

Wanneer het EU menselijke raamwerk wordt gebruikt voor de lichte keten, is het ook gewenst om resten daarvan op de posities 48, 83, 106 en 108 te veranderen, aangezien de EU-resten op deze posities afwijkend zijn voor menselijke antilichamen. Derhalve kunnen de menselijke consensusresten worden gebruikt in plaats van sommige of bij voorkeur alle van deze resten, dat wil zeggen isoleucine (I) op positie 48, valine (V) op positie 83, isoleucine (I) op positie 106 en arginine (R) op positie 108. Toevallig zijn de hTNFl-resten van de muis dezelfde als de menselijke consensusresten op de posities 48 (I) , 106 (I) en 108 (R) . De menselijke consensusrest valine (V) op positie 83 verschilt echter van zowel de EU-rest (F) als de hTNFl-rest (L) op deze positie.

In het bijzonder voorziet de uitvinding in CDR-geënte, gehumaniseerde antilichaammoleculen bestaande uit tenminste één CDR-geënte gehumaniseerde zware keten volgens de eerste bijzondere voorkeursuitvoeringsvorm en tenminste één CDR-geënte, gehumaniseerde lichte keten volgens de tweede bijzondere voorkeursuitvoeringsvorm.

Volgens een derde bijzondere voorkeursuitvoeringsvorm voorziet de uitvinding eveneens in een CDR-geënte, gehumaniseerde zware keten van een antilichaam met een variabel gebied dat bestaat uit menselijk acceptor raamwerk (in het bijzonder KOL menselijke acceptor raamwerk) en 101.4 donor antigeen bindingsgebieden, waarbij het raamwerk 101.4 donorresten omvat op de posities 4, 11, 23, 24, 28, 73, 77, 78, 79, 91, 93 en 94.

De KOL-rest proline (P) op positie 108 van de zware keten is afwijkend voor menselijke antilichamen. Derhalve wordt bij voorkeur de menselijke consensusrest leucine (L) op deze positie gebruikt, wanneer KOL wordt gebruikt als het menselijke acceptor raamwerk. Toevallig heeft het muize 101.4 antilichaam de menselijke consensusrest (L) op deze positie.

Bovendien voorziet de uitvinding volgens een vierde bijzondere voorkeursuitvoeringsvorm in een CDR-geënte, gehumaniseerde lichte keten van een antilichaam met een variabel gebied dat bestaat uit menselijke acceptor raamwerk (in het bijzonder REI menselijke acceptor raamwerk) en 101.4 donorresten op de posities 1, 3, 4 en 73.

Het menselijke REI-raamwerk van de lichte keten heeft resten die afwijkend zijn voor menselijke antilichamen op de posities 39 (threonine, T), 104 (leucine, L), 105 (glutamine, Q) en 107 (threonine, T) . Wanneer derhalve REI wordt gebruikt als het raamwerk van de lichte keten, worden menselijke consensusresten gebruikt op de posities 39 (lysine, K), 104 (valine, V), 105 (glutaminezuur, E) en 107 (lysine, K) . Toevallig zijn de muize 101.4 resten dezelfde als de menselijke consensusresten op de posities 39 (K) , 105 (E) en 107 (K). De menselijke consensusrest op positie 104 (V) verschilt echter van de leucine (L) resten op deze positie van REI en muize 101.4.

De uitvinding voorziet in het bijzonder ook in CDR-geënte, gehumaniseerde antilichaammoleculen die bestaan uit tenminste één CDR-geënte, gehumaniseerde zware keten volgens de derde bijzondere voorkeursuitvoeringsvorm en tenminste één CDR-geënte, gehumaniseerde lichte keten volgens de vierde bijzondere voorkeursuitvoeringsvorm.

Bij voorkeur worden de CDRs van Kabat gebruikt voor alle CDRs (CDR1, CDR2 en CDR3) van zowel de zware als de lichte ketens van de eerste, tweede, derde en vierde bijzondere voorkeursuitvoeringsvormen die hierboven beschreven zijn.

De recombinant en gehumaniseerde antilichaammoleculen en ketens van de onderhavige uitvinding kunnen omvatten: een volledig antilichaammolecuul, met zware en lichte ketens met een volledige lengte; een fragment daarvan, zoals een Fab-, Fab'-, F(ab')2- of Fv-fragment; een monomeer of dimeer van een lichte keten of zware keten; of een antilichaam met enkele keten, bijvoorbeeld een Fv met enkele keten waarin variabele gebieden van zware en lichte keten gekoppeld zijn door een peptidebindingsgroep; of enig ander recombinant, chimeer of CDR-geënt molecuul met dezelfde specificiteit als de oorspronkelijke donor-antilichamen. Evenzo kan desgewenst het variabele gebied van de zware en lichte keten worden gecombineerd met andere antilichaamgebieden.

Ook kunnen de zware of lichte ketens of recombinant of gehumaniseerde volledige antilichaammoleculen volgens de uitvinding gekoppeld zijn aan een effector- of rapporteurmolecuul. Bijvoorbeeld kan een macrocyclische verbinding voor het cheleren van een zwaar metaalatoom, of een toxine zoals ricine, er aan gekoppeld zijn via een covalente brugstructuur. In plaats daarvan kunnen recombi-nant-DNA-technieken worden gebruikt ter vervaardiging van een immunoglobulinemolecuul waarin het Fc-fragment of CH3 gebied van een volledig immunoglobulinemolecuul vervangen is door, of door een peptidebinding gekoppeld is aan, een functioneel niet-immunoglobulineproteïne, zoals een enzym of toxinemolecuul.

De aminozuursequenties van de variabele gebieden van de zware en lichte keten van de CB0010, 101.4, CB0006 en hTNF3 muize MAbs, CDR-geënte varianten daarvan en menselijke acceptor antilichamen zijn respectievelijk weergegeven in de Figuren 1, 2, 3 en 4. De recombinant en gehumaniseerde antilichaamprodukten volgens de uitvinding kunnen worden vervaardigd onder toepassing van recombinant-DNA-technieken, bijvoorbeeld zoals beschreven in W091/ 09967.

Alle geschikte menselijke acceptor sequenties voor het raamwerk van de variabele gebieden kunnen worden gebruikt onder inachtneming van klasse/type van het donor antilichaam waarvan de antigeen-bindingsgebieden afgeleid zijn. Bij voorkeur is het gebruikte type menselijke acceptor raamwerk van dezelfde/soortgelijke klasse/type als het donorantilichaam. Doelmatig kan het raamwerk zodanig worden gekozen dat de homologie met de donorantilichaamsequentie maximaal/optimaal wordt, in het bijzonder op posities dicht bij of naast de CDRs. Een grote mate van homologie tussen donor- en acceptorsequenties is echter niet kritisch voor toepassing van de onderhavige uitvinding. De uitvinding identificeert een hiërarchie van restposities van het raamwerk waarop donorresten van belang of gewenst kunnen zijn voor het verkrijgen van een CDR-geënt antilichaampro-dukt met bevredigende bindingseigenschappen. De CDR-geënte produkten hebben gewoonlijk bindingsaffiniteiten van tenminste 105 M"1, bij voorkeur tenminste ongeveer 108 M-1 of in het bijzonder in het gebied van 10a-1012 M-1. In principe is de onderhavige uitvinding van toepassing op elke combinatie van anti-hTNFa donor antilichaam en menselijke acceptor antilichaam ongeacht de mate van homologie tussen hun sequenties. Voorbeelden van menselijke raamwerken die gebruikt kunnen worden, zijn KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY en POM (ref. 7 en 8) en dergelijke; bijvoorbeeld KOL en NEWM voor de zware keten en REI voor de lichte keten en EU, LAY en POM voor zowel de zware als de lichte keten.

Ook de constante gebieden van de produkten volgens de uitvinding kunnen worden gekozen onder inachtneming van de voorgestelde functie van het antilichaam, in het bijzonder de effectorfuncties die vereist kunnen zijn. De constante gebieden kunnen bijvoorbeeld menselijke IgA, igE, IgG of IgM gebieden zijn. In het bijzonder kunnen constante gebieden van menselijk IgG worden gebruikt, met name de IgGl en IgG3 isotypen, wanneer het gehumaniseerde antili-chaammolecuul bedoeld is voor therapeutische toepassingen en effectorfuncties van het antilichaam vereist worden. In plaats daarvan kunnen IgG2 en IgG4 isotypen worden gebruikt wanneer het gehumaniseerde antilichaammolecuul bedoeld is voor therapeutische doeleinden en effectorfuncties van het antilichaam niet vereist worden, bijvoorbeeld voor het eenvoudig blokkeren van TNF-activiteit.

De rest van de antilichaammoleculen hoeft echter niet enkel proteïnesequenties van immunoglobulines te omvatten. Een gen kan bijvoorbeeld worden geconstrueerd waarin een DNA-sequentie welke codeert voor een deel van een menselijke immunoglobulineketen is gefuseerd met een DNA-sequentie welke codeert voor de aminozuursequentie van een functioneel polypeptide zoals een effector- of rappor-teurmolecuul.

Volgens verdere aspecten omvat de uitvinding ook DNA-sequenties die coderen voor de recombinante en gehumaniseerde, bijvoorbeeld CDR-geënte, zware en lichte ketens van het antilichaam, clonerings- en expressievectoren die de DNA-sequenties bevatten, gastheercellen die getransformeerd zijn met de DNA-sequenties en werkwijzen voor het vervaardigen van de recombinante en gehumaniseerde, bijvoorbeeld CDR-geënte, ketens en antilichaammoleculen, welke werkwijzen de expressie van de DNA-sequenties in de getransformeerde gastheercellen omvatten.

De algemene methoden waarmee de vectoren geconstrueerd kunnen worden, transfectiemethoden en kweekmetho- den zijn op zichzelf goed bekend. Dergelijke methoden worden bijvoorbeeld vermeld in de literatuurplaatsen 12 en 13.

De DNA-sequenties die coderen voor de aminozuurse-quenties van het antilichaammolecuul tegen hTNFa kunnen worden verkregen met algemeen in de techniek bekende methoden. De anti-TNF coderende sequenties kunnen bijvoorbeeld worden verkregen door genomisch kloneren of cDNA-kloneren uit geschikte anti-hTNFa producerende hybridoma-cellijnen. Positieve klonen kunnen worden geselecteerd onder toepassing van geschikte probes voor de betreffende genen voor de zware en lichte keten. Ook kan PCR-klonering worden gebruikt. Een DNA-sequentie die codeert voor een gedeelte van of de gehele zware en lichte ketens van het antilichaam kan desgewenst worden gesynthetiseerd uit de vastgestelde DNA-sequentie of op basis van de overeenkomstige aminozuursequentie.

DNA dat codeert voor acceptorsequenties, bijvoorbeeld menselijke acceptorsequenties, kan op elke geschikte wijze worden verkregen. DNA-sequenties die coderen voor bevoorkeurde menselijke acceptor raamwerken zoals KOL, REI, EU en NEWM, zijn bijvoorbeeld op ruime schaal beschikbaar voor onderzoekers of kunnen gemakkelijk worden gesynthetiseerd op basis van hun bekende aminozuursequenties (zie literatuurplaatsen 7 en 8).

De standaardtechnieken van de moleculaire biologie kunnen worden gebruikt voor het vervaardigen van DNA-sequenties die coderen voor de chimere en CDR-geënte, gehumaniseerde antilichaamprodukten. Gewenste DNA-sequenties kunnen geheel of gedeeltelijk worden gesynthetiseerd onder toepassing van oligonucleotide synthesetechnieken. Plaatsgerichte mutagenese en polymerase kettingreactie (PCR) technieken kunnen desgewenst worden gebruikt. Oligo-nucleotide-gerichte synthese zoals beschreven door Jones c.s. (ref. 14) kan bijvoorbeeld worden gebruikt. Ook kan oligonucleotide-gerichte mutagenese van een reeds bestaand variabel gebied zoals bijvoorbeeld beschreven door

Verhoeyen c.s. (ref. 5) of Riechmann c.s. (ref. 6) worden gebruikt. Ook kan enzymatisch invullen van openingen tussen oligonucleotiden onder toepassing van T4 DNA-polymerase zoals bijvoorbeeld beschreven door Queen c.s. (ref. 9) worden gebruikt.

Elk geschikt gastheercel/vectorsysteem kan worden gebruikt voor expressie van de DNA-sequenties die coderen voor de recombinantie, chimere en CDR-geënte, gehumaniseerde zware en lichte ketens van het antilichaam. Bacteriële, bijvoorbeeld E. coli. en andere microbiële systemen kunnen worden gebruikt in het bijzonder voor expressie van anti-lichaamfragmenten zoals Fab- en F(ab')2-ftagmenten en met name Fv-fragmenten en fragmenten van een enkele-keten-antilichaam, bijvoorbeeld enkele-keten-Fvs. Eucaryote, bijvoorbeeld zoogdier, gastheercel expressiesystemen kunnen worden gebruikt voor de produktie van grotere CDR-geënte antilichaamprodukten, met inbegrip van volledige antili-chaammoleculen, en/of indien geglycosyleerde produkten vereist worden. Geschikte gastheercellen van zoogdieren zijn onder meer CHO-cellen en myeloma- of hybrydomacellij-nen.

De uitvinding voorziet derhalve volgens nog een aspect in een werkwijze voor het vervaardigen van een recombinant of gehumaniseerd antilichaamprodukt tegen hTNFa omvattende: (a) het vervaardigen in een expressievector van een operon met een DNA-sequentie welke codeert voor een zware keten van een antilichaam tegen hTNFa; en/of (b) het vervaardigen in een expressievector van een operon met een DNA-sequentie welke codeert voor een complementaire lichte keten van een antilichaam tegen hTNFa; (c) het transfecteren van een gastheercel met de vector of elke vector; en (d) het kweken van de getransfecteerde cellijn ter vervaardiging van het recombinante anti-hTNFa antilichaamprodukt.

Het recombinante of gehumaniseerde anti-hTNFa-produkt kan enkel uit polypeptide afgeleid van zware of lichte keten bestaan, in welk geval enkel een coderende sequentie voor polypeptide met de zware keten of lichte keten wordt gebruikt om de gastheercellen te transfecteren. Voor de productie van produkten die zowel zware als lichte ketens bevatten, kan de cellijn worden getransfecteerd met twee vectoren, een eerste vector die een operon bevat welke codeert voor een polypeptide dat afgeleid is van een lichte keten en een tweede vector welke een operon bevat dat codeert voor een polypeptide dat is afgeleid van een zware keten. Bij voorkeur zijn de vectoren identiek, behalve wat betreft de coderende sequenties en selecteerbare merkers, teneinde er zo veel mogelijk voor te zorgen dat elke polypeptideketen in gelijke mate tot expressie komt. In plaats daarvan kan ook een enkele vector worden gebruikt, welke de sequenties bevat die coderen voor zowel het polypeptide afgeleid van de lichte keten als dat van de zware keten.

Het DNA in de sequenties die coderen voor de lichte en zware ketens kan bestaan uit cDNA of genomisch DNA of uit beide.

De uitvinding heeft ook betrekking op therapeutische en diagnostische preparaten die de recombinante en gehumaniseerde antilichaamproducten volgens de uitvinding bevatten, en op de toepassingen van deze producten en preparaten bij therapie en diagnose.

De uitvinding voorziet derhalve volgens een verder aspect in een therapeutisch of diagnostisch preparaat dat een recombinant of gehumaniseerd antilichaam volgens de uitvinding in combinatie met een farmaceutisch aanvaardbaar excipiënt, verdunningsmiddel of drager omvat.

De uitvinding voorziet ook in een werkwijze voor de vervaardiging van een therapeutisch of diagnostisch preparaat, waarbij men een recombinant of gehumaniseerd antilichaam volgens de uitvinding mengt met een farmaceutisch aanvaardbaar excipiënt, verdunningsmiddel of drager.

Het recombinant of gehumaniseerde antilichaam kan het enige actieve bestanddeel in het therapeutische of diagnostische preparaat zijn of kan aanwezig zijn in combinatie met een of meer andere werkzame bestanddelen met inbegrip van andere antilichamen, bijvoorbeeld anti-T-cel-, anti-IFNy- of anti-LPS-antilichamen of bestanddelen die geen antilichaam zijn, zoals xanthines. De therapeutische en diagnostische preparaten kunnen verkeren in eenheidsdo-seervorm, in welk geval elke eenheidsdosis bestaat uit een doeltreffende hoeveelheid van het recombinante of gehumaniseerde antilichaam volgens de uitvinding.

De uitvinding voorziet bovendien ook in therapeutische en diagnostische methoden die bestaan uit het toedienen van een doeltreffende hoeveelheid van een recombinant of gehumaniseerd antilichaam volgens de uitvinding aan een mens of dier.

De antilichamen en preparaten kunnen worden toegepast bij elke therapie waarbij het gewenst is om het in het menselijke of dierlijke lichaam aanwezige TNF-gehalte te verlagen. Het TNF kan in het lichaam rondstromen of aanwezig zijn in een ongewenst hoge concentratie op één bepaalde plaats in het lichaam.

Verhoogde TNF-gehalten komen bijvoorbeeld voor bij immunoregulerende en inflammatoire aandoeningen en bij septische of endotoxische en cardiovasculaire shock. Het antilichaam of het preparaat kan worden toegepast bij therapie van aandoeningen zoals sepsis, septische of endotoxische shock, cachexie, ademnood bij volwassenen, AIDS, allergieën, psoriasis, tuberculose, inflammatoire botaandoeningen, aandoeningen van de bloedstolling, verbrandingen, afstotingsreacties na orgaan- of weefseltrans-plantatie en auto-immuunziekte, bijvoorbeeld orgaan-speci-fieke ziekten, zoals thyroiditis, of niet-specifieke orgaanaandoeningen zoals rheumatoïde en osteo-arthritis.

Bovendien kan het antilichaam of preparaat worden gebruikt om neveneffecten die voorkomen bij de vorming van TNF tijdens neoplastische therapie tegen te gaan en ook om symptomen die verband houden met shock bij de behandeling of preventie van afstoting van transplantaten door toepassing van anti-lymfocyt-antilichaam tegen te gaan of te verminderen, of het kan ook worden gebruikt voor het behandelen van falende werking van vele organen (MOF).

De recombinante en gehumaniseerde antilichamen en preparaten volgens de uitvinding zijn bij voorkeur geschikt voor de behandeling van sepsis of septische/endotoxische shock.

De antilichamen en preparaten kunnen voor toedie-ningsdoeleinden aanwezig zijn in elke geschikte vorm en hoeveelheid al naar de therapie waarbij zij worden gebruikt. Dit kan voor profylactische toepassing zijn, bijvoorbeeld wanneer de omstandigheden zodanig zijn dat een verhoging van het TNF-gehalte verwacht zou kunnen worden of zij kunnen ook worden gebruikt voor het verlagen van het TNF-gehalte nadat dit een ongewenst hoog niveau heeft bereikt of wanneer het gehalte toeneemt.

Het therapeutische of diagnostische preparaat kan voorkomen in elke geschikte vorm voor toedieningsdoeleinden en is bij voorkeur aanwezig in een vorm die geschikt is voor parenterale toediening, bijvoorbeeld door injectie of infusie, bijvoorbeeld door bolusinjectie of continue infusie. Wanneer het product bestemd is voor injectie of infusie, kan het de vorm hebben van een suspensie, oplossing of emulsie in een olieachtige of waterige drager en kan het formuleringsmiddelen bevatten zoals suspendeermid-delen, conserveermiddelen, stabiliseermiddelen en/of dispergeermiddelen.

In plaats daarvan kan het antilichaam of preparaat aanwezig zijn in droge vorm om vlak voor gebruik te worden samengesteld met een geschikte steriele vloeistof.

Indien het antilichaam of preparaat geschikt is voor orale toediening, bijvoorbeeld in het geval van antilichaamfragmenten, kan het preparaat naast het werkzame bestanddeel additieven bevatten, zoals: zetmeel - bijvoorbeeld aardappel-, maïs- of tarwezetmeel of -cellulose - of zetmeelderivaten zoals microkristallijne cellulose; silica; verschillende suikers zoals lactose; magnesiumcarbonaat en/of calciumfosfaat. Het is gewenst dat, indien het preparaat bestemd is voor orale toediening, het goed getolereerd wordt door het spijsverteringssysteem van de patiënt. Hiertoe kan het gewenst zijn om in het preparaat slijmvormers en harsen op te nemen. Het kan ook gewenst zijn om de tolerantie te verbeteren door het antilichaam of de preparaten te verwerken in een capsule welke onoplosbaar is in de maagvloeistof. Het kan ook de voorkeur verdienen om het antilichaam of preparaat op te nemen in een preparaat voor geregelde afgifte.

Volgens nog een ander aspect van de uitvinding wordt voorzien in een werkwijze voor de behandeling van een mens of dier die lijdt aan of het risico loopt te gaan lijden aan een aandoening die gepaard gaat met een ongewenst hoog TNF-gehalte, welke werkwijze omvat het toedienen aan de patiënt van een doeltreffende hoeveelheid van het antilichaam of preparaat volgens de uitvinding. In het bijzonder kan de patiënt (mens of dier) lijden aan of het risico lopen te gaan lijden aan, sepsis of septische of endotoxische shock.

De dosis waarin het antilichaam wordt toegediend hangt af van de aard van de te behandelen aandoening, de mate waarin het te neutraliseren TNF is gestegen of naar verwachting zal gaan stijgen boven een gewenst niveau, en van de vraag of het antilichaam profylactisch zal worden gebruikt of om een bestaande aandoening te behandelen. De dosis zal ook worden gekozen op grond van de leeftijd en omstandigheden van de patiënt.

Wanneer het product derhalve bijvoorbeeld bestemd is voor behandeling of profylaxe van septische shock liggen geschikte doses antilichaam tegen TNF in het traject van 0,001-30 mg/kg/dag, bij voorkeur 0,01-10 mg/kg/dag en het liefst 0,1-2 mg/kg/dag.

De antilichaamproducten kunnen bij diagnose worden gebruikt, bijvoorbeeld bij in vivo diagnose en bij het in beeld brengen van de ziektetoestand waarbij verhoogde TNF-gehalten betrokken zijn.

De uitvinding wordt verder enkel bij wijze van toelichting beschreven in de volgende Voorbeelden die verwijzen naar de bijgaande Figuren 1-6.

Korte beschrijving van de figuren

Fig. 1 toont aminozuursequenties voor de variabele gebieden van de zware en lichte ketens voor de menselijke acceptor antilichaam EU (1EU), het muize MAb CB0010 (h t n f 1) en de gehumaniseerde, CDR-geënte lichte (gEU) en zware (2hEUg) ketens; fig. 2 toont aminozuursequenties voor de variabele gebieden van de menselijke acceptorantilichamen REI (1 r e i) voor de lichte keten en KOL (KOL) voor de zware keten, van de zware en lichte ketens van het muize MAb 101.4 (101/4) en gehumaniseerde geënte lichte en zware ketens (beide aangeduid als gl014); fig. 3 toont aminozuursequenties voor de variabele gebieden van de menselijke acceptorantilichamen REI (REI) voor de lichte keten en KOL (KOL) voor de zware keten, van de zware en lichte ketens van het muize MAb CB0006 (CB6) en gehumaniseerde geënte lichte en zware ketens (beide aangeduid als gCB6); fig. 4 toont aminozuursequenties voor de variabele gebieden van de menselijke acceptorantilichamen REI (REI) voor de lichte keten en KOL (KOL) voor de zware keten, van de zware (HTNF3) en lichte (hTNF3) ketens van het muize MAb HTNF3 en gehumaniseerde geënte lichte (gHTNF3) en zware (ghTNF3) ketens; fig. 5 toont een grafiek waarin het vermogen van muize CB0010 (hTNFl) en CDR-geënt CB0010 (GhTNFl; CDP571) om te competeren met HRP-geconjugeerd muize HTNF1 wat betreft binding aan recombinant menselijk TNFa, wordt vergeleken, en fig. 6 toont een grafiek waarin het vermogen van muize HTNF1 (CB0010) en CDR-geënt HTNF1 (CP571) om recombinant TNFa in de biologische bepaling L929 te neutraliseren, wordt vergeleken.

Voorbeeld 1 CDR-enten van muize antilichamen tegen TNFa

Een aantal muize MAbs tegen menselijk TNFa werden met CDR geënt, in wezen zoals in detail is beschreven in WO 91/09967 voor het CDR-enten van het muize antilichaam OKT3 tegen CD3. In dit voorbeeld en in de volgende voorbeelden werden de chimere en CDR-geënte gehumaniseerde antilichamen vervaardigd onder toepassing van constante gebieden van menselijk IgG4, in wezen zoals beschreven is in WO 91/09967 voor de bereiding van γ4 chimere en CDR-geënte OKT3-antili-chamen. Het zal echter duidelijk zijn, dat menselijke constante gebieden van andere types en isotypes, bijvoorbeeld IgGl, IgG2 en IgG3 ook gebruikt zouden kunnen worden zonder dat de beschreven methoden in belangrijke mate gewijzigd hoeven te worden.

Deze antilichamen tegen hTNFa waren de muize MAbs die aangeduid zijn als CB0006 (ook bekend als 61E71), CB0010 (ook bekend als hTNFl) , hTNF3 en 101.4. Een korte samenvatting van het CDR-enten van elk van deze antilichamen wordt hieronder gegeven.

CB0006

Een soortgelijke analyse als beschreven in Voorbeeld 1, onderdeel 12.1 van WO 91/09967 werd uitgevoerd voor CB0006, en voor de zware keten werden 10 raamwerkres-ten op de posities 23, 24, 48, 49, 68, 69, 71, 73, 75 en 88 geïdentificeerd als resten die zo mogelijk moeten worden behouden als muizeresten. De menselijke raamwerken die gekozen werden voor het CDR-enten van dit antilichaam en de hTNF3- en 101.4-antilichamen waren REI voor de lichte keten en KOL voor de zware keten. De aminozuursequenties van de variabele gebieden van het muize CB0006 (CB6) (zware en lichte ketens), REI (REI) lichte keten en KOL (KOL) zware keten, worden weergegeven in Fig. 3.

Drie genen werden geconstrueerd, waarvan de eerste codeerde voor de aminozuurresten 23, 24, 48, 49, 71 en 73 [gH341(6)] als muizeresten. De aminozuursequentie van het variabele gebied die door dit eerste gen wordt gecodeerd, is weergegeven als gCB6 in de samenvatting voor de zware ketens in Fig. 3. Het tweede gen had ook aminozuurresten 75 en 88 als muizeresten [gH34l(8)J terwijl het derde gen bovendien aminozuurresten 68, 69, 75 en 88 als muizeresten had [gH341(10)J. Elk gen werd tot co-expressie gebracht met gL221, de minimaal geënte lichte keten (enkel CDRs) die weergegeven is als gCB6 in de samenvatting van zware ketens in Fig. 3. De gL221/gH341(6) en gL221/gH34l (8) antilicha-men bonden beide even goed aan TNF als muize 61E71. Het gL221/gH341(10) antilichaam kwam niet tot expressie en deze combinatie werd niet verder meegenomen.

Vervolgens werd het gL221/gH341(6) antilichaam beoordeeld in een competitieproef met L929-cellen waarbij het antilichaam een competitie aangaat met de TNF-receptor op L929-cellen wat betreft binding aan TNF in oplossing. Bij deze proef was het gL221/gH341(6) antilichaam ongeveer 10% zo actief als muize CB0006.

CB0010 fook bekend als hTNFl) CB0010 is een monoclonaal antilichaam dat een epitoop van menselijk TNFa herkent. Het EU menselijk raamwerk werd gebruikt voor CDR-enten van zowel de zware als de lichte variabele gebieden. De aminozuursequenties van de zware en lichte variabele gebieden van EU (EU), CB0010 (h t n f 1) en geënte versies van CB0010 (gEU, licht; 2hEUg, zwaar) zijn weergegeven in Fig. 1.

Zware keten

In de CDR-geënte zware keten werden muize CDRs gebruikt op posities 26-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) en 95-102 (CDR3). Muizeresten werden ook gebruikt in de raamwerken op de posities 48, 67, 69, 71, 73, 76, 89, 91, 94 en 108. Vergelijking van de zware-ketenresten van TNF1 van de muis en EU van de mens brengt aan het licht dat deze identiek zijn op de posities 23, 24, 29 en 78.

Lichte keten

In de CDR-geënte lichte keten werden muize CDRs gebruikt op de posities 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) en 89-97 (CDR3). Daarnaast werden muizeresten gebruikt in de raamwerken op de posities 3, 42, 48, 49, 83, 106 en 108.

Vergelijking van de lichte-ketenresten van muize hTNFl en menselijk EU brengt aan het licht dat deze identiek zijn op de posities 46, 58 en 71.

De geënte CB0010 zware keten werd tot co-expressie gebracht met de chimere lichte keten, en het bindingsvermo-gen van het product werd vergeleken met dat van het chimere lichte keten/chimere zware keten-product in een TNF-bin-dingsproef. Het geënte zware ketenproduct bleek een enigszins beter bindingsvermogen voor TNF te hebben dan het volledig chimere product.

Evenzo werd een geënt zware keten/geënt lichte keten-product tot co-expressie gebracht en vergeleken met het volledig chimere product; het eerstgenoemde product bleek bijna dezelfde bindingseigenschappen te hebben als het laatstgenoemde product. Toen het geënte zware keten/ge-ënte lichte keten-product echter werd onderworpen aan de L929-proef (zie Voorbeeld 4) , bleek het een activiteit te hebben die slechts de helft was van die van het chimere product. Derhalve werden verdere CDR-entingsproeven uitgevoerd zoals beschreven in Voorbeeld 2.

hTNF3 hTNF3 herkent een epitoop op menselijk TNFa. De sequentie van hTNF3 vertoont slechts 21 verschillen verge leken met CB0006 in de variabele gebieden van de lichte en zware ketens, 10 in de lichte keten (2 in de CDRs op de posities 50 en 96; en 8 in het raamwerk op de posities 1, 19, 40, 45, 46, 76, 103 en 106) en 11 in de zware keten (3 in de CDR-gebieden op de posities 52, 60 en 95; en 8 in het raamwerk op de posities 1, 10, 38, 40, 67, 73, 87 en 105). De aminozuursequenties van de variabele gebieden van de lichte en zware ketens van hTNF3 (Htnf3, licht; hTNF3, zwaar), CDR-geënt hTNF3 (gHTNF3, licht; ghTNF3, zwaar) en REI (REI, licht) en KOL (KOL, zwaar) zijn weergegeven in Fig. 4. De lichte en zware ketens van de CB0006 en hTNF3 chimere antilichamen kunnen worden uitgewisseld zonder verlies van activiteit in de directe-bindingsproef. Het vermogen van CB0006 om competitie aan te gaan met de TNF-receptor op L929-cellen voor TNFa is echter een ordegrootte minder dan dat van hTNF3. Gebaseerd op de CDR-entgegevens van CB0006 zijn de gL221- en gH341-(+23, 24, 48, 49, 71 en 73 als muizeresten)-genen geconstrueerd voor hTNF3 en onderzocht en het verkregen geënte antilichaam bindt goed aan TNFa, maar geeft een zeer slechte competitie in de L929-bepaling. Het gL221-gen codeert voor het gHTNF3 en het gH341, etc.-gen codeert voor de variabele-gebiedssequenties van ghTNF3, zoals weergegeven in Fig. 4. Het is waarschijnlijk dat in dit geval andere raamwerkresten gewijzigd dienen te worden om het competitieve bindingsvermogen van dit antilichaam te verbeteren.

101.4 101.4 is nog een muize MAb dat menselijk TNFa kan herkennen. De zware keten van dit antilichaam vertoont een goede homologie met KOL en derhalve is het CDR-enten gebaseerd op REI voor de lichte keten en KOL voor de zware keten. De aminozuursequenties van de variabele gebieden van de zware en lichte ketens van 101.4 (101/4) en een CDR-geënte versie van 101.4 (gl014) en de variabele gebieden van de lichte keten van REI (1 r e i) en de zware keten van KOL (KOL) zijn weergegeven in Fig. 2. Verscheidene genen voor geënte zware ketens zijn geconstrueerd met conservatieve keuzen voor de CDRs (gH341) en met één of een klein aantal niet-CDR-resten op de posities 73, 78 of 77 tot en met 79, als de aminozuren van de muis. Deze zijn tot co-expressie gebracht met de chimere lichte keten of de Kabat CDR-geënte lichte keten. In alle gevallen wordt binding met TNF waargenomen die gelijkwaardig is aan die van het chimere antilichaam, en bij co-expressie met cL kunnen de verkregen antilichamen de competitie in de L929-bepaling goed aan. Echter, met gL221 is het vermogen van de verkregen antilichamen om competitie aan te gaan met de TNF-receptor op L929-cellen voor wat betreft TNF tenminste een grootte-orde kleiner.

Aangetoond is dat muizeresten op andere posities in de zware keten, bijvoorbeeld op 23 en 24 tezamen of op 76 geen verbetering geven van het competitieve vermogen van het geënte antilichaam in de L929-bepaling.

Voorbeeld 2

Verder CDR-enten van muize antilichamen CB0010 en 101.4 teaen menseliik TNFa

De muize monoclonale antilichamen CB0010 en 101.4 tegen menselijk TNFa werden verder geënt met CDR, in wezen zoals beschreven in WO 91/09667.

CB0010 CB0010 is een monoclonaal antilichaam dat een epitoop op menselijk TNFa herkent. Het menselijke EU raamwerk werd gebruikt voor het CDR-enten van zowel de zware als de lichte variabele gebieden.

De aminozuursequenties van de variabele gebieden van de zware en lichte ketens van de EU acceptor, CB0010 (h t n f 1) muizedonor en CDR-geënte (gEU, lichte keten en 2HEUg, zware keten)-antilichamen zijn weergegeven in Fig. 1.

Zware keten

In de CDR-geënte zware keten (2hEUg), werden muize CDRs gebruikt op de posities 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) en 95-102 (CDR3). Muizeresten werden ook gebruikt in de raamwerken op de posities 12, 27, 30, 38, 46, 48, 66, 67, 69, 71, 73, 76, 83, 89, 91, 94 en 108. Vergelijking van de zware-ketenresten van muize CB0010 en menselijk EU brengt aan het licht dat deze identiek zijn op de posities 23, 24, 29 en 78.

Lichte keten

In de CDR-geënte lichte keten (gEU) werden muize CDRs gebruikt op de posities 24-34 (CDR1), 50-65 (CDR2) en 89-97 (CDR3). Bovendien werden muizeresten gebruikt in de raamwerken op de posities 3, 42, 48, 49, 106 en 108. De menselijke consensusrest (valine) werd gebruikt op positie 83. Vergelijking van de lichte-ketenresten van muize CB0010 en menselijk EU brengt aan het licht dat deze identiek zijn op de posities 46, 58 en 71.

De geënte zware keten van CB0010 werd tot co-ex-pressie gebracht met de chimere lichte keten en het bin-dingsvermogen van het product werd vergeleken met dat van het chimere lichte keten/chimere zware keten-product in een TNF-bindingsbepaling. Het geënte zware-ketenproduct bleek een enigszins beter bindingsvermogen voor TNF te hebben dan het volledig chimere product.

Evenzo werd een geënte zware keten/geënte lichte keten-product tot co-expressie gebracht en vergeleken met het volledig chimere product; het eerstgenoemde product bleek bindingseigenschappen te hebben die bijna dezelfde waren als die van het laatstgenoemde product. De specifieke combinatie van geënte lichte keten (gEU) en geënte zware keten (2hEUg), zoals weergegeven in Fig. 1, verschaft het antilichaam dat bekend is als CDP571. Het muize CB0010 (CB0010), chimere CB0010 (chimere CB0010) en het geënte zware keten/geënte lichte keten-product (CDP571) werden vergeleken wat betreft binding aan menselijk TNFa in een standaardbepaling. De verkregen resultaten worden weergege ven in onderstaande tabel, uitgedrukt in de KD (pM) die voor elk antilichaam gemeten is.

Antilichaam KD (pM) CB0010 80

Chimeer CB0010 81 CDP571 87

Het volledig geënte antilichaamproduct (CDP571) is thans in pre-klinische ontwikkeling voor behandeling van het sepsis-syndroom en acute afstotingsreacties van trans-plantaten.

101.4 101.4 is nog een ander muize MAb dat menselijk TNFa kan herkennen. De zware keten van dit antilichaam vertoont een goede homologie met KOL en het CDR-enten is derhalve gebaseerd op REI voor de lichte keten en KOL voor de zware keten. Een verbeterd CDR-geënt product is bereid. Aminozuursequenties van variabele gebieden voor REI (rei, lichte keten), KOL (KOL, zware keten) muize 101.4 (101/4, zware en lichte keten) en volledig geënt antilichaam (gl014, zware en lichte keten) zijn weergegeven in Figuur 2.

Zware keten

In de CDR-geënte zware keten (gl014) werden muize CDRs gebruikt op positie 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) en 95-102 (CDR3). Muizeresten werden ook gebruikt in het raamwerk op de posities 4, 11, 23, 24, 28, 73, 77, 78, 79, 91, 93, 94 en 108.

Lichte keten

In de CDR-geënte lichte keten (gl014) werden muize CDRs gebruikt op de posities 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) en 89-97 (CDR3). Daarnaast werden muizeresten gebruikt in het raamwerk op de posities 1, 3, 4, 39, 73, 105 en 107. De menselijke consensusrest (valine) werd gebruikt op positie 104.

De volledig geënte zware en lichte keten (gl014) werden tot coëxpressie gebracht en hun binding met TNF werd vergeleken met muize- en chimeer 101.4 en ook het volledig geënte (gEU/2hEUg, CDP571) CBOOlo-antilichaam. Het volledig geënte 101.4 antilichaam bleek bindingseigenschappen voor menselijk TNFa te hebben die ongeveer gelijk waren aan die van de muize, chimere en geënte CB0010 antilichamen.

Voorbeeld 3

In vitro vergelijking van muize antilichamen en CDR-qeënte antilichamen A. Affiniteitsbepalingen voor muize CB0010 en CDP571

Materialen en methoden

Materialen: PBS/BSA: Dulbeccos PBS + 1% (gew./vol) runder serumalbumine.

TNF: 50nM ree. menselijk TNFa (Bissendorf Bioche-micals) , 0,85 /^g/ml in PBS/BSA

Voorraad 125I-TNF: 5μθί, 185kBq (Amersham International) opgelost in 500 μΐ water en bewaard bij -70°C.

Werkoplossing 125I-TNF: 62pM voor de titratiecurve en 124pM voor Scatchard-analyse, in PBS/BSA.

Antilichamen: gezuiverd muize CB0010 (mHTNFl) en CDP571 werden kwantitatief bepaald met A280nm (Elmg/ml, 280nm'*1*4) , en verdund tot een concentratie van 1 μg/ml voor titratie of 200 ng/ml voor Scatchard-analyse.

Immunokralen: Geite anti-muize IgG-geheel mole- cuul-agarose of geite anti-menselijk IgG-geheel molecuul-agarose (Sigma) werden onverdund gebruikt.

Methode

Antilichaamtitratie: mHTNFl en CDP571 werden getitreerd in zich verdubbelende verdunningen (100 μΐ elk) ter verkrijging van in totaal 16 monsters waaraan 125I-TNF (100 μΐ, 62pM) werd toegevoegd. De uiteindelijke hoogste concentratie antilichaam was 500 ng/ml en die van 125I-TNF was 31pM. Controlebuizen (8) bevatten enkel 125I-TNF en PBS/BSA. Men liet de monsters tot evenwicht komen gedurende de nacht bij kamertemperatuur onder schudden. Vervolgens werd 25 μΐ geite anti-muis-agarose toegevoegd aan de mHTNFl-monsters en werd 50 μΐ geite anti-menselijke kralen toegevoegd aan de CDP571-monsters behalve aan de volledig uit 125I-TNF bestaande controles. Er werd gecorrigeerd voor niet-specifieke absorptie van 125I-TNF aan de agarosekralen door toevoegen van kralen aan 4 van de controles en vergelijken van supernatant-tellingen voor deze monsters met die van de monsters met daarin PBS/BSA in plaats van de kralen. Na 1 uur equilibratie bij kamertemperatuur werd PBS/BSA (0,5 ml) toegevoegd, waarna de monsters gecentrifugeerd werden bij 1500 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten bij 20°c. Het supernatant (0,5 ml) werd verwijderd en de radioactiviteit werd geteld in een gamma-teller.

Bevestigd werd dat 125I-TNF zich op dezelfde wijze gedroeg als het niet-gemerkte materiaal bij deze bepaling door het uitvoeren van de antilichaamtitratie in aanwezigheid van mengsels van 125I-TNF en niet-gemerkt TNF (25 en 75% 125I-TNF) in dezelfde totaalconcentratie.

Scatchard-analyse: Voor beide antilichamen werd niet-gemerkt TNF (100 μΐ, 50nM) in duplo getitreerd in 13 zich verdubbelende verdunningen. Eén monster met daarin PBS/BSA in plaats van TNF werd voor elk antilichaam opgenomen. 125I-TNF (50 μΐ, 124pM) werd aan elk monster toegevoegd. Een constante hoeveelheid antilichaam,bepaald uit de titratiecurve (50 μΐ, 200ng/ml) werd vervolgens toegevoegd. Dit gaf de volgende eindconcentraties: antilichaam, 50 ng/ml; TNF, 25nM hoogste concentratie; 125I-TNF, 31pM. Men liet de monsters gedurende de nacht tot evenwicht komen en behandelde ze op precies dezelfde wijze als de monsters voor de antilichaamtitratie.

Berekeningen

Titratiecurves

Gebonden 125I-TNF cpm = NSB cpm - supernatant cpm Gebonden 125I-TNF cpm

= B/T

Totaal 125I-TNF

NSB = niet-specifieke absorptie blanco, supernatant cpm Totaal = totaal aantal tellen voor enkel 125I-TNF

B/T werd uitgezet tegen de antilichaamconcentratie en de geschikte antilichaamconcentratie voor gebruik bij de Scatchard-analyses werd gekozen bij B/T = 0,6.

Scatchard-analvse

Het gemiddelde van twee bepalingen werd steeds gebruikt.

NSB = totaal cpm-NSB supernatant cpm Vrij cpm = monster cpm + NSB

Percentage vrij TNF = vrij/totaal (F/T) =

monster cpm + NSB cpm 1-F/T

_ = B/F = _

Totaal cpm F/T

B/F werd uitgezet tegen Gebonden TNF ter verkrijging van een helling van -1/Kd waaruit Kd werd berekend.

Resultaten

Dissociatieconstanten voor muize CB0010 en CDP571

Antilichaam Kd.M

Muize HTNF1 1,3 x 10-10 CDP571 1,4 x 10-10

B. Competitie van muize CB0010 (Muhtnflï en CDP571 (GrhTNFl) met HRP-qeconiugeerd in muize CB0010 voor vat betreft binding aan rhuTNF

Methode

Een microtiterplaat met 96 putjes (Nunc, Maxisorb) werd bekleed met 100 μΐ/putje TNF in een concentratie van 0,5 μg/ml. Een reeks verdunningen van muize antilichaam of geënt antilichaam werd bereid onder toepassing van PBS/1% BSA als verdunningsmiddel, van 200 ^g/ml tot 0,01 ^g/ml. 50 μΐ antilichaam werd toegevoegd aan elk putje gevolgd door 50 μΐ HRP-muize CB0010 in drie concentraties (0,625, 0,315 en 0,16 μg/ml). De platen werden twee uur bij kamertemperatuur onder roeren geïncubeerd, viermaal gewassen met PBS, waarna 100 μΐ TMB-substraat werd toegevoegd. De optische dichtheid werd gemeten en de OD werd uitgezet tegen de antilichaamconcentratie.

Conclusies

De curves voor zowel muize antilichaam (MuhTNFl) als geënt antilichaam (GrhTNFl) kunnen op elkaar worden gelegd, wat aangeeft dat beide antilichamen met een soortgelijke affiniteit competitie aangaan voor wat betreft binding aan TNF (zie Figuur 5).

Voorbeeld 4

Vergelijking van muize CBOOIO en CDR-aeënt CDP571 antilichamen in een biologische bepaling en in een diermo-delproef A. Neutralisering van TNF door CBOOIO en CDP571 in de L929-bepaling

Het vermogen van het oorspronkelijke muize antilichaam CBOOIO (hTNFl) en het CDR-geënte antilichaam CDP571 om recombinant menselijk TNF te neutraliseren werd bepaald onder toepassing van de biologische bepaling met L929. De bepaling maakt gebruik van de L929 muize fibroblastoïde cellijn die door TNF wordt gedood. De bepaling wordt uitgevoerd in aanwezigheid van lug/ml actinomycine D dat de cellen gevoeliger maakt voor TNF. Een reeks verdunningen van de twee antilichamen werd gemengd met een constante hoeveelheid recombinant menselijk TNF (100 pg/ml) en toegevoegd aan een L929 monolaag in vlakke platen met 96 putjes. Na 16 uur incubatie werden de cellen die niet door TNF waren gedood zichtbaar gemaakt met behulp van de kleurstof kristalviolet. De schijnbare hoeveelheid niet geneutraliseerd TNF (overgebleven TNF) werd bepaald door vergelijking met een recombinant TNF standaardcurve. De resultaten van een representatief experiment waarbij het overgebleven TNF is uitgezet tegen de antilichaamconcentratie, zijn weergegeven in Figuur 6. Hieruit kan worden afgeleid dat CB0010 en CDP571 soortgelijke neutraliseringsactiviteiten hebben.

B. Effect van CDP571 in sepsis modelnroeven bii bavianen.

In dit onderzoek werd het effect van de voorafgaande behandeling met CDP571 op de fysiologische gevolgen van ernstige sepsis (met inbegrip van de dood) beoordeeld. Bavianen werden gekozen als een geschikt onderzoeksobject, aangezien het bekend is dat CDP571 baviane-TNF neutraliseert. Mannelijke volwassen bavianen, Papio ursinus. met een gewicht van 20-25 kg werden geanesthetiseerd met ketamine-hydrochloride en natriumpentabarbiton en van instrumenten voorzien voor het meten van de bloeddruk, cardiale index (door thermoverdunning), ECG en vuldrukken van de rechterboezem. Een infusie van ofwel enkel zoutoplossing ofwel antilichaam werd vervolgens gegeven gedurende 120 minuten met een snelheid van 2,5 ml/kg/h waarna een infusie van 12 0 minuten werd gegeven van levende E. Coli met dezelfde infusiesnelheid. De gebruikte bacteriestam was Hinshaw's stam B7 ([086a: 61], ATCC 33985) die in de log groeifase werd toegediend in een dosis van 2 x 109 CFU/kg waardoor een plasmaconcentratie van 2-2,5 x 105 CFU/ml aan het eind van de infusie werd verkregen. Na nog eens 120 minuten werden de dieren teruggebracht in hun kooien, waar ze vrije toegang tot voedsel en water kregen en gedurende drie dagen tweemaal daags werden gevolgd ten aanzien van cardiovasculaire veranderingen. Aan alle dieren werd een constante vloeistofvervangingsinfusie gegeven van 5 ml/kg/h die zonodig werd aangepast om de juiste vuldrukken van de rechterboezem te handhaven. Bavianen die tijdens de handeling waren doodgegaan of die de proefperiode van 72 uur hadden overleefd en daarna waren gedood, werden onderworpen aan lijkschouwing. Alle belangrijke organen werden beoordeeld op grove macropathologische schade volgens een semi-kwantitatieve schaal (waarbij +++ het meest ernstig is).

De dieren werden willekeurig in één van de volgende vier behandelingsgroepen verdeeld: - enkel zoutoplossing - CDP571 0,1 mg/kg - CDP571 1,0 mg/kg - CB0010 0,1 mg/kg (oorspronkelijke irtuize antili- chaam)

Het percentage overleving en de cumulatieve beoordelingen van de beschadigingen aan organen worden weergegeven in tabel 1. CDP571 in een hoeveelheid van 1,0 mg/kg voorkwam overlijden en verminderde significant (P<0,005) het optreden van orgaanbeschadiging in dit model; bovendien waren deze effecten dosis-gerelateerd (P<0,005). Voorts waren het percentage overleving en de beoordeling van de beschadiging aan organen die werden waargenomen met CB0010 ongeveer gelijk aan die welke werden waargenomen met CDP571 in dezelfde dosis, wat duidt op een gehandhaafde in vivo potentie van CDP571 vergeleken met het muize antili-chaam waarvan het is afgeleid.

TABEL 1

Sepsis-onderzoek bij bavianen

Overleving na i.v.-toediening van 2 x 109 CFU E. coli 2 uur na zoutoplossing of CDP571

Literatuurlijst 1. Kohier & Milstein, Nature 265. 295-497, 1975 2. Chatenoud et al. (1986), J. Immunol. 137. 830-838.

3. Jeffers et al. (1986), Transplantation, 43., 572- 578.

4. Begent et al. Br. J. Cancer 62: 487 (1990).

5. Verhoeyen et al. Science, 239. 1534-1536, 1988.

6. Riechmann et al. nature, 332. 323-324, 1988.

7. Kabat, E.A., Wu. T.T., Reid-Miller, M., Perry, H.M., Gottesman, K.S., 1987, in Sequences of

Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA.

8. Wu, T.T., and Kabat, E.A., 1970, J. Exp. Med. 132 211-250.

9. Queen et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci- USA, 86/ 10029-10033 en WO 90/07861.

10. Tempest et al. (1991), Biotechnology, 9, 266-271.

11. Beutler et al. (1985), Science, 234. 470-474.

12. Maniatis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, 1989.

13. Primose and Old, Principles of Gene Manipulation, Blackwell, Oxford, 1980.

14. Jones et al. (1986), Nature, 321. 522.

Claims (39)

1. Recombinant antilichaam molecuul dat specifiek is voor menselijk TNFa.

2. Recombinant antilichaammolecuul volgens conclusie 1 met een antigeen-bindingsplaats die is afgeleid van het muize monoclonale antilichaam CB0006 (ook bekend als 61E71), CB0010 (ook bekend als hTNFl), hTNF3 of 101.4.

3. Recombinant antilichaammolecuul volgens conclusie 1 of 2 dat een gehumaniseerd antilichaammolecuul is.

4. Gehumaniseerd chimeer antilichaammolecuul volgens conclusie 3.

5. CDR-geënt, gehumaniseerd antilichaam volgens conclusie 3.

6. Zware keten van een CDR-geënt, gehumaniseerd antilichaam volgens conclusie 5 met een variabel gebied dat bestaat uit menselijke acceptor raamwerk en donor antigeen-bindingsgebieden, waarbij het raamwerk donorresten omvat op tenminste één van de posities 6, 23 en/of 24, 48 en/of 49, 71 en/of 73, 75 en/of 76 en/of 78 en 88 en/of 91.

7. CDR-geënte, gehumaniseerde zware keten volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat deze donorresten omvat op de posities 23, 24, 49, 71, 73 en 78, of op de posities 23, 24 en 49.

8. CDR-geënte, gehumaniseerde zware keten volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat deze donorresten omvat op de posities 2, 4, 6, 25, 36, 37, 39, 47, 48, 93, 94, 103, 104, 106 en 107.

9. CDR-geënte,gehumaniseerde zware keten volgens conclusie 7 of 8, met het kenmerk, dat deze donorresten omvat op één, sommige of alle van de volgende posities: 1 en 3, 69 (indien 48 verschilt tussen donor en acceptor), 38 en 46 (indien 48 de donorrest is), 67, 82 en 18 (indien 67 de donorrest is), 91, en één of meer van de posities 9, 11, 41, 87, 108, 110 en 112.

10. CDR-geënte, gehumaniseerde zware keten volgens één van de conclusies 5-9, met het kenmerk, dat deze donor CDRs op de posities 26-35, 50-65 en 95-100 omvat.

11. Lichte keten van een CDR-geënt, gehumaniseerd antilichaam volgens conclusie 5 met een variabel gebied dat bestaat uit menselijke acceptor raamwerk en donor antigeen-bindingsgebieden, waarbij het raamwerk donorresten omvat op tenminste één van de posities 1 en/of 3 en 46 en/of 47.

12. CDR-geënte lichte keten volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat deze donorresten op de posities 46 en 47 omvat.

13. Lichte keten van een CDR-geënt, gehumaniseerd antilichaam volgens conclusie 5 met een variabel gebied dat bestaat uit menselijke acceptor raamwerk en donor antigeen-bindingsgebieden, waarbij het raamwerk donorresten omvat op tenminste één van de posities 46, 48, 58 en 71.

14. CDR-geënte lichte keten volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat deze donorresten op de posities 46, 48, 58 en 71 omvat.

15. CDR-geënte lichte keten volgens conclusie 11 of 13, met het kenmerk, dat deze donorresten omvat op de posities 2, 4, 6, 35, 36, 38, 44, 47, 49, 62, 64-69, 85, 87, 98, 99, 101 en 102.

16. CDR-geënte lichte keten volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat deze donorresten omvat op één, sommige of alle van de volgende posities: 1 en 3, 63, 60 (indien 60 en 54 een potentiële zoutbrug kunnen vormen), 70 (indien 70 en 24 een potentiële zoutbrug kunnen vormen), 73 en 21 (indien 47 verschilt tussen donor en acceptor), 37 en 45 (indien 47 verschilt tussen donor en acceptor) en één of meer van de posities 10, 12, 40, 83, 103 en 105.

17. CDR-geënte lichte keten volgens één van de conclusies 11-16, met het kenmerk, dat deze donor CDRs op de posities 24-34, 50-56 en 89-97 omvat.

18. CDR-geënt antilichaammolecuul omvattende tenminste één CDR-geënte zware keten volgens één van de conclusies 6-10 en tenminste één CDR-geënte lichte keten volgens één van de conclusies 11-17.

19. CDR-geënte, gehumaniseerde zware keten van een antilichaam met een variabel gebied dat bestaat uit menselijke acceptor raamwerk (in het bijzonder EU menselijke acceptor raamwerk) en hTNFl donor antigeen-bindingsgebie-den, waarbij het raamwerk hTNFl donorresten omvat op de posities 12, 27, 30, 38, 46, 48, 66, 67, 69, 71, 73, 76, 83, 89, 91 en 94.

20. CDR-geënte, gehumaniseerde lichte keten van een antilichaam met een variabel gebied dat bestaat uit menselijke acceptor raamwerk (in het bijzonder EU menselijke acceptor raamwerk) en hTNFl donor antigeen-bindingsge-bieden, waarbij het raamwerk hTNFl donorresten omvat op de posities 3, 42 en 49.

21. CDR-geënt, gehumaniseerd antilichaammolecuul omvattende tenminste één CDR-geënte gehumaniseerde zware keten volgens conclusie 19 en tenminste één CDR-geënte gehumaniseerde lichte keten volgens conclusie 20.

22. CDR-geënte, gehumaniseerde zware keten van een antilichaam met een variabel gebied dat bestaat uit menselijke acceptor raamwerk (in het bijzonder KOL menselijke acceptor raamwerk) en 101.4 donor antigeen-bindingsgebie-den, waarbij het raamwerk 101.4 donorresten omvat op de posities 4, 11, 23, 24, 28, 73, 77, 78, 79, 91, 93 en 94.

23. CDR-geënte, gehumaniseerde lichte keten van een antilichaam met een variabel gebied dat bestaat uit menselijke acceptor raamwerk (in het bijzonder REI menselijke acceptor raamwerk) en 101.4 donorresten op de posities 1, 3, 4 en 73.

24. CDR-geënt, gehumaniseerd antilichaammolecuul omvattende tenminste één CDR-geënte, gehumaniseerde zware keten volgens conclusie 22 en tenminste één CDR-geënte, gehumaniseerde lichte keten volgens conclusie 23,

25. DNA-sequentie die codeert voor een zware of lichte keten van een antilichaammolecuul dat specifiek is voor menselijk TNFa.

26. DNA-sequentie die codeert voor een CDR-geënte zware keten volgens één van de conclusies 6-10, 19 of 22, of een CDR-geënte lichte keten volgens één van de conclusies 11-17, 20 of 23.

27. Clonerings- of expressievector die een DNA-sequentie volgens conclusie 26 bevat.

28. Gastheercel getransformeerd met een DNA-sequentie volgens conclusie 27.

29. Werkwijze voor de vervaardiging van een CDR-geënt antilichaam, omvattende het tot expressie brengen van een DNA-sequentie volgens conlcusie 25 of 26 in een getransformeerde gastheercel.

30. Werkwijze voor de vervaardiging van een recombinant of gehumaniseerd anti-hTNFa antilichaamproduct omvattende: (a) het opnemen in een expressievector van een operon met een DNA-sequentie welke codeert voor een zware keten van een antilichaam tegen hTNFa, en/of (b) het opnemen in een expressievector van een operon met een DNA-sequentie welke codeert voor een complementaire lichte keten van een antilichaam tegen hTNFa, (c) het transfecteren van een gastheercel met de vector of met elke vector; en (d) het kweken van de getransfecteerde cellijn ter vervaardiging van het anti-hTNFa antilichaamproduct.

31. Therapeutisch of diagnostisch preparaat dat een recombinant antilichaammolecuul volgens conclusie 1 in combinatie met een farmaceutisch aanvaardbare drager, verdunningsmiddel of excipiënt omvat.

32. Werkwijze voor de vervaardiging van een therapeutisch of diagnostisch preparaat, welke werkwijze omvat het mengen van een recombinant antilichaammolecuul volgens conclusie 1 met een farmaceutisch aanvaardbaar excipiënt, verdunningsmiddel of drager.

33. Therapeutische of diagnostische werkwijze omvattende het toedienen van een doeltreffende hoeveelheid van een recombinant antilichaammolecuul volgens conclusie 1 aan een mens of dier.

34. Recombinant antilichaammolecuul volgens conclusie 1 of een therapeutisch preparaat volgens conclusie 31 ten gebruike voor het tegengaan van neveneffecten die optreden door de vorming van TNF tijdens neoplastische therapie.

35. Recombinant antilichaammolecuul volgens conclusie 1 of een therapeutisch preparaat volgens conclusie 31 ten gebruike bij het uit de weg ruimen of verminderen van shock-verwante symptomen die optreden bij anti-lymfocyt-therapie.

36. Recombinant antilichaam volgens conclusie 1 of een therapeutisch preparaat volgens conlcusie 31 ten gebruike bij de behandeling van insufficiëntie van vele organen.

37. Recombinant antilichaam volgens conclusie 1 of een therapeutisch preparaat volgens conclusie 31 ten gebruike bij de behandeling van sepsis of septische/endo-toxische shock.

38. Werkwijze voor de behandeling van een mens of dier die lijdt aan of het risico loopt te gaan lijden aan een aandoening die gepaard gaat met een ongewenst hoog TNF-gehalte, welke werkwijze omvat het toedienen aan de patiënt van een doeltreffende hoeveelheid van een recombinant antilichaam volgens conclusie 1.

39. Werkwijze volgens conclusie 33 of 38, waarbij men doses anti-TNF antilichaamproduct toedient in het traject van 0,001-30 mg/kg/dag, bij voorkeur 0,01-10 mg/kg/dag of met bijzondere voorkeur 0,1-2 mg/kg/dag. -o-o-o-