ES2332435T3 - Vector dirigido a tumores. - Google Patents

Abstract

Vector que comprende por lo menos una secuencia nucleotídica ("NS") que codifica una proteína que se une al tumor que reconoce un antígeno 5T4 y opcionalmente que comprende una secuencia nucleotídica de interés ("NOI") que codifica un producto de interés ("POI"), siendo capaz el vector de expresar la proteína que se une al tumor en una célula de mamífero y es capaz de administrar una secuencia nucleotídica de interés ("NOI") que codifica un producto de interés ("POI") y/o un POI a un tumor.

Description

Vector dirigido a tumores.

La presente invención se refiere a un vector, preferentemente para su utilización en medicina.

Como es bien conocido en la técnica, un vector es una herramienta que permite o facilita la transferencia de una entidad desde un medio a otro. A modo de ejemplo, algunos vectores utilizados en las técnicas del ADN recombinante permiten entidades - tal como un segmento de ADN (tal como un segmento de ADN heterólogo, tal como un segmento de ADNc heterólogo) - que debe transferirse al interior de una célula diana. Opcionalmente, una vez dentro de la célula diana, el vector puede servir a continuación para mantener el ADN heterólogo dentro de la célula o puede actuar como una unidad de replicación de ADN. Ejemplos de vectores utilizados en las técnicas del ADN recombinante incluyen plásmidos, cromosomas, cromosomas artificiales o virus.

De este modo, pueden utilizarse vectores para liberar secuencias de proteínas y/o de nucleótidos para las células diana, tales como las células tumorales.

Sin embargo, como es bien sabido, las secuencias nucleotídicas y las proteínas son moléculas complejas que pueden producirse a partir de fuentes biológicas, más frecuentemente a partir de organismos modificados genéticamente o de cultivos de células. Además, los procedimientos para la producción de secuencias nucleotídicas y proteínas pueden ser complicados, muy laboriosos y costosos. Además, las propiedades farmacológicas y otros aspectos de la función de algunas proteínas - tales como las inmunoglobulinas procedentes de fuentes biológicas no humanas - y las secuencias nucleotídicas pueden diferenciarse frecuentemente en maneras importantes de la actividad de las correspondientes inmunoglobulinas humanas naturales producidas en las células humanas. A modo de información de antecedentes, una inmunoglobulina es un miembro de una familia de proteínas poliméricas relacionadas que son segregadas normalmente en las células de la estirpe de linfocitos B de un vertebrado, cuya función típica es unirse específicamente a la zona de una macromolécula identificada como sin control. Las inmunoglobulinas representan un componente principal del repertorio de respuestas inmunitarias del organismo y son sinónimos de "anticuerpos".

La causa principal de dichas diferencias en la actividad puede ser debida a las variaciones en el modelo de glucosilación de las proteínas procedentes de diferentes especies (estudiadas en Bebbington 1995; en Monoclonal Antibodies: the second generation ed. H. Zola págs. 165-181). Además, la administración generalizada de proteínas (especialmente las que contienen dominios de toxinas) y las secuencias nucleótidas pueden provocar problemas farmacocinéticos y toxicológicos adicionales (estudiado en Scheinberg and Chapman 1995. En Monoclonal antibodies (ed. Birch and Lennox) Capítulo 2.1).

Por lo tanto, la presente invención trata de proporcionar un sistema vectorial mejorado para administrar una secuencia nucleotídicas de interés y/o un producto expresado por la misma.

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un vector que comprende por lo menos una secuencia nucleotídica ("NS") que codifica una proteína que se une al tumor que reconoce un antígeno 5T4 y opcionalmente que comprende una secuencia nucleotídica de interés ("NOI") que codifica un producto de interés ("POI"), en la que el vector es capaz de expresar la proteína que se une al tumor en una célula de mamífero y es capaz de administrar una secuencia nucleotídica de interés ("NOI") que codifica un producto de interés ("POI") y/o un POI a un tumor.

Según un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un vector de la presente invención para su utilización en medicina.

Según un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un vector de la presente invención para su utilización en el tratamiento del cáncer.

Según un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona una composición que comprende un vector opcionalmente mezclado con un diluyente, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Según un quinto aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de un vector en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer.

Según un sexto aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de un vector en la preparación de un medicamento para suministrar la NS que codifica la proteína que se une al tumor y/o la proteína que se une al tumor y opcionalmente el NOI y/o el POI a una célula de mamífero.

Según un séptimo aspecto de la presente invención, se proporciona un sistema de suministro para dirigir por lo menos una NS que codifica una proteína que se une al tumor y opcionalmente un NOI que codifica un POI a una célula tumoral; en el que el sistema de suministro comprende un vector.

Según un octavo aspecto de la presente invención, se proporciona un sistema de suministro de genes según la presente invención para introducir uno o más genes que codifican una proteína que se une al tumor (TBP) en las células de la estirpe de células hematopoyéticas (preferentemente hematopoyéticas mieloides) ya sea in vivo o
ex vivo.

Según un noveno aspecto de la presente invención ,se proporciona un sistema de suministro para su utilización en medicina.

Según una forma de realización de la presente invención, se proporciona un vector genético de la presente invención que comprende un gen terapéutico o genes que codifican una TBP, funcionalmente unido a un elemento regulador de la expresión selectivamente funcional en un tipo de células presente en una masa tumoral.

Según una forma de realización de la presente invención, se proporciona un vector genético de la presente invención que comprende un gen terapéutico o genes en los que el gen terapéutico codifica una TBP, que además contiene uno o más dominios efectores.

Según un décimo aspecto de la presente invención, se proporciona un sistema de suministro para su utilización en el tratamiento del cáncer.

Según un undécimo aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de un sistema de suministro en la preparación de un medicamento para tratar una célula tumoral en la que el sistema de suministro se puede administrar ya sea in vivo o ex vivo.

Según una forma de realización de la presente invención, la utilización implica una combinación de una citocina o de un gen que codifica una citocina y uno o más genes de TBP según cualquiera de los aspectos anteriores de la invención.

Según un duodécimo aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de un vector en un procedimiento para preparar una proteína que se une al tumor que comprende expresar una NS que codifica una proteína que se une al tumor en dicho vector.

Según un decimotercer aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de un vector en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer en la que el vector comprende por lo menos una secuencia nucleotídica ("NS") que codifica una proteína que se une al tumor capaz de reconocer una célula tumoral; en la que el vector es capaz de expresar la proteína que se une al tumor en una célula de mamífero y es capaz de suministrar un secuencia nucleotídica de interés ("NOI") que codifica un producto de interés ("POI") para una célula de mamífero, preferentemente una célula tumoral, en la que el vector suministra el polinucelótido de interés ex vivo al tumor, y en el que la proteína que se une al tumor reconoce un antígeno 5T4.

Según un decimocuarto aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de un sistema de suministro de genes en la preparación de un medicamento para el tratamiento de células cancerosas de la estirpe celular hematopoyética en la que el vector comprende por lo menos una secuencia nucleotídica ("NS") que codifica una proteína que se une al tumor capaz de reconocer una célula tumoral; en la que el vector es capaz de expresar la proteína que se une al tumor en una célula de mamífero y es capaz de suministrar un secuencia nucleotídica de interés ("NOI") a un tumor, en la que el vector suministra el NOI a las células cancerosas, y en la que la proteína que se une al tumor reconoce un antígeno 5T4.

Según un decimoquinto aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento de suministro de un nucleótido de interés (NOI) o de un producto de interés (POI) codificado por dicho nucleótido de interés a un tumor, que comprende administrar el NOI o el POI a dicho tumor mediante la utilización de un vector en el que dicho vector comprende por lo menos una secuencia nucleotídica ("NS") que codifica una proteína que se une al tumor capaz de reconocer una célula tumoral; en el que el vector es capaz de expresar la proteína que se une al tumor en una célula de mamífero y es capaz de suministrar una secuencia nucleotídica de interés ("NOI") que codifica el producto de interés ("POI") a un tumor en el que el vector suministra el polinucleótido de interés ex vivo al tumor, y en el que la proteína que se une al tumor reconoce un antígeno 5T4.

Según un decimosexto aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento ex vivo para suministrar un NOI a una segunda célula adyacente a una primera célula que utiliza un vector para suministrar el polinucleótido a dicha primera célula, en el que dicho vector comprende por lo menos una secuencia nucleotídica ("NS") que codifica una proteína que se une al tumor capaz de reconocer una célula tumoral; en el que el vector es capaz de expresar la proteína que se une al tumor en una célula de mamífero y es capaz de suministrar la secuencia nucleotídica de interés ("NOI") a un tumor, y en el que el tumor que se une a la proteína reconoce un antígeno 5T4.

Según un decimoséptimo aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento ex vivo para expresar una NS que codifica una proteína que se une al tumor en una célula de mamífero en el cultivo, que comprende suministrar a dicha célula de mamífero un vector que comprende la NS que codifica la proteína que se une al tumor en la unión operable con un elemento funcional regulador de la expresión en una célula de mamífero, en la que dicha NS se expresa en dicha célula de mamífero, y en el que la proteína que se une al tumor reconoce un antígeno 5T4.

Preferentemente, el vector comprende el NOI.

En un aspecto preferido, el vector está expresando el POI.

El vector de la presente invención puede ser útil entre otras para aplicaciones médicas, tales como aplicaciones para diagnóstico o terapéuticas.

Preferentemente, el NOI es un NOI terapéutico y/o el POI en un POI terapéutico.

En ocasiones en el texto siguiente, la NS que codifica una proteína que se une al tumor y el NOI pueden referirse individual o colectivamente a que es un gen.

La NS que codifica una proteína que se une al tumor y el NOI pueden ser cualquier secuencia nucleotídica adecuada. Por ejemplo independientemente pueden ser ADN o ARN - que pueden prepararse por síntesis o pueden prepararse mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante o pueden aislarse de fuentes naturales o puede ser combinaciones de las mismas. El NOI puede ser una secuencia transcrita o una secuencia complementaria.

Puede haber muchas NS que codifican una proteína que se une al tumor o muchos NOI, que pueden unirse directa o indirectamente entre sí, o combinaciones de las mismas. Por lo tanto, el producto expresado puede tener dos o más dominios efectores (que pueden ser iguales o diferentes) y/o dos o más dominios de TBP (que pueden ser iguales o diferentes).

Preferentemente, en la utilización el vector es capaz de administrar el NOI y/o el POI en el interior de una masa tumoral.

Además de la célula cancerosa, los tipos de células presentes dentro de una masa tumoral incluyen, pero no se limitan a macrófagos, linfocitos, linfocitos que se infiltran en el tumor, células endoteliales, etc.

Preferentemente, la NS que codifica una proteína que se une al tumor comprende por lo menos un dominio que se une al tumor (TBP) capaz de interactuar por lo menos con una molécula de la superficie celular asociada al tumor ("TACSM") que es un antígeno 5T4.

Ejemplos de una TBP incluyen: secuencias de cadena pesada y ligera de una zona variable de inmunoglobulina (Ig) (de procedencia humana y animal), anticuerpo modificado genéticamente o uno de entre un banco de presentación de fagos. Un banco de presentación de fagos es una técnica de expresión de genes de inmunoglobulina en bacteriófagos que se ha desarrollado como un medio de obtener anticuerpos con las especificidades de unión deseadas. Se han desarrollado sistemas de expresión, basados en el bacteriófago lambda, y más recientemente en el fago filamentoso. Los sistemas de expresión de bacteriófagos pueden diseñarse para permitir que las cadenas pesadas y ligeras formen combinaciones aleatorias en las que se prueba su capacidad para unirse al antígeno deseado.

La TBP puede contener también un dominio efector que se activa en la unión de la TBP a la TASCM. El dominio o dominios efector(es) puede(n) activarse en la unión de la TBP a una TASCM lo que conduce a la inhibición de la proliferación, supervivencia o diseminación de las células tumorales. El dominio efector puede poseer actividad enzimática (tal como una enzima que activa un profármaco) o el dominio efector puede incluir una toxina, o un potenciador inmunitario, tal como una citocina/linfocina tal como las enumeradas anteriormente.

Preferentemente la TBP comprende uno o más dominios de unión capaces de interactuar con uno o más TACSM que están presentes en las células cancerosas - cuyas TACSM pueden ser iguales o diferentes, pero por lo menos una reconoce un antígeno 5T4.

La expresión "que interactúa" incluye la unión directa, lo que conduce a un efecto biológico como resultado de dichas unión.

Preferentemente la TBP es o comprende por lo menos parte de un anticuerpo.

Como es bien sabido, los anticuerpos desempeñan una función clave en el sistema inmunitario. En resumen, el sistema inmunitario funciona en tres maneras fundamentalmente diferentes: por inmunidad humoral, por inmunidad celular y por secreción de las proteínas estimulantes, denominadas linfocinas. La inmunidad humoral se basa en las proteínas denominadas en conjunto inmunoglobulinas que constituyen aproximadamente el 20% de las proteínas en la sangre. Una sola molécula de inmunoglobulina se denomina anticuerpo, pero "anticuerpo" se utiliza también para significar muchas moléculas diferentes dirigidas todas contra la misma molécula diana. La inmunidad humoral implica también complementar, una serie de proteínas que son activadas para destruir las bacterias tanto de manera inespecífica como junto con el anticuerpo.

En inmunidad celular, las células intactas son responsables de las reacciones de reconocimiento y eliminación. La primera línea de defensa del cuerpo es el reconocimiento y la destrucción de los microorganismos por fagocitos, células especializadas para la ingestión y digestión del material no deseado. Estas células comprenden neutrófilos y macrófagos. Una función clave de los anticuerpos es ayudar a los fagocitos a reconocer y destruir materiales extraños.

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Con el objetivo de realizar estas funciones, el anticuerpo se divide en dos zonas: dominios de unión (Fab) que interactúan con el antígeno y dominios efectores (Fc) que señalan el inicio de procesos tal como la fagocitosis. Cada molécula de anticuerpo consta de dos clases de cadenas polipeptídicas, cadenas ligeras (L) y cadenas pesadas (H). Un solo anticuerpo tiene dos copias idénticas de la cadena L y dos de la cadena H. El dominio del terminal N de cada cadena forma las zonas variables, que constituyen los puntos de unión del antígeno. El dominio del terminal C se denomina zona constante. Los dominios variables de las cadenas H (V_{H}) y L (V_{L}) constituyen una unidad de Fv y pueden interactuar íntimamente para formar una unidad Fv monocatenaria (ScFv). En la mayoría de las cadenas H, se encuentra una zona bisagra. Esta zona bisagra es flexible y permite que las zonas de unión Fab se desplacen libremente con respecto al resto de la molécula. La zona bisagra es también el lugar de la molécula más sensible a la acción de las proteasas que pueden dividir el anticuerpo en la zona de unión del antígeno (Fab) y la zona efectora (Fc).

La estructura del dominio de la molécula de anticuerpo es favorable a la modificación genética de la proteína, lo que facilita el intercambio entre las moléculas de los dominios funcionales que llevan actividades de unión del antígeno (Fab y Fv) o funciones efectoras (Fc). La estructura del anticuerpo también facilita el producir anticuerpos con una capacidad de reconocimiento del antígeno unidos a las moléculas tales como toxinas, linfocitos o factores de crecimiento.

Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos homogéneos de la misma especificidad antigénica que representan el producto de un solo clon de las células que producen anticuerpos. Se reconoció que los anticuerpos monoclonales ofrecían las bases para productos terapéuticos humanos. Sin embargo, aunque los anticuerpos de ratón son similares a los anticuerpos humanos, son suficientemente diferentes los que son reconocidos por el sistema inmunitario como cuerpos extraños, dando lugar de este modo a una respuesta inmunológica. Esta respuesta del anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) limita la utilidad de los anticuerpos de ratón como productos terapéuticos humanos.

La tecnología del anticuerpo híbrido implica el trasplante de los dominios variables del anticuerpo de ratón global en los dominios constantes del anticuerpo humano. Los anticuerpos híbridos son menos inmunógenos que los anticuerpos de ratón pero conservan su especificidad para el anticuerpo y presentan respuestas a HAMA reducidas.

En los anticuerpos híbridos, la zona variable continúa siendo completamente murina. Sin embargo, la estructura del anticuerpo hace posible producir zonas variables de especificidad comparable que son predominantemente de origen humano. El punto de combinación del antígeno de un anticuerpo se forma en las 6 zonas determinantes de complementariedad (CDR) de la parte variable de las cadenas pesada y ligera. Cada dominio del anticuerpo consta de siete hojas \beta antiparalelas que forman un barril \beta con bucles que conectan las cadenas \beta. Entre los bucles están las zonas CDR. Es factible además de las CDR y su especificidad asociada de una estructura \beta en barril a otra. Esto se denomina injerto de CDR. Los anticuerpos injertados con CDR aparecen en los estudios clínicos iniciales no son tan fuertemente inmunógenos como los anticuerpos de ratón o híbridos. Además, las mutaciones pueden realizarse fuera de la CDR con objeto de aumentar la actividad de unión de la misma, o en anticuerpos denominados humanizados.

Los fragmentos Fab, Fv y Fv monocatenario (ScFv) con VH y VL unidas por un enlazador polipeptídico presentan especificidades y afinidades para el antígeno similar a los anticuerpos monoclonales originales. Las proteínas de fusión ScFv pueden producirse con una molécula distinta de anticuerpo acoplada a los terminales amino o carboxi. En estas moléculas, puede utilizarse el Fv para la dirección específica de la molécula acoplada a una célula que expresa el antígeno apropiado. Los anticuerpos bifuncionales pueden crearse también modificando genéticamente dos especificidades de unión diferentes en una cadena de un solo anticuerpo. Los anticuerpos bifuncionales Fab, Fv y ScFv pueden comprender dominios modificados genéticamente tales como los dominios injertados con CDR o humanizados.

En la terapia enzimática dirigida por virus (ADEPT), se administra un gen extraño a células normales y cancerosas mediante un vector vírico, tal como un vector retrovírico. El gen extraño codifica una enzima que puede convertir un profármaco no tóxico (p. ej. 5-fluorocitosina) en un metabolito tóxico (5-fluorouracilo) que destruirá aquellas células que lo hacen (Sikora et al. 1994 Ann. New York Acad. Sci. 71b: 115-124). Si el activador utilizado es específico para el tumor, entonces el producto tóxico solamente se sintetizará en las células tumorales. Estudios en modelos animales han demostrado que este tipo de tratamiento puede suministrar hasta 50 veces más fármaco que por medios convencionales (Connors y Knox 1995 Stem Cells 13: 501-511). Una variación de esta técnica utiliza anticuerpos asociados al tumor conjugados con enzimas que convierten profármacos para proporcionar la administración específica a los tumores. Este procedimiento se denomina terapia con profármaco enzimático dirigida al anticuerpo (ADEPT) (Maulik S. y Patel SD. "Molecular Biotechnology" 1997 Wiley-Liss Inc pág. 45).

Se conoce un gran número de anticuerpos monoclonales y de moléculas inmunoglobulinoformes los cuales se unen específicamente a los antígenos presentes en las superficies de los tipos de células específicas tales como las células tumorales. Los procedimientos para identificar, caracterizar, clonar y modificar genéticamente estas moléculas están muy demostrados, por ejemplo utilizando los hibridomas procedentes de ratones o ratones transgénicos, bancos de presentación de fagos o bancos de ScFv. Los genes que codifican inmunoglobulinas o las moléculas inmunoglobulinoformes pueden expresarse en varios sistemas de expresión heterólogos. Las proteínas glucosiladas grandes incluyendo las inmunoglobulinas se segregan de manera eficaz y se reúnen en las células eucarióticas, particularmente en las células de mamíferos. Los fragmentos no glucosilados pequeños tales como los fragmentos Fab, Fv o ScFv pueden producirse en forma funcional en células de mamífero o en células bacterianas.

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La inmunoglobulina o la molécula inmunoglobulinoforme puede proceder de un anticuerpo humano o de un anticuerpo de roedor modificado genéticamente, humanizado tal como un anticuerpo injertado con GDR o puede proceder de un banco de presentación de fagos o puede ser una molécula inmunoglobulinoforme sintética.

El dominio de unión al antígeno puede estar compuesto por las cadenas pesada y ligera de una inmunoglobulina, expresada en genes independientes, o puede utilizar la cadena ligera de una inmunoglobulina y una cadena pesada truncada para formar un fragmento Fab o F(ab)'_{2}. Alternativamente, las formas truncadas de ambas cadenas pesada y ligera pueden utilizarse las cuales se montan para forma un fragmento Fv. Puede utilizarse también un fragmento scFv modificado genéticamente, en cuyo caso, solamente se requiere un solo gen para codificar el dominio de unión al antígeno. En un aspecto preferido, el dominio de unión al antígeno se forma a partir de un Fv o de un scFv.

Cuando un patógeno invade el cuerpo, los linfocitos responden con 3 tipos de reacción. Los linfocitos del sistema humoral (linfocitos B) segregan anticuerpos que pueden unirse al patógeno, señalando su degradación mediante macrófagos y otras células. Los linfocitos del sistema celular (linfocitos T) realizan dos tipos principales de funciones. Los linfocitos T cooperadores (linfocitos TH) reconocen independientemente al patógeno y segregan factores proteicos (linfocinas) que estimulan el crecimiento y la sensibilidad de los linfocitos B, linfocitos T y macrófagos, aumentando en gran medida la potencia de la respuesta inmunitaria.

Por lo tanto, en un aspecto preferido, la TBP comprende una inmunoglobulina, o una parte de la misma, o un bioisostero de la misma.

En una forma de realización preferida, la TBP comprende IgG y/o IgE, o una parte de la misma, o un bioisostero de la misma.

En una forma de realización más preferida, la TBP comprende IgE, o una parte de la misma, o un bioisostero de la misma.

El antígeno de la superficie de la célula trofoblasto, definido originalmente por el anticuerpo monoclonal 5T4 (Hole y Stem 1998 Br. J. Cancer 57; 239-246), se expresa a altas concentraciones de las células de una amplia variedad de carcinomas humanos (Myers et al. 1994 J. Biol. Chem. 269; 9319-9324) pero, en los tejidos normales de hembras no embarazadas, se limita esencialmente a la expresión del nivel bajo en un epitelio poco especializado (Myers et al. ibid. y referencia en las mismas). El antígeno 5T4 ha estado implicado en la contribución al desarrollo del potencial metastásico y por consiguiente los anticuerpos que reconocen específicamente esta molécula pueden tener relevancia clínica en el tratamiento de los tumores que expresan el antígeno.

La zona variable del anticuerpo monoclonal 5T4 también puede humanizarse por numerosas técnicas, que son conocidas en la materia, incluyendo el injerto de las secuencias de la zona LR en una columna vertebral humana. Éstas pueden utilizarse a continuación para construir un anticuerpo humanizado intacto o un anticuerpo humanizado monocatenario (Sab), tal como un ScFv acoplado a una zona Fc (véase Antibody Engineering: a practical approach, ed. MacCafferty et al. 1996 OUP).

En este caso, el término Sad no está limitado a sólo un anticuerpo humano o a un anticuerpo humanizado monocatenario. Preferentemente, sin embargo el Sab es un anticuerpo humano monocatenario o un anticuerpo humanizado monocatenario, o parte de los mismos, tal como ScFv acoplada a una zona Fc.

Preferentemente, la NS que codifica una proteína que se une al tumor y el NOI y/o la TBP y el POI se unen conjuntamente.

Preferentemente, la TBP y el POI están unidos directamente.

Preferentemente, uno o más de las NS que codifican una proteína que se une al tumor, NOI, TBP y POI comprenden además por lo menos un componente funcional adicional.

Preferentemente, por lo menos la TBP y/o el POI comprenden además por lo menos un componente funcional adicional.

Preferentemente, el componente funcional adicional se selecciona de entre uno o más de una entidad de señalización (tal como un péptido señal), un potenciador inmunitario, una toxina o una enzima biológicamente activa.

En un aspecto preferido, el POI es un POI segregable. Por lo tanto, en este aspecto de la presente invención, preferentemente, el componente funcional adicional es por lo menos una entidad capaz de ocasionar que se segregue el POI, tal como una entidad de señalización.

Otro componente adicional preferido es un activador.

El término "activador" se utiliza en el sentido normal de la técnica, p. ej. un punto de unión de la ARN polimerasa en la teoría de Jacob-Monod de expresión génica.

Preferentemente, el vector comprende un potenciador activador específico del tumor.

Otros componentes adicionales preferidos incluyen entidades que permiten la expresión eficaz del POI. Por ejemplo, el componente adicional puede ser un potenciador. Aquí, el término potenciador incluye una secuencia de ADN que se une a otros componentes proteicos del complejo de iniciación de la transcripción y de este modo facilita la iniciación de la transcripción dirigida por su activador asociado.

Preferentemente, el vector se utiliza para administrar el NOI y/o el POI ex vivo y/o in vivo al tumor.

El vector de la presente invención es útil en terapia génica para administrar el NOI y/o el POI a un punto selectivo.

La terapia génica incluye una cualquiera o más de entre: la adición, la sustitución, la eliminación, la complementación, la manipulación, etc. de una o más secuencias nucleotídicas, por ejemplo, en uno o más puntos diana, tales como las células diana. Si los puntos diana son células diana, entonces las células pueden formar parte de un tejido o de un órgano. Las directrices generales en terapia génica pueden encontrarse en Molecular Biology (Ed. Robert Meyers, Pub. VCH, tal como en las páginas 556-558).

A modo de ejemplo adicional, la terapia génica proporciona también un medio mediante el cual uno cualquiera o más de entre: una secuencia nucleotídica, tal como un gen, puede aplicarse para sustituir o complementar un gen defectuoso; un gen patógeno o un producto génico puede eliminarse; puede añadirse un nuevo gen con objeto, por ejemplo, de crear un fenotipo más favorable; las células pueden manipularse a nivel molecular para tratar el cáncer (Schmidt-Wolf y Schmidt-Wolf, 1994, Annals of Hematology 69; 273-279) u otras enfermedades - tales como trastornos inmunitarios, cardiovasculares, neurológicos, inflamatorios o infecciosos; pueden manipularse y/o introducirse antígenos para provocar un respuesta inmunitaria - tal como la vacunación genética.

El vector de la presente invención puede ser un vector vírico o un vector no vírico. Los sistemas de suministro no víricos incluyen pero no se limitan a métodos de transfección de ADN. Aquí la transfección incluye un procedimiento que utiliza un vector no vírico para administrar un gen a una célula diana de mamífero. Los métodos típicos de transfección incluyen la electroporación, la biolística de ADN, la transfección mediada por lípidos, la transfección mediada por ADN compactado, liposomas, inmunoliposomas, lipofectina, anfífilos faciales catiónicos mediados por agentes catiónicos (AFC) (Nature Biotechnology 1996 14; 556) y combinaciones de las mismas. Los sistemas de suministro vírica incluyen pero no se limitan a un vector adenovírico, un vector vírico adeno-asociado (VAA), un vector herpes vírico, un vector retrovírico, un vector lentivírico, un vector baculovírico. Otros ejemplos de vectores incluyen sistemas de suministro ex vivo, que incluyen pero no se limitan a métodos de transfección de ADN tales como electroporación, biolística de ADN, transfección mediada por líquidos, transfección mediada por ADN
compactado).

Preferentemente, el vector es un vector vírico.

Preferentemente, el vector es un vector retrovírico.

En los últimos años, se han propuesto retrovirus para su utilización en terapia génica. Esencialmente, los retrovirus son virus con ARN con un ciclo vital diferente al de los virus líticos. A este respecto, cuando un retrovirus infecta una célula, su genoma se convierte en una forma de ADN. Con algo más de detalle, un retrovirus es un virus que contiene ARN genómico que a la entrada en una célula hospedadora una enzima transcriptasa inversa convierte en una molécula de ADN. La copia de ADN sirve como plantilla para la producción de nuevos genomas del ARN y proteínas codificadas por virus necesarias para el montaje de las partículas víricas infecciosas. De este modo, un retrovirus es una entidad infecciosa que se replica mediante un intermedio de ADN.

Existen muchos retrovirus y los ejemplos incluyen: virus de leucemia murina (VLM), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la anemia infecciosa equina (VAIE), virus del tumor de mama de ratón (VTMR), virus del sarcoma de Rous (VSR), virus del sarcoma de Fujinami (VSFu), virus de la leucemia murina de Moloney (VLM-Mo), virus del osteosarcoma murino de FBR (VSM FBR), virus del sarcoma murino de Moloney (VSM-Mo), virus de la leucemina murina de Abelson (VLM-A), virus-29 de la mielocitomatosis aviar (MC29) y virus de la eritroblastosis aviar (VEA).

Una lista detallada de retrovirus puede encontrarse en Coffin et al. ("Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus págs. 758-763).

Detalles sobre la estructura genómica de algunos retrovirus pueden encontrarse en la materia. A modo de ejemplo, los detalles sobre el VIH pueden encontrarse en el NCBI Genbank (es decir, nº de registro del genoma AF033819).

Todos los retrovirus contienen tres dominios de codificación principales, gag, pol, env, que codifican proteínas esenciales del virión. No obstante, los retrovirus pueden dividirse ampliamente en dos categorías: a saber, "sencillo" y "complejo". Estas categorías son discernibles por la organización de sus genomas. Los retrovirus sencillos normalmente llevan solamente esta información elemental. En cambio, los retrovirus complejos también codifican proteínas reguladoras adicionales procedentes de múltiples mensajes de corte y empalme.

Los retrovirus pueden incluso dividirse más en siete grupos. Cinco de estos grupos representan retrovirus con potencial oncogénico. Los dos grupos restantes son los lentivirus y los espumavirus. Un estudio de estos retrovirus se presenta en "Retroviruses" (1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus págs. 1-25).

Todos los elementos oncogénicos excepto el grupo del virus de la leucemia por linfocitos T humanos-virus de la leucemia bovina (VLTH-VLB) son retrovirus sencillos. VLTH, VLB y los lentivirus y los espumavirus son complejos. Algunos de los retrovirus oncogénicos mejor estudiados son el virus del sarcoma de Rous (VSR), el virus del tumor de mama de ratón (VTMR), el virus de leucemia murina (VLM) y el virus de la leucemia por linfocitos T humanos (VLTH).

El grupo de lentivirus puede dividirse aún más en "primates" y "no primates". Ejemplos de lentivirus de primates incluyen el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el agente etiológico del síndrome de autoinmunodeficiencia humana (SIDA) y el virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS). El grupo de lentivirus de no primates incluye el prototipo "virus lento" virus visna-maedi (VVM), así como el virus relacionado de la artritis-encefalitis caprina (VAEC), el virus de la anemia infecciosa equina (VAIE) y el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) descrito más recientemente y el virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB).

Existe una distinción entre la familia de lentivirus y otros tipos de retrovirus por la que los lentivirus tienen capacidad para infectar tanto las células que se dividen como las que no se dividen (Lewis et al. 1992 EMBO. J 11; 3053-3058, Lewis y Emerman 1994 J. Virol. 68: 510-516). En cambio, otros retrovirus- tales como VLM- son incapaces de infectar las células que no se dividen tales como las que aportan, por ejemplo, tejido muscular, cerebral, pulmonar y hepático.

Durante el proceso de infección, un retrovirus se une inicialmente a un receptor en la superficie de la célula específica. Al entrar en la célula hospedadora sensible, el genoma del ARN retrovírico es copiado entonces en el ADN por la transcriptasa inversa codificada por virus que es transportada al interior del virus precursor. Este ADN es transportado al núcleo de la célula hospedadora donde posteriormente se integra en el genoma del hospedador. En esta etapa, se denomina por lo general provirus. El provirus es estable en el cromosoma del hospedador durante la división celular y se transcribe como otras proteínas celulares. El provirus codifica las proteínas y el sistema de encapsulación requerido para fabricar más virus, que pueden abandonar la célula mediante un proceso denominado a veces "en ciernes".

Como ya se indicó, cada genoma retrovírico comprende genes denominados gag, pol y env que codifican las proteínas y enzimas del virión. Estos genes están flanqueados en ambos extremos por zonas denominadas repeticiones grandes terminales (LTR). Las LTR son responsables de la integración provírica y de la transcripción. También sirven como secuencias potenciadoras-activadoras. En otras palabras, las LTR pueden controlar la expresión del gen vírico. La encapsulación de los ARN retrovíricos se produce en virtud de una secuencia psi situada en el extremo 5' del genoma vírico.

Las propias LTR son secuencias idénticas que pueden dividirse en tres elementos, que se denominan U3, R y U5. U3 procede de la secuencia única en el extremo 3' del ARN. R procede de una secuencia repetida en ambos extremos del ARN y U5 procede de la secuencia única en el extremo 5' del ARN. Los tamaños de los tres elementos pueden variar considerablemente entre diferentes retrovirus.

Para facilidad de comprensión, se presenta a continuación un diagrama genérico sencillo (no a escala) de un genoma retrovírico que presenta las características elementales de las LTR, gag, pol y env.

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Para el genoma vírico, el punto de iniciación de la transcripción está en el límite entre U3 y R en la LTR del lado izquierdo (como se muestra anteriormente) y el punto de adición de poli (A) (terminación) está en el límite entre R y U5 en la LTR del lado derecho (como se muestra anteriormente). U3 contiene la mayoría de los elementos de control de la transcripción de los provirus, que incluye el activador y las secuencias potenciadoras múltiples responsables de las proteínas activadoras de la transcripción celular y en algunos casos, vírica. Algunos retrovirus tienen uno o más de los siguientes genes que codifican las proteínas que están implicadas en la regulación de la expresión génica: tat, rev, tax y rex.

Tal como se muestra en el diagrama anterior, la organización molecular básica de una genoma de ARN retrovírico es (5') R - U5 - gag, pol, env - U3-R (3'). En un genoma de vector retrovírico gag, pol y env están ausentes o no son funcionales. Las zonas R en ambos extremos del ARN son secuencias repetidas. U5 y U3 representan secuencias únicas, respectivamente, en los extremos 5' y 3' del genoma del ARN. Estas tres series de secuencias finales van a formar las repeticiones terminales grandes (LTR) en el ADN provírico, que es la forma del genoma que se integra en el genoma de la célula infectada. Las LTR en un retrovirus natural constan de (5') U3 - R - U5 (3'), y por lo tanto U3 y U5 contienen ambos secuencias que son importantes para la integración provírica. Otras secuencias esenciales requeridas en el genoma par el funcionamiento apropiado incluyen un punto de unión al cebador para la transcripción inversa de la primera cadena, un punto de unión al cebador para la transcripción inversa de la segunda cadena y una señal de encapsulado.

Con respecto a los propios genes estructurales gag, pol y env y con algo más de detalle, gag codifica la proteína estructural interna del virus. Gag es procesado proteolíticamente en las proteínas maduras MA (matriz), CA (cápside) y NC (nucleocápside). El gen pol codifica la transcriptasa inversa (RT), que contiene tanto la ADN polimerasa como las actividades asociadas a RNasa H y la integrasa (IN), que media en la replicación del genoma. El gen env codifica la glucoproteína de superficie (SU) y la proteína transmembranaria (TM) del virión, que forma un complejo que interactúa específicamente con las proteínas del receptor celular. Esta interacción conduce por último a la fusión de la membrana vírica con la membrana celular.

La proteína de la envoltura es una proteína vírica que recubre la partícula vírica y desempeña una función esencial al permitir la entrada del virus en una célula diana. El complejo de retrovirus de glucoproteína de la envoltura incluye dos polipéptidos: un polipéptido hidrófilo glucosilado externo (SU) y una proteína que se extiende sobre la membrana (TM). Juntos, éstos forman un "nudo" o "punta anudada" oligomérico en la superficie de un virión. Ambos polipéptidos están codificados por el gen env y se sintetizan en forma de un precursor de la poliproteína que se escinde proteolíticamente durante su transporte a la superficie celular. Aunque las proteínas del env no escindidas son capaces de unirse al receptor, el propio episodio de escisión es necesario para activar la fusión potencial de la proteína, que es necesaria para introducir el virus en la célula hospedadora. Por lo general, ambas proteínas SU y TM están glucosiladas en muchos puntos. Sin embargo, en algunos virus, ilustrados por MLV, TM no están glucosiladas.

Aunque no siempre se requieren las proteínas SU y TM para el montaje de las partículas de virión desarrolladas como tales, desempeñan una función esencial en el proceso de introducción. A este respecto, el dominio SU se une a una molécula receptora con frecuencia una molécula receptora específica en la célula diana. Se cree que este episodio de unión activa la fusión de la membrana provocando potencial de la proteína TM una vez que se fusionen las membranas vírica y celular. En algunos virus, principalmente VLM, un episodio de escisión - resultante de la eliminación de una parte corta de la cola citoplasmática de TM - se cree que desempeña una función clave en el descubrimiento de la actividad de la fusión completa de la proteína (Brody et al. 1994 J. Virol. 68: 4620-4627, Rein et al. 1994 J. Virol. 68: 1773-1781). Esta "cola" citoplásmica, distal del segmento que abarca la membrana de TM permanece en el lado interno de la membrana vírica y varía considerablemente en longitud en diferentes retrovirus.

Por lo tanto, la especificidad de la interacción SU/receptor puede definir la gama de hospedadores y el tropismo del tejido de un retrovirus. En algunos casos, esta especificidad puede limitar el potencial de transducción de un vector retrovírico recombinante. Aquí, la transcripción incluye un proceso de utilización de un vector vírico para administrar un gen no vírico a una célula diana. Por esta razón, muchos experimentos en terapia génica han utilizado el VLM. Un VLM específico que tiene una proteína de la envoltura denominada 4070A se conoce como virus anfótropo, y éste puede infectar también células humanas porque su proteína de la envoltura "se acopla" a una proteína de transporte del fosfato que se conserva entre el hombre y el ratón. Éste transportador es omnipresente y por eso estos virus son capaces de infectar muchos tipos de células. En algunos casos sin embargo, puede ser conveniente, especialmente desde un punto de vista de la seguridad, dirigirse específicamente a células restringidas. Con esta finalidad, varios grupos han modificado genéticamente un retrovirus ecótropo de ratón, que a diferencia de su anfótropo relativo normalmente infecta solamente células de ratón, para infectar específicamente células humanas específicas. La sustitución de un fragmento de una proteína de la envoltura por un segmento de eritropoyetina produjo un retrovirus recombinante que a continuación se unió específicamente a células humanas que expresaban el receptor de eritropoyetina en su superficie, tal como los precursores de los glóbulos rojos (Maulik y Patel 1997 "Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies" 1997. Wiley-Liss Inc. págs. 45).

Además de gag, pol y env, los retrovirus complejos contienen también genes "accesorios" que codifican proteínas accesorias o auxiliares. Las proteínas accesorias o auxiliares se definen como las proteínas codificadas por los genes accesorios además de las codificadas por los habituales genes replicadores o estructurales, gag, pol y env. Estas proteínas accesorias son distintas de las que están implicadas en la regulación de la expresión génica, como las codificadas por tat, rev, tax y rex. Ejemplos de genes accesorios incluyen uno o más de entre vif, vpr, vpx, vpu y nef. Estos genes accesorios pueden encontrarse, por ejemplo, en el VIH (véase, por ejemplo las páginas 802 y 803 de "Retroviruses" Ed. Confin et al. Pub. CSHL 1997). Las proteínas accesorias no esenciales pueden funcionar en tipos de células especializadas, proporcionando funciones que son por lo menos en parte duplicadoras de una función proporcionada por una proteína celular. Por lo general, los genes accesorios está situados entre pol y env, justo corriente debajo de env que incluye la zona U3 de la LTR o las partes solapantes del env y entre sí.

Los retrovirus complejos han desarrollado mecanismos reguladores que emplean activadores de la transcripción codificados por virus así como factores de la transcripción celular. Estas proteínas víricas de actuación en trans sirven como activadores de la transcripción del ARN dirigida por las LTR. Los activadores en trans de transcripción de los lentivirus son codificados por los genes víricos tat. Tat se une a una estructura secundaria de ARN, estable, con bucle troncal, denominada TAR, una función de la cual es colocar de manera óptima aparentemente Tat para activar en trans la transcripción.

Tal como se mencionó al principio, se han propuesto retrovirus como sistema de suministro (expresado de otra manera como vehículo de administración o vector de administración) entre otras para la transferencia de un NOI, o de varios NOI, a uno o más puntos de interés. La transferencia puede producirse in vitro, ex vivo, in vivo o combinaciones de las mismas. Cuando se utilizan de este modo, los retrovirus se denominan por lo general vectores retrovíricos o vectores retrovíricos recombinantes. Los vectores retrovíricos se han aprovechado incluso para estudiar varios aspectos del ciclo vital del retrovirus, incluyendo la utilización del receptor, la transcripción inversa y la encapsulación de ARN (estudiada por Miller, 1992 Curr. Top. Microbiol. Inmunol. 158:1-24).

En un vector retrovírico recombinante típico para su utilización en terapia génica, por lo menos parte de una o más de las zonas de codificación de las proteínas gag, pol y env pueden eliminarse del virus. Esto hace defectuosa la replicación del vector retrovírico. Las partes eliminadas pueden aún sustituirse por un NOI con objeto de generar un virus capaz de integrar su genoma en un genoma del hospedador pero en el que el genoma vírico modificado es incapaz de propagarse debido a una falta de proteínas estructurales. Cuando se integra en el genoma del hospedador, se produce la expresión del NOI, dando como resultado, por ejemplo, un efecto terapéutico. De este modo, la transferencia de un NOI a un punto de interés se consigue por lo general: integrando el NOI en el vector vírico recombinante; encapsulando el vector vírico modificado en una capa de virión; y permitiendo la transducción de un punto de interés, tal como una célula diana o una población de células dianas.

Es posible propagar y aislar cantidades de vectores retrovíricos (p. ej. preparar valores adecuados del vector retrovírico) para la traducción ulterior, por ejemplo, de un punto de interés utilizando una combinación de una estirpe celular de encapsulación o cooperadora y un vector recombinante.

En algunos casos, la propagación y aislamiento pueden implicar el aislamiento de los genes retrovíricos gag, pol y env y su introducción por separado en una célula hospedadora para producir una "estirpe celular de encapsulación". La estirpe celular de encapsulación produce las proteínas requeridas para encapsular el ADN retrovírico pero no puede efectuar la encapsulación debido a la falta de una zona psi. Sin embargo, cuando un vector recombinante que lleva un NOI y una zona psi se introduce en la estirpe celular de encapsulación, las proteínas cooperadoras pueden encapsular el vector recombinante positivo a psi para producir la reserva de virus recombinante. Ésta puede utilizarse para infectar células con objeto de introducir el NOI en el genoma de las células. El virus recombinante cuyo genoma falta en todos los genes requeridos para fabricar proteínas víricas puede infectar solamente una vez y no puede propagarse. Por consiguiente, el NOI se introduce en el genoma de la célula hospedadora sin la generación de retrovirus potencialmente perjudiciales. Un resumen de las estirpes de encapsulación se presenta en "Retroviruses" (1997 Cold Springs Harbour Laboratory Press. Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus págs. 449). Sin embargo, ésta técnica puede ser problemática en el sentido de que las concentraciones del título no están siempre en un nivel satisfactorio. No obstante, el diseño de estirpes celulares de encapsulación retrovíricas ha evolucionado para estudiar el problema de la producción espontánea entre otras del virus cooperador que se encontraba frecuentemente en los diseños iniciales. En cuanto a la recombinación se facilita en gran medida por la homología, reduciendo o eliminando homología entre los genomas del vector y el cooperador ha reducido el problema de producción del virus cooperador.

Más recientemente, se ha desarrollado encapsulado de eritrocitos en el que las zonas de codificación vírica gag, pol y env se realizan en plásmidos de expresión por separado que se transfieren independientemente en una estirpe de encapsulado de eritrocitos de modo que se requieren tres episodios recombinantes para la producción vírica natural. Esta estrategia se denomina a veces procedimiento de transfección de tres plásmidos (Soneoka et al. 1995 Nucl. Acid. Res. 23: 628-633).

Puede utilizarse también la transfección temporal para medir la producción del vector cuando se están desarrollando vectores. A este respecto, la transfección temporal evita el tiempo mayor requerido para generar estirpes celulares que producen un vector estable y se utiliza si el vector o los componentes de encapsulación retrovírica son tóxicos para las células. Los componentes por lo general utilizados para generar vectores retrovíricos incluyen un plásmido que codifica las proteínas Gag-Pol, un plásmido que codifica la proteína Nev y un plásmido que contiene un NOI. La producción del vector conlleva la transfección temporal de uno o más de estos compuestos en las células que contienen los otros componentes requeridos. Si el vector codifica genes tóxicos o genes que interfieren con la replicación de la célula hospedadora, tales como inhibidores del ciclo celular o genes que producen apoptosis, puede ser difícil generar estirpes celulares que producen vectores estables, pero la transfección temporal puede utilizarse para producir el vector antes que mueran las células. Asimismo, se han desarrollado estirpes celulares utilizando la infección temporal que produce niveles con título de vector que son comparables a los niveles obtenidos a partir de estirpes celulares que producen vectores estables (Pear et al. 1993, PNAS 90:8392-8396).

En vista de la toxicidad de algunas proteínas de VIH - que pueden hacer difícil el generar células de encapsulado a base de VIH estable - se preparan normalmente vectores de VIH por transfección temporal del vector y del virus cooperador. Algunos investigadores han sustituido incluso la proteína Env del VIH por la del virus de la estomatitis vesicular (VSV). La inserción de la proteína Env de VSV facilita la encapsulación del vector a medida que se generaron vectores de VIH/VSV-G con valores de 5x10^{5} (10^{8} tras la concentración) por transfección temporal (Naldini et al. 1996 Science 272: 263-267). Por lo tanto, la transfección temporal de los vectores VIH puede proporcionar una estrategia útil para la generación de vectores con valor elevado (Yee et al. 1994 PNAS. 91: 9564-9568).

Si el componente retrovírico incluye una secuencia nucleotídica de env, entonces toda o parte de esta secuencia puede opcionalmente sustituirse con toda o parte de otra secuencia nucleotídica de env. La sustitución del gen env por un gen env heterólogo es un ejemplo de una técnica o estrategia denominada seudotipado. El seudotipado no es un nuevo fenómeno y pueden encontrarse ejemplos en los documentos WO-A-98/05759, WO-A-98/05754, WO-A-97/17457, WO-A-96/09400, WO-A-91/00047 y Mebatsion et al. 1997 Cell 90, 841-847.

El pseudotipado puede proporcionar una o más ventajas. Por ejemplo, con los vectores lentivíricos, el producto génico env de los vectores a base de VIH restringiría estos vectores para infectar solamente células que expresan una proteína denominada CD4. Pero si el gen env en estos vectores se ha sustituido con secuencias env de otros virus con ARN, entonces pueden tener un espectro infeccioso más amplio (Verma y Sonia 1997 Nature 389:239-242). Alternativamente, env puede modificarse de modo que afecte (tal como para alterar) su especificidad.

Por lo tanto, la expresión "vector retrovírico recombinante" describe una entidad (tal como una molécula de ADN) que contiene secuencias retrovíricas suficientes para permitir un ARN transcrito del vector que debe encapsularse en presencia de proteínas retrovíricas esenciales en una partícula retrovírica capaz de infectar una célula diana. La infección de la célula diana incluye la transcripción inversa y la integración en el genoma de la célula diana.

La expresión "vector retrovírico recombinante" se refiere también a una partícula retrovírica que contiene un genoma de ARN codificado por la molécula de ADN. El vector retrovírico también contendrá genes no víricos que han ser suministrados por el vector a la célula diana. Un vector retrovírico recombinante es incapaz de replicación independiente para producir partículas retrovíricas infecciosas. Habitualmente, un vector retrovírico recombinante carece de genes gag-pol y/o env funcionales, o de otros genes que codifican proteínas esenciales para la replicación.

La expresión "vector retrovírico dirigido" significa un vector retrovírico recombinante cuya capacidad para infectar una célula o para expresarse en la célula diana está limitada a determinados tipos de células dentro del organismo hospedador. Un ejemplo de vectores retrovíricos dirigidos es el de la proteína con envoltura modificada genéticamente que se une a moléculas de la superficie celular encontradas solamente en número limitado de tipos de células en el organismo hospedador. Otro ejemplo de vector retrovírico diana es el que contiene elementos activadores y/o potenciadores que permiten la expresión de uno o más transcritos retrovíricos solamente en una producción de los tipos de células del organismo hospedador.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un sistema de suministro útil. El sistema de suministro es capaz de dirigir un NOI y/o un POI a un tumor, es decir es capaz de albergar un NOI y/o POI en un tumor.

El vector puede utilizarse para administrar directamente a una entidad - tal como un organismo o una célula del mismo - tal como ex vivo o in vivo. El este sentido el vector puede administrarse directamente, por ejemplo, a un punto del tumor. Alternativamente, el vector puede administrarse a una entidad a modo de vehículo - tal como ex vivo o in vivo. Un ejemplo del vehículo sería un liposoma o una célula en la que estaría contenido el vector. Un ejemplo de célula con vehículo adecuado sería una célula hematopoyética, tal como una célula mieloide. Estas células portadoras pueden aumentar la especificidad adicional del vector de la presente invención.

Estos y otros aspectos de la presente invención serán elaborados más a fondo.

El potencial percibido de las terapias basadas en anticuerpos monoclonales para el tratamiento de la enfermedad neoplásica no se ha realizado totalmente (examinado en Scheinberg y Chapman 1995, en Monoclonal antibodies (ed. Birch y Lennox) Capítulo 2.1; George et al., 1994 Inmunol. Today 15; 559-561). Por consiguiente, se han conjugado anticuerpos monoclonales con radioisótopos, fármacos citotóxicos o toxinas en un intento de mejorar la eficacia. Sin embargo, pruebas clínicas con dichos conjugados han conducido generalmente a resultados discordantes. Una de las principales razones de la falta de eficacia de anticuerpos y conjugados de anticuerpo en el tratamiento de tumores sólidos es la escasa penetración de los tumores sólidos por las inmunoglobulinas y otras proteínas tales como inmunotoxinas de alto peso molecular (por ejemplo Juweid et al. 1992, Cancer Res. 52; 5144-5153), Espenetos et al. 1986 Cancer Res; 3183-3191). Otras razones de la falta de eficacia incluyen la toxicidad inespecífica, la inmunogenicidad y la farmacocinética inapropiada de muchas inmunotoxinas y conjugados de anticuerpo y radionúclido introducidas en la circulación general (estudiado en Scheinberg y Chapman 1995, En Monoclonal antibodies (ed. Birch and Lennox) Capítulo 2.1).

En contraste con la ausencia general de eficacia in vivo, muchos anticuerpos monoclonales presentan capacidad pronunciada para inhibir el crecimiento de las células tumorales en determinados ensayos in vitro (estudiado en Sandlie y Michaelsen 1996 en Antibody engineering: a practical approach. Ed. McCafferty et al. Capítulo 9). Está bien probado que la fijación del antígeno específico por un anticuerpo puede conducir a la activación de una variedad de funciones efectoras mediadas por la parte Fc de la cadena pesada del anticuerpo. Las zonas Fc de diferentes clases de inmunoglobulinas median en diferentes funciones efectoras, incluyendo la activación de cascadas complementarias y la unión a receptores Fc en varias células efectoras inmunitarias (Duncan et al 1988 Nature 332; 563 y 738). En los ensayos in vitro, el compromiso de los receptores Fc presentes en las células inmunoefectoras por el anticuerpo unido a las células diana tumorales puede conducir a la destrucción de la célula diana por una variedad de mecanismos denominados en conjunto citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Por ejemplo el compromiso de los receptores de Fc por IgG en monocitos y macrófagos humanos, neutrófilos y células destructoras naturales (NK) de la IgG y la IgG3 y en mucha menor extensión las subclases IgG2 e IgG4, estimula a ADCC (Munn et al. 1991 Cancer Res. 51; 1117-1123; Primus et al., 1993 Cancer Res. 53; 3355-3361). Sin embargo, la capacidad relativamente escasa de dichos anticuerpos para destruir los tumores in vivo sugiere que ADCC no desempeña una función significativa en muchas de las terapias actuales a base de anticuerpo (George et al., 1994 Inmunol. Today 15; 559.561). Existen varias razones posibles para esto, incluyendo la escasa penetración de los anticuerpos en los tumores sólidos (Yuan et al. 1995 Cancer Res. 55; 3752-3756) y el hecho de que la mayoría de las moléculas receptoras (FegRI) de gran afinidad presentes en macrófagos están normalmente ocupadas por la IgG del suero que tendrá poca competencia por el anticuerpo específico (Munn et al. 1991 Cancer Res. 51; 1117-1123).

Se ha demostrado anteriormente que las células tumorales transducidas con genes que codifican anticuerpos monoclonales pueden participar en reacciones de ADCC mediadas por células NK xenógenas in vitro (Primus et al., 1993 Cancer Res. 53; 3355-3361). Sin embargo las células NK desempeñan pocas funciones en la destrucción de las células tumorales in vivo, en parte porque sus funciones destructoras están inhibidas por la presencia del propio MHC de clase I sobre las células tumorales autólogas (Correa y Raulet 1995 Inmunity 2; 61-71).

Se ha supuesto también que los linfocitos que se infiltran en el tumor (LIT) podrían utilizarse como vehículo para administrar genes de anticuerpo a un tumor para segregar anticuerpos antitumorales en la zona del tumor (Tsang et al., 1993 J. Immunother. 13; 143-152). Sin embargo, la transducción ex vivo de los LIT seguida de transplante autólogo que utiliza genes marcadores ha demostrado que los LIT aislados no presentan mecanismo de albergamiento específico que les permita volver a los depósitos tumorales (Economou et al., 1996 J. Clin. Invest. 97; 515-521) y por eso dicho método es de valor limitado. La presente invención contrasta con estos descubrimientos ya que se proporciona un vector que puede dirigirse o liberar un NOI y/o un POI a una masa (o zona) tumoral.

La transducción de un gen que codifica una inmunotoxina monocatenaria en linfocitos T humanos activados por linfocina (células LAK) también se ha descrito (Chen et al., 1997 Nature 385, 78-80). Además de los problemas de reintroducción de las células LAK en el zona del tumor, dicho método adolece también de los inconvenientes potenciales asociados a limitarse a la utilización ex vivo. Estos incluyen la necesidad de cultivar los linfocitos T a altas concentraciones de una citocina tal como IL-2 para generar células LAK con los consiguientes problemas en la generación de suficientes células para la terapia.

En un aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de vectores genéticos para administrar genes (tales como genes terapéuticos) que codifican proteínas de unión al tumor segregadas (TBP) en el interior de una masa tumoral e identifica maneras de dirigir la expresión de las TBP al interior del tumor. La expresión del gen o genes que codifica(n) la TBP en el interior de la masa tumoral conduce entonces a la producción local de TBP con la consiguiente reducción del crecimiento, supervivencia o diseminación del tumor por varios mecanismos. Debido a que se segrega TBP, la TBP producida por las células transducidas no puede actuar sólamente en la célula transducida sino también en las células tumorales adyacentes y por consiguiente consigue un efecto circunstante.

Existen numerosos tipos de células presentes en una masa tumoral además de las células cancerosas. Estas pueden incluir células del sistema vascular del tumor (p. ej., las células endoteliales) e inmunocitos que se infiltran en el tumor, tales como los linfocitos que se infiltran en el tumor (LIT) y macrófagos (Normann 1985 Cancer Metastasis Re. 4:277-291; Leek et al. 1996 Cancer Res. 56: 4625-4629). Cualquiera de estos tipos de células pueden dirigirse para la expresión de la TBP y pueden servir como una fábrica local dentro del tumor para la producción de TBP. Preferentemente, las células en la masa tumoral que se utilizan para producir la TBP son las células cancerosas, las células endoteliales o los macrófagos. Alternativamente, los progenitores de monocitos o de células endoteliales pueden ser dirigidos, tales como las células mononucleares de la sangre periférica positivas a CD34 (Asahara et al. 1997 Science 275: 964-967).

Preferentemente, la TBP comprende uno o más dominios de unión capaces de unirse a una o más TACSM que están presentes en las células cancerosas y en las que por lo menos un dominio de unión reconoce un antígeno 5T4. De este modo se segrega la TBP producida a partir de uno o más tipos de células dentro de la masa tumoral y se dirige a las células cancerosas por su afinidad para la TACSM. La TACSM puede estar presente selectivamente en un número restringido de tipos de células. Así la cantidad de TACSM presente en la mayoría de las células cancerosas dentro de la masa tumoral es mayor que en los tejidos circundantes. Preferentemente, la TACSM está presente de manera detectable solamente en las células tumorales y un número limitado de otros tipos de tejido en el individuo que contiene el tumor. Más preferentemente, la TACSM es esencialmente específica del tumor en el individuo que contiene el tumor.

Uno o más dominios de unión de la TBP puede estar constituido, por ejemplo, por un ligando natural para una TACSM, ligando natural que puede ser una molécula de adhesión o un ligando del receptor del factor de crecimiento (p. ej., el factor de crecimiento epidérmico) o un fragmentos de un ligando natural que conserva afinidad de unión para la TACSM. Alternativamente, los dominios de unión pueden proceder de las secuencias de la cadena pesada y ligera de una zona variable de inmunoglobulina (Ig). Dicha zona variable puede proceder de un anticuerpo humano natural o de un anticuerpo de otra especie tal como un anticuerpo de roedor. Alternativamente, la zona variable puede proceder de un anticuerpo modificado genéticamente tal como de un anticuerpo humanizado o de un banco de presentación de fago de un animal inmunizado o no inmunizado o de un banco de presentación de fagos mutagenizado. Como segunda alternativa, la zona variable puede proceder de un fragmento variable monocatenario (scFv). La TBP puede contener otras secuencias para conseguir la polimerización o para actuar como espaciadores entre los dominios de unión o los que proceden de la inserción de las secuencias de restricción en los genes que codifican la TBP, incluyendo las secuencias bisagra de Ig o nuevos espaciadores y secuencias enlazadoras modificadas genéticamente.

La TBP puede comprender, además una o más zonas variables de inmunoglobulina, toda o parte de una zona constante de la cadena pesada de Ig y por eso puede comprender una Ig completa natural, una Ig modificada genéticamente, una molécula similar a Ig modificada genéticamente, una Ig monocatenaria o una molécula similar a Ig monocatenaria. Alternativamente, o además, la TBP puede contener uno o más dominios procedentes de otra proteína tal como una toxina.

En un aspecto de la invención, se proporciona un sistema de suministro de genes para dirigir uno o más genes que codifican una TBP a un tumor, que comprende un vector genético que codifica una TBP y un sistema de suministro de genes in vivo. El sistema de suministro de genes puede ser un sistema de suministro de genes no vírico tal como ADN compactado con un agente de compactación de ADN, o un liposoma o inmunoliposoma que puede contener ADN compactado con un agente de compactación de ADN (tal como una polilisina). El vector puede ser un vector de ADN plásmido. Alternativamente, el vector puede ser un vector vírico recombinante tal como un vector adenovírico, un vector de virus adeno-asociado (VAA), un vector de herpes-virus o un vector retrovírico en cuyo caso la administración del gen está mediada por la infección vírica de una célula diana. Preferentemente el vector es un vector retrovírico recombinante, que puede ser un vector retrovírico diana. Preferentemente, el vector retrovírico es resistente al complemento humano, por ejemplo por producción en una estirpe celular humana.

Por lo general, el vector contendrá un activador para dirigir la expresión del gen o de cada gen (tal como un gen terapéutico) y puede contener elementos genéticos adicionales para la expresión eficaz o regulada de los genes de TBP, incluyendo potenciadores, señales de iniciación de la traducción, zonas internas de entrada al ribosoma (IRES), señales de corte y empalme y de poliadenilación. El activador y/o potenciador puede estar restringido en su actividad por el tejido. Por ejemplo, puede utilizarse un activador-potenciador específico para el tumor, tal como un activador-potenciador génico del antígeno 5T4 o el activador-potenciador CEA-gen. Alternativamente, o además, un elementos o elementos para la expresión regulada puede(n) estar presente(s), tal como un potenciador regulado por hipoxia. Un ejemplo de un elemento de expresión regulado por hipoxia (ERH) es un elemento de unión para el factor de transcripción HIF1. Los elementos potenciadores o los elementos que confieren expresión regulada pueden estar presentes en muchas copias. Preferentemente, la expresión del o de un gen (tal como un gen terapéutico, es inducible por hipoxia (o aporte de poco oxígeno) tal como puede encontrarse en una masa tumoral. Aún más preferentemente, el activador y/o potenciador que dirige la expresión del gen (tal como un gen terapéutico) contiene tanto elementos sensibles a la hipoxia como elementos que proporcionan mayor expresión en las células tumorales que en las células no tumorales adyacentes.

Se proporcionarán componentes del vector adicionales para otros aspectos de la función del vector tal como el mantenimiento del vector, la localización nuclear, la replicación y la integración cuando proceda utilizando componentes que son bien conocidos en la materia.

En una forma de realización preferida de este aspecto de la invención, se proporciona un vector retrovírico para la administración in vivo del gen o genes que codifica(n) la TBP para el tumor. Los vectores retrovíricos adecuados son conocidos en la técnica (véase por ejemplo Gunzberg y Salmons 1996 en Gene Therapy ed. Lemoine and Cooper. Bios; y Cosset et al. 1995 J. Virol. 69; 7430-7436). En una forma de realización particularmente preferida, la expresión de la TBP puede mejorarse en las zonas hipóxicas del tumor mediante la inclusión de elementos genéticos regulados por la hipoxia en el vector retrovírico. En este caso, los elementos regulados por la hipoxia pueden insertarse en una o ambas de las LTR retrovíricas en lugar del potenciador de LTR o en otra posición en el vector, por técnicas habituales de biología molecular. El gen o genes que codifica(n) la TBP puede expresarse en un activador-potenciador que conduce a la expresión mejorada en las células tumorales en comparación con las células tumorales adyacentes o es con preferencia esencialmente específico para el tumor. Ejemplos de activadores adecuados incluyen el activador-potenciador del gen para el antígeno 5T4, el activador-potenciador del gen MUCU1 o del gen CEA.

Se describe un procedimiento del tratamiento del cáncer que comprende administrar el gen o genes de la TBP en un sistema de suministro de genes del primer aspecto de la invención ya sea de manera generalizada o directamente en el zona de un tumor.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un sistema de suministro de genes para introducir uno o más genes que codifican una TBP en las células de la estirpe celular hematopoyética (preferentemente hematopoyética mieloide) ya sea in vivo o ex vivo. Preferentemente, las células hematopoyéticas (preferentemente hematopoyéticas mieloides) son de la estirpe monocito-macrófago o un precursor de dichas células tal como una célula madre positiva a CD34. Para el suministro ex vivo, los genes pueden insertarse en un vector plásmido y ser suministrados por uno de los varios procedimientos de transfección de ADN incluyendo la electroporación, biolística de ADN, transfeccion mediada por lípido o transfección mediada por ADN compactado. Alternativamente puede utilizarse un vector vírico para transducir células hemotopoyéticas (preferentemente hematopoyéticas mieloides) o células madre positivas a CD34 ex vivo, tal como un vector adenovírico, un vector retrovírico o un vector lentivírico. El vector contendrá un activador para dirigir la expresión del gen o de cada gen (tal como un gen terapéutico) y puede contener elementos genéticos adicionales para la expresión eficaz o regulada incluyendo potenciadores, señales iniciadoras de la traducción, zonas de entrada del ribosoma internos (IRES), señales de corte y empalme y de poliadenilación. El activador, o un potenciador o las señales de corte y empalme pueden ser restringidos por el tejido y preferentemente activos en fagocitos mononucleares tales como los macrófagos. El activador y/o potenciador puede contener elementos para la expresión regulada tal como un potenciador regulado por hipoxia. Un ejemplo de un elemento de la expresión regulada por hipoxia es el elemento de respuesta del factor de transcripción HIF1. Dicho elemento puede estar presente en muchas copias. Ejemplos de activadores y potenciadores regulados por hipoxia incluyen los del gen de enolasa, el gen de eritropoyetina, y los genes que codifican enzimas glucolíticas (Semenza et al., 1994 J. Biol. Chem. 269; 23757-23763) tal como el gen PGK. Las HRE aisladas pueden polimerizarse con objeto de aumentar la respuesta a la hipoxia. Pueden proporcionarse componentes vectoriales adicionales para otros aspectos de la función vectorial tal como el mantenimiento del vector, la localización nuclear, la replicación y la integración cuando proceda utilizando componentes que son bien conocidos en la materia.

Tras la introducción del vector en las células ex vivo, las células pueden reintroducirse en el paciente directamente o pueden estimularse para diferenciarse a lo largo de la serie de reacciones de diferenciación monocito-macrófago utilizando combinaciones apropiadas de citocinas y factores de crecimiento antes de la reintroducción en el paciente. Las células positivas a CD34 se estimulan para diferenciarse utilizando citocinas que incluyen IL-3, GMCSF y MCSF. Se diferencian monocitos ya sea por cultivo adscrito al plástico o utilizando GMCSF ya sea solo o en combinación con otras citocinas incluyendo MCSF.

Para la introducción de genes (tales como los genes terapéuticos) en células hematopoyéticas (preferentemente hematopoyéticas mieloides) o en células madre positivas a CD34 in vivo, puede utilizarse un sistema de suministro in vivo adecuado para administrar las unidades de transcripción descritas anteriormente. El sistema de suministro génico puede ser un sistema de suministro génico no vírico tal como ADN compactado con un agente de compactación de ADN, o un liposoma o inmunoliposoma que puede contener ADN compactado con un agente de compactación de ADN. Alternativamente el vector puede ser un vector vírico recombinante tal como un vector adenovírico dirigido, un vector vírico adeno-asociado (VAA), un vector de herpes-virus o un vector retrovírico tal como un vector lentivírico. Preferentemente el vector es un vector retrovírico recombinante dirigido, que preferentemente es resistente al complemento humano, por ejemplo por preparación del vector en una estirpe celular humana de encapsulación.

Las células madre positivas a CD34 pueden diferenciarse también para formar células endoteliales (Ashara et al. 1997 Science 275; 964-967). Dicha vía de diferenciación para las células madre positivas CD34 que contiene TBP que codifica los genes según la invención está prevista además para la diferenciación para formar monocitos y macrófagos.

Cuando proceda pueden proporcionarse componentes vectoriales adicionales para otros aspectos de la función vectorial, tal como al mantenimiento del vector, la localización nuclear, la replicación y la integración utilizando componentes que son bien conocidos en la materia.

En una forma de realización preferida de este aspecto de la invención, un vector plásmido o un vector retrovírico que lleva un gen que codifica una TBP bajo el control de un activador regulado por hipoxia o un activador preferentemente activo en macrófagos se introduce en los monocitos autólogos de la sangre periférica. Los monocitos transfectados se reintroducen en el paciente donde migran a las zonas hipóxicas de los tumores permitiendo el aumento de producción de la TBP en el interior de la masa tumoral. Los macrófagos se tratan opcionalmente con citocinas antes de la reinyección en el paciente. Alternativamente o además el vector puede incluir secuencias de ADN capaces de expresar un gen de citocina tal como un gen para IFNg, CSF-1 o CM-CSF con objeto de producir la diferenciación de las células transfectadas. El gen de citocina ser regulado también por elementos genéticos que presentan aumento de actividad en el zona del tumor.

Se describe un procedimiento para el tratamiento del cáncer en un ser humano o en un mamífero no humano, que comprende extraer una cantidad de sangre de un individuo que padece cáncer, preparar a partir de la sangre una preparación celular enriquecida en monocitos y macrófagos o sus precursores de la célula madre, introducir genes de TBP en la preparación celular utilizando un sistema de suministro de genes del tercer aspecto de la invención a fin de realizar la transfección o transducción de los monocitos y macrófagos, o sus progenitores de la célula madre con los genes de TBP, y reintroducir las células transfectadas o transducidas ya sea de manera generalizada o directamente en el zona del tumor. Las preparaciones celulares pueden tratarse opcionalmente con citocinas antes de la reintroducción con objeto de producir diferenciación hacia los macrófagos activos.

En otro aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para tratar el cáncer en un mamífero, que comprende administrar a un paciente un sistema de suministro de genes de la invención capaz de expresar una TBP en las células de origen hematopoyético (preferentemente hematopoyético mieloide).

En un aspecto adicional de la invención se proporciona un vector genético que comprende un gen (tal como un gen terapéutico) o genes que codifican una TBP, funcionalmente unido a un elemento regulador de expresión selectivamente funcional en un tipo de célula presente en una masa tumoral. La TBP en este aspecto de la invención inhibe la función tumoral uniéndose a una TACSM que desempeña una función esencial en la supervivencia o diseminación de células tumorales y en la que la TBP reconoce un antígeno 5T4. El gen o genes que codifican la TBP pueden administrarse al interior del tumor por cualquiera de las vías descritas en los dos aspectos anteriores de la invención. La unión de la TBP a la correspondiente TACSM bloquea la función de la TACSM y de este modo conduce a la inhibición del crecimiento, migración o metástasis del tumor.

Todavía en un aspecto adicional de la invención, un vector genético que comprende un gen (tal como un gen o genes terapéutico(s)) se suministra al interior del tumor en el que el gen (tal como un gel terapéutico) codifica una TBP, que además contiene uno o más dominios efectores. El dominio o dominios efector(es) puede activarse en la unión de la TBP a una TACSM lo que conduce a la inhibición de la proliferación, supervivencia o diseminación de las células tumorales. La TACSM es un antígeno 5T4 restringido en su distribución en el tejido y se encuentra principalmente en las células tumorales y en la mayoría de las células dentro del tumor. En algunos casos, la TACSM no se libera de la superficie celular en la circulación en una medida apreciable. Sin embargo, puede ocurrir la liberación. A modo de ejemplo, la liberación del antígeno 5T4 en el estroma puede servir para localizar más el NOI y/o el POI en el medio tumoral.

El dominio efector de la presente invención puede poseer actividad enzimática y puede ser por ejemplo una enzima activadora del profármaco, o puede ser un dominio no enzimático. Ejemplos de las TBP que contienen dominios efectores con actividad enzimática incluyen los conjugados o fusiones anticuerpo-enzima. Se han descrito conjugados anticuerpo-enzima incluyendo conjugados con fosfatasa alcalina (Senter et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 4842-4846); carboxipeptidasa G2 (Bagshawe et al., 1988 Br. J. Cancer 58: 700703); P-lactamasa (Shepherd et al., 1991 Bioorg. Med. Chem. Left. 1:21-26); y penicilina-V-amidasa (Kerr et al., 1990 Cancer Immunol. Immunother. 31:202-206). Se han descrito también las fusiones anticuerpo-enzima (Goshorn et al., 1993 Cancer Res. 53: 2123-2127; Wels et al. 1992 Bio/Technology 10:11 28-1132)). Cada uno de estos ejemplos puede utilizarse en este aspecto de la invención. Enzimas adicionales o alternativas que pueden incluirse en las fusiones TBP-enzima incluyen la carboxipeptidasa A1 humana o un mutante de la misma (Smith et al., 1997 J. Biol. Chem. 272: 15804-15816); citocina desaminasa (Mullen et al., 1994 Cancer Res. 54: 1503-1506); VSH timidina cinasa (Borrelli et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 7572-7576); nitrorreductasa; P-450-reductasa y una P450.

Preferentemente, el dominio o dominios enzimático(s) activador(es) de profármacos se fusiona(n) genéticamente al terminal C de una inmunoglobulina o dominio de inmunoglobulina tal como un scfv o de un anticuerpo monocatenario o del fragmento Fab. En una forma de realización particularmente preferida de este aspecto de la invención, el dominio o dominios de la inmunoglobulina son humanos o humanizados y la enzima es una enzima humana, tal como una carboxipeptidasa, una P450 o una P450-reductasa. La enzima puede ser una enzima mutante que convierte un profármaco de manera más eficaz que lo hace la enzima natural humana. Según la presente invención, puede utilizarse cualquier enzima que tenga utilidad en una estrategia de ADEPT.

En cada caso, se utiliza un profármaco adecuado en el tratamiento del paciente en combinación con la enzima activadora del profármaco apropiada. Ejemplos de profármacos incluyen el fosfato de etopósido (utilizado con la fosfatasa alcalina Senter et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 4842-4846); 5-fluorocitosina (con citosina desaminasa Mullen et al., 1994 Cancer Res. 54: 1503-1506); doxorrubicina-N-p-hidroxifenoxiacetamida (con penicilina-V-amidasa) (Kerr et al., 1990 Cancer Inmunol. Immunother. 31:202-206); glutamato de para-N-bis(2-cloroetil)aminobenzoilo (con carboxipeptidasa G2); carbamatos de mostaza nitrogenada cefalosporina (con P-lactamasa); SR4233 (con P450 reductasa); Ganciclovir (con VSH timidina cinasa, Borrelli et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 7572-7576), profármacos de mostaza con nitrorreductasa (Friedlos et al., 1997 J. Med. Chem. 40: 1270-1275) y ciclofosfamida (con P450 Chen et al. 1996 Cancer Res. 56: 1331-1340).

Alternativamente el dominio efector puede ser un dominio no enzimático. Ejemplos de dominios efectores no enzimáticos incluyen toxinas tal como una exotoxina procedente de una bacteria pseudomónada, toda o parte de una citocina tal como IL-2 o IFN\gamma o dominios efectores procedentes de cadenas pesadas de inmunoglobulina.

En una forma de realización preferida de este aspecto de la invención, la TBP contiene un dominio efector capaz de activar los receptores FcgR I, II o III del macrófago. En la unión de la TBP al antígeno en células tumorales, se activan los macrófagos presentes en las zonas hipóxicas del tumor para destruir las células tumorales directamente por fagocitosis o ADCC o se activan para segregar citocinas proinflamatorias que sirven para potenciar la respuesta inmunológica natural al tumor. La TBP puede contener una zona Fc de una inmunoglobulina, una zona Fc mutante, un fragmento de la zona Fc que se une al receptor o puede contener otro dominio que se une a FcR.

Preferentemente la TBP contiene una entidad, preferentemente una entidad con dominio efector, que proporciona estabilidad a la proteína ex vivo y/o in vivo.

Según la presente invención, la TBP puede incluir una zona Fc intacta procedente de una IgG (tal como IgG1 o IgG3 humanas) preferentemente procedente de IgE (tal como IgGE humana) o parte de las mismas.

En una forma de realización preferida de este aspecto de la invención, la TBP es un Sab (anticuerpo monocatenario) que contiene una zona constante de IgG1 humana y un dominio de unión que reconoce al antígeno 5T4.

En una forma de realización particularmente preferida de este aspecto de la invención, la TBP es un Sab (anticuerpo monocatenario) que contiene una zona constante de IgE humana y un dominio de unión que reconoce al antígeno 5T4.

El dominio efector puede estar codificado por un fragmento de un ADNc fusionado en el marco al ADN que codifica el dominio de unión al tumor. Alternativamente puede utilizarse un fragmento genómico que contiene intrones, tal como un fragmento genómico con zona constante de la cadena pesada de IgG1 humana.

Aquí el término "intrón" se utiliza en su sentido normal, p. ej. una secuencia interventora de ADN en un gen que se separa por corte y empalme del ARN y por eso no está presente en el ARN mensajero maduro y no codifica la proteína. Los intrones pueden cortarse y empalmarse condicional o alternativamente en diferentes tipos de células.

La introducción de genes que codifican la TBP en monocitos o macrófagos puede combinarse con tratamientos adicionales para producir la diferenciación y activación del macrófago. Por ejemplo, las células mantenidas ex vivo pueden tratarse con citocinas tales como IFN\gamma, CSF-1 o GM-CSF antes de la reintroducción en el paciente. Alternativamente, los genes que codifican estas citocinas pueden introducirse en los monocitos/macrófagos en el mismo o diferente vector procedentes de los genes de TBP in vivo o ex vivo. Por consiguiente los inventores describen un procedimiento de tratamiento del cáncer en un mamífero que comprende la administración a un individuo de una combinación de una citocina o un gen que codifica la citocina y uno o más genes con TBP según alguno de los aspectos previos de la invención.

Según la invención, pueden utilizarse técnicas convencionales de biología molecular que están comprendidas en el nivel de experiencia en la materia. Dichas técnicas están completamente descritas en la bibliografía. Véase por ejemplo; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: a laboratory manual; Hames and Glover (1985-1997) DNA Cloning: a practical approach, Volúmenes I-IV (segunda edición). Procedimientos para la modificación genética de genes de inmunoglobulina en particular se proporcionan en McCafferty et al. (1996) Antibody engineering: a practical approach.

En un aspecto preferido, la presente invención se refiere al suministro de genes que codifican la TBP a la zona de un tumor. Esto presenta considerables ventajas para aplicaciones médicas (tales como las aplicaciones terapéuticas) en las que están indicadas las TBP ya que solucionan numerosos problemas asociados al suministro de proteínas de manera generalizada en seres humanos.

En contraste con los problemas asociados a la producción y el suministro de proteínas, las utilizaciones de la invención permiten el suministro de genes a la zona del tumor, solucionando de este modo numerosos problemas de producción. Las TBP se producen de este modo in situ en las células autólogas humanas, que sirven como una fábrica local para la producción del medicamento génico (tal como un producto terapéutico). Esto presenta ventajas significativas al minimizar la toxicidad general. La actividad de la proteína es máxima, ya que la glucosilación de la proteína presenta un patrón humano apropiado al individuo en tratamiento.

Las utilizaciones de la invención pueden utilizarse junto con la inyección directa en el zona del tumor o en el suministro generalizado, por ejemplo, de vectores dirigidos o células hematopoyéticas transgénicas (preferentemente hematopoyéticas mieloides) o sus progenitores. El suministro generalizado puede ser particularmente ventajoso en numerosas indicaciones, particularmente en el tratamiento de la enfermedad extendida. En estos casos, el sistema de suministro de genes o células modificadas genéticamente puede administrarse por vía intravenosa o por inyección intravenosa a emboladas o por infusión en una formulación adecuada. Una formulación farmacéuticamente aceptable puede incluir una solución salina isotónica, una solución salina tamponada o un medio de cultivo tisular. Pueden incluirse agentes formuladores adicionales tales como agentes conservantes o estabilizantes.

De este modo, la presente invención también comprende una composición farmacéutica para el tratamiento de uno o más pacientes por terapia génica, en el que la composición comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del vector según la presente invención o del producto expresado del mismo. La composición farmacéutica puede ser para la utilización humana o animal. Por lo general, un médico determinará la dosis real que sea más adecuada para cada paciente y ésta variará con la edad, peso y respuesta de cada paciente.

La composición puede comprender opcionalmente un vehículo, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable. La selección del vehículo, excipiente o diluyente farmacéutico puede hacerse con respecto a la ruta de información deseada y a la práctica farmacéutica habitual. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como - o además de - vehículo, excipiente o diluyente algún o algunos aglutinante(s), lubricante(s), agente(s) de suspensión, agentes(s) de recubrimiento, agente(s) de disolución adecuado(s) y otros agentes portadores que pueden ayudar o aumentar la introducción vírica en el objetivo (tal como por ejemplo un sistema de suministro de lípidos).

Cuando proceda, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por alguna o más de las siguientes vías: inhalación, en forma de supositorio u óvulo vaginal, por vía tópica en forma de loción, solución, crema, pomada o polvos, mediante la utilización de un parche dérmico, por vía oral en forma de comprimidos que contienen excipientes tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos ya sea solas o mezcladas con excipientes, o en forma de elixires, soluciones o suspensiones que contienen agentes aromatizantes o colorantes, o pueden inyectarse por vía parenteral, por ejemplo por vía intracavernosa, intravenosa, intramuscular o subcutánea. Para la administración parenteral, las composiciones pueden utilizarse mejor en forma de una solución acuosa esterilizada que puede contener otras sustancias, por ejemplo suficientes sales o monosacáridos para hacer isotónica la solución con la sangre. Para administración bucal o sublingual las composiciones pueden administrarse en forma de comprimidos o pastillas que pueden formularse de manera convencional.

Por lo tanto, un aspecto preferido de la presente invención se refiere a un vector que comprende: (a) una NS que codifica una TBP y (b) un NOI que codifica un POI; en el que la TBP es capaz de reconocer un antígeno 5T4, de modo que en la utilización el vector es capaz de suministrar el NOI y/o el POI al tumor.

En una forma de realización ilustrativa de la presente invención, la TBP es IgG o IgE o una parte de las mismas.

En otra forma de realización ilustrativa de la presente invención, la TBP comprende EGF o una parte de la misma.

En otra forma de realización ilustrativa de la presente invención, la TBP reconoce un antígeno 5T4 y por lo menos uno de los dominios efectores en una molécula coestimulante segregada. A continuación siguen más directrices de antecedentes y detalles en esta forma de realización.

Este último aspecto mencionado de la presente invención se refiere a un procedimiento para la activación de linfocitos y a la utilización de linfocitos activados en el tratamiento del cáncer. Se refiere también a proteínas de fusión para la activación de linfocitos, a ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión y a los vectores que transportan los ácidos nucleicos.

Los linfocitos requieren por lo menos dos señales distintas con objeto de responder a los antígenos por activación de funciones efectoras (Bretscher y Cohn 1970 Science 169: 1042-1049; Crabtree 1989 Science 243: 355-361). La señal primaria es específica para el antígeno. Para los linfocitos B, el receptor del antígeno de linfocitos B (inmunoglobulina de superficie) reconoce epítopos tridimensionales en la superficie de las células que presentan al antígeno por proteínas de la familia con histocompatibilidad mayor (MHC) (Weiss et al. 1986 Ann Rev. Inmunol. 4: 593-619).

La estimulación de la señal primaria en el aislamiento conduce normalmente a la apoptosis (muerte celular programada) de linfocitos o conduce a la creación de un estado de insensibilidad mantenida o anergía (Weiss et al. anteriormente). Con objeto de conseguir la activación de los linfocitos, se requieren señales accesorias que pueden ser suministradas por citocinas o por ligandos coestimulantes de la superficie de las células presentes en las células que presentan el antígeno (CPA).

Existen numerosas moléculas coestimulantes ahora identificadas que incluyen moléculas de adhesión, LFA-3, ICAM-1, ICAM-2. Las moléculas coestimulantes principales presentes en APC son miembros de la familia B7 incluyendo B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) y B7-3. Estas moléculas son ligandos de receptores coestimulantes en linfocitos incluyendo CD28 (WO 92/00092), probablemente el receptor coestimulante más significativo para los linfocitos T en reposo. Diferentes miembros de la familia B7 de las glucoproteínas pueden suministrar sutilmente diferentes señales a los linfocitos T (Nunes et al., 1996 J. Biol. Chem. 271: 1591-1598).

Los tumores probados, a pesar del hecho de que comúnmente expresan antígenos poco corrientes en sus superficies, son poco inmunógenos. Se ha supuesto anteriormente que un procedimiento para estimular el reconocimiento inmunitario de las células tumorales sería para aumentar la presentación del antígeno y la coestimulación de linfocitos en el contexto de los antígenos tumorales. La transfección de los genes que codifican B7-1 y B7-2 solos o en combinación con citocinas, se ha demostrado que aumentan el desarrollo de la inmunidad en tumores experimentales en modelos animales (p. ej. Leong et. al. 1997 Int. J. Cancer 71: 476-482; Zitvogel et. al. 1996 Eur. J. Inmunol. 26: 1335-1341; Cayeux et. al. 1997 J. Inmunol. 158:2834-2841). Sin embargo, al traducir estos resultados a un tratamiento práctico para el cáncer humano, existen numerosos problemas significativos que deben superarse. Un problema principal en dichos estudios es la necesidad de suministrar genes B7 in vivo a un gran número de células del tumor para conseguir la eficacia. Un segundo problema es que es importante dirigir la expresión de B7 a las células tumorales para evitar la activación inapropiada de los inmunocitos dirigida contra otros tipos de células.

Este aspecto de la presente invención resuelve estos problemas específicos suministrando un gen que codifica una molécula coestimulante segregada ("SCM") con afinidad para la unión a un antígeno tumoral. De esta manera, un número relativamente pequeño de células transfectadas dentro del tumor actúa como una fábrica local para producir la molécula coestimulante que se libera de la célula productora y se une a otras células en el tumor. El aspecto de la presente invención tiene la ventaja adicional de que las células tumorales no necesitan ser la diana para la transfección.

La SCM de la invención es una nueva proteína de fusión modificada genéticamente que comprende un péptido señal para la secreción de células de mamífero, por lo menos un dominio de unión al antígeno procedente de una inmunoglobulina o de una molécula similar a la inmunoglobulina y por lo menos un dominio más que actúa como señal coestimulante para una célula del sistema inmunitario. Se prevé también la utilización de combinaciones de SCM que contienen diferentes dominios coestimulantes. Las SCM se producen por la expresión de los genes que codifican la SCM en las células autólogas del paciente que ha de tratarse y por consiguiente algunas modificaciones añadidas después de la traducción a la proteína por la célula hospedadora son auténticas y proporcionan una proteína completamente funcional y farmacocinética apropiada.

El documento WO-A-92/00092 describe formas truncadas de B7-1 procedentes de la colocación de un codón de terminación de la traducción antes del dominio transmembranario, segregadas procedentes de células de mamífero. En este caso particular, se utilizó un péptido señal heterólogo procedente del gen M de Oncostatina. El documento WO-A92/00092 describe también proteínas de fusión que contienen el dominio extracelular de B7-1 fusionado a la zona Fc de una inmunoglobulina. Dichas moléculas pueden unirse a CD28 en los linfocitos T y servir para estimular la proliferación de linfocitos T. Sin embargo dicha estimulación ocurre solamente en una medida moderada a menos que el B7 o el derivado de B7 esté inmovilizado sobre una superficie sólida.

Gerstmayer et. al. (1997 J. Inmol. 158: 4484-4590) describe una fusión de B7-2 a un scFv específico para ErbB2 seguido de un epítopo tag de myc y polihistidina tag que se segrega cuando se expresa en le levadura Pichia pastoris. Esta molécula conservó la unión para el antígeno y la proliferación coestimulada de linfocitos T preestimulados con PMA e IL-2. Sin embargo, la glucosilación de dicha molécula es del tipo levadura, lo que es probable que conduzca a farmacocinética inapropiada en seres humanos.

Según la presente invención, puede utilizarse cualquier dominio o dominios coestimulante(s). A modo de ejemplo, pueden seleccionarse dominios coestimulantes a partir de porciones extracelulares de la familia B7 de glucoproteínas de la superficie celular, incluyendo B7-1, B7-2 y B7-3 u otras glucoproteínas de la superficie celular coestimulantes tales como, pero no limitadas a, moléculas receptoras del ligando coestimulantes incluyendo CD2/LFA-3, LFA-1/ICAM-1 e ICAM-3. Los estudios han demostrado que la coestimulación de linfocitos T por monocitos depende en cada uno de dos series de reacciones del ligando receptor CD2/LFA-3 y LFA-1/ICAM-1 (Van Seventer et. al. 1991 Eur. J. Inmunol. 21: 1711-1718). Además, se ha demostrado que ICAM-3, el tercer contrarreceptor de LFA-1, es una molécula coestimulante para linfocitos T en reposo y activados (Hernández-Caselles et. al. 1993 Eur. J. Inmunol. 23: 2799-2806).

Otras posibles moléculas coestimulantes pueden incluir un nuevo receptor de glucoproteínas denominado SLAM, se ha identificado el cual, cuando está ocupado, potencia la expansión de linfocitos T de manera independiente de CD28 y produce un perfil de la producción de citocinas Th0/Th1 (Cocks et al. 1995 Nature 376: 260-263).

Se ha demostrado también que CD6, glucoproteína de la superficie celular, funciona como receptor coestimulante y de adhesión en los linfocitos T. Se han descrito cuatro isoformas de CD6 (CD6a, b, c y d) (Kobarg et al. 1997 Eur. J. Inmunol. 27: 2971-2980). Se ha sugerido también una función para el antígeno muy tardío (VLA-4) integrina en la activación de linfocitos B humanos con memoria (Silvy et al. 1997 Eur. J. Inmunol. 27: 2757-2764). Las células endoteliales proporcionan también señales coestimulantes únicas que afectan al fenotipo linfocitos T CD4+ activados (Karmann et al. 1996 Eur. J. Inmunol. 26: 610-617). Se ha descrito una proteína B3, presente en la superficie de los linfocitos B activados con lipopolisacáridos, que puede proporcionar coestimulación a los linfocitos T en reposo conduciendo a una liberación predominante de interleucina (IL)-4 e IL-5 y cantidades despreciables de IL-2 e interferón gamma (Vinay et al. 1995 J. Biol. Chem. 270: 23429-23436). La coexpresión de un nuevo antígeno del linfocito T coestimulante (A6H) en los linfocitos T y las células tumorales ha sugerido una posible función relacionada con las propiedades comunes de estas células (Labuda et al. 1995 Int. Inmunol. 7: 1425-1432).

En una forma de realización preferida de la invención, el dominio coestimulante es una parte de B7-1 o B7-2, más preferentemente la fracción extracelular completa de B7-1 o B7-2.

La SCM se forma por expresión de un nuevo gen que codifica una proteína de fusión que contiene el dominio o dominios de unión al antígeno y el dominio o dominios coestimulantes. Si el dominio que se une al antígeno está compuesto por una cadena pesada y una ligera, el dominio coestimulante se fusiona a una u otra de las cadenas de inmunoglobulina, preferentemente a la cadena pesada. Si el dominio de fijación al antígeno es un scFv, el dominio coestimulante se fusiona al scFv. Los dominios pueden colocarse en el orden (terminal N a terminal C): el dominio de unión al antígeno seguido del dominio coestimulante, o el dominio coestimulante seguido del dominio de unión al antígeno. Preferentemente, el dominio coestimulante se coloca en el terminal N seguido del dominio de unión al antígeno. Un péptido señal está incluido en el terminal N, y puede ser por ejemplo el péptido señal natural del dominio extracelular coestimulante. Los diferentes dominios pueden estar separados por secuencias adicionales, que pueden proceder de la inclusión de las secuencias de escisión de la enzima de restricción conveniente en el nuevo gen para facilitar su construcción, o sirven como un espaciador de péptidos entre los dominios, o sirven como un enlazador peptídico flexible o proporcionan otra función. Preferentemente los dominios están separados por un enlazador flexible.

Pueden utilizarse dos o más genes diferentes que codifican las diferentes SCM para conseguir la coestimulación mejorada, o tanto la coestimulación de linfocitos T naturales como la inducción de respuestas de la memoria. Por ejemplo un gen que codifica una SCM que contiene el dominio extracelular B7-1 puede administrarse con un gen que codifica una SCM que contiene el dominio extracelular B7-2.

Por lo tanto, en un aspecto de la invención, se proporciona uno o más vectores genéticos capaces de expresar en células de mamífero una o más moléculas coestimulantes segregadas, comprendiendo cada molécula coestimulante segregada por lo menos un dominio de unión al antígeno y por lo menos un dominio de la porción extracelular de una molécula coestimulante de la superficie celular. El dominio coestimulante puede obtenerse a partir de una molécula expresada en la superficie de una célula que presenta el antígeno tal como un miembro de la familia B7. Preferentemente el dominio coestimulante procede de B7-1, B7-2 o B7-3. Aún más preferentemente está compuesto por los restos de aminoácidos 1 a aproximadamente 215 de B7-1 de la molécula B7-1 madura (descrita en el documento WO-A-96/00092) o por los aminoácidos 1 hasta aproximadamente 225 de la forma madura de la superficie celular de B7-2 (descrita en Gerstmeyer et. al. 1997 J. Inmol. 158: 4584-4590).

El vector genético según este aspecto de la invención comprende por lo menos un activador y un potenciador para la expresión en células de mamífero y una zona de poliadenilación. Activadores y potenciadores adecuados incluyen el activador-potenciador MIE de citomegalovirus humano o activadores que se expresan preferentemente en células presentes dentro del tumor. Dichos activadores-potenciadores incluyen los del gen MUC1, el gen CEA o el gen del antígeno 5T4. Si se expresan dos o más SCM, las zonas de codificación de éstas pueden insertarse en dos vectores por separado o un solo vector puede utilizarse para expresar los dos genes o más. En este último caso, cada gen se proporciona con una copia por separado del activador, o se utiliza una zona de entrada del ribosoma interno (IRES) para separar las dos secuencias de codificación.

La presente invención también abarca la utilización de mutantes, variantes, homólogos o fragmentos de las secuencias dadas a conocer en la presente memoria.

Los términos "variante", "homólogo" o "fragmento" en relación con las secuencias nucleotídicas incluyen cualquier sustitución, variación, modificación, reemplazamiento, eliminación o adición de uno (o más) ácidos nucleicos desde o hasta la secuencia que proporciona los códigos de la secuencia nucleotídica resultante o es capaz de codificar una entidad que tiene la misma función que la representada en la presente memoria, preferentemente siendo por lo menos biológicamente activa como la misma. En particular, el término "homólogo" abarca la homología con respecto a la estructura y/o función que proporciona los códigos de la secuencia nucleotídica resultante o es capaz de codificar una entidad que tiene la misma función que la presentada en la presente memoria. Con respecto a la homología de secuencia, preferentemente existe por lo menos el 75%, más preferentemente por lo menos 85%, más preferentemente por lo menos el 90% de homología con las secuencias mostradas en la presente memoria. Más preferentemente existe por lo menos el 95%, más preferentemente por lo menos el 98% de homología con las secuencias mostradas en la presente memoria.

En particular, el término "homología" tal como se utiliza en la presente memoria puede identificarse con el término "identidad". La homología con secuencia relativa (es decir, identidad de secuencia) puede determinarse mediante programas informáticos disponibles en el mercado que pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias. Un ejemplo típico de dichos programa informático es CLUSTAL.

Los términos "variante", "homólogo" o "fragmento" son sinónimos con variaciones alélicas de las secuencias.

El término "variante" también comprende las secuencias que son complementarias con las secuencias que son capaces de hibridar a las secuencias nucleotídicas presentadas en la presente memoria. Preferentemente, el término "variante" comprende secuencias que son complementarias con las secuencias que son capaces de hibridarse en condiciones severas (p. ej. 65ºC y 0,1xSSC {1xSSC = NaCl 0,15 M, citrato Na_{3} 0,015 N pH 7,0}) con la secuencia nucleotídica presentada en la presente memoria.

La presente invención también abarca las secuencias nucleotídicas que pueden hibridarse con las secuencias nucleotídicas de la presente invención (incluyendo las secuencias complementarias de las presentadas en la presente memoria). En un aspecto preferido, la presente invención abarca secuencias nucleotídicas que pueden hibridarse con la secuencia nucleotídica de la presente invención en condiciones severas (p. ej. 65ºC y 0,1xSSC) con la secuencia nucleotídica presentada en la presente memoria (incluyendo las secuencias complementarias de las presentadas en la presente memoria).

Los términos "variante", "homólogo" o "fragmento" en relación con las secuencias de aminoácidos incluyen cualquier sustitución, variación, modificación, reemplazamiento, eliminación o adición de uno (o más) aminoácidos desde o hasta la secuencia que proporciona la secuencia de aminoácidos resultante tiene la misma función que la presentada en la presente memoria, preferentemente siendo por lo menos tan biológicamente activa como la misma. En particular, el término "homólogo" abarca la homología con respecto a la estructura y/o función con la condición de que la secuencia de aminoácidos resultante tenga la misma función que la presentada en la presente memoria. Con respecto a la homología de secuencia, preferentemente existe por lo menos el 75%, más preferentemente por lo menos el 85%, más preferentemente el 90% de homología con las secuencias mostradas en la presente memoria. Más preferentemente existe por lo menos el 95%, más preferentemente por lo menos el 98% de homología con las secuencias mostradas en la presente memoria.

En resumen, la presente invención se refiere a un vector que comprende (a) una NS que codifica una TBP y opcionalmente (b) un NOI que codifica un POI; en el que la TBP es capaz de reconocer un antígeno 5T4, de modo que en la utilización el vector es capaz de suministrar el NOI y/o el POI al tumor.

Un aspecto preferido de la presente invención se refiere a un vector que comprende (a) una NS que codifica una TBP y (b) un NOI que codifica un POI; en el que la TBP es capaz de reconocer un antígeno 5T4, de modo que en la utilización el vector es capaz de suministrar el NOI y/o el POI al tumor.

Un aspecto más preferido de la presente invención se refiere a un vector que comprende (a) una NS que codifica una TBP y (b) un NOI que codifica un POI; en el que la TBP es capaz de reconocer un antígeno 5T4, de modo que en la utilización el vector es capaz de suministrar el NOI y/o el POI al tumor; y en el que la TBP y el POI se fusionan entre si.

Este aspecto de la presente invención tiene ventajas ya que permite la producción y el suministro, por ejemplo, de un producto de fusión que comprende un componente efector y un componente de direccionamiento.

Un aspecto más preferido de la presente invención se refiere a un vector que comprende (a) una NS que codifica una TBP y (b) un NOI que codifica un POI; en el que la TBP es capaz de reconocer un antígeno 5T4, de modo que en la utilización el vector es capaz de suministrar el NOI y/o el POI al tumor; y en el que la TBP y el POI se fusionan entre si; y en el que el POI es capaz de segregarse.

Este aspecto de la presente invención presenta muchas ventajas ya que proporciona un medio para la producción in situ de un POI, por ejemplo, mediante un pequeño número de células para el suministro posterior de por lo menos una parte del POI producido a por lo menos una célula adyacente. Por lo tanto, se necesita solamente infectar un pequeño número de células para conseguir un efecto terapéutico beneficioso.

Por lo tanto, alternativamente expresada, la presente invención proporciona la utilización de un vector según la presente invención como una factoría de producción in situ de uno cualquiera o más de la NS que codifica la TDP, NOI, POI y TBP.

Además, la presente invención proporciona la utilización de un vector según la presente invención cuando está presente en una célula para suministrar un NOI y/o POI a una célula adyacente.

Un aspecto más preferido de la presente invención se refiere a un vector que comprende (a) una NS que codifica una TBP, (b) un NOI que codifica un POI, y (c) una secuencia nucleotídica que codifica una entidad secretora; en la que la TBP es capaz de reconocer un antígeno 5T4, de modo que en la utilización el vector es capaz de suministrar el NOI y/o el POI al tumor; en el que la TBP y el POI se fusionan entre sí; y en el que el POI es capaz de segregarse.

La invención se describirá a continuación a modo de ejemplos, que significan que sirven para asistir a cualquier experto en la materia en la realización de la invención y no se pretende en modo alguno limitar el alcance de la invención.

Se hace referencia a las siguientes Figuras:

Figura 1a - que presenta una secuencia de ADN que codifica un 5T4 scFv, denominado 5T4scFv.1. Se proporciona la secuencia de la proteína madura segregada.

Figura 1b - que presenta la secuencia del ADNc que codifica a 5T4Sab1. La secuencia comienza con una secuencia de restricción HindIII seguida de una señal de iniciación de la traducción y de un péptido señal.

La Figura 2 presenta la secuencia de B7-1.5T4.1.

La Figura 3 presenta una representación en diagrama de dos SCM basada en el dominio coestimulante B7-1; la Figura 3a presenta el SCM B7-1.5T4.1 y la Figura 3b presenta B7-1.5T4.2 en la que el orden de los dominios coestimulante y de unión al tumor están invertidos. Sp = péptido señal; B7 ec = dominio extracelular de B7-1; VI = dominio variable de la cadena ligera de 5T4; Vh = dominio variable de la cadena pesada de 5T4.

La Figura 4 presenta la secuencia del dominio extracelular de B7-2 humano, incluyendo la secuencia del péptido señal. La proteína madura comienza en el aminoácido 17. La secuencia derivada de B7-2 es seguida por un enlazador flexible gly-gly-gly-gly-ser.

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de 5T4 Sab y suministro del vector retrovírico al tumor

El ADNc que codifica el anticuerpo monoclonal 5T4 murino se clona y es secuenciado por técnicas habituales (Antibody engineering: a practical approach ed. McCafferty et al. 1996 OUP). La secuencia de la zona variable del anticuerpo puede utilizarse para construir una variedad de moléculas similares a la inmunoglobulina incluyendo los scFv. La secuencia de codificación de un 5T4 scFv, 5T4scFv.1, se muestra en la Figura 1a. En esta molécula, la secuencia del ADN codifica la Vh del anticuerpo monoclonal 5T4 de ratón seguida de un enlazador flexible de 15 aminoácidos y la zona V1 den anticuerpo 5T4 de ratón. El enlazador flexible codifica 3 copias de la secuencia de aminoácidos gly-gly-gly-gly-ser y la similitud de secuencia del ADN entre las repeticiones se ha minimizado para evitar el riesgo de recombinación entre las repeticiones cuando los plásmidos que las contienen se cultivan en E.coli.

La secuencia del ADN presentada en la Figura 1a puede utilizarse también para construir una variedad de anticuerpos monocatenarios (Sab) acoplando las secuencias de codificación de scFv a una secuencia que codifica una zona de Fc para formar una fusión en el marco. Se construye un Sab utilizando una serie de casetes de ADN que pueden variarse independientemente para conseguir los fines específicos.

Casete 1 - Señal de iniciación de la traducción y péptido señal

Para conseguir la iniciación de la traducción correcta y la secreción en células de mamífero, se utiliza la siguiente secuencia:

100

Ésta contiene una secuencia de restricción HindIII conveniente para la clonación en vectores de expresión (caso inferior), la señal de iniciación de la traducción de consenso para células de mamífero (ANNATGPu) y la secuencia de codificación para una secuencia de péptido señal procedente de un gen de inmunoglobulina.

Casete 2 - scFv

La secuencia de la fracción segregada del 5T4scFv.1 se muestra en la Figura 1a. Esta molécula puede representarse como Vh - enlazador (gly_{4}-ser)_{3} - VI.

5T4scFv2 está constituida por las secuencias de la zona variable 5T4 conectadas en el orden VI-enlazador flexible Vh. En este caso el enlazador flexible codifica el péptido de 20 aminoácidos (gly_{4}-ser)_{4}. Un enlazador mayor mejora el montaje del scFv cuando los segmentos de la zona V están en este orden. (Pluckthun et al. en Antibody Engineering: a practical approach, ed. MacCafferty et al. 1996 OUP).

Casete 3 - Zona constante de la cadena pesada

La secuencia de un clon genómico de la zona constante g1 humano se proporciona en Ellison et al. 1982 Nucl. Acids res. 10: 4071-4079. Esta secuencia contiene intrones de la zona constante además de la secuencia de codificación. Esta se fusiona en el marco al extremo 3' de una de las secuencias scFv del casete 2. Los vectores para el montaje conveniente de dichos montajes están descritos (Walls et al. 1993 Nucl. Acids Res. 21:2921-2929).

Un ADNc de un 5T4 Sab, denominado 5T4Sab1 se presenta en la Figura 1b, que contiene las casetes 1, 2 y 3.

Para la expresión de un scFv específico para 5T4 o Sab en células humanas, se inserta la secuencia de codificación en el vector pCIneo (Promega) bajo el control de un activador potente y una señal de poliadenilación. La señal de iniciación de la traducción y la secuencia principal de inmunoglobulina (péptido señal) de la casete 1 y en el extremo 5' de la zona de codificación garantiza secreción eficaz del scFv o del Sab de las células de mamíferos.

Para la expresión de una Ig intacta, se construyen dos casetes de traducción independientes, una para la cadena pesada y otra para la cadena ligera. Estas se separan por una zona de entrada al ribosoma interno (IRES) procedente del picornavirus FMDV (Ramesh et al. 1996 Nucl. Acids res. 24: 2697-2700). Alternativamente, cada ADN se expresa en una copia dependiente del activador hVMC (Ward y Bebbington 1995 en Monoclonal Antibodies ed. Birch and Lennox. Wiley-Liss).

Para la producción de retrovirus capaces de expresar anticuerpos 5T4 o moléculas inmunoglobulinoformes con especificidad de 5T4, se inserta el gen que codifica un Sab a base de 5T4, o un mensaje dicistrónico que codifica cadenas pesadas y ligeras, en un vector retrovírico en el que los transcritos genómicos retrovíricos son producidos en un activador potente tal como el activador hVMC-MIE. Un plásmido apropiado es el pHIT111 (Soneoka et al. 1995 Nucl. Acids res.23; 628-633) y el gen requerido se inserta en lugar del gen LacZ utilizando técnicas convencionales. El plásmido resultante, pHIT-5T4 se transfecta a continuación en las estirpes celulares de encapsulación FLYRD 18 o FLYA 13 (Cosset et al. 1995 J. Virol. 69; 7430-7436) y transfectados seleccionados para resistencia a G418 a A1 mg/ml. Las células de la encapsulación resistentes a G418 producen valores elevados de retrovirus recombinante capaces de infectar células humanas. La preparación del virus se utiliza a continuación para infectar células cancerosas humanas y puede inyectarse en tumores in vivo. El Sab de 5T4 se expresa a continuación y se segrega en células tumorales.

En el pHIT111, el activador-potenciador MoVLM LTR se utiliza para la expresión del gen terapéutico en la célula diana. El vector puede modificarse también de modo que el gen terapéutico se transcribe en un activador-potenciador interno tal como el que es predominantemente activo en las células tumorales o el que contiene un elemento regulado de hipoxia. Un activador adecuado es un activador TK del VSH truncado con 3 copias del PGK HRE de ratón (Firth et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 6496-6500).

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Ejemplo 2 Transfección de macrófagos/monocitos con un vector de expresión que modifica la TBP

Se aíslan células mononucleares de la sangre periférica en la sangre periférica humana a escala de laboratorio por procedimientos con técnicas convencionales (Sandlie y Michaelsen 1996 en Antibody engineering: a practical approach. ed. McCafferty et al. Capítulo 9) y en gran escala por elutriación (p. ej. Ceprate de CellPro). Las células adherentes (esencialmente monocitos) se enriquecen por adherencia al plástico durante la noche y las células pueden dejarse diferenciar a lo largo de la serie de reacciones de diferenciación de macrófagos cultivando células adherentes durante 1 a 3 semanas.

Se transfectan monocitos y macrófagos con un vector de expresión capaz de expresar la TBP en células humanas. Para la expresión constitutiva a alto nivel, se expresa la TBP en un vector que utiliza el activador-potenciador hVMC-MIE, pCI(Promega). Para la expresión provocada por hipoxia, se sustituye el activador hVMC por un activador que contiene por lo menos una HRE. Un activador adecuado es un activador TK de VSH truncado con 3 copias del PGK HRE de ratón (Firth et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 6496-6500).

Para introducir vectores en monocitos y macrófagos puede utilizarse una variedad de procedimientos de transfección, incluyendo el suministro de ADN mediado por partículas (biolística), electroporación, transfección mediada por agente catiónico (p. ej. utilizando Superfect, Qiagen). Cada uno de estos procedimientos se realiza según las instrucciones del fabricante, teniendo en cuenta los parámetros que deben variarse para conseguir resultados óptimos especificados por cada fabricante. Alternativamente, pueden utilizarse vectores víricos tales como los vectores de adenovirus defectuosos (Microbix Inc. o Quantum Biotechnologies Inc.).

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Ejemplo 3 Ensayo para ADCC mediado por macrófagos

Células procedentes de tumores humanos primarios o estirpes de células tumorales que han sido transducidas con retrovirus que expresan TBP se mezclan con macrófagos humanos autólogos o heterólogos, preparados como se describe en el Ejemplo 2, para el análisis de la actividad de ADCC mediada por la TBP. Alternativamente, pueden utilizarse macrófagos transgénicos para producir TBP como los descritos en el Ejemplo 2 para dirigir ADCC sobre células tumorales no transducidas.

El ensayo se realiza según los procedimientos convencionales (Sandlie y Michaelsen 1996 en Antibody engineering: a practical approach. ed. McCafferty et al. Capítulo 9) con modificaciones apropiadas. En resumen, las células efectoras (macrófagos o monocitos recién aislados) se ponen en suspensión en 3 x 10^{6} células/ml en el medio de cultivo tisular apropiado (DMEM/Hepes, adquirido en Life Technologies, que contiene suero de ternero fetal al 1%). 3 x 10^{5} células diana tumorales, marcadas con ^{5l}Cr se colocan en cada pocillo de una placa de microvaloración de fondo redondo en 0,1 ml de medio de cultivo. (Obsérvese que el medio de cultivo puede incluir medio gastado procedente de células que producen la TBP). Se añaden 50 ml de células efectoras a los pocillos, se centrifuga la placa a 300 g durante 2 min. Y se incuba a 37ºC durante periodos variables (p. ej. 4 h) en una incubadora de cultivo tisular. Se recoge a continuación el sobrenadante por centrifugación y se hace un recuento en un contador gamma. Los resultados se expresan en tanto por ciento de lisis referido a la liberación de cromo total de una muestra equivalente de células diana lisadas con Tween-20 al 0,1%. La proporción efector:célula diana puede variarse en el ensayo para producir una curva de valoración.

Para la estimulación anterior de diferenciación de macrófagos o cebado, se añaden citocinas a los cultivos. Se añade IFNg (Sigma) entre 100 y 5000 U/ml. Puede añadirse también CFS-1 o CM-CSF (Santa Cruz Biotechnology) en concentraciones apropiadas.

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Ejemplo 4 Análisis de eficacia en modelos animales

Se cultivan in vivo estirpes celulares y tejidos procedentes de tumor humano en ratones "lampiños", genéticamente inmunodeficientes según técnicas bien probadas (véase por ejemplo Strobel et al. 1997 Cancer Res. 57: 1228-1232; McLeod et al. 1997 Pancreas 14: 237-248). Pueden utilizarse también modelos de ratón clónico, en los que una estirpe tumoral clónica se introduce en una cepa de ratón inmunocompetitiva. Éstas sirven como modelos animales adecuados para evaluar los sistemas de suministro génico de la invención. Se administran vectores o células transgénicas de manera generalizada o directamente en el tumor y se controla el crecimiento del tumor en animales tratados y sin tratar. Este sistema se utiliza para definir el intervalo de dosis eficaz de los tratamientos de la invención y la vía de administración más apropiada.

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Ejemplo 5 Construcción de proteínas de fusión B7-scFv

El dominio extracelular de B7-1 es definido por los restos 1-215 de aminoácidos de la proteína B7-1 natural humana. Ésta secuencia, junto con su secuencia que codifica el péptido señal, se utiliza para construir proteínas de fusión segregadas que contienen también el scFv procedente del anticuerpo monoclonal 5T4. En la Figura 1a se proporciona la secuencia del scFv del 5T4.

Se construye una secuencia de codificación de ADN utilizando técnicas de biología molecular convencionales que codifica una proteína de fusión en la que el terminal N del scFv de 5T4 se fusiona después del aminoácido 215 de B7-1 humana. En la Figura 2 se muestra la secuencia de esta secuencia de codificación, B7-1.5T4.1. La proteína de fusión contiene un espaciador flexible (gly-gly-gly-gly-ser) entre las secuencias B7-1 y scFv de 5T4. La introducción de una secuencia de restricción BamH1 conveniente en el extremo de la inserción del enlazador (que empieza en el nucleótido 733) permite también que sean cribados más enlazadores para la expresión óptima de la proteína de fusión difuncional. La Figura 3 indica la proteína de fusión en forma de diagrama. Asimismo es posible construir B7-1.5T4.2 (Figura 3b) en la que el scFv es el terminal N y el dominio extracelular de B7 es el terminal C. En este caso se requiere solamente la secuencia de codificación de la B7-1 madura (sin péptido señal). Un péptido señal tal como una secuencia principal de inmunoglobulina se añade al terminal N del scFv en este caso.

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Para las proteínas de fusión que utilizan el dominio extracelular coestimulante de B7-2, se utiliza el péptido señal y el dominio extracelular de B7-2 en lugar de las secuencias de B7-1. La Figura 4 muestra la secuencia de codificación del dominio coestimulante SCM B7-2.5T4.1. Éste codifica los primeros 225 aminoácidos de la B7-2 humana, precedida por su péptido señal, y un enlazador flexible (gly4-ser). La secuencia BamHI en el extremo de esta secuencia puede utilizarse para insertar el dominio corriente arriba del 5T4scFv.1 (véase la Figura 3). La secuencia incluye el péptido señal B7-2 que puede servir para dejar la secreción de ésta proteína de fusión en la que el dominio B7-2 está en el terminal N de la proteína de fusión.

Cada ADNc transgénico se inserta en el vector de expresión de mamífero pCI para permitir la expresión en las células del cultivo tisular de mamífero. Con este fin, se añade una secuencia enlazadora al terminal 5' de la secuencia de codificación que introduce una secuencia de restricción conveniente para la inserción en el polienlazador de pCI y se añade la señal de iniciación de la traducción CCACC inmediatamente adyacente al primer codón ATG. Los montajes en pCI se transfieren a una estirpe de células hospedadoras de mamífero adecuada tal como COS-1 para confirmar la secreción de la SCM. La casete de transcripción procedente del pCI o un segmento apropiado de la casete de transcripción se subclona posteriormente en el vector de expresión que ha de utilizarse como sistema de suministro génico para su utilización terapéutica.

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Ejemplo 6 Transfección de macrófagos/monocitos con un vector de expresión que codifica una SCM

Se aíslan células mononucleares de la sangre periférica procedentes de la sangre periférica humana a escala de laboratorio por procedimientos de técnicas convencionales (Sandlie y Michaelsen 1996 en Antibody engineering: a practical approach. Ed. McCafferty et al. Capítulo 9) y a gran escala por elutriación (p. ej. Ceprate de CellPro). Células adherentes (esencialmente monocitos) se enriquecen por adherencia al plástico durante la noche y las células se dejan diferenciar a lo largo de la ruta de diferenciación de macrófagos cultivando células adherentes durante 1 a 3 semanas.

Se transfectan monocitos y macrófagos con un vector de expresión capaz de expresar la SCM en células humanas. Para la expresión constitutiva a alto nivel, se expresa la SCM en un vector que utiliza el activador-potenciador hVMC-MIE, pCI (Promega). Para la expresión provocada por hipoxia, se sustituye el activador hVMC por un activador que contiene por lo menos una HRE. Un activador adecuado es un activador TK de VSH truncado con 3 copias del PGK HRE de ratón (Firth et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 6496-6500).

Para introducir vectores en monocitos y macrófagos puede utilizarse una variedad de procedimientos de transfección, incluyendo el suministro de ADN mediado por partículas (biolística), electroporación, transfección mediada por agente catiónico (p. ej. utilizando Superfect, Qiagen). Cada uno de estos procedimientos se realiza según las instrucciones del fabricante, teniendo en cuenta los parámetros que deben variarse para conseguir resultados óptimos especificados por cada fabricante. Alternativamente, pueden utilizarse vectores víricos tales como los vectores de adenovirus defectuosos (Microbix Inc. o Quantum Biotechnologies Inc.).

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Ejemplo 7 Análisis de la unión de SCM a células que expresan a CTLA-4 y a 5T4-antígeno

Cabe esperar que los dominios B7-1 o B7-2 se unan específicamente a CD28 y CTLA-4 presentes en los linfocitos T humanos. La unión a los linfocitos T o a células de ovario de hámster chino transfectadas con CTLA-4 humano o CD28 se determina utilizando análisis FAGS de la manera siguiente. 5 x 10^{5} CTLA-4 que expresan células diana o células equivalentes que carecen de CTLA-4 (células CHO sin transfectar) se incuban con 0,1 ml de sobrenadante de cultivo procedente de células COS-1 transfectadas temporalmente con genes SCM durante 1 h a 4ºC. Se lavan las células y se incuban con 1 mg de anticuerpo monoclonal específico para el dominio B7 (p. ej. Mab 9E 10) seguido de IgG anti-ratón de cabra marcado con FITC (Pharmingen) y análisis por FACS.

La unión de scFv al 5T4-antígeno se evalúa asimismo utilizando células diana que expresan al 5T4-antígeno (células A9 transfectadas con 5T4) o células de referencia (A9).

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Ejemplo 8 Análisis de actividad coestimulante

Una estirpe de células de ratón probada de origen Balb-c tal como las células HC11 se transfecta con el ADNc que codifica al 5T4-antígeno humano (Myers et al. 1994 J. Biol. Chem. 269; 9319-9324) insertado en el vector de expresión pCIneo.

Linfocitos T de bazo procedentes de ratones Balb/c se aíslan por procedimientos normalizados (Johnstone y Thorpe 1996 en Inmunochemistry in Practice. Blackwell. Capítulo 4). Se estimulan previamente linfocitos T por incubación durante 1 a 2 días en un medio que contiene 10 ng/ml de PMA (Sigma) y 100 U/ml de IL-2 humana (Boehringer Mannheim). Se incuban células HC11-5T4 a razón de 10^{4} células/pocillo de una capa de tejido tisular con 96 pocillos durante 2 h con hasta 0,1 ml de sobrenadante procedente de células de COS transfectadas con el gen SCM. Hasta 10^{5} linfocitos T estimulados previamente se añaden a cada pocillo, se pulsan las células con 0,25 mCi/pocillo de ^{3}H-timidina y se mide la incorporación de ^{3}H-timidina utilizando un contador de centelleo líquido después de 24 h.

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Se prevé que la incorporación de ^{3}H-timidina aumente por la presencia de SCM.

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Ejemplo 9 Análisis de coestimulación en modelos animales

Células HC11 transfectadas con el gen de 5T4-antigen humano (Ejemplo 4) se desarrollan como tumores en ratones Balc/c. Los genes de SCM B7-1.5T4.1 o B7-2.5T4.1 o una combinación de ambos genes se introducen en las células tumorales antes de la implantación y se controla el crecimiento de los tumores y el crecimiento de los tumores de referencia que no expresan los genes SCM in vivo.

Se cree que la expresión de los genes de SCM conduce a una reducción significativa en el crecimiento del tumor.

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Ejemplo 10 Construcción de un B7-1/ScFv, específico para la proteína de fusión 5T4 humana

Se utilizan técnicas de biología molecular convencionales para construir una proteína de fusión constituida por la secuencia principal y el dominio extracelular de B7-1, fusionada mediante un enlazador flexible a las V_{H} y V_{L} del Mab 5T4 murino específico para 5T4 humano.

El enlazador flexible, utilizado para unir el dominio extracelular de B7.1 y el ScFv, se construyó hibridando dos oligonucleótidos homólogos con las secuencias transgénicas 5' Sma I y 3' Spe I, utilizando los oligonucleótidos

2

El enlazador se clona en pBluescript (Stratagene) mediante Sma I y Spe I para producir el pLINK. El péptido señal (ps) y el dominio extracelular de B7.1 murino se ampliaron por PCR en el pLK444-mB7.1 (suministrado por R. Germain NIH, EE.UU.) mediante cebadores que introducen las secuencias 5' EcoRI y 3' Sma I, cebadores transcritos

3

Se clonó el producto B7.1 de PCR en el pLINK mediante EcoRI y Sma I para formar el PBS/B7Link.

El V_{H} y el V_{L} del scFv específico para 5T4 se amplió mediante cebadores -

4

5

que introducen las secuencias 5' Spe I y 3' Not I en el pHEN1-5T4 ScFv. El PBS/B7Link se digirió con Spe I y Not I y se ligó con el ScFv para formar OBM 233 constituido por la secuencia mostrada como SEC. ID. nº 5: secuencia scFv de enlace a B7.

Esta fusión puede utilizarse para construir un vector recombinante p. ej. retrovirus, lentivirus, adenovirus, poxvirus, virus de vacuna o baculovirus. Dichos vectores pueden utilizarse para inyectar tumores al paciente directamente. Para suministrar la proteína de fusión a las células tumorales se utiliza el vector recombinante para transducir macrófagos/monocitos/células CD34+ ex vivo antes de volver a inyectar en los pacientes. Estas células circularán a los tumores. El ScFv se unirá a un antígeno del tumor específico expresado en la superficie de las células tumorales, es decir 5T4 (Myers et al. 1994 JBC). B7 se encuentra en la superficie del antígeno profesional que presenta células p. ej. macrófagos, dendrocitos y linfocitos B. Éste interactúa con los ligandos CD28 y CTL-A4 situados en las células CD4 y CD8. La interacción simultánea de B7-CD28/CTL-A4 y MHC-péptido/receptor de linfocitos T conduce a un aumento pronunciado en IL-2 que activa la expansión de CD8 (linfocito T citotóxico) (Linsley PS., Brady W. Grosmaire L., Aruffo A., Damie NK., Ledbetter JA. J. Exp. Med. 1 de marzo 1991; 173(3):721-730 Binding of the B cell activation antigen B7 to CD28 costimulates T cell proliferation and II-2 mRNA accumulation). Las células tumorales que han sido transfectadas por B7 con B7 han presentado retardo en modelos animales (Townsend SE., Allison JP. Science 1993 15; 259(5093):368-370).

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Ejemplo 11 Expresión temporal y purificación de B7-1/ScFv y LScFv

Para la expresión temporal del B7-1/ScFv se utilizó el plásmido pCIneo (Promega) de expresión en VMC humano. El B7/ScFv se escindió del OBM 233 por digestión con EcoRI/Not I y se clonó en el pCIneo que se digirió previamente con EcoRI/Not I. La expresión temporal de la proteína recombinante se efectúa por transfección de las células 293T con el plásmido apropiado utilizando fosfato cálcico (Profectin, Promega). Las condiciones utilizadas eran similares a las recomendadas por el fabricante. Para reducir la contaminación por suero bovino se añadió suero exento de medio óptimo (Gipco BRL). Tras 36 a 48 horas de transfección se recogieron los sobrenadantes y se centrifugaron con una Centripet (Amicon, Glos. UK) 10 filtros (todas las proteínas mayores de 10 kDa se purifican/concentran) y una Centricon (Amicon) 10 filtros. Se concentran los sobrenadantes aproximadamente 30 veces.

Para que B7-1 sea biológicamente funcional debe ser capaz de demostrar la unión con uno de sus ligandos naturales ya sea CTLA-4 o CD28 hallados en la superficie de poblaciones específicas de linfocitos T (p. ej. CD4+). Se analizó la interacción simultánea de la proteína de fusión B7-1/ScFv con actividad biológica con su ligando natural CTLA-4 (en forma de CTLA4-Ig suministrado por Ancell, Mn, EE.UU.) y células A9 que expresan 5T4 humano. En resumen, se incubaron aproximadamente 5x10^{5} A9-h5T4 con 100 \mul de B7.1/ScFv o LScFv sobrenadante en una placa de 96 pocillos con fondo en U a 4ºC durante 1 hora. Después del lavado se incubaron las células con CTLA4-Ig (Ancell) durante 1 hora. Después del lavado, se detectó la unión CTLA4-Ig utilizando una Ig anti-ratón conjugada con FITC (Dako).

Los resultados presentan la unión obvia de CTLA-Ig con el dominio extracelular B7-1, unido por el ScFv, a la superficie de células A9 positivas a 5T4. La falta de actividad de unión con las células A9 negativas a 5T4 ilustra con más detalle que las interacciones de B7 con CTLA4-Ig y ScFv con 5T4 son específicas.

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Ejemplo 12 Ejemplo de la fusión ScFv-IgG Construcción de ScFv-IgG

La secuencia que codifica una secuencia de iniciación de la traducción y el péptido señal de cadena ligera de la inmunoglobulina kappa humana se sintetiza en forma de dos oligonucleótidos monocatenarios complementarios que cuando se hibridan contienen también una secuencia interna Xho I en el extremo 5' y además dejan una prolongación en 5' compatible con Xba I y una prolongación en 3' compatible con Pst I.

6

\newpage

Esto se clona a continuación en el pBluescript II (Stratagene) restringido con Xba I y Pst I para crear pBSII/Leader.

El ScFv de 5T4 se amplía por PCR a partir del pHEN 1 utilizando oligonucleótidos que incorporan una secuencia Pst I en el terminal 5' del producto y una Hind III en el terminal 3'.

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Ésta se restringe a continuación con las enzimas y se inserta en el pBSII/Leader restringido con las mismas enzimas, creando el pBSII/Leader/ScFv.

La zona constante HIgG 1 se amplía por PCR a partir del gen clonado utilizando oligonucleótidos que incorporan una secuencia Hind III en el terminal 5' y una secuencia Xho I en el terminal 3'.

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Ésta se restringe a continuación con las enzimas y se inserta en el pBSII/Leader/scFv restringido con las mismas enzimas creando el pBSII/Leader/scFv/HG1. La secuencia para este montaje se presenta en las Figuras.

Esta fusión puede utilizarse para construir un vector recombinante p. ej. retrovirus, lentivirus, adenovirus, poxvirus, virus de vacuna o vaculovirus. Dichos vectores pueden utilizarse para inyectar los tumores del paciente directamente. Para suministrar la proteína de fusión a las células tumorales se utiliza vector recombinante para transducir macrófagos/monocitos/células CD34+ ex vivo antes de volver a inyectar a los pacientes. Estas células circularán a los tumores. El ScFv se unirá a un antígeno tumoral específico expresado en la superficie de las células tumorales, es decir, 5T4 (Myers et al. 1994 JBC). La IgG unida activará la destrucción del tumor específico mediante una serie de mecanismos conocidos en conjunto como citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (Munn et al. Cancer Res. 1991 ibid, Primus et al. 1993 Cancer Res ibid).

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Ejemplo 13 Construcción de ScFv-IgE1 (zona constante de la cadena pesada de IgE1 humana)

Se efectúa un montaje para la fusión similar de 5T4 scFv-cadena pesada constante de IgE humana constituido por la secuencia mostrada como SEC. ID. nº 6.

Este montaje para la fusión se realiza ampliando la zona pesada constante de IgE1 humana por ADNc de PCR procedente de ARN de linfocitos B por RT y posteriormente utilizando oligonucleótidos que incorporan una secuencia Hind III en el extremo 5' y una secuencia Xho I en el terminal 3'.

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Ésta se restringe a continuación con las enzimas y se inserta en el pBSII/Leader/scFv restringida con las mismas enzimas, creando el pBSII/Leader/scFv/HE1.

Tal como se describió anteriormente el montaje ScFv-IgE puede incorporarse en un vector vírico recombinante para su utilización en terapia génica del cáncer, p. ej. inyectar tejido del paciente directamente o transducir macrófagos/monocitos/células CD34+ procedentes del paciente ex vivo. La proteína de fusión se segregará y se unirá a las células tumorales que llevan el antígeno que es específico para ScFv. La unión de IgE a las células tumorales activaría una respuesta potente de histamina por activación de mastocitos. Esto conducirá a una respuesta inflamatoria potente y a la destrucción de las células tumorales como se informa para la destrucción citotóxica por IgE de parásitos, p. ej. larvas de helmintos (Capron M. 1988 Eosinophils in diseases: receptors and mediators. In progress in allergy and clinical immunology (Proc. 13^{th} Int. Congress of Allergy and Clinical Immunology) Hogrefe & Huber Toronto p6). Dicha inflamación y destrucción tumoral iniciaría la regeneración de otras células efectoras inmunitarias. Los informes anteriores indican que el tratamiento con un Mab de IgE específico para el antígeno VTMM conduce a la protección de un antígeno de VTMM que expresa el tumor (Nagy E. Istanvan B., Sehon AH. 1991 Cancer Immunol. Immunotherapy vol. 34:63-69).

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Ejemplo 14 de referencia

Construcción de B7/EGF Gen de síntesis B7-EGF

Se prepara un montaje de fusión de B7-EGF insertando un producto de PCR ampliado desde la zona del gen que codifica el péptido EGF maduro (véase el número de registro X04571) en la conexión pBS/B7. Este montaje presenta la secuencia mostrada en la SEC. ID. nº 7.

Utilizando el ADNc derivado por RT de ARN aislado de una estirpe celular tal como la estirpe de riñón humano 293 (ATCC: CRL 1573), se amplía el ADN por PCR utilizando oligonucleótidos que contienen una secuencia de la enzima de restricción Spe I en el terminal N y un codón de terminación y una secuencia Not I en el terminal C.

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El producto resultante se digiere con esas enzimas y se liga a la conexión de pBS/B7 que ha sido restringida con las mismas enzimas que crean el EGF con conexión a pBS/B7. El casete EGF con conexión a B7 se escinde a continuación con Eco RI y Not I y se inserta en un derivado del pHIT111 (Soneoka et al. 1995 Nucl. Acid Res. 23; 628) que ya no lleva el gen LacZ.

Una alternativa para utilizar el ScfV consiste en utilizar factores de crecimiento que tienen una gran afinidad con su receptor correspondiente (p. ej. el factor de crecimiento epidérmico que se une a varios receptores incluyendo erbB-2 que está muy asociado a la génesis tumoral.

Tal como se describió anteriormente el montaje de fusión puede incorporarse a un vector vírico recombinante para su utilización en terapia génica p. ej. inyectar tejido del paciente directamente o para transducir macrófagos/monocitos/células CD34+ ex vivo procedentes del paciente. La proteína de fusión se segregará y se unirá a las células tumorales que llevan el antígeno erbB-2.

El factor de crecimiento epidérmico (EGF) se unirá a su ligando erbB-2 (receptor EGF) obviando de este modo el requisito de un ScFv. ErbB-2 está muy asociado a las células tumorales (Hynes NE. Semin. Cancer Biol. Feb. 1993; 4(1):19-26, Amplification and over expression of the erbB-2 gene in human tumors: its involvement in tumor development, significance as a prognostic factor, and potential as a target for cancer therapy). B7 se encuentra en la superficie de células profesionales presentadoras del antígeno p. ej., macrófagos, dendrocitos y linfocitos B. Éste interactúa con los ligandos CD28 y CTL-A4 situados en las células CD4 y CD8. La interacción simultánea de B7-CD28/CTL-A4 y MHC-péptido/receptor de linfocitos T conduce al aumento masivo en IL-2 que activa la expansión de CD8 (linfocito T citotóxico) (Linsley PS., Brady W, Grosmaire L., Aruffo A., Damle NK., Ledbetter JA. J. Exp. Med. 1 de marzo 1991;173(3):721-730 Binding of the B cell activation antigen B7 to CD28 costimulates T cell proliferation and interleukin 2 mRNA accumulation). Las células tumorales que han sido transfectadas con B7 han presentado retardo en los modelos animales (Townsend SE., Allison JP. Science 1993 15; 259(5093):368-370 Tumor rejection after direct costimulation of CD28+ T cells by B7-transfected melanoma cells). Se ha publicado que B7 mejorará la respuesta de CTL a los antígenos tumorales específicos para células tumorales conduciendo de este modo a la destrucción de dichas células.

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Ejemplo 15 Producción de estirpes celulares que expresan montajes de fusión

Se escindió el gen ScFv-IgG del pBSII/L/ScFv/hIgG1 por digestión con Xho I y se clonó en el pLXSN por la secuencia Xho I, para preparar el pLXSN/ScFv-IgG, de modo que después de la integración cromosómica éste está bajo control de la transcripción de la LTR. El virus se preparó en la estirpe de células de riñón humano 293T cotransfectando plásmidos que contienen los genes gap-pol de VLM (pCIEGPPD) y la envoltura G de VSV (pRV67) utilizando el sistema triple del plásmido HIT (Landau & Littman 1992 J. Virol. 66 5510, Soneoka Y. et al. 1995 NAR 23:628-633). Se recoge el virus después de 48 horas y se utiliza para transducir BHK-21 (ATCC nº CCL-10). Aproximadamente 24 horas después de la transducción se seleccionan células transducidas mediante la adición de 1 mg/ml de G418 (Gipco BRL) al medio de cultivo. Se recogió el sobrenadante de las colonias positivas y se concentró por centrifugación en una Centriprep (Amicon, Glos. UK) 10 filtros (todas las proteínas mayores de 10 kDa se purifican y se concentran) y una Centricon (Amicon) 10 filtros. Se concentraron los sobrenadantes aproximadamente 30 veces.

Otras proteínas de fusión se clonan en el pLXSN por la secuencia Xho I y se expresan y se concentran utilizando un protocolo similar.

Análisis por FACS de la unión de la proteína de fusión con células que expresan el ligando específico.

Para determinar si la proteína de fusión ScFv-IgG es específica para su antígeno, 5T4 humano, se realizó el análisis por FACS de una línea tumoral de carcinoma de vejiga humana (EJ) o de una esirpe de células murinas estables que expresan a h5T4, A9-h5T4 (Myers et al. 1994 JBC) y una estirpe A9-neo negativa a 5T4. Aproximadamente 5x10^{5} células A9 o EJ, en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (Falcon) se incubaron con 100 \mul de una dilución 1:5 de sobrenadante concentrado (como se describió anteriormente) durante 1 hora a 4ºC. Después del lavado, se detecta la proteína unida utilizando un anticuerpo conjugado IgG/FITC humano (Dako). Se analizaron las células en una máquina por FACS de Becton Dickinson. Los resultados por FACS demuestran que existe por lo menos un desplazamiento 1 log de la actividad de fluorescencia en las células positivas a 5T4 tratadas con el montaje ScFv-IgG en comparación con el montaje de referencia negativa constituido por la proteína ScFv sola. La FACS de A9 neo demuestra que no existe unión inespecífica del componente ScFv de la proteína de fusión.

El análisis por FACS de ScFv-IgE se realiza de manera similar al anterior excepto que se utiliza IgG-FITC (Dako) para detectar la unión de la proteína de fusión.

En la proteína de fusión B7/EGF se analiza la unión utilizando FACS y células positivas a HCI1-erbB-2 (Hynes et al. 1990). Se utiliza CTLA4-Ig (Ancell, EE UU) para analizar la bioactividad del componente B7 de la proteína de fusión unida. Se utiliza IgG-FITC anti-ratón para mostrar la unión a CTLA-4.

Sumario

Por lo tanto, la presente invención proporciona un medio para suministrar, por ejemplo, compuestos terapéuticos a una zona tumoral.

Si bien la invención se ha descrito en relación con las formas de realización específicas preferidas, debe entenderse que la invención tal como se reivindica no debería limitarse de forma indebida a dichas formas de realización específicas. De hecho, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que resultan evidentes para los expertos en biología molecular o en campos relacionados se pretende que estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

SEC ID nº 1

Ver Figura 1a.

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SEC ID nº 2

Ver Figura 1b.

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SEC ID nº 3

Ver Figura 2

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SEC ID nº 4

Ver Figura 4

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SEC ID nº 5

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SEC ID nº 6

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SEC ID nº 7

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Claims (60)

1. Vector que comprende por lo menos una secuencia nucleotídica ("NS") que codifica una proteína que se une al tumor que reconoce un antígeno 5T4 y opcionalmente que comprende una secuencia nucleotídica de interés ("NOI") que codifica un producto de interés ("POI"), siendo capaz el vector de expresar la proteína que se une al tumor en una célula de mamífero y es capaz de administrar una secuencia nucleotídica de interés ("NOI") que codifica un producto de interés ("POI") y/o un POI a un tumor.

2. Vector según la reivindicación 1, en el que la proteína que se une al tumor es o comprende por lo menos parte de un anticuerpo.

3. Vector según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo presenta la secuencia de aminoácidos del anticuerpo 5T4 ScFv que comprende la SEC. ID. nº: 1 o presenta la secuencia de aminoácidos del anticuerpo 5T4 Sab que comprende la SEC. ID. nº: 2.

4. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en el que el anticuerpo es un fragmento 5T4 Fab, 5T4 Fv ó 5T4 ScFv.

5. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el anticuerpo es el fragmento 5T4 ScFv con la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. nº: 1.

6. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que el anticuerpo comprende un fragmento ScFv acoplado a una zona Fc.

7. Vector según la reivindicación 6, en el que el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del anticuerpo 5T4 Sab de la SEC ID nº: 2.

8. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

9. Vector según la reivindicación 8, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado intacto.

10. Vector según la reivindicación 6 ó 7, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado monocatenario.

11. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en el que el anticuerpo es un anticuerpo injertado en la CDR.

12. Vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el vector comprende el NOI.

13. Vector según la reivindicación 12, en el que el NOI es un NOI terapéutico y/o el POI es un POI terapéutico.

14. Vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, en la utilización, el vector es capaz de suministrar el NOI y/o el POI al interior de una masa tumoral.

15. Vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que están unidos a la NS que codifica la proteína que se une al tumor y el NOI y/o la proteína que se une al tumor y el POI.

16. Vector según la reivindicación 15, en el que la proteína que se une al tumor y el POI están unidos directamente.

17. Vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se fusionan la NS que codifica la proteína que se une al tumor y el NOI y/o la proteína que se une al tumor y el POI.

18. Vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteína que se une al tumor y/o el POI es capaz de segregarse.

19. Vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cualquiera o más de la NS que codifica la proteína que se une al tumor, NOI, la proteína que se une al tumor y el POI comprenden además por lo menos un componente funcional adicional, en el que el componente funcional adicional se selecciona de entre el grupo constituido por cualquiera o más de entre una entidad de señalización, un potenciador inmunitario, una toxina, y una enzima biológicamente activa o una secuencia que codifica cualquiera de los mismos.

20. Vector según la reivindicación 19, en el que la entidad de señalización es un péptido señal.

21. Vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el vector es un vector vírico.

22. Vector según la reivindicación 21, en el que el vector es un vector retrovírico.

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23. Vector según la reivindicación 22, en el que el vector retrovírico comprende un potenciador activador específico del tumor.

24. Vector según la reivindicación 21, en el que el vector es un vector lentivírico.

25. Vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la NS que codifica la proteína que se une al tumor y/o el NOI que codifica el POI está unido funcionalmente a un elemento regulador de la expresión selectivamente operativo en una célula de mamífero.

26. Vector según la reivindicación 25, en el que la célula de mamífero es una célula tumoral.

27. Vector según la reivindicación 26, en el que dicho elemento regulador de la expresión es un potenciador activador específico del tumor.

28. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en el que dicha NS que codifica la proteína que se une al tumor comprende además uno o más dominios efectores seleccionado(s) de entre el grupo constituido por una enzima, una enzima que activa un profármaco, una toxina, toda o parte de una citocina, un dominio efector de una cadena pesada de inmunoglobulina, un dominio que activa el macrófago FcgR I, II o a receptores de II y un dominio que proporciona estabilidad a la proteína.

29. Vector según la reivindicación 28, en el que dicho polinucleótido codifica una proteína de fusión.

30. Vector según la reivindicación 29, en el que se segrega dicha proteína de fusión.

31. Vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su utilización en medicina.

32. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 para su utilización en el tratamiento del cáncer.

33. Composición que comprende un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 opcionalmente mezclado con un diluyente, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

34. Utilización de un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer.

35. Utilización de un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 en la preparación de un medicamento para suministrar la NS que codifica la proteína que se une al tumor y/o la proteína que se une al tumor y opcionalmente el NOI y/o el POI a una célula de mamífero.

36. Utilización según la reivindicación 35 en la que la célula de mamífero es una célula tumoral.

37. Utilización según una de las reivindicaciones 35 ó 36, en la que el vector comprende por lo menos una secuencia nucleotídica de interés ("NOI") que codifica un producto de interés ("POI").

38. Utilización de un vector según cualquiera de las reivindicaciones 34 a 37 para suministrar cualquiera o más de una NS que codifica la proteína que se une al tumor, la proteína que se une al tumor, el NOI y/o el POI ex vivo y/o in vivo al tumor.

39. Utilización de un vector según cualquiera de las reivindicaciones 34 a 37 para suministrar un NOI que codifica una proteína segregable que se une al tumor al interior de una masa tumoral.

40. Utilización de un vector según cualquiera de las reivindicaciones 34 a 37 como una fábrica de producción in situ de cualquiera o más de la NS que codifica la proteína que se une al tumor, NOI, POI y la proteína que se une al tumor.

41. Utilización de un vector según cualquiera de las reivindicaciones 34 a 38 cuando está presente en una célula para suministrar cualquiera o más de la NS que codifica la proteína que se une al tumor, NOI, POI y la proteína que se une al tumor a una célula adyacente.

42. Sistema de suministro para dirigir por lo menos una NS que codifica una proteína que se une al tumor y opcionalmente un NOI que codifica un POI a una célula tumoral; en el que el sistema de suministro comprende un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30.

43. Sistema de suministro para introducir por lo menos una NS que codifica una proteína que se une al tumor en una célula hematopoyética; en el que el sistema de suministro comprende por lo menos una NS que codifica una proteína que se une al tumor capaz de reconocer una célula tumoral; y opcionalmente comprende por lo menos una secuencia nucleotídica de interés ("NOI") que codifica un producto de interés ("POI"), y en el que la proteína que se une al tumor reconoce un antígeno 5T4.

44. Sistema de suministro según la reivindicación 43, en el que la célula hematopoyética es una célula hematopoyética mieloide.

45. Sistema de suministro según cualquiera de las reivindicaciones 42 a 44, en el que el NOI codifica una citocina.

46. Sistema de suministro según cualquiera de las reivindicaciones 42 a 45 para su utilización en medicina.

47. Sistema de suministro según cualquiera de las reivindicaciones 42 a 45 para su utilización en el tratamiento del cáncer.

48. Utilización de un sistema de suministro según cualquiera de las reivindicaciones 42 a 45 en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una célula tumoral en la que el sistema de suministro se puede administrar in vivo o ex vivo.

49. Utilización según la reivindicación 48, en la que el sistema de suministro se puede administrar de forma generalizada o directamente a la célula tumoral.

50. Utilización según la reivindicación 48 ó 49, en la que el medicamento comprende además una o más citocinas.

51. Utilización de un vector según las reivindicaciones 1 a 30, en un procedimiento para preparar una proteína que se une a un tumor que comprende expresar una NS que codifica a una proteína que se une a un tumor en dicho
vector.

52. Utilización de un vector en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer, en la que el vector comprende por lo menos una secuencia nucleotídica ("NS") que codifica una proteína que se une al tumor capaz de reconocer una célula tumoral; en la que el vector es capaz de expresar una proteína que se une al tumor en una célula de mamífero y es capaz de suministrar una secuencia nucleotídica de interés ("NOI") que codifica un producto de interés ("POI") a una célula de mamífero, preferentemente a una célula tumoral, en la que el vector suministra el polinucleótido de interés ex vivo al tumor y en la que la proteína que se une al tumor reconoce un antígeno
5T4.

53. Utilización de un sistema de suministro de genes que comprende un vector en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de células cancerosas de la estirpe celular hematopoyética en la que el vector comprende por lo menos una secuencia nucleotídica ("NS") que codifica una proteína que se une al tumor capaz de reconocer una célula tumoral; en la que el vector es capaz de expresar la proteína que se une al tumor en una célula de mamífero y es capaz de suministrar un secuencia nucleotídica de interés ("NOI") a un tumor, en la que el vector suministra el NOI a las células cancerosas, y en la que la proteína que se une al tumor reconoce un antígeno 5T4.

54. Procedimiento de suministro de un nucleótido de interés (NOI) o de un producto de interés (POI) codificado por dicho nucleótido de interés a un tumor, que comprende suministrar el NOI o el POI a dicho tumor mediante la utilización de un vector en el que dicho vector comprende por lo menos una secuencia nucleotídica ("NS") que codifica una proteína que se une al tumor capaz de reconocer una célula tumoral; en el que el vector es capaz de expresar la proteína que se une al tumor en una célula de mamífero y es capaz de suministrar una secuencia nucleotídica de interés ("NOI") que codifica el producto de interés ("POI") a un tumor en el que el vector suministra el polinucleótido de interés ex vivo al tumor, y en el que la proteína que se une al tumor reconoce un antígeno 5T4.

55. Procedimiento ex vivo para suministrar un NOI a una segunda célula adyacente a una primera célula que comprende la utilización de un vector para suministrar el polinucleótido a dicha primera célula, en el que dicho vector comprende por lo menos una secuencia nucleotídica ("NS") que codifica una proteína que se une al tumor capaz de reconocer una célula tumoral; en el que el vector es capaz de expresar la proteína que se une al tumor en una célula de mamífero y es capaz de suministrar la secuencia nucleotídica de interés ("NOI") a un tumor, y en el que el tumor que se une a la proteína reconoce un antígeno 5T4.

56. Procedimiento ex vivo para expresar una NS que codifica una proteína que se une al tumor en una célula de mamífero en el cultivo, que comprende suministrar a dicha célula de mamífero un vector que comprende la NS que codifica la proteína que se une al tumor en la unión operable con un elemento funcional regulador de la expresión en una célula de mamífero, expresándose dicha NS en dicha célula de mamífero, y reconociendo la proteína que se une al tumor un antígeno 5T4.

57. Procedimiento según la reivindicación 56, en el que dicha NS que codifica una proteína que se une al tumor se expresa en dicha célula de mamífero y se recupera a partir de la misma.

58. Procedimiento según la reivindicación 56, en el que dicha NS que codifica una proteína que se une al tumor además comprende uno o más dominios efectores seleccionado(s) de entre el grupo constituido por una enzima, una enzima que activa un profármaco, una toxina, toda o parte de una citocina, un dominio efector de una cadena pesada de inmunoglobulina, un dominio que activa al macrófago FcgR I, II o a receptores de II y un dominio que proporciona estabilidad a la proteína.

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59. Procedimiento según la reivindicación 56, en el que dicha NS que codifica una proteína que se une al tumor codifica una proteína de fusión.

60. Procedimiento según la reivindicación 56, en el que se segrega dicha proteína de fusión.