KR20020049054A

KR20020049054A - 항체

Info

Publication number: KR20020049054A
Application number: KR1020027006362A
Authority: KR
Inventors: 킹스맨알란; 킹스맨수잔메리; 베빙턴크리스토퍼로버트; 캐롤마일스윌리엄; 엘라드피오나마가렛; 마이어스케빈알란
Original assignee: 찰스 굿맨; 옥스포드 바이오메디카(유케이) 리미티드
Priority date: 1999-11-18
Filing date: 2000-11-13
Publication date: 2002-06-24
Also published as: ATE411342T1; DE60040555D1; US20070161080A1; EP2161286A1

Abstract

DAM과 관련된 질병 컨디션의 예방 및/또는 치료를 위한 약의 제조에 있어서 질병 결합 분자(DMA)를 인식하는 것이 가능한 ScFv 항체(ScFv Ab)의 이용이 기술된다. ScFv Ab는 치료적, 진단적, 예방적 적용을 지닌다.

Description

항체{Antibodies}

특정한 질병 상태에서 세포 대사의 교란은 하나 또는 그 이상의 DAMs의 발현 수준에 영향을 미칠 수 있다. 일부 상황에서 이러한 세포 교란은 DAM의 발현 수준에서의 변화를 야기한다. 따라서 이러한 질병 유발제 또는 질병 상태는 이를 숙주 생물체 내에서 면역 인식 및/또는 질병 유발제 또는 질병 상태의 제거 및/또는 제어에 중요한 DAM에 결합시킨다. 이러한 방법으로 DAM은 질병 상태의 진단 뿐만 아니라 질병 프로파일(profile)의 정확한 스테이징(staging)을 위한 마커로서 활동하는 것이 가능하여 적당한 치료가 고안된다.

잘 특성화된 DAMs의 특별한 예는 종양-결합 항원(TAAs)을 포함한다. 많은 옹코페탈(oncofoetal) 또는 종양-결합 항원(TAAs)은 인간 및 동물 종양 내에서 확인되고 특성화되었다.

이러한 TAAs는 카시노엠브리오(carcinoembryonic) 항원(CEA), TAG72, c-erB2, (언더글리코실레이트된(undergylcosylated))MUC-1 및 p53, 상피 글리코프로틴(glycoprotein)-2 항원(EPG-2; 또한 EGP40, Ep-CAM, KSA, CO17-1A 또는 GA733-2로 알려짐) 및 5T 항원을 포함한다. 일반적으로 TAAs는 태아 발달 동안 발현되나, 성인 세포 내에서는 하향조절되는 항원이고, 따라서 일반적으로 성인에서는 부재하거나 또는 매우 적은 수준으로 존재한다. 그러나 종양발생 동안 종양 세포는 TAAs의 발현을 다시 시작하는 것으로 관찰되었다. 따라서 악성 세포가 TAAs의 발현 재시작에 의해 비-악성 대조물과 구별된다. 따라서 ⅰ) 실험실 내 및/또는 생체 냉/생체 외의 종양 장애 진단; ⅱ) 암의 이미지화 및/또는 면역치료ⅲ) 종양 관련 질병의 진행 지표로의 TAA의 적용이 제안되었다.

특정한 질병에 대한 체액적 및/또는 세포적 면역 반응에 착수하기 위해 숙주면역 시스템은 DAM과 접촉해야 한다. 외부 항원의 인식에 부가하여 T 세포는 종종 충분히 활성화되기 위해 부가적인 자극을 필요로 한다. 2개의 시그날이 항원 포함 타겟 세포에 의한 원시 T-세포의 활성화에 요구된다는 것은 분명해 졌다. 하나의 그날은 T-세포 수용체를 통해 전달된 항원 특이적 시그날이고, 두 번째 시그날은 림포킨(lymphokine) 생성을 야기시키는 독립적 또는 동시-자극성 시그날이다. 이러한 부가적인 시그날은 수상돌기 세포 및 대식세포와 같은 전문적인 항원 표시 세포(APCs) 상에 존재하나 다른 세포에는 존재하지 않는 리간드(B7 및 CD40과 같은)와 상호작용하는 T 세포 상의 다른 수용체(CD28 및 CD40L과 같은)를 통해 전달된다. 이러한 동시-자극성 리간드는 종종 동시-자극성 분자라고도 표현된다.

예로서 B7계(즉, B7.1, B7.2 및 아마도 B7.3)는 최근에 발견되었으나 동시-자극성 분자에 중요한 그룹임을 나타낸다. B7.1 및 B7.2는 모두 Ig 유전자 상과(superfamily)의 멤버이다. T 림파구가 B7에 의한 동시-자극없이 항원과 단독으로 만날 경우 아네르기(anergy) 또는 세포사멸(apoptosis)(프로그램된 세포 사멸)로 반응할 것이다. 동시-자극성 시그날이 제공될 경우 타겟 항원에 대한 클론 확장으로 반응할 것이다. 주어진 항원에 대한 면역 반응의 유의적인 증폭이 없는 것은 동시-자극없이 발생하는 것으로 여겨진다(June et al(Immunology Today 15:321-331, 1994); Chen et al(Immunology Today 14:483-486); Townsend et al(Science 259:368-370), Freeman et al(J. Immonol. 143:2714-2722, 1989), Asuma et al(Nature 366:76-79). 따라서 충분히 면역원적이지 않은 질병 세포의면역 인식을 자극시키기 위한 하나의 방법은 DAM의 존재시 림파구의 항원 표시 및 동시-자극을 강화하는 것으로 가정된다.

예로서 암, 확증된 종양과 같은 질병 상태는 그들이 통상 DAM를 발현한다는 사실에도 불구하고 충분히 면역원적이지 않다는 것으로 나타났다. 단독으로 또는 사이토킨(cytokine)과 조합된 B7-1 및 B7-2을 인코딩하는 유전자의 세포감염은 동물 모델에서의 실험 종양의 면역성 발달을 강화하는 것으로 나타났다(즉, Leong et al. 1997 Int. J. Cancer 71:476-482; Zitvogel et al. 1996 Eur. J. Immunol. 26:1335-1341; Cayeux et al. 1997 J. Immunol. 158:2834-2841). 그러나 이러한 결과를 인간 종양에 대한 특정한 치료로 해석함에 있어서 극복해야 하는 많은 중요한 문제점이 있다. 이러한 연구에서의 주요한 문제점은 효율성을 달성시키기 위해 많은 종양 세포로 생체 내에서의 B7 유전자를 전달시킬 필요성이 있다는 것이다. 두 번째 문제점은 다른 세포 타입에 대해 지시된 부적당한 면역 세포 활성화를 방지하기 위해 종양 세포에 대한 B7의 선택적인 타겟 발현이다. 이러한 문제점의 해결은 종양 결합 단백질(TBP)과 같은 종양 상호작용 단백질(TIP)이 종양 세포에 대해 동시-자극성 분자를 선택적으로 타겟하는데 이용되는 WO 98/55607에 기술되어 있다.

재조합 DNA 기술이 DAMs를 인식하는 항체를 발달시키기 위해 적용되었다(Hoogenboom et al 1998 Immunotechnology 4:1-20; 및 Winter 1998 FRBSLett 458:92-94). 최근에는 단일 체인 항체(ScFv Abs)와 같이 항체를 생성하는 항체 유전자 라이브러리를 이용하는 상당한 관심이 있다. 특정한 상황에서는 전체 항체 보다 ScFv Abs를 이용하는 하는 것이 장점이라고 알려져 있다. 단편의 더 작은 크기는 빠른 정리를 가능하게 하고, 비-종양에 대한 종양 비율을 증가시킨다. 그러나 많은 노력은 높은 특이성을 지닌 ScFv Abs를 생산하는데 실패하였다. 더욱이 전체 IgG는 확정된 혈청 반감기를 지닌 것으로 간주되는 ScFv Abs 보다 치료적 Mabs에 대해 더 좋은 포맷(format)으로 간주된다(Vanghan et al 1998, Nature Biotech 16:535-539).

본 발명은 DAM과 관련된 질병 조건의 치료에 유용한 DAM에 대해 증가된 ScFv Ab를 제공하는데 목적이 있다.

발명의 요약

본 발명은 DAM을 인식하고 DAM과 관련된 질병에 치료적 효과를 지니는 것이 가능한 ScFv Ab(ScFv Ab)를 제공한다. 이러한 ScFv Ab는 펩티드(합성적으로 또는 유전적으로 발현된) 또는 "네이키드(naked) DNA"(예를 들어 플라스미드) 또는 ScFv Ab를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 바이러스성 벡터와 같은 전달 비히클(vehicle)을 통해 직접적으로 투여될 수 있다. 어떤 경우에는 이러한 ScFv Ab가 B7 또는 IgG와 같은 분비된 동시-자극성 분자(SCM)에 융합된 ScFv Ab 보다 더욱효과적이다. 암과 같은 질병의 치료시, 특히 ScFv에 융합된 SCM으로 구성된 융합 단백질이 ScFv 단독 보다 더 잘 수행되기를 바라는 경우 ScFv Ab의 사용이 치료제로서 분명한 선택은 아니다.

본 발명은 하기의 이유에 있어서 유리하다 :

(ⅰ) DAM을 인식하는 것이 가능한 ScFv Ab를 제공한다. 어떤 경우 B7과 같은 SCM 또는 IgG와 같은 면역글로블린에 융합되는 ScFv Ab 보다 더 큰 치료 효과를 지닌다;

(ⅱ) (a) 실험실 내에서 및 생체 내에서/생체 외에서의 진단 및 치료;

(b) DAM을 발현하는 세포의 이미지와 및 치료

(c) ScFv Ab가 단독으로 또는 적당한 진단용 및/또는 치료적으로 유용한 약제와 조합하여 사용될 때 암종과 같은 다른 인간 질병의 방지 및/또는 치료;

(d) ScFv Ab 특이적으로 결합하는 DAM의 분리 및/또는 정제에 관한 연구; 및

(e) 더한 합리적 치료 ScFv Ab 고안 및 타겟 DAMs에 결합가능한 ScFv Ab을 위한 스크린 및/또는 타겟 ScFv Ab에 결합가능한 DAMs에 대한 스크린을 위한 빌딩 블록(building block)의 제공 :

내에 적용되는 높은 친화력 ScFv Ab를 제공한다.

본 발명은 항체에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 질병 결합 분자(disease associated molecule(DAM)를 인식하는 항체에 관한 것이다.

더욱 특별하게는 본 발명은 DAM과 관련된 질병의 진단 및 치료에 이러한 항체를 실험실 내 및 생체 내/생체 외로 적용하는 것에 관한 것이다.

본 발명은 하기의 도면을 참조하여 더욱 기술될 것이다.

도 1은 5T4ScFv.1.으로 지명된 5T4 ScFv를 인코딩하는 DNA 서열(서열번호: 5)을 나타낸 것이다. 성숙 분비된 단백질의 서열(서열번호: 1)이 제공된다.

도 2는 B7-1.5T4.1 융합 단백질을 인코딩하는 DNA 서열(서열번호: 7)을 나타낸 것이다. B7-1.5T4.1 융합 단백질에 대해 추론된 아미노산 서열(서열번호: 3)도 제공된다.

도 3a는 B7-1.5T4.1 구조물의 도표를 나타낸 것이다.

도 3b는 B7-1.5T4.2 구조물의 도표를 나타낸 것이다.

도 4는 B7-2.5T4.1 융합 단백질을 인코딩하는 DNA 서열(서열번호: 9)를 나타낸 것이다. B7-2.5T4.1 융합 단백질에 대해 추론된 아미노산 서열(서열번호: 3)도 제공된다.

도 5는 B7 링크 ScFv 서열(서열번호: 11)을 나타낸 것이다.

도 6은 Ig-5T4 융합 단백질을 인코딩하는 DNA 서열(서열번호: 8)을 나타낸 것이다. Ig-5T4 융합 단백질에 대해 추론된 아미노산 서열(서열번호: 4)도 제공된다.

도 7은 ScFv-IgE 서열(서열번호: 12)을 나타낸 것이다.

도 8은 B7-EGF 서열(서열번호: 13)을 나타낸 것이다.

도 9는 35일 이상의 기간동안 Balb/c 마우스 내에서의 CT26-neo 종양 세포 생장 상의 ScFv Ab의 효과를 나타낸 것이다.

도 10은 35일 이상의 기간동안 Balb/c 마우스 내에서의 CT26-h5T4 종양 세포생장 상의 ScFv Ab의 효과를 나타낸 것이다.

도 11은 35일 이상의 기간동안 Balb/c 마우스 내에서의 B16-neo 종양 세포 생장 상의 ScFv Ab의 효과를 나타낸 것이다.

도 12는 35일 이상의 기간동안 Balb/c 마우스 내에서의 B16-h5T4 종양 세포 생장 상의 ScFv Ab의 효과를 나타낸 것이다.

도 13은 ScFv 구조물을 나타낸 것이다.

도 14는 5T4 타겟 항원에 결합하는 B7-scFv를 나타낸 것이다.

도 15는 CTLA4에 결합하는 B7-scFv를 나타낸 것이다.

도 16은 scFv 단백질 단독으로 또는 염소 항-인간 IgG - FITC 표지된 항체가 뒤따르는 scFv 융합 단백질로 인큐베이트된 A9-5T4(A) 및 A9-neo(5T4 음성적) (B) 세포의 FACS 분석을 나타낸 것이다.

도 17은 5T4 scFv - Hγ1 ADCC 활성을 나타낸 것이다.

도 18은 pONY8.1SM을 나타낸 것이다.

도 19는 pONY8.1SM 내의 융합 단백질을 나타낸 것이다.

a. B7-5T4scFv

b. L-5T4scFv

도 20은 pKLink를 나타낸 것이다.

도 21은 pBSⅡ 내의 scFv 및 리더 서열을 나타낸 것이다.

도 22는 pONY8.1SM 내의 리더-LI-5 scFv를 나타낸 것이다.

도 23은 pONY8.1SM 내의 리더 HIV-gp120 scFv를 나타낸 것이다.

도 24는 pAdApt를 나타낸 것이다.

도 25는 pAdApt 내의 융합 단백질 구조물을 나타낸 것이다.

a. B7-5T4scFv

b. L-5T4scFv

도 26은 개과 5T4 코딩 서열을 나타낸 것이다.

더욱 상세하게는 :

도 14는 A9 5T4 및 A9 neo 세포와 함께 인큐베이트된, 293 T 세포로 세포감염되거나 태그된 B7-scFv 구조물로 세포감염된 모형으로부터의 상청액을 나타낸 것이다. 검출은 FITC 컨쥬게이트된 αHis 또는 αMyc 항체를 사용하였다.

도 15는 scFv 단독, Myc-His 태크가 없는 B7-scFv 구조물, 또는 태그된 B7-scFv 구조물과 함께 인큐베이트된 A9 5T4 및 A9 neo 세포를 나타낸 것이다. B7.1 리간드, CTLA4-Ig가 첨가되었고, 검출은 FITC 컨쥬게이트된 α마우스 IgG를 사용하였다.

도 20은 pKLink - pBluescriptⅡ SK(pBSⅡ) 내의 (Gly₄Ser)₃링커를 나타낸다. 유연성있는 링커는 2개의 상보적 올리고뉴클레오타이드로서 합성되어 제한 효소 돌출부를 제공하도록 어닐(aneal)된 후 이중 나선의 올리고뉴클레오타이드로서 pBSⅡ 내로 클론된다. (글리신₄세린)₃의 아미노산 번역이 DNA 서열 아래에 단일 문자 코드로 나타나 있다.

도 21은 PBSⅡ 내의 scFv(예를 들어 IL-5 또는 HIV gp120 scFv) 및 리더 서열의 하위 첨가를 나타낸 것이다. 이러한 예에서 VH는 5' 말단에서의 부가적SpeⅠ및MfeⅠ제한 사이트 및 3' 말단에서의 부가적AgeⅠ사이트로 증폭된다. VL은 pKlink 내로 클로닝시 사용되는 것인 5' 말단에서의 부가적Bam HI제한 사이트 및 3' 말단에서의 부가적Eco RI사이트로 증폭된다. 리더 시그날 펩티드는 제한 효소 돌출부를 제공하도록 어닐되어 scFv cDNA의 5' 말단에서SpeⅠ와MfeⅠ사이에서 이중 나선 올리고뉴클레오타이드로 클론되는 2개의 상보적 올리고뉴클레오타이드로서 합성된다. ATG 시작 코돈(밑줄친)을 포함한 Kozak 서열은 굵은 이탤릭체이다.

도 26은 개과 5T4 코딩 서열을 나타낸 것이다. λ대시(dash) 내의 잡종 게놈 라이브러리는 h5T4 cDNA로부터 생성된 프로브로 분비되었다. 양성 클론은 확인되었고, 서열화되었다.

본 발명의 다른 관점은 수반된 청구항 및 하기의 명세서 및 도면 내에 기재되어 있다. 이러한 관점은 각기 다른 섹션 표제 하에 기재된다. 그러나 각각의 섹션하의 지침이 특정한 섹션 표제에 한정적인 것은 아니란 것을 이해되어야 한다.

ScFv 항체

하나의 관점에서 본 발명은 DAM을 인식하는 재조합 ScFv Ab를 제공한다.

여기 사용된 "ScFv Ab"이라는 용어는 라이트 체인(light chain) 변이 구역(VL) 및 헤비 체인(heavy chain) 변이 구역(VH)을 지닌 DAM 항원을 인식하는 것이 가능한 항체를 의미한다. VH 및 VL 파트너 도메인(domain)은 일반적으로 유연성이 있는 올리고펩티드/펩티드 링커(linker)를 통해 결찰/결합된다. VH 및 VL 파트너 도메인은 VH-VL 또는 VL-VH의 순서로 결합된다. 일반적으로 서열은 VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH의 순서로 링커 서열을 통해 결합된다. 여기에 사용된 바와 같이 이 용어는 DAM와 선택적으로 반응하거나 인식하는 것이 가능한 ScFv Ab 분자의 단백질가수분해적으로-분열된 또는 재조합적으로-준비된 부분의 단편을 포함한다. 이러한 단백질가수분해적 및/또는 재조합 단편의 비 제한적 예는 본 발명의 목적을 위해 인간 면역글로블린 유전자 외의 포유류 면역글로블린 유전자로부터유도가능한 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코드된 헤비 및 라이트 체인 변이 구역(VH 및 VL)의 어느 하나 또는 이 둘 모두 및 인간 면역글로블린 유전자로부터 유도가능한 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코드된 헤비 및 라이트 체인 변이 구역의 어느 하나 또는 이둘 모두를 지닌 ScFv Ab를 나타내는 키메릭(chimeric) ScFv 항체를 포함한다. ScFv Ab는 공유결합적으로 또는 비-공유결합적으로 다른 실체(다른 ScFv Ab와 같이)에 결합하여 2 또는 그 이상의 결합 사이트를 형성한다. 예를 들어 하나의 ScFv Ab는 5T4와 같은 DAM에 결합할 수 있고, 두 번째 ScFv Ab는 면역 인핸서(enhancer) 분자에 결합할 수 있다.

본 발명에 따라 "ScFv Ab"라는 용어의 참조는 펩티드 인코딩 뉴클레오타이드 서열 및/또는 융합 단백질 인코딩 뉴클레오타이드 서열 뿐만 아니라 펩티드 그 자체 및 융합 단백질의 부분으로서의 펩티드에 대한 참조를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 펩티드 자체 및/또는 융합 단백질은 합성적 펩티드이다. 또한 펩티드 및/또는 융합 단백질은 유전적으로 발현된/재조합 펩티드/융합 단백질이다. 어떤 적용에 있어서, "ScFv Ab"라는 용어는 펩티드 그 자체를 의미한다. "ScFv Ab"라는 용어는 또한 LScFv로 지명된 분비 리더(leader) 서열을 지닌 ScFv Ab를 포함한다.

여기에 사용된 바와 같이 "변이 구역"이라는 용어는 결합 인식 특이성 및 DAM에 대한 ScFv Ab의 전체 어피니티(affinity)를 위한 결정소(determinant)를 포함한 라이트 체인(VL) 및 헤비 체인(VJ)의 변이 구역 또는 도메인을 나타낸다. 라이트 체인(VL) 및 헤비 체인(VH)의 각각의 쌍의 변이 도메인은 항원 인식에 관련되고, 항원 결합 사이트를 형성한다. 라이트 및 헤비 체인의 도메인은 동일한 일반 구조를 지니고, 각각의 도메인은 상대적으로 보존되고, 3개의 상보성 결정 구역(CDRs)에 의해 연결된 4개의 프레임워크(framework(FR))를 지닌다. FR 구역은 변이 도메인의 구조적 보전(integrity)을 유지한다. CDRs은 DAM과 같은 항원에 결합을 매개하는 변이 도메인 내의 폴리펩티드 세그먼트이다.

바람직하게는 5T4 항원에 대한 본 발명의 ScFv Ab의 어피니티(K_D)는 약 5 ×10^-10∼ 10 ×10^-10이다.

바람직하게는 5T4 항원에 대한 본 발명의 ScFv Ab의 어피니티(K_D)는 약 6 ×10^-10∼ 9 ×10^-10이다.

바람직하게는 5T4 항원에 대한 본 발명의 ScFv Ab의 어피니티(K_D)는 약 7 ×10^-10∼ 8 ×10^-10이다.

바람직하게는 5T4 항원에 대한 본 발명의 ScFv Ab의 어피니티(K_D)는 약 7.9×10^-10이다. ScFv Ab의 K_D는 BIA평가 소프트웨어(Pharmcia)를 이용하여 측정되었다.

여기에 사용된 바와 같이 "오프-속도"라는 용어는 항원으로부터의 ScFv Ab의 해리 속도(k_off)를 의미한다. 본 발명에서 이는 BIA평가 소프트웨어(Pharmcia)를 이용하여 측정되었다. 낮은 오프 속도는 DAM과 같은 항원에 대한 Fab 단편의 어피니트를 반영하기 때문에 바람직하다.

여기에 사용된 바와 같이 "어피니티"라는 용어는 DAM 항원으로부터의 ScFv Ab의 해리 속도 또는 오프-속도로 정의된다. 오프-속도가 더 낮을수록 DAM과 같은 항원에 대해 ScFv Ab가 지니는 어피니트가 더 높아진다.

DAM

여기에 사용된 바와 같이 "DAM"이라는 용어는 면역모듈레이터(immunomodulator), 시토킨, 생장인자, 세포표면 수용체, 호르몬, 순환 분자, 염증성 시토킨 및 바이러스, 박테리아, 기생충 또는 효모와 같은 병원성균을 포함하나 이에 한정적이지 않은 생물적 반응 모디퍼(modifier)를 포함할 수 있으나 이에 한정적인 것은 아니다. 이러한 생물적 반응 모디퍼의 예는 ApoE,Apo-SAA, BDNF, 카디오트로핀(Cardiotropin)-1, EGF, ENA-78, 에오탁신(Eotaxin), 에오탁신-2, 엑소더스(Exodus)-2, 산성-FGF, 염기성-FGF, 섬유아세포 생장인자-10(Marshall 1998 Nature Biotechnology 16:129), FLT3 리간드(Kimura et al. 1997), 프랙탈킨(Fractalkine)(CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, 인슐린, IFN-γ, IGF-Ⅰ, IGF-Ⅱ, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8(72 a.a.), IL-8(77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, Il-16, IL-17, IL-18(IGIF), 인히빈(Inhibi)α, 인히빈 β, IP-10, 케라티노사이트(keratinocyte) 생장인자-2(KGF-2), KGF, 렙틴(Leptin), LIF, 립포탁틴(Lymphotactin), 뮬레리안(Mullerian) 억제물질, 단핵세포 콜로니 억제 인자, 단핵세포 유인제 단백질(Marshall 1998, ibid), M-SCF, MDC(67 a.a.), MDC(69 a.a.), MCP-1(MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC(67 a.a.), MDC(69 a.a.), MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, 마이엘로이드(myeloid) 프로제니터(progenitor) 억제 인자-1(MPIF-1), NAP-2, 뉴투린(Neuturin), 신경생장인자, β-NGF, NT-3, NT-4, 옹코스테인(Oncostain) M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, 줄기세포인자(SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, 종양회저(necrosis)인자(TNF), TNF-α, TNF-β, TNIL-1, TPO, VEGF, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β 및 GRO-γ을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

병원성균의 예는 바이러스, 박테리아, 기생충 및 효모를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 예로서 병원성 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인플루엔자, 헤르페스 심플렉스(simplex), 인간 유두종 바이러스, 말 뇌염 바이러스, 간염, 고양이 백혈병 바이러스, 개 디스템퍼(distemper) 및 광견병 바이러스, 인플루엔자, 폭스바이러스(poxviriuses), 가금류 폭스바이러스(FPV), 카나리폭스바이러스(canarypoxvirus), 엔토모폭스(entomopox)바이러스, DNA 복제 효소 결핍 백신 바이러스, 알파바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEE)를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 병원성 박테리아의 예는 클라미다(Chlamydia), 마이코박테리아(Mycobacteria), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium Falciparum), 레지오니엘라(Legioniella), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 스렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes), 네이세리아 고노르헤아(Neisseria gonorrheae), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphteriae), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 클로스트리디움 페르프린젠스(Clostridium perfrigens), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 및 스트렙토코커스 티피무리움(S. typhimurium) 등을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 병원성 기생충의 예는 트리바토소마, 트리파노소마 크루지, 세이시마니아, 레이시마니아 오노바니, 레이시마니아 트로피카, 레이시마니아 멕시카나, 레이시마니아, 브라질리엔시스, 기아르디아, 기아르디아 람블리아, 트리코모나스, 엔타모에바, 네글레리아, 아칸타모에바, 아칸타모에바 카스텔라니, 아칸타모에바 쿨버트소니 및 다른 종 플라스모디움, 톡소플라스마, 톡소플라스마 곤디, 크립토스포리디움, 크립토스포리디움 파붐, 이소스포라, 이소스포라 벨리, 네글리아 포울레리, 발라티디움, 발라티디움 콜리, 바베시아, 스키스토소마, 톡시플라스마 및 톡소카라 카니스를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 효모의 예는 아스퍼질러스 및 침입성 칸디다를 포함한다. 바람직한 실시태양에서 병원성 미생물은 세포내 생물체이다.

바람직하게는 DAM은 세포내 병원성균이다.

바람직하게는 DAM은 질병 결합 세포 표면 분자(DACSM)이다.

본 발명에 따라 DACSM은 생장 인자 수용체와 같은 점착성 단백질의 수용체를 포함할 수 있으나 이에 한정적인 것은 아니다. 생장 인자 수용체의 예는 ApoE, Apo-SAA, BDNF, 카디오트로핀(Cardiotropin)-1, EGF, ENA-78, 에오탁신(Eotaxin), 에오탁신-2, 엑소더스(Exodus)-2, 산성-FGF, 염기성-FGF, 섬유아세포 생장인자-10(Marshall 1998 Nature Biotechnology 16:129), FLT3 리간드(Kimura et al. 1997), 프랙탈킨(Fractalkine)(CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, 인슐린, IFN-γ, IGF-Ⅰ, IGF-Ⅱ, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8(72 a.a.), IL-8(77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, Il-16,IL-17, IL-18(IGIF), 인히빈(Inhibin)α, 인히빈 β, IP-10, 케라티노사이트(keratinocyte) 생장인자-2(KGF-2), KGF, 렙틴(Leptin), LIF, 립포탁틴(Lymphotactin), 뮬레리안(Mullerian) 억제물질, 단핵세포 콜로니 억제 인자, 단핵세포 유인제 단백질(Marshall 1998, ibid), M-SCF, MDC(67 a.a.), MDC(69 a.a.), MCP-1(MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC(67 a.a.), MDC(69 a.a.), MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, 마이엘로이드(myeloid) 프로제니터(progenitor) 억제 인자-1(MPIF-1), NAP-2, 뉴투린(Neuturin), 신경생장인자, β-NGF, NT-3, NT-4, 옹코스테인(Oncostain) M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, 줄기세포인자(SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, 종양회저(necrosis)인자(TNF), TNF-α, TNF-β, TNIL-1, TPO, VEGF, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 생장 인자 수용체의 비-소모적 리스트는 Molecular Bilogy and Biotechnology(Ed RA Meyers 1995 VCH Publisher Inc.)의 392-297에서 찾을 수 있다; 플라스미노겐 활성자; 메탈로프로티나제(metalloproteinase)(콜라게나제와 같은), 뮤신(mucin); 글리코프로틴; 이러한 조직 분포에 제한된 항원; 및/또는 종양 세포 생장, 이주 또는 전이에 중요한 역할을 하는 세표 표면 분자(5T4 항원, 종양 특이적 탄수화물 반족, 또는 옹코페탈 항원과 같은). DACSM이라는 용어는 또한 항원 결정소를 포함한다.

항원 결정소

여기에 사용된 바와 같이 "항원 결정소"라는 용어는 질병 또는 장애와 결합하는 항원을 나타낸다. 예로서 항원 결정소는 또한 종양 세포와 같이 생물체 내에서 비제한적으로 증식하여 병원성으로 생장하게 되는 병에 걸린 세포와 결합된 병원성균으로부터 유도된다. 이러한 병원성균의 예는 Davis, B.D. et al(Microbilogy, 3rd ed., Harper International Edition) 내에 기술되어 있다. 항원 결정소는 항원 상에서 항원 및/또는 면역우세 에피토프가 된다. 예로서 항원 결정소는 숙주 면역 시스템에 대해 타겟으로 작용하고, 종양 파괴를 초래하는 반응을 유도하는 종양 결합 항원(TAA)을 포함한다.

TAA

여기서 사용된 "종양 결합 항원(TAA)"이라는 용어는 TAA 또는 그의 항원성 펩티드를 나타낸다. 항원은 종양 그 자체 또는 유조직 세포와 같은 종양과 결합된 세포 또는 결합된 맥관구조에 의해 발현된다. "종양 결합 항원(TAA)"이라는 용어는 종양 세포를 적은 양으로 존재하는 그들의 정상 세포 대응부와 구별하는 항원을 포함한다.

TAA의 예는 MART-1(T 세포-1에 의해 인식된 멜라노마 항원), MAGE-1, MAGE-3, 5T4, gp100, 카시노엠브리오닉 항원(CEA), 전립선-특이적 항원(PSA),MUCIN(MUC-1), 티로시나제를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 특히 바람직한 TAAs는 면역 시스템의 요소에 의한 인식을 위해 위치하고, 치료 및/또는 면역치료와 같은 치료 타겟에 우수한 세포 표면 분자이다. 본 발명은 상기에 기입된 TAAs를 인코딩하는 항원 결정소에 한정적이지 않다. 다른 TAAs이 미국 특허 제4,514,506호에 공개된 것과 같이 잘 알려진 방법에 의해 확인되고, 분리되고, 클론되었다.

5T4 TAA

TAA 5T4(WO 889/07947)는 광범위하게 특성화되었다. 이는 암종 내에서 널리 발현되나 정상 성인 조직에서는 크게 제한된 발현 패턴을 지닌 72kDa 글리코프로틴이다. 결장암 및 위암 내의 전이에 크게 관련되는 것으로 보인다. 인간 5T4의 전체 핵산 서열이 알려져 있다(Myers et al., 1994 J Biol Chem 169:9319-24).

동시-자극성 분자

DAM에 반응하기 위해 림파구는 그들의 효과기(effector) 기능을 활성화시키는 2개의 다른 시그날을 필요로 한다(Bretscher and Cohn 1970 Science 169:1042-1049; Crabtree 1989 Science 243:355-361). 초기 시그날은 항원에 특이적이다.분리에서 초기 시그날의 자극은 일반적으로 림파구의 세포사멸(프로그램된 세포사멸)을 이끌거나, 지속된 비-민감성 또는 아네르기의 상태의 확립을 이끈다(Weiss et al.supra). 림파구의 활성화를 달성하기 위해 항원-표시 세포(APC) 상에 존재하는 시토킨 또는 세포-표면 동시-자극성 리간드에 의해 전달된 악세서리 시그날이 요구된다.

유착 분자, LFA-3, ICAM-1, ICAM-2를 포함하는 것으로 확인된 이러한 동시-자극성 분자가 많다. APC 상에 존재하는 주요한 동시-자극성 분자는 B7-1(CD80), B7-2(CD86) 및 B7-3을 포함하는 B7계의 멤버이다. 이러한 분자는 CD28을 포함하는(WO92/00092) 림파구 상의 동시-자극성 수용체의 리간드이고, 아마도 휴지 T-세포의 동시-자극성 수용체가 가장 유의적이다. 글리코프로티의 B7계의 다른 멤버는 다른 시그날을 T-세포를 민감하게 전달한다(Nunes et al. 1996 J. Biol. Chem. 271:1591-1598).

본 발명의 하나의 관점에서 종양 항원과 같이 DAM에 대한 결합 어피니티를 지닌 분비된 동시-자극성 분자("SCM")로 구성된 ScFv Ab가 사용된다.

ScFv Ab 원천

본 발명의 ScFv Ab는 자연적이거나 아니거나 적당한 원천으로부터 수득가능하거나 또는 생산되고, 또는 본 발명의 ScFv Ab의 요구되는 DAM 결합 특이성을 보유하는 한 합성적 ScFv Ab, 반-합성적 ScFv Ab, 모태(mimetic), 파생된 ScFv Ab, 재조합 ScFv Ab, 발효 최적화된 ScFv Ab, 융합 단백질 또는 그의 등가물, 돌연변이체 및 유도체일 수 있다. 이는 아미노산 치환을 지니거나 당 또는 아미노산 기능적 그룹에 부착된 다른 분자를 지닌 DAM 결합 특이성을 지닌 ScFv Ab를 포함한다.

"모태"이라는 용어는 펩티드, 폴리펩티드, 항체 또는 본 발명의 ScFv Ab과 동일한 결합 특이성을 지닌 다른 유기 화합물일 수 있는 어떤 화합물과도 관련이 있다.

여기 사용된 "유도체" 또는 "파생된"이라는 용어는 ScFv Ab의 화학적 변형이다. 이러한 변형의 예는 알킬, 아실 또는 아미노 그룹에 의한 수소의 대치이다. 바람직하게는 ScFv Ab는 재조합 DNA 기술에 의해 준비되거나 화학적 합성 기술 또는 그의 조합에 의해 생산된 적어도 하나 이상의 부분을 포함한다.

바람직하게는 ScFv Ab는 화학적 합성 기술의 이용에 의해 준비된다.

화학적 합성 방법

본 발명의 ScFv Ab 또는 그의 변이체, 상동체, 유도체, 단편, 모태는 ScFvAb 아미노산 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 합성하는 화학적 방법을 이용하여 생산된다. 예를 들어 펩티드는 고체상 기술에 의해 합성되고, 수지로부터 분열되고, 예비 하이 퍼포먼스 액상 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)(즉, Creighton(1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY)에 의해 정제된다. 합성적 펩티드의 구성은 아미노산 분석 또는 서열화에 의해 확인된다(즉, the Edman degradation procedure; Creighton,supra).

ScFv Ab 또는 그의 변이체, 상동체, 유도체, 단편, 모태의 직접적인 합성은 다양한 고체-상 기술을 이용하여 수행될 수 있고(Roberge JY et al(1995) Science 269:202-204) 예를 들어 제조사에 의해 제공된 지침에 따라 ABI 43 1 A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)를 이용하여 자동화된 합성이 달성된다. 이에 더하여 ScFv Ab으로부터 수득 가능한 아미노산 서열 또는 그의 어느 부분도 직접적인 합성 및/또는 다른 서브유니트 또는 그의 부분으로부터의 서열과 결합된 화학적 방법 동안 변경되어 변이체 ScFv Ab를 생산한다.

본 발명의 또다른 실시태양에서 ScFv Ab의 코딩 서열 또는 그의 변이체, 상동체, 유도체, 단편 또는 모태가 당 분야에서 잘 알려진 화학적 방법을 이용하여 전체적으로 또는 부분적으로 합성된다(Caruther MH et al 1980 Nuc Acids Res Symp Ser 215-23, Horn T et al 1980 Nuc Acids Res Symp Ser 225-232 참조).

바람직하게는 본 발명의 ScFv Ab는 서열번호 1 내의 아미노산 서열로 구성된다(도 1 참조).

바람직하게는 본 발명의 ScFv Ab는 서열번호 3 내의 아미노산 서열로 구성된다(도 2 참조).

바람직하게는 본 발명의 ScFv Ab는 서열번호 4 내의 아미노산 서열로 구성된다(도 6 참조).

아미노산 서열

여기에 사용된 바와 같이 "아미노산 서열"이라는 용어는 펩티드, 폴리펩티드 서열, 단백질 서열 또는 그의 부분을 나타낸다.

바람직하게는 ScFv Ab는 분리된 ScFv Ab 및/또는 정제된 및/또는 비-천연적 ScFv Ab이다.

본 발명의 ScFv Ab는 실질적으로 분리된 형태이다. 단백질은 ScFv Ab의 의도된 목적을 방해하지 않고, 실질적으로 분리되는 것으로 간주될 캐리어(carrier)또는 희석제와 혼합된다. 본 발명의 ScFv Ab는 또한 제조시 일반적으로 ScFv Ab로 구성될 것이고, 제조시 ScFv Ab의 90% 이상, 즉 95%, 98% 또는 99%가 서열번호 1, 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4 또는 그의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편으로 구성된 펩티드인 실질적으로 정제된 형태이다.

아미노산 서열의 변이체/상동체/유도체

서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4에 나타난 본 발명의 바람직한 아미노산 서열은 본 발명의 ScFv Ab으로부터 수득가능하고 또한 예를 들어 관련된 바이러스성/박테리아성 단백질, 세포 상동물 및 합성적 펩티드뿐만 아니라 그의 변이체 또는 유도체의 어느 원천으로부터도 수득된 상동성 서열을 포함한다.

또한 본 발명은 처음으로 전체 개과 5T4 아미노산 서열 및 핵산 서열을 제공한다(도 26 및 서열번호 14 및 15). 따라서 본 발명은 또한

ⅰ) 서열번호 14에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체를 지닌 개과 5T4 폴리펩티드 ; 및

ⅱ) 이러한 개과 5T4 폴리펩티드를 인코딩하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 바람직하게는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 15에 나타난 서열 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체를 지닌다.

따라서 본 발명은 여기에 나타난 아미노산 서열의 변이체, 상동체 또는 유도체 뿐만 아니라 이러한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 변이체, 상동체 또는 유도체를 포함한다.

본 발명에서 상동적 서열은 예를 들어 서열목록의 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4 또는 서열번호 14 내의 아미노산 서열과 적어도 75, 85 또는 90% 이상 동일한, 바람직하게는 적어도 95 또는 98% 동일한 아미노산 수준을 지닌 아미노산 서열을 포함한다. 특히 상동성은 일반적으로 비-필수적 이웃 서열 보다는 결합 특이성(아미노산 위치와 같은)에 필수적인 것으로 알려진 서열의 구역에 대해 논의되어야 한다. 상동성이 유사성이라는 점에서 논의될 수 있으나 본 발명은 서열 동일성이라는 점에서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.

상동성 비교는 눈으로 또는 더욱 일반적으로는 용이하게 유용한 서열 비교 프로그램을 통해 수행될 수 있다. 이러한 통상적으로 유용한 컴퓨터 프로그램은 2 또는 그 이상의 서열 사이의 % 상동성을 산출할 수 있다.

% 상동성은 인접하는 서열에 대해 산출된다, 즉 하나의 서열은 다른 서열과 정렬되고, 하나의 서열 내의 각각의 아미노산은 한번에 다한의 잔기에 대해 다른 서열 내의 대응하는 아미노산과 직접적으로 비교된다. 이를 "언갭드(ungapped)" 정렬이라고 부른다. 일반적으로 이러한 언갭드 정렬은 상대적으로 짧은 수의 잔기에만 수행된다.

이는 매우 간단하고 일관된 방법이나 예를 들어 서열의 쌍이 동일하지 않은 경우 하나의 삽입 또는 삭제가 다음의 아미노산 잔기를 정렬로부터 빠져나오도록 유발하여 전체적인 정렬이 수행될 때 % 상동성에서 큰 감소를 잠재적으로 유발한다는 점을 고려하는데 실패하게 된다. 따라서 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 점수에 부당하게 패널티를 과하지 않고 가능한 삽입 및 삭제를 고려한 최상의 정렬을 생성하도록 고안된다. 이는 국부적 상동성을 최대화하기 위해 서열 정렬 내에 "갭"을 삽입시킴으로서 달성된다.

그러나 이러한 더욱 복잡한 방법은 정렬 내에서 발생하는 각각의 갭에 "갭 패널티"를 할당하여 동일한 아미노산의 동일한 수에 있어서 가능한 적은 갭을 지닌 서열 정렬 - 2개의 비교되는 서열 사이의 더 높은 관련도를 반영하는 - 이 많은 갭을 지닌 것 보다 더 높은 점수를 얻게 될 것이다. 갭의 존재를 위해 상대적으로 높은 코스트 및 갭 내의 각각의 수반되는 잔기를 위해 더 적은 패널티를 부가하는 "밀접한 갭 코스트(cost)"가 일반적으로 이용된다. 이는 가장 통상적으로 사용되는 갭 점수 시스템이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 패널티가 변형되는 것이 가능하게 한다. 그러나 이러한 소프트웨어를 서열 비교에 사용할 때 디폴트(defualt) 값을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 GCG Wisconsin Bestifit 팩키지(하기 참조)를 사용할 때 아미노산 서열의 디폴트 갭 패널티는 갭은 -12 및 각각의 확장은 -4이다.

따라서 % 상동성의 산출은 먼저 최적 정렬의 생산을 필요로 하여 갭 패널티를 고려한다. 이러한 정렬을 수행하기 위한 적당한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestifit 팩키지이다(미국 위스콘신 대학; Devereux et al. 1984, Nucleic Acids Research 12:387). 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST 팩키지(Ausubel et al., 1999 ibid - Chapter 18), FASTA(Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) 및 비교 도구의 GENEWORKS 스위트(suite)을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. BLAST 및 FASTA는 모두 오프라인 및 온라인 검색에 유용하다. 그러나 GCG Bestfit 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 Sequence로 불리는 새로운 도구가 또한 단백질 및 뉴클레오타이드 서열을 비교하는데 유용하다(FEMS Microbiol Lett 1999 174(2):247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187-8 및 tatiana@ncbi.nlm.nih.gov 참조).

최종 % 상동성이 동일성이라는 점에서 측정될 수 있으나 정렬 과정 자체는 일반적으로 모두-또는-아무것도 아닌 쌍 비교에 기초를 두지 않는다. 대신에 점수를 화학적 유사성 또는 진화적 거리에 기초를 둔 각각의 페어와이즈(pairwise) 비교에 할당하는 스케일이 있는(scaled) 유사성 점수 매트릭스가 일반적으로 이용된다. 통상적으로 사용되는 이러한 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스 - 프로그램의 BLAST 스위트의 디폴트 매트릭스 - 이다. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 공공의 디폴트 값 또는 보충되는 경우 맞춤 심볼 비교표를 이용한다(더욱 상세한 것은 사용자 매뉴얼을 참조). GCG 팩키지의 공공의 디폴트 값 또는 다른 소프트웨어의 경우 BLOSUM62와 같은 디폴토 매트릭스를 사용하는 것이 바람직하다.

소프트웨어가 최적의 정렬을 생산하면 % 상동성, 바람직하게는 % 서열 동일성을 산출하는 것이 가능하다. 일반적으로 소프트웨어는 서열 비교의 일부분으로서 이렇게 되고, 수적인 결과를 생성한다.

본 발명의 아미노산 서열에 관련한 "변이체" 또는 "유도체"라는 용어는 결합 특이성을 지니고, 바람직하게는 서열목록 내의 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4 또는 서열번호 14에 나타난 아미노산 서열과 적어도 동일한 결합 특이성을 지닌 결과적 아미노산 서열을 제공하는 서열의 하나 또는 그 이상으로부터 또는 그것에 치환, 변이, 변형, 대치, 삭제 또는 첨가를 포함한다.

서열목록 내의 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4 또는 서열번호 14는 본 발명에 사용되기 위해 변형된다. 일반적으로 서열의 결합 특이성을 유지시키는 변형이 이루어진다. 예를 들어 1, 2 또는 3에서부터 10 또는 20개까지의 아미노산 치환은 이루어지고, 변형된 서열이 요구되는 결합 특이성을 보유하도록 제공된다. 아미노산 치환은 비-자연적으로 발생한 아날로그(analogue)의 이용을 포함한다.

본 발명의 ScFv Ab는 또한 사일런트(silent) 변화를 유발하여 기능적으로 동등한 ScFv Ab를 초래하는 아미노산 잔기의 삭제, 삽입 또는 치환을 지닌다. 계획적인 아미노산 치환은 ScFv Ab의 결합 특이성이 유지되는 한 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 암피페틱(amphipathic) 성질에 기초를 두고 이루어진다. 예를 들어 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루타민산을 포함하고; 양으로 하전된 아미노산은 리신 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 값을 지닌 하전되지 않은 극성 헤드 그룹을 지닌 아미노산은 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다. 또한 동일한 것이 개과 5T4 서열에도 적용된다.

예를 들어 하기의 표에 따른 보존적 치환이 이루어진다. 두 번째 컬럼 내의 동일한 블록 내의 아미노산, 바람직하게는 세 번째 컬럼 내의 동일한 라인 내의 아미노산이 서로 치환된다 :

지방성	비-극성	G A P
		I L V
	극성-비하전	C S T M
		N Q
	극성-하전	D E
		K R
방향성		H F W Y

바람직하게는 분리된 ScFv Ab 및/또는 정제된 ScFv Ab 및/또는 비-천연 ScFvAb 및/또는 5T4 서열이 재조합 기술의 사용에 의해 준비된다.

개과 5T4 서열의 단편에 있어서, 바람직하게는 단편은 적어도 하나 이상, 바람직하게는 동일하게, 가장 바람직하게는 서열번호 14에 나타난 아미노산 1-182 및/또는 297-420 모두로 구성된다.

뉴클레오타이드 서열

많은 다른 뉴클레오타이드 서열은 유전적 코드의 퇴보(degeneracy)의 결과로서 본 발명의 동일한 ScFv Ab를 인코드할 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 더욱이 통상의 기술을 이용하여 본 발명의 ScFv Ab가 발현되는 특정한 숙주 생물체의 코돈 용법(usage)을 반영하기 위해 당업자가 뉴클레오타이드 치환이 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코드된 ScFv Ab에 영향을 미치지 않도록 하는 것이 이해된다.

본 발명의 서열번호 5(도 1 참조), 또는 서열번호 7(도 2 참조) 또는 서열번호 8(도 6 참조)에 나타난 뉴클레오타이드 서열에 관련한 "변이체", "상동체" 또는 "유도체"라는 용어는 결합 특이성을 지니고, 바람직하게는 본 발명의 서열목록 내의 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 8에 나타난 뉴클레오타이드 서열과 적어도 동일한 결합 특이성을 지닌 ScFv Ab의 결과적 뉴클레오타이드 서열 코드를제공하는 서열의 하나 또는 그 이상으로부터 또는 그것에 치환, 변이, 변형, 대치, 삭제 또는 첨가를 포함한다.

본 발명의 서열번호 15(도 26 참조)에 나타난 뉴클레오타이드 서열에 관련한 "변이체", "상동체" 또는 "유도체"라는 용어는 개과 5T4 폴리펩티드, 바람직하게는 본 발명의 서열목록 내의 서열번호 14에 나타난 폴리펩티드의 결과적인 뉴클레오타이드 서열 코드를 제공하는 서열의 하나 또는 그 이상으로부터 또는 그것에 치환, 변이, 변형, 대치, 삭제 또는 첨가를 포함한다.

상기에 나타난 바와 같이 서열 상동성에 있어서 서열목록 내에 나타난 서열에 대해 바람직하게는 적어도 75% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 이상의 상동성이 있다. 더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 이상의 상동성이 있다. 뉴클레오타이드 상동성 비교는 상기에 기술된 바와 같이 수행된다. 바람직한 서열 비교 프로그램은 상기에 기술된 GCG Wisconsin Bestfit 프로그램이다. 디폴트 점수 매트릭스는 각각의 동일한 뉴클레오타이드에 대해 10의 매치 값을, 각각의 미스매치에 대해 -9의 매치값을 지닌다. 디폴트 갭 생성 패널티는 -50이고, 디폴트 갭 확장 패널티는 각 뉴클레오타이드d 대해-3이다.

본 발명은 또한 여기 기재된 서열 또는 그의 변이체, 단편 또는 유도체 또는상기의 어느 하나에 상보서열에 선택적으로 하이브리다이즈하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 뉴클레오타이드 서열은 길이로 바람직하게는 적어도 약 15개 이상, 더욱 바람직하게는 길이로 20, 30, 40 또는 50개 이상의 뉴클레오타이드이다.

개과 5T4 서열의 단편에 있어서, 바람직하게는 단편은 서열번호 15에 나타난 핵산 1-546 및/또는 890-1263의 적어도 하나 이상, 바람직하게는 동일한, 가장 바람직하게는 모두로 구성된다.

하이브리디제이션

여기 사용된 "하이브리디제이션"이라는 용어는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술에서 수행된 증폭 과정 뿐만 아니라 "염기쌍을 통해 핵산의 스트랜드가 상보적인 스트랜드와 함께 결합하는 과정"을 포함해야 한다.

여기 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상보물에 선택적으로 하이브리다이즈되는 것이 가능한 본 발명의 뉴클레오타이드는 일반적으로 적어도 20개 이상, 바람직하게는 적어도 24 또는 30, 예를 들어 적어도 40, 60, 또는 100 또는 그 이상의 인접한 뉴클레오타이드에 대해 여기 기재된 대응하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 75% 이상, 바람직하게는 적어도 85 또는 90% 이상, 더욱 바람직하게는적어도 95% 또는 98% 이상 상동성이 있을 것이다. 본 발명의 바람직한 뉴클레오타이드 서열은 본 발명의 서열목록의 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 8 또는 서열번호 15에 나타난 뉴클레오타이드에 상동인 구역, 바람직하게는 본 발명의 서열목록의 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 8에 나타난 뉴클레오타이드 서열에 적어도 80 또는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상 상동적인 구역으로 구성될 것이다.

"선택적으로 하이브리다이즈가능한"이라는 용어는 프로브로 사용된 뉴클레오타이드 서열이 본 발명의 타겟 뉴클레오타이드 서열이 백그라운드(background) 보다 유의적으로 높은 수준으로 프로브에 하이브리다이즈되는 것으로 나타나는 조건 하에서 사용된다는 것을 의미한다. 백그라운드 하이브리디제이션은 예를 들어 스크린되는 cDNA 또는 게노믹 DNA 라이브러리 내에서와 같은 존재하는 다른 뉴클레오타이드 서열 때문에 발생한다. 이러한 이벤트에서 백그라운드는 프로브와 타겟 DNA와 관찰된 특이적 상호작용 만큼 강한 강도의 10 폴드 이하, 바람직하게는 100 폴드 이하의 라이브러리의 비-특이적 DNA 멤버 사이의 상호작용에 의해 생성된 시그날의 레벨을 의미한다. 상호작용의 강도는 예를 들어 프로브를 방사성원소, 즉³²P로 식별함으로서 측정된다.

하이브리디제이션 조건은 Berger and Kimmel(1987, Guide to MoleclarCloning Techniques, Methods in Enzymology, vol 152, Academic Press, San Diego CA)에 나타난 바와 같이 핵산 결합 복합물의 녹는점(Tm)에 기초를 두고, 하기에 설명된 바와 같이 정의된 "스트린젠시(stringency)"를 부여한다.

일반적으로 최대 스트린젠시는 약 Tm-5℃(5℃ 이하의 프로브의 Tm)에서 발생하고; 약 5℃ 내지 10℃ 이하의 Tm에서 높은 스트린젠시; 약 10℃ 내지 20℃ 이하의 Tm에서 중간 스트린젠시; 및 약 20℃ 내지 25℃ 이하의 Tm에서 낮은 스트린젠시. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 최대 스트린젠시 하이브리디제이션은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 확인하거나 검출하는데 사용될 수 있는 반면 중간(또는 낮은) 스트린젠시 하이브리디제이션은 유사한 또는 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인하거나 검출하는데 사용될 수 있다.

바람직한 관점에서 본 발명은 스트린젠트 조건(즉, 65℃ 및 0.1 ×SSC {1 ×SSC = 0.15M NaCl, 0.015M Na₃Citrate pH 7.0}) 하에서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열이 개별적으로 또는 조합된 이중-스트랜드인 경우 이중선 모두 본 발명에 의해 포함된다. 뉴클레오타이드 서열이 단일-스트랜드일 경우 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열도 본 발명의 범위 내에 포함되는 포함됨을 이해해야 한다.

본 발명의 서열에 100% 상동적이지는 않으나 본 발명의 범위 내에 있는 뉴클레오타이드 서열은 많은 방법에 의해 수득가능하다. 여기 기술된 서열의 다른 변이체는 예를 들어 원천으로부터 만들어진 DNA 라이브러리를 프로브함으로서 수득된다. 더욱이 다른 바이러스성/박테리아성 또는 세포적 상동체 특히 포유류 세포 내에서 발견된 세포적 상동체(즉, 래트, 마우스, 소 및 영장류 세포)가 수득되고, 일반적으로 이러한 상동체 및 그의 단편은 서열목록에 나타난 서열에 선택적으로 하이브리다이즈되는 것이 가능할 것이다. 이러한 서열은 다른 동물 종으로부터 만들어지 cDNA 라이브러리 또는 게노믹 라이브러리를 프로브함으로서, 또한 이러한 라이브러리를 중간에서 높은 스트린젠시의 조건 하에서 본 발명의 서열목록 내의 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 8 또는 서열번호 15에 나타난 뉴클레오타이드 서열 모두 또는 그 일부로 구성된 프로브와 함께 프로브함으로서 수득된다. 유사한 논의가 본 발명의 아미노산 및/또는 뉴클레오타이드 서열의 종 상동체 및 대립유전자 변이체를 수득하는데 적용된다.

변이체 및 균주/종 상동체는 또한 본 발명의 서열 내의 보존된 아미노산 서열을 인코딩하는 변이체 및 상동체 내에 서열을 타겟하도록 고안된 프라이머를 이용할 퇴화(degenerate) PCR을 이용하여 수득된다. 보존된 서열은 예를 들어 여러 변이체/상동체로부터 아미노산을 정렬함으로서 예측될 수 있다. 서열 정렬은 당 분야에서 잘 알려진 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어GCG Wisconsin Pileup 프로그램이 널리 사용된다. 퇴화 PCR에서 사용된 프라이머는 하나 또는 그 이상의 퇴화 위치를 포함할 것이고, 잘 알려진 서열에 대한 단일 서열 프라이머로 서열을 클로닝하는데 사용된 것보다 더 낮은 스트린젠시 조건에서 사용될 것이다.

또한 이러한 뉴클레오타이드 서열은 본 발명의 서열목록의 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 8 또는 서열번호 15 내에 나타난 뉴클레오타이드 서열과 같이 특성화된 서열의 사이트 다이렉티드(directed) 돌연변이화에 의해 수득된다. 이는예를 들어 뉴클레오타이드 서열이 발현되는 특정한 숙주 세포에서 사일런트 코돈 변화가 코돈 선호도를 최적화하는데 필수적인 곳에서 유용하다. 다른 서열 변화는 제한 효소 인식 사이트를 도입하거나 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코드된 ScFv Ab의 결합 특이성을 변화시키기 위해 요구된다.

본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 프라이머 즉, PCR 프라이머, 또다른 증폭 반응을 위한 프라이머, 프로브 즉, 방사성동위원소 또는 비-방사성동위원소 표지를 이용한 전통적인 수단에 의한 노출 표지로 표지된 것을 생산하는데 사용되거나 뉴클레오타이드 서열은 벡터 내로 클론된다. 이러한 프라이머, 프로브 및 다른 단편은 적어도 길이로 15개 이상, 바람직하게는 적어도 20개 이상, 예를 들어 적어도 25, 30 또는 40개 뉴클레오타이드가 될 것이고, 또한 여기에 사용된 바와 같이 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 용어에 의해 포함된다.

본 발명에 따른 DNA 폴리뉴클레오타이드 및 프로브와 같은 뉴클레오타이드 서열은 재조합적으로, 합성적으로, 또는 당업자에게 유용한 어떠한 방법에 의해서도 생산된다. 이는 또한 표준 기술에 의해 클론된다.

일반적으로 프라이머는 한번에 원하는 핵산 서열을 하나의 뉴클레오타이드로 하는 단계적인 제조를 포함하는 합성적 수단에 의해 생산될 것이다. 자동화된 기술을 이용한 이를 수행하기 위한 기술은 당 분야에 용이하게 유용하다.

더 긴 뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 예를 들어 PCR(중합효소 연쇄 반응) 클로닝 기술과 같은 재조합 수단을 이용하여 생산될 것이다. 이는 클론하기를 원하는 타켓팅 서열의 측면에 위치한 프라이머 쌍을 만들고(즉, 약 15 내지 30 뉴클레오타이드), 동물 또는 인간 세포로부터 수득된 mRNA 또는 cDNA와 프라이머를 접촉시키고, 원하는 구역의 증폭을 야기시키는 조건 하에서 중합효소 연쇄 반응을 수행하고, 증폭된 단편을 분리하고(즉, 아가로스 겔 상에서 반응 혼합물을 정제함으로서), 증폭된 DNA를 회수하는 것을 포함한다. 프라이머는 적당한 제한 효소 인식 사이트를 포함하여 증폭된 DNA가 적당한 클로닝 벡터 내로 클론될 수 있게된다.

유전적 코드의 유전적 퇴화에 기인하여 실질적으로 동일하거나 기능적으로동등한 아미노산 서열을 인코드하는 다른 DNA 서열이 ScFv Ab을 클론하고 발현하는데 사용된다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 이는 비-자연발생적인 코돈을 포함하는 서열을 인코딩하는 ScFv Ab을 생산하는데 유리하다. 특정한 원핵세포 또는 진핵세포 숙주에 바람직한 코돈이 ScFv Ab의 비율을 증가시키도록 또는 자연 발생적인 서열로부터 생산된 전사체 보다 더 긴 반감기를 지닌 것과 같은 원하는 성질을 지닌 재조합 RNA 전사체를 생성하도록 선택될 수 있다.

본 발명의 하나의 실시태양에서 ScFv Ab는 재조합 ScFv Ab이다.

바람직하게는 재조합 ScFv Ab는 유전적 벡터를 이용하여 준비된다.

벡터

당 분야에서 잘 알려진 바와 같이 벡터는 하나의 환경에서 다른 환경으로의 실체의 트랜스퍼를 가능하게 하고 촉진시키는 수단이다. 본 발명에 따라 또한 예로서 재조합 DNA 기술에서 사용된 일부 벡터는 DNA 세그먼트와 같은(이형적 DNA 세그먼트와 같은, 이형적 cDNA 세그먼트와 같은) 실체가 본 발명의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 벡터를 복제하고/또는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코드된 본 발명의 단백질을 발현하는 목적으로 숙주 및/또는 다켓 세포 내로 트랜스퍼되는 것이 가능하게 한다. 재조합 DNA 기술에서 사용된 벡터의 예는 플라스미드, 염색체, 인공 염색체 또는 바이러스를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

"벡터"라는 용어는 발현 벡터 및/또는 형질전환 벡터를 포함한다.

"발현 벡터"라는 용어는 생체 내에서 또는 실험실 내에서의 발현이 가능한 구조물을 의미한다.

"형질전환 벡터"라는 용어는 하나의 종에서 다른 종으로 트랜스퍼되는 것이 가능한 구조물을 의미한다.

"네이키드 DNA"

바이러스성 감염에 영향을 미치는데 사용되기 위해 본 발명의 ScFv Ab을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 벡터는 "네이키드 핵산 구조물"로서 직접적으로 투여되고, 바람직하게는 숙주 세포 게놈에 상동적인 측면의 서열로 더욱 구성된다.

여기 사용된 바와 같이 "네이키드 DNA"라는 용어는 그의 생성을 제어하는 짧은 프로모터 구역과 함께 본 발명의 ScFv Ab를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 플라스미드를 나타낸다. 플라스미드가 어떤 전달 비히클 내에서도 운반되지 않기 때문에 "네이키드" DNA라고 불린다. 이러한 DNA 플라스미드가 숙주 세포 내로 진입하면 인코드하는 단백질(ScFv Ab과 같은)은 세포내에서 전사되고, 번역된다.

비-바이러스성 전달

또한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 벡터는 세포감염, 형질전환, 일렉트로포레이션(electroporation) 및 바이오리스틱(biolistic) 형질전환과 같은 당 분야에 잘 알려진 다양한 비-바이러스성 기술을 이용하여 적당한 숙주 세포 내로 도입된다.

여기에 사용된 바와 같이 "형질전환"이라는 용어는 타겟 포유류 세포로 유전자를 전달하는 비-바이러스성 벡터를 이용한 과정을 나타낸다.

일반적인 세포감염 방법은 일렉트로포레이션, DNA 바이오리스틱, 액체-매개 세포감염, 압축된 DNA-매개 세포감염, 리포솜(liposome), 면역리포솜, 리포펙틴(lipofectin), 양이온제-매개, 양이온성 페이셜(facial) 암피필(amphiphile)(CFAs)(Nature Biotechnology 1996 14:556), 스퍼민(spermine)과 다가 양이온, 양이온성 리피드 또는 폴리리신(polylysine), 1,2-bis(올레오일록시(oleoyloxy)-3-(트리메틸아미노)프로판(DOTAP)-콜레스테롤 복합물(Wolff andTrubetskoy 1998 Nature Biotechnology 16:421) 및 그의 조합을 포함한다.

포유류 세포에 의한 네이키드 핵산 구조물의 업테이크(uptake)는 예를 들어 세포감염제의 이용을 포함한 일부 알려진 세포감염 기술에 의해 강화된다. 이러한 약제의 예는 양이온제(예를 들어 인산칼슘 및 DEAE-덱스트란) 및 리포펙탄트(lipofectant)(예를 들어 리포펙탐^TM및 트랜스펙탐^TM)을 포함한다. 일반적으로 핵산 구조물은 조성물을 생성하는 세포감염제와 혼합된다.

바이러스성 벡터

또한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 벡터는 예를 들어 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스(simplex) 바이러스 및 아데노바이러스와 같은 재조합 바이러스성 벡터로의 감염과 같은 잘 알려진 다양한 바이러스성 기술을 이용하여 적당한 숙주 세포 내로 도입된다.

바람직하게는 벡터는 재조합 바이러스성 벡터이다. 적당한 재조합 바이러스성 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-결합 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스-바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 폭스(pox) 바이러스 벡터 또는 파르보바이러스(parvovirus) 벡터를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다(Kestler et al 1999 Human Gene Ther 10(10):1619-32 참조). 바이러스 벡터의 경우 유전자 전달은 타겟 세포의 바이러스 감염에 의해 매개된다.

레트로바이러스 벡터

레트로바이러스의 예는 : 쥐과 백혈병 바이러스(MLV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 말과 감염성 빈혈증 바이러스(EIAV), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 로우스(Rous) 육종 바이러스(RSV), 후지나미(Fujinami) 육종 바이러스(FuSV), 몰로니(Moloney) 쥐과 육종 바이러스(Mo-MSV), 아벨슨(Abelson) 쥐과 백혈병 바이러스(A-MLV), 조류 미엘로시토마토시스(myelocytomatosis) 바이러스-29(MC29), 및 조류 적아세포증 바이러스(AEV)를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

본 발명에 따라 사용되기 위한 바람직한 벡터는 재조합 바이러스 벡터, 특히 렌티바이러스 벡터와 같은 재조합 레트로바이러스 벡터(RRV)이다.

"재조합 레트로바이러스 벡터"(RRV)라는 용어는 팩키지 구성성분의 존재시 RNA 게놈을 타겟 세포를 감염시키는 것이 가능한 바이러스 입자 내로 팩키지하는 것을 가능하게 하도록 충분한 레트로바이러스 게놈 정보를 지닌 벡터를 나타낸다. RRV는 벡터에 의해 타겟 세포로 전달되는 비-바이러스성 코딩 서열을 운반한다. RRV는 최종 타겟 세포 내에서 감염성 레트로바이러스 입자를 생산하는 독립적 복제가 불가능하다. 일반적으로 RRV는 복제에 기능적인 gag-pol 및/또는 env 유전자 및/또는 다른 복제에 필수적인 유전자가 없다. 본 발명의 벡터는 스플리트(split)-인트론 벡터로서 형상화된다. 스플리트-인트론 벡터는 PCT 특허 출원 WO 99/15683 내에 기술되어 있다.

레트로바이러스의 상세한 목록은 Coffin et al("Retrovirus" 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp758-763)에 나타나 있다.

렌티바이러스 벡터

렌티바이러스는 영장류 및 비-영장류 그룹으로 나뉠 수 있다. 영장류 렌티바이러스의 예는 : 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 자가-면역결핍 증후군(AIDS)의 유발 작용제 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 비-영장류 렌티바이러스 그룹은 프로토타입(prototype) "슬로우(slow) 바이러스" 비스타(visna)/매디(maedi) 바이러스(VMV) 뿐만 아니라 관련된 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV), 말과 감염성 빈혈증 바이러스(EIAV) 및 더욱 최근에 기술된 고양이과 면역결핍 바이러스(FIV) 및 소과 면역결핍 바이러스(BIV)를 포함한다.

렌티바이러스계와 다른 타입의 레트로바이러스 사이의 차이는 렌티바이러스가 분열 및 비-분열 세포 모두를 감염시킬 수 있는 능력을 지닌다는 점이다(Lewis et al 1992 EMBO. J. 11:3053-3058; Lewis and Emerman 1994 J. Virol. 68:510-516). 반대로 다른 레트로바이러스 - MLV와 같은 - 는 예를 들어 근육, 뇌, 폐 및 간 조직을 이루는 세포와 같은 비-분열 세포를 감염시킬 수 없다.

아데노바이러스

본 발명의 실시태양에서 아데노바이러스의 특징은 타겟 세포가 이웃 세포를 안정하게 감염시키는 것이 가능한 일시적인 레트로바이러스 생산자 세포가 되도록 형질도입하는데 사용될 수 있는 레트로바이러스/렌티바이러스의 유전적 안정성과 결합된다. 이러한 본 발명의 ScFv Ab를 발현하도록 설계된 레트로바이러스 생산자 세포는 암과 같은 질병 치료에 사용되기 위해 동물 또는 인간과 같은 생물체 내로 이식될 수 있다.

폭스 바이러스

본 발명에 따라 사용되기 위한 바람직한 벡터는 가금류 폭시 바이러스(FPV), 엔토모폭스(entomopox) 바이러스, NYVAC와 같은 백시니아(vaccinia) 바이러스, 카나리폭스(canarypox) 바이러스, MVA 또는 WO 95/30018 내에 예로 기술된 것과 같은다른 비-복제 바이러스 벡터 시스템이다.

하이브리드 바이러스성 벡터

더욱 넓은 관점에서 본 발명은 본 발명의 ScFv Ab를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 생체 내에서의 전달을 위한 하이브리드 바이러스성 벡터 시스템을 제공하고, 시스템은 두 번째 바이러스 벡터를 인코드하는 하나 또는 그 이상의 첫 번째 바이러스 벡터로 구성되고, 첫 번째 바이러스 벡터 또는 벡터들은 첫 번째 타겟 세포를 감염시키는 것이 가능하고 이에 따라 두 번째 타겟 세포를 형질도입하는 것이 가능한 두 번째 바이러스 벡터를 발현한다.

바람직하게는 첫 번째 벡터는 아데노바이러스 벡터르부터 수득가능하거나 또는 이에 기초를 두고/또는 두 번째 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터로부터 수득되거나 또는 이에 기초를 둔다.

타겟된 벡터

세포를 감염시키고/세포감염시키고/형질도입하는 능력 또는 숙주 및/또는 타겟 세포 내에서 발현되는 능력이 세포가 일반적이거나 유사한 표현형을 지닌 숙주 생물체 내에서 특정한 세포 타입에 제한되는 벡터를 나타낸다.

복제 벡터

본 발명의 ScFv Ab를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 재조합 복제가능 벡터 내로 도입된다. 벡터는 양립가능한 숙주 세포 내에서 뉴클레오타이드 서열을 복제하는데 사용된다. 따라서 본 발명의 하나의 실시태양에서 본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 복제가능 벡터 내로 도입시킴으로서 본 발명의 ScFv Ab를 만들고, 양립가능한 숙주 세포 내로 벡터를 도입시키고, 또한 벡터의 복제를 유발하는 조건 하에서 숙주 세포를 생장하는 방법을 제공한다. 벡터는 숙주 세포로부터 회수된다.

발현 벡터

바람직하게는 벡터 내로 삽입되는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포에 의해 본 발명의 ScFv Ab의 코딩 서열과 같은 코딩 서열의 발현을 제공하는 것이 가능한 제어 서열에 실시 가능하게 연결된다, 즉 벡터는 발현 벡터이다. 숙주 재조합 세포에 의해 생성된 ScFv Ab는 분비되거나 사용되는 서열 및/또는 벡터에 따라 세포내적으로 포함된다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 ScFv Ab 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터는 특정한 원핵세포막 또는 진핵세포막을 통해 ScFv Ab 코딩 서열의 분비를 지시하는 시그날 서열로 디자인된다.

실험실 내에서의 발현

하기에 기술된 바와 같이 본 발명의 벡터는 본 발명의 ScFv Ab의 발현을 제공하기 위해 적당한 숙주 세포 및/또는 타겟 세포 내로 형질전환되거나 세포감염된다. 이러한 과정은 ScFv Ab를 인코딩하는 코딩 서열의 벡터에 의한 발현을 제공하는 조건 하에서 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및/또는 타겟 세포를 배양하고, 선택적으로는 발현된 ScFv Ab를 회수하는 것으로 구성된다. 벡터는 예를 들어 복제의 오리진(origin), 선택적으로는 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 위한 프로모터, 선택적으로는 프로모터의 조절자가 제공된 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. 벡터는 하나 또는 그 이상의 선택가능한 마커 유전자, 예를 들어 박테리아 플라스미드의 경우 암피실린(ampicillin) 저항성 유전자 또는 포유류 벡터의 경우 네오마이신(neomycin) 저항성 유전자를 포함한다. 본 발명의 ScFv Ab의 발현은 보존적이어서 계속적으로 생산되거나 또는 유도가능하여 발현을 개시하는 자극을 필요로 한다. 유도가능한 발현의 경우 ScFv Ab 생성은 예를 들어 예를 들어 덱사메타손(dexamethasone) 또는 IPTG와 같은 배양 배지로의 인듀서(inducer) 물질의 첨가에 의해 필요시 개시될 수 있다.

ScFv Ab 구조물

융합 단백질

본 발명의 ScFv Ab는 또한 예를 들어 추출 및 정제를 돕는 융합 단백질로서 생성된다. 융합 단백질 파트너의 예는 글루타티온(glutathione)-S-트랜스퍼라제(transferase)(GST), 6xHis, GAL4(DNA 결합 및/또는 전사 활성화 도메인) 및 β-갈락토시다제를 포함한다. 융합 단백질 파트너의 다른 예는 상대적으로 큰 동시-단백질이고, 그의 생성 정제를 해결하고 촉진시키는,Haemophilus influenzae로부터의 GST, β-갈락토시다제 또는 리포프로틴 D와 같은 항원성 동시-단백질로 구성된 융합된 재조합 ScFv Ab 단백질을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 또한 융합 단백질은 소 혈청 알부민(BSA) 또는 키홀(keyhole) 림펫(limpet) 헤모시아닌(haemocyanin)(KLH)과 같은 캐리어 단백질로 구성된다. 본 발명의 특정한 실시태양에서 마커 서열은 pQE 벡터 내에 제공된 바와 같고(Qiagen Inc), Gentz et al(1989 PNAS 86:821-824) 내에 기술된 바와 같이 헥사-히스티딘 펩티드이다. 이러한 융합 단백질은 효모 배양 내에서 용이하게 발현가능하고, 어피니티 크로마토그래피에 의해 용이하게 정제된다.

다른 재조합 구조는 ScFv Ab 코딩 서열을 용해성 단백질의 정제를 촉진시키는 폴리펩티드 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결시킨다(Kroll DJ et al 193 DNA Cell Biol 12:441-53). 이러한 정제 촉진 도메인은 고정된 금속 상에서 정제를 가능하게 하는 히스티딘-트립토판 모듈(Porath J 1992 Protein ExprPurif 3-.26328 1), 고정된 면역글로블린 상에서 정제를 가능하게 하는 단백질 A 도메인 및 FLAGS 확장/어피니티 정제 시스템(Immunex Corp, Seattle, WA) 내에 이용되는 도메인을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

융합 단백질 서열의 제거를 가능하게 하기 위해 융합 단백질 파트너와 목적 단백질 서열 사이의 단백질가수분해 분열을 포함하는 것이 편리하다. 예로서 융합 단백질은 또한 ScFv Ab 인코딩 뉴클레오타이드 서열과 이형적 단백질 서열 사이에 위치한 분열 사이트를 포함하여 ScFv Ab가 분열되고, 이형적 반족(moiety)으로부터 정제되도록 설계된다. 정제 도메인과 ScFv Ab 사이에 Factor XA 또는 엔테로키나제(Invitrogen, San Diego, CA)와 같은 분열가능한 링커(linker) 서열의 포함은 정제를 촉진시키는데 유용하다. 바람직하게는 융합 단백질은 본 발명의 아미노산 서열로 구성된 ScFv Ab의 결합 특이성을 방해하지 않을 것이다.

하나의 바람직한 실시태양에서 융합 단백질은 분비된 동시-자극성 분자(SCM)으로 구성되거나 이를 인코드한다.

SCM 융합 단백질

본 발명의 분비된 동시-자극성 분자(SCM)는 포유류 세포로부터의 분비를 위한 시그날 펩티드로 구성되고, 면역 시스템의 세포에 동시-자극성 시그날로 역할하는 적어도 하나 이상의 도메인으로 더욱 구성된 설계된 융합 단백질이다. 다른 동시-자극성 도메인을 함유한 SCMs 조합의 이용도 또한 관찰된다. SCMs로 구성된 ScFv Ab는 치료되는 개인의 자가 이식 세포 내의 SCM-인코딩 유전자의 발현에 의해 생성되어 숙주 세포에 의해 단백질에 첨가된 후-번역적 변형이 분명해지고, 충분히 기능적인 단백질 및 적당한 파마코키네틱스(pharmacokinetics)를 제공한다.

WO-A-92-00092는 번역 종결 코돈을 트랜스멤브레인(transmembrane) 도메인 전에 위치시킴으로서 유도되고, 포유류 세포로부터 분비된 B7-1의 절단된 형태를 기술하였다. 특정한 경우 옹코스테인 M 유전자로부터의 이형적 시그날 펩티드가 사용되었다. 또한 WO-A-92-00092는 면역글로블린의 Fc 구역으로 융합된 B7-1의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질을 기술하였다. 이러한 분자는 T-세포 상에서 CD28에 결합할 수 있고, T-세포 증식을 자극시킨다. 그러나 이러한 자극은 B7 또는 B7-유도체가 고형 표면 상에 고정되지 않으면 보통 정도만 발생한다.

Gerstmayer et al.(1997 J. Immunol. 158:4584-4590)은 효모Pichia pastoris내에서 발현될 때 분비된 myc 에피토프 태그 및 폴리히스티딘 태그(tag)가 뒤따르는, ErbB2에 특이적인 ScFv에로의 B7-2의 융합을 기술하였다. 이러한 분자는 항원의 결합 및 PMA 및 IL-2로 미리자극된 동시-자극된 T-세포 증식을 유지한다. 그러나 이러한 분자의 글리코실레이션(glycosylation)은 효모 타입이고, 이는 인간의 부적절한 파마코키네틱스를 이끌기 쉽다.

본 발명에 따라 어떤 적당한 동시-자극성 도메인(들)도 사용된다. 예로서 동시-자극성 도메인은 B7-1, B7-2 및 B7-3 또는 CD2/LFA-3, LFA-1/ICAM-1 및 ICAM-3을 포함하는 동시-자극성 수용체-리간드 분자와 같으나 이에 한정적이지는 않는 다른 동시-자극성 세포 표면 글로코프로틴을 포함하여 세포-표면 글리코프로틴의 B7계이 세포외 부분으로부터 선택될 수 있다. 연구는 단핵세포에 의한 T 세포 동시-자극이 각 2개의 수용체 리간드 경로 CD2/LFA-3, LFA-1/ICM-1에 의존적이이라는 것을 기술하였다(Van Seventer et al 1991 Eur J Immunol 21:1711-1718). 더욱이 ICAM-3, 세 번째 LFA-1 대응수용체(counterreceptor)가 휴지하고, 활성화된 T 림파구를 위한 동시-자극성 분자라는 것을 나타낸다(Hernandez-Caselles et al 1993 Eur J Immunol 23:2799-2806).

다른 가능한 동시-자극성 분자는 인게이지되면(engaged) CD28-독립적 방식으로 T-세포 확장을 증가시키고 Th0/Th1 시토킨 생성 프로파일을 유도하는 것으로 확인된 SLAM으로 명명된 신규한 글리코프로틴 수용체를 포함한다(Cocks et al 1995 Nature 376:260-263).

또한 CD6, 세포 표면 글리코프로틴은 T 세포 상에서 동시-자극성 및 부착 수용체로서 기능을 하는 것으로 나타났다. 4개의 CD6 이소폼(isoform)(CD6a, b, c, d)이 기술되었다(Korbarg et al 1997 Eur J Immunol 27:2971-2980). 인간 메모리B 세포의 활성화에서의 매우 최근의 항원(VLA-4) 인테그린(integrin)도 논의되었다(Silvy et al 1997 Eur J Immunol 27:2757-2764). 내피 세포도 또한 활성화된 CD4+ T 세포의 표현형에 영향을 미치는 유일한 동시-자극성 시그날을 제공한다(Karmann et al 1996 Eur J Immonol 26:610-617). 리포폴리사카리드(polysaccharide)-활성화된 B 세포 상에 존재하고, 인터루킨-4(IL-4) 및 IL-5 및 미량의 IL-2 및 인터페론 감마(interferon gamma)의 우세한 방출을 이끄는 휴지 T 세포에 동시-자극을 제공할 수 있는 B3 단백질이 기술되었다(Vinary et al 1995 J Biol Chem 270:23429-23436). T 세포 및 종양 세포 상의 신규한 동시-자극성 T 세포 항원의 동시-발현은 이들 세포의 일반적인 성질에 관련된 가능한 기능을 제안하였다(Labuda et al 1995 Int Immunol 7:1425-1432).

본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서 동시-자극성 도메인은 B7-1 또는 B7-2의 일부, 바람직하게는 B7-1 또는 B7-2의 완전한 세포외 일부분이다.

바람직한 실시태양에서 본 발명의 ScFv Ab는 DAM 결합 도메인 또는 도메인들 및 동시-자극성 도메인 또는 도메인들을 포함한 융합 단백질을 인코딩하는 신규한 유전자의 발현에 의해 형성된다. 본 발명에서 동시-자극성 도메인은 ScFv로 융합된다. 도메인은 다음과 같은 순서(N-말단에서 C-말단)로 위치될 수 있다 : 항원-결합 도메인 다음에 동시-자극성 도메인; 또는 동시-자극성 도메인 다음에 항원-결합 도메인. 바람직하게는 동시-자극성 도메인은 항원-결합 도메인이 뒤따르는 N-말단에 위치한다. 시그날 펩티드는 N-말단에 포함되고, 예를 들어 동시-자극성 세포외 도메인의 자연적 시그날 펩티드이다. 다른 도메인은 그의 구조를 촉진시키는 신규한 유전자 내의 편리한 제한-효소 분열 사이트의 포함으로부터 초래되거나 도메인들 사이에서 펩티드 스페이서(spacer)로 역할을 하거나 유연성있는 펩티드 링커로서 역할을 하거나 또다른 기능을 제공하는 부가적인 서열에 의해 분리된다. 바람직하게는 도메인은 유연성있는 링커에 의해 분리된다.

다른 SCM을 인코딩하는 2 또는 그 이상의 다른 유전자가 증가된 동시-자극 또는 원래의 T 세포의 동시-자극 및 메모리 반응의 유도 모두를 달성하는데 사용된다. 예를 들어 B7-1 세포외 도메인을 함유한 SCM을 인코딩하는 유전자가 B7-2 세포외 도메인을 함유한 SCM을 인코딩하는 유전자와 함께 투입된다.

SCFV 항체 생성의 정량화

마커 유전자 발현의 존재/부재가 뉴클레오타이드 서열 및/또는 그의 ScFv Ab의 존재를 역시 나타내나 그의 존재 및 발현은 통상의 수단에 의해 확인된다. 예를 들어 뉴클레오타이드 서열을 인코딩하는 ScFv Ab가 마커 유전자 서열 내로 삽입되면 ScFv Ab 코딩 구역을 함유한 재조합 세포는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 확인된다. 또한 마커 유전자는 시그날 프로모터의 제어 하에서 뉴클레오타이드서열을 인코딩하는 ScFv Ab와 제휴하여 위치된다. 일반적으로 유도 또는 선택에 반응하는 마커 유전자의 발현은 ScFv Ab의 발현도 나타낸다.

특정한 분자의 발현을 정량화하는 부가적인 방법은 방사성동위원소표식 뉴클레오타이드(Melby PC et al 1993 J Immunol Methods 159:235-44) 또는 바이오티닐레이팅(biotinylating) 뉴클레오타이드(Duplaa C et al 1993 Anal Biochem 229-36), 대조군 핵산의 동시증폭 및 실험 결과가 기입된 표준 곡선을 포함한다. 다수 표본의 정량화는 목적 ScFv Ab가 다양한 희석비율로 존재하고, 분광도 또는 열량측정 반응이 빠른 정량화를 부여하는 ELISA 포맷 내에서 에세이를 수행함으로서 가속화된다.

숙주/타겟 세포

본 발명의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 숙주 및/또는 타겟 세포는 실험실 내, 생체 내 및 생체 외 조건하에 본 발명의 ScFv Ab를 발현하는데 이용된다.

"숙주 세포 및/또는 타겟 세포"라는 용어는 벡터가 세포감염시키거나 형질도입시키는 것이 가능한 적당한 숙주로부터 유도될 수 있는 세포를 포함한다. 숙주 및/또는 타겟 세포의 예는 실험실 내, 생체 내 및 생체 외 조건하에 본 발명의 ScFv Ab를 발현하는 것이 가능한 세포를 포함할 수 있으나 이에 한정적인 것은 아니다. 이러한 세포의 예는 대식세포, 내피세포 또는 그의 조합을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 더한 예는 호흡 에어웨이(airway) 상피 세포, 간세포, 근육세포, 심장 근세포, 활막세포(synoviocyte), 초기 포유류 상피 세스(cess) 및 대식세포 및/또는 뉴런(neuron)과 같은 후-유사분열 종말 분화 비-복제 세포를 포함한다.

바람직한 실시태양에서 세포는 포유류 세포이다.

매우 바람직한 실시태양에서 세포는 인간 세포이다.

"생물체"라는 용어는 적당한 생물체를 포함한다. 바람직한 실시태양에서 생물체는 포유류이다. 매우 바람직한 실시태양에서 생물체는 인간이다.

본 발명의 ScFv Ab가 숙주 세포로서 원핵세포를 이용하여 생성되더라도 포유류 세포 내에서 예를 들어 효모, 곤충 또는 포유류 세포와 같은 진핵세포를 이용하는 것이 바람직하다. 적당한 숙주 세포는 E. coli과 같은 박테리아, 효모, 포유류 세포주 및 예를 들어 곤충 Sf9 세포와 같은 다른 진핵 세포주를 포함한다.

또한 본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열(들)로 숙주 및/또는 타겟 세포를 형질전환하는 것으로 구성된 방법을 제공한다.

"형질전환된 세포"라는 용어는 변형된 유전적 구조를 지닌 숙주 세포 및/또는 타겟 세포를 의미한다. 본 발명에서 세포는 본 발명에 따른 벡터가 세포 내로 도입될 때 변형된 유전적 구조를 지닌다.

숙주 세포 및/또는 타겟 세포는 본 발명의 ScFv Ab의 발현을 가능하게 하는 적당한 조건 하에서 배양된다.

또한 본 발명은 형질전환된 숙주 세포 - 상기 뉴클레오타이드 서열(들)에 의해 인코드된 ScFv Ab의 발현에 적당한 조건 하에서 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열(들)로 형질전환된 세포 - 를 배양하는 것으로 구성된 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 형질전환된 숙주 세포 - 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열(들) 또는 그의 유도체, 상동체, 변이체 또는 단편으로 형질전환된 세포 - 를 상기 뉴클레오타이드 서열(들)에 의해 인코드된 ScFv Ab의 발현에 적당한 조건 하에서 배양하고; 형질전환된 숙주 세포 배양액으로부터 상기 ScFv Ab를 회수하는 것으로 구성된 방법을 제공한다.

본 발명의 ScFv Ab는 효소적, 화학적 및/또는 삼투적 분해 및 생리적 파열을 포함한 당 분양에 알려진 다양한 기술에 의해 숙주 세포로부터 추출될 수 있다.ScFv Ab는 원래 알려진 방식으로 정제되고 분리된다.

실험실 내/생체 내/생체 외 발현의 조절

또한 본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열(들)을 인코딩하는 ScFv Ab가 실험실 내/생체 내/생체 외에서 조절되는 유전적 치료를 포함한다. 예를 들어 발현 조절은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열(들)을 인코딩하는 ScFv Ab에 결합하거나 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 인코딩하는 ScFv Ab과 결합된 구역 또는 전사 또는 번역의 속도를 변형시키는 그에 상응하는 RNA 전사체를 제어하는 투여 화합물에 의해 달성된다.

제어 서열

본 발명의 ScFv Ab를 인코딩하는 서열에 실시가능하게 연결된 제어 서열은 프로모터/인핸서 및 다른 발현 조절 시그날을 포함한다. 이러한 제어 서열은 벡터가 이용되도록 고안된 숙주 세포 및/또는 타겟 세포와 양립할 수 있도록 선택된다. 제어 서열은 예를 들어 전사 레벨을 전사 조절자에 더욱 반응적인 제어 서열에 의해 지시되도록 하는 전사 조절적 요소의 더한 첨가에 의해 변형된다.

실시가능하게 연결됨

"실시가능하게 연결된"이라는 용어는 기술된 구성성분이 그들의 의도된 방식대로 기능하는 것을 가능하게 하는 관계에 있는 것을 의미한다. 코딩 서열에 "실시가능하게 연결된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 제어 서열과 양립할 수 있는 조건 하에서 달성되도록 결찰된다.

바람직하게는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 전사체 단위에 연결된다.

여기 기술된 "전사체 단위(들)"이라는 용어는 다른 어떤 코딩 서열과도 독립적으로 코딩 서열의 발현을 달서하기 위한 코딩 서열 및 시그날을 포함한 핵산의 구역이다. 따라서 일반적으로 각각의 전사체 단위는 적어도 프로모터, 선택적 인핸서 및 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 시그날로 구성된다.

프로모터

프로모터라는 용어는 당 분야에서 잘 알려진 것이고, RNA 중합효소 결합 사이트로 당 분야에서 일반적인 의미로 사용된다. 이 용어는 최소한의 프로모터에서 상위 요소 및 인핸서를 포함하는 프로모터까지 크기 및 복잡성에 이르는 핵산 구역을 포함한다.

다른 진핵세포 내에서 기능적인 원핵세포 프로모터 및 프로모터들이 이용되더라도 프로모터는 일반적으로 포유류 세포 내에서 기능적인 프로모터로부터 선택된다. 일반적으로 프로모터는 바이러스 또는 진핵세포 유전자의 프로모터 서열로부터 유도된다. 예를 들어 발현이 발생하는 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터이다. 진핵세포 프로모터에 있어서, 이는 편재하는 방식으로(α-액틴, β-액틴, 튜블린(tublin과 같은) 또는 또한 조직-특이적인 방식으로(피루베이트 키나제(pyruvate kinase)의 유전자의 프로모터와 같은) 기능하는 프로모터이다.

저산소성 프로모터/인핸서

인핸서 및/또는 프로모터는 저산소성 또는 국소 빈혈적 또는 낮은 포도당 환경에서 우선적을 활성적이어서 뉴클레오타이드 서열(들)을 인코딩하는 ScFv Ab이 종양, 관절염 관절 또는 국소 빈혈의 다른 사이트의 환경과 같이 목적 특정 조직 내에서 우선적을 발현된다. 따라서 치료받는 개인에서 뉴클레오타이드 서열(들)을 인코딩하는 ScFv Ab의 유의적인 생물적 효과 또는 해로운 효과는 감소되거나 제거된다. 인핸서 요소 또는 조절된 발현을 부여하는 다른 요소는 다중 카피(copy)로 존재한다. 이와 같이 또는 이에 더하여 인핸서 및/또는 프로모터는 하나 또는 그 이상의 특이적인 세포 타입 - 하나 또는 그 이상의 대식세포, 내피세포 또는 그의 조합과 같은 - 내에서 우선적으로 활성적이다. 더한 예는 근육세포, 심장 근세포, 활막세포, 초기 포유류 상피세포 및 대식세포 및/또는 뉴런과 같은 후-유사분열 종말 분화 비-복제 세포를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

조직-특이적 프로모터

본 발명의 프로모터는 조직-특이적 프로머터이다. 적당한 조직 제한된 프로모터/인핸서의 예는MUC1유전자,CE4유전자 또는5T4항원 유전자로부터의 프로모터/인핸서와 같은 종양 세포 내에서 매우 활성적인 것이다. 시간적으로 제한된 프로모터/인핸서의 예는 저산소 반응 요소 또는grp78 또는grp94 유전자의 프로모터/인핸서와 같이 국소 빈혈 및/또는 저산소에 반응적인 것이다. 알파 페토프로틴(fetoprotein)(AFP) 프로모터는 또한 종양-특이적 프로모터이다. 하나의 바람직한 프로모터-인핸서 조합은 인간 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus)(fCMV) 주요한 매개 초기(MIE) 프로모터/인핸서 조합이다.

바람직하게는 본 발명의 프로모터는 조직 특이적이다. 즉, 이들은 다른 조직 타입 에서는 크게 "사일런트"로 유지되는 반면 하나의 조직 내에서 뉴클레오타이드 서열(들)을 인코딩하는 ScFv Ab의 전사를 이끄는 것이 가능하다.

"조직 특이적"이라는 용어는 단일 조직 타입의 활성에 제한적이지 않으나 그럼에도 불구하고 하나의 조직 그룹에서는 활성적이고, 또다른 그룹에서는 덜 활성적이거나 사일런트하다는 점에서 선택성을 나타내는 프로모터를 의미한다. 본 발명의 프로모터의 바람직한 특성은 타겟 조직 내에서 조차도 활성화된 저산소-조절된 인핸서 요소의 부재시 낮은 활성을 지닌다는 점이다. 이를 달성하는 하나의 수단은 저산소의 부재시 선택된 프로모터의 활성을 억제하는 "사일렌서(silencer)" 요소를 이용하는 것이다.

"저산소"라는 용어는 특정한 기관 또는 조직이 부적합한 산소 공급을 받는 조건을 의미한다.

특정한 프로모터의 제어 하에서 뉴클레오타이드 서열(들)을 인코딩하는 ScFv Ab의 발현 레벨은 프로모터 구역을 조작함으로서 조절된다. 예를 들어 프로모터 구역 내의 다른 도메인은 다른 유전자 조절 활성을 지닌다. 이러한 다른 구역의 역할은 일반적으로 특이적 구역이 삭제된 프로모터의 다른 변이체를 지닌 벡터 구조물을 이용함으로서 평가된다(즉, 삭제 분석). 이러한 접근은 예를 들어 조직 특이성을 부여하는 것이 가능한 가장 작은 구역 또는 저산소 민감성을 부여하는 가장 작은 구역을 확인하는데 이용된다.

상기에 기술된 많은 조직 특이적 프로모터는 본 발명을 실용화시키는데 특히 유리하다. 대부분의 경우 이러한 프로모터는 선택된 벡터 내에서 클로닝에 적당한 편리한 제한 분해 단편으로서 분리된다. 또한 프로모터 단편은 중합효소 연쇄반응을 이용하여 분리된다. 증폭된 단편의 클로닝은 프라이머의 5' 말단에서 제한 사이트를 통합함으로서 촉진된다.

유도가능한 프로모터

본 발명의 프로모터는 또한 예를 들어 스테로이드 호르몬 수용체에 결합하는 프로모터와 같이 특이적 자극에 반응하는 프로모터이다. 또한 예를 들어 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스 긴 말단 반복(MMLV LTR) 프로모터, 로우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터 또는 인간 시토메갈로바이러스(CMV) IE 프로모터와 같은 바이러스성 프로모터가 이용된다.

프로모터가 유도가능하여 이형적 유전자의 발현 레벨이 세포 수명 동안 조절될 수 있는 장점이 있다. 유도가능하다는 것은 프로모터를 이용하여 수득된 발현 레벨이 조절될 수 있다는 것을 의미한다.

인핸서

더욱이 이러한 프로모터는 예를 들어 인핸서 서열과 같은 조절 서열의 더한 첨가에 의해 변형된다. 또한 상기에 기술된 2 또는 그 이상의 다른 프로모터로부터의 서열 요소로 구성된 키메릭 프로모터가 이용된다.

"인핸서"라는 용어는 전사 개시 복합물의 다른 단백질 구성성분에 결합하고, 따라서 이의 결합된 프로모터에 의해 지시된 전사의 개시를 촉진시키는 DNA 서열을 포함한다.

본 발명의 ScFv Ab의 실험실 내/생체 내/생체 외 발현은 목적 단백질(POI) 또는 동일한 것을 인코딩하는 목적 뉴클레오타이드 서열(NOI)과의 조합으로 이용된다.

POIs/NOIs와의 조합

본 발명의 ScFv Ab 또는 동일한 것을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 예를 들어 타겟 세포 또는 타겟 조직으로 직접적으로 또는 벡터에 의해 전달하는 프로-드러그(pro-drug) 활성화 효소와 같은 POI와의 조합으로 이용된다. 그 대신에 또는 타겟 조직 내에서 선택적으로 발현될 뿐만 아니라 본 발명의 ScFv Ab 또는 동일한 것을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 프로-드로그 활성화 효소 또는 효소들과 같은 또다른 POI와의 조합 또는 프로-드로그 활성화 효소 또는 효소들을 인코드하는 목적 뉴클레오타이드 서열(NOI) 또는 NOIs와의 조합으로 이용된다. 이러한 프로-드로그 활성화 효소 또는 효소들은 개인이 적당한 프로-드로그 효소 또는 효소들이 활동하는 하나 또는 그 이상의 프로-드로그로 치료될 때까지 어떤 유의적인 효과 또는 해로운 효과를 지니지 않는다. 활성적인 POI 또는 동일한 것을 인코딩하는 NOI의 존재시 적당한 프로-드로그로의 개인의 치료가 종양 생장 또는 생존의 감소와 같이 질병 조건의 강화된 감소를 이끈다.

프로-드로그 POIs

프로-드로그 활성화 효소와 같은 POI는 암 치료를 위한 종양 사이트와 같은 질병 사이트로 전달된다. 각각의 경우 적당한 프로-드로그는 적당한 프로-드로그 활성화 효소와의 조합으로 환자를 치료하는데 사용된다. 적당한 프로-드로그는 ScFv Ab 또는 동일한 것을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 벡터와 컨쥬게이션(conjugation)되어 투여된다. 프로-드로그의 예는 : 인산에토포시드(etoposide phosphate)(알카리성 인산염을 지닌, Senter et al 1988 Proc Natl Acad Sci 85:4842-4846); 5-플로오로시토신(fluorocytosine)(시토신 디아미나제(cytosine deaminase을 지닌, Mullen et al 1994 Cancer Res 54:1503-1506); Doxorubicin-N-p-하이드록시페녹시아세트아마이드(hydroxyphenoxyacetamide)(페니실린-V-아미다제를 지닌, Kerr et al 1990 Cancer Immunol Immunother 31:202-206); Para-N-bis(2-클로로에틸(chloroethyl))아미노벤졸 글루타메이트(aminobenzyl glutamate)(카르복시펩티드 G2를 지닌); 세팔로스포린(Cephalosporin) 질소 머스타드 카바마이트(βb-락타마제);SR4233(P450 환원효소를 지닌); 간시클로버(Ganciclovir)(HSV 티미딘 키나제, Borrelli et al 1988 Proc Natl Acad Sci 85:7572-7576); 질소환원효소(nitoreductase)를 지닌 머스타드 프로-드로그 및 시클로포스파마이드(Cyclophosphamide)(P450을 지닌, Chen et al 1996 Cancer Res 56:1331-1340).

본 발명에 사용되는 적당한 프로-드로그 활성화 효소의 예는 5-플루오로-우라실 프로-드로그 캡세타빈(capcetabine) 및 펄툴론(furtulon)을 활성화시키는 티미딘 포스포릴라제; 간시클로버를 활성화시키는 헤르페스 심플렉스 바이러스로부터의 티미딘 키나제; 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide)와 같은 프로-드로그를 DNA 손상 작용제로 활성화시키는 시토크롬 P450; 및 5-플루오로시토신을 활성화시키는 시토신 디아미다제를 포함한다. 바람직하게는 인간 오리진을 활성화시키는 프로-드로그가 이용된다.

POIs 및 NOIs

본 발명에 이용되기 위한 적당한 목적 단백질(POIs) 또는 동일한 것을 인코딩하는 NOIs는 : 시토킨, 케모킨, 호르몬, 항체, 설계된 면역글로블린-유사 분자, 단일 체인 항체, 융합 단백질, 효소, 면역 동시-자극성 분자, 면역조절분자, 안티-센스 RNA, 타겟 단백질의 트랜스도미넌트한 음성 돌연변이체, 톡신(toxin), 조건적톡신, 항원, 종양 억제자 단백질 및 생장 인자, 막단백질, 혈관활성 단백질 및 펩티드, 항-바이러스성 단백질 및 리보자임 및 그의 유도체(수용체 그룹과 결합된 것과 같은)룰 인코딩하는 서열과 같으나 이에 한정적이지는 않은 치료적 및/또는 진단적 적용을 포함한다. 포함될 때 POIs 또는 동일한 것을 인코딩하는 NOIs는 일반적으로 리보자임(들)의 발현을 이끄는 프로모터 또는 하나 또는 그 이상의 특이적인 세포 타입과 같은 다른 프로모터 또는 프로모터들인 적당한 프로모터에 실시가능하게 연결된다.

방관자 효과

POI 및/또는 동일한 것을 인코딩하는 NOI는 세포로부터 분비되는 단백질이다. 또한 POI 발현 생성물은 분비되지 않고, 세포 내에서 활성적이다. 또한 POI 발현 생성물이 방관자(bystander) 효과기 또는 원거리 방관자 효과를 실시하는 것이 바람직하다; 즉 하나의 세포 내의 발현 생성물의 생성은 일반적인 표현형을 dwlsls 이웃하거나 멀리있는(즉, 정적인(metastatic)) 부가적인 관련된 세포의 사멸을 이끈다.

본 발명에서 암의 치료 또는 예방에 이용되기 위한 적당한 POIs 또는 동일한 것을 인코딩하는 NOIs는 : 타겟 세포를 파괴하고(예를 들어 리보소말 톡신), 종양 억제자(야생셩 p53과 같은); 항-종양 면역 메카니즘(시토킨, 동시-자극성 분자 및면역글로블린과 같은); 맥관형성의 억제자로 역할하는 단백질 또는 강화된 약물 민감성을 제공하고(프로-드로그 활성화 효소와 같은); 자연적 효과기 세포에 의한 타겟 세포의 파괴를 간접적으로 자극하는(예를 들어 면역 시스템을 자극하거나 전구체 물질을 타겟 세포(예를 들어 프로드로그 활성화 효소)을 파괴하는 독성 물질로 변환시키는 강한 항원) 단백질을 포함한다. 인코드된 단백질은 방관자 종양 세포를 파괴시킬 수 있고(예를 들어 항체-리보솜 톡신 융합 단백질), 방관자 종양 세포의 파괴를 간접적으로 자극하거나(예를 들어 면역 시스템 또는 국부 혈관 폐색을 유발하는 미리응고된 단백질을 자극하는 시토킨) 전구체 물질을 방관자 종양 세포를 파괴하는 독성 물질로 변환시킨다(즉 프로드로그를 확산성 드로그로 활성화시키는 효소).

또한 종양 존속을 위한 세포 유전자의 발현을 방해하는(예를 들어 Burkitts 내의 이상한myc전사체 또는 만성적 미엘로이드(myeloid) 백혈병 내의bcr-abl전사체에 대한) 안티센스 전구체 또는 리보자임을 인코딩하는 NOI(s)의 전달. 이러한 POIs 및/또는 동일한 것을 인코딩하는 NOIs의 조합의 이용이 관찰된다.

저산소 조절가능 치료 NOIs의 예는 PCT/GB95/00322(WO-A-9521927)에서 발견될 수 있다.

SCFV Ab 커플링

본 발명의 ScFv Ab는 표준 방법을 이용하여 다른 분자와 커플될 수 있다. ScFv Ab의 아미노기 및 카르복시기 말단은 예를 들어 통상의 기술(티로신 잔기 - 클로라민 T, 이오도겐(iodogen), 락토퍼옥시다제(lactoperoxidase); 리신 잔기 - Bolton-Hunter 시약)을 이용한 방사성동위원소표식과 같은 많은 기술로 동위원소적으로 및 비동위원소적으로 표지된다. 이러한 커플링 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 커플링 기술은 아미노, 설프히드랄(sulfhydral), 카르복실, 아마이드, 페놀 및 이미다졸(imidazole)를 포함하나 이에 한정적인 것은 아닌 아미노산 상에 유용한 기능적 그룹의 기초하에 선택된다. 이러한 커플링에 영향을 미치는데 사용된 다양한 시약은 다른 것 중에서 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 디아조화된 벤지딘(diazotized benzidine), 카르보디이미드(carbodiimide) 및 p-벤조퀴논(benzoquinoe)을 포함한다.

화학적 커플링

본 발명의 ScFv Ab는 동위원소, 효소, 캐리어 단백질, 세포독성 작용제, 형광 분자, 방사성동위원소성 뉴클레오타이드 및 이미지화/예측, 진단 및/또는 치료를 포함하나 이에 한정적이지 않은 다양한 적용을 위한 화합물에 화학적으로 커플된다. 커플링 반응의 효율성은 특이적 반응에 적당한 다른 기술을 이용하여 측정되었다. 예를 들어¹²⁵I를 지닌 ScFv Ab 펩티드의 방사성동위원소 표식은 매우 특이적인 활성의 클로라민 T 및 Na¹²⁵I를 이용하여 달성된다. 반응은 이성중아황산나트륨에 의해 종결되고, 혼합물은 일회용 컬럼 상에서 탈염된다. 표지된 펩티드는 컬럼으로부터 용출되고, 프랙션(fraction)이 수집된다. 알리쿼트(aliquote)가 각각의 프랙션으로부터 제거되고, 방사능이 감마 카운터에서 측정된다. 이러한 방법에서 반응하지 않은 Na¹²⁵I는 표지된 ScFv Ab로부터 분리된다. 가장 높은 특이성 방사능을 지닌 펩티드 프랙션은 ScFv Ab에 결합하는 능력의 분석과 같은 하위 사용을 위해 보관된다.

이미지화

짧은 수명의 동위원소로 표지된 본 발명의 ScFv Ab의 이용은 ScFv Ab 결합 사이트와 함께 종양을 위치시키기 위해 방사능사진 또는 모던 방사선 사진 또는 양전자 방출 단층 촬영기와 같은 다른 막 결합 기술을 잉요한 생체 내에서의 DAM 결합 사이트의 시각화 정량화를 가능하게 한다. 이러한 적용은 중요한 진단적 및/또는 예측적 연구 수단을 제공한다.

컨쥬게이트(congugate)

다른 실시태양에서 본 발명의 ScFv Ab은 콜론(colon) 종양 또는 세포-자극 화합물과 같은 질병 사이트로 결과적인 컨쥬게이트를 타겟하기 위해 신티그래픽 방사성동위원소 표식, 세포독성적 화합물 또는 방사성동위원소, 비-독성 프로드로그를 세포독성 드로그로 변환시키는 효소, 면역 시스템을 활성화하는 화합물에 커플된다. 이러한 컨쥬게이트는 본 발명의 ScFv Ab로 구성된 "결합 부분" 및 방사성동위원소 표지, 톡신 또는 효소로 구성된 "기능적 부분"을 지닌다. 다른 ScFv Ab는 ScFv Ab에 결합하는 타겟된 사멸 tvh를 위한 세포독성적 작용제로의 ScFv Ab의 연결을 포함하나 이에 한정적인 것은 아닌 여러 적용에 사용되기 위해 합성될 수 있다.

또한 ScFv Ab는 특히 또다른 화합물의 결합을 생리적으로 방해함으로서 DAM의 활성을 저지하기 위해서 단독으로 이용된다.

컨쥬게이트의 결합 부분 및 기능적 부분(또한 펩티드 또는 폴리펩티드인 경우)은 O'Sullivan et al(Anal. Biochem 1979: 100, 100-108)에 일반적으로 기술된 바와 같은 교차결합 폴리펩티드의 통상적인 방법에 이해 함께 연결된다. 예를 들어 하나의 부분은 티올(thiol) 그룹으로 풍부해지고, 다른 부분은 예를 들어 이오도아세트산(iodoacetic acid)의 N-하이드록시석신이미드(hydroxysuccinimide)에스테르(NHIA) 또는 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오(pyridyldithio)프로피오네이트(propionate)(SPDP)와 같은 티올 그룹과 반응하는 것이 가능한 이중기능성 작용제와 반응한다. 예를 들어 m-말레이미도벤조일(maleimidobenzoyl)-N-하이드록시석신이미드에스테르와 같은 아마이드 및 티오에테르(thioether) 본드는 일반적으로 2황화 본드 보다 생체 내에서 더욱 안정하다.

또한 결합 부분이 항체 또는 일부 항체 단편의 경우에서와 같이 탄수화물을 포함하는 경우 기능적 부분은 EP 0 088 695의 연결 기술을 이용하여 탄수화물 부분을 통해 연결된다.

컨쥬게이트의 기능적 부분은 예를 들어 비-독성적 프로드로그를 독성적 드로그로 변환시키는 효소이다(Bagshawe 1987 Br. J. Cancer 56, 531; Bagshawe et al. (Br. J. Cancer 1988: 58, 700); WO 88/07378) 또는 시아나이드-방출 시스템(WO 91/11201).

전체 효소가 컨쥬게이트로 존재하는 것이 필요하나 물론 촉매 부분이 존재해야 한다. 일반적으로 반응 중간물 상태에서 ScFv Ab가 촉매하고자 하는 반응에 관련된 화합물을 생성시키는 "압자임(abzyme)라 불리는 것이 사용된다. 결과적인 항체는 반응을 위한 효소로 기능할 수 있다.

컨쥬게이트는 크기 배제 또는 어피니티 크로마토그래피에 의해 정제되고, 이중 생물적 활성에 대해 시험된다. 항원 면역반응성은 고정된 항원으로의 효소-연결된 면역흡착분석(ELISA)를 이용하여 또한 살아있는 세포 방사성-면역에세이 내에서 측정된다. 효소 에세이는oNPG(o-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드), 405nm에서 분광도 측정된 자유 2-니트로페놀과 같이 포도당 잔기가 가수분해될 때 흡광도가 변화하는 물질을 이용하여 β-글로코시다제에 이용된다.

컨쥬게이트의 안정성은 초기에 37℃ 혈청 내에서 인큐베이트하고, 크기 배제 FPLC 분석을 함으로서 실험실 내에서 시험된다. 생체 내 안정성은 마우스 내에서 컨쥬게이트의 주입 후 다양한 시간에 혈청을 분석함으로서 동일한 방법으로 시험된다. 더욱이 컨쥬게이트 전에 ScFv Ab를¹²⁵I로, 효소를¹³¹I로 방사성동위원소 표식하여 마우스 내의 컨쥬게이트, 자유 ScFv Ab 및 자유 효소의 생물분포를 측정하는 것이 가능하다.

또한 컨쥬게이트는 DNA의 길이가 서로 인접하거나 컨쥬게이트의 원하는 성질을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 인코딩하는 구역에 의해 분리된 2 부분의 컨쥬게이트를 인코딩하는 각각의 구역으로 구성된 재조합 DNA 기술에 의해 융합 화합물로서 생성된다.

상상컨대 화합물의 2개의 기능적 부분은 전체적으로 또는 부분적으로 겹친다. 그 후 DNA는 알려진 방법대로 적당한 숙주 내에서 발현된다.

진단 키트

본 발명은 또한 생물유체 및 조직 내의 DAM의 검출 및 측정 및 조직 내에서의 DAM의 위치 측정을 위한 진단 방법 및 키트를 포함한다. 높은 결합 특이성을 지닌 본 발명의 ScFv Ab는 플라스마, 소변, 조직의 추출물 내 및 세포 배양 배지 내에서의 빠르고, 용이하고, 민감하고, 특이적인 측정 및 위치측정을 위한 키트를 쉽게 이용하게 하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 ScFv Ab는 또한 특정한 상황에서 원위치의 초기 종양에 의한 미세전이의 확산과 같은 질병 상태의 진전을 나타내는 순환하는 DAM의 검출을 가능하게 하는 진단 방법 및 키트에 이용된다.

이러한 키트는 하기의 기술을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다 : 경쟁적 및 비-경쟁적 분석, 방사성동위원소에세이, 생물발광 및 화학발광 에세이, 형광 에세이, 샌드위치 에세이, 면역방사성동위원소 에세이, 닷 블럿(dot blot), ELISA를 포함한 효소 연결된 에세이, 마이크로타이터(microtiter) 플레이트, 소변 또는 혈액의 빠른 모니터를 위한 항체 코팅된 스트립(strip) 또는 딥스틱(dipstick) 및 면역세포화학. 각각의 키트에 대해 분석의 범위, 감도, 정확도, 신뢰성, 특이성 및 재생성이 확립되었다. 인트라에세이(intraassay) 및 인터에세이(interassay) 변이는 변위 또는 활성의 표준 곡선 상에 20%, 50% 및 80%에 확립되었다.

연구 및 임상에서 통상적으로 사용되는 분석 키트의 하나의 예는 방사성동위원소면역에세이(RIA) 키트이다. ScFv Ab의 성공적인 라디오이오디네이션(radioiodination) 및 정제 후 가장 높은 적정을 지닌 항혈청이 여러 희석으로 적당한 완충액 시스템내에서 10,000cpm과 같은 상대적으로 일정한 양의 방사능을 포함하는 시험관 내로 첨가된다. 다른 시험관은 비-특이적 결합을 측정하기 위해 완충액 또는 전면역 혈청을 포함한다. 4℃에서 24시간 동안의 인큐베이션 후 단백질 A가 첨가되고, 시험관은 볼텍스되고(voltex), 상온에서 90분간 인큐베이트되며 표지된 ScFv Ab에 결합된 항혈청의 복합물을 침전시키기 위해 4℃에서 약 2000∼2500 시간으로 원심분리된다. 상청액은 흡출에 의해 제거되고, 펠렛 내의 방사능은 감마 카운터에 의해 측정된다. 비-특이적 결합의 삭감 후 표지된 ScFv Ab의 약 10∼40%에 결합한 항혈청 희석액이 더욱 특성화된다.

면역조직화학

면역조직화학 키트가 또한 조직 및 세포 내의 DMA의 위치측정에 이용된다. 이러한 면역조직화학 키트는 지침, ScFv Ab 및 가능한 저지 혈청 및 형광 이소티오사이네이트(isothiocyanate)와 같은 형광 분자에 연결되거나 첫 번째 항혈청을 시각화하는데 이용되는 다른 시약에 연결된 두 번째 항혈청을 제공한다. 면역조직화학 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 면역조직화학 키트는 광 및 전자 현미경 모두를 이용한 조직 섹션 및 배양된 세포 내에서의 DAM의 위치측정을 가능하게 한다. 이는 연구 및 임상 모두의 목적에 이용된다. 예를 들어 종양은 생체검사되거나 수집되고, 조직 섹션은 DAM 생성 사이트를 측정하기 위해 마이크로톰(microtome)으로 절단된다. 이러한 정보는 암과 같은 질병의 검출 및 치료의 진단 및 가능한 치료적 목적에 유용하다.

태아 세포 분석

본 발명의 ScFv Ab 항체 및/또는 개과 5T4 서열은 또한 모계 혈액으로부터의 태아 세포를 분리하기 위한 방법에 유용하다. 모계 혈액으로부터의 태아 세포의 분리는 아미노센테시스(aminocentesis) 대신 비-침입적으로 제안된다(WO 97/30354 참조).

이러한 본 발명의 실시태양에서 DAM은 모계 및 태아 세포 상에서의 다른 레벨로 발현되는 다른 분자이다. 바람직하게는 DAM은 태아 세포 상에서 독점적으로 발현된다. 5T4는 트로포블라스트(trophoblast) 상에서 매우 높은 레벨로 발현된다. 따라서 5T4에 대한 항체는 모계 혈액으로부터 트로포블라스트를 분리하는데 사용된다. 예를 들어 항체는 본 발명에 따라 ScFv이거나 또는 다른 종의 5T4 폴리펩티드에 특이적인 항체이다(예를 들어 증가된).

따라서 본 발명은 또한 본 발명의 ScFv 항체 또는 다른 종으로부터의 항-5T4 항체를 이용하여 모계 혈액으로부터 태아 세포를 분리하는 방법을 제공한다. 본 발명의 개과 5T4 폴리펩티드는 이러한 교차-반응 항체를 생성하는데 유용하다.

예를 들어 태아 세포는 트로포블라스트 또는 적혈구이다.

모계/태아 세포는 인간 또는 동물로부터 유래한다. 따라서 본 발명의 방법은 의학적 또는 수의적 적용에 이용된다. 바람직한 실시태양에서 모친 및 태아는 비-인간이어서 분리 방법은 수의적 적용의 일부분이다.

이러한 분리 과정은 진단 방법의 일부분을 형성한다. 예를 들어 태아 세포는 생화학적 또는 유전적 표본화된다. 이러한 절차는 다운 증후군과 같은 태아 비정상을 시험하거나 태아의 성을 감별하는데 이용되어야 한다.

조합 치료

본 발명의 ScFv Ab는 질병의 치료를 위해 다른 조성물 및 절차와 조합하여 사용된다. 예로서 ScFv Ab는 또한 암과 같은 통상적인 질병의 치료와 조합하여 이용된다. 더한 예로서 종양은 ScFv Ab와 조합된 외과, 방사선 또는 화학요법으로 통상적으로 치료되거나 미소전이의 휴지를 확장하고, 잔여 초기 종양을 안정화시키기 위해 ScFv Ab가 후에 환자에게 투여된다.

ScFv Ab 전달

ScFv Ab는 동일한 시간 및 동일한 사이트 내에 치료적으로 효과적인 작용제와 함께 전달될 수 있다. 또한 ScFv Ab 및 치료적으로 효과적인 작용제는 다른 시간 및 다른 사이트 내로 전달된다. ScFv Ab 및 치료적으로 효과적인 작용제는 암과 같은 질병 조건의 방지 및/또는 치료를 위한 동일한 전달 비히클 내로 전달되기도 한다.

ScFv Ab의 이용에 기초를 둔 치료적 전략은 반응성 ScFv Ab 단편과 박테리아성 수퍼항원 포도상구균 엔테로톡신(eterotoxin)의 융합을 이용함으로서(Dohlsten et al 1994) 또는 DAM 및 T 세포 CD3 항원 모두로 방향지원지 이중특이적 항체를 이용함으로서(Kroesen et al 1994) T 세포의 모집 및 활성화를 포함한다. 항-DAM 항체는 또한 유력한 면역독소를 양산하는 다른 박테리아성 독소에 컨쥬게이트된다.(LeMaistre et al 1987; Zimmermann et al 1997). ScFv Ab는 맥관형성 및/또는 암과 같은 질병 상태의 방시 및/또는 치료를 위한 세포독성적 작용제와 조합되어 이용된다. ScFv Ab에 연결된 리신(ricin)과 같은 세포독성적 작용제는 ScFv Ab에 결합하는 세포의 파괴를 위한 도구를 제공한다. 이러한 세포는 미소 전이 및 초기 종양을 포함한 많은 위치에서 발견되나 이에 한정적인 것은 아니다.

스크린

본 발명의 ScFv Ab 또는 본 발명의 유도체 또는 상동체 및/또는 본 발명의 ScFv Ab를 발현하는 세포주 또는 그의 유도체 또는 상동체가 ScFv Ab의 결합 특이성에 영향을 미칠 수 있는 작용제(펩티드, 유기성 또는 무기성 분자와 같은)를 스크린하는데 사용된다.

하나의 실시태양에서 본 발명의 스크린은 본 발명의 ScFv Ab의 작용물 및/또는 반작용물로 간주된다.

또다른 실시태양에서 본 발명의 ScFv Ab는 다양한 약물 스크린 기술에 이용된다. 이러한 시험에 사용된 ScFv Ab는 용액 내에서 자유롭고, 고형 서포트(support)에 부착되고, 세포 표면에 부착되고 또는 세포내부적으로 위치된다.

ScFv Ab 결합 특이성의 폐지 또는 ScFv Ab와 시험되는 작용제 사이의 결합 복합물 형성이 측정된다.

스크린을 위한 또다른 기술은 ScFv Ab에 적당한 결합 친화력을 지닌 작용제의 높은 처리량 스크린을 제공하고, WO 84/03564에 상세히 기술된 방법에 기초를 둔다.

본 발명의 에세이 방법은 정량 에세이 뿐만 아니라 시험 화합물의 작은 또는 큰 규모의 스크린 모두에 적당할 것이다.

파지 디스플레이 스크린(Phage display screen)

파지 디스플레이는 본 발명의 ScFv Ab에 의해 인게이지가능한(engageable) DAM과 같은 작용제를 증명하는데 이용된다. 파지 디스플레이는 재조합 벡테리오파지를 이용하는 분자 스크리닝의 프로토콜이다. 기술은 타겟 ScFv Ab(또는 그의 유도체 또는 상동체)과 반응할 수 있는 적당한 리간드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 동일한 것을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열(또는 그의 유도체 또는 상동체)로 박테리오파지를 형질전환하는 것을 포함한다. 형질전환된 박테리오파지(바람직하게는 고형 서포트에 부착된)는 적당한 리간드(후보 작용제와 같은)를 발현하고, 다른 파지 코트 상에 이를 디스플레이한다. 후보 DAM을 인식하는 ScFv Ab 분자를 품은 실체 또는 실체들(세포와 같은)은 분리되고 증폭된다. 그 후 성공적인 후보 DAM은 특성화된다.

본 발명의 또다른 실시태양에서 ScFv Ab 라이브러리는 특이적인 DAM에 대한 항체를 스크린하는데 이용된다. 예로서 박테리오파지는 타겟 DAM(또는 그의 유도체 또는 상동체)와 반응할 수 있는 적당한 리간드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 동일한 것을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열(또는 그의 유도체 또는 상동체)로 형질전환된다. 형질전환된 박테리오파지(바람직하게는 고형 서포트에 부착된)는 적당한 리간드(후보 ScFv Ab와 같은)를 발현하고, 그드르이 파지 코트 상에 이를 디스플레이한다. 후보 ScFv Ab을 인식하는 타겟 DAM 분자를 품은 실체 또는 실체들(세포와 같은)은 분리되고 증폭된다. 그 후 성공적인 후보 ScFv Ab은 특성화된다.

더한 예로서 "그리핀(Griffin)-1 라이브러리"라고 불리는 인간 ScFv 단편 라이브러리가 lox 라이브러리로부터의 합성적 헤비 및 라이트 체인 변이 구역(VH 및 VL)을 파지미드(phagemid) 벡터 pHEN2 내로 재클론함으로서 구조된다. 용출 및 스크리닝 절차 내의 변형은 다양한 DAM에 대한 ScFv 항체의 파지 디스플레이 라이브러리의 성공적인 스크리닝을 유발한다(de Bruin et al 1999, Nature Biotechnology 17:397-399).

파지 디스플레이는 표준 어피니티 리간드 스크리닝 기술 보다 유리하다. 파지 표면은 3차원 형상으로 자연 발생적인 구조에 더욱 가깝게 후보 작용제를 디스플레이한다. 이는 스크리닝 목적에 더욱 특이적이고, 더 높은 친화력 결합을가능하게 한다.

모태 에세이

파지 디스플레이를 이용한 DAM 또는 Ab의 양성적인 확인은 동일하거나 유사하게 행동할 수 있는 모태를 확인하는 통상적인 라이브러리의 이용을 촉진시킨다. 이러한 모태는 단독으로 또는 본 발명의 DAM과 결합된 질병의 다른 치료와 조합하여 투여된다.

투여량

본 발명의 ScFv Ab의 투여량은 질병 상태 또는 치료되는 조건 및 체중 및 인간 또는 동물의 컨디션 및 화합물 투여 경로와 같은 다른 임상적 인자에 따라 달라진다. 특정한 동물 또는 인간에서 ScFv Ab의 반감기에 따라 ScFv Ab는 하루에 몇 번에서 일주일에 한번 사이에 투여될 수 있다. 본 발명은 인간 또는 수의적 목적 모두에 적용된다는 것이 이해되어야 한다. 본 발명의 방법은 동시에 또는 확장된 기간 이상으로 다중 투여뿐만 아니라 단독 투여를 예상한다.

포뮬레이션

비경구 투여에 적당한 포뮬레이션은 항-산화체, 완충액, 박테리오스타트(bacteriostat) 및 포뮬레이션을 수여되는 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유한 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 부유 작용제 및 농후제를 포함한 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 포뮬레이션은 유니트-도스(unite-dose) 또는 다중-도스 컨테이너 예를 들어 봉함된 암플(ampoule) 및 바이알(vial) 내에 존재하고, 사용되기 직전에 멸균 액체 캐리어 예를 들어 주사를 위한 물의 첨가만이 필요한 동결-건조된 조건으로 보관된다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 앞서 기술된 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 준비된다.

본 발명의 ScFv Ab는 암 관련 질병과 같은 질병을 방지하고/또는 치료하는데 효과적이다. 본 발명은 암 관련 질병을 본 발명의 ScFv Ab의 효과적인 양으로 치료하는 방법을 포함한다. 본 발명의 ScFv Ab는 일반적인 당업자에 알려진 포뮬레이션 방법을 이용한 약제적으로 수용가능한 조성물로 합성적 펩티드 또는 분리되고 실질적으로 정제된 단백질 또는 단백질 단편 또는 그의 조합으로서 제공될 수 있다. 이러한 조성물은 표준 루트에 의해 투여될 수 있다. 이는 : 구강, 직장, 눈(유리체 내 또는 카메라 내), 코, 국부(구강 및 설하를 포함한), 자궁내, 질 또는 비경구(피하, 복막내, 근육내, 혈관내, 피내, 두개골내, 기관내 및 경막내를 포함한), 경피, 복막내, 두개골내, 뇌실내, 뇌내, 질내, 자궁내 또는 비경구(즉, 혈관내, 척수내, 피하 또는 근육내) 루트를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

ScFv Ab 포뮬레이션은 유니트 투여량 형태로 편리하게 존재하고, 통상적인 약제적 기술에 의해 준비된다. 이러한 기술은 활성적인 성분 및 약제적 캐리어(들) 또는 부형제(excipient)(들)을 만들어 내는 과정을 포함한다. 일반적으로 포뮬레이션은 활성적인 성분을 액상 캐리어 또는 세밀히 분할된 고형 캐리어 또는 이 모두와 균일하고 상세하게 결합시킴으로서 또한 필요에 따라 생성물을 형상화함으로서 준비된다.

더욱이 본 발명의 ScFv Ab는 화합물의 지속된 방출을 가능하게 하는 생분해성 폴리머 내로 통합되고, 폴리머는 약물이 전달되고자 하는 곳 예를 들어 종양 사이트의 부근으로 이식되어 ScFv Ab는 천천히 체계적으로 방출된다. 생분해성 폴리머 및 그의 사용은 예를 들어 Brem et al(J. Neurosurg 1991 74:441-446) 내에 상세히 기술된다. 삼투압 또한 미니펌프는 높은 농도의 ScFv Ab의 전이 생장으로 직접 또는 종양으로 공급하는 혈관과 같이 원하는 사이트 내로의 캐뉼러(cannulae)를 통한 제어된 전달을 제공한다.

본 발명의 ScFv Ab는 원하는 위치로의 전달을 최대화시키도록 고안된 방식으로 주입된 세포독성적 작용제에 연결된다. 예를 들어 리신(ricin)-연결된 높은 친화력 ScFv Ab은 타겟 사이트를 공급하는 혈관 또는 직접 타겟으로 캐뉼라를 통해 전달된다. 이러한 작용제는 또한 인퓨전 캐뉼라와 커플된 삼투압 펌프를 통해 제어된 방식으로 전달된다.

바람직한 유니트 투여량 포뮬라는 상기에 나타난 바와 같이 투여된 성분의 일일 투여량 또는 일일 서브-도스(sub-dose) 또는 그의 적당한 프랙션을 함유한 것이다. 특히 상기에 기술된 바와 같이 성분에 더하여 본 발명의 포뮬레이션은 질문의 포뮬레이션 타입에 대해 지닌 통상의 작용제를 포함한다.

ScFv Ab 컨쥬게이트는 일반적으로 비경구적으로 예를 들어 혈관내로 또는 복막내로, 표준 멸균수 내에 희석제 및 캐리어의 비-발열성 포뮬레이션 예를 들어 등장 식염수(혈관 내로 투여될 경우)와 같이 적당한 방법으로 투여된다. ScFv Ab 컨쥬게이트가 타겟 세포에 결합되고, 일반적으로 하루 정도 걸리는 혈류로부터의 제거가 이루어지면(필요에 따라) 일반적으로 단독 주입된 도스 또는 종양이 이미지화될 때 프로-드로그가 투여된다. 필요한 경우에는 ScFv Ab 컨쥬게이트가 면역원적이기 때문에 시클로스포린 또는 동일한 다른 면역억제물질이 치료의 오랜 기간동안 제공되도록 투여될 수 있으나 이는 항상 필요하지는 않다.

컨쥬게이트의 질병/정상 조직 비율이 약 4∼6일 후 가장 높기 때문에 ScFv Ab 컨쥬게이트 투여와 프로-드로그 사이의 타이밍은 정해진 방법에 최적화되는 반면 이 때 그람 당 주입된 투여량의 퍼센트로 표현된 DAM에 결합된 순수한 컨쥬게이트의 양은 더 빠른 시간보다 더 낮다.

따라서 ScFv Ab 컨쥬게이트 투여와 프로-드로그 사이의 최적 시간차는 질병 사이트에서의 효소 농도의 피크와 질병과 정상 조직 사이의 최상 분포 비율 간의 절충이 될 것이다. ScFv Ab 컨쥬게이트의 투여량은 사용자 표준에 따라 의사에 의해 선택될 것이다. 적어도 β-글로코시다제와 같은 타겟된 효소 및 독성적 프로-드로그로서 혈관내 아미그달린을 이용하는 방법의 경우 신체 표면 면적의 제곱 미터 당 0.1∼10.0 그람의 1∼50 일일 투여, 바람직하게는 1.0∼5.0g/㎡가 적당하다. 구강 치료의 경우 1∼55일간 0.05∼10.0g, 바람직하게는 1.0∼5.0g의 3회 투여가 적당하다. ScFv Ab 컨쥬게이트의 투여량은 정상 표준에 따라 특히 질병 조직의 타입, 단계 및 위치 및 환자의 체중에 따라 선택될 것이다. 치료의 기간은 ScFv Ab 컨쥬게이트에 대한 면역 반응의 속도 및 정도에 따라 부분적으로 달라질 것이다.

ScFv Ab 컨쥬게이트의 기능적 부부은 ScFv Ab 컨쥬게이트가 진단용으로 사용될 경우 일반적으로 예를 들어 테크네튬 99m(^99mTc) 또는 이오딘-123(¹²³I)과 같은 신티그램 연구를 위한 방사성 원소 또는 이오딘-123, 이오딘-313, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철과 같은 핵자기 공명 이미지화(자기 공명 이미치화, mri라고도 알려진)를 위한 스핀 라벨(spin label)로 구성된다.

예를 들어 종양과 같은 선택적 파괴를 위한 화합물로 사용되면 ScFv Ab의 기능적 부분은 이웃한 세포 또는 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아미신(adriamicin), 빈카 알칼리오드(vinca alkaliod)(빈크린스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 에토포시드(etoposide)) 다우노루비신(daunorubicin) 또는 다른 인터칼레이트(intercalating) 작용제와 같은 세포독성적 화합물을 파괴하기에 충분하 에너지를 방출하는 이오딘-131, 레늄-186, 레늄-188, 이트륨-90 또는 납-212와 같은 높은 방사성 원소로 구성된다.

방사성- 또는 다른 표지는 알려진 방법대로 ScFv Ab 컨쥬게이트 내로 통합된다. 예를 들어 펩티드는 수소 자리의 불소-19와 같은 것을 포함한 적당하 아미노산 전구체를 이용한 화학적 아미노산 합성에 의해 생합성 또는 합성된다.^99mTc,¹²³I,¹⁸⁶Rh,¹⁸⁸Rh 및¹¹¹In과 같은 표지는 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통해 부착될 수 있다. IODOGEN 방??버이 이오딘-123을 통합시키는데 사용될 수 있다(Fraker et al 1978 Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57). "Monoclonal Antibodies in Immunoscinigraphy"(Chatal, CRC Press 1989)는 다른 방법을 상세하게 기술한다.

약제적 조성

하나의 관점에서 본 발명은 본 발명에 따라 ScFv Ab로 구성되고, 선택적으로는 약제적으로 수용가능한 캐리어, 희석제 또는 부형제(그의 조합을 포함하여)로 구성된 약제적 조성을 제공한다.

약제적 조성은 인간 또는 인간에 이용되기 위한 동물 및 수의약이고, 일반적으로 약제적으로 수용가능한 하나 또는 그 이상의 희석제, 캐리어 또는 부형제로 구성될 것이다. 치료적 이용을 위한 수용가능한 캐리어 또는 희석제는 제약분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A. R. Gennaro edit. 1985)에 기술되어 있다. 약제적 캐리어, 부형제 또는 희석제의 선택은 투여의 의도하는 루트 및 표준 제약 실행에 따라 선택될 수 있다. 약제적 조성은 캐리어, 부형제 또는 희석제, 적당한 바인더(binder)(들), 윤활제(들), 부유제(suspending agent)(들), 코팅제(들), 용해제(solubilising agent)(들)로 구성된다.

방부제, 안정화제, 염료 및 향료도 약제적 조성에 제공된다. 방부제의 예는 안식향산나트륨, 소르빈산 및 p-하이드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 항산화제 및 부유제도 이용된다.

다른 전달 시스템에 따라 다른 조성/포뮬레이션이 요구된다. 예로서 본 발명의 약제적 조성은 미니-펌프를 이용하거나 예를 들어 코 스프레이 또는 흡입용 또는 섭취용 용액의 연무제(aerosole)와 같이 점막 루트를 통해 또는 조성이 예를 들어 혈관내로, 근육내로 또는 피하 루트에 의해 전달도기 위해 주입가능한 형태에 의해 포뮬레이트되어 비경구적으로 전달되도록 포뮬레이트된다. 또한 포뮬레이션은 이둘 모두에 의해 전달되도록 고안된다.

약제적 조성물이 위장내 점막을 통해 점막적으로 전달되면 위장을 통해 통과되는 동안 안정하게 유지될 수 있어야 한다; 예를 들어 단백질가수분해성 분해에 저항적이고, 산성 pH에 안정하고, 담즙의 세정제 효과에 저항적이어야 한다.

적당한 곳에서 약제적 조성물은 좌약 또는 페서리의 형태로, 일반적으로 피부 패치(patch)의 사용에 의해 로션, 용액, 크림, 연고 또는 가루분말의 형태로, 전분 또는 락톳 또는 백악을 함유한 정제 또는 캡슐 또는 오뷸(ovule) 단독으로 또는 부형제와 혼합하여, 또는 향료 또는 칼라링 약제를 함유한 엘릭시르(elixir), 용액 또는 현탁액의 형태로 구강적으로 흡입에 의해 투여될 수 있고, 또는 혈관내, 근육내, 피하 주사와 같이 비경구적으로 주입될 수 있다. 비경구적 투여의 경우 조성물은 혈액과 등장을 이루기에 충분한 염 또는 모노사카라이드와 같은 다른 물질을 함유한 멸균 수용액의 형태로 사용된다. 구강 또는 설하 투여의 경우 조성물은 통상적인 방식으로 포뮬레이트될 수 있는 정제 또는 로젠지(lozenge)의 형태로 투여된다.

투여

일반적으로 의사는 환자에게 가장 적당할 실제적인 투여량을 결정할 것이고, 특정한 환자의 연령, 체중 및 반응 및 컨디션의 심각성에 따라 달라질 것이다. 하기의 투여량은 평균 경우의 실례이다. 물론 더 높거나 더 낮은 투여량이 좋은 개인적인 경우도 있을 수 있다.

본 발명의 조성물(또는 그의 구성성분 부분)은 구강적으로 투여된다. 더욱이 또는 이와는 또 다르게 본 발명의 다른 조성물(또는 그의 구성성분 부분)은 직접적인 주사에 의해 투입된다. 더욱이 또는 이와는 또 다르게 본 발명의 다른 조성물(또는 그의 구성성분 부분)은 국부적으로 투여된다. 더욱이 또는 이와는 또 다르게 본 발명의 다른 조성물(또는 그의 구성성분 부분)은 흡입에 의해 투입된다. 더욱이 또는 이와는 또 다르게 본 발명의 다른 조성물(또는 그의 구성성분 부분)은 또한 : 비경구적, 점막적, 근육내, 혈관내, 피하적, 안구내 또는 경피적 투여 수단의 하나 또는 그 이상에 의해 투여되고, 이러한 투여를 위해 포뮬레이트된다.

더한 예로서 본 발명의 약제적 조성물은 하루에 한 번 또는 두 번과 같이 하루당 1∼10회의 섭생에 따라 투여된다. 특정한 환자에 대한 특정한 투여 수준 및 투여량 빈도는 다양하고, 사용되는 특정한 화합물의 활성, 대사적 안정성 및 화합물의 활동의 길이, 연령, 체중, 종합 건강, 성별, 다이어트, 모드(mode) 및 투여 시간, 배설 속도, 약물 콤비네이션, 특정한 컨디션의 심각성 및 호스트 진행 치료를 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.

"투여된"이라는 용어는 예를 들어 코 스프레이 또는 흡입용 연무제 또는 섭취가능한 용액으로서 점막 루트; 혈관내, 근육내 또는 피하 루트와 같이 주사 가능한 형태에 의해 전달되는 비경국적 루트에 의해 전달되는 것을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

따라서 본 발명의 약제적 조성물은 하기의 루트의 하나 또는 그 이상에 의해 투여된다 : 구강적 투여, 주사(직접적 주사와 같은), 국부적, 흡입, 비경구적 투입, 점막 투여, 근육내 투여, 혈관내 투여, 피하 투여, 안구내 투여 또는 경피성 투여.

질병

ScFv Ab 및/또는 동일한 것을 인코딩하는 NOI의 효과적인 양으로 구성된 약제적 조성물은 WO-A-98/09985에 기재된 목록과 같은 장애를 치료하는데 사용된다. 참고에 용이하도록 목록의 일부분이 제공된다 : 대식세포 억제 및/또는 T 세포 억제 활성 및 항-염증 활성; 염증에 관련되지 않은 반응을 포함한 항-면역 활성, 즉세포 및/또는 호르몬 면역 반응에 대한 억제 효과; 바이러스 및/또는 다른 세포내 병원균과 관련된 질병; T 세포 내의 상향-조절된 파스(fas) 수용체 발현뿐만 아니라 세포외 매트릭스 구성성분 및 피브로넥틴(fibronectin)에 부착되는 대식세포 및 T 세포의 능력을 억제; 류마티즘성 관절염을 포함한 관절염 관련 염증, 과민증 관련 염증, 알레르기성 반응, 천식, 전신 낭창 홍진, 콜라겐(collagen) 질환 및 다른 자가면역 질환, 아테롬성 동맥경화증 관련 염증, 동맥경화증, 아테롬성 동맥경화증성 심장 질환, 재관류 손상, 심장 마비, 심근 경색증, 혈관 염증성 장애, 호흡 곤란 증후군 또는 다른 심폐성 질환, 펩신성 궤양과 관련된 염증, 궤양성 대장염 및 위장의 다른 질환, 간 섬유증, 간 경화증 또는 다른 간 질환, 갑상선염 또는 다른 선성 질환, 사구체신염 또는 다른 신장 및 비뇨기과적 질환, 이염 또는 다른 이비인후과적 질환, 피부염, 또는 다른 피부 질환, 치주 질환 또는 다른 치아 질환, 고환염 또는 고환부고환염, 불임, 고환 충격 또는 다른 면역-관련 고환성 질환, 태반 기능 장애, 태반 기능 부전, 습관성 유산, 경련, 전-경련 및 다른 면역 및/또는 염증-관련 부인과적 질환, 후부 포도막염, 중부 포도막염, 전방 포도막염, 결막염, 맥락망막염, 포도막망막염, 시신경염, 눈내부 염증 즉, 망막염 또는 포낭성 반점 부종, 교감신경성 안염, 공막염, 결막염 피그멘토사(pigmentosa), 퇴화성 폰두스(fondus) 질환의 면역적 및 염증성 성분, 눈 충격의 염증성 성분, 감염에 의해 유발된 눈 염증, 증식적 투명-망막증, 급성 허혈성 시신경장해, 과도한 흉터 즉, 녹내장 여과 수술, 안구 이식에 대한 면역 및/또는 염증 반응 및 다른 면역 및 염증-관련 안염성 질환, 중추신경계(CNS) 또는 다른 기관에서의 자가면역과 관련된 염증 또는 조건 또는 장애, 이로울 수 있는 면역 및/또는 염증 억제, 파킨슨병, 파킨슨병의 치료로부터의 합병증 및/또는 부작용, AIDS-관련 치매 복합 HIV-관련 뇌질환, 데빅(Devic's)병, 시덴함(Sydenham) 무도병, 알츠하이머병 및 CNS의 다른 퇴화성 질환, 조건 또는 장애, 정신병적 장애의 염증 성분, 척수염, 뇌염, 아급성 경화성 팬(pan)-뇌염, 뇌척수염, 급성 신경장해, 아급성 신경장해, 만성 신경장해, 길라임-바르(Guillaim-Barre) 증후군, 시덴함(Sydenham) 무도병, 근무력증 그래비스(gravis), 유사-종양 뇌, 다운 증후군, 헌팅톤병, 근위축성측색경화증, CNS 압박증 또는 CNS 충격 또는 CNS 감염의 염증 성분, 근육 위축증 및 영양 실조의 염증 성분 및 중추 및 말초 신경계의 면역 및 염증 관련 질환, 조건 또는 장애, 후-충격성 염증, 패혈증성 쇼크, 감염성 질환, 수술의 염증성 합병증 또는 부작용, 골수 이식 또는 다른 이식수술 합병증 및/또는 부작용, 바이러스 운반체로의 감염에 기인한 유전자 치료의 염증 및/또는 면역적 합병증 및 부작용 또는 AIDS와 관련된 염증, 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 진압 또는 억제, 단핵세포 또는 림프세포의 양을 감소시킴으로서 백혈병과 같은 단핵세포 또는 림프세포 증식성 질환을 치료하거나 개선, 각막, 골수, 기관, 렌즈, 페이스 메이커(pacemaker), 천연 또는 인공 피부 조직과 같은 천연 또는 인공 세포, 조직 및 기관의 이식의 경우 이식 거부반응의 방지 및/또는 치료. 장애에 관련된 특정한 암은 : 고형 종양; 백혈병과 같은 혈액 유래 종양; 종양 전이; 예를 들어 혈관종, 청신경종, 신경섬유종, 트라코마 및 화농성 육아종과 같은 양성 종양; 류마티즈 관절염; 건선; 예를 들어 당뇨병적 망막증, 조산 망막증, 반점 변성, 각막 이식 거부반응, 신혈관 녹내장, 레트로렌탈섬유 증식증, 루베오시스와 같은 안구 맥관형성 질병; Osler-Webber 증후군; 심근 맥관형성; 플라크 신혈관형성; 모세관확장증; 혈우성 조인트; 섬유성혈관종; 상처 육아(granulation); 관상 측부; 대뇌 측부; 동정맥 기형; 국소 빈혈성 사지 맥관형성; 신혈관 녹내장; 레트로렌탈 섬유 증식증; 당뇨병적 신혈관형성; 헬리오박터 관련 질병, 골절, 혈관형성, 혈액생성, 배란, 월경 및 태반형성을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

(실시예 1) 5T4 ScFv Ab의 구조 및 종양으로의 레트로바이러스성-벡터 전달

쥐과 5T4 단일클론 항체를 인코딩하는 cDNA는 표준 기술에 의해 클론되고, 서열화된다(Antibody engineering : a practical approach ed McCafferty et al.1996 OUP). 항체의 변이 구역의 서열은 ScFv 항체를 구조하는데 이용될 수 있다. 5T4ScFv.1이라 불리는 5T4 ScFv의 코딩 서열(서열번호: 1)은 도 1에 나타나 있다. 이러한 분자에서 DNA 서열은 15 아미노산 유연성있는 링커가 뒤따르는 마우스 5T4 단일클론 항체로부터의 VH 및 마우스 5T4 항체의 VL 구역을 인코드한다. 유연성있는 링커는 아미노산 서열 gly-gly-gly-gly-ser의 3 카피를 인코드하고, 반복사이에서의 DNA 서열 유사성은 이들을 함유한 플라스미드가 E. coli 내에서 생장될 때 반복 사이에서의 재조합의 위험성을 피하도록 최소화되었다.

DNA 카세트

카세트 1 - 번역 개시 시그날 및 시그날 펩티드

정확한 번역 개시 및 포유류 세포로부터의 분비를 달성하기 위해 하기의 서열이 이용된다 :

aagcttCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCC

이는 발현 벡터 내로의 클로닝을 위한 편리한HindⅢ제한 사이트(더 낮은 경우), 포유류 세포의 컨센서스(consensus) 번역 개시 시그날(ANNATGPu) 및 면역글로블린 유전자로부터의 시그날 펩티드 서열의 코딩 서열을 포함한다.

카세트 2 - scFv

5T4ScFv.1의 분비된 부분의 서열은 도 1에 나타나 있다. 이러한 분자는 Vh-(gly₄-ser)₃링커-VI로 표현될 수 있다.

5T4 ScFv Ab는 VI-유연성 링커의 순서로 연결된 5T4 변이 구역으로 구성된다. 이러한 경우 링커는 20개 아미노산 펩티드(gly₄-ser)₃을 인코드한다. 긴 링커는 V-구역이 이러한 순서로 있을 때 ScFv의 어셈블리(assembly)를 증진시킨다(Pluckthun et al in Antibody Engineering : a practical approach ed McCafferty et al. 1996 OUP).

5T4 특이적 SCFV의 발현

인간 세포 내의 5T4-특이적 ScFv의 발현을 위해 코딩 서열은 강한 프로모터 및 폴리아데닐레이션 시그날의 제어 하에서 벡터 pCIneo(Promega) 내로 삽입된다. 코딩 서열의 5' 말단에서 카세트 1로부터의 번역 개시 시그날 및 면역글로블린 리더(시그날 펩티드) 서열은 포유류 세포로부터의 ScFv의 효과적인 분비를 보증한다.

(실시예 2) ScFv Ab를 인코딩하는 발현 벡터로 대식세포/단핵세포의 세포감염

말초 혈액 단일클론 세포는 표준 기술 절차에 의해 실험실 규모(Sandlie and Michaelsen 1996 In Antibody Engineering : a practical approach ed McCafferty et al. Chapter 9) 및 현탁분리에 의한 대규모(즉, CellPro로부터의 Ceprate)로 인간 말초 혈액으로부터 분리된다. 점착성 세포(본질적으로 단핵세포)는 플라스틱에 오버나이트로 부착함으로서 풍부해지고, 세포는 1∼3주 동안 점착성 세포를 배양함으로서 대식세포 분화 경로를 따라 분화되는 것이 가능할 수 있다.

단핵세포 및 대식세포는 인간 세포 내에서 ScFv Ab를 발현하는 것이 가능한 발현 벡터로 세포감염된다. 구성적으로 높은 수준의 발현을 위해 ScFv Ab는 hCMV-MIE 프로모터-인핸서, pCI(Promega)를 이용한 벡터 내에서 발현된다. 저산소-유도된 발현을 위해 hCMV 프로모터가 적어도 하나 이상의 HRE를 포함한 프로모터에 의해 대치된다. 적당한 프로모터는 마우스 PGK HRE의 3 카피로 절단된 HSV TK 프로모터이다(Firth et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. 91:6496-6500).

입자-매개 DNA 전달(바이오리스틱), 일렉트로포레이션, 양이온 작용제-매개 세포감염(즉, Superfect, Qiagen을 이용)을 포함한 다양한 세포감염 방법이 벡터를 단핵세포 및 대식세포 내로 도입하는데 이용된다. 이러한 방법의 각각은 제조사의 지침에 따라 수행되고, 개개의 제조사에 의해 특성화된 될 때 최적의 결과를 이루도록 다양화된 파라미터를 고려해야 한다. 또한 바이러스성 벡터는 결함있는 아데노바이러스 벡터와 같이 이용된다(Microbix Inc 또는 Quantum Biotechnologies Inc.).

(실시예 3) B7-ScFv 융합 단백질의 구조

B7-1의 세포외 도메인은 본래의 인간 B7-1 단백질의 아미노산 잔기 1∼215에 의해 정의된다. 이러한 서열은 그의 시그날 펩티드-인코딩 서열과 함께 5T4 단일클론 항체로부터 유도된 ScFv도 포함한 분비된 융합 단백질을 구조하는데 이용된다. 5T4 ScFv의 서열은 도 1에 나타나 있다.

DNA 코딩 서열은 5T4 ScFv의 N-말단이 인간 B7-1의 아미노산 215 뒤에 융합되는 융합 단백질을 인코드하는 표준 분자생물학 기술을 이용하여 구조된다. 이러한 코딩 서열의 서열, B7-1.5T4.1(서열번호: 7)은 도 2에 나타나 있다. 융합 단백질은 B7-1과 5T4 ScFv 서열 사이에 유연성있는(gly-gly-gly-ser) 스페이서를 포함한다. 링커 삽입의 말단에서의 편리한 BamH1 제한 사이트의 도입은 또한 더한 링커들이 이중-기능성 융합 단백질의 최적 발현을 위해 분비되는 것을 가능하게 한다. 도 3은 개략적 형태의 융합 단백질을 나타낸다. ScFv가 N-말단이고, B7 세포외 도메인이 C-말단인 B7-1.5T4.2를 구조하는 것이 가능하다(도 3b). 이러한경우 성숙 B7-1의 코딩 서열(시그날 펩티드가 없는)이 요구된다. 이러한 경우 면역글로블린 리더 서열과 같은 시그날 펩티드는 ScFv의 N-말단에 첨가된다.

B7-2의 동시-자극성 세포외 도메인을 이용하는 융합 단백질의 경우(Gerstmayer et al 1997 J Immunol. 158(10): 4584-90) B7-2의 시그날 펩티드 및 세포외 도메인은 B7-1 서열의 위치에서 이용된다. 도 4는 SCM B7-2.5T4.1 동시-자극성 도메인의 코딩 서열을 나타낸다. 이는 그의 시그날 펩티드 및 유연성 있는 링커(gly4-ser)에 의해 앞선 인간 B7-2의 첫번째 225개 아미노산을 인코드한다. 이러한 서열의 말단에서 BamHI 사이트는 5T4ScFv.1의 상부 도메인을 삽입하는데 이용될 수 있다(도 3 참조). 서열은 B7-2 도메인이 융합 단백질의 N-말단에 있는 융합 단백질의 분비를 가능하게할 수 있는 B7-2 시그날 펩티드를 포함한다.

각각의 설계된 cDNA는 포유류 조직 배양 세포 내에서의 발현을 가능하게 하는 포유류 발현 벡터 pCI 내로 삽입된다. 이러한 목적으로 링커 서열은 pCI의 폴리링커 내로의 삽입을 위해 편리한 제한 사이트를 도입하고, 첫 번째 ATG 코돈에 바로 인접한 번역 개시 시그날 CCACC를 첨가하는 코딩 서열의 5'-말단에 첨가된다. pCI 내의 구조물은 SCM의 분비를 확인시키는 COS-1과 같은 적당한 포유류 숙주 세포주 내로 세포감염된다. pCI로부터의 전사체 카세트 또는 전사체 카세트의 적당한 세그먼터는 치료적 이용을 위한 유전자 전달 시스템으로서 사용되도록 발현 벡터 내로 서브-클론된다.

(실시예 4) 분비된 동시-자극성 분자(SCM)로 구성된 ScFv Ab를 인코딩하는 발현 벡터로 대식세포/단핵세포의 세포감염

단핵세포 및 대식세포는 인간 세포 내에서 SCM으로 구성된 ScFv Ab를 발현하는 것이 가능한 발현 벡터로 세포감염된다. 구성적으로 높은 수준의 발현을 위해 SCM은 hCMV-MIE 프로모터-인핸서, pCI(Promega)를 이용한 벡터 내에서 발현된다. 저산소-유도된 발현을 위해 hCMV 프로모터가 적어도 하나 이상의 HRE를 포함한 프로모터에 의해 대치된다. 적당한 프로모터는 마우스 PGK HRE의 3 카피로 절단된 HSV TK 프로모터이다(Firth et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. 91:6496-6500).

입자-매개 DNA 전달(바이오리스틱), 일렉트로포레이션, 양이온 작용제-매개 세포감염(즉, Superfect, Qiagen을 이용)을 포함한 다양한 세포감염 방법이 벡터를단핵세포 및 대식세포 내로 도입하는데 이용된다. 이러한 방법의 각각은 제조사의 지침에 따라 수행되고, 개개의 제조사에 의해 특성화된 될 때 최적의 결과를 이루도록 다양화된 파라미터를 고려해야 한다. 또한 바이러스성 벡터는 결함있는 아데노바이러스 벡터와 같이 이용된다(Microbix Inc 또는 Quantum Biotechnologies Inc.).

(실시예 5) CTLA-4 및 5T4-항원 발현 세포에 결합하는 SCM의 분석

ScFv Ab-SCM 융합 단백질의 B7-1 또는 B7-2 도메인은 인간 T 세포 상에 나타난 CD28 및 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 것으로 예상된다. 인간 CTLA-4 또는 CD28로 세포감염된 T-세포 또는 중국 햄스터 난소 세포의 결합은 하기와 같은 FACS 분석을 이용하여 측정된다. 타겟 세포를 발현하는 5 ×10⁵CTLA-4 또는 CTLA-4가 없는 등가 세포는 SCM 유전자로 1시간 동안 4℃에서 일시적으로 세포감염된 COS-1 세포로부터의 0.1ml 배양 상청액으로 인큐베이트된다. 세포는 세척되고, FITC-표지된 염소 항-마우스 IgG(Pharmingen)가 뒤따르는 B7 도메인(즉, Mab 9E10)에 특이적인 1mg 단일클론 항체로 인큐베이트되고, FACS에 의해 분석된다.

ScFv의 5T4-항원으로의 결합은 5T4-항원(5T4-세포감염된 A9 세포) 또는 대조군 세포(A9)를 발현하는 타겟 세포를 이용하여 유사하게 평가된다.

(실시예 6) 동시-자극성 활성의 분석

HC11와 같은 Balb/c 오리진의 확인된 무이스 세포주는 인간 5T4-항원을 인코딩하는 cDNA로 세포감염되고(Myers et al 1994 J. Biol. Chem. 269:9319-9324), 발현 벡터 pCIneo 내로 삽입된다.

Balb/c 마우스 특이적 T-세포 표준 절차에 의해 분리된다(Johnstone and Thorpe 1996 In Immunochemistry in Practice. Blackwell. Chapter 4). T-세포는 10ng/ml PMA(Sigma) 및 100U/ml 인간 IL-2(Boehringer Mannheim)을 함유한 배지 내에서 1∼2일간 인큐베이션함으로서 미리-자극된다. HC11-5T4 세포는 96-웰 조직 배양 트레이의 10⁴세포/웰에서 SCM 유전자로 세포감염된 COS 세포로부터의 0.1ml까지의 상청액으로 인큐베이트된다. 105 미리-자극된 T-세포까지가 각각의 웰에 첨가되고, 세포는 0.25mCi/웰³H-티미딘으로 펄스(pulse)되고,³H-티미딘의 통합은 24시간 후 액상 신틸레이션(scintillation) 카운터를 이용하여 측정된다.

(실시예 7) 동물 모델 내에서의 동시-자극 분석

인간 5T4-항원 유전자로 세포감염된 HC11 세포는 Balb/c 마우스 내에서 종양으로 생장된다. SCM 유전자 B7-1.5T4.1 또는 B7-2.5T4.1 또는 이 두 유전자의 조합은 이식에 앞서 종양 세포 내로 도입되고, 생체 내에서 종양의 생장 및 SCM 유전자를 발현하지 않는 대조군의 생장이 모니터된다.

(실시예 8) 인간 5T4, 융합 단백질에 특이적인 B7-1/ScFv의 구조

표준 분자생물학 기술이 B7-1의 리더 서열 및 세포외 도메인으로 구성된 융합 단백질을 구조하고, 유연성 있는 링커를 통해 인간 5T4에 특이적인 쥐과 Mab 5T4의 V_H및 V_L에 융합되는데 이용된다.

B7.1의 세포외 도메인과 ScFv를 연결하는데 이용된 유연성 있는 링커는 5'SmaⅠ 및 3'SpeⅠ사이트로 설계된 2개의 올리고뉴클레오타이드를 어닐링함으로서 구조되었다 - 다음의 올리고뉴클레오타이드를 이용하여

상위

5' GGG GGT GGT GGG AGC GGT GGT GGC GGC AGT GGC GGC GGC GGA A 3'

및 하위

5' CTA GTT CCG CCG CCG CCA CTG CCG CCA CCA CCG CTC CCA CCA CCC CC 3'

링커는 pLINK를 생성하는 SmaⅠ 및 SpeⅠ을 통해 pBluescript(Stratagene) 내로 클론된다. 시그날 펩티드(sp) 및 쥐과 B7.1의 세포외 도메인은 5'EcoRI 및 3'SmaⅠ 사이트를 도입하는 프라이머를 통해 pLK444-mB7.1(R. Germain NIH, USA에 의해 보충된)로부터 PCR에 의해 증폭되었다 -

전방 프라이머

5' C TCG AAT TCC ACCATGGCT TGC AAT TGT CAG TTG ATG C 3'

역

5' CTC CCC GGG CTT GCT ATC AGG AGG GTC TTC 3'

B7.1 PCR 생성물은 pBS/B7Link를 형성하는 EcoRI 및 SmaⅠ를 통해 pLINK 내로 클론되었다. 5T4 특이적 ScFv의 V_H및 V_L이 프라이머를 통해 증폭되었다 -

전방 프라이머

5' CTC ACT AGT GAG GTC CAG CTT CAG CAG TC 3'

역 프라이머

5' CTC GCG GCC GCT TAC CGT TTG ATT TCC AGC TTG GTG CCT CCA CC 3'

- pHEN1-5T4 ScFv로부터 5'SpeⅠ 및 NotⅠ 사이트를 도입함. PBS/B7Link는 SpeⅠ 및 NotⅠ으로 분해되었고, ScFv로 결찰되어 서열번호: 11 : B7 Link ScRv 서열에 나타난 서열로 구성된 OBN 233을 형성한다(도 5).

이러한 융합은 재조합 바이러스 즉, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 폭시바이러스, 백시니아바이러스, 바큘로바이러스를 구조하는데 이용될 수 있다. 이러한 벡터는 환자 종양을 직접적으로 주사하는데 이용될 수 있다. 종양 세포 내로 융합 단백질의 전달하기 위해 재조합 벡터가 환자 내로 다시 주사되기 전에 생체 외에서 대식세포/단핵세포/CD34+ 세포를 형질도입하는데 이용된다. 이러한 세포는 종양에 거래될 것이다. ScFv는 종양 세포 표면 즉, 5T4 상에 발현되는 특이적 종양 항원에 결합할 것이다(Myers et al 1994 JBC). B7은 전문적인 항원 제시 세포 즉, 대식세포, 수상돌기세포 및 B 세포의 표면 상에서 발견된다. 이는 CD4 및 CD6 세포 상에 위치한 리간드 CD28 및 CTL-A4와 상호작용한다. B7-CD28/CTL-A4와 MHC-펩티드/T 세포 수용체의 동시 상호작용은 CD8(세포독성적 T 세포) 확장을 증진시키는 IL-2에서의 명백한 증가를 유발한다(Linsley PS, Brady W, Grosmaire L, Aruffo A, Damle NK, Ledbetter JA J Exp Med 1991Mar 1;173(3):721-730 Binding of the B cell activation antigen B7 to CD28 costimulated T cell proliferation and Il-2 mRNA accumulation). B7로 세포감염된 종양 세포는 동물모델에서 지연을 나타내었다(Townsend SE, Allison JP Sciecne 1993 15;259(5093):368-370).

(실시예 9) B7-1/ScFv 및 리더 ScFv(LScFv)의 일시적 발현 및 정제

B7-1/ScFv의 일시적 발현을 위해 인간 CMV 발현 플라스미드 pCIneo(Promega)가 사용되었다. B7/ScFv가 EcoRI/NotI로의 분해에 의해 OBM 233로부터 삭제되었고, EcoRI/NotI로 미리 분해된 pCIneo 내로 클론되었다. 재조합 단백질의 일시적인 발현은 인산칼슘(Profectin, Promega)를 이용한 적절한 플라스미드로의 293T 세포의 세포감염에 의해 이루어진다. 사용된 조건은 제조사에 의해 추천된 것과 유사하였다. 소혈청 오염을 감소시키기 위해 혈청이 없는 최적 배지(Gibco BRL)를 사용하였다. 36∼48시간 후 세포감염 상청액은 배양되었고, Centriprep(Amicon, Glos. UK) 10 필터(10kDa 보다 큰 모든 단백질은 정제/농축된다) 및 Centricon(Amicon) 10 필터를 통해 회전되었다. 상청액은 약 30배 농축된다.

생물학적으로 기능적인 B7-1를 위해 이는 T 세포의 특이적 집단의 표면(즉, CD4+) 상에서 발견된 그의 천연 리간드 CTLA-4 또는 CD28와의 결합을 디스플레이할 수 있어야 한다. 생물학적 활성 B7-1/ScFv 융합 단백질은 그의 천연 리간드 CTLA-4(Ancell, MN, USA에 의해 공급된 CTLA4-Ig의 형태) 및 인간 5T4를 발현하는A9 세포와의 동시 상호작용에 대해 분석되었다. 간단히 : 약 5 ×10⁵A9-h5T4 세포가 1시간 동안 4℃에서 96 웰 플레이트 U 바닥에서 100㎕의 B7.1/ScFv 또는 LScFc 상청액으로 인큐베이트되었다. 세척 후 세포는 1시간 동안 CTLA4-Ig(Ancell)로 인큐베이트되었다. 세척 후 결합된 CTLA4-Ig는 FITC 컨쥬게이트된 항-마우스 Ig(Dako)를 이용하여 검출되었다.

결과는 ScFv를 통해 결합된 B7-1 세포외 도메인과 함께 CTLA4-Ig의 인간 5T4 양성 A9 세포 표면으로의 분명한 결합을 나타낸다. 5T4 음성 A9 세포와의 결합 활성의 부재는 B7와의 CTLA4-Ig의 상호작용 및 ScFv와 5T4의 상호작용이 특이적임을 더욱 나타낸다.

(실시예 10) ScFv-IgG 융합 단백질

ScFv-IgG의 구조

번역 개시 서열 및 인간 면역글로블린 카파(kappa) 라이트 체인 시그날 펩티드를 인코딩하는 서열은 어닐될 때 5' 말단에 내부XhoⅠ사이트를 포함하고, 이에 더하여XbaⅠ양립가능한 5' 돌출부 및PstⅠ양립가능한 3' 돌출부를 남기는 2개의 상보적 단일 나선의 올리고뉴클레오타이드로서 합성된다 -

ctagactcgagCCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC GAG GTC CAG ctgca

및

g CTG GAC CTC GGA GTG GAC ACC TGT AGC TGT TGC TAC CAA GAA GAG GAT GAT ACA GCT CCA TCC CAT GGTGGctcgagt

그 후 이는XbaⅠ및PstⅠ로 제한된 pBluescriptⅡ(Stratagene) 내로 클론되어 pBSⅡ/Leader를 생성한다.

5T4 ScFv는 생성물의 5' 말단에서PstⅠ사이트를, 3' 말단에서HindⅢ을 통합시키는 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 pHEN1으로부터 PCR에 의해 증폭된다.

GTC CAG CTG CAG CAG TCT GG

및

CG TTT GAT TTC AAG CTT GGT GC

그 후 이는 효소로 제한되고, 동일한 효소로 제한된 pBSⅡ/Leader 내로 삽입되어 pBSⅡ/Leader/ScFv를 생성한다.

HIgG 컨스턴트(constant) 구역은 5' 말단에서HindⅢ사이트를, 3' 말단에서XhoⅠ사이트를 통합시키는 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 클론된 유전자로부터 PCR에 의해 증폭된다.

gcgc AAG CTT gaa atc aaa cgg GCC TCC ACC AAG GGC CCA

및

gcgc ctcgag TCA TTT ACC CGG AGA CAG GG

그 후 이는 효소로 제한되고, 동일한 효소로 제한된 pBSⅡ/Leader/ScFv 내로 삽입되어 pBSⅡ/Leader/ScFv/HG1을 생성한다. 이러한 구조물에 대한 서열은 도 4에 나타나 있다(서열번호: 10).

이러한 융합은 재조합 벡터 즉, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 폭시바이러스, 백시니아바이러스, 바큘로바이러스를 구조하는데 이용될 수 있다. 이러한 벡터는 환자 종양을 직접적으로 주사하는데 이용될 수 있다. 종양 세포 내로 융합 단백질의 전달하기 위해 재조합 벡터가 환자 내로 다시 주사되기 전에 생체 외에서 대식세포/단핵세포/CD34+ 세포를 형질도입하는데 이용된다. 이러한 세포는 종양에 거래될 것이다. ScFv는 종양 세포 표면 즉, 5T4 상에 발현되는 특이적 종양 항원에 결합할 것이다(Myers et al 1994 JBC). 결합된 IgG는 항체 의존적 세포 독성으로 집합적으로 알려진 메카니즘의 컬렉션(collection)을통해 특이적 종양 파괴를 증진시킬 것이다(Munn et al Can res 1991ibid, Primus et al 1993 Cancer Resibid).

(실시예 11) ScFv-IgE1(인간 IgE1 헤비 체인 구역)의 구조

5T4 ScFv-인간 IgE 컨스턴트 헤비 체인의 유사한 융합 구조물이 도 7에 나타난 서열로 구성된다(서열번호: 12).

이러한 융합 구조물은 RT에 의한 인간 B-세포 RNA로부터 유도된 PCR cDNA에 의해 인간 IgE1 컨스턴트 헤비 구역을 증폭시키고, 다음에 5' 말단에서HindⅢ사이트를, 3' 말단에서XhoⅠ사이트를 통합시키는 올리고뉴클레오타이드를 이용함으로서 생성된다.

gcgc AAG CTT gaa atc aaa cgg GCC TCC ACA CAG AGC CCA

및

gcgcctcgag TCA TTT ACC GGG ATT TAC AGA

그 후 이는 효소로 제한되고, 동일한 효소로 제한된 pBSⅡ/Leader/ScFv 내로 삽입되어 pBSⅡ/Leader/ScFv/HE1을 생성한다.

상기에 기술된 바와 같이 ScFv-IgE 구조물은 암의 유전자 치료를 위한 이용 즉, 환자 조직에 직접적으로 주사 또는 생체 외에서 환자 유도된 대식세포/단핵세포/CD34+ 세포를 형질도입하기 위해 재조합 바이러스 벡터 내로 통합될 수 있다. 융합 단백질은 분비될 것이고, ScFv가 특이적인 항원을 품은 종양 세포에 결합할 것이다. 종양 세포로의 IgE의 결합은 마스트(mast) 세포의 활성화를 통해 강한 히스타민 반응을 증진시켜야 한다. 이는 기생충 즉, 기생충 유생의 IgE 세포독성적 파괴에 대해 보고된 바와 같이(Capron M 1998 Eosinophils in disease: receptors and mediators. In progress in allergy and clinical immunology (Proc. 13th Int. Congress of Allergy and Clinical Immunology) Hogrefe & Huber Toronto p6) 강한 염증성 반응 및 종양 파괴를 유발할 것이다. 이러한 염증 및 종양 파괴는 다른 면역 효과기 세포의 모집을 개시해야 한다. 과거의 보고는 MMTV 항원 특이적 IgE Mab으로의 치료가 종양이 MMTV 항원을 발현하는 것을 방지하도록 한다는 것을 나타낸다(Nagy E Istanvan B, Sehon AH 1991 Cancer Immunol. Immunotherapy vol 34:63-69).

(실시예 12) B7/EGF의 구조

B7-EGF 합성 유전자

B7-EGF의 융합 구조물은 성숙 EGF 펩티드(기탁번호 X04571 참조)를 인코딩하는 유전자의 구역으로부터 증폭된 PCR 생성물을 pBS/B7 Link 내로 삽입시킴으로서 생성된다. 이러한 구조물은 도 8에 나타난 서열을 지닌다(서열번호: 13).

293 인간 신장 라인(ATCC: CRL1573)과 같은 세포주로부터 분리된 RNA의 RT에 의해 유도된 cDNA를 이용하여 DNA는 N-말단에SpeⅠ제한 효소 사이트를, C-말단에 종결 코돈 및NotⅠ사이트를 함유한 올리고뉴클레오타이드를 이용한 PCR에 의해 증폭된다.

GG ACT AGT AAT AGT GAC TCT GAA TGT CCC

및

ATT AGC GGC CGC TTA GCG CAG TTC CCA CCA CTT C

결과적인 생성물은 효소에 의해 분해되고, 동일한 효소로 제한된 pBS/B7 Link에 결찰되어 pBS/B7 Link EGF를 생성한다. pBS/B7 Link EGF 카세트는 그 후 Eco RI 및 NotⅠ에 의해 절단되고, 더 이상LacZ유전자를 운반하지 않는 pHIT111(Soneoka et al. 1995, Nucl Acid Res 23;628) 유도체 내로 삽입된다.

ScFv를 이용한 또다른 것은 그들에 상응하는 수용체에 높은 친화력을 지닌 생장 인자 즉, 종양생성에 크게 관련된 erb-2를 포함한 여러 수용체에 결합하는 상피 생장 인자를 이용하는 것이다.

상기에 기술된 바와 같이 융합 구조물은 암의 유전자 치료를 위한 이용 즉, 환자 조직에 직접적으로 주사 또는 생체 외에서 환자 유도된 대식세포/단핵세포/CD34+ 세포를 형질도입하기 위해 재조합 바이러스 벡터 내로 통합될 수 있다. 융합 단백질은 분비될 것이고, erb-2 항원을 품은 종양 세포에 결합할 것이다.

상피 생장 인자(EGF)는 그의 리간드 erb-2(EGF 수용체)에 결합할 것이고, 따라서 ScFv의 요구를 미연에 방지할 것이다. Erb-2는 종양 세포에 밀접하게 관련된다(Hynes NE Semin Cancer Biol 1993 Feb;4(1):19-26, Amplification and over expression of the erb-2 gene in human tumors: its involvement in tumor development, significance as a prognostic factor, and potential as a target for cancer therapy). B7은 전문적인 항원 제시 세포 즉, 대식세포, 수상돌기 세포 및 B 세포의 표면 상에서 발견된다. 이는 CD4 및 CD8 세포 상에 위치한 리간드 CD28 및 CTL-A4와 상호작용한다. B7-CD28/CTL-A4와 MHC-펩티드/T 세포 수용체와의 동시 상호작용은 CD8(세포독성적 T 세포) 확장을 증진시키는 IL-2의 대량 증가를 유발한다(Linsley PS, Brady W, Grosmaire L, Aruffo A, Damle NK, Ledbetter JA J Exp Med 1991Mar 1;173(3):721-730 Binding of the B cell activation antigen B7 to CD28 costimulated T cell proliferation and Il-2 mRNA accumulation). B7로 세포감염된 종양 세포는 동물 모델에서 지연을나타내었다(Townsend SE, Allison JP Sciecne 1993 15;259(5093):368-370 Tumor rejection after direct costimulation of CD8+ T cell by B7-transfected melanoma cells). 이는 B7이 종양에 특이적인 종양 항원으로의 CTL 반응을 강화시킬 것이고, 따라서 이러한 세포 모두의 파괴를 유발할 것이다.

(실시예 13) 융합 구조물을 발현하는 세포주의 생성

ScFv-IgG 유전자는 XhoⅠ 분해에 의해 pBSⅡ/ScFv/hIgG1으로부터 절단되었고, pLXSN/ScFv-IgG를 생성하도록 XhoⅠ 사이트를 통해 pLXSN 내로 클론되어, 염색체 통합 후 LTR의 전사 제어 하에 놓이게 된다. 바이러스는 3중 플라스미드 HIT 시스템을 이용하여 MLV gap-pol 유전자(pCIEGPPD) 및 VSV G 엔벨로프(pRV67)를 포함한 동시-세포감염 플라스미드에 의해 인간 신장 세포주 293T 내에 생성된다(Landau & Littman 1992 J Virol 66 5110, Soneoka Y et al 1995 NAR 23:628-633). 바이러스는 48시간 후 배양되고, BHK-21 세포(ATCC# CCL-10)를 형질도입하는데 이용된다. 약 24시간 후-형질도입에서 형질도입된 세포는 배양 배지 내로의 1mg/ml의 G418(Gibco BRL)의 첨가에 의해 선택된다. 양성 콜로니로부터의 상청액이 수확되었고, Centriprep(Amicon, Glos. UK) 10 필터(10kDa 보다 큰 모든 단백질은 정제/농축된다) 및 Centricon(Amicon) 10 필터를 통한 원심분리에 의해 농축되었다. 상청액은 약 30배 농축되었다.

다른 융합 구조물은 유사한 프로토콜을 이용하여 XhoⅠ 사이트를 통해 pLXSN 내로 클론되고, 발현되고, 농축된다.

특이적 리간드 발현 세포에 결합하는 융합 단백질의 FACS 분석

ScFv-IgG 융합 단백질이 그의 항원, 인간 5T4에 특이적인지 여부를 측정하기 위해 인간 방광 암종 종양 라인(EJ) 또는 h5T4, A9-h5T4를 발현하는 안정한 쥐과 세포주(Myers et al 1994 JBC) 및 5T4 음성 라인 A9-neo의 FACS 분석이 수행되었다. 96 웰 플레이트 라운드 바닥 내의 약 5 ×10⁵A9 또는 EJ 세포가 4℃에서 1시간 동안 1 : 5 희석의 농축된 상청액 100㎕와 함께 인큐베이트되었다. 세척 후 결합된 단백질이 항 인간 IgG/FITC 컨쥬게이트된 항체(Dako)를 이용하여 검출된다. 세포는 Becton Dickinson FACS 기계 상에서 분석되었다. FACS 결과는 ScFv 단백질 단독으로 구성된 음성 대조군 구조물에 비교하여 ScFv-IgG 구조물로 처리된 5T4 양성 세포의 형광 활성에 있어서 적어도 1 롱 쉬프트(lon shift) 이상이 있음을 나타낸다. A9 neo FACS는 융합 단백질의 ScFv 구성성분으로의 비-특이적인 결합이 전혀 없음을 나타낸다.

ScFv-IgE의 FACS 분석은 항-인간 IgE-FITC(Dako)가 융합 단백질의 결합을 검출하는데 이용된다는 점을 제외하고는 상기와 유사하게 수행된다.

B7/EGF 융합 단백질은 FACS 및 HC11-erb-2 양성 세포를 이용한 결합에 대해 분석된다(Hynes et al 1990). CTLA4-Ig(Ancell, USA)이 결합된 융합 단백질의 B7 구성성분의 생활성을 분석하는데 이용된다. 항-마우스 IgG-FITC는 CTLA-4 결합을 나타내는데 이용된다.

융합 단백질의 분석

B7-scFv의 Facs 분석

재조합 단백질은 하기 플라스미드 pCIneo(Promega) 내 scFv(도 13b)의 c-말단에서 기술된 바와 같이(증명 및 정제를 가능하게 함) 안정적으로 세포감염된 BHK-21 세포주로부터의 발현에 의해 생성되었다. scFv가 5T4 항원에 결합할 수 있다는 것을 설명하기 위해 이들 및 모형 세포감염된 293T 세포로부터의 상청액이 h5T4 발현 마우스 A9 세포내로 첨가되었다(h5T4/네오마이신 저항성 발현 구조물로의 안정적인 세포감염체). FITC 컨쥬게이트된 αHis 또는 αMyc 항체를 이용한 검출은 5T4 음성 A9 neo 세포가 아닌 A9-5T4 세포로의 scFv 결합을 확인하였고, 융합 단백질이 타겟 항원에 결합할 수 있다는 것을 나타내었다(도 14).

또한 FACS 분석은 B7-scFv 단백질이 B7.1 리간드, CTLA4 및 세포 발현 h5T4에 동시에 결합할 수 있다는 것을 나타내기 위해 수행되었다. A9 5T4 및 A9 neo 세포는 scFv 단독, Myc-His 태그 없는 B7-scFv 구조물 또는 태그된 B7-scFv 구조물로 인큐베이트되었다. B7.1 리간드, CTLA4-Ig가 첨가되었고, FITC 컨쥬게이트된 α마우스 IgG를 이용하여 검출되었다(도 15). Myc-His 태그의 존재 유무는 단백질의 5T4 항원 및 CTLA-4로의 동시 결합에서의 작은 차이점을 만든다.

5T4 scFv HIgG 1 단백질의 분석

재조합 단백질은 CMV 즉각적/초기 프로모터의 조절 하에 5T4 scFv 단독 또는 5T4scFv-Hg1(각각 도 13A & C) 융합을 포함한 구조물을 지닌 BHK-21 세포의 안정한 세포감염에 의해 생성되었다. 도 16은 마우스 A9 5T4 세포의 FACS 분석을 나타낸다. 세포는 염소 항-인간 IgG-FITC 표지된 항체가 뒤따르는, scFv 단독 또는 scFv-HF1을 발현하는 BHK-21 세포로부터의 상청액 세포와 함께 인큐베이트되었다. 나타나는 바와 같이 scFv-HG1은 5T4 발현 세포에 결합할 수 있고, 염소 항-인간 IgG-FITC 표지된 항체로 검출될 수 있다. 도 16b는 h5T4가 아닌 네오마이신 저항성 마커를 발현하는 A9 세포에서 어떤 결합도 발견되지 않기 때문에 이것이 세포 표면에서의 5T4의 존재에 기인한다는 것을 나타낸다.

동일한 상청액이 scFv-Hγ1 융합 단백질이 A9 5T4 세포의 세포 용해를 지시할 수 있다는 것을 증명하는 항체 의존적 세포-매개 세포독성(ADCC) 에세이에 이용되었다. A9 5T4 및 neo 세포주는 크로뮴 방출 에세이에 사용되었다.⁵¹Cr으로의 표지 후 세포는 단백질 없는 scFv 단독 또는 scFv-Hγ1 융합 구조물로 인큐베이트되었다. 신선하게 분리된 말초 혈액 림파구가 첨가되었고, 4시간 동안 인큐베이트되었다. 상청액의 알리쿼트가 실틸레이션 카운팅을 위해 취해졌다.

% 세포용해는 다음과 같이 산출된다 :

40%까지의 세포용해가 scFv 단독과 비교하여 효과기 : 타겟 비율의 증가와 함께 얻어졌다. 5T4 음성 세포주는 어떤 증가된 세포용해를 나타내지 않았다(도 17).

(실시예 14) 동물 모델에서의 효율성 분석

인간 종양-유도된 세포주 및 조직은 잘 알려진 기술에 따라 유전적으로 면역결핍된 "누드(nude)" 마우스 생체 내에서 배양되었다(예를 들어 Strobel et al. 1997 Cancer Res. 57:1228-1232; McLeod et al. 1997 Pancreas 14:237-248). 공통 유전자 종양 라인이 면역충분 마우스 스트레인(strain) 내로 도입된 공통 유전자 마운스 모델이 또한 이용된다. 이는 본 발명의 유전자 절달 시스템을 측정하기 위한 적당한 동물 모델로 작용한다. 벡터 또는 설계된 세포가 종양 내로 합성적으로 또는 직접 투여되고, 종양 생장이 치료 및 비-치료된 동물 내에서 모니터된다. 이러한 시스템은 본 발명의 치료의 효과적인 투여 범위 및 가장 적당한 투여 루트를 정의하는데 이용된다.

scFv 융합 단백질 생체 내 항 종양 효능 데이터

본 연구의 목적은 단일 체인 항체 융합 단백질의 시리즈의 효능을 시험하는 것이었다.

CT26에 기초한 쥐과 마우스 모델은 BALB/c 오리진의 아데노카시노마(adenocarcinoma)를 화학적으로 유도하고(Brittain et al. 1980 Cancer Res. 40:179-184), B16에 기초한 것은 C57 B6 마우스로부터 유도된 흑색종 라인을 화학적으로 유도한다. CT26 라인 및 B16 모두 인간 및 마우스 5T4를 발현하도록 안정하게 형질전환된다. 마우스는 단일 대량 피하 종양을 생성하기 위해 I.V(폐 노듈(nodule)을 유도) 또는 피하로 주사된다.

실험 디자인

인간 5T4 발현 CT26 세포(CT26-hT4) 및 CT26-neo

세포는 하기와 함께 미리-인큐베이트되었다 :

PBS, LScFv-1, LScFv-2, B7-ScFv, ScFv-Ig

LScFv-1 및 2는 BHK 세포주 내에서 발현되었다. LScFv-1은 Nicker 컬럼 상에서 그의 히스티딘 태그를 통해 정제되었고, ScFv-2는 여과 시스템을 이용하여 정제되었다. B7-ScFv는 His 태크를 통해 BHK 라인으로부터 정제되었고, ScFv-Ig는 여과 컬럼을 통해 정제되었다. 실험에 이용된 각각의 ScFv의 농도는 FACS 에세이에서의 CT26-h5T4 세포의 결합을 포화하는데 필요한 단백질 양으로 정의되었다.

CT26-h5T4 및 CT26-neo 세포는 각각의 ScFv 포화량으로 미리-인큐베이트되었고, 1시간 동안 인큐베이트되었다. 세포 세척 후 5 ×10⁵세포가 합성적 BALB/c 마우스의 옆구리 내 피하로 주사되었다.

종양 측정은 2일 마다 행해졌고, 부피가 산출되었다.

결과 14

도 9 : CT26-neo

종양 접종 36일 후 PBS 대조군과 비교하여 약 3배 종양 크기가 감소된, LScFv-1로 처리된 것으로부터의 개별적인 연구 그룹 사이에서는 유의적인 차이가 없다.

도 10 : CT26-h5T4

모든 5T4 ScFv 구조물로 처리된 종양은 종양 생장 상에 유의적인 효과를 나타냈다. 5T4 ScFv-1로 처리된 마우스의 4/5는 36일에 종양이 없었다. 36일에 ScFv-1로 처리된 종양 세포는 PBS로 처리된 종양 보다 >60배 보다 작았다.

유사한 실험이 h5T4를 발현하도록 설계된 마우스 흑색종 라인(B16)을 이용하여 수행될 경우 최소한의 항-종양 효과가 이용된 ScFv 구조물에서 발견되었다(도 11 및 12 참조). CT26은 B16 세포 보다 ScFv 결합에 의해 유도된 항-종양 면역 반응에 더욱 민감한 것으로 보인다. 더욱이 B16 세포는 쥐과 5T4를 발현하지 않는 반면 CT26 세포는 쥐과 5T4에 대한 mRNA를 지닌다.

요약적으로 CT26 및 B16 쥐과 모델에서 B7 또는 IgG의 ScFv 특이적 5T4로의융합의 어떤 이익도 없는 것으로 보인다. 사실상 ScFv 단독 그의 높은 결합 친화력에 기인하여 ScFv 융합 구조물 보다 더 효과적이라는 것이 실시예에서 발견되었다(B7-ScFv와 비교된 BIACORE에 나타난 바와 같이). 따라서 이러한 데이터는 ScFv 단독이 종양 지연에 유의적인 효과를 지니고, ScFv에 융합된 면역 강화 분자는 5T4 모델에서 종양 지연에 효과를 나타낼 필요가 없다.

(실시예 15) 융합 구조물을 발현하는 렌티바이러스 벡터의 생성

B7-5T4 scFv 및 L-5T4 scFv의 pONY8.1SM 내로의 클로닝

pONY8.1SM(도 18)은 CMV 프로모터의 4개의 유일한 클로닝 사이트 하위를 지닌 EIAV 벡터이다. 이는 WO 99/32646, 도 1에 나타난 벡터로부터 유도된다. pONY8.1SM은 그것이 포함하는(∼1.1kb) EIVA 서열 및 발현하는(없음) EIVA 단백질에 있어서 기입하는 가장 최소한의 EIAV 벡터이다.

pONY8.1SM 내로 B7-5T4 scFv 및 Leader-5T4 scFv(L-5T4 scFv)을 클론하기 위해 서열은 pBluescriptⅡ(실시예 8 및 10 참조) 내로 앞서 클론된 구조물로부터 PCR에 의해 증폭되어, 하기의 프라이머를 이용하여 유전자의 5' 말단에서의SbfⅠ사이트 및 종결 코돈 후의EcoRI사이트를 통합한다. 그 후 생성물은 pONY 8.1 SM 내로 결찰되고, 동일한 효소로 앞서 분해된다.

B7-5T4 scFv을 위한 프라이머는 하기와 같다 :

프라이머 1. B7-Sbf

ATCGCCTGCAGG CCACC ATG G CTTGCAATTGTCAG

SbfⅠ 사이트 = 밑줄친

Kozak 서열 = 밑줄친 ATG 시작 코돈을 지닌 굵은 이탤릭체

프라이머 2.5T4sc-RI

GCGCGAATTC TTA CCGTTTGATTTCCAGCTTGGT

EcoRI 사이트 = 밑줄친

TAA 종결 코돈 = 굵은 이탤릭체

결과적인 생성물은 도 19a에 나타난 융합 단백질 구조물을 생성하기 위해 pONY 8.1 SM 내로 클론된다.

L-5T4 scFv를 위한 프라이머는 하기와 같다 :

프라이머 1. L-Sbf

ATCGCCTGCAGG CCACC ATG G GATGGAGCTGTAT

SbfⅠ 사이트 = 밑줄친

Kozak 서열 = 밑줄친 ATG 시작 코돈을 지닌 굵은 이탤릭체

프라이머 2.5T4scRI

GCGCGAATTC TTA CCGTTTGATTTCCAGCTTGGT

EcoRI 사이트 = 밑줄친

TAA 종결 코돈 = 굵은 이탤릭체

결과적인 생성물은 도 19b에 나타난 구조물을 생성하기 위해 pONY 8.1 SM 내로 클론된다.

IL-5에 특이적인 scFv의 어셈블리(assembly) 및 클로닝

항-IL-5 scFv는 IL-5, SB 240563에 대해 휴머나이즈드(humanised)된 Mab을 발현하는 것과 같은 하이브리도마(hybridoma) 라인으로부터 준비된 물질을 이용한 RT-PCR에 의해 어셈블된다(Leckie, MJ, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 159, A624 1999). 기술은 Clackson et(Genetically engineered monoclonal antibodies. Br J Rheumatol. 1991;30 Suppl 2:36-9)에 의해 기술된 것과 유사하다. 간단히 총 RNA는 SB 240563 세포로부터 준비된다. 첫 번째 스트랜드 합성은 올리고 dT 프라이머를 이용한 MMLV 역전사효소를 이용하여 수행된다. 주형 cDNA는 하기에 나타난 바와 같이 제한 효소 사이트를 포함하는 V_H및 V_L유전자 특이적 프라이머에 의해 증폭되어 pKLINK 내로 유연성있는 링커 서열, (Gly₄Ser)₃을 포함한 pBluescriptⅡ SK(pBSⅡ) 플라스미드 클로닝하는 것을 가능하게 한다(도 20). 이는 단일 체인 항체 cDNA를 형성한다(도 19). 5T4로의 scFv의 구조에 기술된 것과 유사하게(실시예 10 참조) 번역 개시를 인코딩하는 이중 스트랜드 올리고뉴클레오타이드, Kozak 서열 및 분비를 위한 인간 Ig 카파 라이트 체인 시그날 펩티드가 scFv의 상부에 클론된다(도 21).

그 후 전체 구조물은SbfⅠ및Eco RI에 의해 절단되고, pONY8.1SM 내로 클론된다(도 22).

HIV의 엔벨로프 단백질 gp120에 특이적인 scFv의 어셈블리 및 클로닝

항-HIV scFv는 mAb110.3와 같이 HIV의 엔벨로프 단백질 gp120으로 mAb를 발현하는 하이브리도마 라인으로부터 준비된 물질을 이용하여 RT-PCR에 의해 어셈블된다(Conelly et al, Virology 295:554-557, 1994). 또한 유도된 선택은 scFv가 유도되는 휴머나이즈된 항체를 생성하는데 이용된다(Beiboer SH et al J Mol Biol, 2000;296:833-849 참조). 기술은 Clackson et(Genetically engineered monoclonal antibodies. Br J Rheumatol. 1991;30 Suppl 2:36-9)에 의해 기술된 것과 유사하다. 간단히 총 RNA는 하이브리도마 세포로부터 준비된다. 첫 번째 스트랜드 합성은 올리고 dT 프라이머를 이용한 MMLV 역전사효소를 이용하여 수행된다. 주형 cDNA는 하기에 나타난 바와 같이 제한 효소 사이트를 포함하는 V_H및 V_L유전자 특이적 프라이머와 함께 증폭되어 pKLINK 내로 유연성있는 링커 서열, (Gly₄Ser)₃을 포함한 pBluescriptⅡ SK(pBSⅡ) 플라스미드를 클로닝하는 것을 가능하게 한다(도 20). 이는 단일 체인 항체 cDNA를 형성한다(도 19). 5T4로의 scFv의 구조에 기술된 것과 유사하게(실시예 10 참조) 번역 개시를 인코딩하는 이중 스트랜드 올리고뉴클레오타이드, Kozak 서열 및 분비를 위한 인간 Ig 카파 라이트 체인 시그날 펩티드가 scFv의 상부에 클론된다(도 21).

그 후 전체 구조물은SbfⅠ및Eco RI에 의해 절단되고, 도 23에 나타난 구조물을 생성하도록 pONY8.1SM 내로 클론된다(도 18).

(실시예 16) 융합 구조물을 발현하는 아데노바이러스 벡터의 생성

5T4scFv 융합 구조물, IL-5 scFv 및 HIV gp120 scFv를 발현하는 재조합 아데노바이러스의 생성

pAdApt 내로의 B7-5T4 scFv 및 L-5T4 scFv 클로닝

CMV 프로모터의 8개 유일한 클로닝 사이트 하부를 지닌 아데노바이러스 트랜스퍼 벡터(pAdApt; 도 24 참조)는 Crucell, Leiden, Netherlands로부터 유용하다.

pAdApt 내로 B7-5T4 scFv 및 Leader-5T4 scFv를 클론하기 위해 서열이 pBluescriptⅡ 내로 앞서 클론된 구조물로부터 절단되고(실시예 8 및 10), 하기와 같이 벡터 내로 결찰된다 :

B7-5T4 scFv를 위해 :

B7-scFv는XbaⅠ으로 분해되고, 블런트(blunt) 말단을 제공하도록 채워진 후Eco RI로 분해된다. 이러한 단편은HpaⅠ및Eco RI로 미리 분해된 pAdApt 벡터에 결찰된다(도 25a).

L-5T4 scFv를 위해 :

L-5T4 scFv는XhoⅠ로 절단되고, 블런트(blunt) 말단을 제공하도록 채워진 후HpaⅠ로 미리 분해된 pAdApt 벡터에 결찰된다. 하위 클론은 L-5T4 scFv 삽입의 정확한 방향에 대해 체크된다(도 25b).

pAdApt 내로의 IL-5에 특이적인 scFv의 클로닝

pBSⅡ 내로 클론된 L-scFv(실시예 13 참조)는XbaⅠ로 분해되고, 블런트(blunt) 말단을 제공하도록 채워진 후Eco RI로 분해된다. pAdApt 벡터는 블런트 말단을 제공하도록 채워진HindⅢ로 분해되고, 그 후Eco RI로 분해된다. 2개의 분자는 그 후 상기 도 25b와 유사한 재조합 트랜스퍼 벡터를 제공하도록 결찰된다(Eco RI 제한 사이트가 융합 구조물의 3' 말단에 있고, 유전자의 5' 말단이 채워진HindⅢ사이트에 인접한 것을 제외).

HIV의 엔벨로프 단백질 gp120에 특이적인 scFv의 클로닝

pBSⅡ 내로 클론된 L-scFv(실시예 13 참조)는XbaⅠ로 분해되고,블런트(blunt) 말단을 제공하도록 채워진 후Eco RI로 분해된다. pAdApt 벡터는 블런트 말단을 제공하도록 채워진HindⅢ로 분해되고, 그 후Eco RI로 분해된다. 2개의 분자는 그 후 상기 도 25b와 유사한 재조합 트랜스퍼 벡터를 제공하도록 결찰된다(Eco RI 제한 사이트가 융합 구조물의 3' 말단에 있고, 유전자의 5' 말단이 채워진HindⅢ사이트에 인접한 것을 제외).

scFv 융합 구조물을 발현하는 재조합 아데노바이러스의 생성

scFv 융합 구조물을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 생성하기 위해 PerC6 세포는 융합 구조물을 함유한 재조합 트랜스퍼 벡터 및 아데노바이러스 게놈 벡터의 동일분자량으로 세포감염된다(AdEasy from Quantum Apligene, Harefield UK). 재조합 바이러스는 그 후 Crucell 프로토콜에 기술된 바와 같이 수확된다.

요약

따라서 본 발명은 질병 관련 세포 표면 마커(DAM)를 인식하는 것이 가능한 항체를 제공한다. 이러한 항체는 DAM과 관련된 질병의 진단 및 치료에 이용된다.

상기 명세서 내에 기술된 모든 문헌은 참고문헌으로 포함되어 있다. 본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 정신으로부터 분리됨이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시태양과 결합하여 기술되었으나 청구된 본 발명이 이러한 특정한 실시태양에 과도하게 한정되지 않아야 한다는 것이 이해되어야 한다. 사실상 분자생물학 및 관련된 분야의 당업자에게 분명한 본 발명을 수행하기 위해 기술된 방법의 다양한 변형은 본 발명에 의해 포함되어야 한다.

Claims

DAM과 관련된 질병 컨디션의 예방 및/또는 치료를 위한 약의 제조에 있어서 질병 결합 분자(DAM)를 인식하는 것이 가능한 ScFv 항체(ScFv Ab)의 이용
제 1항에 있어서, 상기 DAM은 종양 결합 항원(TAA)임을 특징으로 하는 ScFv Ab의 이용
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 ScFv Ab는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체에 나타난 서열을 지님을 특징으로 하는 이용
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 ScFv Ab는 서열번호 3 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체에 나타난 서열을 지님을 특징으로 하는 이용
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 ScFv Ab는 서열번호 4 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체에 나타난 서열을 지님을 특징으로 하는 이용
제 1항 내지 제 5항의 어느 한 항에 따른 ScFv Ab를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열
제 6항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 6 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체에 나타난 서열을 지님을 특징으로 뉴클레오타이드 서열
제 6항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체에 나타난 서열을 지님을 특징으로 뉴클레오타이드 서열
제 6항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 8 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체에 나타난 서열을 지님을 특징으로 뉴클레오타이드 서열
제 6항 내지 제 9항의 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열 또는 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열
제 6항 내지 제 10항의 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 실시가능하게 연결됨을 특징으로 하는 뉴클레오타이드 서열
제 6항 내지 제 11항의 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열로 구성된 구조물
제 6항 내지 제 12항의 어느 한 항의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 벡터
제 6항 내지 제 13항의 어느 한 항의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 플라스미드
제 6항 내지 제 14항의 어느 한 항의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 숙주 세포
제 6항 내지 제 11항의 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열을 발현하고, 또는 제 12항 내지 15항의 어느 한 항의 발현 실체 내에 존재시 ScFv Ab를 선택적으로 분리하고/또는 정제하는 것으로 구성된 제 1항 내지 제 5항의 어느 한 항에 따른 ScFv Ab 제조 과정
제 16항에 따른 과정에 의해 생성된 ScFv Ab
ⅰ) 각각의 파지가 잠재적인 결합 도메인으로 구성된 단백질을 인코딩하는 핵산 구조물로 구성됨을 특징으로 하는 파지 라이브러리를 제조하고;

ⅱ) 파지의 외부 표면 상에 상기 잠재적인 단백질의 발현 및 잠재적 결합 도메인의 디스플레이를 유발하고;

ⅲ) 잠재적 결합 도메인 및 DAM 타겟이 상호작용하게 하는 조건 하에서 파지라이브러리와 DAM 타겟을 접촉시키고;

ⅳ) DAM 타겟에 결합하는 도메인을 디스플레이하는 파지를 결합하지 않은 파지로부터 분리시키고;

ⅴ) DAM 타겟에 결합하는 단백질을 그의 외부 표면 상에 디스플레이하는 적어도 하나 이상의 파지를 회수하고;

ⅵ) 결합 구조의 두 번째 풍부화된 라이브러리를 생성하기 위해 실험실 내에서 결합 단백질을 증폭하고;

ⅶ) 단계 (ⅲ) 내지 (ⅵ)를 적어도 2회 이상 반복하고;

ⅷ) 실험실 내의 조건 하에서 결합 단백질을 인코딩하는 핵산을 발현하고;

ⅸ) 시그날의 존재 여부를 검출함으로서 결합 단백질이 DAM과 상호작용하는지 여부를 측정하는 :

것으로 구성된 상기 청구항의 어느 한 항에 따른 ScFv Ab를 수득하기 위한 실험실 내에서의(in vitro) 방법
제 18항에 있어서, 상기 실험실 내에서의 방법은 질병 치료에 유용한 ScFv Ab에 대해 스크린하는 것을 특징으로 하는 실험실 내에서의 방법
a) 제 18항 또는 제 19항에 따른 실험실 내에서의 방법을 수행하고;

b) 검출가능한 시그날에 의해 DAM을 인식하는 것이 가능한 하나 또는 그 이상의 ScFv Ab를 확인하고;

c) 하나 또는 그 이상의 ScFv Ab 다수를 제조하는 :

단계로 구성된 과정
a) 제 18항 또는 제 19항에 따른 방법을 수행하고;

b) 검출가능한 시그날에 의해 DAM을 인식하는 것이 가능한 하나 또는 그 이상의 ScFv Ab를 확인하고;

c) 하나 또는 그 이상의 확인된 ScFv Ab로 구성된 약제적 조성물을 제조하는 :

단계로 구성된 과정
a) 제 18항 또는 제 19항에 방법을 수행하고;

b) DAM을 인식하는 것이 가능한 하나 또는 그 이상의 ScFv Ab를 확인하고;

c) DAM을 인식하는 것이 가능한 하나 또는 그 이상의 확인된 ScFv Ab를 변형시키고;

d) 하나 또는 그 이상의 변형된 ScFv Ab로 구성된 약제적 조성물을 제조하는 :

단계로 구성된 과정
제 1항 내지 제 5항의 어느 한 항에서 정의된 또는 제 17항에 따라 또는 제 18항 또는 19항의 실험실 내에서의 방법에 의해 확인된 ScFv Ab에 있어서, 상기 ScFv Ab는 TAA를 인식하는 것이 가능함을 특징으로 하는 ScFv Ab
제 23항에 있어서, 상기 ScFv Ab는 5T4 항원을 인식하는 것이 가능한 ScFv Ab
실험실 내에서의 방법에서 상기 ScFv Ab는 DAM 항원을 인식하고; 상기 실험실 내에서의 방법은 제 18항 또는 제 19항에서 정의된 방법임을 특징으로하는 생체 내에서(in vivo) ScFv Ab로 질병에 영향을 미치는 방법
약제적 조성물을 제조하기 위한 제 1항 내지 제 5항에서 정의된, 제 17항 또는 제 23항 또는 제 24항에서 정의된 ScFv Ab의 이용
ScFv Ab 및 또다른 치료적으로 유용한 작용제로 구성된 제 26항에서 정의된 약제적 조성물
제 27항에 있어서, 상기 다른 치료적으로 유용한 작용제는 프로-드로그 활성화 효소임을 특징으로 하는 약제적 조성물
제 28항에 있어서, 상기 다른 치료적으로 유용한 작용제는 톡신(toxin)임을 특징으로 하는 약제적 조성물
제 26항 또는 제 27항 또는 제 28항 또는 제 29항에 있어서, 상기 ScFv Ab는 5T4 항원을 인식하는 것이 가능함을 특징으로 하는 약제적 조성물
DAM과 관련된 컨디션의 치료를 위한 제 26항 내지 제 30항에 따른 약제적 조성물의 제조에서의 ScFv Ab의 이용
DAM과 관련된 컨디션의 치료를 위해 제 27항 내지 제 30항에서 정의된 또다른 치료적으로 유용한 작용제 또는 동일한 것을 인코딩하는 목적 뉴클레오타이드 서열(NOI)과 조합하여 제 1항에 따른 DAM을 인식하는 것이 가능한 ScFv Ab의 이용
이미지화 및/또는 DAM과 관련된 질병의 치료를 위한 보조적 치료를 위한 제 31항 또는 32항에 따른 ScFv Ab의 이용
제 31 내지 제 33항에 있어서, 상기 질병은 암임을 특징으로 하는 이용
상기 ScFv Ab는 제 1항 내지 제 5항에서 정의된 것이거나 제 17항 또는 제 23항 내지 제 24항에 따른 것이거나 제 6항 내지 제 12항에 따른 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체에 의해 발현된 것임을 특징으로 하는 ScFv Ab의 DAM 결합 특이성을 조절할 수 있는 작용제를 스크린하는 ScFv Ab의 이용
ⅰ) 제 6항 내지 제 12항에서 정의된 ScFv Ab를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 발현 생성물을 제공하고;

ⅱ) 개인으로부터 유도된 표본 내에서 ScFv Ab의 DAM으로의 결합을 분석하는 :

것으로 구성된 개인에서 DAM의 발현 및/또는 활성에 관련된 질병 컨디션을 진단하기 위한 과정으로 상기 결합은 개인에서 DAM의 존재의 지표가 됨을 특징으로 하는 과정
질병 컨디션으로부터 포유류를 보호하는 치료적 반응을 유도하기 위해 제 1항 내지 제 5항에서 정의되거나 제 17항 또는 제 23항 내지 제 24항에 따른 ScFv Ab 또는 제 6항 내지 제 12항에 따른 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체를 직접 발현하는 벡터로 포유류를 접종하는 것으로 구성된, 생체 내에서 DAM 관련된 질병 컨디션으로 포유류 내 치료적 반응을 유도하는 방법
제 37항에 있어서, 상기 질병 컨디션은 암임을 특징으로 하는 방법
여기에 실질적으로 기술되고 수반된 도면으로 참조된 ScFv Ab의 이용
약제적 이용을 위한 ScFv Ab
서열번호 14에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체를 지닌 개과 5T4 폴리펩티드
제 41항에 따른 개과 5T4 폴리펩티드를 인코딩하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열
서열번호 15에 나타난 서열 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체를 지닌 제 42항에 따른 뉴클레오타이드 서열
제 41항에 따른 개과 5T4 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것이 가능한 항체