JP2022548777A - マウスおよびヒト線維芽細胞活性化タンパク質(fap)と交差反応するイヌ線維芽細胞活性化タンパク質に対するモノクローナル抗体 - Google Patents
マウスおよびヒト線維芽細胞活性化タンパク質(fap)と交差反応するイヌ線維芽細胞活性化タンパク質に対するモノクローナル抗体 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、イヌ、マウス、およびヒトのFAPと交差反応することができる、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に対して特異的な抗体、結合ポリペプチド、およびscFvに関する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C. § 119(e)のもとで、その全体が参照により本明細書に組み入れられる2019年9月23日に出願された米国特許仮出願第62/904,272号に対する優先権を得る権利がある。
本出願は、35 U.S.C. § 119(e)のもとで、その全体が参照により本明細書に組み入れられる2019年9月23日に出願された米国特許仮出願第62/904,272号に対する優先権を得る権利がある。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号CA172921のもとで政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に関して一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号CA172921のもとで政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に関して一定の権利を有する。
発明の背景
腫瘍は、がん化細胞および多数の非がん化細胞を含む、細胞の不均一な集団からなる。異なる細胞型の出現率は、腫瘍間で、および腫瘍進行の異なるステージで変動するが、これらには、浸潤性の炎症および免疫細胞、内皮細胞、間葉由来の平滑筋細胞、周皮細胞、ならびに腫瘍関連線維芽細胞(TAF)が含まれ、これらは、本明細書においてまとめて間質細胞と呼ばれる。TAFは、正常な線維芽細胞と表現型において区別される不均一な集団である。線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)は、腫瘍および肉芽組織における、ならびに線維化病変における反応性線維芽細胞のマーカーとして明らかになってきた。
腫瘍は、がん化細胞および多数の非がん化細胞を含む、細胞の不均一な集団からなる。異なる細胞型の出現率は、腫瘍間で、および腫瘍進行の異なるステージで変動するが、これらには、浸潤性の炎症および免疫細胞、内皮細胞、間葉由来の平滑筋細胞、周皮細胞、ならびに腫瘍関連線維芽細胞(TAF)が含まれ、これらは、本明細書においてまとめて間質細胞と呼ばれる。TAFは、正常な線維芽細胞と表現型において区別される不均一な集団である。線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)は、腫瘍および肉芽組織における、ならびに線維化病変における反応性線維芽細胞のマーカーとして明らかになってきた。
FAPは、ポストプロリンジペプチジルアミノペプチダーゼファミリーに属するII型膜貫通細胞表面タンパク質であり、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV/CD26)と最も高い類似性を有する。FAPは、調べられたヒト上皮がんの90%超において、TAFおよび周皮細胞によって選択的に発現される。これはまた、胚発生の間に、治癒中創傷の組織内で、ならびに慢性の炎症性および線維化状態、例えば、肝硬変および特発性肺線維症において、ならびに骨および軟部組織肉腫ならびに一部の黒色腫でも発現している。しかし、FAPの発現は良性病変でも正常な成体組織でも検出されず、一方で、DPPIVは様々な細胞型でより広く発現している。インビトロでの研究によって、FAPは、ゼラチンおよびI型コラーゲンを分解することができるコラーゲン分解活性を含めて、ジペプチジルペプチダーゼ活性とエンドペプチダーゼ活性の両方を有することが示されたが、そのインビボでの基質はまだ明らかにされていない。
当技術分野において、イヌ、マウス、およびヒトの線維芽細胞活性化タンパク質と交差反応することができる抗体の開発の必要性がある。本発明はこの必要性に対処する。
本明細書において記載されるように、本発明は、イヌ、マウス、およびヒトのFAPと交差反応することができる、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に対して特異的な抗体、結合ポリペプチド、およびscFvに関する。
一局面では、本発明は、ヒトおよびイヌ、および/またはマウスの線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)のエピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、単離された結合ポリペプチドを提供する。
ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、HCDR2がアミノ酸配列
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む。
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは:(a)線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に結合する;および/または(b)抗体もしくはその抗原結合断片を含む;および/または(c)SEQ ID NO:7に記載される重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む;および/または(d)SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む;および/または(e)SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域からなる;および/または(f)SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む;および/または(g)SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む;および/または(h)SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域からなる。
ある特定の態様では、(a)抗原結合断片は、Fab、単鎖可変断片(scFv)、もしくは単一ドメイン抗体からなる群より選択される;および/または(b)抗原結合断片は、Fab、単鎖可変断片(scFv)、もしくは単一ドメイン抗体からなる群より選択され、抗体は完全長抗体である;および/または(c)抗原結合断片は、Fab、単鎖可変断片(scFv)、もしくは単一ドメイン抗体からなる群より選択され、抗体もしくは抗原結合断片はヒト化抗体もしくはその抗原結合断片である。
別の局面では、本発明は、SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;およびSEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離された結合ポリペプチドを提供する。
別の局面では、本発明は、ヒトおよびイヌ、および/またはマウスの線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)のエピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、単鎖可変断片(scFv)を提供する。
ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、HCDR2がアミノ酸配列
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とはリンカーによって隔てられている。
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とはリンカーによって隔てられている。
別の局面では、本発明は、SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;およびSEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単鎖可変断片(scFv)であって、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とがリンカーによって隔てられており、任意で、リンカーがSEQ ID NO:15に記載されるアミノ酸配列を含む、単鎖可変断片(scFv)を提供する。
別の局面では、本発明は、SEQ ID NO:11もしくは13に記載されるアミノ酸配列を含む;またはSEQ ID NO:11もしくは13に記載されるアミノ酸配列からなる、単鎖可変断片(scFv)を提供する。
別の局面では、本発明は、本明細書において企図される結合ポリペプチドのいずれかまたはscFvのいずれかをコードする、単離された核酸を提供する。
別の局面では、本発明は、ヒトおよびイヌ、および/またはマウスの線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)のエピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む結合ポリペプチドをコードする、単離された核酸を提供する。
ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、HCDR2がアミノ酸配列
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む。
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む。
ある特定の態様では、(a)結合ポリペプチドは抗体もしくはその抗原結合断片を含み、任意で、抗体は完全長抗体である;および/または(b)抗原結合断片は、Fab、単鎖可変断片(scFv)、もしくは単一ドメイン抗体からなる群より選択される;および/または(c)抗体もしくは抗原結合断片はヒト化抗体もしくはその断片である。
ある特定の態様では、(a)重鎖可変領域は、SEQ ID NO:8に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる;および/または(b)重鎖可変領域は、SEQ ID NO:8に記載されるポリヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる;および/または(c)重鎖可変領域は、SEQ ID NO:8に記載されるポリヌクレオチド配列からなる核酸にコードされる;および/または(d)軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:10に記載される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる;および/または(e)軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:10に記載されるポリヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる;および/または(f)軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:10に記載されるポリヌクレオチド配列からなる核酸にコードされる。
別の局面では、本発明は、SEQ ID NO:8に記載されるポリヌクレオチド配列を含む核酸配列にコードされる重鎖可変領域;およびSEQ ID NO:10に記載されるポリヌクレオチド配列を含む核酸配列にコードされる軽鎖可変領域を含む結合ポリペプチドをコードする、単離された核酸を提供する。
別の局面では、本発明は、(a)3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、HCDR2がアミノ酸配列
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む、単鎖可変断片(scFv)をコードする;または(b)SEQ ID NO:8に記載されるヌクレオチド配列を含む重鎖可変領域;およびSEQ ID NO:10に記載されるヌクレオチド配列を含む軽鎖可変領域を含む単鎖可変断片(scFv)であって、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とがリンカーによって隔てられており、任意で、リンカーがSEQ ID NO.15に記載されるアミノ酸配列を含む単鎖可変断片(scFv)をコードする;ならびに/または(c)SEQ ID NO:12もしくは14に記載されるポリヌクレオチド配列を含む単鎖可変断片(scFv)をコードする;ならびに/または(d)SEQ ID NO:12もしくは14に記載されるポリヌクレオチド配列からなる単鎖可変断片(scFv)をコードする、単離された核酸を提供する。
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む、単鎖可変断片(scFv)をコードする;または(b)SEQ ID NO:8に記載されるヌクレオチド配列を含む重鎖可変領域;およびSEQ ID NO:10に記載されるヌクレオチド配列を含む軽鎖可変領域を含む単鎖可変断片(scFv)であって、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とがリンカーによって隔てられており、任意で、リンカーがSEQ ID NO.15に記載されるアミノ酸配列を含む単鎖可変断片(scFv)をコードする;ならびに/または(c)SEQ ID NO:12もしくは14に記載されるポリヌクレオチド配列を含む単鎖可変断片(scFv)をコードする;ならびに/または(d)SEQ ID NO:12もしくは14に記載されるポリヌクレオチド配列からなる単鎖可変断片(scFv)をコードする、単離された核酸を提供する。
別の局面では、本発明は、本明細書において企図される単離された核酸のいずれかを含むベクターを提供する。
ある特定の態様では、ベクターは発現ベクターである;ならびに/またはベクターは、DNAベクター、RNAベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターからなる群より選択される。
別の局面では、本発明は、(a)本明細書において企図されるベクターのいずれかを含む;および/または(b)真核生物もしくは原核生物起源のものである;および/または(c)哺乳動物起源のものである;および/または(d)細菌起源のものである、宿主細胞を提供する。
別の局面では、本発明は、FAPに結合する結合ポリペプチドまたはscFvを生成する方法を提供する。本方法は、本明細書において企図される宿主細胞のいずれかを培養する工程を含む。
別の局面では、本発明は、本明細書において企図される結合ポリペプチドのいずれかまたはscFvのいずれかを含む、薬学的組成物を提供する。
別の局面では、本発明は、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に対する養子細胞療法に適した対象を特定するための方法を提供する。本方法は、(a)対象から疾患組織を単離する工程;(b)単離した組織を、FAPに特異的に結合する結合ポリペプチドと接触させる工程;および(c)単離した組織においてFAP発現細胞を検出し、それによって、養子細胞療法に適切な対象を特定する工程を含む。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、HCDR2がアミノ酸配列
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む。
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む。
ある特定の態様では、(a)結合ポリペプチドは抗体もしくはその抗原結合断片を含む;および/または(b)抗原結合断片は、Fab、単鎖可変断片(scFv)、もしくは単一ドメイン抗体からなる群より選択され、任意で、抗体は完全長抗体である;および/または(c)抗体もしくは抗原結合断片は、ヒト化抗体もしくはその抗原結合断片である;および/または(d)結合ポリペプチドは、治療的分子もしくは診断的分子にコンジュゲートしている;および/または(e)結合ポリペプチドは診断的分子にコンジュゲートしており、診断的分子は検出可能な標識を含む;および/または(f)結合ポリペプチドは診断的分子にコンジュゲートしており、診断的分子は検出可能な標識を含み、さらに、検出可能な標識は、放射標識、フルオロフォア、酵素、ハプテン、ビオチン、もしくはクロモフォアである。
ある特定の態様では、適切な対象として対象が特定された後に、対象に養子細胞療法が施される。
ある特定の態様では、(a)養子細胞療法はキメラ抗原受容体(CAR)を含む改変免疫細胞を含む;および/または(b)養子細胞療法はキメラ抗原受容体(CAR)を含む改変免疫細胞を含み、免疫細胞はTリンパ球である;および/または(c)養子細胞療法はキメラ抗原受容体(CAR)を含む改変免疫細胞を含み、免疫細胞はNK細胞である;および/または(d)養子細胞療法はキメラ抗原受容体(CAR)を含む改変免疫細胞を含み、CARはFAPに特異的に結合する。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは:(a)SEQ ID NO:7に記載される重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む;および/または(b)SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む;および/または(c)SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域からなる;および/または(d)SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む;および/または(e)SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む;および/または(f)SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域からなる。
別の局面では、本発明は、それを必要とする対象においてがんを処置するための方法であって、SEQ ID NO:7と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;およびSEQ ID NO:9と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単離された結合ポリペプチドを対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
ある特定の態様では、(a)がんは線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)発現細胞と関連する;および/または(b)FAP発現細胞はがん関連細胞である;および/または(c)FAP発現細胞はがん関連細胞であり、がん関連細胞はがん関連線維芽細胞(CAF)である;および/または(d)FAP発現細胞はがん関連細胞であり、FAP発現がん関連細胞はFAP発現脂肪細胞である;および/または(e)FAP発現細胞はがん関連細胞であり、FAP発現がん関連細胞は腫瘍関連マクロファージ(TAM)である;および/または(f)FAP発現細胞はがん関連細胞であり、FAP発現がん関連細胞は腫瘍関連好中球(TAN)である;および/または(g)FAP発現細胞はがん関連細胞であり、FAP発現がん関連細胞は骨髄系由来サプレッサー細胞(MDSC)である;および/または(h)FAP発現細胞はがん関連細胞であり、FAP発現がん関連細胞はがん開始細胞である。
ある特定の態様では、(a)結合ポリペプチドは線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する;および/または(b)結合ポリペプチドは抗体もしくはその抗原結合断片を含む;および/または(c)抗原結合断片は、Fab、単鎖可変断片(scFv)、もしくは単一ドメイン抗体からなる群より選択され、任意で、抗体は完全長抗体である;および/または(d)抗体もしくは抗原結合断片はヒト化抗体もしくはその抗原結合断片である。
別の局面では、本発明は、それを必要とする対象においてがんを処置するための方法であって、(a)(i)対象から疾患組織を単離すること;(ii)単離した組織を、FAPに特異的に結合する結合ポリペプチドと接触させること;および(iii)単離した組織においてFAP発現細胞を検出することを含む、適切な対象として対象を特定する工程;ならびに(b)線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合するキメラ抗原受容体(CAR)を含む改変T細胞を含む養子細胞療法を適切な対象に施す工程を含む、方法を提供する。
本発明の好ましい態様の下記の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むと、より良く理解されるであろう。本発明を例示する目的で、現在好ましい態様が図面に示される。しかし、本発明は図面に示される態様の厳密な配置および手段に限定されないことを理解されたい。
詳細な説明
A.定義
別段定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと同様または均等な任意の方法および材料を本発明の試験のための実施で使用することができるが、好ましい材料および方法が本明細書において記載される。本発明の説明および主張において、以下の術語が使用される。
A.定義
別段定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと同様または均等な任意の方法および材料を本発明の試験のための実施で使用することができるが、好ましい材料および方法が本明細書において記載される。本発明の説明および主張において、以下の術語が使用される。
本明細書において使用される術語は、特定の態様を説明することのみを目的とし、限定を意図したものではないことも理解されたい。
冠詞「1つ(a)」および「1つ(an)」は、該冠詞の文法的目的語の1つ(one)または1つ(one)より多い(すなわち、少なくとも1つ)を指すように本明細書において使用される。例として、「1つ(an)の要素」は、1つ(one)の要素または1つ(one)より多い要素を意味する。
量、時間的持続期間などのような測定可能な値に言及する場合に本明細書において使用する「約」は、指定された値から±20%または±10%、より好ましくは±5%、より一層好ましくは±1%、さらにより好ましくは±0.1%の変動を包含することが意図され、これは、そのような変動が開示される方法を行うために適切であるからである。
本明細書において使用する場合、用語「抗体」は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然供給源に由来するかまたは組換え供給源からのインタクトな免疫グロブリンでもよく、インタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分でもよい。抗体は、典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。四量体は、天然に存在し得るか、または単鎖抗体もしくは抗体断片から再構成され得る。抗体は、天然に存在し得るか、または単鎖抗体もしくは抗体断片から構築され得る、二量体も含む。本発明の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF(ab')2、ならびに単鎖抗体(scFv)、ヒト化抗体、およびヒト抗体を含めて、様々な形態で存在し得る(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。
用語「抗体断片」はインタクトな抗体の一部を指し、かつインタクトな抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片、直鎖抗体、scFv抗体、シングルドメイン抗体、例えば、標的に対して十分な親和性を示すVLまたはVHドメインのいずれかからなるラクダ科動物抗体(Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38)、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体断片としては、ヒト抗体もしくはヒト化抗体またはヒト抗体もしくはヒト化抗体の一部も挙げられる。
本明細書において使用する場合、「抗体重鎖」は、その天然に存在するコンフォメーションにおいてすべての抗体分子に存在する2つのタイプのポリペプチド鎖の大きい方を指す。
本明細書において使用する場合、「抗体軽鎖」は、その天然に存在するコンフォメーションにおいてすべての抗体分子に存在する2つのタイプのポリペプチド鎖の小さい方を指す。κおよびλ軽鎖は、2つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
本明細書において使用する場合、用語「合成抗体」は、組換えDNA技術を使用して生成される抗体、例えば、本明細書において記載されるようにバクテリオファージによって発現される抗体などを意味する。本用語はまた、抗体をコードするDNA分子の合成によって生成されており、DNA分子が抗体タンパク質、または抗体を指定するアミノ酸配列を発現し、DNAまたはアミノ酸配列が、当技術分野におい利用可能であり、かつ周知である合成DNAまたはアミノ酸配列技術を使用して得られている、抗体を意味すると解釈されるべきである。
本明細書において使用する場合、用語「抗原」または「Ag」は、免疫応答を引き起こす分子と定義される。この免疫応答は、抗体産生もしくは特異的な免疫担当細胞の活性化のいずれか、または両方をともない得る。当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含めた任意の巨大分子が、抗原として働くことができることを理解するであろう。さらに、抗原は組換えまたはゲノムDNAに由来し得る。当業者は、この用語が本明細書において使用される場合、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、したがって、「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要がないことを理解するであろう。本発明は、限定されないが、1種より多くの遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むこと、およびこれらのヌクレオチド配列は、望ましい免疫応答を誘発するために様々な組み合わせで配置されことが容易に明らかになる。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」にコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原は、生成、合成され得るか、または生物試料に由来し得ることが容易に明らかになる。そのような生物試料としては、限定されないが、組織試料、腫瘍試料、細胞、または生体液を挙げることができる。
本明細書において使用する場合、用語「抗腫瘍効果」は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、寿命の増加、またはがんの状態に付随する様々な生理的症状の改善によって顕在化される生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」は、そもそも、腫瘍の発生の防止における本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、および抗体の能力によっても顕在化され得る。
本明細書において使用する場合、用語「自己の」は、後に個体に再導入されることになる、同じ個体に由来する任意の材料を指すことが意図される。
「同種異系の」は、同じ種の異なる動物に由来する移植片を指す。
「異種の」は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
本明細書において使用する場合、用語「がん」は、異常細胞の急速かつ制御されていない増殖を特徴とする疾患と定義される。がん細胞は局所的に広がることができ、または血流およびリンパ系を通って体の他の部分に広がることができる。様々ながんの例としては、限定されないが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺がんなどが挙げられる。
本明細書において使用する場合、用語「保存された配列修飾」は、そのアミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響を及ぼすこともなく、該結合特性を変化させることもないアミノ酸修飾を指すことが意図される。そのような保存された修飾としては、アミノ酸の置換、付加、および欠失が挙げられる。修飾は、当技術分野において公知の標準的な技法、例えば、部位特異的変異誘発およびPCR媒介性突然変異誘発によって、本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷の極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、本発明の抗体のCDR領域内の1つまたは複数のアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基と置き換えることができ、本明細書において記載される機能アッセイを使用して、FAPに結合する能力について変化した抗体を試験することができる。
「共刺激性リガンド」は、本用語が本明細書において使用される場合、T細胞上の同族共刺激性分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子とのTCR/CD3複合体の結合によってもたらされる一次シグナルに加えて、限定されないが、増殖、活性化、分化などを含めたT細胞応答を媒介するシグナルをもたらす、抗原提示細胞(例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など)上の分子を含む。共刺激性リガンドとしては、限定されないが、CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激性リガンド(ICOS-L)、細胞間接着分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、リンホトキシンベータ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、Tollリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3と特異的に結合するリガンドが挙げられる。共刺激性リガンドは、特に、T細胞上に提示される共刺激性分子、例えば、限定されないが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3と特異的に結合する抗体、およびCD83と特異的に結合するリガンドも包含する。
「共刺激性分子」は、共刺激性リガンドと特異的に結合し、それによって、T細胞による共刺激性応答、例えば、限定されないが、増殖を媒介する、T細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激性分子としては、限定されないが、MHCクラスI分子、BTLA、およびTollリガンド受容体が挙げられる。
用語「調節不全の」は、FAPの発現または活性のレベルの文脈で使用される場合に、その他の点では同一の健常な動物、生物、組織、細胞、またはそれらの成分におけるFAPの発現レベルまたは活性と異なる、発現または活性のレベルを指す。用語「調節不全の」は、その他の点では同一の健常な動物、生物、組織、細胞、またはそれらの成分における調節と比較した、FAPの発現および活性のレベルの調節の変化も指す。
「コードする」は、定義されたヌクレオチド配列(すなわち、rRNA、tRNA、およびmRNA)または定義されたアミノ酸配列のいずれか、ならびにそれらから得られる生物学的特性を有する、生物学的プロセスにおいて他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、cDNA、またはmRNAなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列の固有の特性を指す。したがって、遺伝子は、細胞または他の生物システムにおいて、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳がタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり、通常、配列表に提供されるコード鎖と遺伝子またはcDNAの転写のための鋳型として使用される非コード鎖との両方を、遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードすると言うことができる。
別段の指定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびRNAをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含むことができる。
「有効量」または「治療的有効量」は本明細書において互換的に使用され、特定の生物学的結果を達成するのに有効な、本明細書において記載される化合物、製剤、材料、または組成物の量を指す。そのような結果としては、限定されないが、当技術分野において適切な任意の手段によって決定されるウイルス感染の阻害を挙げることができる。
本明細書において使用する場合、「内在性」は、生物、細胞、組織、もしくはシステムの内部からの、または該内部で生成される任意の材料を指す。
本明細書において使用する場合、用語「外来性」は、生物、細胞、組織、もしくはシステムの外部から導入される、または該外部で生成される任意の材料を指す。
本明細書において使用する場合、用語「発現」は、特定のヌクレオチド配列の、そのプロモーターによって駆動される転写および/または翻訳と定義される。
「発現ベクター」は、発現させるヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用エレメントを含み;発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現システムにおいて供給され得る。発現ベクターとしては、当技術分野において公知のすべてのもの、例えば、コスミド、プラスミド(例えば、ネイキッドまたはリポソームに含まれる)、ならびに組換えポリヌクレオチドを組み込むウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス)が挙げられる。
本明細書において使用する場合、「相同な」は、2つのポリマー分子間の、例えば、2つの核酸分子、例えば、2つのDNA分子もしくは2つのRNA分子間の、または2つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の同一性を指す。2つの分子の両方におけるサブユニットの位置が同じ単量体サブユニットによって占められている場合;例えば、2つのDNA分子のそれぞれにおける位置がアデニンによって占められている場合、これらは、その位置において相同である。2つの配列間の相同性は、一致するかまたは相同な位置の数の一次関数であり;例えば、2つの配列における位置の半分(例えば、長さが10サブユニットのポリマーにおける5個の位置)が相同である場合、2つの配列は50%相同であり;位置の90%(例えば、10個のうちの9個)が一致するかまたは相同である場合、2つの配列は90%相同である。
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」および「キメラ」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらの断片(例えば、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、もしくは抗体の他の抗原結合部分配列)である。大部分は、ヒト化およびキメラ抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、望ましい特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基に置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)の残基が対応する非ヒト残基に置き換えられている。さらに、ヒト化およびキメラ抗体は、レシピエント抗体にも移入されたCDRまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含むことができる。抗体性能を洗練させ、最適化するために、これらの改変は行われる。一般に、ヒト化およびキメラ抗体は、少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含むと考えられ、CDR領域のすべてまたは実質的にすべては非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域のすべてまたは実質的にすべてはヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化およびキメラ抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含むと考えられる。世界保健機関(WHO)国際一般名称(INN)専門家グループは、非ヒト由来抗体が「ヒト化」とみなされるための要件を定義した。ガイドラインに従って、International Immunogenetics Information System(登録商標)(IMGT(登録商標))DomainGapAlignツール(www.imgt.org)によって、候補抗体とヒト配列の比較を行わなければならない。このツールは、抗体生殖系列可変領域遺伝子のIMGT(登録商標)データベースに照会し、ここでは、アライメントスコアが生殖系列配列可変領域エクソンに対してのみ作成され、したがって、CDR3とJ領域の一部が分析から省かれる。抗体が「ヒト化」されるためには、「他の種よりもヒトに近いこと」に加えて、最上位の「ヒット」がヒトである必要があり、かつヒト配列に対する同一性が少なくとも85%でなければならず、さもないと、抗体は「キメラ」として指定されるであろう。さらなる詳細については、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992を参照されたい。
「完全ヒト」は、分子全体がヒト起源のものであるか、またはヒト型の抗体と同一のアミノ酸配列からなる免疫グロブリン、例えば抗体を指す。
本明細書において使用する場合、「指示資料」は、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために使用することができる刊行物、録音物、図、または任意の他の表現媒体を含む。本発明のキットの指示資料は、例えば、本発明の核酸、ペプチド、および/もしくは組成物を含む容器に貼ることができるか、または該核酸、ペプチド、および/もしくは組成物を含む容器とともに出荷することができる。あるいは、指示資料は、指示資料および化合物がレシピエントによって共同で使用されるという意図で、容器とは別に出荷することができる。
本明細書において使用する場合、「同一性」は、2つのポリマー分子間、特に2つのアミノ酸分子間、例えば、2つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の同一性を指す。2つのアミノ酸配列が同じ位置に同じ残基を有する場合;例えば、2つのポリペプチド分子のそれぞれにおける位置がアルギニンによって占められている場合、これらはその位置において同一である。アライメントにおいて2つのアミノ酸配列が同じ位置に同じ残基を有する同一性または程度は、パーセンテージで表されることが多い。2つのアミノ酸配列間の同一性は、一致するかまたは同一の位置の数の一次関数であり;例えば、2つの配列における位置の半分(例えば、長さが10アミノ酸のポリマーにおける5個の位置)が同一である場合、2つの配列は50%同一であり;位置の90%(例えば、10個のうちの9個)が一致するかまたは同一である場合、2つのアミノ酸配列は90%同一である。
「単離された」は、天然状態から変化したまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物中に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共存する物質から部分的にまたは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離されている」。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在してもよいし、または例えば宿主細胞などの非天然環境に存在してもよい。
本発明において、一般に存在する核酸塩基についての以下の省略形が使用される。「A」はアデノシンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、「U」はウリジンを指す。
別段の指定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはRNAをコードするヌクレオチド配列というフレーズは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がある種のバージョンにおいてイントロンを含むことができる範囲内で、イントロンを含むこともできる。
本明細書において使用する場合、「レンチウイルス」はレトロウイルス(Retroviridae)科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという点でレトロウイルスの中でユニークであり;これは、かなりの量の遺伝情報を宿主細胞のDNAに送達することができるので、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の1つである。HIV、SIV、およびFIVがレンチウイルスのすべての例である。レンチウイルスに由来するベクターは、インビボでかなりのレベルの遺伝子導入を達成するための手段を提供する。
用語「機能的に連結される」は、制御配列と異種性核酸配列の間の機能的連結であって、後者の発現をもたらす機能的連結を指す。例えば、第1の核酸配列は、第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的な関係で配置される場合に、第2の核酸配列と機能的に連結される。例えば、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合に、コード配列に機能的に連結される。一般に、機能的に連結されるDNA配列は隣接しており、2つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合、同じリーディングフレーム中にある。
免疫原性組成物の「非経口」投与は、例えば、皮下(s.c.)、静脈内(i.v.)、筋肉内(i.m.)、または胸骨内の注射または注入技法を含む。
本明細書において使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの鎖と定義される。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書において使用する場合、核酸およびポリヌクレオチドは互換的である。当業者は、核酸はポリヌクレオチドであり、これは、単量体「ヌクレオチド」に加水分解され得るという一般的知識を有する。単量体ヌクレオチドはヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書において使用する場合、ポリヌクレオチドとしては、非限定的に、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術およびPCR(商標)などを使用する、組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング、ならびに合成手段によるものを含めた当技術分野において利用可能な任意の手段によって得られるすべての核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において使用する場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成することができるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドとしては、ペプチド結合によって互いに結合した2つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が挙げられる。本明細書において使用する場合、本用語は、一般に当技術分野において、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも呼ばれる短鎖と一般に当技術分野においてタンパク質と呼ばれる長鎖との両方を指し、これらには多くのタイプが存在する。「ポリペプチド」としては、数ある中でも、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が挙げられる。ポリペプチドとしては、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
本明細書において使用する場合、用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的な転写を開始するのに必要とされる、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列と定義される。
本明細書において使用する場合、用語「プロモーター/調節配列」は、プロモーター/調節配列に機能的に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味する。場合によっては、この配列はコアプロモーター配列でもよく、他の場合では、この配列は遺伝子産物の発現に必要とされるエンハンサー配列および他の調節エレメントを含むこともできる。プロモーター/制御配列は、例えば、組織特異的様式で遺伝子産物を発現するものでもよい。
「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたは指定するポリヌクレオチドと機能的に連結される場合に、細胞の大抵のまたはすべての生理的条件下で、該遺伝子産物を細胞で産生させるヌクレオチド配列である。
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたは指定するポリヌクレオチドと機能的に連結される場合に、該プロモーターに対応する誘導因子が細胞に存在する場合のみ、細胞で該遺伝子産物を実質的に産生させるヌクレオチド配列である。
「組織特異的」プロモーターは、遺伝子をコードするかまたは遺伝子によって指定されるポリヌクレオチドと機能的に連結される場合に、細胞が該プロモーターに対応する組織型の細胞である場合のみ、細胞で遺伝子産物を実質的に産生させるヌクレオチド配列である。
「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす様々なシグナル伝達分子の間の生化学的関係を指す。フレーズ「細胞表面受容体」は、シグナルを受け取り、細胞の原形質膜を横断してシグナルを伝達することができる分子および分子の複合体を含む。
「単鎖抗体」は、単一ポリペプチドとして抗体のFv領域を再現するように、操作されたアミノ酸スパンを使用して免疫グロブリンの重鎖断片および軽鎖断片が互いに連結している、組換えDNA技法によって形成される抗体を指す。米国特許第4,694,778号; Bird (1988) Science 242:423-442; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Ward et al. (1989) Nature 334:54454; Skerra et al. (1988) Science 242:1038-1041に記載されているものを含めて、単鎖抗体を生成する様々な方法が公知である。
用語「対象」は、免疫応答が誘発され得る、生きている生物(例えば、哺乳動物)を含むことが意図される。本明細書において使用される「対象」または「患者」は、ヒトでもよいし、またはヒト以外の哺乳動物でもよい。ヒト以外の哺乳動物としては、例えば、家畜およびペット、例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、およびマウスの哺乳動物が挙げられる。好ましくは、対象はヒトである。
本明細書において使用する場合、「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含んでいない細胞である。実質的に精製された細胞は、その天然に存在する状態において通常付随する他の細胞型から分離された細胞も指す。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団は細胞の均一な集団を指す。他の場合では、この用語は、その天然状態において天然に付随する細胞から分離された細胞を単に指す。いくつかの態様では、細胞はインビトロで培養される。他の態様では、細胞はインビトロで培養されない。
本明細書において使用する場合、用語「治療的」は処置および/または予防を意味する。治療効果は、病態の抑制、寛解、または根絶によって得られる。
本明細書において使用する場合、用語「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」は、宿主細胞に外来核酸が移行または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外来性核酸でトランスフェクトされた、形質転換された、または形質導入された細胞である。細胞としては、初代対象細胞およびその後代が挙げられる。
本明細書において使用する場合、フレーズ「転写制御下」または「機能的に連結される」は、プロモーターが、RNAポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するように、ポリヌクレオチドに対して正しい位置および向きにあることを意味する。
「ベクター」は、単離された核酸を含み、かつ単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。限定されないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合しているポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含めて、多数のベクターが当技術分野において公知である。したがって、用語「ベクター」は、自律複製プラスミドまたはウイルスを含む。本用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどのような、細胞中への核酸の移行を容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。
本明細書において使用する場合、用語「特異的に結合する」は、試料中に存在する同族結合パートナー(例えば、T細胞上に存在する刺激性および/または共刺激性分子)タンパク質を認識し、それと結合するが、試料中の他の分子を実質的に認識もせず、それと結合もしない、抗体またはリガンドを意味する。
用語「刺激」は、刺激性分子(例えば、TCR/CD3複合体)とその同族リガンドが結合し、それによって、シグナル伝達イベント、例えば、限定されないが、TCR/CD3複合体を介したシグナル伝達を媒介することによって誘導される一次応答を意味する。刺激は、ある特定の分子の発現の変化、例えば、TGF-βのダウンレギュレーション、および/または細胞骨格構造の再構築などを媒介することができる。
「刺激性分子」は、本用語が本明細書において使用される場合、抗原提示細胞上および/または腫瘍細胞上に存在する同族刺激性リガンドと特異的に結合する、T細胞上の分子を意味する。
本明細書において使用する場合、「刺激性リガンド」は、抗原提示細胞(例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など)または腫瘍細胞上に存在する場合に、T細胞上の同族結合パートナー(本明細書において「刺激性分子」と呼ばれる)と特異的に結合し、それによって、T細胞による一次応答、限定されないが、活性化、免疫応答の開始、増殖などを媒介することができるリガンドを意味する。刺激性リガンドは当技術分野において周知であり、特に、ペプチドが負荷されたMHCクラスI分子、抗CD3抗体、スーパーアゴニスト抗CD28抗体、およびスーパーアゴニスト抗CD2抗体を包含する。
範囲:本開示の全体を通して、本発明の様々な局面が範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は単に便宜および簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する変更できない制限として解釈されるべきでないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、範囲内の個々の数値だけでなく、すべての可能な部分範囲も具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、1~6などの範囲の説明は、範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6だけでなく、1~3、1~4、1~5、2~4、2~6、3~6などのような部分範囲も具体的に開示しているとみなされるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
B.結合ポリペプチド、抗体、およびscFv
本発明の結合ポリペプチドおよび抗体は、抗体の特定の機能的特色または特性を特徴とする。そのような態様では、抗原結合ドメインは異種間反応性と呼ぶことができる。例えば、結合ポリペプチドおよび抗体はイヌ線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合し、かつマウスおよびヒトのFAPとも交差反応する。好ましくは、本発明の結合ポリペプチドおよび抗体は、イヌ、マウス、およびヒトのFAPに高親和性で結合する。好ましくは、本発明の結合ポリペプチドおよび抗体は、細胞上で天然に発現しているイヌFAPタンパク質を特異的に認識し、かつその細胞上の他の表面分子に交差反応しない。
本発明の結合ポリペプチドおよび抗体は、抗体の特定の機能的特色または特性を特徴とする。そのような態様では、抗原結合ドメインは異種間反応性と呼ぶことができる。例えば、結合ポリペプチドおよび抗体はイヌ線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合し、かつマウスおよびヒトのFAPとも交差反応する。好ましくは、本発明の結合ポリペプチドおよび抗体は、イヌ、マウス、およびヒトのFAPに高親和性で結合する。好ましくは、本発明の結合ポリペプチドおよび抗体は、細胞上で天然に発現しているイヌFAPタンパク質を特異的に認識し、かつその細胞上の他の表面分子に交差反応しない。
ある特定の局面では、本発明は、ヒトおよびイヌ、および/またはマウスの線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)のエピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む単離された結合ポリペプチドを提供する。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域を含む。
ある特定の態様では、本発明は、3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域を含む単離された結合ポリペプチドを提供する。ある特定の態様では、HCDR1はアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、および/またはHCDR2はアミノ酸配列
を含み、および/またはHCDR3はアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、および/またはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域を含む。
を含み、および/またはHCDR3はアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、および/またはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域を含む。
ある特定の局面では、本発明は、アミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含むHCDR1を含む単離された結合ポリペプチドを提供する。アミノ酸配列GYTITSYSLH(SEQ ID NO:17)を含むHCDR1を含む単離された結合ポリペプチドも提供される。アミノ酸配列
を含むHCDR2を含む単離された結合ポリペプチドも提供される。アミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含むHCDR3を含む単離された結合ポリペプチドも提供される。アミノ酸配列
を含むHCDR3を含む単離された結合ポリペプチドも提供される。アミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含むLCDR1を含む軽鎖可変領域を含む単離された結合ポリペプチドも提供される。アミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含むLCDR2を含む単離された結合ポリペプチドも提供される。アミノ酸配列LTSNLAS(SEQ ID NO:20)を含むLCDR2を含む単離された結合ポリペプチドも提供される。アミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含むLCDR3を含む単離された結合ポリペプチドも提供される。
を含むHCDR2を含む単離された結合ポリペプチドも提供される。アミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含むHCDR3を含む単離された結合ポリペプチドも提供される。アミノ酸配列
を含むHCDR3を含む単離された結合ポリペプチドも提供される。アミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含むLCDR1を含む軽鎖可変領域を含む単離された結合ポリペプチドも提供される。アミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含むLCDR2を含む単離された結合ポリペプチドも提供される。アミノ酸配列LTSNLAS(SEQ ID NO:20)を含むLCDR2を含む単離された結合ポリペプチドも提供される。アミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含むLCDR3を含む単離された結合ポリペプチドも提供される。
ある特定の態様では、本発明は、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、および/またはHCDR2がアミノ酸配列
を含み、および/またはHCDR3がアミノ酸配列
を含む3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域を含む単離された結合ポリペプチドを提供する。ある特定の態様では、単離された結合ポリペプチドは、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、および/またはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域を含む。
を含み、および/またはHCDR3がアミノ酸配列
を含む3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域を含む単離された結合ポリペプチドを提供する。ある特定の態様では、単離された結合ポリペプチドは、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、および/またはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域を含む。
ある特定の局面では、本発明は、アミノ酸配列GYTITSYSLH(SEQ ID NO:17)を含むHCDR1、アミノ酸配列
を含むHCDR2、アミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含むHCDR3、アミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含むLCDR1、アミノ酸配列LTSNLAS(SEQ ID NO:20)を含むLCDR2、およびアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含むLCDR3を含む単離された結合ポリペプチドを提供する。
を含むHCDR2、アミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含むHCDR3、アミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含むLCDR1、アミノ酸配列LTSNLAS(SEQ ID NO:20)を含むLCDR2、およびアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含むLCDR3を含む単離された結合ポリペプチドを提供する。
ある特定の態様では、本発明は、本明細書において記載される3つの重鎖相補性決定領域、すなわち、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3のいずれかを含む重鎖可変領域を含む単離された結合ポリペプチドを提供する。ある特定の態様では、単離された結合ポリペプチドは、本明細書において記載される3つの軽鎖相補性決定領域、すなわち、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3のいずれかを含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、単離された結合ポリペプチドは、本明細書において記載されるHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3の任意の組み合わせを含む。当業者は、本明細書で提供される重鎖および軽鎖可変領域配列を考慮して、アミノ酸の番号付けに基づいて、適切な相補性決定領域を容易に決定することができるであろう。
相補性決定領域(CDR)配列の許容できる変動は当業者に公知であろう。例えば、いくつかの態様では、ポリペプチドは、SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、17、18、19、または20に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域(HCDRまたはLCDR)を含む。
いくつかの態様では、結合ポリペプチドは線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に結合する。いくつかの態様では、結合ポリペプチドは抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの態様では、抗原結合断片は、Fab、単鎖可変断片(scFv)、または単一ドメイン抗体からなる群より選択される。さらなる態様では、抗体は完全長抗体である。さらに他の態様では、抗体または抗原結合断片はマウス抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの態様では、抗体または抗原結合断片はヒト化抗体またはその抗原結合断片である。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に記載される重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域からなる。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域からなる。
SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単離された結合ポリペプチドも提供される。
ある特定の態様では、本発明は、本発明の抗体と同じヒト、マウス、またはイヌのFAP上のエピトープに結合する抗体(すなわち、イヌFAPへの結合について本発明の抗体のいずれかと交差競合する能力を有する抗体)を含む。好ましい態様では、交差競合研究のための参照抗体は、本明細書において記載される抗体の1つ(例えば、4G5)であり得る。例えば、本発明の抗体との交差競合を実証するために、Biacore分析、ELISAアッセイ、またはフローサイトメトリーを使用することができる。試験抗体がイヌFAPへの例えば4G5の結合を阻害する能力は、試験抗体がイヌ、マウス、およびヒトのFAPへの結合について4G5と競合することができ、それにより、4G5と同じFAPのエピトープに結合すると考えられることを実証する。
本発明の抗体は、改変抗体を操作するための出発材料として、本明細書において開示されるVHおよび/またはVL配列の1つまたは複数を有する抗体を使用して、調製することができ、改変抗体は、出発抗体と比較して特性が変化している可能性がある。抗体は、一方または両方の可変領域(すなわち、VHおよび/またはVL)内の、例えば、1つもしくは複数のCDR領域内および/または1つもしくは複数のフレームワーク領域内の1つまたは複数のアミノ酸を修飾することによって、操作することができる。さらに、または代わりに、抗体は、例えば抗体のエフェクター機能を変化させるために、定常領域内の残基を修飾することによって操作することができる。
ヒトおよび/またはイヌおよび/またはマウスの線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)のエピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む単鎖可変断片(scFv)も提供される。
本明細書において使用する場合、用語「単鎖可変断片」または「scFv」は、VH::VLヘテロ二量体を形成するように共有結合した、免疫グロブリン(例えば、マウスまたはヒト)の重鎖(VH)および軽鎖(VL)の可変領域の融合タンパク質である。重鎖(VH)および軽鎖(VL)は、直接的に結合しているか、またはペプチドをコードするリンカーによって結合しているかのいずれかであり、リンカーは、VHのN末端とVLのC末端を、またはVHのC末端とVLのN末端を接続する。いくつかの態様では、抗原結合ドメイン(例えば、FAP結合ドメイン)は、N末端からC末端に、VH-リンカー-VLの配置を有するscFvを含む。いくつかの態様では、抗原結合ドメインは、N末端からC末端に、VL-リンカー-VHの配置を有するscFvを含む。当業者は、本発明で使用するための適切な配置を選択することができるであろう。
リンカーは通常、可動性のためのグリシンおよび溶解度のためのセリンまたはスレオニンに富む。リンカーは、細胞外抗原結合ドメインの重鎖可変領域と軽鎖可変領域を連結することができる。リンカーの非限定例はShen et al., Anal. Chem. 80(6):1910-1917 (2008)およびWO 2014/087010に開示されており、それらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。様々なリンカー配列が当技術分野において公知であり、それらとしては、非限定的に、グリシンセリン(GS)リンカー、例えば、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:21)、(GGGS)n(SEQ ID NO:22)、および(GGGGS)n(SEQ ID NO:23)が挙げられ、nは少なくとも1の整数を表す。例示的なリンカー配列は、非限定的に、GGSG(SEQ ID NO:24)、GGSGG(SEQ ID NO:25)、GSGSG(SEQ ID NO:26)、GSGGG(SEQ ID NO:27)、GGGSG(SEQ ID NO:28)、GSSSG(SEQ ID NO:29)、GGGGS(SEQ ID NO:30)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:15)などを含めて、アミノ酸配列を含むことができる。当業者は、本発明で使用するための適切なリンカー配列を選択することができるであろう。一態様では、本発明のscFvは重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含み、VHとVLは、核酸配列
にコードされ得るアミノ酸配列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:15)を有するリンカー配列によって隔てられている。
にコードされ得るアミノ酸配列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:15)を有するリンカー配列によって隔てられている。
定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、scFvタンパク質は元の免疫グロブリンの特異性を保持する。単鎖Fvポリペプチド抗体は、Hustonら(Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988)によって記載されているように、VHおよびVLをコードする配列を含む核酸から発現させることができる。米国特許第5,091,513号、第5,132,405号、および第4,956,778号;ならびに米国特許出願公開第20050196754号および第20050196754号も参照されたい。阻害活性を有するアンタゴニスト性scFvが記載されている(例えば、Zhao et al., Hyrbidoma (Larchmt) 2008 27(6):455-51; Peter et al., J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012 August 12; Shieh et al., J Imunol 2009 183(4):2277-85; Giomarelli et al., Thromb Haemost 2007 97(6):955-63; Fife eta., J Clin Invst 2006 116(8):2252-61; Brocks et al., Immunotechnology 1997 3(3):173-84; Moosmayer et al., Ther Immunol 1995 2(10:31-40)を参照されたい。刺激活性を有するアゴニスト性scFvが記載されている(例えば、Peter et al., J Bioi Chem 2003 25278(38):36740-7; Xie et al., Nat Biotech 1997 15(8):768-71; Ledbetter et al., Crit Rev Immunol 1997 17(5-6):427-55; Ho et al., BioChim Biophys Acta 2003 1638(3):257-66を参照されたい)。
ある特定の局面では、本発明は、ヒトおよびイヌ、および/またはマウスの線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)のエピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む単鎖可変断片(scFv)を提供し、抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域を含む。
scFvのある特定の態様では、HCDR1はアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、および/またはHCDR2はアミノ酸配列
を含み、および/またはHCDR3はアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含み、および/またはLCDR1はアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2はアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、および/またはLCDR3はアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む。重鎖可変領域と軽鎖可変領域とはリンカーによって隔てられている。
を含み、および/またはHCDR3はアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含み、および/またはLCDR1はアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2はアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、および/またはLCDR3はアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む。重鎖可変領域と軽鎖可変領域とはリンカーによって隔てられている。
scFvのある特定の態様では、HCDR1はアミノ酸配列GYTITSYSLH(SEQ ID NO:17)を含み、および/またはHCDR2はアミノ酸配列
を含み、および/またはHCDR3はアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含み、および/またはLCDR1はアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2はアミノ酸配列LTSNLAS(SEQ ID NO:20)を含み、および/またはLCDR3はアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む。重鎖可変領域と軽鎖可変領域とはリンカーによって隔てられている。
を含み、および/またはHCDR3はアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含み、および/またはLCDR1はアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2はアミノ酸配列LTSNLAS(SEQ ID NO:20)を含み、および/またはLCDR3はアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む。重鎖可変領域と軽鎖可変領域とはリンカーによって隔てられている。
SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単鎖可変断片(scFv)も提供される。重鎖可変領域と軽鎖可変領域とはリンカーによって隔てられている。
別の局面では、SEQ ID NO:11または13に記載されるアミノ酸配列を含む単鎖可変断片(scFv)が提供される。別の局面では、SEQ ID NO:11または13に記載されるアミノ酸配列からなる単鎖可変断片(scFv)が提供される。
scFv配列の許容できる変動は当業者に公知であろう。例えば、いくつかの態様では、scFvは、SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、9、11、13、15、17、18、19、または20に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
C.核酸および発現ベクター
本開示は、ヒトおよびイヌ、および/またはマウスの線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)のエピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む結合ポリペプチド(例えば、抗体またはその断片、例えばscFv)をコードする単離された核酸を提供する。本開示の核酸は、本明細書において開示される結合ポリペプチド、scFv、または抗体のいずれか1つをコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。
本開示は、ヒトおよびイヌ、および/またはマウスの線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)のエピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む結合ポリペプチド(例えば、抗体またはその断片、例えばscFv)をコードする単離された核酸を提供する。本開示の核酸は、本明細書において開示される結合ポリペプチド、scFv、または抗体のいずれか1つをコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、および/またはHCDR2がアミノ酸配列
を含み、および/またはHCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域を含む抗原結合ドメインを含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、および/またはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域も含む。
を含み、および/またはHCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域を含む抗原結合ドメインを含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、および/またはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域も含む。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、HCDR1がアミノ酸配列GYTITSYSLH(SEQ ID NO:17)を含み、および/もしくはHCDR2がアミノ酸配列
を含み、および/もしくはHCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む重鎖可変領域;ならびに/またはLCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/もしくはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLAS(SEQ ID NO:20)を含み、および/もしくはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合ドメインを含む。
を含み、および/もしくはHCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む重鎖可変領域;ならびに/またはLCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/もしくはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLAS(SEQ ID NO:20)を含み、および/もしくはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合ドメインを含む。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、および/もしくはHCDR2がアミノ酸配列
を含み、および/もしくはHCDR3がアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域;ならびに/またはLCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/もしくはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、および/もしくはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む軽鎖変性を含む抗原結合ドメインを含む。
を含み、および/もしくはHCDR3がアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域;ならびに/またはLCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/もしくはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、および/もしくはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む軽鎖変性を含む抗原結合ドメインを含む。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドをコードする核酸は、本明細書において記載される3つの重鎖相補性決定領域、すなわち、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3のいずれかを含む重鎖可変領域を含む抗原結合ドメインを含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、本明細書において記載される3つの軽鎖相補性決定領域、すなわち、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3のいずれかを含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3の任意の組み合わせを含み、本明細書において記載される。当業者は、本明細書で提供される重鎖および軽鎖可変領域配列を考慮して、アミノ酸の番号付けに基づいて、適切な相補性決定領域を容易に決定することができるであろう。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは抗体またはその抗原結合断片を含む。ある特定の態様では、抗原結合断片は、Fab、単鎖可変断片(scFv)、または単一ドメイン抗体からなる群より選択される。ある特定の態様では、抗体は完全長抗体である。ある特定の態様では、抗体または抗原結合断片はヒト化抗体またはその断片である。
重鎖可変領域が、SEQ ID NO:8に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる、ヒトおよびイヌ、および/またはマウスの線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)のエピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む結合ポリペプチドをコードする核酸も提供される。ある特定の態様では、重鎖可変領域はSEQ ID NO:8に記載されるポリヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる。ある特定の態様では、重鎖可変領域はSEQ ID NO:8に記載されるポリヌクレオチド配列からなる核酸にコードされる。
ある特定の態様では、軽鎖可変領域はSEQ ID NO:10に記載される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる。ある特定の態様では、軽鎖可変領域はSEQ ID NO:10に記載されるポリヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる。ある特定の態様では、軽鎖可変領域はSEQ ID NO:10に記載されるポリヌクレオチド配列からなる核酸にコードされる。
SEQ ID NO:8に記載されるポリヌクレオチド配列を含む核酸配列にコードされる重鎖可変領域およびSEQ ID NO:10に記載されるポリヌクレオチド配列を含む核酸配列にコードされる軽鎖可変領域を含む結合ポリペプチドをコードする単離された核酸も提供される。
3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域を含む単鎖可変断片(scFv)をコードする単離された核酸も提供される。ある特定の態様では、HCDR1はアミノ酸配列GYTITSYSLH(SEQ ID NO:17)を含み、および/またはHCDR2はアミノ酸配列
を含み、および/またはHCDR3はアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含み、および/またはLCDR1はアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2はアミノ酸配列LTSNLAS(SEQ ID NO:20)を含み、および/またはLCDR3はアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む。
を含み、および/またはHCDR3はアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含み、および/またはLCDR1はアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2はアミノ酸配列LTSNLAS(SEQ ID NO:20)を含み、および/またはLCDR3はアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む。
ある特定の態様では、核酸は、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、および/またはHCDR2がアミノ酸配列
を含み、および/またはHCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域を含む単鎖可変断片をコードする。ある特定の態様では、軽鎖可変領域は、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、および/またはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む。
を含み、および/またはHCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域を含む単鎖可変断片をコードする。ある特定の態様では、軽鎖可変領域は、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、および/またはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む。
ある特定の態様では、核酸は、HCDR1がアミノ酸配列GYTITSYSLH(SEQ ID NO:17)を含み、および/またはHCDR2がアミノ酸配列
を含み、および/またはHCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域を含む単鎖可変断片を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLAS(SEQ ID NO:20)を含み、および/またはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域を含む。
を含み、および/またはHCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域を含む単鎖可変断片を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLAS(SEQ ID NO:20)を含み、および/またはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域を含む。
ある特定の態様では、核酸は、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、および/またはHCDR2がアミノ酸配列
を含み、および/またはHCDR3がアミノ酸配列
を含む3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域を含む単鎖可変断片を含む。ある特定の態様では、単鎖可変断片は、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、および/またはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域も含む。
を含み、および/またはHCDR3がアミノ酸配列
を含む3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域を含む単鎖可変断片を含む。ある特定の態様では、単鎖可変断片は、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、および/またはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域も含む。
ある特定の態様では、単鎖可変断片を含む核酸は、本明細書において記載される3つの重鎖相補性決定領域、すなわち、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3のいずれかを含む重鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、単鎖可変断片は、本明細書において記載される3つの軽鎖相補性決定領域、すなわち、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3のいずれかを含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、単鎖可変断片は、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3の任意の組み合わせを含み、本明細書において記載される。当業者は、本明細書で提供される重鎖および軽鎖可変領域配列を考慮して、アミノ酸の番号付けに基づいて、適切な相補性決定領域を容易に決定することができるであろう。
SEQ ID NO:8に記載されるポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域;および/またはSEQ ID NO:10に記載されるポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域を含む単鎖可変断片(scFv)をコードする単離された核酸も提供される。重鎖可変領域と軽鎖可変領域とはリンカーによって隔てられている。ある特定の態様では、リンカーはSEQ ID NO.15に記載されるアミノ酸配列を含む。
単鎖可変断片(scFv)をコードする単離された核酸であって、SEQ ID NO:12または14に記載されるポリヌクレオチド配列を含む核酸も提供される。単鎖可変断片(scFv)をコードする単離された核酸であって、SEQ ID NO:12または14に記載されるポリヌクレオチド配列からなる核酸も提供される。
核酸配列の許容できる変動は当業者に公知であろう。例えば、いくつかの態様では、核酸は、SEQ ID NO:8、10、12、または14に記載されるヌクレオチド配列のいずれかに対して少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
ある特定の態様では、本開示の核酸は、第1のポリヌクレオチド配列および第2ポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の態様では、第1のポリヌクレオチド配列は、本開示のFAPターゲティング結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、本開示のFAPターゲティング結合ポリペプチドは、他の治療的作用因子、例えば、非限定的に、免疫療法、例えば、がん免疫抗体療法およびチェックポイント遮断、またはCAR-T細胞療法と組み合わせて用いることができる。したがって、そのような態様では、第2のポリヌクレオチド配列は、抗がん抗体、チェックポイント遮断分子、またはCARをコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。
第1および第2のポリヌクレオチド配列はリンカーによって隔てられ得る。例えば、ある特定の態様では、scFvの重鎖可変領域および軽鎖可変領域はリンカーによって隔てられている。ある特定の態様では、リンカーはSEQ ID NO.15に記載されるアミノ酸配列を含む。本開示で使用するためのリンカーは、複数のタンパク質が、別々のタンパク質成分に解離されるポリタンパク質として翻訳される同じ核酸配列(例えば、マルチシストロニックまたはバイシストロニック配列)にコードされることを可能にする。ある特定の態様では、核酸は、5’から3’に、第1のポリヌクレオチド配列、リンカー、および第2ポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の態様では、核酸は、5’から3’に、第2ポリヌクレオチド配列、リンカー、および第1のポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、リンカーは、配列内リボソーム進入部位(IRES)をコードする核酸配列を含む。本明細書において使用する場合、「配列内リボソーム進入部位」または「IRES」は、タンパク質コード領域のATGなどの開始コドンへの直接配列内リボソーム進入を促進し、それによって、遺伝子のキャップ非依存的翻訳をもたらすエレメントを指す。非限定的に、ウイルスまたは細胞性mRNA供給源、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(BiP);血管内皮増殖因子(VEGF);維芽細胞増殖因子2;インスリン様増殖因子;翻訳開始因子eIF4G;酵母転写因子TFIIDおよびHAP4から入手可能なIRES;ならびに例えば、カルジオウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス、HCV、フレンドマウス白血病ウイルス(FrMLV)、およびモロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)から入手可能なIRESを含めて、様々な配列内リボソーム進入部位が当業者に公知である。当業者は、本発明で使用するための適切なIRESを選択することができるであろう。
いくつかの態様では、リンカーは自己切断ペプチドをコードする核酸配列を含む。本明細書において使用する場合、「自己切断ペプチド」または「2Aペプチド」は、複数のタンパク質が、翻訳の際に成分タンパク質に解離するポリタンパク質としてコードされることを可能にするオリゴペプチドを指す。用語「自己切断」の使用は、タンパク質分解性切断反応を意味することは意図されない。非限定的に、ピコルナウイルス科ウイルスファミリーのメンバー、例えば、口蹄疫ウイルス(FMDV)、ウマ鼻炎Aウイルス(ERAV0、ゾセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルス(TaV)、およびブタテッショウウイルス-1(PTV-1);ならびにカリオウイルス(carioviruses)、例えば、タイロウイルスおよび脳心筋炎ウイルスで見出されるものを含めて、様々な自己切断または2Aペプチドが当業者に公知である。FMDV、ERAV、PTV-1、およびTaVに由来する2Aペプチドは、本明細書において、それぞれ「F2A」、「E2A」、「P2A」、および「T2A」と呼ばれる。当業者は、本発明で使用するための適切な自己切断ペプチドを選択することができるであろう。
いくつかの態様では、リンカーは、フューリン切断部位をコードする核酸配列をさらに含む。フューリンは、トランスゴルジに存在し、タンパク質前駆体をその分泌前にプロセッシングする、遍在的に発現しているプロテアーゼである。フューリンは、そのコンセンサス認識配列のCOOH末端で切断する。様々なフューリンコンセンサス認識配列(または「フューリン切断部位」)が当業者に公知であり、それらとしては、非限定的に、Arg-X1-Lys-Arg(SEQ ID NO:32)またはArg-X1-Arg-Arg(SEQ ID NO:33)、X2-Arg-X1-X3-Arg(SEQ ID NO:34)、およびArg-X1-X1-Arg(SEQ ID NO:35)、例えば、Arg-Gln-Lys-Arg(SEQ ID NO:36)が挙げられ、X1は任意の天然のアミノ酸、X2はLysまたはArg、およびX3はLysまたはArgである。当業者は、本発明で使用するための適切なフューリン切断部位を選択することができるであろう。
いくつかの態様では、リンカーは、フューリン切断部位と2Aペプチドの組み合わせをコードする核酸配列を含む。例としては、非限定的に、フューリン切断部位およびF2Aをコードする核酸配列を含むリンカー、フューリン切断部位およびE2Aをコードする核酸配列を含むリンカー、フューリン切断部位およびP2Aをコードする核酸配列を含むリンカー、フューリン切断部位およびT2Aをコードする核酸配列を含むリンカーが挙げられる。当業者は、本発明で使用するための適切な組み合わせを選択することができるであろう。そのような態様では、リンカーは、フューリン切断部位と2Aペプチドの間にスペーサー配列をさらに含むことができる。いくつかの態様では、リンカーは、2Aペプチドに対して5’にフューリン切断部位を含む。いくつかの態様では、リンカーは、フューリン切断部位に対して5’に2Aペプチドを含む。様々なスペーサー配列が当技術分野において公知であり、それらとしては、非限定的に、グリシンセリン(GS)スペーサー、例えば、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:21)、および(GGGS)n(SEQ ID NO:22)が挙げられ、nは少なくとも1の整数を表す。例示的なスペーサー配列は、非限定的に、GGSG(SEQ ID NO:24)、GGSGG(SEQ ID NO:25)、GSGSG(SEQ ID NO:26)、GSGGG(SEQ ID NO:27)、GGGSG(SEQ ID NO:28)、GSSSG(SEQ ID NO:29)などを含めて、アミノ酸配列を含むことができる。当業者は、本発明で使用するための適切なスペーサー配列を選択することができるであろう。
本発明の別の局面は、本明細書において開示される単離された核酸のいずれか1つを含むベクターを提供する。ある特定の態様では、ベクターは、DNAベクター、RNAベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターからなる群より選択される。ある特定の態様では、ベクターは発現ベクターである。
本明細書において開示されるベクターまたは核酸のいずれかを含む宿主細胞も提供される。宿主細胞は、真核生物、原核生物、哺乳動物、または細菌起源のものであり得る。FAPに結合する結合ポリペプチドまたはscFvを生成する方法も本明細書で提供され、該方法は、宿主細胞を培養する工程を含む。
いくつかの態様では、本開示の核酸は、転写制御エレメント、例えば、プロモーターおよびエンハンサーなどに機能的に連結され得る。適切なプロモーターおよびエンハンサーエレメントは当業者に公知である。
ある特定の態様では、核酸はプロモーターと機能的連結されている。ある特定の態様では、プロモーターはホスホグリセリン酸キナーゼ-1(PGK)プロモーターである。
細菌細胞における発現について、適切なプロモーターとしては、限定されないが、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダP、およびtrcが挙げられる。真核細胞における発現について、適切なプロモーターとしては、限定されないが、軽および/または重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーターおよびエンハンサーエレメント;サイトメガロウイルス最初期プロモーター;単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター;初期および後期SV40プロモーター;レトロウイルスのロングターミナルリピート中に存在するプロモーター;マウスのメタロチオネイン-Iプロモーター;ならびに技術分野で公知の様々な組織特異的プロモーターが挙げられる。可逆的誘導性プロモーターを含めて、適切な可逆的プロモーターは当技術分野において公知である。そのような可逆的プロモーターは、多くの生物、例えば、真核生物および原核生物から単離することができ、これらの生物に由来し得る。例えば、第1の原核生物および第2の真核生物、第1の真核生物および第2の原核生物など、第2の生物で使用するための、第1の生物に由来する可逆的プロモーターの改変は、当技術分野において周知である。そのような可逆的プロモーターに基づくが、さらなる制御タンパク質も含む、そのような可逆的プロモーターおよびシステムとしては、限定されないが、アルコール調節性プロモーター(例えば、アルコール脱水素酵素I(alcA)遺伝子プロモーター、アルコールトランスアクチベータータンパク質(A1cR)に応答性のプロモーターなど)、テトラサイクリン調節性プロモーター(例えば、TetActivators、TetON、TetOFFなどを含めたプロモーターシステム)、ステロイド調節性プロモーター(例えば、ラットグルココルチコイド受容体プロモーターシステム、ヒトエストロゲン受容体プロモーターシステム、レチノイドプロモーターシステム、甲状腺プロモーターシステム、エクジソンプロモーターシステム、ミフェプリストンプロモーターシステムなど)、金属調節性プロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーターシステムなど)、病原性関連調節性プロモーター(例えば、サリチル酸調節性プロモーター、エチレン調節性プロモーター、ベンゾチアジアゾール調節性プロモーターなど)、温度調節性プロモーター(例えば、ヒートショック誘導性プロモーター(例えば、HSP-70、HSP-90、ダイズヒートショックプロモーターなど)、光調節性プロモーター、合成誘導性プロモーターなどが挙げられる。
いくつかの態様では、プロモーターは、CD8細胞特異的プロモーター、CD4細胞特異的プロモーター、好中球特異的プロモーター、またはNK特異的プロモーターである。例えば、CD4遺伝子プロモーターを使用することができる;例えば、Salmon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:7739;およびMarodon et al. (2003) Blood 101:3416を参照されたい。別の例として、CD8遺伝子プロモーターを使用することができる。NK細胞特異的発現は、NcrI(p46)プロモーターの使用によって達成することができる;例えば、Eckelhart et al. Blood (2011) 117:1565を参照されたい。
酵母細胞における発現について、適切なプロモーターは、構成的プロモーター、例えば、ADH1プロモーター、PGK1プロモーター、ENOプロモーター、PYK1プロモーターなど;または調節可能なプロモーター、例えば、GAL1プロモーター、GAL10プロモーター、ADH2プロモーター、PHOSプロモーター、CUP1プロモーター、GALTプロモーター、MET25プロモーター、MET3プロモーター、CYC1プロモーター、HIS3プロモーター、ADH1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、ADC1プロモーター、TRP1プロモーター、URA3プロモーター、LEU2プロモーター、ENOプロモーター、TP1プロモーター、およびAOX1(例えば、ピキアで使用するため)である。適切なベクターおよびプロモーターの選択は十分に当業者のレベル内である。原核生物宿主細胞で使用するための適切なプロモーターとしては、限定されないが、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼプロモーター;trpプロモーター;lacオペロンプロモーター;ハイブリッドプロモーター、例えば、lac/tacハイブリッドプロモーター、tac/trcハイブリッドプロモーター、trp/lacプロモーター、T7/lacプロモーター;trcプロモーター;tacプロモーターなど;araBADプロモーター;インビボ調節性プロモーター、例えば、ssaGプロモーターまたは関連したプロモーター(例えば、米国特許出願公開第20040131637号を参照されたい)、pagCプロモーター(Pulkkinen and Miller, J. Bacteriol. (1991) 173(1): 86-93; Alpuche-Aranda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89(21): 10079-83)、nirBプロモーター(Harborne et al. Mol. Micro. (1992) 6:2805-2813)など(例えば、Dunstan et al., Infect. Immun. (1999) 67:5133-5141; McKelvie et al., Vaccine (2004) 22:3243-3255;およびChatfield et al., Biotechnol. (1992) 10:888-892を参照されたい);シグマ70プロモーター、例えば、コンセンサスシグマ70プロモーター(例えば、GenBank受託番号AX798980、AX798961、およびAX798183を参照されたい);静止期プロモーター、例えば、dpsプロモーター、spvプロモーターなど;病原性アイランドSPI-2に由来するプロモーター(例えば、WO96/17951を参照されたい);actAプロモーター(例えば、Shetron-Rama et al., Infect. Immun. (2002) 70:1087-1096を参照されたい);rpsMプロモーター(例えば、Valdivia and Falkow Mol. Microbiol. (1996). 22:367を参照されたい);tetプロモーター(例えば、Hillen, W. and Wissmann, A. (1989) In Saenger, W. and Heinemann, U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein--Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162を参照されたい);SP6プロモーター(例えば、Melton et al., Nucl. Acids Res. (1984) 12:7035を参照されたい)などが挙げられる。大腸菌(Escherichia coli)などの原核生物で使用するための適切な強力なプロモーターとしては、限定されないが、Trc、Tac、T5、T7、およびPラムダが挙げられる。細菌宿主細胞で使用するためのオペレーターの非限定例としては、ラクトースプロモーターオペレーター(LacIリプレッサータンパク質が、ラクトースと接触した場合にコンフォメーションを変え、それによって、Ladリプレッサータンパク質がオペレーターと結合するのを防止する)、トリプトファンプロモーターオペレーター(トリプトファンと複合体化された場合に、TrpRリプレッサータンパク質はオペレーターと結合するコンフォメーションを有し;トリプトファンの非存在下で、TrpRリプレッサータンパク質はオペレーターに結合しないコンフォメーションを有する)、およびtacプロモーターオペレーター(例えば、deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:21-25を参照されたい)が挙げられる。
適切なプロモーターの他の例としては、最初期サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター配列が挙げられる。このプロモーター配列は、それに機能的に連結される任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強い構成的プロモーター配列である。限定されないが、シミアンウイルス40(SV40)初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス(MMTV)またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)ロングターミナルリピート(LTR)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン-バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、EF-1アルファプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば、限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターを含めて、他の構成的プロモーター配列を使用することもできる。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が望ましい場合に、機能的に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、または発現が望ましくない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、限定されないが、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。
いくつかの態様では、適切なプロモーターを含む遺伝子座またはコンストラクトまたは導入遺伝子は、誘導性システムの誘導を通して不可逆的に切り換えられる。不可逆的切り換えの誘導のための適切なシステムは当技術分野において周知であり、例えば、不可逆的切り換えの誘導はCre-lox媒介性組換えを使用することができる(例えば、その開示が参照により本明細書に組み入れられる、Fuhrmann-Benzakein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 28:e99を参照されたい)。本技術分野に公知である、リコンビナーゼ、エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、組換え部位などの任意の適切な組み合わせを不可逆的に切り換え可能なプロモーターの生成で使用することができる。本明細書の他の個所で記載されている、部位特異的組換えを行うための方法、メカニズム、および要件は、不可逆的に切り換えられるプロモーターの生成において使用され、当技術分野において周知であり、例えば、その開示が参照により本明細書に組み入れられる、Grindley et al. Annual Review of Biochemistry (2006) 567-605;およびTropp, Molecular Biology (2012)(Jones & Bartlett Publishers, Sudbury, Mass.)を参照されたい。
本開示の核酸は、発現ベクターおよび/またはクローニングベクター内に存在していてもよい。発現ベクターは、選択マーカー、複製開始点、ならびにベクターの複製および/または維持を提供する他の特色を含むことができる。適切な発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルスベクターなどが挙げられる。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に公知であり、多くは、対象の組換えコンストラクトを生成するために市販されている。以下のベクターは例として提供され、限定として決して解釈されるべきでない:細菌性:pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene, La Jolla, Calif., USA);pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、およびpRIT5(Pharmacia, Uppsala, Sweden)。真核性:pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVL(Pharmacia)。
発現ベクターは、一般に、異種性タンパク質をコードする核酸配列の挿入をもたらすために、プロモーター配列の近くに位置する便利な制限部位を有する。発現宿主で機能的である選択マーカーが存在してもよい。適切な発現ベクターとしては、限定されないが、ウイルスベクター(例えば、ワクシニアウイルス;ポリオウイルス;アデノウイルス(例えば、Li et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. (1994) 35: 2543-2549; Borras et al., Gene Ther. (1999) 6: 515-524; Li and Davidson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 7700-7704; Sakamoto et al., H. Gene Ther. (1999) 5: 1088-1097; WO 94/12649、WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984、およびWO 95/00655を参照されたい);アデノ随伴ウイルス(例えば、Ali et al., Hum. Gene Ther. (1998) 9: 81-86, Flannery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 6916-6921; Bennett et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. (1997) 38: 2857-2863; Jomary et al., Gene Ther. (1997) 4:683 690, Rolling et al., Hum. Gene Ther. (1999) 10: 641-648; Ali et al., Hum. Mol. Genet. (1996) 5: 591-594; Srivastava in WO 93/09239、Samulski et al., J. Vir. (1989) 63: 3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166: 154-165;およびFlotte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 10613-10617)を参照されたい);SV40;単純ヘルペスウイルス;ヒト免疫不全ウイルス(例えば、Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 10319-23; Takahashi et al., J. Virol. (1999) 73: 7812-7816を参照されたい)に基づくウイルスベクター;レトロウイルスベクター(例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにレトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳房腫瘍ウイルスに由来するベクター)などが挙げられる。
使用に適したさらなる発現ベクターは、例えば、非限定的に、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、操作されたハイブリッドウイルスベクター、トランスポゾン媒介性ベクターなどである。ウイルスベクター技術は当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY)ならびに他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが挙げられる。
一般に、適切なベクターは、少なくとも1つの生物で機能的な複製開始点、プロモーター配列、便利な制限酵素部位、および1つまたは複数の選択マーカーを含む(例えば、WO 01/96584; WO 01/29058;および米国特許第6,326,193号)。
いくつかの態様では、発現ベクター(例えば、レンチウイルスベクター)は、宿主細胞に核酸を導入するために使用することができる。したがって、本発明の発現ベクター(例えば、レンチウイルスベクター)は、ポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。いくつかの態様では、発現ベクター(例えば、レンチウイルスベクター)は、その中にコードされるポリペプチドの機能的発現を援助するさらなるエレメントを含む。いくつかの態様では、ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターは、哺乳動物プロモーターをさらに含む。一態様では、ベクターは伸長因子1アルファプロモーター(EF-1αプロモーター)をさらに含む。EF-1αプロモーターの使用は、下流の導入遺伝子の発現の効率を高めることができる。生理的プロモーター(例えば、EF-1αプロモーター)は、組み込み媒介性遺伝毒性を誘導する可能性が低い場合があり、かつレトロウイルスベクターが幹細胞をがん化する能力を抑止することができる。ベクター(例えば、レンチウイルスベクター)での使用に適する他の生理的プロモーターは当業者に公知であり、本発明のベクターに組み込むことができる。いくつかの態様では、ベクター(例えば、レンチウイルスベクター)は、力価および遺伝子発現を向上させることができる必須でないシス作用性配列をさらに含む。必須でないシス作用性配列の1つの非限定例は、効率的な逆転写および核内移行に重要なセントラルポリプリントラクトおよびセントラルターミネーション配列(cPPT/CTS)である。他の必須でないシス作用性配列は当業者に公知であり、本発明のベクター(例えば、レンチウイルスベクター)に組み込むことができる。いくつかの態様では、ベクターは転写後調節エレメントをさらに含む。転写後調節エレメントは、RNAの翻訳を向上させる、導入遺伝子の発現を向上させる、およびRNA転写物を安定化することができる。転写後調節エレメントの一例は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)である。したがって、いくつかの態様では、本発明のためのベクターはWPRE配列をさらに含む。様々な転写後調節エレメントが当業者に公知であり、本発明のベクター(例えば、レンチウイルスベクター)に組み込むことができる。本発明のベクターは、さらなるエレメント、例えば、RNA輸送のためのrev応答エレメント(RRE)、パッケージング配列、ならびに5’および3’ロングターミナルリピート(LTR)をさらに含むことができる。用語「ロングターミナルリピート」または「LTR」は、U3、R、およびU5領域を含む、レトロウイルスDNAの末端に位置する塩基対のドメインを指す。LTRは、一般に、レトロウイルス遺伝子の発現(例えば、促進、開始、および遺伝子転写物のポリアデニル化)に、ならびにウイルス複製に必要とされる機能を提供する。一態様では、本発明のベクター(例えば、レンチウイルスベクター)は、3’U3が欠失したLTRを含む。したがって、本発明のベクター(例えば、レンチウイルスベクター)は、導入遺伝子の機能的発現の効率を増強するために、本明細書において記載されるエレメントの任意の組み合わせを含むことができる。例えば、本発明のベクター(例えば、レンチウイルスベクター)は、CARをコードする核酸に加えて、WPRE配列、cPPT配列、RRE配列、5’LTR、3’U3が欠失したLTR'を含むことができる。
本発明のベクターは自己不活性化ベクターでもよい。本明細書において使用する場合、用語「自己不活性化ベクター」は、3’LTRエンハンサープロモーター領域(U3領域)が(例えば、欠失または置換によって)改変されているベクターを指す。自己不活性化ベクターは、ウイルス複製の第1ラウンドを越えたウイルスの転写を防止することができる。したがって、自己不活性化ベクターは、感染し、次いで宿主ゲノム(例えば、哺乳動物ゲノム)に一度だけ組み込まれることができてもよく、かつさらに受け継がれる(passed)可能性はない。したがって、自己不活性化ベクターは、複製能があるウイルスを作出する危険性を大きく低減することができる。
いくつかの態様では、本発明の核酸はRNA、例えば、インビトロ合成したRNAでもよい。RNAのインビトロ合成のための方法は当業者に公知であり;本開示のポリペプチドをコードする配列を含むRNAを合成するために、任意の公知の方法を使用することができる。RNAを宿主細胞に導入するための方法は当技術分野において公知である。例えば、Zhao et al. Cancer Res. (2010) 15: 9053を参照されたい。本開示のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むRNAの宿主細胞への導入は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで行うことができる。例えば、本開示のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むRNAを用いて、宿主細胞(例えば、NK細胞、細胞傷害性Tリンパ球など)をインビトロまたはエクスビボでエレクトロポレーションすることができる。
ポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、ウイルスベクターによってトランスフェクトまたは感染させようした細胞の集団からの発現細胞の特定および選択を容易にするために、選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれか、または両方を含むこともできる。いくつかの態様では、選択マーカーを別のDNA片に載せ、コトランスフェクション手順で使用することができる。選択マーカーとレポーター遺伝子の両方は、宿主細胞での発現を可能にするのに適切な調節配列が隣接していてもよい。有用な選択マーカーとしては、非限定的に、抗生物質抵抗性遺伝子が挙げられる。
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性がある細胞を特定するために、および調節配列の機能性を評定するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物および組織中に存在もせず、レシピエント生物および組織が発現もせず、かつある種の容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって発現が顕在化されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、レシピエント細胞にDNAが導入された後の適切な時点で評価される。適切なレポーター遺伝子としては、非限定的に、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を挙げることができる(例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82)。
いくつかの態様では、本開示の核酸は、例えば宿主細胞における、本明細書において記載されるポリペプチドの産生のために提供される。いくつかの態様では、本開示の核酸は、ポリペプチドをコードする核酸の増幅を提供する。
D.使用方法
本明細書において開示される抗FAP抗体、結合ポリペプチド、およびscFvは、診断およびイメージング適用のために使用することもできる。
本明細書において開示される抗FAP抗体、結合ポリペプチド、およびscFvは、診断およびイメージング適用のために使用することもできる。
例えば、本明細書において記載される抗FAP抗体は、イムノアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、免疫沈降法、ウエスタンブロッティング法、または免疫組織化学法を含めて、当業者に公知である古典的な免疫組織学的方法を使用して、生物試料中のFAPタンパク質レベルをアッセイするために使用することができる。適切な抗体アッセイ標識は当技術分野において公知であり、該標識としては、限定されないが、酵素標識、例えば、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼ;放射性同位体、例えば、ヨウ素(125I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(121In)、およびテクネチウム(99mTc);発光標識、例えばルミノール;ならびに蛍光標識、例えば、フルオレセインおよびローダミン、ならびにビオチンが挙げられる。そのような標識は、本明細書において記載される結合ポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片(例えばscFv)を標識するために使用することができる。
あるいは、本明細書において記載される抗FAP抗体またはその抗原結合断片を認識する二次抗体を標識することができ、FAPタンパク質レベルを検出するために、抗FAP抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて使用することができる。一態様では、本発明は、インビトロで、またはインビボでの対象において生物試料中のFAPタンパク質レベルをアッセイおよび/または検出するための、本発明の抗FAP抗体の使用に関する。
FAPタンパク質の発現レベルについてアッセイすることは、直接的(例えば、絶対タンパク質レベルを決定もしくは推定することによる)かまたは相対的(例えば、第2の生物試料における疾患関連タンパク質のレベルと比較することによる)かのいずれかで第1の生物試料中のFAPタンパク質のレベルを定性的または定量的に測定または推定することを含むことが意図される。第1の生物試料におけるFAPポリペプチドの発現レベルを測定または推定することができ、標準FAPタンパク質レベルと比較することができる。標準は、障害を有さない個体から得られた第2の生物試料からとることができ、または障害を有さない個体の集団からのレベルを平均することによって決定することができる。当技術分野において認識されるように、「標準」FAPポリペプチドレベルが一旦分かれば、これを比較のための標準として繰り返し使用することができる。
本明細書において記載される抗FAP抗体またはその抗原結合断片は、当業者に周知かつ標準的である、本明細書に基づくインビトロおよびインビボ適用を含めて、予後判定、診断、モニタリング、またはスクリーニング適用のために使用することができる。
免疫系の状態および/または免疫応答のインビトロ評価および評定のための予後判定、診断、モニタリング、およびスクリーニングのアッセイおよびキットを利用して、免疫系の機能不全または疾患もしくは状態を有するかまたは有する疑いがあることが公知のものを含めた患者の試料を、あるいは状態の疾患の処置と関連している、予測されるかまたは望ましい免疫系応答、抗原応答またはワクチン応答に関して、予測、診断、およびモニターする、または評定することができる。免疫系の状態および/または免疫応答の評価および評定は、薬物の臨床試験について、あるいは、異なる剤または抗体もしくはその抗原結合断片と対比して、以下のものの組み合わせを含めて、特定の化学療法剤または抗体もしくはその抗原結合断片の投与について、患者の適合性を決定するのにも有用である。このタイプの予後判定および診断のモニタリングおよび評価は、乳がんにおいて、HER2タンパク質に対する抗体を利用して既に実際に実施されており(HercepTest(商標)、Dako)、該アッセイは、ハーセプチン(登録商標)を使用する抗体療法について患者を評定するためにも使用されている。インビボ適用としては、指向的細胞療法および免疫系のモジュレーションおよび免疫応答の放射性イメージングが挙げられる。
一局面では、本発明は、診断剤として使用するための、本発明の抗FAP抗体および/または薬学的組成物に関する。
一局面では、本発明は、免疫系機能不全および/またはがんの予測、診断、および/またはモニタリングのための方法で使用するための、本発明の抗FAP抗体および/または薬学的組成物に関する。
一態様では、本発明は、インビトロの対象の生物試料中のFAPタンパク質レベルをアッセイおよび/または検出することによって、対象において免疫系機能不全および/またはがんを予測、診断、および/またはモニターするための、本発明の抗FAP抗体の使用に関する。
一態様では、抗FAP抗体またはその抗原結合断片は、生検試料の免疫組織化学法で使用することができる。別の態様では、抗FAP抗体またはその抗原結合断片を使用して、FAPのレベル、またはその膜の表面にFAPを含む細胞のレベルを検出し、次いで、そのレベルをある特定の疾患症状と関連づけることができる。本明細書において記載される抗FAP抗体またはその抗原結合断片は、検出可能または機能的な標識を保有することができる。蛍光標識が使用される場合、特異的結合メンバー特定する、および定量化するために、当技術分野において公知の現在利用可能な顕微鏡および蛍光活性化セルソーター分析(FACS)または両方の方法手順の組み合わせを利用することができる。
本明細書において記載される抗FAP抗体またはその抗原結合断片は、蛍光標識を保有することができる。例示的な蛍光標識としては、例えば、反応性およびコンジュゲートプローブ、例えば、アミノクマリン、フルオレセイン、およびTexas red、Alexa Fluor色素、Cy色素、およびDyLight色素が挙げられる。抗FAP抗体またはその抗原結合断片は、放射性標識、例えば、同位体3H、14C、32P、35S、36C1、51Cr、52Co、57Co、59Fe、67Cu、90Y、99MTc、111In、117Lu、121I、124I、125I、131I、198Au、211At、213Bi、225Ac、および186Reを保有することができる。放射性標識が使用される場合、FAPへの抗FAP抗体またはその抗原結合断片の特異的結合を特定および定量化するために、当技術分野において公知の現在利用可能なカウント手順を利用することができる。標識が酵素である場合、検出は、当技術分野において公知の現在利用されている比色分析、分光光度、蛍光分光光度、電流測定、または気体定量技法のいずれかによって、成し遂げることができる。これは、抗体またはその抗原結合断片とFAPの間で複合体の形成を可能にする条件下で、試料または対照試料を抗FAP抗体またはその抗原結合断片と接触させることによって、達成することができる。試料および対照において、抗体またはその抗原結合断片とFAPの間で形成される任意の複合体が検出され、比較される。本明細書において記載される抗体のFAPに対する特異的結合に照らして、抗体またはその抗原結合断片は、細胞の表面上のFAP発現を特異的に検出するために使用することができる。本明細書において記載される抗体またはその抗原結合断片は、免疫親和性精製によってFAPを精製するために使用することもできる。例えばFAPまたはCTLA-4/FAPリガンド複合体の存在の程度の定量分析のための試験キットの形態で調製することができるアッセイシステムも本明細書に含まれる。システムまたは試験キットは、標識された成分、例えば標識された抗体、および1種または複数種のさらなる免疫化学的試薬を含むことができる。
一態様では、本発明は、生物試料中のFAPタンパク質レベルをアッセイおよび/または検出するためのインビトロ方法であって、(1)抗体またはその抗原結合断片とFAPの間で複合体の形成を可能にする条件下で、試料および任意で対照試料を本発明の抗FAP抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程、ならびに(2)試料および任意で対照において形成された複合体を検出し、比較する工程を含むインビトロ方法に関する。
ある特定の態様では、FAPのレベルおよび/または分布は、適切なイメージング技法、例えば、陽電子放出断層撮影(PET)スキャンを使用して、検出可能な程度に標識されている本明細書において開示される抗体を検出することによって、インビボで(例えば、非侵襲的に)決定される。例えば、標的抗体PETまたは免疫PET(例えば、抗FAP PET)は、標的FAP発現細胞のレベルおよび/または分布(例えば腫瘍局在)をインビボで検出するために使用することができる。抗体イメージング(例えば、抗体PETイメージング)のための技法は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Lamberts, L. E. et al. (2015) J. Clin. Oncol. 33 (DOI: 10.1200/JCO.2014.57.8278); Tavare, R. et al. (2014) PNAS 111(3):1108-1113; Pampaloni et al., J Clin Oncol 32:5s, 2014 (suppl; abstr 3084);およびBoerman and Oyen (2011) The Journal of Nuclear Medicine 52 (8):1171-72;米国特許第5,192,525号、米国特許第5,219,548号、米国特許第5,399,338号によって記載されているように、当技術分野において公知である。
一態様では、FAPのレベルおよび/または分布は、例えば、Tavare, R. et al. (2014) PNAS 111(3):1108-1113などに記載されているように、例えば、64Cu放射標識のために5-2-(4-イソチオシアナトベンジル)-1,4,7-トリアザシクロノナン-1,4,7-三酢酸にコンジュゲートされたPET試薬で検出可能な程度に標識された抗FAP抗体を検出することによって、インビボで決定される。別の態様では、FAPのレベルおよび/または分布は、例えば、PET試薬で検出可能な程度に標識された抗FAP抗体、例えば、抗体、抗体断片、またはFAPターゲティングポリペプチドのフッ素-18標識を検出することによって、インビボで決定される。さらに別の態様では、FAPのレベルおよび/または分布は、例えば、米国特許第9,988,452号などに記載されているように、PET試薬で検出可能な程度に標識された抗FAP抗体を検出することによって、インビボで決定される。さらに別の態様では、FAPターゲティングポリペプチドは、適切な放射性同位体に対するキレート化のためにデスフェロキサミンに共有結合している。
他の態様では、FAPのレベルは、対象から得た試料(例えば、腫瘍生検)において(例えば、免疫組織化学的技法を使用して)決定される。
検出試薬も本発明の範囲内である。例えば、本明細書において記載される抗FAP抗体分子を含む免疫PET試薬が提供される。例示的な標識試薬としては、限定されないが、アスタチン-211(211At)、臭素-76(76Br)、カルシウム-47(47Ca)、炭素-11(11C)、炭素-14(14C)、クロム-51(51Cr)、コバルト-57(57Co)、コバルト-58(58Co)、銅-64(64Cu)、エルビウム-169(169Er)、フッ素-18(18F)、フルオロデオキシグルコース(18F-FDG)、ガリウム-67(67Ga)、ガリウム-68(68Ga)、水素-3(3H)、インジウム-111(111In)、ヨウ素-123(123I)、ヨウ素-124(124I)、ヨウ素-125(125I)、ヨウ素-131(131I)、鉄-59(59Fe)、クリプトン-81m(81mKr)、ルテチウム-177(177Lu)、窒素-13(13N)、酸素-15(15O)、リン-32(32P)、サマリウム-153(153Sm)、セレン-75(75Se)、ストロンチウム-89(89Sr)、タリウム-201(201Tl)、ナトリウム-22(22Na)、ナトリウム-24(24Na)、テクネチウム99m(99mTc)、キセノン-133(133Xe)、イットリウム-86(86Y)、イットリウム-88(88Y)、イットリウム-90(90Y)、およびジルコニウム-89(89Zr)が挙げられる。免疫PETにおけるさらなる例示的な標識試薬およびそれらの適用は、例えば、Lamberts, L. E. et al. (2015) J. Clin. Oncol. 33 (DOI: 10.1200/JCO.2014.57.8278)、およびBoerman and Oyen (2011) The Journal of Nuclear Medicine 52 (8):1171-72に記載されている。
一局面では、本発明は、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に対する養子細胞療法に適した対象を特定するための方法を提供する。方法は、(a)対象から疾患組織を単離する工程、(b)単離した組織を、FAPに特異的に結合する結合ポリペプチドと接触させる工程、および(c)単離した組織においてFAP発現細胞を検出し、それによって、養子細胞療法に適切な対象を特定する工程を含む。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列GYTITSYSLH(SEQ ID NO:17)を含み、HCDR2がアミノ酸配列
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLAS(SEQ ID NO:20)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む。
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLAS(SEQ ID NO:20)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む。
ある特定の態様では、単離された結合ポリペプチドは、3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、および/またはHCDR2がアミノ酸配列
を含み、および/またはHCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;ならびに3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、および/またはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む。
を含み、および/またはHCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;ならびに3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、および/またはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む。
ある特定の態様では、単離された結合ポリペプチドは、3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列GYTITSYSLH(SEQ ID NO:17)を含み、および/またはHCDR2がアミノ酸配列
を含み、および/またはHCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;ならびに3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLAS(SEQ ID NO:20)を含み、および/またはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む。
を含み、および/またはHCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;ならびに3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLAS(SEQ ID NO:20)を含み、および/またはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む。
ある特定の態様では、単離された結合ポリペプチドは、3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、および/またはHCDR2がアミノ酸配列
を含み、および/またはHCDR3がアミノ酸配列
を含む、重鎖可変領域;ならびに3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、および/またはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む。
を含み、および/またはHCDR3がアミノ酸配列
を含む、重鎖可変領域;ならびに3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、および/またはLCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、および/またはLCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む。
ある特定の態様では、単離された結合ポリペプチドは、本明細書において記載される3つの重鎖相補性決定領域、すなわち、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3のいずれかを含む重鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、本明細書において記載される3つの軽鎖相補性決定領域、すなわち、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3のいずれかを含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3の任意の組み合わせを含み、本明細書において記載される。当業者は、本明細書で提供される重鎖および軽鎖可変領域配列を考慮して、アミノ酸の番号付けに基づいて、適切な相補性決定領域を容易に決定することができるであろう。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは抗体またはその抗原結合断片を含む。ある特定の態様では、抗原結合断片は、Fab、単鎖可変断片(scFv)、または単一ドメイン抗体からなる群より選択される。ある特定の態様では、抗体は完全長抗体である。ある特定の態様では、抗体または抗原結合断片はヒト化抗体またはその抗原結合断片である。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、治療的分子または診断的分子にコンジュゲートしている。ある特定の態様では、診断的分子は検出可能な標識を含む。ある特定の態様では、検出可能な標識は、放射標識、フルオロフォア、酵素、ハプテン、ビオチン、またはクロモフォアである。
ある特定の態様では、適切な対象として対象が特定された後に、対象に養子細胞療法が施される。ある特定の態様では、養子細胞療法はキメラ抗原受容体(CAR)を含む改変免疫細胞を含む。ある特定の態様では、免疫細胞はTリンパ球である。ある特定の態様では、免疫細胞はNK細胞である。ある特定の態様では、CARはFAPに特異的に結合する。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に記載される重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域からなる。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域からなる。
E.処置方法
本明細書において記載される抗体、結合ポリペプチド、およびscFvは、それを必要とする対象において疾患または状態を処置するための組成物に含めることができる。組成物は薬学的組成物を含むことができ、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。治療的有効量の薬学的組成物を対象に投与することができる。
本明細書において記載される抗体、結合ポリペプチド、およびscFvは、それを必要とする対象において疾患または状態を処置するための組成物に含めることができる。組成物は薬学的組成物を含むことができ、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。治療的有効量の薬学的組成物を対象に投与することができる。
一局面では、本発明は、それを必要とする対象においてがんを処置するための方法を提供する。方法は、ヒトおよびイヌ、および/またはマウスの線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)のエピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む単離された結合ポリペプチドを対象に投与する工程を含む。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、本明細書において企図されるHCDRまたはLCDRのいずれかを含む。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:7と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO:9と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
ある特定の態様では、がんは線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)発現細胞と関連する。ある特定の態様では、FAP発現細胞はがん関連細胞である。ある特定の態様では、がん関連細胞はがん関連線維芽細胞(CAF)である。ある特定の態様では、FAP発現がん関連細胞はFAP発現脂肪細胞である。ある特定の態様では、FAP発現がん関連細胞は腫瘍関連マクロファージ(TAM)である。ある特定の態様では、FAP発現がん関連細胞は腫瘍関連好中球(TAN)である。ある特定の態様では、FAP発現がん関連細胞は骨髄系由来サプレッサー細胞(MDSC)である。ある特定の態様では、FAP発現がん関連細胞はがん開始細胞である。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは抗体またはその抗原結合断片を含む。ある特定の態様では、抗原結合断片は、Fab、単鎖可変断片(scFv)、または単一ドメイン抗体からなる群より選択される。ある特定の態様では、抗体は完全長抗体である。ある特定の態様では、抗体または抗原結合断片はヒト化抗体またはその抗原結合断片である。
いくつかの態様では、本開示のFAPターゲティング結合ポリペプチドは、他の治療的作用因子、例えば、非限定的に、免疫療法、例えば、がん免疫学抗体療法およびチェックポイント遮断、またはCAR-T療法と組み合わせて用いることができる。したがって、そのような態様では、第2のポリヌクレオチド配列は、抗がん抗体、チェックポイント遮断分子、またはCARをコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。
本発明の別の局面は、それを必要とする対象においてがんを処置するための方法であって、(a)(i)対象から疾患組織を単離すること;(ii)単離した組織を、FAPに特異的に結合する結合ポリペプチドと接触させること;および(iii)単離した組織においてFAP発現細胞を検出することを含む、適切な対象として対象を特定する工程;ならびに(b)線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合するキメラ抗原受容体(CAR)を含む改変T細胞を含む養子細胞療法を適切な対象に施す工程を含む方法を含む。
本発明の別の局面では、線維症を処置する方法が本明細書で提供される。線維症は、修復または反応プロセスにおける、器官または組織の過剰な線維性結合組織の形成である。刺激された線維芽細胞による結合組織のこの沈着は、下にある器官または組織の正常な構築および機能を妨げ得るか、または完全に阻害し得る。ある特定の態様では、処置することができる線維症としては、限定されないが、肺線維症、心臓線維症、肝線維症、皮膚線維症(ケロイドおよび強皮症を含める)、腸線維症、ならびに腎線維症が挙げられる。ある特定の態様では、線維症は心臓線維症である。
本発明の組成物は、適切な前臨床および臨床実験および試験で決定された投薬量および経路および時間で投与することができる。組成物は、これらの範囲内の投薬量で複数回投与することができる。組成物の投与は、当業者によって決定されるように、望ましい疾患または状態を処置するのに有用な他の方法と組み合わせることができる。
F.薬学的組成物および製剤
本明細書において開示される結合ポリペプチド、scFv、抗体、または抗原結合断片のいずれか1つを含む薬学的組成物も提供される。組成物の中には、疾患または障害の処置などのための投与のための薬学的組成物および製剤がある。対象、例えば患者に薬学的組成物を投与するための治療方法も提供される。
本明細書において開示される結合ポリペプチド、scFv、抗体、または抗原結合断片のいずれか1つを含む薬学的組成物も提供される。組成物の中には、疾患または障害の処置などのための投与のための薬学的組成物および製剤がある。対象、例えば患者に薬学的組成物を投与するための治療方法も提供される。
薬学的組成物および製剤は、一般に、1つまたは複数の随意の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。いくつかの態様では、組成物は、少なくとも1つのさらなる治療的作用物質を含む。
用語「薬学的製剤」は、その中に含まれる活性成分の生物活性が有効であることを可能にするような形態であり、かつ製剤が投与されるであろう対象に対して許容されない毒性を持つさらなる成分を含まない、調製物を指す。「薬学的に許容される担体」は、対象に対して毒性を持たない、薬学的製剤中の活性成分以外の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、限定されないが、緩衝液、賦形剤、安定化剤、または防腐剤が挙げられる。いくつかの局面では、担体の選択は、特定の組成物によって、および/または投与方法によって、ある程度決定される。したがって、様々な適切な製剤が存在する。例えば、薬学的組成物は防腐剤を含むことができる。適切な防腐剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムを挙げることができる。いくつかの局面では、2種以上の防腐剤の混合物が使用される。防腐剤またはそれらの混合物は、典型的には、全組成物の約0.0001~約2重量%の量で存在する。担体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)によって記載されている。薬学的に許容される担体は、一般に、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性を持たず、該担体としては、限定されないが、以下が挙げられる:緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸;アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた、単糖類、二糖類、および他の炭水化物;キレート化剤、例えばEDTA;糖、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属錯体(例えば、亜鉛-タンパク質錯体);ならびに/または非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール(PEG)。
いくつかの局面において、組成物に緩衝剤が含まれる。適切な緩衝剤としては、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、ならびに様々な他の酸および塩が挙げられる。いくつかの局面では、2種以上の緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤またはそれらの混合物は、典型的には、全組成物の約0.001~約4重量%の量で存在する。投与可能な薬学的組成物を調製するための方法は公知である。例示的な方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)により詳細に記載されている。
製剤は水溶液を含むことができる。製剤または組成物は、組成物で処置される特定の適応症、疾患、または状態に有用な1種より多い活性成分、好ましくは、それぞれの活性が互いに悪影響を及ぼさない、組成物に補足的な活性を有するものも含むことができる。そのような活性成分は、意図された目的に有効な量で組み合わされて適切に存在する。したがって、いくつかの態様では、薬学的組成物は、他の薬学的に活性な剤または薬物、例えば化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、および/またはビンクリスチンをさらに含む。いくつかの態様では、薬学的組成物は、疾患または状態を処置または防止するのに有効な量、例えば、治療的有効量または予防的有効量で組成物を含む。いくつかの態様では、治療的または予防的有効性は、処置を受けている対象の定期的な評価によってモニターされる。望ましい投薬量は、組成物の単回ボーラス投与によって、組成物の複数回ボーラス投与によって、または組成物の持続注入投与によって、送達することができる。
製剤としては、経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、頬側、舌下、または坐剤投与のためのものが挙げられる。いくつかの態様では、組成物は非経口的に投与される。本明細書において使用する場合、用語「非経口」は、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、腟、および腹腔内投与を含む。いくつかの態様では、組成物は、静脈内、腹腔内、または皮下注射による末梢性全身送達を使用して、対象に投与される。いくつかの態様では、組成物は、無菌液体調製物、例えば、等張性水溶液、懸濁液、乳濁液、分散液、または粘性組成物として提供され、これらは、いくつかの局面において、選択されたpHに緩衝され得る。液体調製物は、通常、ゲル、他の粘性組成物および固体組成物よりも調整しやすい。さらに、液体組成物は、特に注射によって投与するのがやや簡便である。一方で、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間をもたらすのに適切な粘性範囲内で製剤化することができる。液体または粘性組成物は担体を含むことができ、担体は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール(polyoi)(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコール)およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒でもよい。
無菌の注射用溶液は、例えば、適切な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどと混合して、組成物を溶媒に組み込むことによって、調製することができる。組成物は、望ましい投与経路および調製物に応じて、補助物質、例えば、湿潤剤、分散剤、または乳化剤(例えば、メチルセルロース)、pH緩衝剤、ゲル化もしくは粘性増強添加剤、防腐剤、着香剤、および/または着色剤を含むことができる。いくつかの局面において、適切な調製物を調製するために標準的なテキストを調べることができる。
抗菌性防腐剤、抗酸化剤、キレート化剤、および緩衝液を含めて、組成物の安定性および無菌性を増強する様々な添加剤を加えることができる。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、およびソルビン酸によって確実にすることができる。注射用薬学的剤形の持続性吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。
インビボ投与に使用される製剤は、一般に無菌である。無菌性は、例えば滅菌濾過膜による濾過によって、容易に成し遂げることができる。
本明細書において言及または引用される論文、特許、および特許出願、ならびにすべての他の文献および電子的に入手可能な情報の内容は、個々の刊行物のそれぞれが参照により組み入れられることが具体的におよび個々に示される場合と同じ程度に、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。出願人らは、任意のそのような論文、特許、特許出願、または他の物理的および電子的文書からのありとあらゆる材料および情報を本出願に物理的に組み入れる権利を保有する。
G.本開示の態様
一局面では、本発明は、ヒトおよびイヌ、および/またはマウスの線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)のエピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む単離された結合ポリペプチドを提供する。
一局面では、本発明は、ヒトおよびイヌ、および/またはマウスの線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)のエピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む単離された結合ポリペプチドを提供する。
ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、HCDR2がアミノ酸配列
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む。
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に結合する。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは抗体またはその抗原結合断片を含む。ある特定の態様では、抗原結合断片は、Fab、単鎖可変断片(scFv)、または単一ドメイン抗体からなる群より選択される。ある特定の態様では、抗体は完全長抗体である。ある特定の態様では、抗体または抗原結合断片はヒト化抗体またはその抗原結合断片である。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に記載される重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域からなる。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域からなる。
別の局面では、本発明は、SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;およびSEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単離された結合ポリペプチドを提供する。
別の局面では、本発明は、ヒトおよびイヌ、および/またはマウスの線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)のエピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む単鎖可変断片(scFv)を提供する。
scFvのある特定の態様では、抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、HCDR2がアミノ酸配列
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とはリンカーによって隔てられている。
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とはリンカーによって隔てられている。
別の局面では、本発明は、SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;およびSEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単鎖可変断片(scFv)であって、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とがリンカーによって隔てられている単鎖可変断片(scFv)を提供する。
scFvのある特定の態様では、リンカーはSEQ ID NO:15に記載されるアミノ酸配列を含む。
別の局面では、本発明は、SEQ ID NO:11または13に記載されるアミノ酸配列を含む単鎖可変断片(scFv)を提供する。別の局面では、本発明は、SEQ ID NO:11または13に記載されるアミノ酸配列からなる単鎖可変断片(scFv)を提供する。
別の局面では、本発明は、本明細書において企図される結合ポリペプチドのいずれかまたはscFvのいずれかをコードする単離された核酸を提供する。
別の局面では、本発明は、ヒトおよびイヌ、および/またはマウスの線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)のエピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む結合ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。
核酸のある特定の態様では、抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、HCDR2がアミノ酸配列
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む。
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む。
核酸のある特定の態様では、結合ポリペプチドは抗体またはその抗原結合断片を含む。核酸のある特定の態様では、抗原結合断片は、Fab、単鎖可変断片(scFv)、または単一ドメイン抗体からなる群より選択される。核酸のある特定の態様では、抗体は完全長抗体である。核酸のある特定の態様では、抗体または抗原結合断片はヒト化抗体またはその断片である。
核酸のある特定の態様では、重鎖可変領域は、SEQ ID NO:8に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる。核酸のある特定の態様では、重鎖可変領域は、SEQ ID NO:8に記載されるポリヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる。核酸のある特定の態様では、重鎖可変領域は、SEQ ID NO:8に記載されるポリヌクレオチド配列からなる核酸にコードされる。
核酸のある特定の態様では、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:10に記載される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる。核酸のある特定の態様では、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:10に記載されるポリヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる。核酸のある特定の態様では、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:10に記載されるポリヌクレオチド配列からなる核酸にコードされる。
別の局面では、本発明は、SEQ ID NO:8に記載されるポリヌクレオチド配列を含む核酸配列にコードされる重鎖可変領域;およびSEQ ID NO:10に記載されるポリヌクレオチド配列を含む核酸配列にコードされる軽鎖可変領域を含む結合ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。
別の局面では、本発明は、3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、HCDR2がアミノ酸配列
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域、をコードする単離された核酸を含む単鎖可変断片(scFv)を提供する。
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域、をコードする単離された核酸を含む単鎖可変断片(scFv)を提供する。
別の局面では、本発明は、SEQ ID NO:8に記載されるヌクレオチド配列を含む重鎖可変領域;およびSEQ ID NO:10に記載されるヌクレオチド配列を含む軽鎖可変領域含む単鎖可変断片(scFv)をコードする単離された核酸であって、重鎖可変領域と軽鎖可変領域がリンカーによって隔てられている単離された核酸を提供する。ある特定の態様では、リンカーはSEQ ID NO.15に記載されるアミノ酸配列を含む。
別の局面では、本発明は、SEQ ID NO:12または14に記載されるポリヌクレオチド配列を含む単鎖可変断片(scFv)をコードする単離された核酸を提供する。別の局面では、本発明は、SEQ ID NO:12または14に記載されるポリヌクレオチド配列からなる単鎖可変断片(scFv)をコードする単離された核酸を提供する。
別の局面では、本発明は、本明細書において企図される単離された核酸のいずれかを含むベクターを提供する。ある特定の態様では、ベクターは発現ベクターである。ある特定の態様では、ベクターは、DNAベクター、RNAベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターからなる群より選択される。
別の局面では、本発明は、本明細書において企図されるベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。ある特定の態様では、宿主細胞は真核生物または原核生物起源のものである。ある特定の態様では、宿主細胞は哺乳動物起源のものである。ある特定の態様では、宿主細胞は細菌起源のものである。
別の局面では、本発明は、FAPに結合する結合ポリペプチドまたはscFvを生成する方法であって、本明細書において企図される宿主細胞のいずれかを培養する工程を含む方法を提供する。
別の局面では、本発明は、本明細書において企図される結合ポリペプチドのいずれかまたはscFvのいずれかを含む薬学的組成物を提供する。
別の局面では、本発明は、本明細書において企図される抗体のいずれかまたは抗原結合断片のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。
別の局面では、本発明は、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に対する養子細胞療法に適した対象を特定するための方法であって、(a)対象から疾患組織を単離する工程;(b)単離した組織を、FAPに特異的に結合する結合ポリペプチドと接触させる工程;および(c)単離した組織においてFAP発現細胞を検出し、それによって、養子細胞療法に適切な対象を特定する工程を含む方法を提供する。
方法のある特定の態様では、結合ポリペプチドは、3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、HCDR2がアミノ酸配列
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む。
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域を含む。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは抗体またはその抗原結合断片を含む。ある特定の態様では、抗原結合断片は、Fab、単鎖可変断片(scFv)、または単一ドメイン抗体からなる群より選択される。ある特定の態様では、抗体は完全長抗体である。ある特定の態様では、抗体または抗原結合断片はヒト化抗体またはその抗原結合断片である。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、治療的分子または診断的分子にコンジュゲートしている。ある特定の態様では、診断的分子は検出可能な標識を含む。ある特定の態様では、検出可能な標識は、放射標識、フルオロフォア、酵素、ハプテン、ビオチン、またはクロモフォアである。
ある特定の態様では、適切な対象として対象が特定された後に、対象に養子細胞療法が施される。ある特定の態様では、養子細胞療法はキメラ抗原受容体(CAR)を含む改変免疫細胞を含む。
ある特定の態様では、免疫細胞はTリンパ球である。ある特定の態様では、免疫細胞はNK細胞である。
ある特定の態様では、CARはFAPに特異的に結合する。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に記載される重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域からなる。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域からなる。
別の局面では、本発明は、それを必要とする対象においてがんを処置するための方法を提供する。方法は、SEQ ID NO:7と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;およびSEQ ID NO:9と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単離された結合ポリペプチドを対象に投与する工程を含む。
ある特定の態様では、がんは線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)発現細胞と関連する。ある特定の態様では、FAP発現細胞はがん関連細胞である。ある特定の態様では、がん関連細胞はがん関連線維芽細胞(CAF)である。ある特定の態様では、FAP発現がん関連細胞はFAP発現脂肪細胞である。ある特定の態様では、FAP発現がん関連細胞は腫瘍関連マクロファージ(TAM)である。ある特定の態様では、FAP発現がん関連細胞は腫瘍関連好中球(TAN)である。ある特定の態様では、FAP発現がん関連細胞は骨髄系由来サプレッサー細胞(MDSC)である。ある特定の態様では、FAP発現がん関連細胞はがん開始細胞である。
ある特定の態様では、結合ポリペプチドは線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する。ある特定の態様では、結合ポリペプチドは抗体またはその抗原結合断片を含む。ある特定の態様では、抗原結合断片は、Fab、単鎖可変断片(scFv)、または単一ドメイン抗体からなる群より選択される。ある特定の態様では、抗体は完全長抗体である。ある特定の態様では、抗体または抗原結合断片はヒト化抗体またはその抗原結合断片である。
別の局面では、本発明は、それを必要とする対象においてがんを処置するための方法であって、(a)(i)対象から疾患組織を単離すること;(ii)単離した組織を、FAPに特異的に結合する結合ポリペプチドと接触させること;および(iii)単離した組織においてFAP発現細胞を検出することを含む、適切な対象として対象を特定する工程;ならびに(b)線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合するキメラ抗原受容体(CAR)を含む改変T細胞を含む養子細胞療法を適切な対象に施す工程を含む方法を提供する。
本発明をその特定の態様に関連して記載してきたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、および均等物で置換することができることを当業者は理解されたい。本明細書において開示される態様の範囲を逸脱することなく、適切な均等物を使用して、本明細書において記載される方法の他の適切な改変および適合を行うことができることが当業者に容易に明らかになるであろう。さらに、特定の状況、材料、物質の組成物、プロセス、プロセス工程、または工程を本発明の目的、趣旨、および範囲に適合させるために、多くの改変を行うことができる。すべてのそのような改変は、本明細書に添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。ある特定の態様をここで詳細に記載してきたが、同じことが、例示目的のためだけに含まれ、限定を意図したものではない以下の実施例を参照することにより、より明らかに理解されるであろう。
実験実施例
以下の実験実施例を参照することにより、本発明を詳細にさらに記載する。これらの実施例は、別段の指定がない限り、例示目的のためだけに提供され、限定を意図したものではない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されるとして決して解釈されるべきでなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる、ありとあらゆる変形形態を包含すると解釈されるべきである。
以下の実験実施例を参照することにより、本発明を詳細にさらに記載する。これらの実施例は、別段の指定がない限り、例示目的のためだけに提供され、限定を意図したものではない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されるとして決して解釈されるべきでなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる、ありとあらゆる変形形態を包含すると解釈されるべきである。
さらなる説明なしで、当業者が、前述の説明および以下の例示的な実施例を使用して、本発明の化合物を作製し、利用することができ、かつ特許請求される方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例(working example)は本発明の好ましい態様を特に示すものであり、本開示の残りの部分を限定するものとして決して解釈されるべきでない。
本明細書において開示される実験の実行において使用される材料および方法を次に記載する。
イヌFAP遺伝子配列の生物情報学的推測:イヌFAPについてのNCBI予測配列(XM_005640252.2)を使用して、PCRプライマーを設計した。得られたPCR産物は、タンパク質レベルで予測配列と100%一致した。ヌクレオチドレベルでは、T127およびA603に2つの保存された塩基対置換があった。
イヌFAP cDNAのPCR、サブクローニング、および発現:内在性FAPを発現するイヌSK骨肉腫細胞のコンフルエントな10cmディッシュを1ml TRIzol(Life Technologies, #15596-026)で処理し、製造者のプロトコールに従って全RNAを抽出した。SuperScriptファーストストランド合成キット(Life Technologies, #11904-018)を使用して、5μgの全RNAからcDNAを逆転写した。以下のプライマー:フォワード
;リバース
を用いるタッチダウンPCRのための鋳型としてこのcDNAを使用した。1%アガロースゲルで2291bpの増幅産物を検出した。
;リバース
を用いるタッチダウンPCRのための鋳型としてこのcDNAを使用した。1%アガロースゲルで2291bpの増幅産物を検出した。
得られたPCR産物を精製し、pGEM-T Easy(Promega)にクローニングし、配列決定した。このシャトルベクターは直鎖状にされ、単一の「T」オーバーハングを含む。これによって、TaqポリメラーゼによってPCR産物に付加された3’「A」オーバーハングを使用することによる、PCR産物の単純な非方向性クローニングが可能になる。ここから、EcoRIクローニング部位を使用してcDNAをプラスミドpcDNA3.1に非方向性クローニングした。
cDNAを切り取るためにSpeIを使用し、pLenti6/v5-D-TOPOを開裂するためにXbaIを使用して、イヌFAP cDNAをpcDNA3.1からレンチウイルスプラスミド(pLenti6/v5-D-TOPO)にサブクローニングした。これらの制限部位は適合性末端を有する。これによって、イヌFAP.pLenti6/v5-D-TOPOが得られた。
イヌFAP.pLenti/v5-D-TOPOをパッケージングプラスミド(pMD2.G, pCMVΔR8.2)とともにHEK 293細胞にコトランスフェクトした。48時間後にウイルス含有上清を収集した。p24 ELISAによってウイルスの力価を決定し、0.5:1~10:1の範囲の異なるMOIでBalb/C 3T3線維芽細胞に形質導入した。
フローサイトメトリーを使用して、Balb/C 3T3.イヌFAP細胞における導入遺伝子の発現を確認した。使用した一次抗体は、R&Dシステムのビオチン化ヒツジ抗huFAPポリクローナル抗体(5μg/ml)であった。二次抗体は、BiolegendのAPC-ストレプトアビジン(1μg/ml)であった。
免疫化およびハイブリドーマ生成:完全長イヌFAPを発現するBalb/C 3T3細胞を使用して、14週齢のBalb/C.FAP-\-マウスを免疫化した。すべての注射は腹腔内に与え、0.5ml無菌PBS中の1×107細胞からなっていた。最初の免疫化に続いて、14および28日目に追加免疫し;次いで、42日目に動物から採血し、続いて、56日目に追加免疫し、63日目に採血し、70、217、および238日目にさらに3回追加免疫した。241日目に、2017個の脾臓を収集し、単一細胞懸濁液を調製し、UPENN Hybridoma Core Facilityによって、脾臓細胞をsp2/0細胞と融合した。一次抗体としてハイブリドーマ上清および二次抗体としてAF488ヤギ抗マウスIgGを使用して、MC KOSA親(FAPヌル)対イヌFAP導入遺伝子を発現するMC KOSA.K9FAPについて、FACSによって、ハイブリドーマ上清を最初にスクリーニングした。クローン4G5を親細胞ではなく形質導入細胞に反応するとして特定し、FAP陰性細胞ではなくFAP発現細胞との反応性を確認するために、この細胞を以下のさらなる細胞についてスクリーニングした:ヒト初代線維芽細胞、BALB/c 3T3を発現するマウスまたはヒトFAP導入遺伝子、イヌ初代線維芽細胞、SK KOSA(FAP発現)、およびBALB/c 3T3(FAP陰性)細胞。次いで、(Thermo FisherラピッドELISAマウスmAbアイソタイピングキット#37503)を使用して、4G5をIgG1kアイソタイプ抗体であると決定した。
実施例1:PCRプライマーを設計するために使用されるイヌFAP遺伝子配列の生物情報学的推測
第1工程として、イヌFAP遺伝子の配列をPCRによって増幅した。イヌFAPについてのNCBI予測配列(XM_005640252.2)を使用して、イヌFAPに対して特異的なPCRプライマーを設計した。得られたPCR産物は、タンパク質レベルでイヌFAPの配列と100%一致した(図1)。その後のシークエンシングによって、イヌFAPがヌクレオチドレベルでT127およびA603に2つの保存された塩基対置換を有することが明らかになった。
第1工程として、イヌFAP遺伝子の配列をPCRによって増幅した。イヌFAPについてのNCBI予測配列(XM_005640252.2)を使用して、イヌFAPに対して特異的なPCRプライマーを設計した。得られたPCR産物は、タンパク質レベルでイヌFAPの配列と100%一致した(図1)。その後のシークエンシングによって、イヌFAPがヌクレオチドレベルでT127およびA603に2つの保存された塩基対置換を有することが明らかになった。
実施例2:イヌFAP cDNAのPCR、サブクローニング、シークエンシング、および発現
抗イヌFAP抗体の生成に向けた第1工程として、組換えイヌFAPタンパク質を生成することができるコンストラクトを作出した。イヌFAP cDNAを準備するために、内在性FAPを発現するイヌSK骨肉腫細胞をTRIzolベースのRNA抽出に供し、続いて、単離したRNAをcDNAへ逆転写した。タッチダウンPCRのための鋳型としてこのcDNAを使用し、該PCRによって2291bpの増幅産物を得た。増幅したPCR産物を、精製し、PCR産物の単純な非方向性クローニングを可能にするシャトルベクターにクローニングした。ここから、cDNAを真核生物発現プラスミドにクローニングした(図2A)。次いで、哺乳動物細胞株への形質導入を可能にするために、イヌFAP cDNAをレンチウイルスプラスミドにサブクローニングした(図2B)。次いで、得られたイヌFAP-レンチウイルスコンストラクトをパッケージングプラスミドとともにHEK 293細胞にコトランスフェクトした。次いで、48時間後にウイルス含有上清を収集した。p24 ELISAによってウイルスの力価を決定し、0.5:1~10:1の範囲の様々なMOIでBALB/c由来3T3線維芽細胞に形質導入した。フローサイトメトリーを使用して、3T3-イヌFAP細胞における導入遺伝子の発現を確認した(図2C)。
抗イヌFAP抗体の生成に向けた第1工程として、組換えイヌFAPタンパク質を生成することができるコンストラクトを作出した。イヌFAP cDNAを準備するために、内在性FAPを発現するイヌSK骨肉腫細胞をTRIzolベースのRNA抽出に供し、続いて、単離したRNAをcDNAへ逆転写した。タッチダウンPCRのための鋳型としてこのcDNAを使用し、該PCRによって2291bpの増幅産物を得た。増幅したPCR産物を、精製し、PCR産物の単純な非方向性クローニングを可能にするシャトルベクターにクローニングした。ここから、cDNAを真核生物発現プラスミドにクローニングした(図2A)。次いで、哺乳動物細胞株への形質導入を可能にするために、イヌFAP cDNAをレンチウイルスプラスミドにサブクローニングした(図2B)。次いで、得られたイヌFAP-レンチウイルスコンストラクトをパッケージングプラスミドとともにHEK 293細胞にコトランスフェクトした。次いで、48時間後にウイルス含有上清を収集した。p24 ELISAによってウイルスの力価を決定し、0.5:1~10:1の範囲の様々なMOIでBALB/c由来3T3線維芽細胞に形質導入した。フローサイトメトリーを使用して、3T3-イヌFAP細胞における導入遺伝子の発現を確認した(図2C)。
実施例3.免疫化、融合、およびスクリーニング
次いで、完全長イヌFAPを発現するように形質導入されたBALB/c 3T3線維芽細胞を使用して、14週齢のBALB/c FAP-\-マウスを免疫化した。すべての注射は腹腔内に与え、0.5ml無菌PBS中の1×107細胞からなっていた。最初の免疫化に続いて、次の8か月にわたって一定の間隔で6回、追加免疫を行った。研究の終わりに、脾臓を収集し、得られた単一細胞懸濁液を使用して、sp2/0細胞との融合を介してハイブリドーマを生成した。次いで、抗イヌFAP抗体を産生するものについて、得られたハイブリドーマをスクリーニングした。最初のスクリーニングとして、FAPヌルMC KOSA親細胞ではなくイヌFAP導入遺伝子を発現するMC KOSA細胞を染色することができる免疫グロブリンを産生する細胞をフローサイトメトリーによって特定した(図3)。その結果、4G5クローンを潜在的候補として特定した。フォローアップ研究によって、本クローンによって産生された免疫グロブリンが、FAP発現ヒト初代線維芽細胞、マウスまたはヒトFAP導入遺伝子を発現するBALB/c 3T3細胞、イヌ初代線維芽細胞、およびFAP発現SK KOSA細胞を染色することができることが、さらに明らかになった。同様に、4G5免疫グロブリンはFAP陰性親BALB/c 3T3細胞を染色することができず、これによって、その特異性がさらに示される。最後に、市販のELISAベースの抗体アイソタイピングキットを使用して、4G5によって産生される免疫グロブリンをさらに特徴づけた。これらの結果によって、4G5がマウス-IgG1-カッパアイソタイプ抗体であることが実証された(図4A~4C)。4G5とマウスIgG1アイソタイプ対照とを比較するためのフォローアップタンパク質ゲルは、重鎖および軽鎖バンドが同様のパターンになり、これにより、4G5のアイソタイプ同一性がさらに実証される(図5)。
次いで、完全長イヌFAPを発現するように形質導入されたBALB/c 3T3線維芽細胞を使用して、14週齢のBALB/c FAP-\-マウスを免疫化した。すべての注射は腹腔内に与え、0.5ml無菌PBS中の1×107細胞からなっていた。最初の免疫化に続いて、次の8か月にわたって一定の間隔で6回、追加免疫を行った。研究の終わりに、脾臓を収集し、得られた単一細胞懸濁液を使用して、sp2/0細胞との融合を介してハイブリドーマを生成した。次いで、抗イヌFAP抗体を産生するものについて、得られたハイブリドーマをスクリーニングした。最初のスクリーニングとして、FAPヌルMC KOSA親細胞ではなくイヌFAP導入遺伝子を発現するMC KOSA細胞を染色することができる免疫グロブリンを産生する細胞をフローサイトメトリーによって特定した(図3)。その結果、4G5クローンを潜在的候補として特定した。フォローアップ研究によって、本クローンによって産生された免疫グロブリンが、FAP発現ヒト初代線維芽細胞、マウスまたはヒトFAP導入遺伝子を発現するBALB/c 3T3細胞、イヌ初代線維芽細胞、およびFAP発現SK KOSA細胞を染色することができることが、さらに明らかになった。同様に、4G5免疫グロブリンはFAP陰性親BALB/c 3T3細胞を染色することができず、これによって、その特異性がさらに示される。最後に、市販のELISAベースの抗体アイソタイピングキットを使用して、4G5によって産生される免疫グロブリンをさらに特徴づけた。これらの結果によって、4G5がマウス-IgG1-カッパアイソタイプ抗体であることが実証された(図4A~4C)。4G5とマウスIgG1アイソタイプ対照とを比較するためのフォローアップタンパク質ゲルは、重鎖および軽鎖バンドが同様のパターンになり、これにより、4G5のアイソタイプ同一性がさらに実証される(図5)。
他の態様
本明細書の可変物の任意の定義における要素のリストの記述は、列挙される要素の任意の単一の要素または組み合わせ(もしくは部分的組み合わせ)としてのその可変物の定義を含む。本明細書における態様の記述は、任意の単一の態様としての、または任意の他の態様もしくはそれらの一部と組み合わせたその態様を含む。
本明細書の可変物の任意の定義における要素のリストの記述は、列挙される要素の任意の単一の要素または組み合わせ(もしくは部分的組み合わせ)としてのその可変物の定義を含む。本明細書における態様の記述は、任意の単一の態様としての、または任意の他の態様もしくはそれらの一部と組み合わせたその態様を含む。
本明細書において引用されるありとあらゆる特許、特許出願、および刊行物の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。本発明を特定の態様に関連して開示してきたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の他の態様および変形が他の当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、すべてのそのような態様および均等な変形形態を含むと解釈されることが意図される。
Claims (31)
- ヒトおよびイヌ、および/またはマウスの線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)のエピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、単離された結合ポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインが、
(a)3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、HCDR2がアミノ酸配列
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および
(b)3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域
を含む、請求項1記載の結合ポリペプチド。 - (a)線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に結合する;および/または
(b)抗体もしくはその抗原結合断片を含む;および/または
(c)SEQ ID NO:7に記載される重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む;および/または
(d)SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む;および/または
(e)SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域からなる;および/または
(f)SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む;および/または
(g)SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む;および/または
(h)SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域からなる、
請求項1または2記載の結合ポリペプチド。 - (a)前記抗原結合断片が、Fab、単鎖可変断片(scFv)、もしくは単一ドメイン抗体からなる群より選択される;および/または
(b)前記抗原結合断片が、Fab、単鎖可変断片(scFv)、もしくは単一ドメイン抗体からなる群より選択され、該抗体が完全長抗体である;および/または
(c)前記抗原結合断片が、Fab、単鎖可変断片(scFv)、もしくは単一ドメイン抗体からなる群より選択され、該抗体もしくは抗原結合断片がヒト化抗体もしくはその抗原結合断片である、
請求項1~3のいずれか一項記載の結合ポリペプチド。 - (a)SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、単離された結合ポリペプチド。 - ヒトおよびイヌ、および/またはマウスの線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)のエピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、単鎖可変断片(scFv)。
- 前記抗原結合ドメインが、
(a)3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、HCDR2がアミノ酸配列
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および
(b)3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域
を含み、
該重鎖可変領域と該軽鎖可変領域とがリンカーによって隔てられている、
請求項6記載のscFv。 - (a)SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、単鎖可変断片(scFv)であって、
該重鎖可変領域と該軽鎖可変領域とがリンカーによって隔てられており、任意で、該リンカーがSEQ ID NO:15に記載されるアミノ酸配列を含む、単鎖可変断片(scFv)。 - (a)SEQ ID NO:11もしくは13に記載されるアミノ酸配列を含む;または
(b)SEQ ID NO:11もしくは13に記載されるアミノ酸配列からなる、
単鎖可変断片(scFv)。 - 請求項1~9のいずれか一項記載の結合ポリペプチドまたはscFvをコードする、単離された核酸。
- ヒトおよびイヌ、および/またはマウスの線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)のエピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む結合ポリペプチドをコードする、単離された核酸。
- 前記抗原結合ドメインが、
(a)3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、HCDR2がアミノ酸配列
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および
(b)3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域
を含む、請求項11記載の核酸。 - (a)前記結合ポリペプチドが抗体もしくはその抗原結合断片を含み、任意で、該抗体が完全長抗体である;および/または
(b)該抗原結合断片が、Fab、単鎖可変断片(scFv)、もしくは単一ドメイン抗体からなる群より選択される;および/または
(c)該抗体もしくは抗原結合断片がヒト化抗体もしくはその断片である、
請求項11または12記載の核酸。 - (a)前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:8に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる;および/または
(b)前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:8に記載されるポリヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる;および/または
(c)前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:8に記載されるポリヌクレオチド配列からなる核酸にコードされる;および/または
(d)前記軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:10に記載される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる;および/または
(e)前記軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:10に記載されるポリヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる;および/または
(f)前記軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:10に記載されるポリヌクレオチド配列からなる核酸にコードされる、
11~13のいずれか一項記載の核酸。 - (a)SEQ ID NO:8に記載されるポリヌクレオチド配列を含む核酸配列にコードされる重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO:10に記載されるポリヌクレオチド配列を含む核酸配列にコードされる軽鎖可変領域
を含む結合ポリペプチドをコードする、単離された核酸。 - (a)(i)3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、HCDR2がアミノ酸配列
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域、および
(ii)3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域
を含む単鎖可変断片(scFv)をコードする;または
(b)(i) SEQ ID NO:8に記載されるヌクレオチド配列を含む重鎖可変領域、および
(ii) SEQ ID NO:10に記載されるヌクレオチド配列を含む軽鎖可変領域
を含む単鎖可変断片(scFv)をコードし、
該重鎖可変領域と該軽鎖可変領域とがリンカーによって隔てられており、任意で、該リンカーがSEQ ID NO.15に記載されるアミノ酸配列を含む;ならびに/または
(c)SEQ ID NO:12もしくは14に記載されるポリヌクレオチド配列を含む単鎖可変断片(scFv)をコードする;ならびに/または
(d)SEQ ID NO:12もしくは14に記載されるポリヌクレオチド配列からなる単鎖可変断片(scFv)をコードする、
単離された核酸。 - 請求項10~16のいずれか一項記載の単離された核酸を含む、ベクター。
- (a)発現ベクターである;ならびに/または
(b)DNAベクター、RNAベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターからなる群より選択される、
請求項17記載のベクター。 - (a)請求項17もしくは18記載のベクターを含む;および/または
(b)真核生物もしくは原核生物起源のものである;および/または
(c)哺乳動物起源のものである;および/または
(d)細菌起源のものである、
宿主細胞。 - 請求項19記載の宿主細胞を培養する工程を含む、FAPに結合する結合ポリペプチドまたはscFvを生成する方法。
- 請求項1~9のいずれか一項記載の結合ポリペプチドまたはscFvを含む、薬学的組成物。
- 線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に対する養子細胞療法に適した対象を特定するための方法であって、
(a)該対象から疾患組織を単離する工程;
(b)該単離した組織を、FAPに特異的に結合する結合ポリペプチドと接触させる工程;および
(c)該単離した組織においてFAP発現細胞を検出する工程
を含み、
それによって、該養子細胞療法に適切な対象を特定する、方法。 - 前記結合ポリペプチドが、
(a)3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列YTITSYSLH(SEQ ID NO:1)を含み、HCDR2がアミノ酸配列
を含み、HCDR3がアミノ酸配列LDDSRFHWYFDV(SEQ ID NO:3)を含む、重鎖可変領域;および
(b)3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)を含み、LCDR2がアミノ酸配列LTSNLA(SEQ ID NO:5)を含み、LCDR3がアミノ酸配列QQWSGYPPIT(SEQ ID NO:6)を含む、軽鎖可変領域
を含む、請求項22記載の方法。 - (a)前記結合ポリペプチドが抗体もしくはその抗原結合断片を含む;および/または
(b)該抗原結合断片が、Fab、単鎖可変断片(scFv)、もしくは単一ドメイン抗体からなる群より選択され、任意で、該抗体が完全長抗体である;および/または
(c)該抗体もしくは抗原結合断片がヒト化抗体もしくはその抗原結合断片である;および/または
(d)前記結合ポリペプチドが、治療的分子もしくは診断的分子にコンジュゲートしている;および/または
(e)前記結合ポリペプチドが診断的分子にコンジュゲートしており、該診断的分子が検出可能な標識を含む;および/または
(f)前記結合ポリペプチドが診断的分子にコンジュゲートしており、該診断的分子が検出可能な標識を含み、さらに、該検出可能な標識が、放射標識、フルオロフォア、酵素、ハプテン、ビオチン、もしくはクロモフォアである、
請求項22または23記載の方法。 - 適切な対象として前記対象が特定された後に、前記対象に前記養子細胞療法が施される、請求項22~24のいずれか一項記載の方法。
- (a)前記養子細胞療法が、キメラ抗原受容体(CAR)を含む改変免疫細胞を含む;および/または
(b)前記養子細胞療法が、キメラ抗原受容体(CAR)を含む改変免疫細胞を含み、該免疫細胞がTリンパ球である;および/または
(c)前記養子細胞療法が、キメラ抗原受容体(CAR)を含む改変免疫細胞を含み、該免疫細胞がNK細胞である;および/または
(d)前記養子細胞療法が、キメラ抗原受容体(CAR)を含む改変免疫細胞を含み、該CARがFAPに特異的に結合する、
請求項25記載の方法。 - 前記結合ポリペプチドが、
(a)SEQ ID NO:7に記載される重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む;および/または
(b)SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む;および/または
(c)SEQ ID NO:7に記載されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域からなる;および/または
(d)SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む;および/または
(e)SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む;および/または
(f)SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域からなる、
請求項22~26のいずれか一項記載の方法。 - それを必要とする対象においてがんを処置するための方法であって、
(a)SEQ ID NO:7と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO:9と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む単離された結合ポリペプチドを該対象に投与する工程を含む、方法。 - (a)前記がんが線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)発現細胞と関連する;および/または
(b)該FAP発現細胞ががん関連細胞である;および/または
(c)該FAP発現細胞ががん関連細胞であり、該がん関連細胞ががん関連線維芽細胞(CAF)である;および/または
(d)該FAP発現細胞ががん関連細胞であり、該FAP発現がん関連細胞がFAP発現脂肪細胞である;および/または
(e)該FAP発現細胞ががん関連細胞であり、該FAP発現がん関連細胞が腫瘍関連マクロファージ(TAM)である;および/または
(f)該FAP発現細胞ががん関連細胞であり、該FAP発現がん関連細胞が腫瘍関連好中球(TAN)である;および/または
(g)該FAP発現細胞ががん関連細胞であり、該FAP発現がん関連細胞が骨髄系由来サプレッサー細胞(MDSC)である;および/または
(h)該FAP発現細胞ががん関連細胞であり、該FAP発現がん関連細胞ががん開始細胞である、
請求項28記載の方法。 - (a)前記結合ポリペプチドが線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する;および/または
(b)前記結合ポリペプチドが抗体もしくはその抗原結合断片を含む;および/または
(c)該抗原結合断片が、Fab、単鎖可変断片(scFv)、もしくは単一ドメイン抗体からなる群より選択され、任意で、抗体が完全長抗体である;および/または
(d)該抗体もしくは抗原結合断片がヒト化抗体もしくはその抗原結合断片である、
請求項28または29記載の方法。 - それを必要とする対象においてがんを処置するための方法であって、
(a)(i)該対象から疾患組織を単離すること;
(ii)該単離した組織を、FAPに特異的に結合する結合ポリペプチドと接触させること;および
(iii)該単離した組織において、FAP発現細胞を検出すること
を含む、適切な対象として該対象を特定する工程;ならびに
(b)線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合するキメラ抗原受容体(CAR)を含む改変T細胞を含む養子細胞療法を該適切な対象に施す工程
を含む、方法。
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