CN117264062A - 一种特异性结合Trop2的抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种特异性结合Trop2的抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用，属于生物免疫治疗技术领域，该抗体具有良好的安全性以及靶向Trop2的治疗效果，且该抗体能够用于制备靶向Trop2的免疫效应细胞，为与Trop2表达相关的疾病提供了治疗或改善途径。

Description

一种特异性结合Trop2的抗体或其抗原结合片段及其制备方 法和应用

技术领域

本发明涉及嵌合抗原受体技术领域，具体涉及一种特异性结合Trop2的抗体或其抗原结 合片段及其制备方法和应用。

背景技术

针对肿瘤，通过传统的手术切除、化疗、放射线治疗，对正常组织有伤害，具有局限性， 效果有限。近年来出现的靶向疗法在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点来设计相应 的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死 亡，不会伤及肿瘤周围的正常组织细胞。

Trop2是由TACSTD2基因编码表达的细胞表面糖蛋白，全称为人滋养细胞表面糖蛋白抗 原2(Trophoblast Cell Surface Antigens 2)。Trop2由疏水性前导肽、细胞外结构域、一个跨膜 结构域和一个胞质尾部组成，是单次跨膜糖蛋白，大小为35.7KD，是一类钙离子通道信号转 化器。Trop2蛋白N-端为胞外域(Trop2 EC)，该胞外域通过一个单向跨膜螺旋(TM)与胞 内短尾(Trop2 IC)连接，从而固定于胞膜。其细胞质尾部有高度保守的磷脂酰肌醇4,5-二磷 酸(PIP2)结合序列，表明PIP2在Trop2的信号转导中起重要作用。除了PIP2结合基序外，它 还含有保守的酪氨酸和丝氨酸磷酸化位点。正常组织中Trop2不表达或者低表达，在乳腺癌、 胃癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、宫颈癌、头颈癌和卵巢癌等多种恶性肿瘤中过表达， 可促进肿瘤的发生、侵袭、转移和扩散等，在肿瘤生长过程中起着关键作用，所以Trop2被 认为是肿瘤免疫候选的一个靶点。

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能 以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治 疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段， 是一种针对肿瘤细胞表面特异性抗原的新型免疫治疗方法。大量研究表明，CAR-T细胞可以 有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。

嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA以非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更 广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFv段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号域。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安 全性来讲都是关键的决定因素。

单链抗体作为CAR中重要的组成部分，目前传统上采用鼠源抗体，但由于鼠抗的异质性 会引起人抗鼠抗体反应(Human anti-mouse antibody reaction，HAMA)，因此会导致CAR-T 在循环系统中被很快清除，失去疗效。

目前未见如本申请记载的具有良好治疗效果和安全性的Trop2结合分子、基于所述Trop2 结合分子的CAR修饰的免疫效应细胞的报道。

发明内容

本发明提供一种Trop2结合分子，其包含抗Trop2抗体或其抗原结合片段，所述Trop2 结合分子包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:1-12任一所示的重 链互补决定区HCDR，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:13-24任一所示的轻链互补决定区 LCDR，

在一个或多个实施方案中，所述重链可变区的CDR序列和轻链可变区的CDR序列选自 以下任一项：

(1)序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR2、序列 如SEQ ID NO:3所示的HCDR3以及序列如SEQ ID NO:13所示的LCDR1、序列如 SEQ ID NO:14所示的LCDR2、序列如SEQ ID NO:15所示的LCDR3；

(2)序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR1、序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR2、序列 如SEQ ID NO:6所示的HCDR3以及序列如SEQ ID NO:16所示的LCDR1、序列如 SEQ ID NO:17所示的LCDR2、序列如SEQ ID NO:18所示的LCDR3；

(3)序列如SEQ ID NO:7所示的HCDR1、序列如SEQ ID NO:8所示的HCDR2、序列 如SEQ ID NO:9所示的HCDR3以及序列如SEQ ID NO:19所示的LCDR1、序列如 SEQ ID NO:20所示的LCDR2、序列如SEQ ID NO:21所示的LCDR3；

(4)序列如SEQ ID NO:10所示的HCDR1、序列如SEQ ID NO:11所示的HCDR2、序 列如SEQ ID NO:12所示的HCDR3以及序列如SEQ ID NO:22所示的LCDR1、序列如 SEQ ID NO:23所示的LCDR2、序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR3。

在一个或多个实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25-28中的任意 一种所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29-32中的任意一种所示；

在一个或多个实施方案中，所述重链可变区和轻链可变区的序列选自以下任一项：

(a)当所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示时，所述轻链可变区的氨基 酸序列如SEQ ID NO:29所示；

(b)当所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示时，所述轻链可变区的氨基 酸序列如SEQ ID NO:30所示；

(c)当所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示时，所述轻链可变区的氨基 酸序列如SEQ ID NO:31所示；

(d)当所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示时，所述轻链可变区的氨基 酸序列如SEQ ID NO:32所示。

在一个或多个实施方案中，所述抗体为单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性 抗体中的至少一种；所述抗原结合片段为Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fd、单链抗体scFv、二硫键 连接的Fv(sdFv)、或单域抗体中的至少一种。

本发明另一方面提供一种嵌合抗原受体，包含任选的信号肽序列、本文任一实施方案所 述的Trop2结合分子、铰链区、跨膜区和胞内区。

在一个或多个实施方案中，胞内区包括胞内共刺激域和/或胞内信号域。

在一个或多个实施方案中，从N端到C端，该嵌合抗原受体依次含有信号肽、本文任一 实施方案所述的Trop2结合分子、铰链区、跨膜区、胞内共刺激域和胞内信号域。

本发明还提供核酸分子，其具有选自以下任一项的序列：

(1)本文任一实施方案所述Trop2结合分子或嵌合抗原受体的编码序列；

(2)(1)的互补序列；

(3)(1)或(2)中任一序列的5-50bp的片段。

在一个或多个实施方案中，所述片段是引物。

本发明还提供一种核酸构建物，包含本文所述的核酸分子。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体、表达载体或整合载体。

本发明还提供一种宿主细胞，选自：

(1)表达和/或分泌本文任一实施方案所述Trop2结合分子或嵌合抗原受体；

(2)包含本文所述的核酸分子；和/或

(3)包含本文所述的核酸构建物。

在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞是免疫效应细胞，优选T细胞。

本发明还提供一种产生本文任一实施方案Trop2结合分子的方法，包括：在适合产生Trop2 结合分子(例如抗Trop2抗体或其抗原结合片段，单价或多价抗Trop2抗体、或多特异性抗Trop2 抗体)的条件下培养本文所述的宿主细胞，和任选的从培养物中纯化所述Trop2结合分子。

本发明还提供一种药物组合物，包含本文任一实施方案所述Trop2结合分子、核酸分子、 核酸构建物或宿主细胞，和药学上可接受的辅料。

在一个或多个实施方案中，所述药物组合物用于治疗Trop2表达相关的疾病或病况。

本发明还提供本文任一实施方案所述Trop2结合分子、嵌合抗原受体、核酸分子、核酸构 建物或宿主细胞在制备活化的免疫细胞(例如T细胞)中的用途。

本发明还提供本文任一实施方案所述Trop2结合分子、嵌合抗原受体、核酸分子、核酸构 建物或宿主细胞在制备用于预防或治疗Trop2表达相关的疾病或病况的药物中的用途。

在一个或多个实施方案中，所述疾病或病况选自以下的一种或多种：乳腺癌、胃癌、结 直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、宫颈癌、头颈癌、肺癌、食道癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌和卵巢癌。

本发明还提供一种治疗或预防Trop2表达相关的疾病或病况的方法，所述方法包括给予需 要的患者治疗有效量的本发明任一实施方案所述的Trop2结合分子或宿主细胞，或本发明任一 实施方案所述的药物组合物。

本发明还提供一种检测Trop2的试剂盒，用于例如评估药物治疗效果或诊断癌症，所述的 试剂盒包含本文任一实施方案所述Trop2结合分子、核酸分子、核酸构建物或宿主细胞。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括用于检测Trop2与所述Trop2结合分子的结 合的试剂。例如通过酶联免疫反应法检测所述结合的试剂。

在一个或多个实施方案中，所述检测结合的试剂是能与Trop2结合分子连接的可检测标记 物，例如生物素。所述的可检测标记物被连接于所述Trop2结合分子或分离地存在于试剂盒中。

本发明还提供一种检测样品中Trop2存在情况的非诊断性方法，所述方法包括：以本文任 一实施方案所述Trop2结合分子与样品孵育，和检测Trop2与所述Trop2结合分子的结合，从而 确定样品中Trop2存在情况。所述检测是酶联免疫反应法检测。

本发明还提供本文任一实施方案所述Trop2结合分子在制备用于检测样品中Trop2、评估 药物治疗效果或诊断癌症的试剂盒中的用途。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种新的特异性识别Trop2的抗体以及含有该抗体的CAR修饰细胞，该抗 体和细胞具有良好的靶向Trop2的治疗效果和安全性，为与Trop2表达相关的疾病提供了治 疗或改善途径。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简 单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的 限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图 获得其他相关的附图。

图1为重组人Trop2-avi-his抗原蛋白的SDS电泳图。

图2为不同克隆Trop2 CAR的示意图。

图3为不同克隆Trop2 CAR-T细胞的CAR阳性率。

图4为不同克隆Trop2 CAR-T细胞的CD107a表达。

图5为效靶比10:1时不同克隆Trop2 CAR-T细胞的INFγ分泌。

图6为效靶比2:1时不同克隆Trop2 CAR-T细胞的INFγ分泌。

图7为效靶比10:1时不同克隆Trop2 CAR-T细胞的IL-2分泌。

图8为效靶比2:1时不同克隆Trop2 CAR-T细胞的IL-2分泌。

图9为实施例5不同克隆Trop2 CAR-T细胞对靶细胞BxPC3-LUC-GFP的杀伤实验结果。

图10为实施例5不同克隆Trop2 CAR-T细胞对靶细胞U251-LUC-GFP的杀伤实验结果。

图11、12为实施例6不同克隆Trop2 CAR-T细胞对靶细胞的杀伤动力图。

图13为实施例6不同克隆Trop2 CAR-T细胞对靶细胞的29H、59H杀伤率统计图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，经过大量的筛选，发现一类抗Trop2抗体及其抗原结合 片段，其能够特异性识别Trop2，以高亲和力与Trop2结合，具有良好的功能活性。

具体地，本发明首先构建人Trop2蛋白表达载体，在真核细胞表达并纯化得到人Trop2蛋 白，然后构建人天然抗体噬菌体展示文库，淘选得到具有良好的靶向性和安全性的抗Trop2 抗体，能够特异性结合人Trop2的胞外域。

本发明还提供含有所述抗Trop2抗体的嵌合抗原受体(CAR)。将包含该CAR的编码序列的 载体用于感染免疫细胞，能够获得对过表达Trop2的肿瘤细胞具有显著杀伤能力的免疫效应细 胞，该免疫效应细胞能够应用于治疗或改善Trop2表达相关的疾病，从而为Trop2阳性肿瘤的 治疗奠定了基础。

抗体

本文中，“Trop2结合分子”是特异性结合Trop2的蛋白质，包括但不仅限于，抗体、重 链抗体、纳米抗体或它们的抗原结合片段。

本文中，术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长抗体，其具有免疫球蛋白Fc区)，具有多表位特异性的抗体组合物，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，双抗体和单链分子，以及抗体片段，尤其是抗原结合片段，例如，Fab，F(ab’)2，Fd和Fv。本文中，“抗体”与“免 疫球蛋白”可互换使用。

传统的“抗体”含有基本的4链抗体单元，是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链 (H)构成的异四聚体糖蛋白。每条重链在N-末端具有可变结构域(VH)，接着是三个(对于每种α和γ链，CH1、CH2和CH3)和四个(对于μ和ε同种型，CH1、CH2、CH3和CH4)恒 定结构域(CH)以及位于CH1结构域与CH2结构域之间的绞链区(Hinge)。每条轻链在N- 末端具有可变结构域(VL)，接着是其另一端的恒定结构域(CL)。成对的VH和VL一起形 成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见如Basic and Clinical Immunology，第八版，Daniel P.Sties，Abba I.Terr和Tristram G.Parsolw编辑，Appleton& Lange，Norwalk，CT，1994，第71页和第6章。来自任何脊椎动物物种的轻链，根据其恒定 结构域氨基酸序列，可归入两种称作κ和λ的截然不同型中的一种。根据CH序列和功能的相对 较小差异，γ和α类可进一步分为亚类，例如人表达下列亚类：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、 IgG4、IgA1和IgA2。

抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和 轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分(相对于相同类型的其它抗体)并含有抗原结合位点。

术语“可变的”指可变结构域中的某些区段在抗体序列中差异广泛的情况。可变结构域 介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变结 构域跨越的全部氨基酸。相反，其集中在三个称为高变区(HVR)的区段(在轻链和重链可 变结构域中均有)，即分别为重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3以及轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3。可变结构域中更为高度保守的部分称为骨架区(FR)。天然重 链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区(FR1、FR2、FR3和FR4)，它们大多采取β-折叠 构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个HVR连接。每条链中 的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点 的形成。通常，轻链可变区的结构为FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4，重链可变区 的结构为FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的 结合，但展现出多种效应子功能，如在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中抗体的参与。抗体 的可变区有多种标注方案，包括：Chothia、Kabat、IMGT和Contact。本文示例性使用IMGT 标注方案。

“Fc区”(可结晶片段区域)或“Fc结构域”或“Fc”是指抗体重链的C-末端区域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞) 上的Fc受体的结合，或者与经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。在IgG，IgA和IgD抗体同 种型中，Fc区由来自抗体两条重链的CH2结构域和CH3结构域的两个相同的蛋白片段构成； IgM和IgE的Fc区在每个多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。虽然免疫球蛋白重 链的Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为从重链位置C226或P230的氨基酸 残基到羧基端的序列段，其中该编号是根据EU索引，如在Kabat中一样。如本文所使用的， Fc区可以是天然序列Fc或变体Fc。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片 段优选为抗体的抗原结合片段。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)、F(ab’)2、Fd、和Fv 片段、二硫键连接的Fv；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；scFv-Fc片段；由抗体片段形成 的多特异性抗体；以及通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段。抗 原结合片段可以通过多种技术制备，包括但不限于将完整的抗体蛋白水解消化，以及由包含 抗原结合片段的宿主细胞表达产生。

“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的 一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中突出了 六个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特 异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个HVR的半个Fv)也具有识 别和结合抗原的能力，尽管亲合力低于完整结合位点。“单链Fv”也可缩写为“sFv”或“scFv”， 是包含抗体VH和VL结构域的连接成一条多肽链的抗体片段。优选的是，sFv多肽在VH和VL 结构域之间还包含多肽接头，使得sFv形成期望的抗原结合结构。

本文中，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能以 少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体 的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。与多克隆抗体制剂 (其典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相比，每个单克隆抗体针对抗原上的 单个决定簇。除它们的特异性外，单克隆抗体的优势在于它们通过杂交瘤培养合成，未受到 其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不 应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过 多种技术来生成，包括例如杂交瘤法、噬菌体展示法、重组DNA法、及用于从具有部分或整 个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物生成人或人样抗体的技术、单 细胞测序法。

单克隆抗体在本文中也包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物 种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另 一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段， 只要它们展现出期望的生物学活性。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的 嵌合抗体。因此，“人源化抗体”通常指可变结构域构架区与在人抗体中发现的序列交换的 非人抗体。通常在人源化抗体中，整个抗体(除CDR以外)由人来源的多核苷酸编码或与这 种抗体相同(除CDR以外)。CDR(其中一些或全部由源自非人生物体的核酸编码)被移植 到人抗体可变区的β-折叠骨架中以产生抗体，其特异性由被移植的CDR来决定。这类抗体的 产生方法本领域周知，例如使用具有基因工程免疫系统的小鼠而产生。本发明中，抗体、单 链抗体等均包括各所述抗体的经人源化的变体。

“人抗体”指这样的抗体，其具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/ 或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术产生。人抗体的这种定义明确排除包含非人 抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示 文库。

在一些实施方案中，本发明还提供与本发明的任何抗Trop2抗体的抗原接合区结合人 Trop2上相同表位的抗体或其抗原结合片段，即能够与本发明的任何抗体的抗原结合区交叉竞 争与Trop2的结合的抗体或其抗原结合片段。

本发明中，Trop2结合分子包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:1-12任一所示的重链互补决定区HCDR，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:13-24任一所 示的轻链互补决定区LCDR。优选地，本发明的Trop2结合分子其重链可变区的CDR序列和 轻链可变区的CDR序列选自以下任一项：(a)序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR2、序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR3以及序列如 SEQ ID NO:13所示的LCDR1、序列如SEQ ID NO:14所示的LCDR2、序列如SEQ ID NO:15 所示的LCDR3；(b)序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR1、序列如SEQ ID NO:5所示的 HCDR2、序列如SEQ ID NO:6所示的HCDR3以及序列如SEQ ID NO:16所示的LCDR1、序 列如SEQ ID NO:17所示的LCDR2、序列如SEQ ID NO:18所示的LCDR3；(c)序列如 SEQ ID NO:7所示的HCDR1、序列如SEQ IDNO:8所示的HCDR2、序列如SEQ ID NO:9所 示的HCDR3以及序列如SEQ ID NO:19所示的LCDR1、序列如SEQ ID NO:20所示的LCDR2、 序列如SEQ ID NO:21所示的LCDR3；(d)序列如SEQ ID NO:10所示的HCDR1、序列如 SEQ ID NO:11所示的HCDR2、序列如SEQ ID NO:12所示的HCDR3以及序列如 SEQ ID NO:22所示的LCDR1、序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR2、序列如SEQ ID NO:24 所示的LCDR3。

优选地，本发明的Trop2结合分子的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25-28中的 任意一种所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29-32中的任意一种所示。

本文所述Trop2结合分子可以是包含一条、两条或多条本文所述的抗Trop2抗体或抗原 结合片段的单价或多价抗体、或多特异性抗体。多特异性可以是针对Trop2和另一种抗原， 也可以是针对Trop2的两种不同表位。

本发明还包括所述抗体衍生物和类似物。“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发 明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的衍生物或类似物可以是(i)在一个或多个氨 基酸残基中具有取代基团的多肽，或(ii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合 物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的 多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融 合蛋白)。根据本文的教导，这些衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明的抗体序列改变一个 或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段序列的变体。这些变体包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30 个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端 添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。在本领域 中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质的功能。如在FR和 /或Fc区中将具有类似性质的氨基酸进行取代。可进行保守性取代的氨基酸残基为本领域所周 知。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。又比如，在C末端和/或 N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。它们都被视为包括在本发明保 护的范围内。

本文所述抗体的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、 诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋 白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。在一些实施方案中，本发明所述变 体的序列可以与其来源序列有至少有95％、96％、97％、98％或99％的一致性。本发明所述的 序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是 BLASTP或TBLASTN。本发明还包括那些具有带CDR的抗体重链可变区或轻链可变区的分 子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源 性。

可采用本领域常规的方法制备本发明的抗体，如杂交瘤技术。可采用本领域常规的方法 制备本发明的单链抗体，如本领域熟知的噬菌体展示技术。或者，本发明的抗体或单链抗体 可在其他细胞系中表达。可用编码本发明抗体的序列转化合适的哺乳动物宿主细胞，然后培 养宿主细胞并纯化抗体。转化可采用任何已知的方法进行，例如包括将多核苷酸包装在病毒 (或病毒载体中)并用病毒(或载体)转导宿主细胞。所用的转化程序取决于将转化的宿主。 用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法为本领域所熟知，包括葡聚糖介导的转染、 磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸囊封在脂质体中和将 DNA直接微注射至核中等。可用作用于表达的宿主的哺乳动物细胞系为本领域所熟知，包括 但不限于可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的多种永生化细胞系，包括但不限于 中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝 细胞癌细胞(例如，HepG2)等。

CAR

本发明还提供一种靶向Trop2的嵌合抗原受体(CAR)。该CAR含有任选的信号肽序列、抗 原识别区即本文所述的抗Trop2结合分子、铰链区、跨膜区和胞内区。其中胞内区包含一个或 多个胞内共刺激域和/或一个或多个胞内信号域。本文中的“铰链区”、“跨膜区”和“胞内 区”均可选自已知的CAR-T技术中的铰链区、跨膜区和胞内区的序列。

CAR上任选的信号肽可以根据需要选择。一般而言，信号肽是使多肽靶向细胞中的所需 部位的肽序列。信号肽使多肽靶向细胞的分泌通路，并且将允许多肽整合和锚定至脂双层； 信号肽还可以是膜定位信号肽。示例性的信号肽例如CD8信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽 或轻链信号肽，其序列在本领域技术人员的知识范围内。适用于本发明的CD8信号肽可以是 本领域常用于CAR的各种人CD8信号肽序列。在某些实施方案中，所述CD8信号肽的氨基酸 序列包含SEQ ID NO:33所示序列。

嵌合抗原受体的铰链区位于胞外抗原结合区和跨膜区之间，铰链区是通常在蛋白质的两 个域之间存在的氨基酸区段，并且可以允许蛋白质的柔性和两个域的彼此相对运动。铰链区 可以是天然存在的蛋白质的铰链区或其部分。抗体(诸如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体) 的铰链区也可用于本文所述的嵌合抗原受体。非天然存在的肽也可用作本文所述的嵌合抗原 受体的铰链区。示例性地，CAR的铰链区选自CD8α铰链区、IgD铰链区、IgG1Fc CH2CH3铰 链区或IgG4 Fc CH2CH3铰链区，其序列在本领域技术人员的知识范围内。适用于本发明的 CD8α铰链区可以是本领域常用于CAR的各种人CD8α铰链区序列。在某些实施方案中，所述 人CD8α铰链区包含SEQ ID NO:34所示序列。

嵌合抗原受体的跨膜区可以形成α螺旋、多于一个α螺旋的复合物、β桶或能够跨域细胞磷 脂双层的任何其它稳定结构。跨膜区可以是天然或合成来源的。跨膜区可选自以下蛋白的跨 膜区：CD3ε、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、 CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、T细胞受体的α、β或ζ链。适用于本发明的人CD8α 跨膜区可以是本领域常用于CAR的各种人CD8α跨膜区序列。在某些实施方案中，所述人CD8α 跨膜区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:35所示序列。

胞内信号区(或胞内信号传导区)负责表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞的至少一种正 常效应子功能的活化。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞 因子的分泌。虽然通常可以利用整个胞内信号传导区，但是在很多情况下，使用整个链是不 必要的。就使用胞内信号传导区的截短部分而言，只要其转导效应子功能信号，就可以使用 这种截短部分代替完整链。因此，胞内信号传导区包括足以转导效应子功能信号的胞内信号 传导区的任何截短形式。CAR的胞内信号域可以根据需要选择，包括但不限于来源于CD3ζ、 FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d 中的至少一种的胞内信号域。优选地，所述胞内信号区来源于人CD3ζ胞内信号区。进一步地， 所述人CD3ζ胞内信号区具有SEQ ID NO:37所示氨基酸序列。

在抗原特异性信号的刺激以外，很多免疫效应细胞还需要共刺激来促进细胞增殖、分化 和存活，以及活化细胞的效应子功能。“共刺激域”可以是共刺激分子的胞质部分。术语“共刺 激分子”是指免疫细胞(诸如T细胞)上的关联结合伴侣，该关联结合伴侣与共刺激配体特异 性结合，从而由免疫细胞介导共刺激响应，诸如但不限于增殖和存活。可以根据需要选择适 合的胞内共刺激域，包括具有共刺激信号分子的胞内结构域，例如源自4-1BB，CARD11， CD2，CD7，CD27，CD28，CD30，CD40，CD54，CD83，OX40，CD137，CD134，CD150，CD152，CD223，CD270，PD-L2，PD-L1，CD278，DAP10，LAT，NKD2C，SLP76，TRIM，FcεRIγ，MyD88，和41BBL的胞内结构域的至少一种。在某些实施方案中，4-1BB共刺激域 的氨基酸序列包含SEQ ID NO:36所示序列。

形成本发明的嵌合抗原受体的上述各部分，如CD8信号肽、抗Trop2单链抗体、CD8α铰 链区、CD8α跨膜区、CD3ζ胞内信号域、4-1BB共刺激域等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头 序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA和GGSGG。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有插入 氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3～25个 氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多 甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、 2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。在某些实施方案中，接头序列为(GGGGS)n连接，其中n为1～5的整数。

在示例性实施方案中，CAR从N端到C端依次含有CD8信号肽、本文所述的抗Trop2抗体或其抗原结合片段、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB共刺激域、CD3ζ胞内信号域。 在具体实施例中，具有上述结构的示例性CAR如SEQ ID NO:38-41中任一所示。

应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸 序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋 白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化， 常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例 如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本发明的CAR的 氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于 本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII， AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。

本发明的CAR中的抗原识别区可以是前述的抗Trop2抗体或其功能性片段序列的变体。此 外，CAR的其他部分也可以发生序列变化，得到的突变体与该CAR具有至少80％，优选至少 85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该CAR的生物学活 性(如活化T细胞)。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。

突变体还包括：在任一实施方案所述的CAR的氨基酸序列中具有一个或数个突变(插入、 缺失或取代)、同时仍保留该CAR的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1-10个以 内，例如1-8个、1-5个或1-3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或 相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的 氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基 酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不 带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、 半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯 丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和 具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中 用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。

核酸

本发明还提供了编码上述抗体或CAR的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或 RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码融合蛋白的多核苷酸序列的简并变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。

所以，本发明还涉及与上述多核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至 少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多 核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严谨条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度 下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰 胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上， 更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生 物学功能和活性。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的 方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。 通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链 或轻链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。CAR的序列也可以如上获 得。或者，可以如上得到CAR的各部分(信号肽、抗原识别区、铰链区、跨膜区或胞内区) 的序列后再连接得到CAR的全长。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆 入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明 所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。目前，已经可以完全 通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA 序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合 成将突变引入本发明蛋白序列中。CAR各部分可以顺序克隆到载体中或者可以整合为全长 CAR后再克隆。

本发明也涉及核酸构建物，该核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列，以及与这些序 列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的多核苷酸序列可以多种方式被操作以保 证所述抗体或CAR的表达。在将核酸构建物插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对 核酸构建物进行操作。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。

调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连 接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截 短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。 合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱 动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动 子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但 不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末 端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、 鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动 子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动 子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸 序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫 蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子 序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终 止子都可用于本发明。调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的 非翻译区。前导序列与编码该多肽的核苷酸序列的5’末端可操作连接。在选择的宿主细胞中 有功能的任何终止子都可用于本发明。

在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体，例如克隆载体、表达载体和整合载体。通 常通过可操作地连接本发明的多核苷酸序列至表达载体，实现本发明多核苷酸序列的表达。 典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。 整合载体含有将靶序列整合到细胞基因组上的组件。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞， 以使其能够表达蛋白质。载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的 序列。所述序列(在某些实施方案中总称为“侧翼序列”)通常包括一个或多个以下核苷酸 序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位 点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化 序列、用于插入编码将要表达的抗体的核酸的多连接子区和可选标记元件。

此外，载体的类型不受限制，例如，质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒，可根据待导入的宿主细胞而改变。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork) 和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、 腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的载体也可包含可选择的标记基因或报 道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择 表达细胞。

细胞

适用于导入本文所述核酸构建物的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真 核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，特别是免疫细胞，优选免疫效 应细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵 母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。

“免疫效应细胞”是可执行免疫效应功能的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫效应细 胞表达至少FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的免疫效应细胞的实例包括外周血 单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞、中性粒细胞和嗜酸性 粒细胞。优选地，免疫效应细胞选自：由多能干细胞或胚胎干细胞培养分化的免疫细胞、T 淋巴细胞、NK细胞、外周血单个核细胞(PBMC)和造血干细胞中的至少一种。更优选地， 所述免疫效应细胞为T淋巴细胞(同T细胞)。在一些实施方案中，T细胞可以为CD4+/CD8-、 CD4-/CD8+、CD4+/CD8+、CD4-/CD8-或它们的组合。在一些实施方案中，T细胞在表达嵌合 抗原受体并结合至靶细胞时产生IL-2、IFN和/或TNF。在一些实施方案中，CD8+T细胞在表 达嵌合抗原受体并结合至靶细胞时裂解抗原特异性靶细胞。

适用于本发明的T细胞可以是各种来源的各种类型的T细胞。例如，T细胞可来源于恶性 实体瘤(例如胰腺癌)患者的PBMC。在某些实施方案中，获得T细胞后，可先用适量的(例如30～ 80ng/ml，如50ng/ml)的CD3抗体刺激活化，然后在含有适量的(例如30～80IU/ml，如50IU/ml) 的IL2培养基进行培养备用。

将核酸或载体引入哺乳动物细胞的方法是本领域已知的，所述载体可以通过物理、化学 或生物方法转入细胞。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数 生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。当宿主是真核生物，可选用 如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。 在一些实施方案中，转导的或转染的免疫效应细胞在引入核酸或载体之后离体繁殖。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的抗体或CAR。根据所用 的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进 行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导 选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要， 可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是 本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀 剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、 离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

用途和方法

通过构建单链抗体文库，发明人筛选了可以结合Trop2的单链抗体。利用这些单链抗体， 发明人构建了CAR以及CAR-T细胞，经细胞水平实验验证，所述CAR-T有很强的免疫功能， 更优的CD107a表达、IFN-γ和IL-2分泌以及对靶细胞的特异性杀伤功能，体内药效显著。

本文所述的抗体、CAR、编码序列、核酸构建物、和细胞的所有方面都可用于制备用以 预防或治疗本文所述各种病况和疾病的药物，所述病况和疾病是与Trop2表达相关的疾病或病 况，指由Trop2表达异常所直接或间接导致的疾病，通常是指由Trop2过表达所导致的疾病， 例如癌症，包括但不限于：乳腺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、宫颈癌、头颈癌、 肺癌和卵巢癌。

本发明还包括一类细胞疗法，包括在免疫细胞(例如T细胞)中表达本文所述的CAR， 和对需要其的接受者施用治疗有效量的细胞，细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。相比抗体疗 法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。由CAR-T细胞引起 的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法 步骤的一部分，其中CAR-T细胞诱导对CAR中的抗原结合部分特异性的免疫应答。

本发明的抗体、核酸或CAR-修饰的细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或 与其他组分诸如相关的细胞因子或细胞群结合施用。在此方面，药物组合物可以通过使具有 所需纯度的活性药剂与任选的药学上可接受的载剂混合以冻干制剂或水溶液的形式制备。药 学上可接受的载剂在所用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，可包括缓冲剂(例如中性缓冲 盐水、硫酸盐缓冲盐水)、抗氧化剂、防腐剂、等渗剂、稳定剂、螯合剂(例如EDTA或谷 胱甘肽)、佐剂(例如氢氧化铝)和表面活性剂中的至少一种。此外，为了使药物组合物可 用于体内施用，它们必须是无菌的。可以通过无菌过滤膜过滤使药物组合物无菌。

在一些实施方案中，药物组合物可以含有：细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫 抑制剂、生长抑制剂以及待治疗的具体适应症所需的活性药剂中的至少一种添加剂。添加剂 的具体添加量可根据实际需要进行调整。本发明的药物组合物可以以“免疫学上有效量”、 “抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”的量施用。“治疗”指向受试者采用本文所述治疗方案以达到至少一种阳性治疗效果(比如，癌症细胞数目减少、肿瘤体积减小、 癌细胞浸润至周边器官的速率降低或肿瘤转移或肿瘤生长的速率降低)。当指出“免疫学上 有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。通常，包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的 剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可 通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676，1988) 施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医 学领域技术人员容易地确定。

组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入 或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施 用给患者。在另一个实施方案中，本发明的T细胞组合物优选通过静脉注射施用。T细胞的组 合物可被直接注入肿瘤、淋巴结或感染位置。

在本发明的一些实施方案中，本发明的CAR-T细胞或其组合物可与本领域已知的其它疗 法结合。所述疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。例如，可结合本领域周知的治疗 间皮素介导的疾病的放疗或化疗制剂进行治疗。

本文中，“抗肿瘤效应”指一种生物学效应，其可由肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的减 少、转移数的减少、预期寿命的增加或与癌相关的各种生理症状的改善表示。

“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，指可引起免疫应答的活有机体，如哺乳动物。例子包括但不限于人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。

诊断、检测和试剂盒

本发明的结合分子因其与Trop2的高亲合力可用于测定，例如结合测定来检测和/或定量 在组织或细胞中表达的Trop2。结合分子例如单链抗体可用在进一步研究Trop2在疾病中的作 用的研究中。检测Trop2的方法大致如下：获得细胞和/或组织样本；检测样本中Trop2的水平。

本发明的Trop2结合分子可用于诊断目的，用来检测、诊断或监控与Trop2相关的疾病和/ 或病况。本发明提供使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法检测样本中Trop2的存 在。可以体内或体外进行Trop2的检测。适用于检测Trop2的存在的方法实例包括ELISA、 FACS、RIA等。

对于诊断应用来说，通常用可检测的标记基团来标记结合分子例如单链抗体。合适的标 记基团包括(但不限于)以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、 99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如，FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶促基团(例 如，辣根过氧化物酶、β根半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基 基团或由二级报导体识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、用于二级抗体的结合位 点、金属结合结构域、表位标签)、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术) 造影剂。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中已知且可用来进行本发明。

本发明的另一方面提供检测与本发明的抗体竞争结合Trop2的测试分子的存在的方法。一 种所述测定的实例将涉及在存在或不存在测试分子的情形下检测含有一定量Trop2的溶液中 的游离抗体的量。游离抗体(即，未结合Trop2的抗体)的量增加将表示测试分子能与该抗体竞 争结合Trop2。在一个实施方案中，用标记基团标记抗体。或者，标记测试分子并在存在或不 存在抗体的情形下监控游离测试分子的量。

本发明还提供了用于检测Trop2水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别Trop2蛋白的抗 体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、 检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意 图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则均为本领域常规 的材料和方法。

实施例

实施例1：重组人Trop2蛋白表达载体构建与真核表达

1.基因序列的合成及蛋白的表达载体的构建

从Uniport下载人Trop2蛋白序列(https://www.uniprot.org/uniprot)，经密码子在线优化 工具(http://www.jcat.de/#opennewwindow)优化后，交由生工合成Trop2胞外段基因序列。 同时在该基因序列的3’端添加avi-tag和6×his-tag的核酸序列，融合基因序列编码SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，融合基因的序列如SEQ ID NO:47所示。通过分子克隆，拼接产物 用TaKaRa无缝克隆试剂盒克隆到pTT5中获得表达载体。

2.重组人Trop2蛋白的表达、纯化

以获得的表达载体转染293T细胞(ATCC)5天后，收集培养上清，用AKTA Explorer100 (GE)纯化重组人Trop2蛋白。Trop2蛋白经SDS-PAGE电泳后通过考马斯亮蓝染色显示其大小约36千道尔顿左右，结果如图1所示。

实施例2：抗人Trop2抗体的制备

1.scFv噬菌体展示文库的构建

采用两步法构建人天然抗体噬菌体展示文库，即分两步将人天然抗体轻链可变区基因和 重链可变区基因连接到噬菌体展示载体中。

1)κ链，λ链可变区基因扩增

用人免疫球蛋白κ链可变区正向引物(3z3-1-F)和反向引物(Huvksc-R)以人PBMCcDNA 为模板，PCR扩增人免疫球蛋白κ链可变区基因，用人免疫球蛋白λ链可变区正向引物(3z3-1-F)和反向引物(HuvLR-1)以人PBMC cDNA为模板，PCR扩增人免疫球蛋白λ链 可变区基因，PCR反应条件如下：98℃预变性45秒后进入温度循环，98℃变性15秒，60℃ 退火20秒，72℃延伸23秒，循环30次，72℃最终延伸5分钟。PCR产物经1.5％琼脂糖凝 胶电泳后，用胶回收试剂盒(Promega)回收330bp左右的κ链可变区基因片段和λ链可变区 基因片段。

2)κ链，λ链文库构建

κ链基因、λ链基因和噬菌粒pcomb3sc用NheI-HF和SalI-HF DNA内切酶(NEB)进行双酶切，酶切后的κ链基因和λ链基因直接用胶回收试剂盒进行回收。而酶切后的pcomb3sc载体经1％琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒(Promega)回收4100bp载体片段。将κ链基因和λ链基因分别用T4 DNA连接酶试剂盒(Invitrogen)连接到pcomb3sc载体中，pComb3sc1000ng，κ和λ用量分别200ng，配制多个反应管，50μl/管，16℃连接过夜，取少量连接产物琼脂糖凝胶电泳检测连接效率。连接产物用MECK MILLIPOREF微孔滤膜进行脱盐。将脱 盐的连接产物电击转化自制的TG1电转感受态细胞，得到κ链文库和λ链文库，电击转化后 的κ链文库和λ链文库经过夜扩增，第二天用质粒大抽试剂盒(NucleoBond Xtra Maxi EF) 抽取κ链文库质粒和λ链文库质粒。

3)重链可变区VH基因扩增

使用人免疫球蛋白重链可变区正向引物(VH-MIX 1/7)和反向引物(VH-MIX R)，使用 人免疫球蛋白重链可变区正向引物(VH-MIX3)和反向引物(VH-MIX R)，使用人免疫球蛋白重链可变区正向引物(VH-MIX4)和反向引物(VH-MIX R)，均以人PBMC cDNA为模板 PCR扩增人免疫球蛋白VH可变区基因，PCR反应条件：98℃预变性45秒后进入温度循环，98℃变性15秒，60℃退火20秒，72℃延伸23秒，循环30次，72℃最终延伸5分钟。PCR 产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒(Promega)回收330bp左右的VH基因片段。

4)scFv文库构建

将回收的VH片段等比例混合，和上述的κ链文库质粒、λ链文库质粒均用SfiI DNA内 切酶进行单酶切，50℃酶切16h，酶切后的VH基因直接用胶回收试剂盒进行过柱回收，而酶切后的κ链文库和λ链文库经1％琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒(Promega)回收4000bp 左右载体片段。将VH基因用T4 DNA连接酶试剂盒(Invitrogen)连接到κ链和λ链载体文 库中，即pComb3sc-lambda/kappa(SfiI)1000ng，VH amplify mix(sfiI)200ng，配制多个反 应管，50μl/管，16℃连接过夜，取少量连接产物琼脂糖凝胶电泳检测连接效率。连接产物用 MECK MILLIPOREF微孔滤膜进行脱盐。

将上述连接产物加入自制的TG1电转化感受态中，然后使用电转仪进行电击转化。取出 50μL菌液用PBS进行梯度稀释10²-10⁵倍。取10μL各梯度稀释液在Amp/2YT plate上流线， 37℃孵育过夜，以此计数并统计噬菌体抗体文库的大小。剩余的电转化后的细菌补2YT至 500ml，加入含100μg/mL氨苄青霉素，30℃220rpm培养过夜。最后得到超过3E10的scFv免疫文库。电击转化后的抗体文库经过夜扩增，离心收集文库菌体，加终浓度20％甘油-80度保存。

取冻存的部分人天然抗体噬菌体展示文库菌种接种到2YT培养集中，接种密度为0.1OD， 将菌液置于37℃、220rpm条件进行培养，大约1.5小时后，菌液密度达到0.6OD，此时加入 20倍于菌体数的M13KO7噬菌体静置30分钟侵染，然后30℃、220rpm培养过夜。第二天，10000g离心菌液，收集培养上清，向培养上清中加入1/4体积的PEG/NaCl溶液(20％PEG8000， 2.5M NaCl)，混匀后冰浴1小时。冰浴结束后，8000g离心10分钟收集沉淀，10％Glycerol/PBST 溶解沉淀即得到人天然抗体噬菌体展示文库。测OD268，并将其分装至1.5mL离心管中，6OD/ 管，-80℃保存。

2.淘选Trop2 scFv抗体

1)重组人Trop2蛋白偶联到链霉亲和素磁珠

用生物素化试剂盒(易锦生物)按试剂盒说明书，将重组人Trop2蛋白的avi-tag进行生 物素修饰，得到生物素化的Trop2蛋白。取10μg上述生物素修饰的重组蛋白加入到经PBS 洗涤3次的100μL链霉亲和素磁珠(DynaBeads 280)中，置于旋转摇床上，速度20转每分钟，室温偶联1小时后PBS洗涤3次。

2)封闭噬菌体文库及阴性磁珠

取Kappa-scFv-lib和Lambda-scFv-lib各一支，室温融化后，各加入200μL 5％BSA/PBST， 置于旋转摇床速度20转每分钟，室温旋转封闭1小时，这些噬菌体为Input1。同时取100μL 未偶联蛋白的DynaBeads 280，PBS洗涤3次后，加入1mL 1％BSA/PBS，按上述条件旋转孵 育1小时。

3)封闭阳性磁珠

向上述偶联Trop2的磁珠中加入1mL 1％BSA/PBS20转每分钟，室温旋转封闭1小时。

4)阴性淘选

为去除与磁珠相互作用的抗体，有必要进行阴性淘选。将经BSA封闭的噬菌体文库和未 偶联抗原的磁珠混合，按上述条件旋转孵育1小时。孵育结束后将噬菌体磁珠混合物置于磁 力架上，待磁珠都贴壁之后，将上清转移至新的EP管中。

5)阳性淘选

将上述封闭后的偶联有Trop2蛋白的磁珠加入到阴性淘选后的噬菌体上清中进行阳性淘 选，20转每分钟，室温旋转封闭1小时。孵育结束后用1mL PBST(0.1％Tween-20inPBS) 洗涤磁珠，重复洗涤10次。洗涤结束后加入1mL 100mM甘氨酸(pH2.0)，置于旋转摇床上 速度设定20转每分钟，旋转洗脱10分钟。洗脱结束后将EP管置于磁力架上，待磁珠都贴 壁后将洗脱液转移至新的EP管中。向洗脱液中加入0.2mL 1M Tris-HCl溶液(pH 8.0)进行 中和。将中和后的洗脱液加入到30mL OD600约为0.6的TG1菌液中静置侵染30分钟，然后 加入20倍于菌体数的M13KO7噬菌体，静置侵染30分钟，最后加入100mL 2YT培养基及 终浓度为100μg/mL的氨苄霉素和卡那霉素，30℃、220rpm培养过夜。第二天按上述收获噬 菌体文库的方法收获噬菌体，此时得到的噬菌体为Input2。

6)重复阳性淘选

按上述淘选方法进行2次重复，即将Input2进行下一轮阴性淘选和阳性淘选得到Input3。 不同之处在于Input3进行淘选得到的洗脱液侵染TG1后，不加M13KO7，而是取10μl菌液 用PBS进行梯度稀释，取10³、10⁴、10⁵三个稀释梯度各100μl菌液涂布2YT/Amp平板，30℃ 培养过夜，剩余的菌液30℃、220rpm培养过夜。

7)ELISA筛选阳性抗体

用牙签随机挑取上述平板中的TG1单克隆到800μL含有10×自诱导2YT/Amp的深孔板 中，深孔板粘覆透气膜，37℃、220rpm培养3小时后，30℃、220rpm培养过夜。ELISA板 中包被重组人Trop2蛋白，每孔100ng。次日，先在深孔板中取50μl保菌，其余的4000rpm 离心10分钟，去除孔内培养基保留菌体沉淀，每孔加入100μl TES溶液(20％蔗糖、0.1mM EDTA、50mM Tris-HCl，pH 8.0)，震荡使菌体重新悬浮后冰浴30分钟后再加入200μL超纯 水震荡混匀30min，震荡结束后4000rpm离心10分钟，此时深孔板中的上清溶液即为含有抗 体的周质腔提取物。用洗板机清洗ELISA板三次，然后加入200μL 1％BSA/PBS，37℃封闭 1小时。去除ELISA板中的封闭液，加入100μL上述周质腔提取物，37℃孵育1小时，用洗 板机清洗3次，加入100μL Chicken anti-HA HRP(1％BSA/PBS)，37℃孵育1小时，用洗板 机清洗3次，加入100μL TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100μL Stop solution终止液。 用酶标仪读取OD450值，将读值高于背景值3倍的克隆进行桑格测序，获得抗体的基因序 列。

8)验证阳性克隆

根据测序结果，选取抗体CDR3氨基酸序列差异较大的克隆重新接种并诱导过夜，按上 述ELISA方法再次验证所选克隆能否结合Trop2。最终得到L2C8、L2C9、L3G5、K2F5四条较好的抗体序列。

L2C8的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，轻链可变区序列的氨基酸序列如 SEQ ID NO:29所示。

L2C9的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，轻链可变区序列的氨基酸序列如 SEQ ID NO:30所示。

L3G5的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，轻链可变区序列的氨基酸序列如 SEQ ID NO:31所示。

K2F5的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，轻链可变区序列的氨基酸序列如 SEQ ID NO:32所示。

实施例3：含抗人Trop2嵌合抗原受体元件的逆转录病毒原液制备

1.靶向人Trop2抗原的嵌合抗原受体的制备

基因合成或克隆含抗人Trop2抗原的单链抗体scFv，铰链区、跨膜区和胞内信号段的嵌 合抗原受体序列，其结构如图2所示。根据装载scFv和胞内信号的不同，将嵌合抗原受体分 别命名为L2C8-BBz、L2C9-BBz、L3G5-BBz和K2F5-BBz，其氨基酸序列分别为SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41所示，核苷酸序列分别为SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示。

以逆转录载体MSGV为骨架载体，构建了表达L2C8、L2C9、L3G5和K2F5克隆的嵌合抗原受体的逆转录病毒质粒。挑选测序正确的克隆，接种菌液至200ml 2YT培养基中，过夜摇菌，并按照NucleoBond Xtra Maxi EF试剂盒说明书完成大提质粒。

2.逆转录病毒包装

用阳离子聚合物PEI包装逆转录病毒，流程如下：分别用无血清DMEM 600μl稀释PEI 36μl和逆转录病毒包装质粒(病毒主质粒2μg、Gag-pol3.8μg、vsvg1.5μg)；然后将PEI/DMEM 加入质粒/DMEM混合物，涡旋震荡混匀，在室温下静置15分钟；将质粒-PEI复合物加入预 先铺板的293T细胞。转染后16h换液，在48h后收集第一次病毒上清，72h后收集第二次病毒上清，并用0.45μm滤器过滤，分装至1.5mL离心管，1ml/管，-80℃保存备用。

实施例4：Trop2 CAR-T细胞的制备和CAR阳性率测定

1.PBMC分离与活化

领取一支PBMC，核对患者个体识别码无误后，进行复苏。用X-VIVO完全培养基调整细胞密度为1×10⁶/mL。将复苏后恢复过夜的PBMC，轻柔吹打，用70μm细胞筛网过滤后， 转入50ml离心管中，室温离心，1500rpm，离心5min，弃上清。用适量的DPBS重悬细胞， 取20μl与台盼蓝1:1混匀后计数，计算活率、CD3+细胞数，然后取所需体积的细胞，室温 1500rpm，离心5min，弃上清，用于分选。按照CD3/CD28磁珠(LIFE)与CD3+细胞1:1比例， 计算磁珠用量，磁珠量＝【CD3+细胞数/4×10⁵】μl。清洗磁珠：取无菌流式管一支，加入2ml 的DPBS，同时加入磁珠，磁力架上静置1min后，弃上清。将流式管移除磁力架，取与细胞 悬液等体积的DPBS或X-VIVO15重悬，加入细胞悬液中磁珠和细胞于15ml离心管混合后， 在旋转混合仪上孵育。室温孵育30min。孵育完成后，轻柔将细胞转移至无菌流式管中，用 1ml DPBS冲洗15ml离心管，冲洗液并入同一流式管中。将无菌流式管移至磁力架上，静置 1min后，吸弃未吸附的液体。将无菌流式管移出磁力架，用1ml CAR-T培养基重悬细胞，并 用CAR-T培养基冲洗管壁2次，全部收集转移至同一离心管内。用CAR-T培养基调整细胞 密度为1×10⁶ml，添加IL-2终浓度为200IU/ml，置37℃，5％CO₂培养箱培养两天。

2.病毒原液感染与培养

将活化后的T细胞调整为5×10⁵/mL，在24孔板中分别加入1ml T细胞和1ml病毒原液， 每孔加2μl polybrene，32℃，2500rpm，离心1.5h。弃去上清液，每孔加入1ml T细胞培养基 (含IL-2 300IU/ml)。将培养板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。感染后24h，转至6孔板， 每天观察细胞的密度，适时补加含IL-2 300IU/ml的T细胞培养液，使T细胞的密度维持在 1×10⁶/ml左右，使细胞扩增。

3.CAR阳性率检测

逆转录病毒感染的T淋巴细胞在病毒感染72h后检测CAR阳性率。针对含L2C8、L2C9、 L3G5和K2F5克隆的嵌合抗原受体组和阴性未感染对照组NT，分别取1×10⁶个细胞，离心 去除培养基，用500μl PBS洗细胞一次后用100μl重悬置于流式上样管中(BD)。加入生物素 -标记的Trop2抗原(1:200)四度孵育30分钟。PBS洗细胞一次后按1:100加入二抗PE-SA 链霉亲合素(BioLegend)四度避光孵育30分钟。500μl PBS洗细胞后用200μl PBS重悬细胞 并上机检测，CAR-T阳性率流式分析结果如图3所示。

实施例5：基于抗人Trop2 CAR-T细胞功能分析

1.抗人Trop2 CAR-T细胞CD107a表达分析

将含不同抗体克隆的CAR-T细胞分别与靶细胞(Trop2阳性表达的人胰腺癌细胞系BxPC3)与对照靶细胞(人神经胶质细胞瘤细胞U251)按1:1的效靶比(效应细胞和靶细胞 均为3×10⁵个)混合置于37℃，5％CO₂培养箱中共孵育4小时后，流式检测CD107a占CAR-T 细胞数的比例。评价CAR-T细胞在受到靶细胞刺激后的脱颗粒反应。CD107a表达的流式分 析结果如图4所示。

2.抗人Trop2 CAR-T细胞细胞因子分泌能力检测

将含不同抗体克隆的CAR-T细胞分别与靶细胞(Trop2阳性表达的细胞系BxPC3)，对 照靶细胞(Trop2阴性表达的细胞系U251)分别均按10:1，2:1的效靶比(靶细胞为3×10⁴个)共孵育24小时后，收集其上清，利用ELISA(酶联免疫)方法检测IFN-γ和IL-2的分 泌情况。IFN-γ和IL-2检测使用爱必信试剂盒检测(Human IFN-gamma ELISA Kit，Human IL-2ELISA kit)，实验步骤依据产品说明书进行。IFN-γ分泌的检测结果如图5，图6所示。IL-2分泌的检测结果如图7，图8所示。

3.抗人Trop2 CAR-T细胞毒性实验

CAR-T杀伤毒性实验通过检测CAR-T细胞体外对靶细胞的杀伤效果来评估CAR-T细胞 的体外功能。以不同效靶比(以3×10⁴个靶细胞为基准，效靶比分别为10:1和2:1)将T细胞分别与稳定表达萤火虫荧光素酶的Trop2阳性靶细胞Bxpc3-LUC-GFP，以及对照靶细胞U251-LUC-GFP共同培养，同时设置只有靶细胞的阳性对照。37℃过夜孵育后在培养体系中加入100μl萤光素酶反应底物，检测荧光值，通过以下公式计算杀伤效率：杀伤效率＝(阳性对照孔荧光值－实验孔荧光值)/阳性对照孔荧光值)×100％。实验分组及分析结果如图9，图 10所示。

实施例6：基于不同抗人Trop2单链抗体的CAR-T细胞毒性比较

本申请人研发过程淘选得到多条抗体，除本文所述L2C8、L2C9、L3G5、K2F5四条抗体外，筛选得到的其他抗体包括L1A8、L2G1、K2G1、L1F4等。按照本文实施例3和4的 方法分别构建CAR质粒，包病毒，感染T细胞，得到八种基于不同scFv的CAR-T细胞，这 些CAR-T细胞之间仅CAR的scFv序列有所不同，如L1F4-BBz的scFv氨基酸序列为SEQ ID NO:48(重链CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO:48的第26-33、第51-60、第99-110aa 所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO:48的第178-185、第203-205、第242-252 aa所示)。

再使用安捷伦xCELLigence RTCA SP杀伤分选仪以不同效靶比(3:1，1:1和1:3)进行杀 体外杀伤BxPC3细胞实验。

(1)根据样品数，先在电阻96孔板里加入50μl靶细胞对应的培养基上机测基线。

(2)靶细胞铺板：取出电阻板于超净台先加入100μl(1×10⁴个)BxpC3靶细胞，室温静止 半小时，让细胞自然沉降至板底，上机。

(3)T细胞铺板：次日待靶细胞cell index增长至1左右暂停程序，取出电阻板，按效 靶比3:1，1:1和1:3加入100μl CAR-T细胞，同时加入对照空T细胞。各克隆的杀伤动力图如图11、12所示(绿色曲线代表培养基加靶细胞，红色曲线代表T细胞加靶细胞，最下面的曲线代表CAR-T细胞加靶细胞)。从杀伤动力学图可以看出，L2C8、L2C9、L3G5、K2F5对 靶细胞具有明显的抑制作用，且杀伤速度较快，L1A8、L2G1、K2G1、L1F4对靶细胞的抑制 作用没有L2C8、L2C9、L3G5、K2F5对靶细胞的抑制作用好。根据杀伤动力图计算得到29H， 59H的杀伤率(图13)，可见L2C8，L2C9，L3G5，K2F5在不同的效靶比时比其它克隆的杀 伤力更好。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员 来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等 同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海恒润达生生物科技股份有限公司

<120> 一种特异性结合Trop2的抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用

<130> /

<160> 48

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 1

Gly Phe Ser Val Arg Asn Asn Tyr

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 2

Val Phe Pro Gly Gly Ser Ser

1 5

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 3

Ala Arg Asp Ser Gly Ser Pro Leu Trp Arg Gly His Phe Gln Tyr

1 5 10 15

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 4

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 5

Ile Trp Ser Asp Gly Thr Tyr Thr

1 5

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 6

Ala Lys Ser Leu Thr Pro Leu Gly Gly Ser Phe Arg Ile Gly Asp

1 5 10 15

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 7

Gly Gly Ser Ile Ser Ser His Tyr

1 5

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 8

Ile His Ser Ser Gly Ile Thr

1 5

<210> 9

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 9

Ala Arg Gly Leu Arg Leu Thr Asp Asp Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 10

Gly Asp Asn Phe Ser Thr Asn Trp

1 5

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 11

Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Ser

1 5

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 12

Ala Arg Tyr Gln Gly Ser Thr Thr Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 13

Ser Ala Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp

1 5

<210> 14

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 14

Asp Asn Asn

1

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 15

Gly Thr Trp Asp Thr Ser Leu Ser Ala Trp Val

1 5 10

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 16

Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp

1 5

<210> 17

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 17

Asp Asn Thr

1

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 18

Gln Ser Tyr Asp Ser Arg Leu Asn Ala Leu Val

1 5 10

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 19

Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr

1 5

<210> 20

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 20

Asp Val Ser

1

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 21

Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Asn Thr Leu Ala

1 5 10

<210> 22

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 22

Gln Ser Ile Asn Ser Asn

1 5

<210> 23

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 23

Ala Ala Ser

1

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 24

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 25

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Arg Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Ser Val Arg Asn Asn

20 25 30

Tyr Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ile Val Phe Pro Gly Gly Ser Ser Tyr His Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Leu Ser Lys Asn Ser Val Tyr Leu

65 70 75 80

Glu Met Asn Ser Leu Arg Glu Asp Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Ser Gly Ser Pro Leu Trp Arg Gly His Phe Gln Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 26

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 26

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Met

1 5 10 15

Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ile Ile Trp Ser Asp Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Leu His

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Leu Thr Pro Leu Gly Gly Ser Phe Arg Ile Gly Asp Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 27

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 27

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Ile Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser His

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile His Ser Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Met

50 55 60

Gly Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Pro Leu

65 70 75 80

Lys Val Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Leu Arg Leu Thr Asp Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 28

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 28

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gly Asp Asn Phe Ser Thr Asn

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Ser Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Glu Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Gln Gly Ser Thr Thr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 29

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 29

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ala Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Asn Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Thr Ser

85 90 95

Leu Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 30

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 30

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asp Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Asp Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Arg

85 90 95

Leu Asn Ala Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 31

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 31

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile His Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Phe Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Asn Thr Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Asn

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

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Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

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20

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<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 34

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 35

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 36

Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

1 5 10 15

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

20 25 30

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

35 40 45

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<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

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Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

1 5 10 15

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

20 25 30

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

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Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

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Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

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Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 38

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu

20 25 30

Val Gln Arg Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Ser Val Arg Asn Asn Tyr Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Val Ala Ile Val Phe Pro Gly Gly Ser Ser Tyr His

65 70 75 80

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Leu Ser Lys

85 90 95

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100 105 110

Val Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Gly Ser Pro Leu Trp Arg Gly His

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Ala Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Ala Gln Ser Val

165 170 175

Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr

180 185 190

Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ala Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val

195 200 205

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210 215 220

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Asn Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln Thr Gly

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275 280 285

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Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu

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Cys Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

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Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

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Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

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Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

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Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

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Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

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<211> 513

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 39

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val

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Val Gln Pro Gly Met Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

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Gly Leu Glu Trp Val Gly Ile Ile Trp Ser Asp Gly Thr Tyr Thr Tyr

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115 120 125

Arg Ile Gly Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly

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Gln Ala Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Ala Gln Ser

165 170 175

Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val

180 185 190

Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp

195 200 205

Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Asp Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

225 230 235 240

Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala

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Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

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Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

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His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

325 330 335

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

340 345 350

Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

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Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

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Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

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Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

405 410 415

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

420 425 430

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

435 440 445

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Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

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Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

485 490 495

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Arg

<210> 40

<211> 509

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 40

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

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His Ala Ala Arg Pro Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

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Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Ile Cys Thr Val Ser Gly Gly

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Ser Ile Ser Ser His Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys

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Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Ala Gln Ser Ala Leu Thr

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Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser

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Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp

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Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile His Asp Val

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Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu

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Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Asn Thr Leu Ala Phe

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Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

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Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

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Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

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Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe

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Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

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Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

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Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

435 440 445

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<211> 506

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 41

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His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

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Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gly Asp

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Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Ser Arg

65 70 75 80

Tyr Ser Pro Ser Phe Glu Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser

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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Ala Gly

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Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Ala Asp Ile Gln Met Thr

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Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

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Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Asn Leu Asn Trp Tyr Gln

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Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser

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Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

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245 250 255

Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly

260 265 270

Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

275 280 285

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

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Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

305 310 315 320

Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val

325 330 335

Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val

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Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

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Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

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Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

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Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

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Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

450 455 460

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

465 470 475 480

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

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<210> 42

<211> 1536

<212> DNA

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<400> 42

atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60

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cttgaaatga acagcctgcg agaggacgac acgggtgtat atttctgtgc gcgcgatagt 360

gggagtcccc tttggcgagg ccactttcaa tactggggcc aggggaccac ggtcaccgtc 420

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ccctcagtgt ctggggcccc agggcagagg gtcaccatct cctgcactgg gagcagcgcc 600

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ctcctcattt atgacaataa taagcgaccc tcagggattc ctgaccgatt ctctggctcc 720

aactctggca cgtcggccac cctgggcatc accggactcc agactggaga cgaggccgat 780

tattactgcg gaacatggga taccagcctg agtgcttggg tgttcggcgg agggaccagg 840

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actcggggac tggactttgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 1020

ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca ggttcagtgt cgtgaagaga 1080

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caggaggaag atggatgcag ctgtagattc cctgaagagg aggaaggagg ctgtgagctg 1200

agagtgaagt tctcccgaag cgcagatgcc ccagcctatc agcagggaca gaatcagctg 1260

tacaacgagc tgaacctggg aagacgggag gaatacgatg tgctggacaa aaggcggggc 1320

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gagctgcaga aagacaagat ggctgaggcc tactcagaaa tcgggatgaa gggcgaaaga 1440

aggagaggaa aaggccacga cggactgtac caggggctga gtacagcaac aaaagacacc 1500

tatgacgctc tgcacatgca ggctctgcca ccaaga 1536

<210> 43

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 43

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cctgaggtgc agctgttgga gtctggggga ggcgtggtcc agcctgggat gtccctgaga 120

gtctcctgtg cagcgtctgg attcaccttc agtaactatg gcatgcactg ggtccgccag 180

gctccaggca agggactgga gtgggtggga attatatggt ctgatggaac ttatacatat 240

tacggagact ccgtgcaggg ccgattcacc atctccagag acaactccga gaacaccctg 300

catctgcaaa tgaatagcct gagagccgag gacacggctg tgtattactg tgcgaaatcc 360

ctgacccccc ttggggggag cttccgtatt ggcgactggg gccagggaac cctggtcacc 420

gtctcctcag gccaggccgg cccgggaggt ggtggctctg gaggtggtgg ctctggaggt 480

ggcggttctg gaggtggcgg ttctggaggt ggcgctagcg ctcagtctgt gttgacgcag 540

ccgccctcag tgtctggggc cccagggcag agggtcacca tctcctgcac tgggagcagc 600

tccaacatcg gggcaggtta tgatgtacac tggtaccagc agcttccagg gacagccccc 660

aaactcctca tctatgataa caccaatcgg ccctcagggg tccctgaccg attctctggc 720

tccaagtctg gcacctcagc ctccctggcc atcactgggc tccaggctga cgatgagggt 780

gattattact gccagtccta cgacagcaga ctgaatgctt tggtattcgg cggagggacc 840

aagctgaccg tcctaactac aactccagca cccagacccc ctacacctgc tccaactatc 900

gcaagtcagc ccctgtcact gcgccctgaa gcctgtcgcc ctgctgccgg gggagctgtg 960

catactcggg gactggactt tgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 1020

tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaggttcag tgtcgtgaag 1080

agaggccgga agaagctgct gtacatcttc aagcagcctt tcatgaggcc cgtgcagact 1140

acccaggagg aagatggatg cagctgtaga ttccctgaag aggaggaagg aggctgtgag 1200

ctgagagtga agttctcccg aagcgcagat gccccagcct atcagcaggg acagaatcag 1260

ctgtacaacg agctgaacct gggaagacgg gaggaatacg atgtgctgga caaaaggcgg 1320

ggcagagatc ctgagatggg cggcaaacca agacggaaga acccccagga aggtctgtat 1380

aatgagctgc agaaagacaa gatggctgag gcctactcag aaatcgggat gaagggcgaa 1440

agaaggagag gaaaaggcca cgacggactg taccaggggc tgagtacagc aacaaaagac 1500

acctatgacg ctctgcacat gcaggctctg ccaccaaga 1539

<210> 44

<211> 1527

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 44

atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60

cctcagctgc agctgcagga gtcgggccca ggactgctga agccttcgga gaccctgtcc 120

ctcatttgca ctgtctctgg tggctccatc agtagtcact actggagttg gatccggcag 180

accccaggga agggactgga gtggattggg tggatccatt ccagtgggat caccaactac 240

aacccctccc tcatgggtcg agtcaccatg tcagtggaca cgtccaagaa ccagttcccc 300

ctgaaggtga actctgtgac cgctgcggac acggccgtct attactgtgc gagaggtctg 360

agactaactg atgatgcttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcctca 420

ggccaggccg gcccgggagg tggtggctct ggaggtggtg gctctggagg tggcggttct 480

ggaggtggcg gttctggagg tggcgctagc gctcagtctg ccctgactca gcctgcctcc 540

gtgtctgggt ctcctggaca gtcgatcacc atctcctgca ctggaaccag cagtgacgtt 600

ggtggttata actatgtctc ctggtaccaa caacacccag gcaaagcccc caaactcatg 660

attcatgatg tcagtaatcg gccctcaggg gtttctaatc gcttctttgg ctccaagtct 720

ggcaacacgg cctccctgac catctctggg ctccaggctg aggacgaggc tgattattac 780

tgcagctcat atacaagcag caacactctc gcgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc 840

ctaactacaa ctccagcacc cagaccccct acacctgctc caactatcgc aagtcagccc 900

ctgtcactgc gccctgaagc ctgtcgccct gctgccgggg gagctgtgca tactcgggga 960

ctggactttg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 1020

ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aggttcagtg tcgtgaagag aggccggaag 1080

aagctgctgt acatcttcaa gcagcctttc atgaggcccg tgcagactac ccaggaggaa 1140

gatggatgca gctgtagatt ccctgaagag gaggaaggag gctgtgagct gagagtgaag 1200

ttctcccgaa gcgcagatgc cccagcctat cagcagggac agaatcagct gtacaacgag 1260

ctgaacctgg gaagacggga ggaatacgat gtgctggaca aaaggcgggg cagagatcct 1320

gagatgggcg gcaaaccaag acggaagaac ccccaggaag gtctgtataa tgagctgcag 1380

aaagacaaga tggctgaggc ctactcagaa atcgggatga agggcgaaag aaggagagga 1440

aaaggccacg acggactgta ccaggggctg agtacagcaa caaaagacac ctatgacgct 1500

ctgcacatgc aggctctgcc accaaga 1527

<210> 45

<211> 1518

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 45

atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60

cctcaggtcc agctggtgca gtctggagca gaggtgaaaa agcccgggga gtctctgacg 120

atctcctgta agagttctgg agacaacttt agcacgaact ggatcggctg ggtgcgccag 180

atgcccggga aaggcctgga gtggatgggg atcatctatc ctggtgactc tgatagcaga 240

tacagtccgt ccttcgaagg ccaggtcacc atctcagccg acaagtccat cagcaccgcc 300

tacctgcagt ggagcagcct gaaggcctcg gacaccgcca tgtattactg tgcgagatat 360

caagggtcta ccaccccctt tgactactgg ggccagggaa ccacggtcac cgtctcctca 420

ggccaggccg gcccgggagg tggtggctct ggaggtggtg gctctggagg tggcggttct 480

ggaggtggcg gttctggagg tggcgctagc gctgacatcc agatgaccca gtctccatcc 540

tccctgtctg catctgtagg agacagagtc accatcactt gccgggcaag tcagagcatt 600

aacagtaatt taaattggta tcagcagaaa ccagggaaag cccctaagct cctgatctat 660

gctgcatcca gtttgcaaag tggggtccca tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca 720

gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa cctgaagatt ttgcaactta ctactgtcaa 780

cagagttaca gtaccccgct cactttcggc ggagggacca aggtggagat caaaactaca 840

actccagcac ccagaccccc tacacctgct ccaactatcg caagtcagcc cctgtcactg 900

cgccctgaag cctgtcgccc tgctgccggg ggagctgtgc atactcgggg actggacttt 960

gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca 1020

ctggttatca ccctttactg caggttcagt gtcgtgaaga gaggccggaa gaagctgctg 1080

tacatcttca agcagccttt catgaggccc gtgcagacta cccaggagga agatggatgc 1140

agctgtagat tccctgaaga ggaggaagga ggctgtgagc tgagagtgaa gttctcccga 1200

agcgcagatg ccccagccta tcagcaggga cagaatcagc tgtacaacga gctgaacctg 1260

ggaagacggg aggaatacga tgtgctggac aaaaggcggg gcagagatcc tgagatgggc 1320

ggcaaaccaa gacggaagaa cccccaggaa ggtctgtata atgagctgca gaaagacaag 1380

atggctgagg cctactcaga aatcgggatg aagggcgaaa gaaggagagg aaaaggccac 1440

gacggactgt accaggggct gagtacagca acaaaagaca cctatgacgc tctgcacatg 1500

caggctctgc caccaaga 1518

<210> 46

<211> 271

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 46

His Thr Ala Ala Gln Asp Asn Cys Thr Cys Pro Thr Asn Lys Met Thr

1 5 10 15

Val Cys Ser Pro Asp Gly Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Arg Ala Leu

20 25 30

Gly Ser Gly Met Ala Val Asp Cys Ser Thr Leu Thr Ser Lys Cys Leu

35 40 45

Leu Leu Lys Ala Arg Met Ser Ala Pro Lys Asn Ala Arg Thr Leu Val

50 55 60

Arg Pro Ser Glu His Ala Leu Val Asp Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro

65 70 75 80

Asp Cys Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn Gln Thr

85 90 95

Ser Val Cys Trp Cys Val Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys

100 105 110

Gly Asp Leu Ser Leu Arg Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile

115 120 125

Leu Ile Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala Gly Ala Phe Asn His Ser

130 135 140

Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu

145 150 155 160

His Pro Lys Phe Val Ala Ala Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln

165 170 175

Ile Glu Leu Arg Gln Asn Thr Ser Gln Lys Ala Ala Gly Asp Val Asp

180 185 190

Ile Gly Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Glu Arg Asp Ile Lys Gly Glu Ser

195 200 205

Leu Phe Gln Gly Arg Gly Gly Leu Asp Leu Arg Val Arg Gly Glu Pro

210 215 220

Leu Gln Val Glu Arg Thr Leu Ile Tyr Tyr Leu Asp Glu Ile Pro Pro

225 230 235 240

Lys Phe Ser Met Lys Arg Leu Thr Ala Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe

245 250 255

Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His His His His His His

260 265 270

<210> 47

<211> 813

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 47

cacaccgccg cccaggacaa ctgcacctgc cccaccaaca agatgaccgt gtgcagcccc 60

gacggccccg gcggccgctg ccagtgccgc gccctgggca gcggcatggc cgtggactgc 120

agcaccctga ccagcaagtg cctgctgctg aaggcccgca tgagcgcccc caagaacgcc 180

cgcaccctgg tgcgccccag cgagcacgcc ctggtggaca acgacggcct gtacgacccc 240

gactgcgacc ccgagggccg cttcaaggcc cgccagtgca accagaccag cgtgtgctgg 300

tgcgtgaaca gcgtgggcgt gcgccgcacc gacaagggcg acctgagcct gcgctgcgac 360

gagctggtgc gcacccacca catcctgatc gacctgcgcc accgccccac cgccggcgcc 420

ttcaaccaca gcgacctgga cgccgagctg cgccgcctgt tccgcgagcg ctaccgcctg 480

caccccaagt tcgtggccgc cgtgcactac gagcagccca ccatccagat cgagctgcgc 540

cagaacacca gccagaaggc cgccggcgac gtggacatcg gcgacgccgc ctactacttc 600

gagcgcgaca tcaagggcga gagcctgttc cagggccgcg gcggcctgga cctgcgcgtg 660

cgcggcgagc ccctgcaggt ggagcgcacc ctgatctact acctggacga gatccccccc 720

aagttcagca tgaagcgcct gaccgctagc ggtctgaacg acatcttcga ggctcagaaa 780

atcgaatggc acgaacatca tcaccatcac cat 813

<210> 48

<211> 265

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical sequence)

<400> 48

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Trp Gly Ser Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Ala Gly Pro Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Ala Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro

145 150 155 160

Ser Leu Ser Ala Ala Pro Gly Gln Ala Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly

165 170 175

Ser Asn Ser Asn Ile Gly Gly Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Leu His Leu

180 185 190

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Asp Asp Asn Glu Arg Pro

195 200 205

Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala

210 215 220

Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Phe

225 230 235 240

Cys Gly Ala Trp Asp Arg Thr Leu Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly

245 250 255

Thr Lys Gly Asp Arg Pro Ser Gln Ala

260 265

Claims (10)

1.一种Trop2结合分子，其特征在于，其包含抗Trop2抗体或其抗原结合片段，所述Trop2结合分子包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:1-12任一所示的重链互补决定区HCDR，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:13-24任一所示的轻链互补决定区LCDR，

优选地，所述重链可变区的CDR序列和轻链可变区的CDR序列选自以下任一项：

(1)序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR2、序列如SEQ IDNO:3所示的HCDR3以及序列如SEQ ID NO:13所示的LCDR1、序列如SEQ ID NO:14所示的LCDR2、序列如SEQ ID NO:15所示的LCDR3；

(2)序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR1、序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR2、序列如SEQ IDNO:6所示的HCDR3以及序列如SEQ ID NO:16所示的LCDR1、序列如SEQ ID NO:17所示的LCDR2、序列如SEQ ID NO:18所示的LCDR3；

(3)序列如SEQ ID NO:7所示的HCDR1、序列如SEQ ID NO:8所示的HCDR2、序列如SEQ IDNO:9所示的HCDR3以及序列如SEQ ID NO:19所示的LCDR1、序列如SEQ ID NO:20所示的LCDR2、序列如SEQ ID NO:21所示的LCDR3；

(4)序列如SEQ ID NO:10所示的HCDR1、序列如SEQ ID NO:11所示的HCDR2、序列如SEQID NO:12所示的HCDR3以及序列如SEQ ID NO:22所示的LCDR1、序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR2、序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR3，

优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25-28中的任意一种所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29-32中的任意一种所示，

优选地，所述重链可变区和轻链可变区的序列选自以下任一项：

(1)当所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示时，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示；

(2)当所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示时，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示；

(3)当所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示时，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示；

(4)当所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示时，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，

优选地，所述抗体为单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体中的至少一种，所述抗原结合片段为Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fd、单链抗体scFv、二硫键连接的Fv(sdFv)、或单域抗体中的至少一种。

2.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含任选的信号肽、权利要求1所述的Trop2结合分子、铰链区、跨膜区和胞内区，

优选地，胞内区包括信号传导区和/或共刺激信号传导区，

优选地，从N端到C端，该嵌合抗原受体依次含有信号肽、权利要求1所述的Trop2结合分子、铰链区、跨膜区、胞内共刺激域和胞内信号域。

3.一种核酸分子，其特征在于，其具有选自以下任一项的序列：

(1)权利要求1所述Trop2结合分子或权利要求2所述的嵌合抗原受体的编码序列；

(2)(1)的互补序列；

(3)(1)或(2)中任一序列的5-50bp的片段，

优选地，所述片段是引物。

4.一种核酸构建物，其特征在于，其包含权利要求3所述的核酸分子，

优选地，所述核酸构建物是克隆载体、表达载体或整合载体。

5.一种宿主细胞，其特征在于，选自：

(1)表达和/或分泌权利要求1所述Trop2结合分子或权利要求2所述的嵌合抗原受体；

(2)包含权利要求3所述的核酸分子；和/或

(3)包含权利要求4所述的核酸构建物，

优选地，所述宿主细胞是免疫效应细胞，更优选T细胞。

6.一种产生权利要求1所述的Trop2结合分子或权利要求2所述的嵌合抗原受体的方法，包括：在适合产生Trop2结合分子的条件下培养权利要求5所述的宿主细胞，和任选的从培养物中纯化所述Trop2结合分子或嵌合抗原受体的步骤。

7.一种药物组合物，包含权利要求1所述的Trop2结合分子、权利要求2所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的核酸构建物或权利要求5所述的宿主细胞，和药学上可接受的辅料。

8.权利要求1所述的Trop2结合分子、权利要求2所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的核酸构建物或权利要求5所述的宿主细胞在制备活化的免疫细胞中的用途，或在制备用于预防或治疗Trop2表达相关的疾病或病况的药物中的用途，

优选地，所述疾病或病况选自以下的一种或多种：乳腺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、宫颈癌、头颈癌、肺癌、食道癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌和卵巢癌。

9.一种检测Trop2的试剂盒，所述的试剂盒包含权利要求1所述的Trop2结合分子、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的核酸构建物或权利要求5所述的宿主细胞，

优选地，所述试剂盒还包括用于检测Trop2与所述Trop2结合分子的结合的试剂；更优选地，所述检测结合的试剂是能与Trop2结合分子连接的可检测标记物。

10.权利要求1所述Trop2结合分子在制备用于检测样品中Trop2、评估药物治疗效果或诊断癌症的试剂盒中的用途。