CN116529264A - 抗claudin 18.2多特异性抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本公开总体涉及免疫球蛋白相关组合物(例如,多特异性抗体或其抗原结合片段),这些组合物可结合到Claudin 18.2蛋白质。本技术的多特异性抗体可用于检测和治疗有需要的受试者中的Claudin 18.2相关癌症的方法中。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年8月6日提交的美国临时申请63/061,895、于2020年9月4日提交的美国临时申请63/074,582和于2021年2月2日提交的美国临时申请63/144,657的权益和优先权,这些申请的公开内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本技术总体涉及特异性结合Claudin 18.2蛋白质的免疫球蛋白相关组合物(例如,多特异性抗体或其抗原结合片段)的制备及其用途。特别地,本技术涉及Claudin 18.2结合多特异性抗体的制备及其在检测和治疗癌症中的用途。
背景技术
以下对本技术背景的描述仅简单地作为理解本技术的辅助而提供,并不承认描述或构成本技术的现有技术。
Claudin是形成紧密连接的整合膜蛋白。紧密连接充当防止溶质和水自由通过上皮或内皮细胞层之间的细胞间隙的物理屏障(Markov,A.G.等人,IUBMB Life,第67卷:第29-35页(2015年);Furuse,M.等人,J Cell Biol,第141卷:第1539-1550页(1998年);Nitta,T.等人,J Cell Biol,第161卷:第653-660页(2003年);Deli,M.A.,BiochimBiophys Acta,第1788卷:第892-910页(2009年))。此外,紧密连接在维持细胞极性和信号传导中也起着关键作用。上皮细胞极性的破坏是恶性转化的早期事件(Martin,T.A.和Jiang,W.G.,Biochim Biophys Acta,第1788卷:第872-891页(2009年))。Claudin 18.2在很大一部分的原发性胃癌及其转移癌中含量丰富,并在其恶性转化中发挥重要作用。例如,在胰腺、食管、卵巢和肺肿瘤中发现了claudin 18.2的频繁异位激活(Niimi等人(2001年),Mol Cell Biol,第21卷第21期:第7380-7390页;Tanaka等人(2011年),J HistochemCytochem,第59卷第10期:第942-952页;Micke等人(2014年),Int J Cancer,第135卷第9期:第2206-2214页;Shimobaba等人(2016年),Biochim Biophys Acta,第1863卷(第6期A专辑):第1170-1178页;Singh等人(2017年),J Hematol Oncol,第10卷第1期:第105页;Tokumitsu等人(2017年),Cytopathology,第28卷第2期:第116-121页)。
因此,迫切需要有效治疗Claudin 18.2相关恶性肿瘤的新型抗Claudin18.2免疫球蛋白相关组合物。
发明内容
在一个方面,本公开提供了多特异性(例如,双特异性)抗体或其抗原结合片段,该抗体或其抗原结合片段包含结合Claudin 18.2表位的第一抗原结合部分和结合到第二表位的至少第二抗原结合部分,其中第一抗原结合部分包含第一重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和第一轻链免疫球蛋白可变结构域(VL),其中第二抗原结合部分包含第二VH和第二VL,并且其中(a)第一VH包含选自SEQ ID NO:6、12、18、24和30的VH-CDR1序列;选自SEQ ID NO:7、13、19、25和31的VH-CDR2序列;以及选自SEQ ID NO:8、14、20、26和32的VH-CDR3序列,并且/或者(b)第一VL包含选自SEQ ID NO:9、15、21、27和33的VL-CDR1序列;选自SEQ ID NO:10、16、22、28、34、155和156的VL-CDR2序列;以及选自SEQ ID NO:11、17、23、29和35的VL-CDR3序列。
在一个方面,本公开提供了多特异性(例如,双特异性)抗体或其抗原结合片段,该抗体或其抗原结合片段包含结合claudin 18.2表位的第一抗原结合部分和结合到第二表位的至少第二抗原结合部分,其中第一抗原结合部分包含第一重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和第一轻链免疫球蛋白可变结构域(VL),其中第二抗原结合部分包含第二VH和第二VL,并且其中(a)第一VH包含SEQ ID NO:6的VH-CDR1序列、SEQ ID NO:7的VH-CDR2序列和SEQ IDNO:8的VH-CDR3序列,并且/或者第一VL包含SEQ ID NO:9的VL-CDR1序列、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:155的VL-CDR2序列和SEQ ID NO:11的VL-CDR3序列;(b)第一VH包含SEQ ID NO:12的VH-CDR1序列、SEQ ID NO:13的VH-CDR2序列和SEQ ID NO:14的VH-CDR3序列,并且/或者第一VL包含SEQ ID NO:15的VL-CDR1序列、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:156的VL-CDR2序列和SEQ ID NO:17的VL-CDR3序列;(c)第一VH包含SEQ ID NO:18的VH-CDR1序列、SEQ ID NO:19的VH-CDR2序列和SEQ ID NO:20的VH-CDR3序列,并且/或者第一VL包含SEQ ID NO:21的VL-CDR1序列、SEQ ID NO:22的VL-CDR2序列和SEQ ID NO:23的VL-CDR3序列;(d)第一VH包含SEQID NO:24的VH-CDR1序列、SEQ ID NO:25的VH-CDR2序列和SEQ ID NO:26的VH-CDR3序列,并且/或者第一VL包含SEQ ID NO:27的VL-CDR1序列、SEQ ID NO:28的VL-CDR2序列和SEQ IDNO:29的VL-CDR3序列;或者(e)第一VH包含SEQ ID NO:30的VH-CDR1序列、SEQ ID NO:31的VH-CDR2序列和SEQ ID NO:32的VH-CDR3序列,并且/或者第一VL包含SEQ ID NO:33的VL-CDR1序列、SEQ ID NO:34的VL-CDR2序列和SEQ ID NO:35的VL-CDR3序列。
在一个方面,本公开提供了多特异性(例如,双特异性)抗体或其抗原结合片段,该抗体或其抗原结合片段包含结合claudin 18.2表位的第一抗原结合部分和结合到第二表位的至少第二抗原结合部分,其中第一抗原结合部分包含第一重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和第一轻链免疫球蛋白可变结构域(VL),其中第二抗原结合部分包含第二VH和第二VL,并且其中第一VH包含选自SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46-49或54-57中任一者的氨基酸序列;并且/或者(b)第一VL包含选自SEQ ID NO:37、39、41、43、45、50-53或58-61中任一者的氨基酸序列。
除此之外或另选地,在本文公开的多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段的一些实施方案中,第二VH包含选自SEQ ID NO:97、99、100、101、102或157中任一者的氨基酸序列;并且/或者(b)第二VL包含选自SEQ ID NO:98、103或158中任一者的氨基酸序列。
在本文公开的多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段的任何和所有实施方案中,多特异性(例如,双特异性)抗原结合片段可选自Fab、F(ab')2、Fab'、scFv和Fv。
除此之外或另选地,在一些实施方案中,多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段还包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE的同种型的Fc结构域。在某些实施方案中,多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段包含IgG1恒定区,该恒定区包含选自N297A、K322A、L234A和L235A的一个或多个氨基酸取代。在其他实施方案中,多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段包含IgG4恒定区,该恒定区包含S228P突变。
在另一个方面,本公开提供了多特异性(例如,双特异性)抗体,该抗体包含结合Claudin 18.2表位的第一抗原结合部分和结合到第二表位的第二抗原结合部分,其中第一抗原结合部分包含第一重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和第一轻链免疫球蛋白可变结构域(VL),其中第二抗原结合部分包含第二VH和第二VL,并且其中(a)第一VL序列与SEQ IDNO:37、39、41、43、45、50-53或58-61中任一者的轻链免疫球蛋白可变结构域序列具有至少95%同一性;并且/或者(b)第一VH序列与SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46-49或54-57中任一者的重链免疫球蛋白可变结构域序列具有至少95%同一性。除此之外或另选地,在一些实施方案中,第二VH包含选自SEQ ID NO:97、99、100、101、102或157中任一者的氨基酸序列;并且/或者(b)第二VL包含选自SEQ ID NO:98、103或158中任一者的氨基酸序列。
在一个方面,本公开提供了多特异性(例如,双特异性)抗体,该抗体包含结合Claudin 18.2表位的第一抗原结合部分和结合到第二表位的第二抗原结合部分,其中多特异性抗体包含重链(HC)氨基酸序列或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体以及/或者轻链(LC)氨基酸序列或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体,该重链氨基酸序列包括SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ IDNO:95、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161,该轻链氨基酸序列包括SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:160、SEQID NO:162。在一些实施方案中,多特异性(例如,双特异性)抗体包含分别选自EQ ID NO:62和SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:68和SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84、SEQID NO:85和SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95和SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:160以及SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:162的HC氨基酸序列和LC氨基酸序列。在另一个方面,本公开提供了多特异性(例如,双特异性)抗体,该多特异性抗体包含结合Claudin 18.2表位的第一抗原结合部分和结合到第二表位的第二抗原结合部分,其中多特异性抗体包含:(a)与存在于SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ IDNO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:160或SEQ ID NO:162中的LC序列具有至少95%同一性的LC序列;以及/或者(b)与存在于SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ IDNO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:159或SEQID NO:161中的HC序列具有至少95%同一性的HC序列。除此之外或另选地,在一些实施方案中,免疫球蛋白相关组合物含有IgG4恒定区,该恒定区包含S228P突变。在某些实施方案中,多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段包含IgG1恒定区,该恒定区包含选自N297A、K322A、L234A和L235A的一个或多个氨基酸取代。
在本文公开的多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段的任何和所有实施方案中,多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段结合到CLDN18.2多肽,该多肽包含胞外环1(EL1)序列。胞外环1(EL1)序列可包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列,或者CLDN18.2多肽可包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。除此之外或另选地,在一些实施方案中,本技术的多特异性(例如,双特异性)抗体是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体,并且/或者缺乏α-1,6-岩藻糖修饰。
在一个方面,本公开提供了多特异性(例如,双特异性)抗体,该多特异性抗体包含第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链,其中第一多肽链和第二多肽链彼此共价键合,第二多肽链和第三多肽链彼此共价键合,并且第三多肽链和第四多肽链彼此共价键合,并且其中:(a)第一多肽链和第四多肽链中的每一者在N-末端至C-末端方向上包含:(i)能够特异性结合到第一表位的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域;(ii)第一免疫球蛋白的轻链恒定结构域;(iii)包含氨基酸序列(GGGGS)3的柔性肽接头;和(iv)连接到第二免疫球蛋白的互补重链可变结构域的第二免疫球蛋白的轻链可变结构域,或连接到第二免疫球蛋白的互补轻链可变结构域的第二免疫球蛋白的重链可变结构域,其中第二免疫球蛋白的轻链可变结构域和重链可变结构域能够特异性结合到第二表位,并通过包含氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽接头连接在一起以形成单链可变片段;并且(b)第二多肽链和第三多肽链中的每一者在N-末端至C-末端方向上包含:(i)能够特异性结合到第一表位的第一免疫球蛋白的重链可变结构域;和(ii)第一免疫球蛋白的重链恒定结构域;并且其中第一免疫球蛋白的重链可变结构域或第二免疫球蛋白的重链可变结构域选自SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46-49或54-57中的任一者,并且/或者第一免疫球蛋白的轻链可变结构域或第二免疫球蛋白的轻链可变结构域选自SEQ ID NO:37、39、41、43、45、50-53或58-61中的任一者。
除此之外或另选地,在一些实施方案中,第一免疫球蛋白的重链可变结构域选自SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46-49或54-57中的任一者,第一免疫球蛋白的轻链可变结构域选自SEQ ID NO:37、39、41、43、45、50-53或58-61中的任一者,第二免疫球蛋白的重链可变结构域选自SEQ ID NO:97、99、100、101、102或157中的任一者,并且第二免疫球蛋白的轻链可变结构域选自SEQ ID NO:98、103或158中的任一者。
在其他实施方案中,第一免疫球蛋白的重链可变结构域选自SEQ ID NO:97、99、100、101、102或157中的任一者,第一免疫球蛋白的轻链可变结构域选自SEQ ID NO:98、103或158中的任一者,第二免疫球蛋白的重链可变结构域选自SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46-49或54-57中的任一者,并且第二免疫球蛋白的轻链可变结构域选自SEQ ID NO:37、39、41、43、45、50-53或58-61中的任一者。
除此之外或另选地,在一些实施方案中,本技术的多特异性抗体或抗原结合片段也结合到T细胞和/或CD3。在一个方面,本公开提供了T细胞,该细胞离体装配有也结合到T细胞和/或CD3的本技术的多特异性抗体或抗原结合片段。在另一个方面,本公开提供了制备治疗性T细胞的离体方法,该方法包括用能够结合到T细胞和/或CD3的本技术的多特异性抗体或抗原结合片段离体装配T细胞,其中T细胞任选地为人T细胞,并且其中结合是非共价键合。在另一个方面,本公开提供了用于治疗有需要的受试者的癌症的方法,该方法包括向受试者施用有效量的T细胞,该细胞离体装配有也结合到T细胞和/或CD3的本技术的多特异性抗体或抗原结合片段。
在一个方面,本公开提供了编码本文所述的多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段中的任何多特异性抗体或抗原结合片段的重组核酸序列。在另一个方面,本公开提供了宿主细胞或载体,该宿主细胞或载体包含本文公开的重组核酸序列中的任何重组核酸序列。
在又一个方面,本公开提供了药物组合物,该药物组合物包含本文所述的多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段中的任何多特异性抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体,其中抗体或抗原结合片段任选地与选自以下的药剂缀合:同位素、染料、色原(chromagen)、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或它们的任何组合。在一些实施方案中,药物组合物还包含选自以下的药剂:同位素、染料、色原、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或它们的任何组合。
除此之外或另选地,在一些实施方案中,本技术的多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段结合到T细胞、B细胞、骨髓细胞、浆细胞或肥大细胞。除此之外或另选地,在一些实施方案中,多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段的第二抗原结合部分结合到CD3、CD4、CD8、CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、CD22、CD14、CD15、CD16、CD123、TCRγ/δ、NKp46、KIR或小分子DOTA半抗原。小分子DOTA半抗原可选自DOTA、DOTA-Bn、DOTA-去铁胺、DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2、Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2、DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2;DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2、Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2、Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2、Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2、Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2、DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2、(Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2、Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、(Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2、Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2、Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2和Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2。
在一个方面,本公开提供了用于治疗有需要的受试者的癌症的方法,该方法包括向受试者施用有效量的本文所述的多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段中的任何多特异性抗体或抗原结合片段或者本文公开的药物组合物中的任何药物组合物,其中多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段特异性结合到CLDN18.2。在一些实施方案中,癌症是实体瘤。癌症的示例包括但不限于胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌。在该方法的一些实施方案中,将多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段与另外的治疗剂分开、依次或同时施用于受试者。另外的治疗剂的示例包括以下治疗剂中的一者或多者:烷化剂、铂剂、紫杉烷、长春花剂、抗雌激素药物、芳香酶抑制剂、卵巢抑制剂、VEGF/VEGFR抑制剂、EGF/EGFR抑制剂、PARP抑制剂、细胞生长抑制生物碱、细胞毒素抗生素、抗代谢药、内分泌/激素药剂、双膦酸盐治疗剂、T细胞和免疫调节/刺激抗体(例如,抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM3抗体、抗4-1BB抗体、抗CD73抗体、抗GITR抗体或抗LAG-3抗体)。
在另一个方面,本公开提供了用于体内检测受试者的癌症的方法,该方法包括(a)向受试者施用有效量的本技术的多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段,其中多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段被配置成定位于表达CLDN18.2的癌细胞并用放射性同位素标记;以及(b)通过检测由多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段发射的高于参考值的放射性水平来检测受试者中肿瘤的存在。在某些实施方案中,癌症是实体瘤。在一些实施方案中,受试者被诊断患有或疑似患有癌症(例如,胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌)。可使用正电子发射断层扫描或单光子发射计算机断层扫描来检测由多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段发射的放射性水平。除此之外或另选地,在一些实施方案中,该方法还包括向受试者施用有效量的免疫缀合物,该免疫缀合物包含缀合到放射性核素的本技术的多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段。
在本文公开的方法的任何和所有实施方案中,受试者是人。
在另一个方面,本公开提供了用于检测生物样品中CLDN18.2蛋白质表达水平的方法,该方法包括使生物样品与本文公开的多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段接触,并且检测与生物样品中CLDN18.2蛋白质的结合。
本文还公开了用于检测和/或治疗CLDN18.2相关癌症的试剂盒,该试剂盒包括本技术的至少一种免疫球蛋白相关组合物(例如,本文所述的任何多特异性(例如,双特异性)抗体或抗原结合片段)或其功能变体(例如,取代变体)和使用说明。在某些实施方案中,免疫球蛋白相关组合物与一种或多种可检测标记偶联。在一个实施方案中,所述一种或多种可检测标记包括放射性标记、荧光标记或显色标记。除此之外或另选地,在一些实施方案中,试剂盒还包括特异性结合到本文所述的抗CLDN18.2免疫球蛋白相关组合物的二抗。在一些实施方案中,二抗与选自放射性标记、荧光标记或显色标记的至少一种可检测标记偶联。
在一个方面,本公开提供了抗CD3抗体或其抗原结合片段,该抗体或其抗原结合片段包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL),其中:(a)VH包含SEQ ID NO:99-102或SEQ ID NO:157中任一者的氨基酸序列;并且/或者(b)VL包含SEQID NO:103或SEQ ID NO:158的氨基酸序列。在一些实施方案中,抗CD3抗体或抗原结合片段包含分别选自SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:103;以及SEQ ID NO:157和SEQ ID NO:158的重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)氨基酸序列。除此之外或另选地,在一些实施方案中,抗CD3抗体或抗原结合片段是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。抗原结合片段可选自Fab、F(ab')2、Fab'、scFv和Fv。
除此之外或另选地,在某些实施方案中,抗CD3抗体或抗原结合片段还包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE的同种型的Fc结构域。在一些实施方案中,抗CD3抗体还包含IgG1恒定区,该恒定区包含选自N297A、L234A、L235A和K322A的一个或多个氨基酸取代。在其他实施方案中,抗CD3抗体包含IgG4恒定区,该恒定区包含S228P突变。除此之外或另选地,在一些实施方案中,抗CD3抗体缺乏α-1,6-岩藻糖修饰。
在一个方面,本公开提供了多特异性抗体,该多特异性抗体包含第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链,其中第一多肽链和第二多肽链彼此共价键合,第二多肽链和第三多肽链彼此共价键合,并且第三多肽链和第四多肽链彼此共价键合,并且其中:(a)第一多肽链和第四多肽链中的每一者在N-末端至C-末端方向上包含:(i)能够特异性结合到第一表位的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域;(ii)第一免疫球蛋白的轻链恒定结构域;(iii)包含氨基酸序列(GGGGS)3的柔性肽接头;和(iv)连接到第二免疫球蛋白的互补重链可变结构域的第二免疫球蛋白的轻链可变结构域,或连接到第二免疫球蛋白的互补轻链可变结构域的第二免疫球蛋白的重链可变结构域,其中第二免疫球蛋白的轻链可变结构域和重链可变结构域能够特异性结合到第二表位,并通过包含氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽接头连接在一起以形成单链可变片段;并且(b)第二多肽链和第三多肽链中的每一者在N-末端至C-末端方向上包含:(i)能够特异性结合到第一表位的第一免疫球蛋白的重链可变结构域;和(ii)第一免疫球蛋白的重链恒定结构域;并且其中第一免疫球蛋白的重链可变结构域或第二免疫球蛋白的重链可变结构域包含SEQ ID NO:99-102或SEQ ID NO:157中的任一者,并且/或者第一免疫球蛋白的轻链可变结构域或第二免疫球蛋白的轻链可变结构域包含SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:158。
除此之外或另选地,在一些实施方案中,抗CD3多特异性抗体或抗原结合片段结合到T细胞、B细胞、骨髓细胞、浆细胞或肥大细胞。除此之外或另选地,在某些实施方案中,抗CD3多特异性抗体或抗原结合片段结合到CD3、GPA33、HER2/neu、GD2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、MUM-1、CDK4、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、p15、gp75、β-连环蛋白、ErbB2、癌抗原125(CA-125)、癌胚抗原(CEA)、RAGE、MART(黑色素瘤抗原)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、酪氨酸酶、Pmel 17(gp100)、GnT-V内含子V序列(N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V内含子V序列)、前列腺癌psm、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、EBNA(EB病毒核抗原)1-6、LMP2、p53、肺抗性蛋白质(LRP)、Bcl-2、前列腺特异性抗原(PSA)、Ki-67、CEACAM6、结肠特异性抗原-p(CSAp)、HLA-DR、CD40、CD74、CD138、EGFR、EGP-1、EGP-2、VEGF、PlGF、胰岛素样生长因子(ILGF)、腱生蛋白、血小板衍生生长因子、IL-6、CD20、CD19、PSMA、CD33、CD123、MET、DLL4、Ang-2、HER3、IGF-1R、CD30、TAG-72、SPEAP、CD45、L1-CAM、Lewis Y(Ley)抗原、E-钙粘蛋白、V-钙粘蛋白、GPC3、EpCAM、CD4、CD8、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、CD22、CD14、CD15、CD16、CD123、TCRγ/δ、NKp46、KIR、CD56、DLL3、PD-1、PD-L1、CD28、CD137、CD99、GloboH、CD24、STEAP1、B7H3、聚唾液酸、OX40、OX40-配体、肽MHC复合物(其中肽源自TP53、KRAS、MYC、EBNA1-6、PRAME、MART、酪氨酸酶、MAGEA1-A6、pmel17、LMP2或WT1)或小分子DOTA半抗原。
在另一个方面,本公开提供了组合物,该组合物包含本文公开的抗CD3抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体的任何和所有实施方案,其中抗体或抗原结合片段任选地与选自以下的药剂缀合:同位素、染料、色原(chromagen)、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或它们的任何组合。
在又一个方面,本公开提供了用于治疗有需要的受试者的癌症的方法,该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的抗CD3抗体或抗原结合片段的任何和所有实施方案。在另一个方面,本公开提供了用于治疗有需要的受试者的癌症的方法,该方法包括向受试者施用有效量的组合物,该组合物包含本文公开的抗CD3抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体的任何和所有实施方案,其中抗体或抗原结合片段任选地与选自以下的药剂缀合:同位素、染料、色原(chromagen)、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或它们的任何组合。
在一个方面,本公开提供了T细胞,该细胞离体装配有本文公开的抗CD3抗体或抗原结合片段的任何和所有实施方案。在另一个方面,本公开提供了制备治疗性T细胞的离体方法,该方法包括用本文公开的抗CD3抗体或抗原结合片段的任何和所有实施方案离体装配T细胞,其中T细胞任选地是人T细胞,并且其中结合是非共价键合。在另一个方面,本公开提供了用于治疗有需要的受试者的癌症的方法,该方法包括向受试者施用有效量的T细胞,该细胞离体装配有本文公开的抗CD3抗体或抗原结合片段的任何和所有实施方案。
附图说明
图1示出了Claudin 18.2的剪接变体和示意性蛋白质结构(改编自Markov,A.G.等人,IUBMB Life,第67卷:第29-35页(2015年))。
图2示出了hCLDN18.1-EL1(SEQ ID NO:1)、hCLDN18.2-EL1(SEQ ID NO:2)和mCLDN18.2-EL1(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列比对;以及hCLDN18.1-EL2(SEQ ID NO:3)和hCLDN18.2-EL2(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列比对。hCLDN18.2-EL1和mCLDN18.2-EL1的氨基酸序列是相同的。hCLDN18.1-EL2和hCLDN18.2-EL2的氨基酸序列是相同的。
图3示出了正常人体组织中CLDN18的RNA和蛋白质表达(改编自人类蛋白质图谱数据:www.proteinatlas.org/ENSG00000066405-CLDN18/tissue)。
图4示出了CLDN18在人癌症组织中的表达(改编自Sahin U.等人,Clin CancerRes,第14卷:第7624-7634页(2008年))。
图5示出了稳定表达人CLDN18.2的细胞系(例如,CHO、3T3和HEK293)(使用基准抗体IMAB362分析,根据来自imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/details.cgi?pdbcode=10473的序列产生)。
图6示出了病毒样颗粒(VLP),该病毒样颗粒表达人CLDN18.2EL1(使用基准抗体IMAB362分析,根据来自imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/details.cgi?pdbcode=10473的序列产生)。与对照(左图)相比,超过90%的纯化VLP(右图)表达hCLDN18.2 EL1。
图7示出了5种选定克隆(32G4、47D10、29G4、31A6和15B10)的结合,如通过FACS分析所确定的,这些克隆表现出与人CLDN18.2的特异性结合。上图:小鼠嵌合抗体克隆与在细胞表面表达的CLDN18.1的结合。下图:小鼠嵌合抗体克隆与在细胞表面表达的CLDN18.2的结合。
图8示出了鼠抗CLDN18.2嵌合抗体克隆32G4、47D10、29G4、31A6和15B10的结合亲和力。
图9A示出了示例性人源化32G4抗体变体与小鼠32G4嵌合对照抗体相比的结合亲和力。
图9B示出了示例性人源化47D10抗体变体与小鼠47D10嵌合对照抗体相比的结合亲和力。
图10示出了人CLDN18.2蛋白质(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。
图11示出了人CLDN18.1蛋白质(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列。
图12示出了鼠克隆32G4(分别为SEQ ID NO:6-11)、47D10(分别为SEQ ID NO:12-17)、29G4(分别为SEQ ID NO:18-23)、31A6(分别为SEQ ID NO:24-29)和15B10(分别为SEQID NO:30-35)的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列。SEQ ID NO:155对应于32G4-huVL4 CDR2序列并且SEQ ID NO:156对应于47D10-huVL4 CDR2序列。
图13示出了鼠克隆32G4(分别为SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37)、47D10(分别为SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39)、29G4(分别为SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41)、31A6(分别为SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43)和15B10(分别为SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45)的可变重链免疫球蛋白结构域(VH)和可变轻链免疫球蛋白结构域(VL)的氨基酸序列。VHCDR 1-3和VLCDR 1-3氨基酸序列用下划线标出。
图14示出了克隆32G4的四种人源化VH变体(SEQ ID NO:46-49)和四种人源化VL变体(SEQ ID NO:50-53)的氨基酸序列。VH CDR 1-3和VLCDR 1-3氨基酸序列用下划线标出。
图15示出了克隆47D10的四种人源化VH变体(SEQ ID NO:54-57)和四种人源化VL变体(SEQ ID NO:58-61)的氨基酸序列。VH CDR 1-3和VLCDR 1-3氨基酸序列用下划线标出。
图16示出了32G4-huIgG1-V8(SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63)和32G4-huIgG1-V9(SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65)的重链(HC)和轻链(LC)氨基酸序列。VH CDR 1-3和VL CDR1-3氨基酸序列用下划线标出,并且VH和VL氨基酸序列用斜体标出。
图17示出了47D10-huIgG1-V6(SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67)和47D10-huIgG1-V7(SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69)的重链(HC)和轻链(LC)氨基酸序列。VH CDR 1-3和VLCDR 1-3氨基酸序列用下划线标出,并且VH和VL氨基酸序列用斜体标出。
图18示出了与IMAB362基准抗体和阴性同种型对照相比,32G4和47D10克隆的示例性抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定数据。
图19示出了相对于IMAB362基准抗体和阴性同种型对照,示例性人源化32G4和47D10抗体变体与食蟹猴和小鼠claudin 18.2靶蛋白质在细胞表面上的跨物种结合。
图20示出了32G4-huIgG1-V8×OKT3(抗CLDN18.2×CD3)双特异性抗体(BsAb)(SEQID NO:81和SEQ ID NO:82)和32G4-huIgG1-V9×OKT3(抗CLDN18.2×CD3)BsAb(SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84)的示例性重链(HC)和轻链(LC)氨基酸序列。抗CLDN18.2免疫球蛋白的VH CDR 1-3和VL CDR 1-3氨基酸序列用下划线标出,所有接头都是粗体,并且BsAb的所有VH和VL氨基酸序列均用斜体标出。
图21示出了47D10-huIgG1-V6×OKT3(抗CLDN18.2×CD3)双特异性抗体(BsAb)(SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86)和47D10-huIgG1-V7×OKT3 BsAb(抗CLDN18.2×CD3)(SEQID NO:87和SEQ ID NO:88)的示例性重链(HC)和轻链(LC)氨基酸序列。抗CLDN18.2免疫球蛋白的VH CDR 1-3和VL CDR 1-3氨基酸序列用下划线标出,所有接头都是粗体,并且BsAb的所有VH和VL氨基酸序列均用斜体标出。
图22示出了32G4-huIgG1-V8×huSP34(抗CLDN18.2×CD3)双特异性抗体(BsAb)(SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90)和32G4-huIgG1-V9×huSP34 BsAb(抗CLDN18.2×CD3)(SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92)的示例性重链(HC)和轻链(LC)氨基酸序列。抗CLDN18.2免疫球蛋白的VH CDR 1-3和VL CDR 1-3氨基酸序列用下划线标出,所有接头都是粗体,并且BsAb的所有VH和VL氨基酸序列均用斜体标出。
图23示出了47D10-huIgG1-V6×huSP34(抗CLDN18.2×CD3)双特异性抗体(BsAb)(SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94)和47D10-huIgG1-V7×huSP34 BsAb(抗CLDN18.2×CD3)(SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:96)的示例性重链(HC)和轻链(LC)氨基酸序列。抗CLDN18.2免疫球蛋白的VH CDR 1-3和VL CDR 1-3氨基酸序列用下划线标出,所有接头都是粗体,并且BsAb的所有VH和VL氨基酸序列均用斜体标出。
图24示出了与IMAB362-抗CD3基准抗体和阴性同种型对照相比,32G4-抗CD3和47D10-抗CD3双特异性抗体变体的示例性胃癌细胞杀伤(TDCC)测定数据。
图25示出了抗CD3 OKT3抗体的VH和VL氨基酸序列(SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98)、人源化SP34 VH 1-5的VH氨基酸序列(SEQ ID NO:99-102和157)和人源化SP34 VL的VL氨基酸序列(SEQ ID NO:103和158)。
图26示出了32G4-V8×huSP34-v5(抗CLDN18.2×CD3)双特异性抗体(BsAb)(SEQID NO:159和SEQ ID NO:160)和47D10-V7×huSP34-v5 BsAb(抗CLDN18.2×CD3)(SEQ IDNO:161和SEQ ID NO:162)的示例性重链(HC)和轻链(LC)氨基酸序列。抗CLDN18.2免疫球蛋白的VH CDR 1-3和VL CDR 1-3氨基酸序列用下划线标出,所有接头都是粗体,并且BsAb的所有VH和VL氨基酸序列均用斜体标出。
图27示出了32G4-V8×huSP34-v5在小鼠异种移植胃癌模型中的示例性体内疗效。
图28示出了32G4-V8×huSP34-v5在加速压力测试条件下的示例性稳定性,如通过SEC-HPLC评估的。
图29示出了32G4-V8×huSP34-v5在加速应力测试条件下的示例性胃癌细胞杀伤(TDCC)测定数据。
具体实施方式
应当理解,本方法的某些方面、模式、实施方案、变型和特征在下文中以各种详细程度描述以便提供对本技术的实质性理解。
本公开总体提供了免疫球蛋白相关组合物(例如,抗体或其抗原结合片段),这些组合物可特异性结合到Claudin 18.2多肽。本技术的免疫球蛋白相关组合物可用于检测或治疗有需要的受试者的Claudin 18.2相关癌症的方法中。因此,本方法的各个方面涉及抗Claudin 18.2抗体的制备、表征和操作。本技术的免疫球蛋白相关组合物可单独使用或与另外的治疗剂组合使用以治疗癌症。在一些实施方案中,免疫球蛋白相关组合物是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
在实践本方法时,使用分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组DNA中的许多常规技术。参见,例如,Sambrook和Russell编辑(2001年),MolecularCloning:A Laboratory Manual,第3版;Ausubel等人编辑(2007年),Current Protocolsin Molecular Biology系列;Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)系列;MacPherson等人(1991年),PCR 1:A Practical Approach(IRL Press at OxfordUniversity Press);MacPherson等人(1995年),PCR 2:A Practical Approach;Harlow和Lane编辑(1999年),Antibodies,A Laboratory Manual;Freshney(2005年),Culture ofAnimal Cells:A Manual of Basic Technique,第5版;Gait编辑(1984年),Oligonucleotide Synthesis;美国专利号4,683,195;Hames和Higgins编辑(1984年),Nucleic Acid Hybridization;Anderson(1999年),Nucleic Acid Hybridization;Hames和Higgins编辑(1984年),Transcription and Translation;Immobilized Cells andEnzymes(IRL Press(1986年));Perbal(1984年),A Practical Guide to MolecularCloning;Miller和Calos编辑(1987年),Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Cold Spring Harbor Laboratory);Makrides编辑(2003年),Gene Transfer andExpression in Mammalian Cells;Mayer和Walker编辑(1987年),ImmunochemicalMethods in Cell and Molecular Biology(Academic Press,London)和Herzenberg等人编辑(1996年),Weir’s Handbook of Experimental Immunology。检测和测量多肽基因表达产物的水平(即基因翻译水平)的方法是本领域众所周知的,包括使用多肽检测方法,诸如抗体检测和定量技术。(另外参见,Strachan&Read,Human Molecular Genetics,第二版(John Wiley and Sons,Inc.,NY,1999年))。
定义
除非另有定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语通常具有与本技术的所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。如本说明书和所附权利要求中所用,除非内容另有明确说明,否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。例如,提及“一个细胞”包括两个或多个细胞的组合等。通常,本文使用的命名法和细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学和核酸化学中的实验室程序以及下文描述的杂合是本领域众所周知和常用的那些。
除非另有说明或从上下文中明显看出,否则如本文所用,通常认为涉及数字的术语“约”包括落在该数字的任一方向(大于或小于)1%、5%或10%范围内的数字(不包括这种数字小于0%或超过可能值的100%的情况)。
如本文所用,向受试者“施用”药剂或药物包括向受试者引入或递送化合物以执行其预期功能的任何途径。施用可通过任何合适的途径进行,包括但不限于口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌内、腹膜内或皮下)、直肠、鞘内、瘤内或局部施用。施用包括自我施用和经他人施用。
“佐剂”是指引起免疫系统的刺激的一种或多种物质。在这种情况下,佐剂用于增强对一种或多种疫苗抗原或抗体的免疫应答。佐剂可以在施用疫苗之前、之后或与施用疫苗组合施用于受试者。用作佐剂的化合物的示例包括铝化合物、油、嵌段聚合物、免疫刺激复合物、维生素和矿物质(例如,维生素E、维生素A、硒和维生素B12)、Quil A(皂苷)、细菌和真菌细胞壁成分(例如,脂多糖、脂蛋白质和糖蛋白质)、激素、细胞因子和共刺激因子。
如本文所用,术语“抗体”统称为免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子,包括例如但不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、它们的组合以及在任何脊椎动物,例如哺乳动物诸如人、山羊、兔子和小鼠以及非哺乳动物物种中免疫应答期间产生的类似分子,诸如鲨鱼免疫球蛋白。如本文所用,“抗体”(包括完整的免疫球蛋白)和“抗原结合片段”特异性结合到感兴趣的分子(或一组高度相似的感兴趣的分子),基本上排除与其他分子(例如,对感兴趣的分子具有比对生物样品中的其他分子大至少103M-1、大至少104M-1或大至少105M-1的结合常数的抗体和抗体片段)结合。术语“抗体”还包括基因工程改造形式,诸如嵌合抗体(例如,人源化鼠抗体)、异缀合抗体(诸如,双特异性抗体)。另外参见,Pierce Catalog and Handbook,1994年-1995年(Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.);Kuby,J.,Immunology,第3版,W.H.Freeman&Co.,New York,1997年。
更具体地,抗体是指多肽配体,该多肽配体包含至少轻链免疫球蛋白可变区或重链免疫球蛋白可变区并且特异性识别并结合抗原的表位。抗体由重链和轻链组成,重链和轻链中的每一者均具有可变区,称为可变重链区(VH)和可变轻链区(VL)。VH区和VL区一起负责结合由抗体识别的抗原。通常,免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重(H)链和轻(L)链。存在两种类型的轻链,lambda(λ)和kappa(k)。存在五种主要的重链类别(或同种型),它们决定了抗体分子的功能活性:IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条重链和轻链都包含恒定区和可变区(这些区也称为“结构域”)。重链和轻链可变区组合时特异性结合抗原。轻链和重链可变区包含被三个也称为“互补决定区”或“CDR”的高变区中断的“框架”区。已经限定框架区和CDR的范围(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,1991年,该文献据此通过引用方式并入)。Kabat数据库正处于在线维护。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内相对保守。抗体的框架区,即组成轻链和重链的组合框架区主要呈β-折叠构型,并且CDR形成环,这些环连接并在某些情况下形成β-折叠结构的一部分。因此,框架区用于形成支架,该支架通过链间非共价相互作用将CDR定位在正确的取向上。
CDR主要负责结合到抗原的表位。每条链的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3,从N末端开始按顺序编号,并且通常也由特定CDR所在的链标识。因此,VH CDR3位于其所在抗体重链的可变结构域中,而VL CDR1是来自其所在抗体轻链的可变结构域的CDR1。结合Claudin 18.2蛋白质的抗体将具有特定的VH区和VL区序列,因此具有特定的CDR序列。具有不同特异性(即针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。尽管CDR因抗体而异,但CDR内仅有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置被称为特异性决定残基(SDR)。如本文所用,“免疫球蛋白相关组合物”是指抗体(包括单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、多特异性抗体、双特异性抗体等)以及抗体片段。抗体或其抗原结合片段特异性结合到抗原。
如本文所用,术语“抗体相关多肽”意指抗原结合抗体片段,包括单链抗体,其可单独包含可变区,或与以下多肽元件的全部或部分组合:抗体分子的铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。该技术中还包括可变区和铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。可用于本方法中的抗体相关分子例如但不限于Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。示例包括:(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab')2片段,包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段;(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段;(v)dAb片段(Ward等人,Nature,第341卷:第544-546页,1989年),其由VH结构域组成;和(vi)分离的互补决定区(CDR)。因此,“抗体片段”或“抗原结合片段”可包含全长抗体的一部分,通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段或抗原结合片段的示例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段;双体;线性抗体;单链抗体分子;以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用,“双特异性抗体”或“BsAb”是指可同时结合到具有不同结构的两个靶标的抗体,例如,两个不同的靶抗原、同一靶抗原上的两个不同表位或者半抗原和靶抗原或靶抗原上的表位。本领域已知多种不同的双特异性抗体结构。在一些实施方案中,双特异性抗体中的每个抗原结合部分均包括VH和/或VL区;在一些此类实施方案中,VH和/或VL区是在特定单克隆抗体中发现的那些。在一些实施方案中,双特异性抗体含有两个抗原结合部分,每个抗原结合部分包括来自不同单克隆抗体的VH和/或VL区。在一些实施方案中,双特异性抗体含有两个抗原结合部分,其中所述两个抗原结合部分中的一个抗原结合部分包括具有VH和/或VL区的免疫球蛋白分子,这些区含有来自第一单克隆抗体的CDR,并且另一个抗原结合部分包括具有VH和/或VL区的抗体片段(例如,Fab、F(ab')、F(ab')2、Fd、Fv、dAB、scFv等),这些区含有来自第二个单克隆抗体的CDR。
如本文所用,术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的免疫防御机制,免疫系统的效应细胞凭借这种机制主动裂解靶细胞诸如肿瘤细胞,其膜表面抗原已被抗体诸如抗CLDN18.2抗体结合。
如本文所用,“抗原”是指抗体(或其抗原结合片段)可选择性结合的分子。靶抗原可以是蛋白质、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。在一些实施方案中,靶抗原可以是多肽(例如,CLDN18.2多肽)。也可将抗原施用于动物以在动物中产生免疫应答。
术语“抗原结合片段”是指整个免疫球蛋白结构的片段,其具有多肽的负责结合到抗原的一部分。可用于本技术的抗原结合片段的示例包括scFv、(scFv)2、scFvFc、Fab、Fab'和F(ab')2,但不限于此。使用本领域技术人员已知的常规技术获得上述抗体片段中的任何抗体片段,并且以与完整抗体相同的方式筛选片段的结合特异性和中和活性。
如本文所用,“结合亲和力”意指分子(例如,抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如,抗原或抗原肽)之间的总非共价相互作用的强度。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(KD)表示。亲和力可通过本领域已知的标准方法测量,包括本文所述的标准方法。低亲和力复合物含有通常倾向于容易与抗原解离的抗体,而高亲和力复合物含有通常倾向于保持与抗原结合更长时间的抗体。
如本文所用,术语“生物样品”意指源自活细胞的样品材料。生物样品可包括从受试者分离的组织、细胞、蛋白质或细胞膜提取物和生物流体(例如,腹水或脑脊液(CSF)),以及存在于受试者体内的组织、细胞和流体。本技术的生物样品包括但不限于取自以下的样品:乳腺组织、肾组织、子宫颈、子宫内膜、头部或颈部、胆囊、腮腺组织、前列腺、脑、脑下垂体、肾组织、肌肉、食道、胃、小肠、结肠、肝脏、脾脏、胰腺、甲状腺组织、心脏组织、肺组织、膀胱、脂肪组织、淋巴结组织、子宫、卵巢组织、肾上腺组织、睾丸组织、扁桃体、胸腺、血液、毛发、口腔、皮肤、血清、血浆、CSF、精子、前列腺液、精液、尿液、粪便、汗液、唾液、痰液、粘液、骨髓、淋巴和泪液。生物样品也可从内部器官的活检或从癌症获得。生物样品可从受试者获得以用于诊断或研究,或者可从未患病的个体获得,作为对照或用于基础研究。样品可通过标准方法获得,这些标准方法包括例如静脉穿刺和手术活检。在某些实施方案中,生物样品是通过针刺活检获得的组织样品。
如本文所用,术语“CDR移植”意指用来自具有期望的抗原特异性的“供体”抗体的CDR“移植物”替换“受体”抗体的至少一个CDR。
如本文所用,术语“嵌合抗体”意指其中来自一个物种的单克隆抗体的Fc恒定区(例如,小鼠Fc恒定区)使用重组DNA技术被来自另一个物种的抗体的Fc恒定区(例如,人Fc恒定区)替换的抗体。通常参见,Robinson等人,PCT/US86/02269;Akira等人,欧洲专利申请184,187;Taniguchi,欧洲专利申请171,496;Morrison等人,欧洲专利申请173,494;Neuberger等人,WO 86/01533;Cabilly等人,美国专利号4,816,567;Cabilly等人,欧洲专利申请0125,023;Better等人,Science,第240卷:第1041-1043页,1988年;Liu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第84卷:第3439-3443页,1987年;Liu等人,J.Immunol,第139卷:第3521-3526页,1987年;Sun等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第84卷:第214-218页,1987年;Nishimura等人,Cancer Res,第47卷:第999-1005页,1987年;Wood等人,Nature,第314卷:第446-449页,1885年;以及Shaw等人,J.Natl.Cancer Inst.,第80卷:第1553-1559页,1988年。
如本文所用,术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”通常是指IgG和IgM抗体的效应子功能,当这些抗体结合到表面抗原时触发经典补体途径,从而诱导膜攻击复合物的形成和靶细胞裂解。
如本文所用,术语“共有FR”意指共有免疫球蛋白序列中的框架(FR)抗体区。抗体的FR区不接触抗原。
如本文所用,“对照”是用于比较目的的实验中的另选样品。对照可以是“阳性”或“阴性”。例如,在实验的目的是确定治疗剂用于治疗特定类型疾病的疗效的相关性的情况下,通常采用阳性对照(已知表现出所需治疗效果的化合物或组合物)和阴性对照(未接受疗法或接受安慰剂的受试者或样品)。
如本文所用,术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段,这些片段包含与同一条多肽链中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VH VL)。通过使用太短而不允许在同一条链上的两个结构域之间配对的接头,这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地描述于例如EP 404,097;WO93/11161;和Hollinger等人,Proc Natl Acad Sci USA,第90卷:第6444-6448页(1993年)。
如本文所用,称为最大半数有效浓度的术语“EC50”是指在特定暴露时间后诱导基线值与最大值之间的中值应答的抗体浓度。
如本文所用,术语“有效量”是指足以实现期望的治疗性和/或预防性效果的量,例如导致预防或减少本文所述的疾病或病症或者与本文所述的疾病或病症相关的一种或多种体征或症状的量。在治疗性或预防性应用的情况下,施用于受试者的组合物的量将根据组合物;疾病的程度、类型和严重性;以及个体的特征诸如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性而改变。技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的剂量。组合物也可与一种或多种另外的治疗化合物组合施用。在本文所述的方法中,可将治疗组合物施用于具有本文所述的疾病或病症的一种或多种体征或症状的受试者。如本文所用,组合物的“治疗有效量”是指疾病或病症的生理效应得到改善或消除的组合物水平。治疗有效量可以一次或多次施用来提供。
如本文所用,术语“效应细胞”意指参与免疫应答的效应阶段的免疫细胞,与免疫应答的认知和激活阶段相反。示例性免疫细胞包括骨髓或淋巴来源的细胞,例如,淋巴细胞(例如,B细胞和T细胞,包括溶细胞性T细胞(CTL))、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。效应细胞表达特定的Fc受体并执行特定的免疫功能。效应细胞可诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),例如能够诱导ADCC的嗜中性粒细胞。例如,表达FcαR的单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞参与特异性杀伤靶细胞并将抗原呈递给免疫系统的其他组分,或结合到呈递抗原的细胞。
如本文所用,术语“表位”意指能够特异性结合到抗体的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面分组诸如氨基酸或糖侧链组成,并且通常具有特定的三维结构特征,以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于,在变性溶剂的存在下会失去与前者的结合,但不会失去与后者的结合。在一些实施方案中,CLDN18.2蛋白质的“表位”是本技术的抗CLDN18.2抗体特异性结合的蛋白质区域。在一些实施方案中,表位是构象表位或非构象表位。为了筛选与表位结合的抗CLDN18.2抗体,可进行诸如Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow和David Lane(1988年)中所述的常规交叉阻断测定。该测定可用于确定抗CLDN18.2抗体是否结合与本技术的抗CLDN18.2抗体相同的位点或表位。另选地或除此之外,可通过本领域已知的方法进行表位作图。例如,可诸如通过丙氨酸扫描对抗体序列进行诱变,以鉴定接触残基。在一种不同的方法中,对应于CLDN18.2蛋白质的不同区域的肽可用于与测试抗体或与测试抗体和具有特征或已知表位的抗体的竞争测定。
如本文所用,“表达”包括以下中的一者或多者:基因转录成前体mRNA;对前体mRNA进行剪接和其他加工以产生成熟的mRNA;mRNA稳定性;将成熟的mRNA翻译成蛋白质(包括密码子使用和tRNA可用性);以及翻译产物的糖基化和/或其他修饰,如果适当表达和功能需要的话。
如本文所用,术语“基因”意指包含用于调节RNA产物生物合成的全部信息(包括启动子、外显子、内含子和控制表达的其他非翻译区)的DNA片段。
如本文所用,“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可通过比较可以为了比较的目的而比对的每条序列中的位置来确定同源性。当比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时,则这些分子在该位置是同源的。序列之间的同源性程度是序列共享的匹配或同源位置数的函数。与另一条序列具有一定百分比(例如,至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%)的“序列同一性”的多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)意味着,当比对时,碱基(或氨基酸)的百分比在比较两条序列时是相同的。这种比对和同源性或序列同一性的百分比可使用本领域已知的软件程序来确定。在一些实施方案中,默认参数用于比对。一种比对程序是BLAST,使用默认参数。具体地,程序是BLASTN和BLASTP,使用以下默认参数:遗传密码=标准;过滤器=无;链=两条;截止值=60;期望值=10;矩阵=BLOSUM62;描述=50条序列;排序方式=高分;数据库=非冗余,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS平移+Swiss蛋白质+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息可见于国家生物技术信息中心。生物学上等效的多核苷酸是具有特定百分比同源性并编码具有相同或相似生物学活性的多肽的多核苷酸。如果两条序列彼此共享小于40%的同一性或小于25%的同一性,则认为它们是“不相关的”或“非同源的”。
如本文所用,非人(例如,鼠)抗体的“人源化”形式是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下,人源化抗体是人免疫球蛋白,其中受体的高变区残基被具有期望的特异性、亲和力和能力的来自非人物种诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的(供体抗体)的高变区残基替换。在一些实施方案中,人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被对应的非人残基替换。此外,人源化抗体可包含不存在于受体抗体或供体抗体中的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能,诸如结合亲和力。通常,人源化抗体将包含至少一个可变结构域(例如Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv)的基本上全部并且通常包含两个可变结构域,其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有FR序列的FR区,但是FR区可包含改善结合亲和力的一个或多个氨基酸取代。FR中这些氨基酸取代的数量通常在H链中不超过6个,并且在L链中不超过3个。任选地,人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。有关详细信息,请参见Jones等人,Nature,第321卷:第522-525页(1986年);Reichmann等人,Nature,第332卷:第323-329页(1988年)以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,第2卷:第593-596页(1992年)。参见,例如,Ahmed&Cheung,FEBSLetters,第588卷第2期:第288-297页(2014年)。
如本文所用,术语“高变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如,VL中的大约第24-34位(L1)、第50-56位(L2)和第89-97位(L3)残基,以及VH中的大约第31-35B位(H1)、第50-65位(H2)和第95-102位(H3)残基(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991年))和/或来自“高变环”的那些残基(例如,VL中的第26-32位(L1)、第50-52位(L2)和第91-96位残基(L3),以及VH中的第26-32位残基(H1)、第52A-55位残基(H2)和第96-101位残基(H3)(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,第196卷:第901-917页(1987年))。
如本文所用,术语“相同”或百分比“同一性”在两条或多条核酸或多肽序列的上下文中使用时是指当在比较窗口或指定区域上进行比较和比对以获得最大对应性时,两条或多条序列或子序列是相同的或具有特定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即在指定区域(例如,编码本文所述的抗体的核苷酸序列或本文所述的抗体的氨基酸序列)上约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性)),如使用具有下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法测量的,或通过手动比对和视觉检查(例如,NCBI网站)测量的。此类序列则被称为“基本上相同的”。该术语还指或可应用于测试序列的互补序列。该术语还包括具有缺失和/或添加的序列,以及具有取代的序列。在一些实施方案中,同一性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸,或长度为50个-100个氨基酸或核苷酸的区域上。
如本文所用,“免疫原”是指能够诱导体液和/或细胞介导的免疫应答而不是免疫耐受的任何抗原。
如本文所用,术语“完整的抗体”或“完整的免疫球蛋白”意指具有通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链多肽和两条轻(L)链多肽的抗体。每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步细分为高变区,这些高变区称为互补决定区(CDR)并穿插有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL由按以下顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个CDR和四个FR组成:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。
如本文所用,术语“个体”、“患者”或“受试者”可以是个体生物、脊椎动物、哺乳动物或人。在一些实施方案中,个体、患者或受试者是人。
如本文所用,术语“接头”是指共价连接两个或多个多肽或核酸以使它们彼此连接的官能团(例如,化学物质或多肽)。如本文所用,“肽接头”是指用于将两种蛋白质偶联在一起(例如,用于偶联VH和VL结构域)的一个或多个氨基酸。在某些实施方案中,接头包含具有序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:79)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:80)的氨基酸。
如本文所用,术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体,即构成该群体的个体抗体是相同的,不同的是可能以少量存在的可能天然存在的突变。例如,单克隆抗体可以是源自单个克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)的抗体,而不是其产生方法。单克隆抗体组合物对特定表位表现出单一结合特异性和亲和力。单克隆抗体具有高度特异性,针对单个抗原位点。此外,与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反,每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体是从基本上同质的抗体群体获得的特征,不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。可使用本领域已知的多种技术来制备单克隆抗体,包括例如但不限于杂交瘤、重组和噬菌体展示技术。例如,根据本方法使用的单克隆抗体可通过由Kohler等人,Nature,第256卷:第495页(1975年)首先描述的杂交瘤方法制备,或者可通过重组DNA方法制备(参见,例如,美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可使用例如Clackson等人,Nature,第352卷:第624-628页(1991年)和Marks等人,J.Mol.Biol.,第222卷:第581-597页(1991年)中描述的技术从噬菌体抗体文库分离。
如本文所用,术语“核酸”或“多核苷酸”意指任何RNA或DNA,其可以是未修饰或修饰的RNA或DNA。多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA,单链区和双链区混合的DNA,单链和双链RNA,单链区和双链区混合的RNA,以及包含可以是单链或者更典型地双链、或者单链区和双链区混合的DNA和RNA的杂合分子。另外,多核苷酸是指包含RNA、或DNA、或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA,以及具有为了稳定性或其他原因而修饰的主链的DNA或RNA。
如本文所用,术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌化合物、等渗和延迟吸收化合物等。药学上可接受的载体及其制剂是本领域技术人员已知的并且在例如Remington's PharmaceuticalSciences(第20版,A.Gennaro编辑,2000年,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.)中有所描述。
如本文所用,术语“多克隆抗体”意指源自至少两(2)种不同的抗体产生细胞系的抗体制剂。该术语的使用包括至少两(2)种抗体的制剂,所述至少两种抗体含有特异性结合到抗原的不同表位或区域的抗体。
如本文所用,术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用,意指包含通过肽键或修饰的肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的聚合物,即肽等排体。多肽既指短链,通常称为肽、糖肽或低聚物,也指长链,通常称为蛋白质。多肽可含有除20种基因编码氨基酸之外的氨基酸。多肽包括通过自然过程诸如翻译后加工或通过本领域熟知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。这种修饰充分描述于基础文本和更详细的专著中,以及大量研究文献中。
如本文所用,术语“重组”当参考例如细胞、核酸、蛋白质或载体使用时,表示该细胞、核酸、蛋白质或载体已通过异源核酸或蛋白质的引入或者天然核酸或蛋白质的改变而被修饰,或该材料源自如此修饰的细胞。因此,例如,重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中未发现的基因,或表达以其他方式异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。
如本文所用,术语“分开的”治疗使用是指通过不同途径同时或基本上同时施用至少两种活性成分。
如本文所用,术语“依次的”治疗使用是指在不同时间施用至少两种活性成分,施用途径是相同或不同的。更具体地,依次使用是指施用全部的一种活性成分,然后开始施用另一种或其他活性成分。因此,可以在数分钟、数小时或数天内施用一种活性成分,然后施用另一种或多种活性成分。在这种情况下不存在同时治疗。
如本文所用,术语“同时”治疗使用是指通过相同途径同时或基本上同时施用至少两种活性成分。
如本文所用,术语“单链抗体”或“单链Fv(scFv)”是指Fv片段的两个结构域VL和VH的抗体融合分子。单链抗体分子可包括具有多个单独分子的聚合物,例如二聚体、三聚体或其他聚合物。此外,虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码,但可以使用重组方法通过合成接头连接它们,使它们能够制成单条蛋白质链,其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv))。Bird等人(1988年),Science,第242卷:第423-426页和Huston等人(1988年),Proc Natl Acad Sci,第85卷:第5879-5883页。此类单链抗体可通过重组技术或者完整抗体的酶促或化学切割来制备。
如本文所用,“特异性结合”是指一种分子(例如,抗体或其抗原结合片段)识别并结合另一种分子(例如,抗原),但基本上不识别并结合其他分子。如本文所用,术语“特异性结合”、“特异性结合到”或“特异于”特定分子(例如,多肽或多肽上的表位)可例如通过分子对其结合的分子具有约10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M的KD表现出。术语“特异性结合”也可指这样的结合:其中分子(例如,抗体或其抗原结合片段)与特定多肽(例如,CLDN18.2多肽)或特定多肽上的表位结合,而基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合。
如本文所用,“序列倾向性”是指核酸或氨基酸序列的可影响本公开的免疫球蛋白相关组合物的异质性的任何特征。此类序列倾向性包括但不限于易于脱酰胺、异构化、切割、氧化和糖基化的任何序列基序。
如本文所用,术语“受试者”、“患者”或“个体”可以是个体生物、脊椎动物、哺乳动物或人。在一些实施方案中,受试者、患者或个体是人。
如本文所用,术语“治疗剂”旨在表示当以有效量存在时对有需要的受试者产生期望的治疗效果的化合物。
如本文所用,“治疗”涵盖受试者诸如人中本文所述的疾病或障碍的治疗,并且包括:(i)抑制疾病或障碍,即,阻止其发展;(ii)缓解疾病或障碍,即,引起障碍的消退;(iii)减慢障碍的进展;以及/或者(iv)抑制、缓解或减慢疾病或障碍的一种或多种症状的进展。在一些实施方案中,治疗意指与疾病相关的症状例如减轻、减少、被治愈或处于缓解状态。
还应当理解,如本文所述的障碍的各种治疗模式旨在表示“显著的”,这包括全面治疗但也包括不全面治疗,并且其中实现了一些生物学或医学相关结果。治疗可以是针对慢性疾病的连续延长治疗或针对急性病症治疗的单次或若干次施用。
考虑了本文描述的抗CLDN18.2抗体的氨基酸序列修饰。可以进行此类修饰以提高抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性,例如,使编码的氨基酸糖基化,或破坏抗体与C1q、Fc受体结合的能力,或激活补体系统。抗CLDN18.2抗体的氨基酸序列变体通过将适当的核苷酸变化引入抗体核酸中,通过肽合成,或通过化学修饰来制备。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。进行缺失、插入和取代的任意组合以获得感兴趣的抗体,只要所获得的抗体具有期望的特性即可。修饰还包括蛋白质糖基化模式的改变。最感兴趣的取代诱变位点包括高变区,但也考虑FR改变。
保守氨基酸取代是将给定氨基酸改变为具有相似生化特性(例如,电荷、疏水性和大小)的不同氨基酸的氨基酸取代。“保守取代”示于下表中。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体的一个或多个高变区残基。一种用于产生此类取代变体的方便的方式涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。具体地,若干高变区位点(例如,6个-7个位点)突变以在每个位点产生所有可能的氨基酸取代。由此产生的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒展示为与包装在每个颗粒内的M13的基因III产物的融合物。然后筛选噬菌体展示变体的如本文所公开的生物活性(例如,结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点,可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定显著有助于抗原结合的高变区残基。另选地或除此之外,可能有益的是分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点。根据本文详述的技术,此类接触残基和相邻残基是取代的候选物。一旦产生此类变体,就使变体组经受如本文所述的筛选,并且可选择在一个或多个相关测定中具有相似或优异特性的抗体以进行进一步开发。
Claudin
在人中,已经描述了27种claudin家族成员(包括claudin 18)。所有claudin都有四个跨膜结构域和两个胞外环,其中N-末端和C-末端位于细胞质中(Markov,A.G.等人,IUBMB Life,第67卷:第29-35页(2015年);Furuse,M.等人,J Cell Biol,第141卷:第1539-1550页(1998年);Turksen,K.和Troy,T.C.,Biochim Biophys Acta,第1816卷:第73-79页(2011年))。
Claudin家族成员18基因由5个外显子组成。存在两种剪接变体:Claudin 18.1(CLDN18.1)和Claudin 18.2(CLDN18.2)。这两种变体是利用外显子1中的另选DNA序列的另选剪接的产物,这些序列编码蛋白质的包含第一胞外环(EL1)的N-末端部分(图1)(Mineta,K.等人,FEBS Lett,第585卷:第606-612页(2011年);Suzuki,H.等人,Science,第344卷:第304-307页(2014年))。CLDN18.1和CLDN18.2具有不同的EL1序列,但共享相同的EL2序列(图2)。CLDN18.2在人、食蟹猴和小鼠等物种中的同源性极高,因为它们都具有相同的EL1氨基酸序列。
Claudin 18在正常人体组织中的表达受到高度限制,其中CLDN18.1主要存在于肺部,并且CLDN18.2主要存在于胃部(图3)(Sahin U.等人,Clin Cancer Res,第14卷:第7624-7634页(2008年))。CLDN18.2的癌性表达已在胃癌、胰腺癌和其他癌症中报道(图4)(Sahin U.等人,Clin Cancer Res,第14卷:第7624-7634页(2008年);Karanjawala,Z.E.等人,Am J Surg Pathol,第32卷:第188-196页(2008年))。一项研究报道称,70%的胃癌、50%的胰腺癌、30%的食道癌和25%的NSCLC表达CLDN18.2(Sahin U.等人,Clin CancerRes,第14卷:第7624-7634页(2008年))。CLDN18.2已被视为特异性胃肿瘤相关抗原(TAA)。
CLDN18.2的恶性肿瘤相关表达及其组织限制性表达使其成为基于抗体疗法的理想靶标(Sahin U.等人,Clin Cancer Res,第14卷:第7624-7634页(2008年))。虽然不能开放进入胃粘膜中形成正常紧密连接的CLDN18.2,但CLDN18.2表位在恶性转化后暴露在细胞表面上,从而使它们可进入治疗性抗体。
本技术的免疫球蛋白相关组合物
本技术描述了用于产生和使用抗CLDN18.2免疫球蛋白相关组合物(例如,抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段)的方法和组合物。本技术的抗体和抗原结合片段选择性地结合到CLDN18.2多肽(图10)而不是CLDN18.1多肽(图11)。本公开的抗CLDN18.2免疫球蛋白相关组合物可用于诊断或治疗CLDN18.2相关癌症。本技术范围内的抗CLDN18.2免疫球蛋白相关组合物包括例如但不限于特异性结合靶多肽、同源物、衍生物或其片段的单克隆、嵌合、人源化、双特异性抗体和双抗体。本公开还提供了本文公开的抗CLDN18.2抗体中的任何抗体的抗原结合片段,其中抗原结合片段选自Fab、F(ab)'2、Fab'、scFv和Fv。本技术的抗CLDN18.2免疫球蛋白相关组合物的氨基酸序列描述于图12-图17和图20-图23中。
在一个方面,本公开提供了抗体或其抗原结合片段,该抗体或其抗原结合片段包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL),其中(a)VH包含选自SEQ ID NO:6、12、18、24和30的VH-CDR1序列;选自SEQ ID NO:7、13、19、25和31的VH-CDR2序列;以及选自SEQ ID NO:8、14、20、26和32的VH-CDR3序列,并且/或者(b)VL包含选自SEQ IDNO:9、15、21、27和33的VL-CDR1序列;选自SEQ ID NO:10、16、22、28、34、155和156的VL-CDR2序列;以及选自SEQ ID NO:11、17、23、29和35的VL-CDR3序列。
在一个方面,本公开提供了抗体或其抗原结合片段,该抗体或其抗原结合片段包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL),其中(a)VH包含SEQID NO:6的VH-CDR1序列、SEQ ID NO:7的VH-CDR2序列和SEQ ID NO:8的VH-CDR3序列,并且/或者VL包含SEQ ID NO:9的VL-CDR1序列、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:155的VL-CDR2序列和SEQ ID NO:11的VL-CDR3序列;(b)VH包含SEQ ID NO:12的VH-CDR1序列、SEQ ID NO:13的VH-CDR2序列和SEQ ID NO:14的VH-CDR3序列,并且/或者VL包含SEQ ID NO:15的VL-CDR1序列、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:156的VL-CDR2序列和SEQ ID NO:17的VL-CDR3序列;(c)VH包含SEQ ID NO:18的VH-CDR1序列、SEQ ID NO:19的VH-CDR2序列和SEQ ID NO:20的VH-CDR3序列,并且/或者VL包含SEQ ID NO:21的VL-CDR1序列、SEQ ID NO:22的VL-CDR2序列和SEQ IDNO:23的VL-CDR3序列;(d)VH包含SEQ ID NO:24的VH-CDR1序列、SEQ ID NO:25的VH-CDR2序列和SEQ ID NO:26的VH-CDR3序列,并且/或者VL包含SEQ ID NO:27的VL-CDR1序列、SEQ IDNO:28的VL-CDR2序列和SEQ ID NO:29的VL-CDR3序列;或者(e)VH包含SEQ ID NO:30的VH-CDR1序列、SEQ ID NO:31的VH-CDR2序列和SEQ ID NO:32的VH-CDR3序列,并且/或者VL包含SEQ ID NO:33的VL-CDR1序列、SEQ ID NO:34的VL-CDR2序列和SEQ ID NO:35的VL-CDR3序列。
在一个方面,本公开提供了抗体或其抗原结合片段,该抗体或其抗原结合片段包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL),其中:(a)VH包含选自SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46-49或54-57中任一者的氨基酸序列;并且/或者(b)VL包含选自SEQ ID NO:37、39、41、43、45、50-53或58-61中任一者的氨基酸序列。
在上述实施方案中的任何实施方案中,抗体还包含任何同种型的Fc结构域,例如但不限于IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD、IgE或IgM和IgY。恒定区序列的非限制性示例包括:
人IgD恒定区,Uniprot:P01880(SEQ ID NO:70)
APTKAPDVFPIISGCRHPKDNSPVVLACLITGYHPTSVTVTWYMGTQSQPQRTFPEIQRRDSYYMTSSQLSTPLQQWRQGEYKCVVQHTASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK
人IgG1恒定区,Uniprot:P01857(SEQ ID NO:71)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2恒定区,Uniprot:P01859(SEQ ID NO:72)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG3恒定区,Uniprot:P01860(SEQ ID NO:73)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
人IgM恒定区,Uniprot:P01871(SEQ ID NO:74)
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
人IgG4恒定区,Uniprot:P01861(SEQ ID NO:75)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
人IgA1恒定区,Uniprot:P01876(SEQ ID NO:76)
ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
人IgA2恒定区,Uniprot:P01877(SEQ ID NO:77)
ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRMAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
人Igκ恒定区,Uniprot:P01834(SEQ ID NO:78)
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一些实施方案中,本技术的免疫球蛋白相关组合物包含与SEQ ID NO:70-77具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%同一性的重链恒定区。除此之外或另选地,在一些实施方案中,本技术的免疫球蛋白相关组合物包含与SEQ ID NO:78具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%同一性的轻链恒定区。
除此之外或另选地,在一些实施方案中,抗体或抗原结合片段结合到CLDN18.2多肽的第一胞外环。在一些实施方案中,CLDN18.2多肽具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在某些实施方案中,第一胞外环包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列(参见图2)。在某些实施方案中,表位是构象表位或非构象表位。
在一个方面,本公开提供了抗体,该抗体包含重链(HC)氨基酸序列,该重链氨基酸序列包括SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:81、SEQID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQID NO:95、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161或它们的具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。除此之外或另选地,在一些实施方案中,本技术的免疫球蛋白相关组合物包含轻链(LC)氨基酸序列,该轻链氨基酸序列包括SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ IDNO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162或它们的具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。在一些实施方案中,本技术的免疫球蛋白相关组合物包含分别选自以下的HC氨基酸序列和LC氨基酸序列:SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:81和SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86、SEQID NO:87和SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:159和SEQ IDNO:160以及SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:162。
在免疫球蛋白相关组合物的上述实施方案中的任何实施方案中,HC和LC免疫球蛋白可变结构域序列形成抗原结合位点,该抗原结合位点结合到CLDN18.2多肽的第一胞外环。在某些实施方案中,第一胞外环包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中,表位是构象表位或非构象表位。
在一些实施方案中,HC和LC免疫球蛋白可变结构域序列是同一多肽链的组分。在其他实施方案中,HC和LC免疫球蛋白可变结构域序列是不同多肽链的组分。在某些实施方案中,抗体是全长抗体。
在一些实施方案中,本技术的免疫球蛋白相关组合物特异性结合到至少一种CLDN18.2多肽。在一些实施方案中,本技术的免疫球蛋白相关组合物以约10-3M、10-4M、10- 5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M的解离常数(KD)结合至少一种CLDN18.2多肽。在某些实施方案中,免疫球蛋白相关组合物是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施方案中,抗体包含人抗体框架区。
在某些实施方案中,免疫球蛋白相关组合物包括以下特征中的一种或多种特征:(a)轻链免疫球蛋白可变域序列与SEQ ID NO:37、39、41、43、45、50-53或58-61中任一者的轻链免疫球蛋白可变域序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性;以及/或者(b)重链免疫球蛋白可变域序列与SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46-49或54-57中任一者的重链免疫球蛋白可变域序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性。在另一个方面,本文提供的免疫球蛋白相关组合物中的一个或多个氨基酸残基被另一个氨基酸取代。取代可以是如本文所定义的“保守取代”。
在另一个方面,本公开提供了多特异性(例如,双特异性)抗体,该多特异性抗体包含:(a)与存在于SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ IDNO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:160或SEQ ID NO:162中的LC序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的LC序列;以及/或者(b)与存在于SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ IDNO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ IDNO:159或SEQ ID NO:161中的HC序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的HC序列。
在某些实施方案中,免疫球蛋白相关组合物含有IgG1恒定区,该恒定区包含选自N297A、K322A、L234A和L235A的一个或多个氨基酸取代。除此之外或另选地,在一些实施方案中,免疫球蛋白相关组合物含有IgG4恒定区,该恒定区包含S228P突变。
在一个方面,本公开提供了多特异性(例如,双特异性)抗体,该多特异性抗体包含第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链,其中第一多肽链和第二多肽链彼此共价键合,第二多肽链和第三多肽链彼此共价键合,并且第三多肽链和第四多肽链彼此共价键合,并且其中:(a)第一多肽链和第四多肽链中的每一者在N-末端至C-末端方向上包含:(i)能够特异性结合到第一表位的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域;(ii)第一免疫球蛋白的轻链恒定结构域;(iii)包含氨基酸序列(GGGGS)3的柔性肽接头;和(iv)连接到第二免疫球蛋白的互补重链可变结构域的第二免疫球蛋白的轻链可变结构域,或连接到第二免疫球蛋白的互补轻链可变结构域的第二免疫球蛋白的重链可变结构域,其中第二免疫球蛋白的轻链可变结构域和重链可变结构域能够特异性结合到第二表位,并通过包含氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽接头连接在一起以形成单链可变片段;并且(b)第二多肽链和第三多肽链中的每一者在N-末端至C-末端方向上包含:(i)能够特异性结合到第一表位的第一免疫球蛋白的重链可变结构域;和(ii)第一免疫球蛋白的重链恒定结构域;并且其中第一免疫球蛋白的重链可变结构域或第二免疫球蛋白的重链可变结构域选自SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46-49或54-57中的任一者,并且/或者第一免疫球蛋白的轻链可变结构域或第二免疫球蛋白的轻链可变结构域选自SEQ ID NO:37、39、41、43、45、50-53或58-61中的任一者。
除此之外或另选地,在一些实施方案中,第一免疫球蛋白的重链可变结构域选自SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46-49或54-57中的任一者,第一免疫球蛋白的轻链可变结构域选自SEQ ID NO:37、39、41、43、45、50-53或58-61中的任一者,第二免疫球蛋白的重链可变结构域选自SEQ ID NO:97、99、100、101、102或157中的任一者,并且第二免疫球蛋白的轻链可变结构域选自SEQ ID NO:98、103或158中的任一者。
在其他实施方案中,第一免疫球蛋白的重链可变结构域选自SEQ ID NO:97、99、100、101、102或157中的任一者,第一免疫球蛋白的轻链可变结构域选自SEQ ID NO:98、103或158中的任一者,第二免疫球蛋白的重链可变结构域选自SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46-49或54-57中的任一者,并且第二免疫球蛋白的轻链可变结构域选自SEQ ID NO:37、39、41、43、45、50-53或58-61中的任一者。
在一些方面,本文所述的抗CLDN18.2免疫球蛋白相关组合物含有结构修饰以促进快速结合以及细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面,本技术的抗CLDN18.2免疫球蛋白相关组合物(例如,抗体)可含有CH2重链恒定区的缺失以促进快速结合以及细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面,Fab片段用于促进快速结合以及细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面,F(ab')2片段用于促进快速结合以及细胞摄取和/或缓慢释放。
在一个方面,本技术提供了编码本文所述的免疫球蛋白相关组合物中的任何免疫球蛋白相关组合物的核酸序列。本文还公开了编码本文所述的抗体中的任何抗体的重组核酸序列。
在另一个方面,本技术提供了宿主细胞,该宿主细胞表达编码本文所述的免疫球蛋白相关组合物中的任何免疫球蛋白相关组合物的任何核酸序列。
本技术的免疫球蛋白相关组合物(例如,抗CLDN18.2抗体)可以是单特异性、双特异性、三特异性或具有更大的多特异性。多特异性抗体可以对一种或多种CLDN18.2多肽的不同表位具有特异性,或者可以对CLDN18.2多肽以及异源组合物(诸如异源多肽或固体支持物材料)两者具有特异性。参见,例如,WO 93/17715;WO 92/08802;WO 91/00360;WO 92/05793;Tutt等人,J.Immunol.,第147卷:第60-69页(1991年);美国专利号5,573,920、4,474,893、5,601,819、4,714,681、4,925,648;6,106,835;Kostelny等人,J.Immunol.,第148卷:第1547-1553页(1992年)。在一些实施方案中,免疫球蛋白相关组合物是嵌合的。在某些实施方案中,免疫球蛋白相关组合物是人源化的。
本技术的免疫球蛋白相关组合物可进一步在N-或C-末端重组融合到异源多肽,或化学缀合(包括共价和非共价缀合)到多肽或其他组合物。例如,本技术的免疫球蛋白相关组合物可重组融合或缀合到可在检测测定中用作标记物的分子和效应分子诸如异源多肽、药物或毒素。参见,例如,WO 92/08495;WO 91/14438;WO 89/12624;美国专利号5,314,995;和EP 0 396 387。
在一个方面,本公开提供了抗CD3抗体或其抗原结合片段,该抗体或其抗原结合片段包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL),其中:(a)VH包含SEQ ID NO:99-102或SEQ ID NO:157中任一者的氨基酸序列;并且/或者(b)VL包含SEQID NO:103或SEQ ID NO:158的氨基酸序列。在一些实施方案中,抗CD3抗体或抗原结合片段包含分别选自SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:103;以及SEQ ID NO:157和SEQ ID NO:158的重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)氨基酸序列。除此之外或另选地,在一些实施方案中,抗CD3抗体或抗原结合片段是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。抗原结合片段可选自Fab、F(ab')2、Fab'、scFv和Fv。
除此之外或另选地,在某些实施方案中,抗CD3抗体或抗原结合片段还包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE的同种型的Fc结构域。在一些实施方案中,抗CD3抗体还包含IgG1恒定区,该恒定区包含选自N297A、L234A、L235A和K322A的一个或多个氨基酸取代。在其他实施方案中,抗CD3抗体包含IgG4恒定区,该恒定区包含S228P突变。除此之外或另选地,在一些实施方案中,抗CD3抗体缺乏α-1,6-岩藻糖修饰。
在一个方面,本公开提供了多特异性抗体,该多特异性抗体包含第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链,其中第一多肽链和第二多肽链彼此共价键合,第二多肽链和第三多肽链彼此共价键合,并且第三多肽链和第四多肽链彼此共价键合,并且其中:(a)第一多肽链和第四多肽链中的每一者在N-末端至C-末端方向上包含:(i)能够特异性结合到第一表位的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域;(ii)第一免疫球蛋白的轻链恒定结构域;(iii)包含氨基酸序列(GGGGS)3的柔性肽接头;和(iv)连接到第二免疫球蛋白的互补重链可变结构域的第二免疫球蛋白的轻链可变结构域,或连接到第二免疫球蛋白的互补轻链可变结构域的第二免疫球蛋白的重链可变结构域,其中第二免疫球蛋白的轻链可变结构域和重链可变结构域能够特异性结合到第二表位,并通过包含氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽接头连接在一起以形成单链可变片段;并且(b)第二多肽链和第三多肽链中的每一者在N-末端至C-末端方向上包含:(i)能够特异性结合到第一表位的第一免疫球蛋白的重链可变结构域;和(ii)第一免疫球蛋白的重链恒定结构域;并且其中第一免疫球蛋白的重链可变结构域或第二免疫球蛋白的重链可变结构域包含SEQ ID NO:99-102或SEQ ID NO:157中的任一者,并且/或者第一免疫球蛋白的轻链可变结构域或第二免疫球蛋白的轻链可变结构域包含SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:158。
除此之外或另选地,在一些实施方案中,抗CD3多特异性抗体或抗原结合片段结合到T细胞、B细胞、骨髓细胞、浆细胞或肥大细胞。除此之外或另选地,在某些实施方案中,抗CD3多特异性抗体或抗原结合片段结合到CD3、GPA33、HER2/neu、GD2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、MUM-1、CDK4、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、p15、gp75、β-连环蛋白、ErbB2、癌抗原125(CA-125)、癌胚抗原(CEA)、RAGE、MART(黑色素瘤抗原)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、酪氨酸酶、Pmel 17(gp100)、GnT-V内含子V序列(N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V内含子V序列)、前列腺癌psm、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、EBNA(EB病毒核抗原)1-6、LMP2、p53、肺抗性蛋白质(LRP)、Bcl-2、前列腺特异性抗原(PSA)、Ki-67、CEACAM6、结肠特异性抗原-p(CSAp)、HLA-DR、CD40、CD74、CD138、EGFR、EGP-1、EGP-2、VEGF、PlGF、胰岛素样生长因子(ILGF)、腱生蛋白、血小板衍生生长因子、IL-6、CD20、CD19、PSMA、CD33、CD123、MET、DLL4、Ang-2、HER3、IGF-1R、CD30、TAG-72、SPEAP、CD45、L1-CAM、Lewis Y(Ley)抗原、E-钙粘蛋白、V-钙粘蛋白、GPC3、EpCAM、CD4、CD8、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、CD22、CD14、CD15、CD16、CD123、TCRγ/δ、NKp46、KIR、CD56、DLL3、PD-1、PD-L1、CD28、CD137、CD99、GloboH、CD24、STEAP1、B7H3、聚唾液酸、OX40、OX40-配体、肽MHC复合物(其中肽源自TP53、KRAS、MYC、EBNA1-6、PRAME、MART、酪氨酸酶、MAGEA1-A6、pmel17、LMP2或WT1)或小分子DOTA半抗原。
在另一个方面,本公开提供了组合物,该组合物包含本文公开的抗CD3抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体的任何和所有实施方案,其中抗体或抗原结合片段任选地与选自以下的药剂缀合:同位素、染料、色原(chromagen)、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或它们的任何组合。
在又一个方面,本公开提供了用于治疗有需要的受试者的癌症的方法,该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的抗CD3抗体或抗原结合片段的任何和所有实施方案。在另一个方面,本公开提供了用于治疗有需要的受试者的癌症的方法,该方法包括向受试者施用有效量的组合物,该组合物包含本文公开的抗CD3抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体的任何和所有实施方案,其中抗体或抗原结合片段任选地与选自以下的药剂缀合:同位素、染料、色原(chromagen)、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或它们的任何组合。
A.本技术的抗CLDN18.2抗体的制备方法
总体概述。最初,选择可以针对其提出本技术的抗体的靶多肽。例如,可以针对全长CLDN18.2蛋白质或针对CLDN18.2蛋白质的第一胞外环的一部分提出抗体。用于产生针对此类靶多肽的抗体的技术是本领域技术人员众所周知的。此类技术的示例包括例如但不限于那些涉及展示文库、异种或人类小鼠、杂交瘤等的技术。在本技术范围内的靶多肽包括源自CLDN18.2蛋白质的任何多肽,该蛋白质含有能够引发免疫应答的第一胞外环。
应当理解,针对CLDN18.2蛋白质及其片段的经重组工程改造的抗体和抗体片段,例如抗体相关多肽适合根据本公开使用。
可经受本文阐述的技术的抗CLDN18.2抗体包括单克隆和多克隆抗体以及抗体片段,诸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、scFv、双抗体、抗体轻链、抗体重链和/或抗体片段。已经描述了可用于高产率产生含抗体Fv的多肽,例如Fab'和F(ab')2抗体片段的方法。参见美国专利号5,648,237。
通常,抗体是从起源物种获得的。更具体地,获得对靶多肽抗原具有特异性的起源物种抗体的轻链、重链或两者的可变部分的核酸或氨基酸序列。起源物种是可用于产生本技术的抗体或抗体文库的任何物种,例如大鼠、小鼠、兔、鸡、猴、人等。
噬菌体或噬菌粒展示技术是可用于得到本技术抗体的技术。用于产生和克隆单克隆抗体的技术是本领域技术人员众所周知的。编码本技术抗体的序列的表达可在大肠杆菌(E.coli)中进行。
由于核酸编码序列的简并性,编码与天然存在的蛋白质的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的其他序列可用于本技术的实践中。这些序列包括但不限于核酸序列,包括编码上述多肽的全部或部分核酸序列,这些核酸序列通过编码序列内功能上等同的氨基酸残基的不同密码子的取代而改变,从而产生沉默变化。应当理解,根据本技术的免疫球蛋白的核苷酸序列耐受高达25%的序列同源性变化,如通过标准方法计算的(“Current Methodsin Sequence Comparison and Analysis”,Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications,第127-149页,1998年,Alan R.Liss,Inc.),只要这样的变体形成识别CLDN18.2蛋白质的有效抗体。例如,多肽序列内的一个或多个氨基酸残基可被充当功能等同物的具有相似极性的另一个氨基酸取代,导致沉默改变。序列内氨基酸的取代物可选自该氨基酸所属类别的其他成员。例如,非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。在本技术的范围内还包括蛋白质或其片段或衍生物,其在翻译期间或之后例如通过糖基化、蛋白水解切割、与抗体分子或其他细胞配体的连接等被差异修饰。此外,免疫球蛋白编码核酸序列可在体外或体内突变以产生和/或破坏翻译、起始和/或终止序列,或产生编码区变异和/或形成新的限制性核酸内切酶位点或破坏预先存在的位点,以促进进一步的体外修饰。可使用本领域已知的任何诱变技术,包括但不限于体外定点诱变,J.Biol.Chem.,第253卷:第6551页,使用Tab接头(Pharmacia)等。
多克隆抗血清和免疫原的制备。产生本技术的抗体或抗体片段的方法通常包括用纯化的CLDN18.2蛋白质或其片段、编码CLDN18.2蛋白质或其片段的核酸,或用表达CLDN18.2蛋白质或其片段的细胞免疫受试者(通常非人受试者诸如小鼠或兔)。合适的免疫原性制剂可含有例如重组表达的CLDN18.2蛋白质或化学合成的CLDN18.2肽。CLDN18.2蛋白质或其部分或片段的第一胞外环可用作免疫原以使用多克隆和单克隆抗体的标准制备技术产生结合到CLDN18.2蛋白质或其部分或片段的抗CLDN18.2抗体。在一些实施方案中,抗原性CLDN18.2肽包含至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸残基。取决于用途和根据本领域技术人员众所周知的方法,有时需要较长的抗原肽而不是较短的抗原肽。给定表位的多聚体有时比单体更有效。
例如但不限于,免疫原性制剂可包括例如包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重组表达的CLDN18.2蛋白质或化学合成的CLDN18.2肽。CLDN18.2蛋白质或其部分或片段的第一胞外环,例如具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CLDN18.2-EL1可用作免疫原以产生与CLDN18.2蛋白质的EL1部分结合的抗CLDN18.2抗体。
如果需要,CLDN18.2蛋白质(或其片段)的免疫原性可通过融合或缀合到载体蛋白质诸如钥孔戚血蓝素(KLH)或卵清蛋白(OVA)而增加。许多这样的载体蛋白质是本领域已知的。人们还可将CLDN18.2蛋白质与常规佐剂如弗氏完全或不完全佐剂组合,以增加受试者对多肽的免疫反应。用于增加免疫应答的各种佐剂包括但不限于弗氏(完全和不完全)、矿物凝胶(例如,氢氧化铝)、表面活性物质(例如,溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、二硝基苯酚等)、人佐剂诸如卡介苗和短小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)或类似的免疫刺激化合物。这些技术在本领域中是标准的。
另选地,纳米颗粒例如病毒样颗粒(VLP)可用于向宿主动物呈递抗原例如CLDN18.2-EL1。病毒样颗粒是多蛋白质结构,该多蛋白质结构模仿真正天然病毒的组织和构象而不具有传染性,因为它们不携带任何病毒遗传物质(Urakami A等人,Clin VaccineImmunol,第24卷:e00090-17(2017年))。当引入宿主免疫系统中时,VLP可引起有效的免疫应答,使它们成为有吸引力的外来抗原载体。基于VLP的抗原呈递平台的重要优势是它可以密集、重复的方式展示抗原。因此,携带抗原的VLP能够通过有效实现B细胞受体(BCR)的交联来诱导强烈的B细胞应答。可以对VLP进行基因操作以改善它们的特性,例如免疫原性。这些技术在本领域中是标准的。
分离足够的针对其提出抗体的纯化蛋白质或多肽可能是耗时的,有时在技术上具有挑战性。与传统的基于蛋白质的免疫相关的另外的挑战包括对蛋白质抗原的安全性、稳定性、可扩展性和一致性的担忧。基于核酸(DNA和RNA)的免疫已成为有前景的替代方案。DNA疫苗通常基于编码候选抗原例如CLDN18.2的多肽序列的细菌质粒。利用强大的真核启动子,一旦宿主接种了质粒,编码的抗原就可表达以产生足够的转基因表达水平(GalvinT.A.等人,Vaccine,2000年,第18卷:第2566-2583页)。现代DNA疫苗的生产依赖于DNA合成,可能一步克隆到质粒载体中,然后分离质粒,这大大减少了制造时间和成本。所得的质粒DNA在室温下也是高度稳定的,避免了低温运输并导致保质期大大延长。这些技术在本领域中是标准的。
另选地,可将编码感兴趣的抗原例如CLDN18.2的核酸序列以合成方式引入到mRNA分子中。然后将mRNA递送到宿主动物中,该宿主动物的细胞将识别mRNA序列并将其翻译成候选抗原例如CLDN18.2的多肽序列,从而触发对外来抗原的免疫应答。mRNA抗原或mRNA疫苗的一种吸引人的特征是mRNA是非传染性、非整合平台。不存在与DNA疫苗相关的感染或插入诱变的潜在风险。此外,mRNA会被正常的细胞过程降解,并且通过修改设计和递送方法具有可控的体内半衰期(Kariko,K.等人,Mol Ther,第16卷:第1833-1840页(2008年);Kauffman,K.J.等人,J Control Release,第240卷,第227-234页(2016年);Guan,S.&Rosenecker,J.,Gene Ther,第24卷,第133-143页(2017年);Thess,A.等人,Mol Ther,第23卷,第1456-1464页(2015年))。这些技术在本领域中是标准的。
在描述本技术时,可将免疫应答描述为“初次”或“二次”免疫应答。初次免疫应答也被描述为“保护性”免疫应答,是指由于一定程度初始暴露(例如,初始“免疫接种”或“免疫引发”)于特定抗原例如CLDN18.2蛋白质而在个体中产生的免疫应答。在一些实施方案中,免疫可作为用含有抗原的疫苗接种个体的结果而发生。例如,疫苗可以是包含一种或多种CLDN18.2蛋白质衍生抗原的CLDN18.2疫苗。初次免疫应答可随着时间的推移而减弱或衰减,甚至可消失或至少减弱到无法检测到的程度。因此,本技术还涉及“二次”免疫应答,其在本文中也被描述为“记忆免疫应答”。术语二次免疫应答是指在已经产生初次免疫应答之后在个体中引发的免疫应答。
因此,引发二次免疫应答,例如可以增强已经减弱或衰减的现有免疫应答(例如,免疫加强剂量),或重建已经消失或不再能被检测到的先前免疫应答。二次或记忆免疫应答可以是体液(抗体)应答或细胞应答。二次或记忆体液应答在刺激记忆B细胞时发生,该记忆细胞是在抗原的第一次呈递时产生的。迟发型超敏(DTH)反应是一种由CD4+T细胞介导的细胞二次或记忆免疫应答。第一次暴露于抗原会触发免疫系统,再次暴露会导致DTH。
在适当的免疫后,可从受试者的血清中制备抗CLDN18.2抗体。如果需要,可从哺乳动物(例如,从血液)中分离针对CLDN18.2蛋白质的抗体分子,并通过众所周知的技术诸如多肽A色谱法进一步纯化以获得IgG级分。
单克隆抗体。在本技术的一个实施方案中,抗体是抗CLDN18.2单克隆抗体。例如,在一些实施方案中,抗CLDN18.2单克隆抗体可以是人或小鼠抗CLDN18.2单克隆抗体。为了制备针对CLDN18.2蛋白质或其衍生物、片段、类似物或同源物的单克隆抗体,可使用通过连续细胞系培养产生抗体分子的任何技术。此类技术包括但不限于杂交瘤技术(参见,例如,Kohler&Milstein,1975年,Nature,第256卷:第495-497页);三源杂交瘤技术;人B细胞杂交瘤技术(参见,例如,Kozbor等人,1983年,Immunol.Today,第4卷:第72页)和EBV杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(参见,例如,Cole等人,1985年,于:MONOCLONAL ANTIBODIES ANDCANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,第77-96页)。人单克隆抗体可用于本技术的实践中,并且可通过使用人杂交瘤(参见,例如,Cote等人,1983年,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第80卷:第2026-2030页)或通过用EB病毒体外转化人B细胞(参见,例如,Cole等人,1985年,于:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,第77-96页)来产生。例如,可分离编码抗体区域的核酸群体。利用源自编码抗体保守区的序列的引物的PCR被用于从群体中扩增编码抗体部分的序列,然后从扩增的序列重建编码抗体或其片段诸如可变结构域的DNA。此类扩增序列也可与编码其他蛋白质-(例如噬菌体外壳或细菌细胞表面蛋白质)的-DNA融合,以在噬菌体或细菌上表达和展示融合多肽。然后扩增序列可表达并进一步例如基于表达的抗体或其片段对存在于CLDN18.2蛋白质上的抗原或表位的亲和力来选择或分离。另选地,表达抗CLDN18.2单克隆抗体的杂交瘤可通过免疫受试者,然后使用常规方法从受试者的脾脏分离杂交瘤来制备。参见,例如,Milstein等人(Galfre和Milstein,Methods Enzymol(1981年),第73卷:第3-46页)。使用标准方法筛选杂交瘤将产生具有不同特异性(即针对不同表位)和亲和力的单克隆抗体。具有期望的特性(例如,CLDN18.2结合)的选定单克隆抗体可在被杂交瘤表达时使用,它可与分子诸如聚乙二醇(PEG)结合以改变特性,或者可以各种方式分离、测序和操作编码它的cDNA。可将合成树枝状树添加到反应性氨基酸侧链例如赖氨酸,以增强CLDN18.2蛋白质的免疫原性。此外,可使用CPG-二核苷酸技术来增强CLDN18.2蛋白质的免疫原性。其他操作包括取代或缺失导致抗体在储存期间或施用于受试者后不稳定的特定氨基酰基残基,以及亲和力成熟技术以提高抗体对CLDN18.2蛋白质的亲和力。
杂交瘤技术。在一些实施方案中,本技术的抗体是由杂交瘤产生的抗CLDN18.2单克隆抗体,该杂交瘤包括获自转基因非人动物(例如,转基因小鼠)的B细胞,该转基因非人动物的基因组包含人重链转基因和融合到永生化细胞的轻链转基因。杂交瘤技术包括本领域已知的和Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY,第349页(1988年);Hammerling等人,MonoclonalAntibodies And T-Cell Hybridomas,第563-681页(1981年)中教导的技术。用于产生杂交瘤和单克隆抗体的其他方法是本领域技术人员众所周知的。
噬菌体展示技术。如上所述,本技术的抗体可通过应用重组DNA和噬菌体展示技术来产生。例如,可使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来制备抗CLDN18.2抗体。在噬菌体展示方法中,功能性抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。具有期望的结合特性的噬菌体是通过直接用抗原(通常是结合或捕获到固体表面或珠粒的抗原)选择,从组库或组合抗体文库(例如,人或鼠)中选择的。这些方法中使用的噬菌体通常是包含具有Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域的fd和M13的丝状噬菌体,这些抗体结构域与噬菌体基因III或基因VIII蛋白质重组融合。此外,方法可适用于构建Fab表达文库(参见,例如,Huse等人,Science,第246卷:第1275-1281页,1989年),以允许快速且有效地鉴定对CLDN18.2多肽例如多肽或其衍生物、片段、类似物或同源物具有期望的特异性的单克隆Fab片段。可用于制备本技术的抗体的噬菌体展示方法的其他示例包括在以下中公开的那些示例:Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,第85卷:第5879-5883页,1988年;Chaudhary等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,第87卷:第1066-1070页,1990年;Brinkman等人,J.Immunol.Methods,第182卷:第41-50页,1995年;Ames等人,J.Immunol.Methods,第184卷:第177-186页,1995年;Kettleborough等人,Eur.J.Immunol.,第24卷:第952-958页,1994年;Persic等人,Gene,第187卷:第9-18页,1997年;Burton等人,Advances in Immunology,第57卷:第191-280页,1994年;PCT/GB91/01134;WO 90/02809;WO 91/10737;WO 92/01047;WO 92/18619;WO 93/11236;WO 95/15982;WO 95/20401;WO 96/06213;WO 92/01047(Medical Research Council等人);WO97/08320(Morphosys);WO 92/01047(CAT/MRC);WO 91/17271(Affymax);以及美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727和5,733,743。Lohning的美国专利号6,753,136已经描述了可用于通过经由二硫键连接多肽,在噬菌体颗粒表面上展示多肽的方法。如以上参考文献中所述,在噬菌体选择后,可从噬菌体中分离抗体编码区,这些抗体编码区用于产生完整抗体(包括人抗体或任何其他期望的抗原结合片段),并在任何期望的宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中表达。例如,也可采用使用本领域已知的方法,诸如WO 92/22324;Mullinax等人,BioTechniques,第12卷:第864-869页,1992年;和Sawai等人,AJRI,第34卷:第26-34页,1995年;以及Better等人,Science,第240卷:第1041-1043页,1988年中公开的那些方法重组产生Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术。
通常,可针对适当的抗原选择克隆到展示载体中的杂合抗体或杂合抗体片段,以便鉴定保持良好结合活性的变体,因为抗体或抗体片段将存在于噬菌体或噬菌粒颗粒的表面上。参见,例如,Barbas III等人,Phage Display,A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001年)。然而,其他载体形式可用于此过程,诸如将抗体片段文库克隆到裂解噬菌体载体(修饰的T7或λZap系统)中进行选择和/或筛选。
重组抗CLDN18.2抗体的表达。如上所述,本技术的抗体可通过应用重组DNA技术来产生。编码本技术的抗CLDN18.2抗体的重组多核苷酸构建体通常包含可操作地连接到抗CLDN18.2抗体链的编码序列的表达控制序列,包括天然相关或异源启动子区。因此,本技术的另一个方面包括载体,该载体含有编码本技术的抗CLDN18.2抗体的一条或多条核酸序列。对于本技术的多肽中的一种或多种多肽的重组表达,通过本领域众所周知并如下文详述的重组DNA技术将含有编码抗CLDN18.2抗体的全部或一部分核苷酸序列的核酸插入合适的克隆载体或表达载体(即,含有用于转录和翻译所插入的多肽编码序列所必需的元件的载体)中。Lerner等人的美国专利号6,291,160和6,680,192中已经描述了用于产生不同载体群体的方法。
一般来讲,可用于重组DNA技术的表达载体通常为质粒形式。在本公开中,“质粒”和“载体”可互换使用,因为质粒是最常用的载体形式。然而,本技术旨在包括具有等同功能的技术上不是质粒的此类其他形式的表达载体,诸如病毒载体(例如,复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。此类病毒载体允许感染受试者并在该受试者中表达构建体。在一些实施方案中,表达控制序列是载体中能够转化或转染真核宿主细胞的真核启动子系统。一旦载体已经被掺入合适的宿主中,就将宿主保持在适合编码抗CLDN18.2抗体的核苷酸序列的高水平表达以及抗CLDN18.2抗体(例如,交叉反应抗CLDN18.2抗体)的收集和纯化的条件下。一般参见,U.S.2002/0199213。这些表达载体通常可作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分在宿主生物体中复制。通常,表达载体含有选择标记(例如,氨苄青霉素抗性或潮霉素抗性),以允许检测那些用期望的DNA序列转化的细胞。载体也可编码可用于引导胞外抗体片段的分泌的信号肽,例如果胶裂解酶。参见美国专利号5,576,195。
本技术的重组表达载体包含编码具有CLDN18.2结合特性的蛋白质的核酸,该重组表达载体的形式适合于核酸在宿主细胞中的表达,这意味着重组表达载体包含可操作地连接到待表达的核酸序列的基于待用于表达的宿主细胞选择的一条或多条调节序列。在重组表达载体内,“可操作地连接”旨在意指感兴趣的核苷酸序列以允许核苷酸序列(例如,在体外转录/翻译系统中或当载体被引入宿主细胞时在宿主细胞中)表达的方式连接到调节序列。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如,聚腺苷酸化信号)。此类调节序列在例如Goeddel,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS INENZYMOLOGY,第185卷,Academic Press,San Diego,Calif.(1990年)中有所描述。调节序列包括引导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成型表达的那些调节序列和引导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中表达的那些调节序列(例如,组织特异性调节序列)。本领域的技术人员应当理解,表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需多肽的表达水平等因素。可用作重组多肽(例如,抗CLDN18.2抗体)表达的启动子的典型调节序列包括例如但不限于3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶的启动子。诱导型酵母启动子包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶等的启动子。在一个实施方案中,编码本技术的抗CLDN18.2抗体的多核苷酸可操作地连接到ara B启动子并且可在宿主细胞中表达。参见美国专利号5,028,530。可将本技术的表达载体引入宿主细胞中,从而产生由本文所述的核酸编码的多肽或肽,包括融合多肽(例如,抗CLDN18.2抗体等)。
本技术的另一个方面涉及表达抗CLDN18.2抗体的宿主细胞,这些宿主细胞含有编码一种或多种抗CLDN18.2抗体的核酸。本技术的重组表达载体可被设计用于在原核或真核细胞中表达抗CLDN18.2抗体。例如,抗CLDN18.2抗体可在细菌细胞诸如大肠杆菌、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、真菌细胞例如酵母、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在Goeddel,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY,第185卷,Academic Press,San Diego,Calif.(1990年)中有进一步讨论。另选地,可例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶,在体外转录和翻译重组表达载体。先前已经描述了经由随机产生的多核苷酸序列的表达,可用于制备和筛选具有预定特性的多肽(例如抗CLDN18.2抗体)的方法。参见美国专利号5,763,192;5,723,323;5,814,476;5,817,483;5,824,514;5,976,862;6,492,107;6,569,641。
多肽在原核生物中的表达最常在大肠杆菌中进行,其中含有组成型或诱导型启动子的载体引导融合或非融合多肽的表达。融合载体将许多氨基酸添加到其中编码的多肽中,通常添加到重组多肽的氨基末端。此类融合载体通常起到三个目的:(i)增加重组多肽的表达;(ii)增加重组蛋白的溶解度;并且(iii)通过在亲和纯化中充当配体来有助于重组多肽的纯化。通常,在融合表达载体中,在融合部分与重组多肽的接合处引入蛋白水解切割位点,以在融合多肽纯化之后使重组多肽与融合部分分离。此类酶及其同源识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合多肽或多肽A融合到靶重组多肽的pGEX(Pharmacia Biotech Inc;Smith和Johnson,1988年,Gene,第67卷:第31-40页)、pMAL(New England Biolabs,Beverly,Mass.)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,N.J.)。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的示例包括pTrc(Amrann等人(1988年),Gene,第69卷:第301-315页)和pET 11d(Studier等人,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY,第185卷,Academic Press,San Diego,Calif.(1990年),第60-89页)。Pack等人的美国专利号6,294,353;6,692,935已经描述了用于经由多肽融合靶向组装不同活性肽或蛋白质结构域以产生多功能多肽的方法。一种最大程度增强大肠杆菌中重组多肽例如抗CLDN18.2抗体的表达的策略是在宿主细菌中表达蛋白水解切割重组多肽的能力受损的多肽。参见,例如,Gottesman,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS INENZYMOLOGY,第185卷,Academic Press,San Diego,Calif.(1990年),第119-128页。另一种策略是改变待插入表达载体中的核酸的核酸序列,使得每个氨基酸的各个密码子是在表达宿主例如大肠杆菌中优先利用的密码子(参见,例如,Wada等人,1992年,Nucl.Acids Res.,第20卷:第2111-2118页)。本技术的核酸序列的这种改变可通过标准DNA合成技术进行。
在另一个实施方案中,抗CLDN18.2抗体表达载体是酵母表达载体。用于在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的载体的示例包括pYepSec1(Baldari等人,1987年,EMBO J.,第6卷:第229-234页)、pMFa(Kurjan和Herskowitz,Cell,第30卷:第933-943页,1982年)、pJRY88(Schultz等人,Gene,第54卷:第113-123页,1987年)、pYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,Calif.)和picZ(Invitrogen Corp,San Diego,Calif.)。另选地,可使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达抗CLDN18.2抗体。可用于在培养的昆虫细胞(例如,SF9细胞)中表达多肽(例如抗CLDN18.2抗体)的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人,Mol.Cell.Biol.,第3卷:第2156-2165页,1983年)和pVL系列(Lucklow和Summers,1989年,Virology,第170卷:第31-39页)。
在又一个实施方案中,编码本技术的抗CLDN18.2抗体的核酸使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的示例包括例如但不限于pCDM8(Seed,Nature,第329卷:第840页,1987年)和pMT2PC(Kaufman等人,EMBO J.,第6卷:第187-195页,1987年)。当用于哺乳动物细胞时,表达载体的控制功能通常由病毒调节元件提供。例如,常用的启动子源自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。针对可用于表达本技术的抗CLDN18.2抗体的原核和真核细胞两者的其他合适的表达系统参见,例如,Sambrook等人,第16和17章,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第2版,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989年。
在另一个实施方案中,重组哺乳动物表达载体能够引导核酸在特定细胞类型(例如,组织特异性调节元件)中的表达。组织特异性调节元件是本领域已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性示例包括白蛋白启动子(肝脏特异性;Pinkert等人,Genes Dev.,第1卷:第268-277页,1987年)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton,Adv.Immunol.,第43卷:第235-275页,1988年)、T细胞受体的启动子(Winoto和Baltimore,EMBO J.,第8卷:第729-733页,1989年)和免疫球蛋白(Banerji等人,1983年,Cell,第33卷:第729-740页;Queen和Baltimore,Cell,第33卷:第741-748页,1983年)、神经元特异性启动子(例如,神经丝启动子;Byrne和Ruddle,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第86卷:第5473-5477页,1989年)、胰腺特异性启动子(Edlund等人,1985年,Science,第230卷:第912-916页)和乳腺特异性启动子(例如,乳清启动子;美国专利号4,873,316和欧洲申请公布号264,166)。发育调节启动子也包括在内,例如,鼠hox启动子(Kessel和Gruss,Science,第249卷:第374-379页,1990年)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman,Genes Dev.,第3卷:第537-546页,1989年)。
本方法的另一个方面涉及宿主细胞,这些宿主细胞中已引入本技术的重组表达载体。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应当理解,此类术语不仅指特定的主题细胞,而且还指此类细胞的子代或潜在子代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而发生在后代中,所以此类后代实际上可能与亲本细胞不相同,但仍包括在本文所用术语的范围内。
宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如,抗CLDN18.2抗体可在细菌细胞诸如大肠杆菌、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞中表达。哺乳动物细胞是适用于表达编码免疫球蛋白或其片段的核苷酸片段的宿主。参见,Winnacker,From Genes To Clones(VCHPublishers,NY,1987年)。本领域已经开发了许多能够分泌完整异源蛋白质的合适宿主细胞系,包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、L细胞和骨髓瘤细胞系。在一些实施方案中,细胞是非人细胞。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列,诸如复制起点、启动子、增强子和必要的处理信息位点,诸如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。Queen等人,Immunol.Rev.,第89卷:第49页,1986年。说明性表达控制序列是源自内源基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。Co等人,J Immunol,第148卷:第1149页,1992年。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
载体DNA可经由常规转化或转染技术引入原核或真核细胞中。如本文所用,术语“转化”和“转染”旨在指用于将外源核酸(例如,DNA)引入宿主细胞中的多种本领域公认的技术,包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染、电穿孔、生物射弹或基于病毒的转染。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(一般参见Sambrook等人,Molecular Cloning)。适用于转化或转染宿主细胞的方法可见于Sambrook等人(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,1989年)和其他实验室手册。可根据细胞宿主的类型,通过众所周知的方法将含有感兴趣的DNA片段的载体转移到宿主细胞中。
合适载体的非限制性示例包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于两者的那些载体。例如,克隆载体可选自pUC系列、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,Calif.)、pET系列(Novagen,Madison,Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)和pEX系列(Clontech,Palo Alto,Calif.)。也可使用噬菌体载体,诸如λ-GT10、λ-GT11、λ-ZapII(Stratagene)、λ-EMBL4和λ-NM1149。植物表达载体的非限制性示例包括pBI110、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的非限制性示例包括pEUK-C1、pMAM和pMAMneo(Clontech)。TOPO克隆系统(Invitrogen,Calsbad,CA)也可按照制造商的推荐使用。
在某些实施方案中,载体是哺乳动物载体。在某些实施方案中,哺乳动物载体含有至少一个启动子元件(其介导mRNA转录的起始)、抗体编码序列以及转录物的转录终止和聚腺苷酸化所需的信号。在某些实施方案中,哺乳动物载体含有另外的元件,诸如例如增强子、Kozak序列和侧接用于RNA剪接的供体和受体位点的间插序列。在某些实施方案中,可利用例如来自SV40的早期和晚期启动子、来自逆转录病毒(例如RSV、HTLVI、HIVI)的长末端重复序列(LTRS)和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子来实现高效转录。也可使用细胞元件(例如,人肌动蛋白启动子)。哺乳动物表达载体的非限制性示例包括载体,诸如pIRESlneo、pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN或pLNCX(Clonetech Labs,Palo Alto,Calif.),pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen,Calsbad,CA),PSVL和PMSG(Pharmacia,Uppsala,Sweden),pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC 67109)。可与此类哺乳动物载体组合使用的哺乳动物宿主细胞的非限制性示例包括人Hela 293、HEK 293、H9和Jurkat细胞,小鼠3T3、NIH3T3和C127细胞,Cos 1、Cos 7和CV 1,quail QC1-3细胞,小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在某些实施方案中,载体是病毒载体,例如逆转录病毒载体、基于细小病毒的载体(例如,基于腺相关病毒(AAV)的载体、AAV-腺病毒嵌合载体和基于腺病毒的载体)以及慢病毒载体(诸如基于单纯疱疹病毒(HSV)的载体)。在某些实施方案中,对病毒载体进行操作以使病毒复制不足。在某些实施方案中,对病毒载体进行操作以消除对宿主的毒性。这些病毒载体可使用例如Sambrook等人,Molecular Cloning,a Laboratory Manual,第2版,ColdSpring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989年);以及Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates和John Wiley&Sons,New York,N.Y.(1994年)中描述的标准重组DNA技术来制备。
在某些实施方案中,可通过常规技术将本文所述的载体或多核苷酸转移到细胞(例如,离体细胞),并且可通过常规技术培养所得细胞以产生本文所述的抗CLDN18.2抗体或抗原结合片段。因此,本文提供了细胞,这些细胞包含编码抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段并可操作地连接到用于在宿主细胞中表达此类序列的调节表达元件(例如,启动子)的多核苷酸。在某些实施方案中,编码可操作地连接到启动子的重链的载体和编码可操作地连接到启动子的轻链的载体可在细胞中共表达以表达整个抗CLDN18.2抗体或抗原结合片段。在某些实施方案中,细胞包含载体,该载体包含编码可操作地连接到启动子的本文所述的抗CLDN18.2抗体或抗原结合片段的重链和轻链两者的多核苷酸。在某些实施方案中,细胞包含两种不同的载体,第一载体包含编码可操作地连接到启动子的重链的多核苷酸,并且第二载体包含编码可操作地连接到启动子的轻链的多核苷酸。在某些实施方案中,第一细胞包含第一载体,该第一载体包含编码本文所述的抗CLDN18.2抗体或抗原结合片段的重链的多核苷酸,并且第二细胞包含第二载体,该第二载体包含编码本文所述的抗CLDN18.2抗体或抗原结合片段的轻链的多核苷酸。在某些实施方案中,本文提供了包含所述第一细胞和所述第二细胞的细胞混合物。细胞的示例包括但不限于人细胞、人细胞系、大肠杆菌(例如,大肠杆菌TB-1、TG-2、DH5a、XL-Blue MRF'(Stratagene)、SA2821和Y1090)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、绿脓杆菌(P.aerugenosa)、啤酒酵母(S.cerevisiae)、尖顶羊肚菌(N.crassa)、昆虫细胞(例如,Sf9、Ea4)等。
对于哺乳动物细胞的稳定转染,众所周知,根据所用的表达载体和转染技术,只有一小部分细胞可将外源DNA整合到它们的基因组中。为了鉴定和选择这些整合体,通常将编码可选择标记(例如,抗生素抗性)的基因连同感兴趣的基因一起引入宿主细胞中。各种可选择标记包括那些赋予药物抗性的标记,诸如G418、潮霉素和甲氨蝶呤。编码可选择标记的核酸可在与编码抗CLDN18.2抗体的核酸相同的载体上引入宿主细胞中,或者可在单独的载体上引入。可通过药物选择来鉴定用所引入的核酸稳定转染的细胞(例如,已经掺入可选择标记基因的细胞将存活,而其他细胞死亡)。
包含本技术的抗CLDN18.2抗体的宿主细胞,诸如培养的原核或真核宿主细胞可用于产生(即,表达)重组抗CLDN18.2抗体。在一个实施方案中,该方法包括在合适的培养基中培养宿主细胞(其中已引入编码抗CLDN18.2抗体的重组表达载体),从而产生抗CLDN18.2抗体。在另一个实施方案中,该方法还包括从培养基或宿主细胞中分离抗CLDN18.2抗体的步骤。一旦表达,就从培养基和宿主细胞中纯化抗CLDN18.2抗体的集合,例如,抗CLDN18.2抗体或抗CLDN18.2抗体相关多肽。抗CLDN18.2抗体可根据本领域的标准程序(包括HPLC纯化、柱层析、凝胶电泳等)纯化。在一个实施方案中,抗CLDN18.2抗体通过Boss等人的美国专利号4,816,397的方法在宿主生物体中产生。通常,抗CLDN18.2抗体链与信号序列一起表达,因此被释放到培养基中。然而,如果抗CLDN18.2抗体链不由宿主细胞自然分泌,则可通过用温和的洗涤剂处理来释放抗CLDN18.2抗体链。重组多肽的纯化是本领域众所周知的,包括硫酸铵沉淀、亲和层析纯化技术、柱层析、离子交换纯化技术、凝胶电泳等(一般参见,Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,1982年)。
编码抗CLDN18.2抗体的多核苷酸,例如抗CLDN18.2抗体编码序列可掺入转基因中以引入转基因动物的基因组中并随后在转基因动物的乳汁中表达。参见,例如,美国专利号5,741,957、5,304,489和5,849,992。合适的转基因包括用于与来自乳腺特异性基因(诸如酪蛋白或β-乳球蛋白)的启动子和增强子可操作地连接的轻链和/或重链的编码序列。为了产生转基因动物,可将转基因显微注射到受精卵母细胞中,或者可将其掺入胚胎干细胞的基因组中,并将此类细胞的细胞核转移到无核卵母细胞中。
单链抗体。在一个实施方案中,本技术的抗CLDN18.2抗体为单链抗CLDN18.2抗体。根据本技术,技术可适用于产生对CLDN18.2蛋白质具有特异性的单链抗体(参见,例如,美国专利号4,946,778)。可用于产生本技术的单链Fv和抗体的技术的示例包括美国专利号4,946,778和5,258,498;Huston等人,Methods in Enzymology,第203卷:第46-88页,1991年;Shu,L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第90卷:第7995-7999页,1993年;以及Skerra等人,Science,第240卷:第1038-1040页,1988年中描述的那些。
嵌合抗体和人源化抗体。在一个实施方案中,本技术的抗CLDN18.2抗体是嵌合抗CLDN18.2抗体。在一个实施方案中,本技术的抗CLDN18.2抗体是人源化抗CLDN18.2抗体。在本技术的一个实施方案中,供体和受体抗体是来自不同物种的单克隆抗体。例如,受体抗体是人抗体(以最大程度降低其在人体内的抗原性),在这种情况下,所得的CDR移植抗体被称为“人源化”抗体。
包含人和非人部分两者的重组抗CLDN18.2抗体,诸如嵌合和人源化单克隆抗体可使用标准重组DNA技术制备,并且在本技术的范围内。对于一些用途,包括本技术的抗CLDN18.2抗体在人体中的体内使用以及这些药剂在体外检测测定中的使用,可使用嵌合或人源化抗CLDN18.2抗体。此类嵌合和人源化单克隆抗体可通过本领域已知的重组DNA技术产生。此类可用的方法包括例如但不限于以下中描述的方法:国际申请号PCT/US86/02269;美国专利号5,225,539;欧洲专利号184187;欧洲专利号171496;欧洲专利号173494;PCT国际公布号WO 86/01533;美国专利号4,816,567;5,225,539;欧洲专利号125023;Better等人,1988年,Science,第240卷:第1041-1043页;Liu等人,1987年,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第84卷:第3439-3443页;Liu等人,1987年,J.Immunol.,第139卷:第3521-3526页;Sun等人,1987年,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第84卷:第214-218页;Nishimura等人,1987年,Cancer Res.,第47卷:第999-1005页;Wood等人,1985年,Nature,第314卷:第446-449页;Shaw等人,1988年,J.Natl.Cancer Inst.,第80卷:第1553-1559页;Morrison(1985年),Science,第229卷:第1202-1207页;Oi等人(1986年),BioTechniques,第4卷:第214页;Jones等人,1986年,Nature,第321卷:第552-525页;Verhoeyan等人,1988年,Science,第239卷:第1534页;Morrison,Science,第229卷:第1202页,1985年;Oi等人,BioTechniques,第4卷:第214页,1986年;Gillies等人,J.Immunol.Methods,第125卷:第191-202页,1989年;美国专利号5,807,715;以及Beidler等人,1988年,J.Immunol.,第141卷:第4053-4060页。例如,抗体可使用多种技术进行人源化,这些技术包括CDR移植(EP 0239 400;WO 91/09967;美国专利号5,530,101;5,585,089;5,859,205;6,248,516;EP460167)、饰面或表面重建(EP 0 592 106;EP 0 519 596;Padlan E.A.,MolecularImmunology,第28卷:第489-498页,1991年;Studnicka等人,Protein Engineering,第7卷:第805-814页,1994年;Roguska等人,PNAS,第91卷:第969-973页,1994年)和链改组(美国专利号5,565,332)。在一个实施方案中,编码鼠抗CLDN18.2单克隆抗体的cDNA用专门选择的限制酶消化,以去除编码Fc恒定区的序列,并用编码人Fc恒定区的cDNA的等效部分取代(参见,Robinson等人,PCT/US86/02269;Akira等人,欧洲专利申请184,187;Taniguchi,欧洲专利申请171,496;Morrison等人,欧洲专利申请173,494;Neuberger等人,WO 86/01533;Cabilly等人,美国专利号4,816,567;Cabilly等人,欧洲专利申请125,023;Better等人(1988年),Science,第240卷:第1041-1043页;Liu等人(1987年),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第84卷:第3439-3443页;Liu等人(1987年),J Immunol,第139卷:第3521-3526页;Sun等人(1987年),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第84卷:第214-218页;Nishimura等人(1987年),Cancer Res,第47卷:第999-1005页;Wood等人,(1985年),Nature,第314卷:第446-449页;以及Shaw等人,(1988年),J.Natl.Cancer Inst.,第80卷:第1553-1559页;美国专利号6,180,370;美国专利号6,300,064;6,696,248;6,706,484;6,828,422。
在一个实施方案中,本技术提供了人源化抗CLDN18.2抗体的构建,这些抗体不太可能诱导人抗小鼠抗体(下文称为“HAMA”)应答,同时仍具有有效的抗体效应子功能。如本文所用,与抗体相关的术语“人”和“人源化”涉及预期在人受试者中引发治疗上可耐受的弱免疫原性应答的任何抗体。在一个实施方案中,本技术提供了人源化抗CLDN18.2抗体、重链和轻链免疫球蛋白。
CDR抗体。在一些实施方案中,本技术的抗CLDN18.2抗体是抗CLDN18.2 CDR抗体。通常,用于产生抗CLDN18.2 CDR抗体的供体和受体抗体是来自不同物种的单克隆抗体;通常受体抗体是人抗体(以最大程度降低其在人体内的抗原性),在这种情况下,所得的CDR移植抗体被称为“人源化”抗体。移植物可以是受体抗体的单个VH或VL内的单个CDR(或甚至单个CDR的一部分),或者可以是VH和VL中的一者或两者内的多个CDR(或其部分)。通常,受体抗体的所有可变结构域中的所有三个CDR都将被相应的供体CDR替换,但是只需要替换必要的数量以允许所得的CDR移植抗体与CLDN18.2蛋白质充分结合。Queen等人的美国专利号5,585,089;美国专利号5,693,761;美国专利号5,693,762和Winter的美国专利号5,225,539和EP 0682040教导了用于产生CDR移植和人源化抗体的方法。Winter等人的美国专利号4,816,397;6,291,158;6,291,159;6,291,161;6,545,142;EP 0368684;EP0451216和EP0120694教导了可用于制备VH和VL多肽的方法。
在从同一家族和/或同一家族成员中选择合适的框架区候选物后,通过将来自起源物种的CDR移植到杂合框架区中来产生重链和轻链可变区中的任一者或两者。可使用本领域技术人员已知的常规方法来完成关于上述方面中任一方面的具有杂合可变链区的杂合抗体或杂合抗体片段的组装。例如,可通过寡核苷酸合成和/或PCR产生编码本文所述的杂合可变结构域的DNA序列(即,基于目标物种的框架和来自起源物种的CDR)。编码CDR区的核酸也可使用合适的限制酶从起源物种抗体中分离,并通过用合适的连接酶连接而连接到目标物种框架中。另选地,可通过定点诱变改变起源物种抗体的可变链的框架区。
由于杂合体是由对应于每个框架区的多个候选物选择构建的,因此存在可以根据本文所述的原理构建的许多序列组合。因此,可组装杂合体文库,其成员具有各个框架区的不同组合。此类文库可以是序列的电子数据库集合或杂合体的物理集合。
该过程通常不改变受体抗体侧接所移植的CDR的FR。然而,本领域技术人员有时可通过替换给定FR的某些残基以使FR与供体抗体的相应FR更相似来提高所得抗CLDN18.2CDR移植抗体的抗原结合亲和力。合适的取代位置包括与CDR相邻或能够与CDR相互作用的氨基酸残基(参见,例如US 5,585,089,尤其是第12-16列)。或者,本领域技术人员可从供体FR开始并将其修饰为更类似于受体FR或人共有FR。用于进行这些修饰的技术是本领域已知的。具体地,如果所得的FR符合该位置的人共有FR,或者与此类共有FR具有至少90%或更大的同一性,则与具有完全人FR的相同抗体相比,这样做可能不会显著增加所得修饰的抗CLDN18.2CDR移植抗体的抗原性。
双特异性抗体(BsAb)。双特异性抗体是可同时结合到具有不同结构的两个靶标的抗体,例如,两个不同的靶抗原、同一靶抗原上的两个不同表位或者半抗原和靶抗原或靶抗原上的表位。例如,BsAb可通过组合识别相同或不同抗原的不同表位的重链和/或轻链来制备。在一些实施方案中,双特异性结合剂通过分子功能在其两个结合臂中的一个结合臂(一个VH/VL对)上结合一个抗原(或表位),并在其第二臂(不同的VH/VL对)上结合不同的抗原(或表位)。根据这个定义,双特异性结合剂具有两个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列两者中),并且对于其结合的每个抗原都是单价的。
多特异性抗体诸如双特异性抗体(BsAb)和双特异性抗体片段(BsFab)具有与例如CLDN18.2特异性结合的至少一个臂和与第二靶抗原特异性结合的至少一个其他臂。在一些实施方案中,第二靶抗原是B细胞、T细胞、骨髓细胞、浆细胞或肥大细胞的抗原或表位。除此之外或另选地,在某些实施方案中,第二靶抗原选自CD3、CD4、CD8、CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、CD22、CD14、CD15、CD16、CD123、TCRγ/δ、NKp46和KIR。与第二靶抗原(例如,CD3)结合的示例性VH和VL序列示于图25中。在某些实施方案中,BsAb能够结合在细胞表面表达CLDN18.2抗原的肿瘤细胞。在一些实施方案中,BsAb已被工程改造为通过将细胞毒性T细胞引导(或募集)到肿瘤部位来促进肿瘤细胞的杀伤。其他示例性BsAb包括那些包含对CLDN18.2具有特异性的第一抗原结合位点和对小分子半抗原具有特异性的第二抗原结合位点的抗体(例如,DTP A、IMP288、DOTA、DOTA-Bn、DOTA-去铁胺、本文所述的其他DOTA螯合物、生物素、荧光素或Goodwin,D A.等人,1994年,Cancer Res.,第54卷第22期:第5937-5946页中公开的那些抗体)。
使用分子工程可产生多种双特异性融合蛋白质。例如,已经构建了利用完整免疫球蛋白框架(例如,IgG)、单链可变片段(scFv)或它们的组合的BsAb。在一些实施方案中,双特异性融合蛋白质是二价的,包含例如具有针对一种抗原的单个结合位点的scFv和具有针对第二种抗原的单个结合位点的Fab片段。在一些实施方案中,双特异性融合蛋白质是二价的,包含例如具有针对一种抗原的单个结合位点的scFv和具有针对第二种抗原的单个结合位点的另一个scFv片段。在其他实施方案中,双特异性融合蛋白质是四价的,包含例如具有针对一种抗原的两个结合位点和针对第二种抗原的两个相同scFv的免疫球蛋白(例如,IgG)。已证明由串联的两个scFv单元组成的BsAb是临床上成功的双特异性抗体形式。在一些实施方案中,BsAb包含串联的两个单链可变片段(scFv),这两个片段已被设计为使得结合肿瘤抗原(例如,CLDN18.2)的scFv(例如,通过结合CD3)与接合T细胞的scFv连接。以这种方式,T细胞被募集到肿瘤部位,使得它们可介导肿瘤细胞的细胞毒性杀伤。参见,例如,Dreier等人,J.Immunol.,第170卷:第4397-4402页(2003年);Bargou等人,Science,第321卷:第974-977页(2008年))。在一些实施方案中,本技术的BsAb包含串联的两个单链可变片段(scFv),这两个片段已被设计为使得结合肿瘤抗原(例如,CLDN18.2)的scFv与接合小分子DOTA半抗原的scFv连接。
最近用于产生BsAb的方法包括经工程改造的重组单克隆抗体,这些抗体具有另外的半胱氨酸残基,因此它们的交联比更常见的免疫球蛋白同种型更强。参见,例如,FitzGerald等人,Protein Eng.,第10卷第10期:第1221-1225页(1997年)。另一种方法是工程改造重组融合蛋白质,将具有所需双重特异性的两个或多个不同的单链抗体或抗体片段连接起来。参见,例如,Coloma等人,Nature Biotech,第15卷:第159-163页(1997年)。使用分子工程可产生多种双特异性融合蛋白质。
以类似方式产生连接两个或多个不同单链抗体或抗体片段的双特异性融合蛋白质。重组方法可用于产生多种融合蛋白质。在一些特定的实施方案中,根据本技术的BsAb包含免疫球蛋白和scFv,该免疫球蛋白包含重链和轻链。在一些特定的实施方案中,scFv连接到本文公开的任何CLDN18.2免疫球蛋白的重链的C末端。在一些特定的实施方案中,scFv连接到本文公开的任何CLDN18.2免疫球蛋白的轻链的C末端。在各种实施方案中,scFv经由接头序列连接到重链或轻链。通过PCR反应将重链Fd框内连接到scFv所需的适当接头序列引入VL和Vκ结构域。然后将编码scFv的DNA片段连接到含有编码CH1结构域的DNA序列的分期载体中。将所得的scFv-CH1构建体切下并连接到含有编码CLDN18.2抗体的VH区的DNA序列的载体中。所得载体可用于转染适当的宿主细胞,诸如哺乳动物细胞以表达双特异性融合蛋白质。
在一些实施方案中,接头的长度为至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个或更多个氨基酸。在一些实施方案中,接头的特征在于它倾向于不采用刚性三维结构,而是为多肽提供柔性(例如,第一和/或第二抗原结合位点)。在一些实施方案中,基于赋予BsAb的特定特性诸如例如稳定性的增加,在本文所述的BsAb中采用接头。在一些实施方案中,本技术的BsAb包含G4S接头。在一些特定的实施方案中,本技术的BsAb包含(G4S)n接头,其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1 1、12、13、14、15或更大。
Fc修饰。在一些实施方案中,本技术的抗CLDN18.2抗体包含Fc区变体,其中所述Fc区变体相对于野生型Fc区(或亲本Fc区)包含至少一个氨基酸修饰,使得所述分子对Fc受体(例如,FcγR)具有改变的亲和力,前提是基于由Sondermann等人,Nature,第406卷:第267-273页(2000年)公开的Fc-Fc受体相互作用的晶体学和结构分析,所述Fc区变体在与Fc受体直接接触的位置处不具有取代。Fc区内与Fc受体诸如FcγR直接接触的位置的示例包括氨基酸234-239(铰链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299(C7E环)和氨基酸327-332(F/G)环。
在一些实施方案中,本技术的抗CLDN18.2抗体对激活和/或抑制受体具有改变的亲和力,具有包含一个或多个氨基酸修饰的Fc变体区,其中所述一个或多个氨基酸修饰是用丙氨酸取代N297或用丙氨酸取代K322。除此之外或另选地,在一些实施方案中,本文公开的CLDN18.2抗体的Fc区包含两个氨基酸取代Leu234Ala和Leu235Ala(所谓的LALA突变)以消除FcγRIIa结合。LALA突变通常用于减弱来自T细胞的细胞因子诱导,从而降低抗体的毒性(Wines BD等人,J Immunol,第164卷:第5313-5318页(2000年))。
糖基化修饰。在一些实施方案中,本技术的抗CLDN18.2抗体具有与亲本Fc区相比具有糖基化变体的Fc区。在一些实施方案中,糖基化变体包括不存在岩藻糖;在一些实施方案中,糖基化变体由GnT1缺陷型CHO细胞中的表达引起。
在一些实施方案中,本技术的抗体相对于与感兴趣的抗原(例如,CLDN18.2)结合的适当参考抗体可具有修饰的糖基化位点,而不改变抗体的功能,例如,对抗原的结合活性。如本文所用,“糖基化位点”包括抗体中低聚糖(即,含有连接在一起的两个或多个单糖的碳水化合物)将特异性并共价连接的任何特定氨基酸序列。
低聚糖侧链通常经由N-或O-键与抗体的主链连接。N-连接的糖基化是指将低聚糖部分连接到天冬酰胺残基的侧链。O-连接的糖基化是指将低聚糖部分连接到羟基氨基酸,例如丝氨酸、苏氨酸。例如,缺乏某些低聚糖(包括岩藻糖和末端N-乙酰葡糖胺)的Fc-糖型(hCLDN18.2-IgGln)可能会在特殊的CHO细胞中产生,并表现出增强的ADCC效应子功能。
在一些实施方案中,本文公开的免疫球蛋白相关组合物的碳水化合物含量通过添加或缺失糖基化位点而改变。用于改变抗体的碳水化合物含量的方法是本领域众所周知的并且包括在本技术内,参见例如美国专利号6,218,149;EP 0359096B1;美国专利公布号US2002/0028486;国际专利申请公布WO 03/035835;美国专利公布号2003/0115614;美国专利号6,218,149;美国专利号6,472,511;所有这些专利全文均通过引用方式并入本文。在一些实施方案中,抗体(或其相关部分或组分)的碳水化合物含量通过缺失抗体的一个或多个内源性碳水化合物部分而改变。在一些特定的实施方案中,本技术包括通过将位置297由天冬酰胺改变为丙氨酸来缺失抗体的Fc区的糖基化位点。
经工程改造的糖型可用于多种目的,包括但不限于增强或降低效应子功能。经工程改造的糖型可通过本领域技术人员已知的任何方法产生,例如通过使用经工程改造的或变体表达菌株,通过与一种或多种酶例如N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII)共表达,通过表达在各种生物体或来自各种生物体的细胞系中包含Fc区的分子,或通过在包含Fc区的分子已经表达后改变碳水化合物。用于生成经工程改造的糖型的方法是本领域已知的,并且包括但不限于描述于:Umana等人,1999年,Nat.Biotechnol.,第17卷:第176-180页;Davies等人,2001年,Biotechnol.Bioeng.,第74卷:第288-294页;Shields等人,2002年,J.Biol.Chem.,第277卷:第26733-26740页;Shinkawa等人,2003年,J.Biol.Chem.,第278卷:第3466-3473页;美国专利号6,602,684;美国专利申请序列号10/277,370;美国专利申请序列号10/113,929;国际专利申请公布WO 00/61739A1;WO 01/292246A1;WO 02/311140A1;WO 02/30954A1中的那些;POTILLEGENTTM技术(Biowa,Inc.,Princeton,N.J.);GLYCOMABTM糖基化工程技术(GLYCART biotechnology AG,Zurich,Switzerland);这些专利中的每一篇全文均通过引用方式并入本文。参见,例如,国际专利申请公布WO 00/061739;美国专利申请公布号2003/0115614;Okazaki等人,2004年,JMB,第336卷:第1239-1249页。
融合蛋白质。在一个实施方案中,本技术的抗CLDN18.2抗体是融合蛋白质。本技术的抗CLDN18.2抗体在与第二蛋白质融合时可用作抗原标签。可与多肽融合的结构域的示例不仅包括异源信号序列,还包括其他异源功能区。融合不一定需要是直接的,也可通过接头序列发生。此外,本技术的融合蛋白质也可被工程改造以改善抗CLDN18.2抗体的特征。例如,可将另外的氨基酸,特别是带电荷的氨基酸的区域添加到抗CLDN18.2抗体的N-末端,以提高从宿主细胞中纯化期间或后续处理和储存过程中的稳定性和持久性。此外,可将肽部分添加到抗CLDN18.2抗体中以促进纯化。在最终制备抗CLDN18.2抗体之前,可去除此类区域。添加肽部分以促进多肽的处理是本领域熟知和常规的技术。本技术的抗CLDN18.2抗体可与标记序列诸如促进融合多肽纯化的肽融合。在选定的实施方案中,标记氨基酸序列是六组氨酸肽,诸如pQE载体(QIAGEN,Inc.,Chatsworth,Calif)中提供的标签等,其中许多序列是可商购获得的。例如,如Gentz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第86卷:第821-824页,1989年中所述,六组氨酸可以方便地纯化融合蛋白质。可用于纯化的另一种肽标签“HA”标签对应于源自流感血凝素蛋白质的表位。Wilson等人,Cell,第37卷:第767页,1984年。
因此,可使用本技术的多核苷酸或多肽来工程改造上述这些融合蛋白质中的任何融合蛋白质。此外,在一些实施方案中,本文所述的融合蛋白质显示出延长的体内半衰期。
与单独的单体分泌蛋白质或蛋白质片段相比,具有二硫键连接的二聚体结构(由于IgG)的融合蛋白质可更有效地结合和中和其他分子。Fountoulakis等人,J.Biochem.,第270卷:第3958-3964页,1995年。
类似地,EP-A-O 464 533(加拿大对应专利2045869)公开了融合蛋白质,该融合蛋白质包含免疫球蛋白分子的恒定区的各个部分连同另一种人蛋白质或其片段。在许多情况下,融合蛋白质中的Fc部分有利于疗法和诊断,因此可导致例如改善的药代动力学特性。参见EP-A 0232262。另选地,可能需要在已经表达、检测和纯化融合蛋白质之后缺失或修饰Fc部分。例如,如果融合蛋白质用作免疫的抗原,则Fc部分可阻碍疗法和诊断。在药物发现中,例如,为了高通量筛选测定以鉴定hIL-5的拮抗剂,已经将人蛋白质诸如hIL-5与Fc部分融合。Bennett等人,J.Molecular Recognition,第8卷:第52-58页,1995年;Johanson等人,J.Biol.Chem.,第270卷:第9459-9471页,1995年。
标记的抗CLDN18.2抗体。在一个实施方案中,本技术的抗CLDN18.2抗体与标记部分,即可检测基团偶联。与抗CLDN18.2抗体缀合的特定标记或可检测基团不是本技术的关键方面,只要它不显著干扰本技术的抗CLDN18.2抗体与CLDN18.2蛋白质的特异性结合即可。可检测基团可以是具有可检测的物理或化学特性的任何材料。此类可检测标记在免疫测定和成像领域得到很好的发展。一般而言,可用于此类方法的几乎任何标记均可应用于本技术。因此,标记是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方式检测的任何组合物。可用于实践本技术的标记包括磁珠(例如,DynabeadsTM)、荧光染料(例如,异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)、放射性标记(例如,3H、14C、35S、125I、121I、131I、112In、99mTc)、其他成像剂诸如微泡(用于超声成像)、18F、11C、15O、89Zr(用于正电子发射断层扫描)、99mTC、111In(用于单光子发射断层扫描)、酶(例如,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其他酶)和热量标记,诸如胶体金或有色玻璃或塑料(例如,聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。描述此类标签的使用的专利包括美国专利号3,817,837;3,850,752;3,939,350;3,996,345;4,277,437;4,275,149;和4,366,241,每一篇专利均全文以引用方式并入本文并用于所有目的。另外参见,Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals(第6版,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR.)。
根据本领域众所周知的方法,可将标记直接或间接偶联到测定的期望组分。如上所述,可使用多种标记,并且标记的选择取决于所需的灵敏度、与化合物缀合的难易程度、稳定性要求、可用的仪器和处置规定等因素。
非放射性标记通常通过间接方式连接。通常,配体分子(例如,生物素)与该分子共价键合。然后配体与抗配体(例如,链霉亲和素)分子结合,该抗配体分子本身可检测或与信号系统诸如可检测酶、荧光化合物或化学发光化合物共价键合。可使用多种配体和抗配体。当配体具有天然抗配体例如生物素、甲状腺素和皮质醇时,它可与标记的、天然存在的抗配体结合使用。另选地,任何半抗原或抗原化合物可与抗体例如抗CLDN18.2抗体组合使用。
分子也可例如通过与酶或荧光团缀合,直接与产生信号的化合物缀合。作为标记的感兴趣的酶主要是水解酶(特别是磷酸酶、酯酶和糖苷酶),或氧化还原酶(特别是过氧化物酶)。用作标记部分的荧光化合物包括但不限于例如荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮等。用作标记部分的化学发光化合物包括但不限于例如萤光素和2,3-二氢酞嗪二酮,例如鲁米诺。对于可使用的各种标记或信号产生系统的综述,参见美国专利号4,391,904。
检测标记的装置是本领域技术人员众所周知的。因此,例如,当标记是放射性标记时,用于检测的装置包括闪烁计数器或放射自显影术中的胶片。当标记是荧光标记时,可通过用适当波长的光激发荧光染料并检测所得的荧光来检测。通过使用电子检测器诸如电荷耦合器件(CCD)或光电倍增管等,可通过胶片目视检测荧光。类似地,可通过为酶提供适当的底物并检测所得的反应产物来检测酶标记。最后,简单的比色标记可简单地通过观察与标记相关的颜色来检测。因此,在各种油纸测定中,缀合的金通常呈粉色,而各种缀合的珠呈珠的颜色。
一些测定形式不需要使用标记的组分。例如,凝集测定可用于检测靶抗体,例如抗CLDN18.2抗体的存在。在这种情况下,抗原包被的颗粒被包含靶抗体的样品凝集。在这种形式中,不需要标记任何组分,并且通过简单的目视检查可检测靶抗体的存在。
B.鉴定和表征本技术的抗CLDN18.2抗体
用于鉴定和/或筛选本技术的抗CLDN18.2抗体的方法。可用于鉴定和筛选针对CLDN18.2多肽的抗体以得到对CLDN18.2蛋白质具有期望特异性的抗体(例如,与CLDN18.2蛋白质的第一胞外环结合的那些抗体,诸如包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽)的方法包括本领域内已知的任何免疫学介导的技术。可通过本领域普通技术人员众所周知的各种方法在体外检测免疫应答的组分。例如,(1)可将细胞毒性T淋巴细胞与放射性标记的靶细胞一起温育,并通过放射性释放来检测这些靶细胞的裂解;(2)可将辅助性T淋巴细胞与抗原和抗原呈递细胞一起温育,并通过标准方法测量细胞因子的合成和分泌(Windhagen A等人,Immunity,第2卷:第373-380页,1995年);(3)可将抗原呈递细胞与全蛋白质抗原一起温育,并通过T淋巴细胞激活测定或生物物理学方法检测该抗原在MHC上的呈递(Harding等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,第86卷:第4230-4234页,1989年);(4)可将肥大细胞与使其Fc-ε受体交联的试剂一起温育,并通过酶免疫测定法测量组胺释放(Siraganian等人,TIPS,第4卷:第432-437页,1983年);(5)酶联免疫吸附测定(ELISA)。
类似地,也可通过本领域普通技术人员众所周知的各种方法检测模型生物体(例如,小鼠)或人受试者中的免疫应答的产物。例如,(1)通过临床实验室目前使用的标准方法,例如ELISA可容易地检测响应于接种而产生的抗体;(2)免疫细胞向炎症部位的迁移可通过刮擦皮肤表面并放置无菌容器以捕获刮擦部位上的迁移细胞来检测(Peters等人,Blood,第72卷:第1310-1315页,1988年);(3)外周血单核细胞(PBMC)响应于促有丝分裂或混合淋巴细胞反应的增殖可使用3H-胸苷来测量;(4)PBMC中粒细胞、巨噬细胞和其他吞噬细胞的吞噬能力可通过将PBMC连同标记颗粒一起置于孔中来测量(Peters等人,Blood,第72卷:第1310-1315页,1988年);(5)免疫系统细胞的分化可通过用CD分子诸如CD4和CD8的抗体标记PBMC并测量表达这些标记的PBMC的分数来测量。
在一个实施方案中,本技术的抗CLDN18.2抗体是使用CLDN18.2肽在可复制基因包表面上的展示来选择的。参见,例如,美国专利号5,514,548;5,837,500;5,871,907;5,885,793;5,969,108;6,225,447;6,291,650;6,492,160;EP 585 287;EP 605522;EP 616640;EP1024191;EP 589 877;EP 774 511;EP 844 306。已经描述了可用于产生/选择丝状噬菌体颗粒的方法,该丝状噬菌体颗粒含有编码具有期望特异性的结合分子的噬菌粒基因组。参见,例如,EP 774 511;US 5871907;US 5969108;US 6225447;US 6291650;US 6492160。
在一些实施方案中,本技术的抗CLDN18.2抗体是使用CLDN18.2肽在酵母宿主细胞表面上的展示来选择的。Kieke等人,Protein Eng.,1997年十一月;第10卷第11期:第1303-1310页已经描述了可用于通过酵母表面展示来分离scFv多肽的方法。
在一些实施方案中,使用核糖体展示来选择本技术的抗CLDN18.2抗体。Mattheakis等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第91卷:第9022-9026页,1994年;以及Hanes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第94卷:第4937-4942页,1997年已经描述了可用于使用核糖体展示来鉴定肽文库中的配体的方法。
在某些实施方案中,使用CLDN18.2肽的tRNA展示来选择本技术的抗CLDN18.2抗体。Merryman等人,Chem.Biol.,第9卷:第741-746页,2002年已经描述了可用于使用tRNA展示在体外选择配体的方法。
在一个实施方案中,使用RNA展示来选择本技术的抗CLDN18.2抗体。Roberts等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第94卷:第12297-12302页,1997年;以及Nemoto等人,FEBSLett.,第414卷:第405-408页,1997年已经描述了可用于使用RNA展示文库来选择肽和蛋白质的方法。Frankel等人,Curr.Opin.Struct.Biol.,第13卷:第第506-512页,2003年已经描述了可用于使用非天然RNA展示文库来选择肽和蛋白质的方法。
在一些实施方案中,本技术的抗CLDN18.2抗体在革兰氏阴性细菌的周质中表达并与标记的CLDN18.2蛋白质混合。参见WO 02/34886。在表达对CLDN18.2蛋白质具有亲和力的重组多肽的克隆中,与抗CLDN18.2抗体结合的标记的CLDN18.2蛋白质的浓度增加,并允许细胞与文库的其余部分分离,如Harvey等人,Proc.Natl.Acad.Sci.第22卷:第9193-9198页,2004年以及美国专利公布号2004/0058403中所述。
在选择期望的抗CLDN18.2抗体后,预期可通过本领域技术人员已知的任何技术例如原核或真核细胞表达等来大量产生所述抗体。抗CLDN18.2抗体例如但不限于抗CLDN18.2杂合抗体或片段可通过使用常规技术构建表达载体来产生,该表达载体编码抗体重链,其中CDR和(如有必要)保留原始物种抗体结合特异性所需的可变区框架的最小部分(如根据本文所述的技术工程改造的)源自起源物种抗体并且抗体的其余部分源自可如本文所述操作的目标物种免疫球蛋白,从而产生用于表达杂合抗体重链的载体。
CLDN18.2结合的测量。在一些实施方案中,CLDN18.2结合测定是指其中CLDN18.2蛋白质和抗CLDN18.2抗体在适用于在CLDN18.2蛋白质和抗CLDN18.2抗体之间结合并且评估在CLDN18.2蛋白质和抗CLDN18.2抗体之间的结合量的条件下混合的测定形式。将结合量与合适的对照进行比较,该对照可以是不存在CLDN18.2蛋白质时的结合量、存在非特异性免疫球蛋白组合物时的结合量或两者。可通过任何合适的方法评估结合量。结合测定方法包括例如ELISA、放射免疫测定、闪烁亲近测定、荧光能量转移测定、液相色谱、膜过滤测定等。用于直接测量CLDN18.2蛋白质与抗CLDN18.2抗体结合的生物物理测定是例如核磁共振、荧光、荧光偏振、表面等离子体共振(BIACORE芯片)等。特异性结合通过本领域已知的标准测定例如放射性配体结合测定、ELISA、FRET、免疫沉淀、SPR、NMR(2D-NMR)、质谱等来确定。如果候选抗CLDN18.2抗体的特异性结合比不存在候选抗CLDN18.2抗体时观察到的结合高至少1%,则候选抗CLDN18.2抗体可用作本技术的抗CLDN18.2抗体。
本技术抗CLDN18.2抗体的用途
概述。本技术的抗CLDN18.2抗体可用于本领域已知的与CLDN18.2蛋白质的定位和/或定量相关的方法中(例如,用于测量适当生理样品内CLDN18.2蛋白质的水平,用于诊断方法,用于使多肽成像等)。本技术的抗体可用于通过标准技术诸如亲和层析或免疫沉淀来分离CLDN18.2蛋白质。本技术的抗CLDN18.2抗体可促进来自生物样品例如哺乳动物血清或细胞的天然免疫反应性CLDN18.2蛋白质以及在宿主系统中表达的重组产生的免疫反应性CLDN18.2蛋白质的纯化。此外,抗CLDN18.2抗体可用于检测(例如,血浆、细胞裂解物或细胞上清液中的)免疫反应性CLDN18.2蛋白质,以便评估免疫反应性多肽的丰度和表达模式。本技术的抗-CLDN18.2抗体可在诊断上用于监测组织中的免疫反应性CLDN18.2蛋白质水平,作为临床测试程序的一部分,例如,以确定给定治疗方案的疗效。如上所述,可通过将本技术的抗CLDN18.2抗体与可检测物质偶联(即,物理连接)来促进检测。
CLDN18.2蛋白质的检测。用于检测生物样品中免疫反应性CLDN18.2蛋白质的存在或不存在的示例性方法涉及从测试受试者中获得生物样品并将生物样品与本技术的能够检测免疫反应性CLDN18.2蛋白质的抗CLDN18.2抗体接触,从而在生物样品中检测免疫反应性CLDN18.2蛋白质的存在。检测可通过与抗体连接的可检测标记来完成。
关于抗CLDN18.2抗体的术语“标记”旨在涵盖通过将可检测物质偶联(即,物理连接)到抗体而直接标记抗体,以及通过与直接标记的另一种化合物诸如二抗的反应性间接标记抗体。间接标记的示例包括使用荧光标记的二抗检测一抗以及用生物素末端标记DNA探针,使得其可用荧光标记的链霉亲和素检测。
在一些实施方案中,本文公开的抗CLDN18.2抗体与一种或多种可检测标记缀合。对于此类用途,抗CLDN18.2抗体可通过显色、酶促、放射性同位素、同位素、荧光、毒性、化学发光、核磁共振造影剂或其他标记的共价或非共价连接被可检测标记。
合适的显色标记的示例包括二氨基联苯胺和4-羟基偶氮-苯-2-羧酸。合适的酶标记物的示例包括苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
合适的放射性同位素标记的示例包括3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd等。111In是使用体内成像的示例性同位素,因为它避免了125I或131I标记的CLDN18.2结合抗体被肝脏脱卤的问题。此外,该同位素具有更利于成像的伽马发射能量(Perkins等人,Eur.J.Nucl.Med.,第70卷:第296-301页,1985年;Carasquillo等人,J.Nucl.Med.,第25卷:第281-287页(1987年))。例如,利用1-(P-异硫氰基苄基)-DPTA与单克隆抗体偶联的111In在非肿瘤组织,特别是肝脏中几乎不表现出摄取,并增强了肿瘤定位的特异性(Esteban等人,J.Nucl.Med.,第28卷:第861-870页(1987年))。合适的非放射性同位素标记的示例包括157Gd、55Mn、162Dy、52Tr和56Fe。
合适的荧光标记的示例包括152Eu标记、荧光素标记、异硫氰酸酯标记、罗丹明标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝蛋白标记、绿色荧光蛋白质(GFP)标记、邻苯二醛标记和荧光胺标记。合适的毒素标记的示例包括白喉毒素、蓖麻毒素和霍乱毒素。
化学发光标记的示例包括鲁米诺标记、异鲁米诺标记、芳香族吖啶酯标记、咪唑标记、吖啶盐标记、草酸酯标记、荧光素标记、荧光素酶标记和水母发光蛋白标记。核磁共振造影剂的示例包括重金属原子核,诸如Gd、Mn和铁。
本技术的检测方法可用于在体外以及在体内检测生物样品中的免疫反应性CLDN18.2蛋白质。用于检测免疫反应性CLDN18.2蛋白质的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀、放射免疫测定和免疫荧光。此外,用于检测免疫反应性CLDN18.2蛋白质的体内技术包括将标记的抗CLDN18.2抗体引入受试者中。例如,抗CLDN18.2抗体可用放射性标记物标记,其在受试者中的存在和位置可通过标准成像技术检测。在一个实施方案中,生物样品含有来自测试受试者的CLDN18.2蛋白质分子。
免疫测定和成像。本技术的抗CLDN18.2抗体可用于使用基于抗体的技术测定生物样品(例如,人血浆)中的免疫反应性CLDN18.2蛋白质水平。例如,可利用经典的免疫组织学方法研究组织中的蛋白质表达。Jalkanen,M.等人,J.Cell.Biol.,第101卷:第976-985页,1985年;Jalkanen,M.等人,J.Cell.Biol.,第105卷:第3087-3096页,1987年。用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定,诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域已知的并且包括酶标记(诸如葡萄糖氧化酶)、放射性同位素或其他放射性药剂(诸如碘(125I、121I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc))和荧光标记(诸如荧光素、罗丹明和绿色荧光蛋白质(GFP)),以及生物素。
除了测定生物样品中的免疫反应性CLDN18.2蛋白质水平外,本技术的抗CLDN18.2抗体可用于CLDN18.2的体内成像。可用于此方法的抗体包括可通过X射线照相术、NMR或ESR检测的抗体。对于X射线照相术,合适的标记包括放射性同位素(诸如钡或铯),它们会发出可检测的辐射,但不会对受试者造成明显伤害。适用于NMR和ESR的标记包括具有可检测特征自旋的标记,诸如氘,其可通过标记用于相关scFv克隆的营养素而掺入抗CLDN18.2抗体中。
将已经用适当的可检测成像部分(诸如放射性同位素(例如,131I、112In、99mTc)、不透射线的物质或可通过核磁共振检测的材料)标记的抗CLDN18.2抗体(例如,肠胃外、皮下或腹膜内)引入受试者中。在本领域中应当理解,受试者的体型和所使用的成像系统将决定产生诊断图像所需的成像部分的量。在放射性同位素部分的情况中,对于人受试者,所注射的放射性同位素的量通常在约5毫居里至20毫居里99mTc的范围内。然后,标记的抗CLDN18.2抗体将在含有特定靶多肽的细胞位置处积累。例如,本技术的标记的抗CLDN18.2抗体将在受试者体内积累在CLDN18.2蛋白质所定位的细胞和组织中。
因此,本技术提供了医学病症的诊断方法,该诊断方法涉及:(a)通过测量本技术的抗CLDN18.2抗体在个体的细胞或体液中的结合来测定免疫反应性CLDN18.2蛋白质的表达;(b)将样品中存在的免疫反应性CLDN18.2蛋白质的量与标准参考进行比较,其中免疫反应性CLDN18.2蛋白质水平与标准相比的增大或减小指示医学病症。
亲和力纯化。本技术的抗CLDN18.2抗体可用于从样品中纯化免疫反应性CLDN18.2蛋白质。在一些实施方案中,抗体固定在固体支持物上。此类固体支持物的示例包括塑料诸如聚碳酸酯、复合碳水化合物诸如琼脂和琼脂糖、丙烯酸树脂诸如聚丙烯酰胺以及乳胶珠。用于将抗体与此类固体支持物偶联的技术是本领域众所周知的(Weir等人,“Handbook ofExperimental Immunology”,第4版,Blackwell Scientific Publications,Oxford,England,第10章(1986年);Jacoby等人,Meth.Enzym.,第34卷,Academic Press,N.Y.(1974年))。
将抗原与抗体支持基质结合的最简单方法是将珠收集在柱中,并使抗原溶液通过柱。这种方法的有效性取决于固定的抗体和抗原之间的接触时间,该接触时间可通过使用低流速来延长。固定的抗体在流过时捕获抗原。另选地,可通过将抗原溶液与支持物(例如,珠)混合并旋转或摇动浆液来使抗原与抗体支持物基质接触,从而允许抗原与固定的抗体之间的最大接触。在结合反应已经完成后,将浆液传递到柱中以收集珠。使用合适的洗涤缓冲液来洗涤珠,然后洗脱纯的或基本上纯的抗原。
可将感兴趣的抗体或多肽缀合到固体支持物诸如珠。此外,如果需要,也可通过任何合适的方式,包括本文公开的用于将多肽缀合到支持物的那些方式将第一固体支持物诸如珠缀合到第二固体支持物(其可以是第二珠或其他支持物)。因此,本文公开的关于多肽与固体支持物缀合的缀合方法和方式中的任何缀合方法和方式也可应用于将第一支持物与第二支持物缀合,其中第一固体支持物和第二固体支持物可以是相同或不同的。
用于将多肽缀合到固体支持物的合适接头可以是交联剂,包括可与支持物表面上存在的官能团或与多肽或与两者反应的多种药剂。可用作交联剂的试剂包括同双功能试剂,特别是异双功能试剂。可使用的双功能交联剂包括但不限于N-SIAB、二马来酰亚胺、DTNB、N-SATA、N-SPDP、SMCC和6-HYNIC。可将交联剂选择为在多肽和固体支持物之间提供可选择性切割的键。例如,对光不稳定的交联剂诸如3-氨基-(2-硝基苯基)丙酸可用作从固体支持物中切割多肽的方式。(Brown等人,Mol.Divers,第4-12页(1995年);Rothschild等人,Nucl.Acids Res.,第24卷:第351-366页(1996年);以及美国专利号5,643,722)。其他交联剂是本领域中众所周知的。(参见,例如,Wong(1991年),出处同上;以及Hermanson(1996年),出处同上)。
抗体或多肽可通过在羧基基团官能化珠和多肽的氨基末端之间形成的共价酰胺键,或相反地通过在氨基基团官能化珠和多肽的羧基末端之间形成的共价酰胺键而固定在固体支持物(诸如珠)上。此外,双官能三苯甲基接头可通过树脂上的氨基基团或羧基基团,经由氨基树脂连接到支持物,例如连接到树脂上的4-硝基苯基活性酯诸如Wang树脂。使用双功能三苯甲基方法,固体支持物可能需要用挥发性酸例如甲酸或三氟乙酸处理,以确保多肽被切割并可被去除。在这种情况下,多肽可作为无珠贴片沉积在固体支持物孔的底部或沉积在固体支持物的平坦表面上。在加入基质溶液之后,多肽可解吸到MS中。
通过使用挥发性酸或合适的基质溶液,例如,含有3-HPA的基质溶液,疏水性三苯甲基接头也可用作对酸不稳定的接头,以从多肽中切割氨基连接的三苯甲基基团。酸不稳定性也可改变。例如,可将三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基或三甲氧基三苯甲基改变为多肽的适当对位取代的或对酸更不稳定的三苯甲基胺衍生物,即,可在多肽上形成三苯甲基醚和三苯甲基胺键。因此,可例如通过破坏疏水吸引力或通过在酸性条件下,包括(如果需要)在典型的MS条件下(其中基质诸如3-HPA充当酸)切割三苯甲基醚或三苯甲基胺键来从疏水性接头中去除多肽。
可正交切割的接头也可用于将第一固体支持物例如珠结合到第二固体支持物,或用于将感兴趣的多肽结合到固体支持物。使用此类接头,可从第二固体支持物选择性地切割第一固体支持物例如珠,而不从支持物切割多肽;然后可在稍后的时间从珠中切割多肽。例如,可采用二硫键接头使珠与第二固体支持物结合,该二硫键接头可使用还原剂(诸如DTT)切割,并且可使用可酸切割的双功能三苯甲基基团将多肽固定到支持物。根据需要,可首先切割多肽与固体支持物的连接,例如,使第一支持物和第二支持物之间的连接保持完整。三苯甲基接头可提供共价或疏水性缀合,并且无论缀合的性质如何,三苯甲基基团在酸性条件下都容易裂解。
例如,珠可通过连接基团与第二支持物结合,可将该连接基团选择为具有一定长度和化学性质,使得珠与固体支持物的高密度结合或多肽与珠的高密度结合得以提升。这样的连接基团可具有例如“树状”结构,从而在固体支持物上的每个连接位点提供多个官能团。这样的连接基团的示例包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、季戊四醇和三羟基氨基甲烷。
非共价结合缔合。抗体或多肽可与固体支持物缀合,或者第一固体支持物也可通过非共价相互作用与第二固体支持物缀合。例如,由能够被磁化的铁磁材料制成的磁珠可被吸引到磁性固体支持物上,并且可通过撤去磁场而从支持物释放。另选地,固体支持物可具有离子或疏水性部分,这可允许离子或疏水性部分分别与多肽例如含有连接的三苯甲基基团的多肽或与具有疏水特性的第二固体支持物相互作用。
固体支持物也可具有特异性结合对的成员,因此可与多肽或含有互补结合部分的第二固体支持物缀合。例如,用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白包被的珠可与其中掺入生物素部分的多肽结合,或者与用生物素或生物素衍生物诸如亚氨基生物素包被的第二固体支持物结合。
应当认识到,本文公开的或本领域以其他方式已知的结合成员中的任何结合成员都可以逆转。因此,例如,生物素可掺入多肽或固体支持物中,相反地,抗生物素蛋白或其他生物素结合部分将分别掺入支持物或多肽中。预期用于本文的其他特异性结合对包括但不限于激素及其受体、酶及其底物、核苷酸序列及其互补序列、抗体及其特异性相互作用的抗原,以及本领域技术人员所知的其他此类对。
A.本技术的抗CLDN18.2抗体的诊断用途
概述。本技术的抗CLDN18.2抗体可用于诊断方法。因此,本技术提供了使用抗体诊断受试者中CLDN18.2活性的方法。可将本技术的抗CLDN18.2抗体选择为使得它们具有任何水平的表位结合特异性和对CLDN18.2蛋白质非常高的结合亲和力。通常,抗体的结合亲和力越高,在免疫测定中可执行的洗涤条件越严格,以去除非特异性结合的材料而不去除靶多肽。因此,可用于诊断测定的本技术的抗CLDN18.2抗体通常具有约108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1或1012M-1的结合亲和力。此外,希望用作诊断试剂的抗CLDN18.2抗体具有足够的动力学结合速率以在至少12小时、至少五(5)小时或至少一(1)小时内在标准条件下达到平衡。
抗CLDN18.2抗体可用于在多种标准测定形式中检测免疫反应性CLDN18.2蛋白质。此类形式包括免疫沉淀、蛋白质印迹、ELISA、放射免疫测定和免疫测定。参见,Harlow和Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Publications,New York,1988年);美国专利号3,791,932;3,839,153;3,850,752;3,879,262;4,034,074、3,791,932;3,817,837;3,839,153;3,850,752;3,850,578;3,853,987;3,867,517;3,879,262;3,901,654;3,935,074;3,984,533;3,996,345;4,034,074;和4,098,876。生物样品可从受试者的任何组织或体液中获得。在某些实施方案中,受试者处于癌症的早期阶段。在一个实施方案中,癌症的早期阶段是由从受试者获得的样品中CLDN18.2蛋白质的水平或表达模式确定的。在某些实施方案中,样品选自尿液、血液、血清、血浆、唾液、羊水、脑脊液(CSF)和活检身体组织。
免疫测定或夹心式测定是本技术诊断方法的一种形式。参见美国专利号4,376,110、4,486,530、5,914,241和5,965,375。此类测定使用一种抗体,例如固定到固相的抗CLDN18.2抗体或抗CLDN18.2抗体群体,以及溶液中的另一种抗CLDN18.2抗体或抗CLDN18.2抗体群体。通常,抗CLDN18.2抗体或抗CLDN18.2抗体群体的溶液被标记。如果使用抗体群体,则该群体可含有与靶多肽内的不同表位特异性结合的抗体。因此,同一群体可用于固相和溶液抗体两者。如果使用抗CLDN18.2单克隆抗体,则具有不同结合特异性的第一和第二CLDN18.2单克隆抗体用于固相和溶液相。固相(也称为“捕获”)和溶液(也称为“检测”)抗体可按任一顺序或同时与靶抗原接触。如果首先接触固相抗体,则该测定被称为正向测定。相反,如果首先接触溶液抗体,则该测定被称为反向测定。如果靶标与两种抗体同时接触,则该测定称为同时测定。在CLDN18.2蛋白质与抗CLDN18.2抗体接触后,将样品温育通常从约10分钟至约24小时不等且通常为约1小时的时间。然后执行洗涤步骤以去除样品中不与用作诊断试剂的抗CLDN18.2抗体特异性结合的组分。当固相和溶液抗体在不同的步骤中结合时,可在一个或两个结合步骤之后进行洗涤。洗涤后,通常通过标记溶液抗体的结合检测与固相连接的标记来对结合进行定量。通常对于给定的一对抗体或抗体群体和给定的反应条件,由含有已知浓度的靶抗原的样品制备校准曲线。然后通过校准曲线(即,标准曲线)插值读取所测试样品中免疫反应性CLDN18.2蛋白质的浓度。分析物可由在平衡时结合的标记溶液抗体的量来测量,或者通过在达到平衡之前的一系列时间点对结合的标记溶液抗体的动力学测量来测量。这种曲线的斜率是样品中CLDN18.2蛋白质的浓度的量度。
适用于上述方法的支持物包括例如硝酸纤维素膜、尼龙膜和衍生尼龙膜,以及颗粒,诸如琼脂糖、基于葡聚糖的凝胶、油纸、颗粒、微球、磁性颗粒、试管、微量滴定孔SEPHADEXTM(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,N.J.)等等。可通过吸收或通过共价连接来固定。任选地,抗CLDN18.2抗体可连接到接头分子诸如生物素,以连接到表面结合的接头,诸如抗生物素蛋白。
在一些实施方案中,本公开提供了与诊断剂缀合的本技术的抗CLDN18.2抗体。诊断剂可包括放射性或非放射性标记、造影剂(诸如用于磁共振成像、计算机断层扫描或超声),并且放射性标记可以是γ、β、α、俄歇电子、或正电子发射同位素。诊断剂是与抗体部分即抗体或抗体片段或亚片段偶联施用的分子,并且可用于通过定位含有抗原的细胞来诊断或检测疾病。
可使用的诊断剂包括但不限于放射性同位素、染料(诸如与生物素-链霉亲和素复合物)、造影剂、荧光化合物或分子以及用于磁共振成像(MRI)的增强剂(例如,顺磁离子)。美国专利号6,331,175描述了MRI技术和与MRI增强剂缀合的抗体的制备,并整体通过引用方式并入。在一些实施方案中,诊断剂选自放射性同位素、用于磁共振成像的增强剂和荧光化合物。为了用放射性金属或顺磁离子装载抗体组分,可能需要使其与具有长尾的试剂反应,长尾连接有用于结合离子的多个螯合基团。这种尾可以是聚合物诸如聚赖氨酸、多糖或具有侧基基团的其他衍生化或可衍生化链,其上可结合螯合基团,诸如例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟和已知可用于此目的的类似基团。可使用标准化学将螯合物与本技术的抗体偶联。螯合物通常通过基团与抗体连接,该基团能够在免疫反应性损失最小并且聚集和/或内部交联最低的情况下与分子形成键。用于将螯合物与抗体缀合的其他方法和试剂公开于美国专利号4,824,659中。特别可用的金属螯合物组合包括2-苄基-DTPA及其单甲基和环己基类似物与诊断同位素一起用于放射性成像。当与本技术的CLDN18.2抗体一起使用时,相同的螯合物在与非放射性金属诸如锰、铁和钆复合时可用于MRI。大环螯合物诸如NOTA(1,4,7-三氮杂-环壬烷-N,N',N”-三乙酸)、DOTA和TETA(对溴乙酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸)可与多种金属和放射性金属一起使用,诸如分别为放射性核素镓、钇和铜。这种金属螯合物复合物可通过根据感兴趣的金属调整环尺寸来稳定。其他DOTA螯合物的示例包括(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2;(ii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2;(iii)DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2;(iv)DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2;(v)DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2;(vi)DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2;(vii)DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2;(viii)Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2;(ix)Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2;(x)Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2;(xi)Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2;(xii)DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2;(xiii)(Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2;(xiv)Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2;(xv)(Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2;(xvi)Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2;(xvii)Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2;(xviii)Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2;和(xix)Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2。
还考虑了其他环型螯合物诸如大环聚醚,其对稳定结合核素诸如用于RAIT的223Ra感兴趣。
B.本技术的抗CLDN18.2抗体的治疗用途
在一个方面,本技术的免疫球蛋白相关组合物(例如,抗体或其抗原结合片段)可用于治疗CLDN18.2相关癌症,诸如胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌诸如非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌或表达CLDN18.2的任何其他肿瘤组织。在一些实施方案中,CLDN18.2相关癌症是实体瘤。此类治疗可用于被鉴定为具有病理学高水平CLDN18.2的患者(例如,通过本文所述方法诊断的患者)或诊断患有已知与此类病理水平相关的疾病的患者。
本技术的组合物可与可用于治疗CLDN18.2相关癌症的其他治疗剂联合使用。例如,本技术的抗体或抗原结合片段可与选自烷化剂、铂剂、紫杉烷、长春花剂、抗雌激素药物、芳香酶抑制剂、卵巢抑制剂、VEGF/VEGFR抑制剂、EGF/EGFR抑制剂、PARP抑制剂、细胞生长抑制生物碱、细胞毒素抗生素、抗代谢药、内分泌/激素药剂、双膦酸盐治疗剂、T细胞和靶向生物治疗剂(例如,US 6306832、WO 2012007137、WO 2005000889、WO 2010096603中描述的治疗性肽)的至少一种另外的治疗剂分开、依次或同时施用。在一些实施方案中,所述至少一种另外的治疗剂是化学治疗剂。具体的化学治疗剂包括但不限于环磷酰胺、氟尿嘧啶(或5-氟尿嘧啶或5-FU)、甲氨蝶呤、依达曲沙(10-乙基-10-去氮-氨基蝶呤)、噻替派、卡铂、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、蛋白结合紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、氟维司群、吉西他滨、伊立替康、伊沙匹隆、替莫唑胺、拓扑替康、长春新碱、长春碱、艾日布林、突变霉素、卡培他滨、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、亮丙瑞林、阿巴瑞克、布舍瑞林、戈舍瑞林、醋酸甲地孕酮、利塞膦酸盐、帕米膦酸盐、伊班膦酸盐、阿仑膦酸盐、地诺单抗、唑来膦酸盐、曲妥珠单抗、拉帕替尼、蒽环霉素(例如,柔红霉素和阿霉素)、贝伐单抗、奥沙利铂、美法仑、依托泊苷、氮芥、博来霉素、微管毒物、番荔枝内酯或它们的组合。
除此之外或另选地,在一些实施方案中,本技术的抗体或抗原结合片段可与至少一种另外的免疫调节/刺激抗体(包括但不限于抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM3抗体、抗4-1BB抗体、抗CD73抗体、抗GITR抗体和抗LAG-3抗体)分开、依次或同时施用。
本技术的组合物可任选地作为单次推注施用于有需要的受试者。另选地,给药方案可包括在肿瘤出现后的不同时间进行的多次施用。
施用可通过任何合适的途径进行,包括口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌内、腹膜内或皮下)、直肠、颅内、瘤内、鞘内或局部施用。施用包括自我施用和经他人施用。还应当理解,如所述的医学病症的各种治疗模式旨在表示“显著的”,这包括全面治疗但也包括不全面治疗,并且其中实现了一些生物学或医学相关结果。
在一些实施方案中,本技术的抗体包含药物制剂,其可以一个或多个剂量施用于有需要的受试者。可调整给药方案以提供期望的应答(例如,治疗性应答)。
通常,足以实现治疗效果的本技术的抗体组合物的有效量范围为每天每千克体重约0.000001mg至每天每千克体重约10,000mg。通常,剂量范围为每天每千克体重约0.0001mg至每天每千克体重约100mg。对于抗CLDN18.2抗体的施用,剂量范围为约0.0001mg/kg至100mg/kg,更通常为每周、每两周或每三周0.01mg/kg至5mg/kg受试者体重。例如,剂量可以是每周、每两周或每三周1mg/kg体重或10mg/kg体重,或者在每周、每两周或每三周1mg/kg-10mg/kg的范围内。在一个实施方案中,抗体的单剂量范围为每kg体重0.1微克-10,000微克。在一个实施方案中,载体中的抗体浓度范围为所递送的每毫升0.2微克至2000微克。示例性治疗方案需要每两周施用一次或每月施用一次或每3至6个月施用一次。抗CLDN18.2抗体可多次施用。单剂量之间的间隔可以是每隔一小时、每隔一天、每隔一周、每隔一个月或每隔一年。间隔也可以是不定期的,如通过测量受试者中抗体的血液水平所示。在一些方法中,调整剂量以使受试者中的血清抗体浓度达到约75μg/mL至约125μg/mL、100μg/mL至约150μg/mL、约125μg/mL至约175μg/mL或约150μg/mL至约200μg/mL。另选地,抗CLDN18.2抗体可作为缓释制剂施用,在这种情况下需要较低的施用频率。剂量和频率根据受试者中抗体的半衰期而变化。施用的剂量和频率可根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中,在很长一段时间内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。在治疗性应用中,有时需要以相对短的间隔给予相对高的剂量,直到疾病的进展减轻或终止,或者直到受试者表现出疾病症状的部分或完全改善。此后,可对患者施用预防性方案。
在另一个方面,本公开提供了用于体内检测受试者的癌症的方法,该方法包括(a)向受试者施用有效量的本技术的抗体(或其抗原结合片段),其中抗体被配置成定位于表达CLDN18.2的癌细胞并用放射性同位素标记;以及(b)通过检测由抗体发射的高于参考值的放射性水平来检测受试者中肿瘤的存在。在一些实施方案中,参考值表示为每克注射剂量(%ID/g)。参考值可通过以下方式计算:测量非肿瘤(正常)组织中存在的放射性水平,并计算非肿瘤(正常)组织中存在的平均放射性水平±标准偏差。在一些实施方案中,肿瘤与正常组织之间的放射性水平的比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。
在一些实施方案中,受试者被诊断患有或疑似患有癌症。可使用正电子发射断层扫描或单光子发射计算机断层扫描来检测由抗体发射的放射性水平。
除此之外或另选地,在一些实施方案中,该方法还包括向受试者施用有效量的免疫缀合物,该免疫缀合物包含缀合到放射性核素的本技术的抗体。在一些实施方案中,放射性核素是发射α粒子的同位素、发射β粒子的同位素、俄歇发射体或它们的任何组合。发射β粒子的同位素的示例包括86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu和67Cu。发射α粒子的同位素的示例包括213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At和255Fm。俄歇发射体的示例包括111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl和203Pb。在该方法的一些实施方案中,正常组织中的非特异性FcR依赖性结合(例如,通过Fc区中的导致非糖基化的N297A突变)被消除或减弱。这种免疫缀合物的治疗效果可通过计算曲线下面积(AUC)肿瘤:AUC正常组织比率来确定。在一些实施方案中,免疫缀合物具有约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1的AUC肿瘤:AUC正常组织比率。
毒性。最佳地,有效量(例如,剂量)的本文所述的抗CLDN18.2抗体将提供治疗有益效果而不会对受试者造成显著毒性。本文所述的抗CLDN18.2抗体的毒性可通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序,例如,通过确定LD50(对50%的群体致死的剂量)或LD100(对100%的群体致死的剂量)来确定。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数。从这些细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于制定对人体无毒的剂量范围。本文所述的抗CLDN18.2抗体的剂量处于循环浓度的范围内,这些循环浓度包括几乎没有或没有毒性的有效剂量。剂量可根据所采用的剂型和所利用的施用途径在此范围内变化。确切的制剂、施用途径和剂量可由个体医师根据受试者的病症来选择。参见,例如,Fingl等人,于:ThePharmacological Basis of Therapeutics,第1章(1975年)。
药物组合物的制剂。根据本技术的方法,可将抗CLDN18.2抗体掺入适于施用的药物组合物中。药物组合物通常包含重组或基本上纯化的抗体和适合施用于受试者的形式的药学上可接受的载体。药学上可接受的载体部分地取决于所施用的特定组合物,以及用于施用该组合物的特定方法。因此,存在用于施用抗体组合物的多种合适的药物组合物制剂(参见,例如,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,PA,第18版,1990年)。药物组合物通常被配制成无菌的、基本上等渗的并且完全符合美国食品和药物管理局的所有优质生产规范(GMP)规定。药物组合物还可包含选自以下的药剂:同位素、染料、色原、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或它们的任何组合。
当术语“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”及其语法变型指的是组合物、载体、稀释剂和试剂时,它们可互换使用,并且表示该材料能够施用于受试者或受试者身上,而不产生达到将阻止组合物施用的程度的不希望的生理效应。例如,“药学上可接受的赋形剂”意指可用于制备通常是安全、无毒且期望的药物组合物的赋形剂,并且包括对于兽医用途以及人类药物用途是可接受的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体,或者在气溶胶组合物的情况下,可以是气体。“药学上可接受的盐和酯”意指药学上可接受的并具有期望的药理学特性的盐和酯。此类盐包括在组合物中存在的酸性质子能够与无机或有机碱反应时可形成的盐。合适的无机盐包括与碱金属例如钠和钾、镁、钙和铝形成的那些盐。合适的有机盐包括与有机碱诸如胺碱(例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等)形成的那些盐。此类盐还包括与无机酸(例如,盐酸和氢溴酸)和有机酸(例如,乙酸、柠檬酸、马来酸以及烷烃磺酸和芳烃磺酸诸如甲磺酸和苯磺酸)形成的酸加成盐。药学上可接受的酯包括由抗CLDN18.2抗体中存在的羧基、磺酰氧基和膦酰氧基基团形成的酯,例如C1-6烷基酯。当存在两个酸性基团时,药学上可接受的盐或酯可以是单酸单盐或酯或者二盐或酯;并且类似地,当存在多于两个酸性基团时,这些基团中的一些或全部基团可成盐或酯化。本技术中命名的抗CLDN18.2抗体可以未成盐或未酯化的形式存在,或者以成盐和/或酯化的形式存在,并且这种抗CLDN18.2抗体的命名旨在包括原始的(未成盐的和未酯化的)化合物及其药学上可接受的盐和酯。此外,本技术的某些实施方案可以多于一种立体异构形式存在,并且此类抗CLDN18.2抗体的命名旨在包括此类立体异构体的所有单一立体异构体和所有混合物(无论是外消旋还是其他形式的混合物)。本领域的普通技术人员将不难确定本技术的特定药物和组合物的适当施用时间、顺序和剂量。
此类载体或稀释剂的示例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水性载体诸如固定油。此类介质和化合物用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除非任何常规介质或化合物与抗CLDN18.2抗体不相容,否则考虑将其用于组合物中。补充的活性化合物也可掺入组合物中。
本技术的药物组合物被配制成与其预期施用途径相容。本技术的抗CLDN18.2抗体组合物可通过肠胃外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、皮内、透皮、直肠、颅内、鞘内、腹膜内、鼻内;或肌内途径,或作为吸入剂施用。抗CLDN18.2抗体可任选地与至少部分地有效治疗各种CLDN18.2相关癌症的其他药剂组合施用。
用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包括以下组分:无菌稀释剂,诸如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂;抗菌化合物,诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯;抗氧化剂,诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合化合物,诸如乙二胺四乙酸(EDTA);缓冲液,诸如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐;以及用于调节张力的化合物,诸如氯化钠或葡萄糖。pH值可用酸或碱诸如盐酸或氢氧化钠调节。肠胃外制剂可封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(如果是水溶性的)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌散剂。对于静脉内施用,合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下,组合物必须是无菌的并且应当是流动的以达到易于注射的程度。它在制备和储存条件下必须是稳定的;并且必须保存以抵抗微生物诸如细菌和真菌的污染作用。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及它们的合适的混合物的溶剂或分散介质。例如,可通过使用包衣诸如卵磷脂,通过在分散体的情况下保持期望的粒度以及通过使用表面活性剂保持适当的流动性。可通过各种抗菌和抗真菌化合物(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现预防微生物的作用。在许多情况下,希望在组合物中包含等渗化合物,例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)、氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的化合物(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射组合物的长时间吸收。
无菌可注射溶液可通过以下方式制备:根据需要将所需量的本技术的抗CLDN18.2抗体与上文列举的一种成分或成分的组合掺入适当的溶剂中,然后过滤灭菌。通常,分散体是通过将抗CLDN18.2抗体掺入无菌溶媒中来制备的,该无菌溶媒含有基本分散介质和来自上文列举的那些的所需其他成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌散剂而言,制备方法是真空干燥和冷冻干燥,这些技术由活性成分加上任何附加期望成分的先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何附加期望成分的散剂。本技术的抗体可以积存注射或植入物制剂的形式施用,其可以允许活性成分持续或脉冲释放的方式配制。
口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。它们可封装在明胶胶囊中或压制成片剂。为了口服治疗施用的目的,抗CLDN18.2抗体可掺有赋形剂并以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。也可使用用作漱口水的流体载体来制备口服组合物,其中流体载体中的化合物经口服应用并漱口后吐出或吞服。药学上相容的结合化合物和/或佐剂材料可作为组合物的一部分包括在内。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有以下成分或具有类似性质的化合物中的任一者:粘合剂,诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶;赋形剂,诸如淀粉或乳糖,崩解化合物,诸如海藻酸、Primogel或玉米淀粉;润滑剂,诸如硬脂酸镁或Sterotes;助流剂诸如二氧化硅胶体;甜味化合物,诸如蔗糖或糖精;或调味化合物,诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙子调味剂。
对于通过吸入施用,抗CLDN18.2抗体以气溶胶喷雾剂的形式从盛有合适的推进剂(例如气体诸如二氧化碳)的压力容器或分配器,或雾化器递送。
全身施用也可通过透粘膜或透皮方式进行。对于透粘膜或透皮施用,在制剂中使用适合待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域中通常是已知的,并且包括例如用于透粘膜施用的洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。透粘膜施用可通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂来完成。对于透皮施用,抗CLDN18.2抗体被配制成本领域众所周知的软膏剂、药膏剂、凝胶或霜剂。
抗CLDN18.2抗体也可被制备成栓剂形式的药物组合物(例如,具有常规栓剂基质诸如可可脂和其他甘油酯)或用于直肠递送的保留灌肠剂。
在一个实施方案中,抗CLDN18.2抗体用载体制备,这些载体将保护抗CLDN18.2抗体免于从机体快速消除,诸如包括植入物和微胶囊化递送系统的控释制剂。可使用可生物降解的生物相容性聚合物,诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。这些材料也可从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.商购获得。脂质体悬浮剂(包括靶向具有针对病毒抗原的单克隆抗体的感染细胞的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。这些材料可根据本领域技术人员已知的方法来制备,例如,如美国专利号4,522,811中所述的。
与本技术的多特异性结合分子结合的T细胞。不受任何理论的束缚,据信当本文提供的抗CD3多特异性结合分子(例如,CLDN 18.2×CD3)通过例如诸如本文所述的那些程序与T细胞结合时,多特异性结合分子的抗CD3 scFv与T细胞表面上的CD3结合。不受任何理论的束缚,据信多特异性结合分子与T细胞的结合(即,抗CD3 scFv与T细胞上表达的CD3的结合)激活T细胞,并因此允许将基于T细胞受体的细胞毒性重定向到期望的肿瘤靶标,绕过MHC限制。
因此,本公开还提供了与本技术的多特异性结合分子结合的T细胞。在具体的实施方案中,T细胞与多特异性结合分子非共价结合。在具体的实施方案中,T细胞是与将施用T细胞的受试者自体同源的。在具体的实施方案中,T细胞是与将施用T细胞的受试者同种异体的。在具体的实施方案中,T细胞是人T细胞。
在具体的实施方案中,根据本文所述的治疗方法使用与本发明的多特异性结合分子结合的T细胞。在具体的实施方案中,与本公开的多特异性结合分子结合的T细胞用作如下所述的联合疗法的一部分。
在涉及与输注T细胞联合的疗法的具体实施方案中,本文提供了药物组合物,该药物组合物包含(a)本文所述的多特异性结合分子;(b)T细胞;和/或(c)药学上有效的载体。在具体的实施方案中,T细胞是与施用T细胞的受试者自体同源的。在某些实施方案中,T细胞是与施用T细胞的受试者同种异体的。在具体的实施方案中,T细胞与或不与多特异性结合分子结合。在具体的实施方案中,T细胞与多特异性结合分子的结合是非共价结合。在具体的实施方案中,T细胞是人T细胞。可用于将多特异性结合分子与T细胞结合的方法是本领域已知的。参见,例如,Lum等人,2013年,Biol Blood Marrow Transplant,第19卷:第925-933页;Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,第5版,New York:Garland Science;Vaishampayan等人,2015年,Prostate Cancer,2015:285193;以及Stromnes等人,2014年,Immunol Rev.,第257卷第1期:第145-164页。
在一个具体的实施方案中,本文提供的多特异性结合分子;编码多特异性结合分子的多核苷酸、载体或细胞;或包含多特异性结合分子的药物组合物的施用是在用T细胞输注治疗患者之后进行的。在具体的实施方案中,T细胞输注是用与施用T细胞的受试者自体同源的T细胞进行的。在具体的实施方案中,T细胞输注是用与施用T细胞的受试者同种异体的T细胞进行的。在具体的实施方案中,T细胞可与和本文所述的多特异性结合分子相同的分子结合。在具体的实施方案中,T细胞与和多特异性结合分子相同的分子的结合是非共价结合。在具体的实施方案中,T细胞是人T细胞。
C.试剂盒
本技术提供了用于检测和/或治疗CLDN18.2相关癌症的试剂盒,该试剂盒包括本技术的至少一种免疫球蛋白相关组合物(例如,本文所述的任何抗体或抗原结合片段)或其功能变体(例如,取代变体)。任选地,本技术的试剂盒的上述组分包装在合适的容器中并标记用于诊断和/或治疗CLDN18.2相关癌症。上述组分可储存在单位剂量或多剂量容器(例如,密封安瓿、小瓶、瓶、注射器和试管)中,作为水性溶液,优选无菌溶液,或作为用于重构的冻干制剂,优选无菌制剂。试剂盒还可包括第二容器,该第二容器容纳适于将药物组合物稀释至更高体积的稀释剂。合适的稀释剂包括但不限于药物组合物的药学上可接受的赋形剂和盐水溶液。此外,试剂盒可包括用于稀释药物组合物的说明书和/或用于施用无论是否稀释的药物组合物的说明书。容器可由多种材料诸如玻璃或塑料制成,并且可具有无菌入口(例如,容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。试剂盒还可包括更多容器,这些容器盛有药学上可接受的缓冲液,例如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。试剂盒还可包括从商业和用户的角度所期望的其他材料,包括用于合适宿主中的一种或多种宿主的其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器、培养基。试剂盒可任选地包括通常包括在治疗或诊断产品的商业包装中的说明书,该说明书包括关于例如适应症、用法、剂量、制造商、施用、禁忌症和/或关于使用此类治疗或诊断产品的警告的信息。
试剂盒可用于检测生物样品(例如,任何体液,包括但不限于例如血清、血浆、淋巴液、囊肿液、尿液、粪便、脑脊液、腹水或血液,并包括身体组织的活检样品)中免疫反应性CLDN18.2蛋白质的存在。例如,试剂盒可包括:能够结合生物样品中的CLDN18.2蛋白质的一种或多种本技术的人源化、嵌合、双特异性或多特异性抗CLDN18.2抗体(或其抗原结合片段);用于确定样品中CLDN18.2蛋白质的量的装置;以及将样品中免疫反应性CLDN18.2蛋白质的量与标准品进行比较的装置。可标记抗CLDN18.2抗体中的一种或多种抗体。试剂盒组分(例如,试剂)可包装在合适的容器中。试剂盒还可包括用于使用试剂盒来检测免疫反应性CLDN18.2蛋白质的说明书。
对于基于抗体的试剂盒,该试剂盒可包含例如1)连接到固体支持物的第一抗体,例如,本技术的人源化、嵌合、双特异性或多特异性CLDN18.2抗体(或其抗原结合片段),其与CLDN18.2蛋白质结合;以及任选地2)不同的第二抗体,其与CLDN18.2蛋白质或与第一抗体结合并与可检测标记缀合。
试剂盒还可包含例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒还可包含用于检测可检测标记所必需的组分,例如酶或底物。试剂盒还可含有一个对照样品或一系列对照样品,可测定这些对照样品并将其与测试样品进行比较。试剂盒的每种组分都可封装在单独的容器中,并且所有各个容器连同用于解释使用试剂盒进行的测定的结果的说明书都可处于单个包装中。本技术的试剂盒可在试剂盒容器上或试剂盒容器中包含书面产品。书面产品描述了如何使用试剂盒中包含的试剂,例如,用于体外或体内检测CLDN18.2蛋白质,或用于治疗有需要的受试者的CLDN18.2相关癌症。在某些实施方案中,试剂的使用可根据本技术的方法。
实施例
本技术通过以下实施例进一步说明,这些实施例不应被解释为以任何方式进行限制。以下实施例展示了本技术的例示性抗CLDN18.2抗体的制备、表征和使用。
实施例1:材料和方法
hCLDN18.2和hCLDN18.1基因表达载体的构建。将编码CLDN18.2蛋白质的人cDNA(SEQ ID NO:4,如图10所示)克隆到pCMV3表达载体(Sino Biological US Inc.,Chesterbrook,PA)中,并用于稳定细胞系的产生和作为用于小鼠免疫的DNA免疫原。类似地,将人CLDN18.1 cDNA(SEQ ID NO:5,如图11所示)克隆到pCMV3表达载体中并用于稳定细胞系的产生。人CLDN18.1细胞系用于选择性反筛选。
表达hCLDN18.2和hCLDN18.1的细胞系的产生。所构建的pCMV3-hCLDN18.2和pCMV3-hCLDN18.1表达质粒用于转染细胞以开发以下稳定或瞬时细胞系:1)3T3-hCLDN18.2小鼠胚胎成纤维细胞系,其用于增强小鼠免疫;2)CHO-hCLDN18.2,其用于通过ELISA和FACS进行抗体筛选;3)HEK293-hCLDN18.2,其用于通过ELISA和FACS进行抗体筛选;4)HEK293-hCLDN18.1,其用于抗体反筛选。对于稳定的细胞系,所有最终选择的克隆都表现出靶蛋白质的高表达水平。如图5所示,用pCMV3-hCLDN18.2转染的所有3个细胞系都表现出比亲本对照细胞系高至少100倍的hCLDN18.2表达。
hCLDN18.2-EL1在病毒样颗粒(VLP)中的表达。为了产生抗hCLDN18.2特异性抗体,靶向EL1区,因为CLDN18.2和18.1共享相同的EL2序列。为了驱动针对EL1区的免疫应答,构建载体以在病毒样颗粒(VLP)中表达hCLDN18.2 EL1区。携带CLDN18.2EL1与CD81细胞溶胶结构域的嵌合基因(pEF6-CLDN18.2EL1-CD81cd)的pEF6-CLDN18.2EL1和pEF6载体(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)使用以下方案转染到Expi293细胞:在4℃旋转下,用180μL Epifectamine于4mL OptimMEM中的溶液将Expi293细胞与pEF6-CLDN18.2EL1或pEF6-CLDN18.2EL1-CD81cd和VLP-芯编码载体共转染24小时。转染24小时后,将细胞悬浮液加入26mL的Expi293表达培养基中,并在37℃和125rpm振荡下培养。在振荡培养24小时时,分别加入150μL和1.5mL的EXPI293TMMembranePro表达系统(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)的增强子1和2,并再继续培养24小时。随后将细胞离心用于FACS,并收集上清液用于VLP沉淀。用小鼠抗CEA Ab,随后用抗小鼠PE缀合物探测细胞。总小鼠IgG用作同种型对照。FACS分析表明,超过90%的纯化VLP表达hCLDN18.2 EL1(图6)。纯化的VLP用于加强小鼠的免疫。
表达人CLDN18.2和CLDN18.1的癌细胞系。为了促进抗体表征、体外细胞杀伤测定开发和动物异种移植模型开发,以下癌细胞系购自ATCC,Manassas,VA:1)胃癌细胞系KatoIII、NCI-N87、NUGC4和SNU-16,所有这些细胞系都表达CLDN18.2;2)肺癌细胞系A529,该细胞系表达CLDN18.1。
小鼠免疫。用编码CLDN18.2的真核表达载体免疫Balb/C小鼠。简而言之,每隔两周使用基因枪系统(Bio-rad,Hercules,CA)肌内注射70μg pCMV3-hCLDN18.2质粒,注射最多四次,并且最后共同施用107个3T3-hCLDN18.2细胞和10μg表达hCLDN18.2-EL1的VLP来增强免疫。在使用基准IMAB362抗体作为阳性对照的免疫过程中,使用基于CHO-hCLDN18.2细胞的ELISA测定来监测血清滴度。
杂交瘤融合、筛选和亚克隆。在最后增强免疫后,选择三只针对基准IMAB362抗体具有高血清滴度的小鼠进行杂交瘤融合实验。在最后增强免疫三天之后,通过离心将来自淋巴结和脾脏的刚刚收获的小鼠B细胞与小鼠NS0骨髓瘤细胞共沉淀,并通过电穿孔进行融合。将融合的细胞重悬于HAT选择培养基中并分配到96孔微量滴定板中(每次融合60个板)。使杂交瘤生长至至少50%融合度(融合后10天-14天),然后使用基于CHO-hCLDN18.2细胞的ELISA以IMAB362作为阳性对照来筛选CLDN18.2特异性抗体的产生。然后用表达CLDN18.2和CLDN18.1的细胞通过FACS分析确认阳性克隆。只有那些具有特异性和比基准IMAB362抗体更强结合信号的克隆才进行亚克隆,并进行2轮-3轮有限稀释克隆以确认克隆性。
FACS细胞结合测定。将细胞与5μg/mL的抗claudin 18.2一抗在PBS中于4℃下温育三十分钟,然后在洗掉过多的一抗后加入对人Fc具有特异性的藻红蛋白标记的二抗。在FACSCalibur细胞仪(BD biosciences,Franklin Lakes,New Jersey,U.S.)上分析之前,用1%多聚甲醛(PFA)固定细胞。对照是仅具有二抗的细胞,其平均荧光强度(MFI)设定为5。
抗体纯化和表征。在筛选约4000个杂交瘤克隆之后,选择表现出高于基准IMAB362抗体的结合信号的5个克隆进行亚克隆。将5个最终亚克隆杂交瘤的细胞以约106个细胞/mL的密度扩增到50mL-100mL培养物,并使用标准蛋白质A或蛋白质G柱来纯化所分泌的抗体。对纯化的抗体进行表征以进一步确认它们与重组和内源性细胞系的结合特异性和亲和力。
抗体基因测序。使用表2中公开的简并引物(靶向前导序列区)通过PCR扩增五种选定的前导鼠抗体的重链和轻链可变基因,并将PCR产物直接用于第一重测序。为了获得清晰的读数,增加TA克隆/测序步骤作为最终确认。将VH和VL序列克隆到人IgG1恒定区以形成嵌合抗体。将表达所选抗CLDN18.2抗体的相应重链和轻链的质粒在HEK293细胞中瞬时共表达。以聚乙烯亚胺(PEI)作为转染试剂进行共转染。转染6天-8天后收集上清液。通过蛋白质A层析来纯化抗体。五个小鼠克隆的重链和轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:36-45)示于图13中。
表2
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R=AG,Y=CT,M=AC,K=GT,S=CG,W=AT,H=ACT,B=CGT,V=ACG,D=AGT,N=ACGT
32G4和47D10克隆的人源化。使用种系CDR移植来将小鼠克隆32G4和47D10的可变区(包括VH和VL)人源化。简而言之,将原始鼠序列与所有人种系序列进行比对。分析原始小鼠和最近匹配的种系序列的序列倾向性,并选择最适当的种系框架。将来自亲本小鼠抗CLDN18.2抗体的互补决定区(CDR)移植到人框架上,并根据需要引入回复突变。对于32G4和47D10两者,产生四种人源化VH和四种人源化VL序列。可将来自每个克隆的四种VH和VL序列变体组合以产生用于32G4或47D10的16种人源化抗体变体。32G4和47D10的四种人源化VH和VL变体的氨基酸序列分别如图14和图15所示。
人源化完整IgG1 32G4和47D10表达构建体的构建。构建用于32G4和47D10的两种人源化完整IgG1抗体变体,并将其用于进一步表征。来自32G4和47D10的两种完整人源化IgG1抗体的氨基酸序列分别如图16和图17所示。
抗CLDN18.2×CD3双特异性抗体的工程化和表达。分别将抗CLDN18.2抗体的人源化32G4变体V8和V9以及人源化47D10变体V6和V7的可变重链和轻链基因序列密码子优化、合成并插入到具有人IgG1的恒定区基因的哺乳动物表达质粒(含有LALA突变:L234A和L235A)中。将人源化SP34或OKT3抗CD3 scFv连接到抗CLDN18.2抗体的轻链的C端。制备十个抗CLDN18.2×CD3双特异性抗体构建体:32G4-V8×OKT3、32G4-V9×OKT3、47D10-V6×OKT3、47D10-V7×OKT3、32G4-V8×huSP34、32G4-V9×huSP34、47D10-V6×huSP34、47D10-V7×huSP34、32G4-V8×huSP34-v5和47D10-V7×huSP34-v5。通过插入片段的正向和反向测序来确认最终序列。十种抗CLDN18.2×CD3双特异性抗体的氨基酸序列示于图20-图23和图26中。将表达特定的抗CLDN18.2×CD3双特异性抗体的相应重链和轻链的质粒在HEK293细胞中瞬时共表达。以聚乙烯亚胺(PEI)作为转染试剂进行共转染。转染6天-8天后收集上清液。通过蛋白质A层析来纯化双特异性抗体。
实施例2:本技术的抗CLDN18.2抗体的表征
基于五个克隆(32G4、47D10、29G4、31A6和15B10)与人CLDN18.2蛋白质的结合亲和力和选择性结合来选择它们。FACS数据在每幅图的右上图中显示MFI值。
如图7所示,通过FACS分析确定,鼠克隆32G4、47D10、29G4、31A6和15B10与CLDN18.2的结合比它们各自与CLDN18.1的结合强至少1000倍。使用FACS细胞表面结合分析进一步评估五个鼠克隆与人CLDN18.2的结合亲和力。如图8所示,32G4、47D10、29G4、31A6和15B10与人CLDN18.2结合的EC50分别为0.502nM、1.973nM、1.260nM、10.903nM和2.196nM。32G4-huIgG1-V8、32G4-huIgG1-V9、47D10-huIgG1-V6和47D10-huIgG1-V7与人CLDN18.2结合的EC50分别为0.147nM、0.129nM、0.22nM和0.361nM。参见图9A-图9B。如图19所示,与IMAB362阳性对照抗体相比,人源化32G4和47D10抗体变体显示出与食蟹猴和小鼠claudin18.2靶蛋白质的结合增加。
ADCC测定。使用生物发光报告基因测定(Promega目录号7015,Madison,WI)进行抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定,其中具有NFAT-luc和Fc-RIIIa的工程化Jurkat细胞用作效应细胞并且NUGC4胃癌细胞用作靶细胞。简而言之,将PBMC在含有50ng/mL IL-2的完全RPMI1640培养基中培养过夜(18小时)。根据制造商的说明书进行ADCC测定。简而言之,将2×104个NUGC4(靶细胞)接种到96孔板的每个孔中,并在100μL/孔的完全生长培养基中培养过夜。向每个孔中加入50μL抗CLDN18.2抗体(浓度为0μg/mL、0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL)。将50μl培养基中的6×104个Jurkat效应细胞加入每个孔中。轻轻混合细胞。21小时后,将板以1000rpm离心5分钟。然后,从每个孔中收集50μL细胞培养基,并测定乳酸脱氢酶(LDH)的释放作为细胞毒性的量度。如图18所示,与IMAB362阳性对照抗体相比,本技术的32G4和47D10单克隆抗体表现出优异的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
这些结果表明,本技术的抗CLDN18.2免疫球蛋白相关组合物可用于检测生物样品中的CLDN18.2多肽的方法中。
实施例3:本技术的抗CLDN18.2抗体的体内和体外细胞毒活性的表征
体外癌细胞杀伤测定(TDCC:T细胞依赖性细胞毒性)。使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法进行体外癌细胞杀伤测定,该活力测定法通过测量由活细胞释放的ATP来监测活细胞。简而言之,在一天前将靶细胞(claudin 18.2-HEK293)以10k/孔接种在RPMI1640培养基中。培养细胞直至它们达到50%融合度。以1:10连续稀释将抗CLDN18.2×抗CD3抗体32G4-V8×OKT3、32G4-V9×OKT3、47D10-V6×OKT3和47D10-V7×OKT3(参见图20-图21)稀释。IMAB-362-CD3(OKT3)用作阳性基准对照,并且同种型CD3(OKT3)用作阴性对照。在去除培养的靶细胞claudin 18.2-HEK293的上清液后,加入50μL/孔的稀释抗体,然后加入50μL/孔的PBMC,并将培养物在37℃下保持48小时。根据制造商的说明书(Promega,Madison,WI),使用CellTiter-Glo试剂盒进行ATP测定。图24示出了与IMAB362-抗CD3基准抗体和阴性同种型对照相比,32G4-抗CD3和47D10-抗CD3双特异性抗体变体的示例性胃癌细胞杀伤(TDCC)测定数据。如图24所示,与IMAB-362-CD3阳性对照抗体相比,本技术的CLDN18.2双特异性抗体在低至0.001nM的浓度下显示出优异的TDCC活性。
体内小鼠异种移植模型开发。在BRG(Balb/c Rag2-/-,IL2Rγ-/-)小鼠中开发了使用Kato-III和NUGC4的胃癌细胞系异种移植(CDX)模型。这种小鼠品系缺乏适应性免疫细胞和NK细胞,并用于癌细胞移植。将两千五百万个癌细胞植入皮下,每周用卡尺测量两次肿瘤体积。一旦肿瘤达到约1500mm3,就将动物随机用于疗效研究。将动物分成以下三组。第1组:5只实验小鼠(实验组具有32G4-V8×huSP34-v5抗CLDN18.2×抗CD3;剂量浓度:5mg/KG;注射时间表:每隔一天;途径:IV);第2组:5只对照小鼠(PBS/盐水;注射时间表:每隔一天;途径:IV);第3组:基准抗体(IMAB362×抗CD3,5mg/KG,注射时间表:每隔一天;途径:IV)。肿瘤测量每周进行两次,直至移植后40天。图27示出了与阴性对照(PBS)相比,32G4-V8×huSP34-v5在小鼠异种移植胃癌模型中的示例性体内疗效。如图27所示,32G4-V8×huSP34-v5双特异性抗体在小鼠模型中显示出对胃肿瘤生长的强烈抑制。
本技术的抗CLDN18.2免疫球蛋白相关组合物表现出针对CLDN18.2相关癌症的强效的体外和/或体内细胞毒性活性。因此,本技术的免疫球蛋白相关组合物可用于治疗有需要的受试者的Claudin 18.2相关癌症。
实施例4:本技术的抗CLDN18.2抗体的稳定性
在SEC-HPLC和TDCC癌细胞杀伤活性评估1天、3天、7天和14天之后,在冷冻/解冻(-80℃)/(RT)循环中以及在4℃、室温(25℃)和40℃下评估32G4-V8×huSP34-v5分子的稳定性。在三种缓冲液条件下测试样品(缓冲液1:20mM柠檬酸钠、0.02% PS 80,pH 6.0;缓冲液2:20mM柠檬酸钠、5.8%蔗糖、0.02%聚山梨酯80,pH 7.2;缓冲液3:PBS,pH 7.4)。如图28所示,32G4-V8×huSP34-v5双特异性抗体在所测试的条件下保持稳定,并且如图29所示,32G4-V8×huSP34-v5双特异性抗体在所测试的条件下保持癌细胞杀伤活性。
这些结果表明,本技术的抗CLDN18.2免疫球蛋白相关组合物稳定用于检测生物样品中的CLDN18.2多肽或治疗有需要的受试者的Claudin 18.2相关癌症的方法中。
等同物
本技术不限于本申请中描述的特定实施方案,这些特定实施方案旨在作为本技术的各个方面的单一说明。在不脱离本技术的实质和范围的情况下,可对本技术进行许多修改和变型,这对本领域技术人员来说是显而易见的。除了本文列举的那些之外,本技术范围内的功能等同的方法和装置对于本领域技术人员根据前述描述将是显而易见的。此类修改和变型旨在落在本技术的范围内。应当理解,本技术不限于特定的方法、试剂、化合物组合物或生物系统,它们当然可以变化。还应当理解,本文所用的术语仅为了描述具体实施方案的目的,并非旨在进行限制。
此外,在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下,本领域技术人员将认识到本公开由此也根据马库什组的任何个体成员或成员的亚组描述。
如本领域技术人员将理解的,为了任何和所有目的,特别是在提供书面描述方面,本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可容易地被识别为充分描述并能够将相同的范围分解成至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例,本文讨论的每个范围都可容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。正如本领域技术人员还将理解的,诸如“最多”、“至少”、“大于”、“小于”等的所有语言包括列举的数字,并指代可随后分解成如上所述的子范围的范围。最后,如本领域技术人员所理解的,范围包括每个单独的成员。因此,例如,具有1个-3个单元的组是指具有1个、2个或3个单元的组。类似地,具有1个-5个单元的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个单元的组,等等。
本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物均通过引用方式整体并入,包括所有图和表,只要它们不与本说明书的明确教导内容不一致。
Claims (60)
1.一种双特异性抗体或其抗原结合片段,所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含结合Claudin 18.2表位的第一抗原结合部分和结合到第二表位的第二抗原结合部分,其中所述第一抗原结合部分包含第一重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和第一轻链免疫球蛋白可变结构域(VL),其中所述第二抗原结合部分包含第二VH和第二VL,并且其中:
(a)所述第一VH包含SEQ ID NO:6的VH-CDR1序列、SEQ ID NO:7的VH-CDR2序列和SEQ IDNO:8的VH-CDR3序列,并且/或者所述第一VL包含SEQ ID NO:9的VL-CDR1序列、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:155的VL-CDR2序列和SEQ ID NO:11的VL-CDR3序列;
(b)所述第一VH包含SEQ ID NO:12的VH-CDR1序列、SEQ ID NO:
13的VH-CDR2序列和SEQ ID NO:14的VH-CDR3序列,并且/或者所述第一VL包含SEQ IDNO:15的VL-CDR1序列、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:156的VL-CDR2序列和SEQ ID NO:17的VL-CDR3序列;
(c)所述第一VH包含SEQ ID NO:18的VH-CDR1序列、SEQ ID NO:
19的VH-CDR2序列和SEQ ID NO:20的VH-CDR3序列,并且/或者所述第一VL包含SEQ IDNO:21的VL-CDR1序列、SEQ ID NO:22的VL-CDR2序列和SEQ ID NO:23的VL-CDR3序列;
(d)所述第一VH包含SEQ ID NO:24的VH-CDR1序列、SEQ ID NO:
25的VH-CDR2序列和SEQ ID NO:26的VH-CDR3序列,并且/或者所述第一VL包含SEQ IDNO:27的VL-CDR1序列、SEQ ID NO:28的VL-CDR2序列和SEQ ID NO:29的VL-CDR3序列;或者
(e)所述第一VH包含SEQ ID NO:30的VH-CDR1序列、SEQ ID NO:
31的VH-CDR2序列和SEQ ID NO:32的VH-CDR3序列,并且/或者所述第一VL包含SEQ IDNO:33的VL-CDR1序列、SEQ ID NO:34的VL-CDR2序列和SEQ ID NO:35的VL-CDR3序列。
2.一种双特异性抗体或其抗原结合片段,所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含结合Claudin 18.2表位的第一抗原结合部分和结合到第二表位的第二抗原结合部分,其中所述第一抗原结合部分包含第一重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和第一轻链免疫球蛋白可变结构域(VL),其中所述第二抗原结合部分包含第二VH和第二VL,并且其中所述第一VH包含选自SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46-49或54-57中任一者的氨基酸序列;并且/或者(b)所述第一VL包含选自SEQ ID NO:37、39、41、43、45、50-53或58-61中任一者的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗体或抗原结合片段,其中所述第二VH包含选自SEQ ID NO:97、99、100、101、102或157中任一者的氨基酸序列;并且/或者(b)所述第二VL包含选自SEQ ID NO:98、103或158中任一者的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段,所述双特异性抗体或抗原结合片段还包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE的同种型的Fc结构域。
5.根据权利要求4所述的双特异性抗体,所述双特异性抗体包含IgG1恒定区,所述恒定区包含选自N297A、K322A、L234A和L235A的一个或多个氨基酸取代;或者包含IgG4恒定区,所述恒定区包含S228P突变。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的双特异性抗原结合片段,其中所述抗原结合片段选自Fab、F(ab')2、Fab'、scFv和Fv。
7.一种双特异性抗体,所述双特异性抗体包含结合Claudin 18.2表位的第一抗原结合部分和结合到第二表位的第二抗原结合部分,其中所述双特异性抗体包含重链(HC)氨基酸序列或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体以及/或者轻链(LC)氨基酸序列或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体,所述重链氨基酸序列包括SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ IDNO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:159、SEQID NO:161,所述轻链氨基酸序列包括SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ IDNO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162。
8.根据权利要求7所述的双特异性抗体,所述双特异性抗体包含分别选自以下的HC氨基酸序列和LC氨基酸序列:SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:81和SEQ IDNO:82、SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87和SEQID NO:88、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:160以及SEQID NO:161和SEQ ID NO:162。
9.一种双特异性抗体,所述双特异性抗体包含结合Claudin 18.2表位的第一抗原结合部分和结合到第二表位的第二抗原结合部分,其中所述第一抗原结合部分包含第一重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和第一轻链免疫球蛋白可变结构域(VL),其中所述第二抗原结合部分包含第二VH和第二VL,并且其中(a)所述第一VL序列与SEQ ID NO:37、39、41、43、45、50-53或58-61中任一者的所述轻链免疫球蛋白可变结构域序列具有至少95%同一性;并且/或者(b)所述第一VH序列与SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46-49或54-57中任一者的所述重链免疫球蛋白可变结构域序列具有至少95%同一性,任选地其中所述第二VH包含选自SEQ IDNO:97、99、100、101、102或157中任一者的氨基酸序列;并且/或者(b)所述第二VL包含选自SEQ ID NO:98、103或158中任一者的氨基酸序列。
10.一种双特异性抗体,所述双特异性抗体包含结合Claudin 18.2表位的第一抗原结合部分和结合到第二表位的第二抗原结合部分,其中所述双特异性抗体包含:
(a)与存在于SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:
67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:160或SEQ ID NO:162中的LC序列具有至少95%同一性的LC序列;以及/或者
(b)与存在于SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:
66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:159或SEQ ID NO:161中的HC序列具有至少95%同一性的HC序列。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的双特异性抗体,其中所述抗体包含IgG1恒定区,所述恒定区包含选自N297A、K322A、L234A和L235A的一个或多个氨基酸取代。
12.一种双特异性抗体,所述双特异性抗体包含第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链,其中所述第一多肽链和所述第二多肽链彼此共价键合,所述第二多肽链和所述第三多肽链彼此共价键合,并且所述第三多肽链和所述第四多肽链彼此共价键合,并且其中:
(a)所述第一多肽链和所述第四多肽链中的每一者在N-末端至C-末端方向上包含:
(i)能够特异性结合到第一表位的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域;
(ii)所述第一免疫球蛋白的轻链恒定结构域;
(iii)包含氨基酸序列(GGGGS)3的柔性肽接头;和
(iv)连接到第二免疫球蛋白的互补重链可变结构域的所述第二免疫球蛋白的轻链可变结构域,或连接到第二免疫球蛋白的互补轻链可变结构域的所述第二免疫球蛋白的重链可变结构域,其中所述第二免疫球蛋白的所述轻链可变结构域和所述重链可变结构域能够特异性结合到第二表位,并通过包含氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽接头连接在一起以形成单链可变片段;并且
(b)所述第二多肽链和所述第三多肽链中的每一者在所述N-末端至C-末端方向上包含:
(i)能够特异性结合到所述第一表位的所述第一免疫球蛋白的重链可变结构域;和
(ii)所述第一免疫球蛋白的重链恒定结构域;并且
其中所述第一免疫球蛋白的所述重链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述重链可变结构域选自SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46-49或54-57中的任一者,并且/或者所述第一免疫球蛋白的所述轻链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述轻链可变结构域选自SEQ ID NO:37、39、41、43、45、50-53或58-61中的任一者。
13.根据权利要求12所述的双特异性抗体或抗原结合片段,其中所述第一免疫球蛋白的所述重链可变结构域选自SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46-49或54-57中的任一者,所述第一免疫球蛋白的所述轻链可变结构域选自SEQ ID NO:37、39、41、43、45、50-53或58-61中的任一者,所述第二免疫球蛋白的所述重链可变结构域选自SEQ ID NO:97、99、100、101、102或157中的任一者,并且所述第二免疫球蛋白的所述轻链可变结构域选自SEQ ID NO:98、103或158中的任一者。
14.根据权利要求12所述的双特异性抗体或抗原结合片段,其中所述第一免疫球蛋白的所述重链可变结构域选自SEQ ID NO:97、99、100、101、102或157中的任一者,所述第一免疫球蛋白的所述轻链可变结构域选自SEQ ID NO:98、103或158中的任一者,所述第二免疫球蛋白的所述重链可变结构域选自SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46-49或54-57中的任一者,并且所述第二免疫球蛋白的所述轻链可变结构域选自SEQ ID NO:37、39、41、43、45、50-53或58-61中的任一者。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段,其中所述抗体或抗原结合片段结合到CLDN18.2多肽,所述多肽包含胞外环1(EL1)序列。
16.根据权利要求15所述的双特异性抗体或抗原结合片段,其中所述胞外环1(EL1)序列包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列,或者所述CLDN18.2多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段,其中所述抗体为单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
18.根据权利要求1至5或7至17中任一项所述的双特异性抗体,其中所述抗体缺乏α-1,6-岩藻糖修饰。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段,其中所述双特异性抗体或抗原结合片段结合到T细胞、B细胞、骨髓细胞、浆细胞或肥大细胞。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段,其中所述第二表位是CD3、CD4、CD8、CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、CD22、CD14、CD15、CD16、CD123、TCRγ/δ、NKp46、KIR或小分子DOTA半抗原。
21.一种重组核酸序列,所述重组核酸序列编码根据权利要求1至20中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段。
22.一种宿主细胞或载体,所述宿主细胞或载体包含根据权利要求21所述的重组核酸序列。
23.一种药物组合物,所述药物组合物包含根据权利要求1至20中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体。
24.根据权利要求23所述的药物组合物,其中所述药物组合物还包含选自以下的药剂:同位素、染料、色原、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或它们的任何组合。
25.一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至20中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段或者根据权利要求23至24中任一项所述的药物组合物,其中所述双特异性抗体或抗原结合片段与CLDN18.2特异性结合。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述癌症是实体瘤。
27.根据权利要求25或26所述的方法,其中所述癌症选自胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法,其中所述双特异性抗体或抗原结合片段与另外的治疗剂分开、依次或同时施用于所述受试者。
29.根据权利要求28所述的方法,其中所述另外的治疗剂是以下治疗剂中的一者或多者:烷化剂、铂剂、紫杉烷、长春花剂、抗雌激素药物、芳香酶抑制剂、卵巢抑制剂、VEGF/VEGFR抑制剂、EGF/EGFR抑制剂、PARP抑制剂、细胞生长抑制生物碱、细胞毒素抗生素、抗代谢药、内分泌/激素药剂、T细胞和双膦酸盐治疗剂。
30.根据权利要求28所述的方法,其中所述另外的治疗剂是免疫调节/刺激抗体。
31.根据权利要求30所述的方法,其中所述免疫调节/刺激抗体是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM3抗体、抗4-1BB抗体、抗CD73抗体、抗GITR抗体或抗LAG-3抗体。
32.一种用于体内检测受试者的癌症的方法,所述方法包括
(a)向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至20中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段,其中所述双特异性抗体或抗原结合片段被配置成定位于表达CLDN18.2的癌细胞并用放射性同位素标记;以及
(b)通过检测由所述双特异性抗体或抗原结合片段发射的高于参考值的放射性水平来检测所述受试者中肿瘤的存在。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述受试者被诊断患有或疑似患有癌症。
34.根据权利要求32或33所述的方法,其中使用正电子发射断层扫描或单光子发射计算机断层扫描来检测由所述双特异性抗体或抗原结合片段发射的所述放射性水平。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的方法,所述方法还包括向所述受试者施用有效量的免疫缀合物,所述免疫缀合物包含缀合到放射性核素的根据权利要求1至20中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段。
36.根据权利要求32至35中任一项所述的方法,其中所述癌症是实体瘤。
37.根据权利要求32至36中任一项所述的方法,其中所述癌症选自胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌。
38.根据权利要求25至37中任一项所述的方法,其中所述受试者是人。
39.一种试剂盒,所述试剂盒包括根据权利要求1至20中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段和使用说明。
40.根据权利要求39所述的试剂盒,其中所述双特异性抗体或抗原结合片段与选自放射性标记、荧光标记和显色标记的至少一种可检测标记偶联。
41.根据权利要求39或40所述的试剂盒,所述试剂盒还包含与根据权利要求1至20中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段特异性结合的二抗。
42.一种用于检测生物样品中CLDN18.2蛋白质表达水平的方法,所述方法包括使所述生物样品与根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触,并检测与所述生物样品中CLDN18.2蛋白质的结合。
43.一种抗CD3抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL),其中:(a)所述VH包含SEQ ID NO:99-102或SEQ ID NO:157中任一者的氨基酸序列;并且/或者(b)所述VL包含SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:158的氨基酸序列。
44.根据权利要求43所述的抗CD3抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段包含分别选自SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:103以及SEQ ID NO:157和SEQ ID NO:158的重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)氨基酸序列。
45.根据权利要求43或44所述的抗CD3抗体或抗原结合片段,其中所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
46.根据权利要求43至45中任一项所述的抗CD3抗体或抗原结合片段,所述抗体或抗原结合片段还包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE的同种型的Fc结构域。
47.根据权利要求46所述的抗CD3抗体,所述抗体包含IgG1恒定区,所述恒定区包含选自N297A、L234A、L235A和K322A的一个或多个氨基酸取代。
48.根据权利要求46所述的抗CD3抗体,所述抗体包含IgG4恒定区,所述恒定区包含S228P突变。
49.根据权利要求43至48中任一项所述的抗CD3抗体,其中所述抗体缺乏α-1,6-岩藻糖修饰。
50.根据权利要求43至45或49中任一项所述的抗CD3抗原结合片段,其中所述抗原结合片段选自Fab、F(ab')2、Fab'、scFv和Fv。
51.一种抗CD3多特异性抗体,所述多特异性抗体包含第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链,其中所述第一多肽链和所述第二多肽链彼此共价键合,所述第二多肽链和所述第三多肽链彼此共价键合,并且所述第三多肽链和所述第四多肽链彼此共价键合,并且其中:
(a)所述第一多肽链和所述第四多肽链中的每一者在N-末端至C-末端方向上包含:
(i)能够特异性结合到第一表位的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域;
(ii)所述第一免疫球蛋白的轻链恒定结构域;
(iii)包含氨基酸序列(GGGGS)3的柔性肽接头;和
(iv)连接到第二免疫球蛋白的互补重链可变结构域的所述第二免疫球蛋白的轻链可变结构域,或连接到第二免疫球蛋白的互补轻链可变结构域的所述第二免疫球蛋白的重链可变结构域,其中所述第二免疫球蛋白的所述轻链可变结构域和所述重链可变结构域能够特异性结合到第二表位,并通过包含氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽接头连接在一起以形成单链可变片段;并且
(b)所述第二多肽链和所述第三多肽链中的每一者在所述N-末端至C-末端方向上包含:
(i)能够特异性结合到所述第一表位的所述第一免疫球蛋白的重链可变结构域;和
(ii)所述第一免疫球蛋白的重链恒定结构域;并且其中所述第一免疫球蛋白的所述重链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:99-102或SEQID NO:157中的任一者,并且/或者所述第一免疫球蛋白的所述轻链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:158。
52.根据权利要求45至51中任一项所述的抗CD3多特异性抗体,其中所述多特异性抗体或抗原结合片段结合到T细胞、B细胞、骨髓细胞、浆细胞或肥大细胞。
53.根据权利要求45至52中任一项所述的抗CD3多特异性抗体或抗原结合片段,其中所述多特异性抗体或抗原结合片段结合到CD3、GPA33、HER2/neu、GD2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、MUM-1、CDK4、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、p15、gp75、β-连环蛋白、ErbB2、癌抗原125(CA-125)、癌胚抗原(CEA)、RAGE、MART(黑色素瘤抗原)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、酪氨酸酶、Pmel 17(gp100)、GnT-V内含子V序列(N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V内含子V序列)、前列腺癌psm、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、EBNA(EB病毒核抗原)1-6、LMP2、p53、肺抗性蛋白质(LRP)、Bcl-2、前列腺特异性抗原(PSA)、Ki-67、CEACAM6、结肠特异性抗原-p(CSAp)、HLA-DR、CD40、CD74、CD138、EGFR、EGP-1、EGP-2、VEGF、PlGF、胰岛素样生长因子(ILGF)、腱生蛋白、血小板衍生生长因子、IL-6、CD20、CD19、PSMA、CD33、CD123、MET、DLL4、Ang-2、HER3、IGF-1R、CD30、TAG-72、SPEAP、CD45、L1-CAM、Lewis Y(Ley)抗原、E-钙粘蛋白、V-钙粘蛋白、GPC3、EpCAM、CD4、CD8、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、CD22、CD14、CD15、CD16、CD123、TCRγ/δ、NKp46、KIR、CD56、DLL3、PD-1、PD-L1、CD28、CD137、CD99、GloboH、CD24、STEAP1、B7H3、聚唾液酸、OX40、OX40-配体、肽MHC复合物(其中肽源自TP53、KRAS、MYC、EBNA1-6、PRAME、MART、酪氨酸酶、MAGEA1-A6、pmel17、LMP2或WT1)或小分子DOTA半抗原。
54.一种组合物,所述组合物包含根据权利要求43至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体,其中所述抗体或抗原结合片段任选地与选自以下的药剂缀合:同位素、染料、色原、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或它们的任何组合。
55.一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求45至53中任一项所述的多特异性抗CD3抗体或抗原结合片段或者根据权利要求54所述的组合物。
56.一种T细胞,所述细胞离体装配有根据权利要求45-53中任一项所述的抗CD3多特异性抗体或抗原结合片段。
57.根据权利要求1至20中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段,其中所述双特异性抗体或抗原结合片段结合到T细胞和/或CD3。
58.一种T细胞,所述细胞离体装配有根据权利要求57所述的双特异性抗体或抗原结合片段。
59.一种制备治疗性T细胞的离体方法,所述方法包括将(a)根据权利要求57所述的双特异性抗体或抗原结合片段或(b)根据权利要求45至53中任一项所述的抗CD3多特异性抗体或抗原结合片段与T细胞结合,其中所述T细胞任选地是人T细胞,并且其中所述结合是非共价结合。
60.一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求56或58所述的T细胞。
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