PT99934B - Processo para a producao de um anticorpo anti-htnf alfa recombinante ou humanizado - Google Patents

Processo para a producao de um anticorpo anti-htnf alfa recombinante ou humanizado Download PDF

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Description

A presente invenção refere-se a moléculas de anticorpo recombinantes, em particular humanizadas, possuindo uma especificidade para determinantes antigénicos do factor alfa da necrose de tumores (TNF-α), a processos para a sua produção utilizando a tecnologia de ADN recombinante, e refere ainda as suas utilizações terapêuticas.
Para os objectivos da presente descrição o termo molécula de anticorpo recombinante é utilizado para
descrever uma molécula de anticorpo produzida por qualquer processo que envolva a utilização da tecnologia de ADN recombinante, incluindo quaisquer análogos de imunoglobulinas naturais ou os seus fragmentos.
Também para os objectivos da presente descrição o termo molécula de anticorpo humanizada é utilizado para descrever uma molécula que possui um ponto de ligação de antigénio derivado de uma imunoglobulina de uma espécie não humana, e as partes derivadas da imunoglobulina restantes da molécula derivadas de uma imunoglobulina humana. Assim as moléculas de anticorpo humanizadas incluem moléculas de anticorpo quiméricas humanizadas compreendendo domínios de regiões variáveis de cadeia pesada e/ou leve completas não humanos ligados a domínios de regiões constantes humanos. As moléculas de anticorpo humanizadas também compreendem moléculas de anticorpo humanizadas enxertadas com CDR compreendendo um ou mais CDRs de um anticorpo não humano enxertado a uma estrutura de regiões variável humana de cadeia pesada e/ou leve.
A especificidade de ligação de antigénio dos anticorpos é determinada pelas suas regiões determinantes complementares (CDRs) que são sequências de péptidos relativamente pequenas contidas nas regiões de estrutura dos domínios variáveis. Existem três tipos de CDRs, (CDR1, CDR2 e CDR3) em cada um dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve.
A abreviatura MAb é utilizada para indicar um
V
referência a várias publicações por número, e estas publicações são listadas em ordem numérica no final da descrição.
Antecedentes de Invenção
As imunoglobulinas naturais são conhecidas desde há vários anos, tal como os seus vários fragmentos, tais como os fragmentos Fab, Fv, (Fab')2 e Fc, que podem ser derivados por clivagem enzimática. As imunoglobulinas naturais compreendem uma molécula geralmente com a forma de um Y possuindo um elo de ligação a antigénio na direcção da extremidade de cada braço superior. A parte restante da estrutura, e particularmente a haste do Y, efectua a mediação das funções efectoras associadas com as imunoglobulinas.
As imunoglobulinas naturais têm sido utilizadas em ensaios, diagnóstico e, numa extensão mais limitada, em terapia. Contudo, essas utilizações, especialmente em terapia, têm sido prejudicadas até recentemente pela natureza policlonal das imunoglobulinas naturais. Um avanço significativo para a realização do potencial das imunoglobulinas como agentes terapêuticos foi a descoberta de procedimentos para a produção reprodutível de anticorpos monoclonais (MAbs) com especificidade definida (1).
Contudo, a maior parte dos MAbs são produzidos por hibridomas que são fusões de células do baço de
roedores com células de mielomas de roedores. Elas são assim essencialmente proteínas de roedores. Existem muito poucas referências para a produção de MAbs humanos.
Dado que os MAbs mais disponíveis são de origem de roedores, eles são naturalmente antigénicos em seres humanos, e assim podem dar origem a uma resposta imunoindesejável designada por resposta de HAMA (Anticorpo Anti-Rato Humano) se o MAb for administrado a um ser humano. Assim, .a utilização de MAbs de roedores como agentes terapêuticos em seres humanos é inerentemente limitada pelo facto de o paciente humano ter uma resposta imunológica ao MAb e ou o remove inteiramente ou pelo menos reduz a sua eficiência. Na prática, os MAbs de origem de roedores não devem ser utilizados em pacientes em mais do que um ou alguns tratamentos, dado que de desenvolve uma resposta HAMA rapidamente tornando o MAb ineficaz além de dar origem a reacções indesejáveis. Por exemplo, ο OKT3 que é um IgG2a/k MAb de rato que reconhece um antigênio do complexo do receptor de célula T - CD3, foi aprovado para utilização em muitos países como imunossupressor no tratamento da rejeição aguda de enxertos [Chatenoud e col.
(2) e Jeffers e col. (3)]. Contudo, tendo em conta a natureza de origem de roedores deste e de outros MAbs, pode aparecer durante a utilização uma resposta HAMA significativa que pode incluir um componente anti-idiotipo importante. Obviamente, seria muito desejável diminuir ou eliminar esta resposta HAMA indesejável e assim aumentar as
Têm sido feitas propostas para tornar os MAbs não-humanos menos antigénicos em seres humanos. Essas técnicas podem ser genericamente designadas como técnicas de humanização. Estas técnicas envolvem tipicamente a utilização da tecnologia de ADN recombinante para manipular as sequências de ADN que codificam as cadeias de polipéptidos da molécula de anticorpo.
Os processos anteriores para humanizar os MAbs envolviam a produção de anticorpos quiméricos em que o ponto de ligação a antigénio, compreendendo os domínios variáveis completos de um anticorpo, é ligado a domínios constantes derivados de outro anticorpo. Os processos para efectuar esses procedimentos de quimerização são descritos em EP0120694 (Celltech Limited), EP0125023 (Genentech Inc. and City of Hope), EP-A-0 171495 (Res. Dev. Corp. Japan), EP-A-0 173 494 (Stanford University), e WO 86/01533 (Celltech Limited). Estes pedidos de patente antigos referem geralmente processos para a preparação de moléculas de anticorpos que possuem os domínios variáveis de um MAb de rato e os domínios constantes de uma imunoglobulina humana. Esses anticorpos quiméricos humanizados ainda contêm, contudo, uma proporção significativa de sequências de aminoãcidos não humanas, isto é, os domínios variáveis não-humanos completos, e podem assim gerar alguma resposta HAMA, particularmente se administrados durante um longo período [Begent e col. (ref. 4)].
iwoa;)
Numa técnica alternativa, descrita em EP-A0239400 (Winter), foram enxertadas as regiões determinantes complementares (CDRs) de MAb de rato nas estruturas das regiões dos domínios variáveis de uma imunoglobulina humana por meio de mutagénese dirigida a pontos utilizando oligonucleótidos compridos. Esses anticorpos humanizados enxertados com CDR têm uma muito menor probalidade de darem origem a uma resposta HAMA do que os anticorpos quiméricos humanizados tendo em consideração a proporção muito menor de sequências de aminoácidos não-humanos que eles contêm.
O trabalho mais antigo na humanização de MAbs por enxerto de CDR foi efectuado em MAbs que reconhecem antigénios sintéticos, como por exemplo, os antigénios NP ou NIP. Contudo, exemplos em que um MAb de rato que reconhece a lisozima e um MAb de rato que reconhece um antigénio em células T humanas foram humanizadas por enxerto com CDR, foram descritos por Verhoeyen e col. (5) and Riechmann e col. (6) respectivamente. A preparação do anticorpo enxertado com CDR ao antigénio em células T humanas é também descrito em WO 89/07452 (Medicai Research Council).
Em Riechmann e col./Medicai Research Council verificou-se que a transferência das regiões CDR isoladamente [tal como definido em Kabat refs. (7) e (8)] não foi suficiente para conferir uma actividade de ligação a antigénio satisfatória no produto enxertado com CDR. Riechmann e col. verificaram que era necessário converter o i
resíduo de serina na posição 27 da cadeia da sequência pesada humana no resíduo correspondente de fenilalanina de rato para se obter um produto enxertado com CDR que possui uma maior actividade de ligação a antigénio. Este resíduo na posição 27 da cadeia pesada está dentro do anel estrutural adjacente a CDR1. Uma outra construção que também continha adicionalmente uma serina humana para uma
alteração da tirosina de rato na posição 30 da cadeia
pesada não tinha uma actividade de ligação
significativamente alterada em relação ao anticorpo
humanizado com a alteração de serina para fenilalanina apenas na posição 27. Estes resultados indicavam que as alterações nos resíduos da sequência humana fora das regiões CDR, em particular no anel estrutural adjacente a CDR1 da cadeia pesada, podem ser necessárias para obter uma actividade de ligação de antigénio eficaz para anticorpos enxertados com CDR que reconhecem antigénios mais complexos. Mesmo assim a afinidade de ligação dos melhores anticorpos enxertados com CDR obtidos era significativamente inferior ao MAb original.
Recentemente Queen e col. (9) descreveram a preparação de um anticorpo humanizado que se liga a um receptor de interleucina 2, por combinação dos CDRs de um MAb de murina (anti-Tac) com uma estrutura de imunoglobulina humana e regiões constantes. As regiões de estrutura humana foram escolhidas para maximizar a homologia com a sequência anti-Tac MAb. Além disso, foi
utilizada a modelação por computador para identificar os resíduos de aminoácidos na estrutura que poderiam interactuar com os CDRs ou antigénio, e foram utilizados aminoácidos de rato nestas posições no anticorpo numanizado.
No documento WO/07861 de Queen e col. propõem quatro critérios para a designação de imunoglobulinas humanas. 0 primeiro critério é utilizar como receptor humano a estrutura de uma imunoglobulina humana particular que é contrariamente ao habitual, homóloga à imunoglobulina humana que se pretende humanizar, ou utilizar uma estrutura de consenso de muitos anticorpos humanos. O segundo critério é utilizar o aminoácido dador em vez do receptor se o resíduo receptor humano não for o habitual e o resíduo dador é típico para as sequências humanas num resíduo específico da estrutura. 0 terceiro critério é utilizar o resíduo de aminoácido da estrutura dadora em vez da receptora nas posições imediatamente adjacentes aos CDRs. O quarto critério é utilizar o resíduo dador de aminoácidos nas posições da estrutura nas quais se prevê que o aminoácido tenha um átomo na cadeia lateral a uma distância de cerca de 3 A dos CDRs num modelo tridimensional de imunoglobulina e seja susceptível de interactuar com o antigénio ou com os CDRs da imunoglobulina humanizada. É proposto que o segundo, terceiro ou quarto critério possa ser aplicado em adição ou alternativamente ao primeiro critério, e possa ser aplicado
isoladamente ou em qualquer combinação.
documento WQ9Q/07861 descreve detalhadamente a preparação de um único anticorpo humanizado e enxertado com CDR, num anticorpo humanizado possuindo uma especificidade para a proteína p55 Tac do reeeptor IL-2. A combinação de todos os quatro critérios, tal acomo acima referidos, foi utilizada na concepção deste anticorpo humanizado, sendo utilizadas como receptoras as estruturas da região variável do anticorpo humano EU (7). No anticorpo humanizado resultante os CDRs dadores foram como definidos por Kabat e col. (7 e 8) e além disso foram utilizados os resíduos de dador de rato em vez dos resíduos de receptores humanos nas posições 27, 30, 48, 66, 67, 89, 91, 94, 103, 104, 105 e 107 na cadeia pesada e nas posições 48, 60 e 63 na cadeia ligeira, das estruturas das regiões variáveis. 0 anticorpo anti-Tac humanizado obtido é referido como tendo uma afinidade para p55 de 3 x 109 M1, que é cerca de um terço do MAb de murina.
Poi ainda investigada a preparação de moléculas de anticorpo humanizadas enxertadas com CDR e foi identificada uma hierarquia de posições dentro da estrutura das regiões variáveis (isto é, fora dos CDRs de Kabat e dos anéis estruturais das regiões variáveis) nas quais as identidades de aminoácido dos resíduos são importantes para se obterem produtos enxertados com CDR com afinidade de ligação satisfatória. Isto permitiu estabelecer um protocolo para a obtenção de produtos enxertados com CDR
satisfatórios que podem ser utilizados em muitas aplicações independentemente do nível da homologia entre a imunoglobulina do dador e a estrutura do receptor. 0 conjunto de resíduos que foram identificados como sendo de importância crítica sobrepõe-se mas não coincide com as regiões identificadas por Queen e col. (9). O pedido de patente Internacional co-pendente W0091/09967 descreve este protocolo para a preparação de cadeias de anticorpo pesadas e ligeiras enxertadas com CDR, em particular humanizadas, e moléculas completas de qualquer especificidade pretendida. 0 conteúdo total do pedido de patente Internacional WO/91/09967 é incorporado na presente descrição como referência.
Tempest e col. (10) descreveram muito recentemente a preparação de um anticorpo monoclonal humano reformulado para utilização na inibição in vivo da infecção pelo vírus sincitial respiratório humano (RSV). Este anticorpo reformulado foi preparado enxertando oligonucleótidos sintéticos que codificam para os CDRs de um MAb de murina, que neutralizam a infecção do RSV, por meio de mutagénese dirigida a sítios na codificação de ADN para as estruturas de um anticorpo monoclonal humano IgGl. Contudo, o anticorpo reformulado simples em que tinham sido transferidos os CDRs isolados entre anticorpos de rato e humanos tinha apenas uma ligação muito fraca para RSV que não era significativamente muito acima da normal. Para restaurar parcialmente a capacidade de ligação provou-se
ser necessário converter adicionalmente os resíduos humanos em resíduos de rato numa região de estrutura adjacente a CDR3 da cadeia pesada. Tempest e col. não converteram resíduos humanos em resíduos de rato nas posições importantes identificadas no protocolo de W0019/09967.
TNFa é uma citocina gue é libertada e interactua com as células do sistema imune. Assim o TNF é libertado por macrofagos que foram activados por um lipopolissacárido (LPS) de bactérias gran negativas. Assim esse TNFa parece ser um mediador endógeno de grande importância envolvido no desenvolvimento e patogénese do choque endotóxico associado com a sépsia bacteriana. Foram propostos anticorpos para TNFa para a profilaxia e o tratamento do choque endotóxico (Beutler e col. (11)). Contudo os anticorpos a TNFa actualmente disponíveis para a utilização nesse tratamento são tipicamente os MAbs de murina. Dado que esses MAbs de murina são apenas para uso limitado para o tratamento de seres humanos tendo em conta a resposta indesejada ΗΔΜΑ (Anticorpo Anti-Rato Humano) que eles podem desenvolver se forem utilizados mais do que uma ou algumas vezes. É assim altamente desejável preparar produtos de anti-TNFa humanizados para a utilização em terapia humana.
O pedido de patente Internacional co-dependente
W0091/09967 descreve, entre outras coisas, a preparação de produtos de anticorpos enxertados com CDR humanizados que têm especificidade para TNFa. Em particular, o documento
W0091/09967 descreve, no Exemplo 5, a preparação de anticorpos enxertados de CDR humanizados específicos para o TNFa humano derivado de MAbs de TNFa anti-humanos de murina identificados como 61E71 (alternativamente conhecidos como CB0006), hTNFl (alternativamente conhecido como CB0010), hTNF3 e 101.4. O presente pedido refere-se especificamente a anticorpos recombinantes, em particular humanizados para TNFa humano, incluindo os descritos em W0091/09967 e outros anticorpos aperfeiçoados enxertados com CDR humanizado para TNFa humano baseados em hTNFl (CB0010) e MAbs de murina 101.4. Outros estudos de vários MAbs de murina anti-TNFa humanos revelaram que o hTNFl e
101.4 têm propriedades particularmente desejáveis para a utilização em terapia anti-TNF.
Resumo da Invenção
Assim a presente invenção proporciona moléculas de anticorpo recombinantes que têm uma especificidade para TNFa humano.
Às moléculas de anticorpo recombinante da invenção são de preferência neutralizantes de TNF, isto é são susceptiveis de reduzir ou inibir uma actividade biológica de TNFa humano medida por ensaios in vitro ou in vivo.
A invenção proporciona de preferência moléculas de anticorpo recombinante possuindo pontos de ligação de antigénio derivados de MAbs de murina CB0006. CB0010, hTNF3 ou 101.4f especialmente os MAbs de murina CB0010 ou 101.4.
As moléculas de anticorpo recombinante da invenção são de preferência moléculas de anticorpo humanizadas incluindo moléculas de anticorpo humanizadas quiméricas e moléculas de anticorpo humanizadas enxertadas com CDR.
Para os objectivos da presente descrição uma molécula de anticorpo humanizada quimérica compreende domínios variáveis completos não-humanos (por exemplo MÀb de murina) ligados a domínios constantes humanos, e uma molécula de anticorpo humanizada enxertada com CDR que compreende um anticorpo de cadeia pesada e/ou ligeira contendo um ou mais CDRs de um anticorpo não-humano (por exemplo um MAb de murina) enxertado numa estrutura de uma região variável humana pesada e/ou ligeira.
Os produtos de anticorpo anti-TNFa humanizados enxertados com CDR da presente invenção incluem o anticorpo TNFa anti-humano e produtos de cadeia ligeira e moléculas tal como definidas no primeiro, segundo, terceiro e quarto aspectos da invenção descrita em WO91/09967.
Descrição Detalhada da Invenção
Assim nas primeiras realizações preferidas, a invenção proporciona uma cadeia pesada de anticorpo antihTNFa humanizado enxertada com CDR possuindo um domínio de regiões variável compreendendo uma estrutura de um receptor humano e regiões de ligação de antigénio dadoras em que a estrutura compreende resíduos de dadores em pelo menos uma
das posições 6, 23 e/ou 24, 48 e/ou 49, 71 e/ou 73, 75 e/ou 76 e/ou 78 e 88 e/ou 91.
De preferência nestas primeiras realizações preferidas, a estrutura de cadeia pesada compreende resíduos dadores nas posições 23, 24, 49, 71, 73 e 78 ou nas posições 23, 24 e 49. Os resíduos nas posições 71, 73 e 78 da estrutura de cadeia pesada são de preferência todos receptores ou todos resíduos dadores.
Especialmente nestas primeiras realizações preferidas a estrutura de cadeia pesada compreende adicionalmente resíduos dadores numa, algumas ou todas as posições 6, 37, 48 e 94. Também é particularmente preferido que os resíduos das posições da estrutura de cadeia pesada que são habitualmente conservados entre espécies, isto é as posições 2, 4, 25, 36, 39, 47, 93, 103, 104, 106 e 107, se não conservados entre dador e receptor, compreendem adicionalmente resíduos dadores. Mais preferivelmente a estrutura de cadeia pesada compreende adicionalmente resíduos dadores nas posições 2, 4, 6, 25, 36, 37, 39, 47, 48, 93, 94, 103, 104, 106 e 107.
Além disso a estrutura de cadeia pesada compreende opcionalmente resíduos de dador numa, nalgumas, ou todas as posições:
e 3, e 76, (se 48 for diferente entre dador e receptor), e 46 (se 48 for o resíduo dador),
e 20 (se 69 for o resíduo dador),
67, e 18 (se 67 for o resíduo dador),
91,
88, e qualquer um ou mais de entre 9, 11, 41, 87, 108, 110 e 112.
Na presente descrição, o anticorpo dador é tipicamente um anticorpo anti-hTNFa não-humano, como por exemplo um MÀb de roedores e o anticorpo receptor é um anticorpo humano.
Nos anticorpos anti-hTNFa humanizados enxertados com CDR da presente invenção, a ligação da região antigénio do dador compreende tipicamente pelo menos um CDR do anticorpo dador. Habitualmente a região de ligação de antigénio do dador compreende pelo menos dois e de preferência todos os três CDRs de cada um das regiões variáveis de cadeia pesada e/ou cadeia leve. Os CDRs podem compreender os CDRs de Kabat, os CDRs do anel estrutural ou um compósito dos CDRs de Kabat e do anel estrutural e qualquer combinação de qualquer destes.
As regiões de ligação de antigénio de domínio variável de cadeia pesada enxertada com CDR compreende, de preferência, CDRs correspondentes aos CDRs de Kabat e CDR2 (resíduos 50-65) e CDR3 (resíduos 95-102) e um compósito de CDRs de Kabat e do anel estrutural em CDR1 (resíduos 2635). Estas designações de CDR preferidas são de preferência utilizadas para as cadeias pesadas enxertadas com CDR das
primeiras realizações preferidas, isto é os resíduos 26-30 são incluídos dentro de CDRl.
As designações dos resíduos acima assinaladas e em outros lugares no presente pedido são numeradas de acordo com a numeração de Kabat [refs. (7) e (8)]. Assim as designações dos resíduos não correspondem sempre directamente à numeração linear dos resíduos de aminoácidos. A sequência real linear de aminoácidos pode conter menos ou mais aminoácidos do que na numeração restrita de Kabat correspondendo a um encurtamento de, ou uma inserção em, de um componente estrutural, quer estrutura, quer CDR, da estrutura de domínios variável básica. Por exemplo, a região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-Tac descrito por Queen e al (9) contem uma única inserção de aminoacido (resíduo 52a) após o resíduo 52 do CDR2 e uma inserção de três aminoácidos (resíduos 82a, 82b e 82c) após o resíduo da estrutura 82, na numeração de Kabat. A correcta numeração de Kabat dos resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo por alinhamento das regiões de homologia da sequência do anticorpo com a sequência normal’1 numerada de Kabat.
Deve notar-se que quando as realizações da molécula de anticorpo humanizada enxertada com CDR da invenção, tal como acima descrita e noutros lugares da presente descrição, são aplicadas a um par particular de anticorpo de dador/receptor, em alguns casos os resíduos de aminoácidos do dador e do receptor podem ser idênticos numa
posição particular identificada por alteração do resíduo dador, e assim não é necessário alteração ao resíduo de estrutura do receptor.
A invenção também proporciona numa segunda realização preferida uma cadeia ligeira de anticorpo antihTNFa humanizada enxertada com CDR possuindo um domínio de regiões variáveis compreendendo uma estrutura de receptor humano e regiões de ligação de antigénio de dador em que a estrutura compreende resíduos do dador em pelo menos uma das posições 1 e/ou 3 e 46 e/ou 47.
A cadeia ligeira enxertada com CDR na segunda realização preferida compreende, de preferência, resíduos dadores nas posições 46 e/ou 47.
A invenção também proporciona numa terceira realização preferida uma cadeia ligeira de anticorpo antihTNFa humanizado enxertado com CDR possuindo um domínio de regiões variável que compreende uma estrutura de receptor humano e regiões de ligação de antigénio de dador em que a estrutura compreende resíduos de dador em pelo menos uma das posições 46, 48, 58 e 71.
Na terceira realização preferida, a estrutura compreende de preferência resíduos dadores em todas as posições 46, 48, 58 e 71.
Nas realizações particularmente preferidas das segunda e terceira realizações preferidas, a estrutura compreende adicionalmente resíduos dadores nas posições 36,
44, 47, 85 e 87. Posições semelhantes da estrutura de
cadeia ligeira que são normalmente conservadas ao longo das espécies, isto é, posições 2, 4, 6, 35, 49, 62, 64-69, 98, 99, 101 e 102, se não conservadas entre o dador e o receptor humano, compreendem adicionalmente resíduos de dador. Mais preferivelmente a estrutura de cadeia ligeira compreende adicionalmente resíduos dadores nas posições 2, 4, 6, 35, 36, 38, 44, 47, 49, 62, 64-69, 85, 87, 98, 99,
101 e 102.
Além disso a estrutura da segunda ou terceira realizações preferidas compreende opcionalmente resíduos dadores em uma, algumas ou todas as posições:
e 3,
63, (se 60 e 54 forem susceptíveis de formar ponte salina potencial), (se 70 e 24 forem susceptíveis de formar ponte salina potencial), e 21 (se 47 for diferente entre o dador e o receptor), e 45 (se 47 for diferente entre o dador e o receptor), e
qualquer um de entre 10, 12, 40, 80, 103 e 105.
As regiões de ligação de antigénio do domínio variável de cadeia ligeira enxertado com CDR, incluindo as da segunda e terceira realizações preferidas acima descritas, compreende CDRs correspondentes aos CDRs de Kabat em CDR1 (resíduos 24-34), CDR2 (resíduos 50-56) e CDR3 (resíduos 89-97).
A invenção proporciona ainda numa quarta realização preferida uma molécula de anticorpo enxertada com CDR compreendendo pelo menos uma cadeia pesada enxertada com CDR e pelo menos uma cadeia ligeira enxertada com CDR de acordo com a primeira e segunda ou primeira e terceira realizações preferidas da invenção.
Numa primeira realização particularmente preferida, a invenção proporciona, contudo, uma cadeia pesada de anticorpo humanizada enxertada com CDR possuindo um domínio de regiões variável compreendendo uma estrutura de receptor humano (especialmente uma estrutura de receptor humano EU) e regiões de ligação a antigénio dador hTNFl em que a estrutura compreende resíduos dadores hTNFl nas posições 12, 27, 30, 38, 46, 48, 66, 67, 69, 71, 73, 76, 83, 89, 91 e 94.
A estrutura de cadeia pesada EU tem resíduos na estrutura 4 (FR4) da cadeia pesada que são anómalos para as estruturas de cadeia pesada humanas. Assim são utilizados de preferência resíduos de consenso humanos em vez de resíduos EU em FR4- da cadeia pesada. Em particular, o resíduo de consenso humano treonina (T) pode ser utilizado na posição 108. O resíduo de murina hTNFl na posição 108 é também fortuitamente a treonina.
Numa segunda realização particularmente preferida a invenção proporciona uma cadeia ligeira de anticorpo humanizada enxertada com CDR possuindo um domínio variável compreendendo uma estrutura de receptor humano
(especialmente uma estrutura de receptor humano EU) e regiões de ligação de antigénio de dador hTNFl em gue a estrutura compreende resíduos dadores hTNFl nas posições 3, e 49.
Quando a estrutura humana EU é utilizada para a cadeia ligeira é também desejável alterar os resíduos dos resíduos EU nas posições 48, 83, 106 e 108, dado que os resíduos EU nestas posições são anómalos para anticorpos humanos. Assim os resíduos de consenso humano podem ser utilizados em alguns ou de preferência em todos estes resíduos, isto é leucina (I) na posição 48, valina (V) na posição 83, isoleucina (I) na posição 106 e arginina (R) na posição 108. Os resíduos hTNFl de murina são fortuitamente os mesmos dos resíduos de consenso humano nas posições 48 (I), 106 (I) e 108 (R). Contudo o resíduo de consenso humano valina (V) na posição 83 é diferente do resíduo EU (F) e do resíduo hTNFl (I) nesta posição.
A invenção inclui especialmente moléculas de anticorpo humanizado enxertado com CDR compreendendo pelo menos uma cadeia pesada humanizada enxertada com CDR de acordo com a primeira realização particularmente preferida e pelo menos uma cadeia ligeira humanizada enxertada com CDR de acordo com a segunda realização particularmente preferida.
Também numa terceira realização particularmente preferida a invenção proporciona uma cadeia pesada de anticorpo humanizado enxertado com CDR possuindo um domínio
de regiões variável compreendendo uma estrutura de receptor humano (especialmente uma estrutura de receptor humano KOL) e regiões de ligação de antigénio de dador 101.4 em que a estrutura compreende resíduos de dador 101.4 nas posições 4, 11, 23, 24, 28, 73, 77, 78, 79, 91, 93 e 94.
resíduo KOL prolina (P) na posição 108 da cadeia pesada é anómalo para anticorpos humanos. Assim e de preferência o resíduo de consenso humano leucina (L) está nesta posição se for utilizado KOL como estrutura de receptor humano. O anticorpo 101.4 de murina tem fortuitamente o resíduo de consenso humano (L) nesta posição.
Além disso numa quarta realização particularmente preferida a invenção proporciona uma cadeia ligeira de anticorpo humanizado enxertado com CDR possuindo um domínio de regiões variável compreendendo uma estrutura de receptor humano (especialmente uma estrutura de receptor humano REI) e resíduos de dador 101.4 nas posições 1, 3, 4 e 73.
A estrutura humana de cadeia ligeira REI tem resíduos que são anómalos para anticorpos humanos nas posições 39 (treonina, T), 104 (leucina, L), 105 (glutamina, Q), e 107 (treonina, T). Assim quando é utilizado o REI como estrutura de cadeia ligeira, os resíduos de consenso humano são utilizados nas posições 39 (lisina, K), 104 (valina, V), 105 (ácido glutâmico, E) e 107 (lisina, K). Os resíduos 101.4 de murina são
Λ
fortuitamente os mesmos dos resíduos de consenso humano nas posições 39 (K), 105 (E) e 107 (K). Contudo, o resíduo de consenso humano na posição 104 (V) é diferente de resíduos de leucina (L) REI e 101.4 de murina nesta posição.
A invenção também inclui especialmente moléculas de anticorpo humanizadas enxertadas com CDR compreendendo pelo menos uma cadeia pesada humanizada enxertada com CDR de acordo com a terceira realização particularmente preferida e pelo menos uma cadeia ligeira humanizada enxertada com CDR de acordo com a quarta realização particularmente preferida.
Os CDRs de Kabat são usados para todos os CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) ou para as cadeias pesada e ligeira da primeira, segunda, terceira e quarta realizações particularmente preferidas acima descritas.
As moléculas e cadeias de anticorpo recombinante e humanizado da presente invenção podem compreender: uma molécula de anticorpo completa, possuindo cadeias pesadas e ligeiras de comprimento total; um fragmento seu, como por exemplo Fab, Fab', F(ab')2 ou Fv* um Monomero ou dímero de cadeia ligeira ou de cadeia pesada; ou um anticorpo de cadeia simples, por exemplo um Fv de cadeia simples em que as regiões variáveis de cadeia pesada e ligeira são ligadas por um ligante do tipo péptido; ou por qualquer outro recombinante, molécula quimérica ou enxertada com CDR com a mesma especificidade dos anticorpos do dador originais. De forma semelhante a região variável de cadeia pesada e
ligeira pode ser combinada com os outros domínios de anticorpo de forma adequada.
Também as cadeias pesadas ou ligeiras ou moléculas de anticorpo completas recombinantes ou humanizadas da presente invenção podem ter ligadas a elas uma molécula efectora ou de ligação. Por exemplo, ela pode ser um macrociclo, para efectuar a quelação de um átomo de metal pesado, ou de uma toxina, como por exemplo a ricina, fixada a ela por uma estrutura de ponte de tipo covalente. Alternativamente, podem ser utilizados os procedimentos de tecnologia de ADN recombinante para produzir uma molécula de imunoglobulina em que o fragmento Fc ou o domínio CH3 de uma molécula completa de imunoglobulina foi substituída por, ou tem fixada a ela, uma ligação de péptido, uma proteína funcional de tipo não-imunoglobulina, como por exemplo uma enzima ou uma molécula de toxina.
As sequências de aminoácidos dos domínios variáveis de cadeia pesada e ligeira dos MAbs de murina CB0010, 101.4, CB0006 e hTNF3, e suas variantes enxertadas com CDR e anticorpos de receptores humanos são dados nos diagramas anexos, Figuras 1, 2, 3 e 4 respectivamente. Os produtos de anticorpo recombinante e humanizado da invenção podem ser preparados utilizando técnicas de ADN recombinante, por exemplo da forma essencialmente descrita em W091/09967.
Podem ser utilizadas quaiquer sequências de estrutura de regiões variáveis de um receptor humano
anticorpo dador.
convenientemente, homologia com a maximizar/optimizar a adequado tendo em atenção a classe/tipo do anticorpo dador a partir do qual são derivadas as regiões de ligação de antigénio. De preferência, o tipo de estrutura de receptor humano utilizado é do mesmo/semelhante classe/tipo do A estrutura pode ser escolhida, de forma a sequência de anticorpo do dador particularmente nas posições próximas ou adjacentes aos CDRs. Contudo, não é crítico um alto valor de homologia entre as sequências dadoras e receptoras para a aplicação da presente invenção. A presente invenção identifica uma hierarquia de posições na estrutura na qual os resíduos dadores podem ser importantes ou desejáveis para obter um produto de anticorpo enxertado com CDR possuindo propriedades ligantes satisfatórias. Os produtos enxertados com CDR têm geralmente afinidade de ligação de pelo menos zr-1
Μ , de preferencia pelo menos cerca de 10° M ou especialmente na gama de 1O8-1O12 M”1. Em princípio, a presente invenção é aplicável a qualquer combinação de anticorpos anti-hTNFa de dador e de receptor humano seja qual for o valor da homologia entre as suas sequências. Exemplos de estruturas humanas que podem ser utilizados são KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (refs. 7 e 8) e produtos semelhantes; por exemplo KOL e NEWM para a cadeia pesada e REI para a cadeia ligeira e LAY e POM para a cadeia pesada e para a cadeia ligeira.
Também os domínios de região constante dos
produtos da invenção podem ser escolhidos tendo em atenção a função proposta do anticorpo em particular das funções efectoras que podem ser necessárias. Por exemplo, os domínios de região constante podem ser domínios humanos Iga, IgE, IgG ou IgM. Em particular, podem ser utilizados domínios de região constante humanos IgG, especialmente os isotipos IgGl e IgG3, guando se pretende uma molécula de anticorpo humanizada para utilização terapêutica, e são necessárias funções de efector de anticorpo. Alternativamente, podem ser utilizados isotipos IgG2 e IgG4 quando a molécula de anticorpo humanizada é para ser utilizada para objectivos terapêuticos e não são necessárias funções efectoras de anticorpo, por exemplo para o bloqueamento simples da actividade de TNF.
Contudo, a parte restante das moléculas de anticorpo não necessitam de compreender apenas sequências de proteína de imunoglobulina. Por exemplo, pode ser construído um gene em que é fundida uma sequência de ADN que codifica parte de uma cadeia de imunoglobulina a uma sequência de ADN que codifica a sequência de aminoácidos de um polipéptido funcional como por exemplo uma molécula efectora ou de ligação.
Em outros aspectos a invenção também inclui sequências de ADN que codificam para o anticorpo recombinante e humanizado, por exemplo cadeias pesadas e ligeiras e enxertadas com CDR, vectores de clonação e de expressão contendo as sequências de ADN, células
transformadas com as sequências de ADN e processos para a preparação de cadeias e moléculas de anticorpo recombinantes e humanizadas por exemplo enxertadas com CDR compreendendo expressarem-se as sequências de ADN nas células hospedeiras transformadas.
Os processos gerais para a construção dos vectores, processo de transfecção e processo de cultura são bem conhecidos. Esses processos são apresentados, por exemplo, nas referências 12 e 13.
As sequências de ADN que codificam as sequências de aminoácidos de moléculas anti-hTNFa podem ser obtidas por processos bem conhecidos. Por exemplo as sequências que codificam anti-TNF podem ser obtidas por clonação genómica, ou clonação de cADN a partir de anti-hTNFa adequado que produz linhas de células de hibridoma. Podem ser escrutinados os clones positivos utilizando sondas adequadas para os genes de cadeia pesada e ligeira em questão. Também pode ser utilizada a clonação por PCR. A sequência de ADN que codifica parte ou todas as cadeias pesadas e ligeiras de anticorpos podem ser sintetizadas da forma pretendida a partir da sequência de ADN determinada ou com base nas sequências de aminoácidos correspondentes.
O ADN que codifica para as sequências de receptor, por exemplo receptor humano, pode ser obtido de qualquer forma adequada. Por exemplo as sequências de ADN que codificam as estruturas de receptor humano preferidas tais como KOL, REI, EU e NEWM, estão facilmente
disponíveis aos especialistas, ou podem ser facilmente sintetizadas com base nas suas sequências conhecidas de aminoácidos (ver referências 7 e 8).
Podem ser utilizadas as técnicas convencionais da biologia molecular para preparar sequências de ADN que codificam os produtos de anticorpo humanizados quiméricos e enxertados com CDR. As sequências de ADN desejadas podem ser sintetizadas completamente ou parcialmente utilizando técnicas de síntese de oligonucleótidos. Podem ser utilizadas como adequado as técnicas de mutagénese dirigida a pontos e de reacção em cadeia de polimerase (PCR). Pode ser por exemplo utilizada a técnica da síntese dirigida a oligonucleótidos como descrito por Jones e col (ref. 14). Pode também ser utilizada a mutagénese dirigida a oligonucleótidos de uma região veriável pré-existente tal como, por exemplo, a descrita por Verhoeyen e col (ref. 5) ou Riechmann e col (ref. 6). Também pode ser utilizado o enchimento enzimãtico em oligonucleótidos separados utilizando a polimerase de T4 ADN tal como, por exemplo, descrita por Queen e col (ref. 9).
Pode ser utilizado qualquer sistema adequado de célula hospedeira/vector para a expressão das sequências de ADN que codificam as cadeias pesadas e ligeiras e o anticorpo humanizado quimérico e enxertado com CDR. Podem ser usadas bactérias, por exemplo E. coli. e outros sistemas microbianos, em particular para a expressão de fragmentos de anticorpo tais como Fab e F(ab')2, e
especialmente fragmentos Fv e fragmentos de anticorpo de cadeia simples por exemplo Fv de cadeia simples. Podem ser utilizados sistemas eucarióticos por exemplo sistemas de expressão de células hospedeiro de mamíferos para a produção de produtos de anticorpo enxertados com CDR mais compridos, incluindo moléculas de anticorpo completas, e/ou se necessários produtos glicosilados. As células hospedeiro de mamíferos adequadas incluem células CHO e linhas de células de mieloma ou hibridoma.
Assim, num outro aspecto a presente invenção proporciona um processo para a preparação de um produto de anticorpo recombinante ou humanizado anti-hTNFa compreendendo:
a) produzir-se num vector de expressão um operão tendo uma sequência de ADN que codifica uma cadeia pesada de anticorpo anti-hTNFa, e/ou
b) produzir-se num vector de expressão um operão tendo uma sequência de ADN que codifica uma cadeia ligeira complementar de anticorpo anti-hTNFa;
c) incorporar-se uma célula hospedeira com o vector ou com cada vector, e
d) efectuar-se a cultura da linha de células incorporada para se obter o produto de anticorpo antihTNFa .
produto anti-hTNFa recombinante ou humanizado pode compreender apenas um polipéptido derivado de cadeia pesada ou ligeira, e nesse caso é utilizada apenas uma
sequência de codificação de polipéptido de cadeia pesada ou ligeira para efectuar a transfecção das células hospedeiro. Para a produção dos produtos que compreendem cadeias pesadas e ligeiras, a linha de células pode ser transfectada com dois vectores, em que um primeiro vector contem um operão que codifica um polipéptido derivado de cadeia ligeira e um segundo vector que contem um operão que codifica um polipéptido derivado de cadeia pesada. Os vectores são, de preferência, idênticos, com a exepção de as sequências de codificação e os marcadores seleccionáveis serem particulares, de modo a assegurar tanto quanto possível que cada cadeia de polipéptido seja igualmente expressa. Alternativamente, pode ser utilizado um único vector, incluindo o vector as sequências que codificam os polipéptidos de derivados de cadeia ligeira e de cadeia pesada.
o ADN nas sequências de codificação das cadeia ligeiras e pesadas pode compreender o cADN ou o ADN genómico ou ambos.
A invenção também inclui composições terapêuticas e de diagnóstico compreendendo os produtos recombinantes e humanizados de produtos de anticorpo da invenção e as utilizações destes produtos e composições em terapia e diagnóstico.
Assim num outro aspecto a invenção proporciona uma composição terapêutica ou de diagnóstico compreendendo um anticorpo recombinante ou humanizado de acordo com a
veículo farmaceuticamente aceitável.
A invenção também proporciona um processo para a preparação de uma composição terapêutica ou de diagnóstico compreendendo misturar-se um anticorpo recombinante ou humanizado de acrodo com a invenção em associação com um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.
anticorpo recombinante ou humanizado pode ser o único ingrediente activo na composição terapêutica ou de diagnóstico acompanhado por um ou mais ingredientes activos incluindo outros ingredientes de anticorpos, por exemplo, anti-células T, anti-IFNa ou anticorpos anti-LPS, ou ingredientes que não sejam anticorpos como por exemplo as xantinas. As composições terapêuticas e de diagnóstico podem apresentar-se numa forma de unidade de dosagem, e nesse caso cada dose unitária compreende uma quantidade eficaz do anticorpo recombinante ou humanizado da invenção.
Além disso, a invenção também proporciona métodos de terapia e de diagnóstico compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de anticorpo recombinante ou humanizado de acordo com a invenção a um paciente humano ou animal.
Os anticorpos e composições podem ser utilizados em qualquer terapia em que se pretenda reduzir o valor do
CNF presente no corpo humano ou animal. O TNF pode estar em circulação no corpo ou presente a um valor indesejavelmente
elevado localizado num ponto particular do corpo.
Por exemplo, valores elevados de TNF estão implicados em doenças imunorreguladoras e inflamatórias e em choques sépticos, ou endotóxicos, e cardiovasculares. O anticorpo ou composição pode ser utilizado em terapia nas condições que incluem a sépsia, o choque endotoxico, cachexia, sindroma de doença respiratória dos adultos, SIDA, alergias, psoríase, T.B., doenças inflamatórias dos ossos, doenças da coagulação do sangue, queimaduras, rejeições após transplante de órgãos ou tecidos e doença auto-imune por exemplo a doença específica dos órgãos como por exemplo a tiroidite ou doenças não específicas de órgãos como por exemplo a doença reumatóide e osteoartrite.
Além disso, o anticorpo ou composição pode ser utilizado para melhorar os efeitos laterais associados com a produção de TNF durante a terapia neoplástica e também para eliminar ou melhorar os sintomas relacionados com o choque associado com o tratamento ou a prevenção da rejeição de enxertos por utilização de um anticorpo antilinfócito, ou pode ser utilizado para o tratamento da deficiência multi-orgânica (MOF).
Os anticorpos recombinantes e humanizados e as composições da invenção são de preferência utilizados para o tratamento da sépsia ou do choque séptico/endotóxico.
Os anticorpos e composições podem ser utilizados para a administração em qualquer forma adequada e numa
quantidade de acordo com a terapia em que se pretendem utilizar. Esta utilização pode ser para uso profilático, por exemplo quando as circunstâncias são tais que a subida do teor de TNF é de esperar ou alternativamente, eles podem ser utilizados para reduzir o valor de TNF após ele ter atingido um valor indesejavelmente elevado ou quando se nota uma subida do valor.
As composições terapêuticas ou de diagnóstico podem tomar qualquer forma adequada para a administração, e, de preferência, apresentam-se numa forma adequada para a administração parentérica, por exemplo injecção ou infusão, por exemplo por uma injecção de bólus ou por infusão contínua. Quando o produto é para ser aplicado em injecções ou infusões, ele pode tomar a forma de uma suspensão, solução ou emulsão num veículo oleoso ou aquoso e pode conter agentes de formulação como por exemplo agentes conservantes, estabilizantes e/ou dispersantes.
Alternativamente, o anticorpo ou composição pode estar numa forma seca, para reconstituição antes da utilização com um líquido esterelizado adequado.
Se o anticorpo ou composição for adequado para a administração oral, por exemplo no caso de fragmentos de anticorpos, a formulação pode conter, para além do ingrediente activo, aditivos tais como o amido, por exemplo amido de batata, amido de milho ou de trigo ou celulose, ou aditivos de amido como por exemplo celulose microcristalina; sílica? vários açúcares como por exemplo
lactose; carbonato de magnésio e /ou fosfato de cálcio. É desejável que, se a formulação for dirigida à administração oral, ela possa ser bem tolerada pelo sistema digestivo do paciente. Para este objectivo, pode ser desejável incluir na formulação formadores de mucos e resinas. Pode também ser desejado melhorar a tolerância por formulação do anticorpo ou das composições numa cápsula que seja insolúvel nos sucos gástricos. Pode também ser preferível incluir o anticorpo ou composição numa formulação de libertação controlada.
Em ainda outro aspecto da invenção, é referido um método de tratamento de um paciente humano ou animal que sofra ou esteja em risco de sofrer uma doença associada com um valor indesejavelmente elevado de TNF, compreendendo esse método a administração ao paciente de uma quantidade eficaz do anticorpo ou composição da invenção. Em particular, o paciente humano ou animal pode sofrer de, ou ter o risco de sofrer de sépsia, ou choque séptico ou endotóxico.
A dose a que se administra o anticorpo depende da natureza da condição que se pretende tratar, grau a qual o TNF tem de ser neutralizado, ou é esperado que o seja, possuindo acima de um valor desejável, e se o anticorpo é para ser utilizado profilaticamente ou para tratar uma condição existente. A dose será também escolhida de acordo com a idade e as condições do paciente.
Assim, por exemplo, quando o produto é para ser
utilizado no tratamento ou profilaxia do choque séptico as doses adequadas de anticorpo para TNF estão na gama de 0,001-30 mg/kg/dia, de preferência 0,01-10 mg/kg/dia e particularmente de preferência 0,1-2 mg/kg/dia.
Os produtos de anticorpo podem ser utilizados em diagnóstico por exemplo em diagnóstico in vivo e determinação dos estados de doença que envolvam valores elevados de TNF.
A invenção é ainda descrita apenas como ilustração com os seguintes Exemplos que se referem aos diagramas anexos, Figuras 1-6.
Breve descrição das Figuras
A Figura 1 mostra sequências de aminoácidos para os domínios variáveis das cadeias pesadas e ligeiras para o anticorpo receptor humano EU (1EU), as cadeias de MAb de murina CB0010 (h t n f 1) e cadeias ligeiras (gEU) e pesadas (2hEUg) humanizadas enxertadas com CDR;
A Figura 2 mostra sequências de aminoácidos para os domínios de regiões variáveis de anticorpos receptoras humanos REI (Irei) para a cadeia ligeira e KOL (KOL) para a cadeia pesada, das cadeias pesada e ligeira e de MAb da murina 101.4 (101/4) e de cadeias ligeiras e pesadas humanizadas e enxertadas (ambas designadas por gl014);
A Figura 3 mostra sequências de aminoácidos para os domínios de regiões variáveis dos anticorpos receptores humanos REI (REI) para a cadeia ligeira e KOL (KOL) para a cadeia pesada, das cadeias pesada e ligeira de MAb da
murina CB0006 (CB6) e cadeias ligeira e pesada humanizadas e enxertadas (ambas designadas por gCB4);
A Figura 4 mostra sequências de aminoácidos para os domínios de regiões variáveis dos anticorpos receptores humanos REI (REI) para a cadeia ligeira e KOL (KOL) para a cadeia pesada, das cadeias pesada (HTNF3) e ligeira (hTNF3) de MAb da murina HTNF3 e cadeias ligeira (gHTNF3) e pesada (ghTNF3);
A Figura 5 mostra um gráfico que compara a capacidade de CB0010 da murina (hTNFl) e de CB0010 enxertado com CDR (GrhTNFl; CDP571) para competirem com HTNFl de murina conjugado com HRP para a ligação ao TNFa recombinante humano, e
A Figura 6 mostra o gráfico que compara capacidade de HTNFl da murina (CB0010) e de HTNFl enxertado com CDR (CP571) para neutralizar o TNFa recombinante no bioensaio L292.
Descrição Detalhada das Realizações da Invenção
Exemplo l
Enxerto com CDR de anticorpos anti-TNFa de murina
Foram enxertados com CDR vários MAb de TNFa anti-humano de murina essencialmente da forma descrita pormenorizadamente no documento W091/09967 para o enxerto com CDR do anticorpo anti-CDR3 de murina OKT3. Neste Exemplo e nos seguintes, os anticorpo humanizados enxertados com CDR e quiméricos foram preparados utilizando
domínios de região constante IgG4 humanos, essencialmente da forma descrita para a preparação de anticorpos a4 quimérico e 0KT3 enxertados com CDR descrito em WO91/G9967. Deverá notar-se, contudo, que os domínios de regiões constantes humanas de outros tipos e isotipos, por exemplo IgGl, IgG2 e IgG3, podiam também ser utilizados sem alteração significativa dos procedimentos descritos.
Esses anticorpos anti-hTNFa incluiam os MAbs de murina designados por CB0006 (também conhecido como 61E71), CB0010 (também conhecido como hTNFl), hTNF3 e 101.4. É apresentado a seguir um breve resumo do enxerto com CDR de cada um destes anticorpos.
CB0006
Foi efectuada uma análise semelhante à descrita no Exemplo 1, Secção 12.1. de WO91/09967 para o CB0006 e para a cadeia pesada de 10 os resíduos de estrutura foram identificados nas posições 23, 24, 48, 49, 68, 69, 71, 73, 75 e 88 como resíduos para serem retidos potencialmente como murina. As estruturas humanas escolhidas para o enxerto com CDR deste anticorpo, e os anticorpos hTNF3 e
101.4 eram REI para a cadeia ligeira e KOL para a cadeia pesada. As sequências de aminoácidos dos domínios variáveis de cadeia pesada de murina CBD006 (CB6) (pesada e ligeira) REI (REI) ligeira e KOL (KOL) de cadeia pesada são apresentados na Figura 3.
Foram construídos três genes, o primeiro dos quais codificava os resíduos de aminoãcidos 23, 24, 48, 49,
e 73 [gH341(6)]. A sequência de aminoácidos no domínio variável que codificava este primeiro gene é designada por gCB6 no resumo da cadeia pesada na Figura 3. 0 segundo gene também tinha os resíduos de aminoácidos 75 e 88 como resíduos de murina [gH341 (8)]. Enquanto que o terceiro gene tinha adicionalmente resíduos de aminoácidos 68, 69, 75 e 88 como resíduos de murina [gH341 (10)]. Cada um deles foi co-expresso com gL221, a cadeia ligeira enxertada mínima (apenas CDR) representada por gCB6 no resumo da cadeia pesada na Figura 3. Os anticorpos de gL221/gH341(6) e gL221/gH341(8) ligavam-se ambos tanto a TNF como à murina 61E71. 0 anticorpo de gL221/gH341(10) não expressava e esta combinação não foi continuada.
Posteriormente o anticorpo gL221/gH341(6) foi ensaiado no ensaio de competição de células L929 em que o anticorpo efectua uma competição contra o receptor de TNF em células L929 para a ligação TNF em solução. Neste ensaio o anticorpo gL221/gH341(6) foi aproximadamente 10% tão activo como o CB0006 de murina.
CB0010 (também conhecida como hTNFl)
CB0010 é um anticorpo monoclonal que reconhece um epitopo de TNF-α humano. A estrutura humana EU foi utilizada para enxertar CDR dos domínios variáveis pesados e ligeiros. As sequências de aminoácidos dos domínios variáveis pesados e ligeiros de EU (EU), CB0010 (h t n f 1) e as versões enxertadas de CB0010 (gEU, ligeira; 2hEUg, pesada) são mostrados na Figura 1.
seiiàfitíi»—
Cadeia Pesada
Na cadeia pesada enxertada com CDR foram utilizados CDRs de rato nas posições 26-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) e 95-102 (CDR3). Os resíduos de rato foram também utilizados nas estruturas nas posições 48, 67, 69,71, 73, 76, 89, 91, 94 e 108. A comparação do TNF1 de rato e dos resíduos de cadeia pesada humana EU revelam que eles são idênticos na posições 23, 24, 29 e 78.
Cadeia Ligeira
Na cadeia ligeira enxertada com CDR foram utilizados CDRs de rato nas posições 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) e 89-97 (CDR3). Além disso foram utilizados resíduos de ratos nas estruturas nas posições 3, 42, 48, 49, 83, 106 e 108. A comparação do hTNFl de rato e os resíduos de cadeia ligeira humana EU revela que eles são indênticos nas posições 46, 58 e 71.
A cadeia pesada CB0010 enxertada foi co-expressa com a cadeia ligeira quimérica e a capacidade de ligação do produto de cadeia leve quimérica/cadeia pesada quimérica no ensaio de ligação de TNF. O produto de cadeia pesada enxertado parecia ter uma capacidade de ligação para TNF ligeiramente superior à do produto totalmente quimérico.
De forma semelhante, foi co-expresso um produto de cadeia pesada enxertada/cadeia leve enxertada e foi comparado o produto totalmente quimérico e verificou-se que tinham propriedades de ligação muito semelhantes com o último produto. Contudo quando o produto de cadeia pesada
enxertada/cadeia ligeira enxertada foi ensaiado num ensaio L929 (ver Exemplo 4), verificou-se que tinha uma actividade que era de apenas metade da do produto quimérico. Assim foram efectuadas outras experiências de enxerto de CDR da forma descrita no Exemplo 2.
hTNF3 hTNF3 reconhece um epitopo em TNFa humano. A sequência de hTNF3 revela apenas 21 diferenças comparadas com CB0006 nas regiões variáveis de cadeia ligeira e pesada, 10 na cadeia leve (2 nos CDR nas posições 50, 96 e 8 na estrutura a 1, 19, 40, 45, 46, 76, 103 e 106) e 11 na cadeia pesada (3 nas regiões CDR nas posições 52, 60 e 95 e 8 na estrutura a 1, 10, 38, 40, 67, 73, 87 e 105). As sequências de aminoácidos dos domínios variáveis de cadeia ligeira e pesada de hTNF3 (Htnf3, ligeira; hTNF3, pesada), hTNF3 enxertado com CDR (gHTNF3; gTNF3, pesada) e REI (REI, ligeira) e KOL (KOL, pesada) são mostradas na Figura 4. As cadeias ligeira e pesada dos anticorpos quiméricos CB0006 e hTNF3 podem ser permutados sem perda de actividade no ensaio de ligação directa. Contudo o CB0006 é uma ordem de grandeza menos capaz de competir com o reeeptor TNF nas células L929 para TNF-α comparado com hTNF3. Com base nos dados de enxerto de CB0006 CDR gL221 e gH341 (+23, 24, 48, 49, 71 e 73 como no rato) foram construídos genes para hTNF3 e ensaiados e o anticorpo enxertado resultante ligase bem a TNF-α, mas efectua a competição muito fraca no ensaio L929. O gene gL221 codifica para gHTNF3 e gH341 etc.
o gene codifica para as sequências de domínio variáveis gHTNF3 como se mostra na Figura 4. É provável que neste caso possam ser necessários outros resíduos da estrutura permutados de forma a melhorar a capacidade de ligação competitiva deste anticorpo.
101.4
O 101.4 é um outro MAb de murina susceptível de reconhecer o TNF-α humano. A cadeia pesada deste anticorpo revela uma boa homologia com KOL e assim o enxerto com CDR foi baseado em REI para a cadeia ligeira e KOL para a cadeia pesada. As sequências de aminoácidos do domínio variável pesado e ligeiro de 101.4 (101/4) e uma versão enxertada com CDR de 101.4 (gl014) e a cadeia ligeira de REI (Irei) e a cadeia pesada de KOL (KOL) de domínios variáveis são apresentados na Figura 2. Foram construídos vários genes de cadeia pesada enxertados com escolhas conservativas para o CDR (gH341) para os quais um ou um pequeno número de resíduos não-CDR nas posições 73, 78 ou 77-79 inclusive como aminoácidos de ratos. Foram coexpressos com a cadeia ligeira quimérica ou com a cadeia ligeira enxertada com CDR de Kabat. Em todos os casos a ligação ao TNF equivalente ao anticorpo quimérico foi verificado e quando foi co-expresso com cL os anticorpos resultantes são susceptíveis de competirem bem num ensaio de L929. Contudo, com gL221 os anticorpos resultantes são de pelo menos uma ordem de grandeza susceptíveis de competirem para o TNF contra o receptor de TNF em células
L929.
Os resíduos de rato noutras posições na cadeia pesada, por exemplo a 23 e 24 em conjunto ou a 76 revelaram não proporcionar melhoria na capacidade competitiva do anticorpo enxertado no ensaio L929.
Exemplo 2
Outros enxertos com CDR de anticorpos de TNFa anti-humano de Murina CB0Q10 e 101.4
Foram ainda enxertados com CDR anticorpos monoclonais de TNFa anti-humano de murina CB0010 e 101.4 substancialmente da forma descrita em WQ91/-9667.
CB0010
O CB0010 é um anticorpo monoclonal que reconhece um epitopo em TNF-α humano. A estrutura humana EU foi utilizada para o enxerto com CDR de ambos os domínios variáveis pesado e ligeiro.
As sequências de aminoácidos nos domínios de variáveis de cadeia pesada e ligeira do receptor EU, do dador de murina CB0010 (h t n f 1) e anticorpos enxertados com CDR (gEU, cadeia ligeira e 2hEUg, cadeia pesada) são apresentadas na Figura 1.
Cadeia pesada
Na cadeia pesada enxertada com CDR (2hEUg), foram utilizados CDRs de rato nas posições 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) e 95-102 (CDR3).
Foram também utilizados resíduos de rato nas
estruturas nas posições 12, 27, 30, 38, 46, 48, 66, 67, 69, 71, 73, 76, 83, 89, 91, 94 e 108. A comparação de resíduos de cadeia pesada EU e de rato CB0010 revela que estes são idênticos nas posições 23, 24, 29 e 78.
Cadeia ligeira
Na cadeia ligeira enxertada com CDR (gEU) foram utilizados CDRs de rato nas posições 24-34 (CDR1), 50-65 (CDR2) e 89-97 (CDR3). Além disso foram utilizados resíduos de rato nas estruturas nas posições 3, 42, 48, 49, 106 e 108. 0 resíduo de consenso humano (valina) foi utilizado na posição 83. A comparação dos resíduos de cadeia ligeira humana EU e de rato CB0010 revela que estes são idênticos nas posições 46, 58 e 71.
A cadeia pesada CB0010 enxertada foi co-expressa com a cadeia ligeira quimérica e a capacidade de ligação do produto foi comparada com a do produto de cadeia ligeira quimérica/cadeia pesada quimérica num ensaio de ligação de TNF. O produto de cadeia pesada enxertada parecia ter uma capacidade de ligação para TNF ligeiramente superior á do produto totalmente quimérico.
De forma semelhante, foi co-expresso um produto de cadeia pesada enxertada/cadeia pesada enxertada e foi comparado com o produto totalmente quimérico e verificou-se que tinha propriedades de ligação muito semelhantes ao último produto. A combinação específica de cadeia ligeira enxertada (gEU) e cadeia pesada enxertada (2hEUg), como se mostra na Figura 1, proporciona um anticorpo designado por
CDP571. 0 produto de murina CB0010 (CB0010), quimérico
CB0010 (quimérico CB0010) e o produto de cadeia pesada enxertada/cadeia pesada enxertada (CDP571) foram comprados para verificar a ligação ao TNFa humano num ensaio convencional. Os resultados obtidos são apresentados na tabela seguinte em termos dos valores de Kp (pM) medidos para cada anticorpo.
Anticorpo KD (pM)
CB0010 80
CB0010 Quimérico 81
CDP571 87
O produto de anticorpo totalmente enxertado (CDP571) está actualmente em desenvolvimento pré-clínico para o tratamento do sindroma da sépsia e a rejeição aguda de transplante.
101.4
101.4 é um outro MAb de murina susceptível de reconhecer o TNF-α humano. A cadeia pesada deste anticorpo revela uma boa homologia com KOL e assim o enxerto com CDR foi baseado em REI para a cadeia ligeira em KOL para a cadeia pesada. Foi preparado um produto enxertado com CDR aperfeiçoado. As sequências de aminoácido de domínios variáveis para REI (rei, cadeia ligeira), KOL (KOL, cadeia pesada) murina 101.4 (101/4, cadeias pesadas e ligeira) e anticorpo totalmente enxertado (gl014, cadeias pesada e
ligaira) como se mostra na Figura 2.
Cadeia pesada
Na cadeia pesada enxertada com CDR (gl0l4) foram utilizados CDRs de rato nas posições 31-35 (CDRl), 50-65 (CDR2) e 95-102 (CDR3). Foram também utilizados resíduos de rato na estrutura nas posições 4, 11, 23, 24, 28, 73, 77, 78, 79, 91, 93, 94 e 108.
Cadeia ligeira
Na cadeia ligeira enxertada com CDR (gl014) foram utilizados CDRs de rato nas posições 24-34 (CDRl), 50-56 (CDR2) e 89-97 (CDR3). Além disso foram utilizados resíduos de rato na estrutura nas posições 1, 3, 4, 39, 73, 105 e 107. 0 resíduo de consenso humano (valina) foi utilizado na posição 104.
A cadeia pesada e ligeira totalmente enxertada (gl014) foi co-expressa e sua ligação a TNF foi comparada com 101.4 de murina e quimérico e também com o anticorpo totalmente enxertado (gEU/2hEUg, CDP571) CB0010. O anticorpo 101.4 totalmente enxertado revelou ter propriedades de ligação para TNFa humano semelhantes aos anticorpos de murina, quiméricos e CB0010 enxertados. Exemplo 3
Comparação in vitro de anticorpos de Murina e enxertados com CDR
A.Medidas da Afinidade para CB0010 e CDP571 de Murina Materiais e Processos
Materiais;
PBS/BSA: Dulbeccos PBS + 1% (p/v) de albumina de soro de bovino.
TNF: 50 nM TNF-α rec. humano (Bissendorf Biochemicals), 0,85 Mg/ml em PBS/BSA.
125I-TNF de Armazém: 5 mCí, 185 kBq (Amersham International) dissolvido em 500 μΐ de água e guardado a -70°C.
Solução do Trabalho 125i-TNF: -62 pM para a curva de titulação e 124 pM para a análise de Scatchard em PBS/BSA. Anticorpos: Foram quantificados os CDP571 e CB0010 (mHTNFl) de murina por A280nm (E1 mg/ml, 280 nnT1'4), e diluídos para uma concentração de 1 Mg/ml para titulação, ou 200 ng/ml para análise de Scatchard.
Imunopérolas: Foram utilizadas de forma não diluída antimurina de cabra IgG de molécula integral com agarose ou IgG anti-humana de cabra de molécula integral-agarose (Sigma).
Processo:
Titulação de anticorpo: Foram titulados os mHTNFl e CDP571 em diluições duplas (100 μΐ cada) para se obter um total de 16 amostras e foi adicionado 125I-TNF (100 μΐ, 62 pM). A concentração final máxima de anticorpo foi de 500 ng/ml e 125i-TNF e foi de 31 pM. Os tubos de controlo (8) continham 125I-TNF e PBS/BSA. As amostras foram deixadas em equilíbrio durante a noite à temperatura ambiente, com agitação. Após equilibração, foram adicionados, 25 μΐ de agarose anti-rato de cabra às amostras de mHTNFl, e 50 μΐ de pérolas anti-humanas de cabra adicionadas à amostra de
CDP571 com exepção dos controlos totais de 125j_tnf> a absorção não específica de ^2^I-TNF ás pérolas de agarose foi corrigida adicionando pérolas a 4 dos controlos e comparando as contagens de sobrenadante para estas amostras que continha PBS/BSA em vez de pérolas. Passada l hora de equilibração à temperatura ambiente foi adicionado PBS/BSA (0,5 ml) e as amostras foram centrifugadas a 1500 rpm durante 10 minutos a 20c. O sobrenadante (0,5 ml) foi removido e foi contada a radioactividade num contador gama.
A confirmação que o 125I-TNF se comportava de forma semelhante ao do material não marcado neste ensaio foi feita efectuando a titulação de anticorpo na presença de misturas de 125I-TNF e de TNF não marcado (a 25% e 75% de 125I-TNF) para a mesma concentração final.
Análise de Scatchard: para ambos os anticorpos, foi titulado TNF não marcado (100 μΐ, 50 nM) em duplicado, em 13 diluições duplas. Uma das amostras contendo PBS/BSA em vez de TNF foi incluída para cada anticorpo. Foi adicionado a cada amostra •'-25i-tnf (50 μΐ, 124 pM). Foi em seguida adicionada uma quantidade constante de anticorpo, determinada a partir da curva de titulação (50 μΐ, 200 ng/ml).
Isto deu as concentrações finais seguintes: anticorpo, 50 ng/ml? TNF, 25 nM concentração máxima; 125lTNF, 31 pM. As amostras foram deixadas a equilibrar durante a noite e em seguida tratadas exactamente como as amostras de anticorpos de titulação.
' % A-
Cálculos
Curvas de Titulação 125I-TNF ligado cpm = NSB cpm - sobrenadante cpm 125I-TNF ligado cpm
--------------------------= B/T 125I-TNF Total
NSB = absorção não específica em branco, sobrenadante cpm Total = contagens totais para ^2^I-TNF apenas.
Foi representado B/T em função da concentração de anticorpo e foi escolhida a concentração de anticorpo adequada para utilização na análise de Scatchard a B/T = 0,6
Análise de Scatchard
Foi utilizada em todo ensaio a média de determinação duplicada
NSB = cpm Total - cpm de NBS sobrenadante cpm livre = cpm da amostra + NSB
Proporção de TNF livre = livre/Total (F/T) = cpm da amostra + cpm do NSB 1-F/T
------------------------------- = B/p --------------cpm Total F/T
Foi representado B/F em função de TNF ligado para se obter uma curva de -1/KD a partir da qual foi calculado o valor de KD
RESULTADOS OBTIDOS
Constantes de dissociação para CBQ010 e CDP571 de murina Anticorpo K^.M
HTNF1 de Murina
1,3 X 10
CDP571 1,4 x 10“10
B. Competição de CB0010 (Muhtnfl) e CDP571 de murina com o conjugado de HRP em CBOOIO de Murina para a ligação a rhuTNF
Processo
Foi revestida uma placa de microtitulação com 96 furos (Nunc, Maxisorb) com 100 μΐ/furo de TNF a 0,5 μg/ml.
Foram preparadas diluições em série de anticorpo de murina ou anticorpo enxertado utilizando como diluente PBS/1% BSA, a partir de 200 ^g/ml até 0,01 ^g/ml. Foram adicionados 50 μΐ de anticorpo a cada furo seguido por 50 μΐ de CBOOIO de murina HRP a 3 concentrações (0,625, 0,315 e 0,16 μς^Ι). As placas foram incubadas durante 2 horas à temperatura ambiente com agitação, lavadas por 4 vezes com PBS e foram adicionados 100 μΐ do substrato TMB.
Foi medida a Densidade Óptica (OD) e representado o valor de OD em função da concentração de anticorpo.
Conclusões
As curvas para os anticorpos de murina (MuhTNFl) e anticorpo enxertado (GrhTNFl) são sobreponiveis indicando que ambos os anticorpos efectuam a competição com afinidade semelhante para a ligação a TNF (ver Figura 5).
Exemplo 4
Comparação de Anticorpos de Murina CB 0010 e CDP571 enxertado com CDR em Experiências de Bioensaios e Modelos
Animais
A. Neutralização de TNF por CB0010 e CDP571 no Ensaio de
L929
Foi determinada a capacidade do anticorpo de murina mãe CB0010 (hTNFl) e do anticorpo CDP571 enxertado com CDR para neutralizar o TNF humano recombinante utilizando o bioensaio L929. O ensaio L929 utiliza a linha de células fibriblastóides de rato que é exterminada por TNF. O ensaio é efectuada na presença de 1 /zg/ml de actinomicina D que torna as células mais sensíveis a TNF. Foram misturadas diluições em série dos dois anticorpos com uma quantidade constante de TNF humano recombinante (100 pg/ml) e foi adicionado a uma monocamada de L929 em placas de 96 furos com o fundo plano. Após um período de incubação de 16 horas as células que não tinham sido exterminadas pelo TNF foram reveladas utilizando a revelação por critais violetas. A quantidade aparente de TNF não neutralizado (TNF residual) foi determinada por comparação com uma curva padrão de TNF recombinante. Apresenta-se na Figura 1 os resultados obtidos numa experiência representativa em que é representado TNF residual em função da concentração de anticorpo. Pode observar-se que os CB0010 e CDP571 têm actividades de neutralização semelhantes.
B. Efeito de CDP571 no Modelo de Sepsia em Baboons
Foi ensaiado neste estudo o efeito do tratamento
com CDP571 em relação a consequências psicológicas de sépsia severa (incluindo morte). Foram escolhidos Baboons como espécies revelantes para estudar, dado que se sabe que o CDO571 é neutralizante de TNF de baboon.
Foram anestesiados baboons machos adultos, Papio ursinus, pesando 20-25 kg com cloridrato de cetamina e pentabarbitona de sódio e instrumentados para medir a pressão sanguínea, ritmo cardíaco (por termodiluição), ECG e pressão de enchimento do aurículo direito. A infusão de solução salina ou de anticorpo foi dada durante 120 min a uma taxa de 2,5 ml/kg/h e em seguida foi administrada durante mais 120 min infusão de E. coli vivo à mesma taxa de infusão. A estirpe bacteriana utilizada foi a estirpe Hinshaw B7 ([086a:61], ATCC 33985) administrada na fase logarítmica do crescimento a uma dose de 2 x 109 CFU/kg originando uma concentração de plasma de 2-2,5 x 109 CFU/ml no fim da infusão. Passados 120 min, os animais voltaram às gaiolas, com livre acesso à comida e água e monitorados para verificar as variações cardiovasculares duas vezes por dia durante 3 dias. Foi dado a todos animais o fluido de infusão constante de 5 ml/kg/h que era ajustado, se necessário, para manter a pressão de enchimento de aurículo direito adequadamente. Os baboons que morreram durante o tratamento ou que sobreviveram ao período de 72 h experimental, e depois mortos, foram autopsiados. Todos os órgãos importantes foram ensaiados para determinar o dano macro-patológico bruto de aordo com uma escala semi50 quantitativa (representando +++ o grau mais severo).
Os animais foram aleatoriamente colocados num dos 4 grupos de tratamento seguintes:
- apenas solução salina
- CDP571 0,1 mg/kg
- CDP571 1,0 mg/kg
- CB0010 0,1 mg/kg (anticorpo mãe de murina)
Os graus de danos aos órgãos de sobrevivência e cumulativos são apresentados na tabela 1. O CDP571 a 1,0 mg/kg evitava a morte e reduzia significativamente (P<0,005) a incidência de danos a órgãos neste modelo, além disso, estes efeitos dependiam da dose (P<0,005). Além disso, a taxa de sobrevivência e o grau de danos aos órgãos observados com CB0010 eram semelhantes aos observados com CDP571 para a mesma dose, indicando uma potência mantida in vivo de CD571 comparada com o seu anticorpo mãe de murina.
E.COLI
Tabela 1
ESTUDO DE SÉPSIA EM BABOON
SOBREVIVÊNCIA APÓS ADMINISTRAÇÃO DADAS IV 2H APÓS SOLUÇÃO SALINA OU TRATAMENTO NO MORTE SOBREVIVOS
DE 2X109 CFU DE
CDP 571
PERCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA
PÃTOL.
ORGAN.
SOLUÇÃO 8 7
SALINA
CDP571 6 2
0,1 mg7kg +++ ++
CDP571 6 0
1,0 mg/kg
100 +/CB0010 4 1
0,1 mg/kg ++
Referências
1. Kohler e Milstein, Nature, 265, 295-497, 1975.
2. Chatenoud e col, (1986), J. Immunol. 137. 830-838.
3. Jeffers e col, (1986), Transplantation, 41, 572-578.
4. Begent e col, Br. J. Câncer 62: 487 (1990).
5. Verhoeyen e col, Science, 239, 1534-1536, 1988.
6. Riechmann e col, Nature, 332. 3230324, 19788.
7. Kabat, E.A., Wu, T.T., Reid-Miller, Μ., Perry, H.M.,
Gottesman, K.S., 19U7, em Seguences of Proteins of immunological Interest, US Department of Healt and Human Services, NIH, Estados Unidos da América.
8. Wu, T.T. e Kabat, E.A., 1970, J. Exp. Med. 132 211-250.
9. Queen e col, (1989), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86,
10029-10033 e WO 90/07861
10. Tempest e col, (1991), Biotechnology, 9, 266-271
11. Beutler e col, (1985), Science, 234, 470-474
12. Maniatis e col, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989.
13. Primorse e Old, Principies of Gene Manipulation, Blackwell, Oxford, 1980.
14. Jones e col, (1986), Nature, 321. 522.

Claims (4)

  1. REIVINDICAÇÕES
    - Ia Processo para a preparação de um produto de anticorpo anti-hTNFa recombinante ou humanizado caracterizado por compreender:
    a) produzir num vector de expressão um operão tendo uma sequência de ADN que codifica uma cadeia pesada de anticorpo anti-hTNFa, e/ou
    b) produzir num vector de expressão um operão tendo uma sequência de ADN que codifica uma cadeia ligeira complementar de anticorpo anti-hTNFa?
    c) incorporar uma célula hospedeira com o vector ou com cada vector, e
    d) efectuar a cultura da linha de células incorporada para se obter o produto de anticorpo de antihTNFa .
    - 23 Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se obter uma molécula de anticorpo recombinante possuindo um ponto de ligação a um antigénio derivado do anticorpo monoclonal de murina CB0006 (conhecido alternativamente como 61E71), CB0010 (conhecido alternativamente como hTNFl), hTNF3 ou 101.4.
    - 3S Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2 caracterizado por se obter uma molécula de anticorpo humanizada.
    _ 4 a _
    Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por se obter uma molécula de anticorpo quimérica humanizada.
    -5aProcesso de caracterizado por se enxertado com CDR.
    acordo com a reivindicação 3 obter um anticorpo humanizado
    -6aProcesso de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por se obter uma cadeia pesada de um anticorpo humanizado enxertado com CDR possuindo um domínio de regiões variável compreendendo uma estrutura receptora humana e regiões de ligação de antigénio dador em gue a estrutura compreende resíduos dadores em pelo menos uma das posições 6, 23 e/ou 24, 48 e/ou 49, 71 e/ou 73, 75 e/ou 76 e/ou 78 e 88 e/ou 91.
    _ 7 â _
    Processo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por se obter uma cadeia pesada humanizada enxertada com CDR compreendendo resíduos dadores nas
    posições 23, 24, 49, 71, 73 e 78, ou nas posições 23, 24 e 49. - 8 3 - Processo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por se obter uma cadeia pesada humanizada
    enxertada com CDR compreendendo resíduos dadores nas posições 2, 4, 6, 25, 36, 37, 39, 47, 48, 93, 94, 103, 104,
    106 e 107.
    - 9 3 Processo de acordo com as reivindicações 7 ou 8 caracterizado por se obter uma cadeia pesada humanizada enxertada com CDR compreendendo resíduos dadores numa, algumas ou todas as posições;
    1 e 3
    69 (se 48 for diferente entre o dador e o receptor),
    38 e 46 (se 48 for o resíduo dador),
    67,
    82 e 18 (se 67 for o resíduo dador),
    91, e qualquer um ou mais de entre 9, 11, 41, 87, 108, 110 e 112.
    - 10 â Processo de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 9 caracterizado por se obter uma cadeia pesada humanizada enxertada com CDR compreendendo resíduos dadores nas posições 26-35, 50-65 e 95-100.
    - 11 3 Processo de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por se obter uma cadeia ligeira de anticorpo humanizado enxertado com CDR possuindo um domínio de regiões variável compreendendo uma estrutura receptora humana e regiões de ligação de antigénio dador em que a estrutura compreende resíduos dadores em pelo menos uma das posições 1 e/ou 3 e 46 e/ou 47.
    - 12 3 Processo de acordo com a reivindicação 11 caracterizado por se obter uma cadeia ligeira enxertada com CDR compreendendo resíduos dadores nas posições 46 e 47.
    - 13 â Processo de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por se obter uma cadeia ligeira de anticorpo humanizado enxertado com CDR possuindo um domínio de regiões variável compreendendo uma estrutura receptora humana e regiões dadoras de ligação de antigénio em que a estrutura compreende resíduos dadores em pelo menos uma das posições 46, 48, 58 e 71.
    - 14 a Processo de acordo com a reivindicação 13 caracterizado por se obter uma cadeia ligeira enxertada com
    CDR compreendendo resíduos dadores nas posições 46, 48, 58 e 71.
    - 15 3 Processo de acordo com as reivindicações 11 ou 13 caracterizado por se obter uma cadeia ligeira enxertada com CDR compreendendo resíduos dadores nas posições 2, 4, 6, 35, 36, 38, 44, 47, 49, 62, 64-69, 85, 87, 98, 99, 101 e
    102.
    - 16 3 Processo de acordo com a reivindicação 15 caracterizado por se obter uma cadeia ligeira enxertada com CDR compreendendo resíduos dadores numa, algumas ou todas as posições:
    1 e 3,
    63,
    60 (se 60 e 54 forem susceptíveis de formar uma ponte salina potencial),
    70 (se 70 e 24 forem susceptíveis de formar uma ponte salina potencial),
    73 e 21 (se 47 for diferente entre o dador e o receptor),
    37 e 45 (se 47 for diferente entre o dador e o receptor), e qualquer uma ou mais de entre 10, 12, 40, 83, 103 e 105.
    - 17 s Processo de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 16 caracterizado por se obter uma cadeia ligeira enxertada com CDR compreendendo resíduos dadores nas posições 24-34, 50-56 e 89-97.
    - 18 3 57
    Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se obter uma molécula de anticorpo enxertada com CDR compreendendo pelo menos uma cadeia pesada enxertada com CDR quando preparada de acordo com qualquer das reivindicações 6 a 10 e pelo menos uma cadeia ligeira enxertada com CDR quando preparada de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 17.
    _ 19 fi _
    Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se obter uma cadeia pesada de anticorpo humanizado enxertada com CDR possuindo um domínio de regiões variável compreendendo uma estrutura receptora humana (especialmente uma estrutura receptora humana EU) e regiões de ligação de antigénio dador hTNFl em que a estrutura compreende resíduos dadores hTNFl nas posições
    12, 27, 30, 38, 46, 48, 66, 67, 69, 71, 73, 76, 83, 89, 91 e 94. - 20 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se obter uma cadeia ligeira de um
    anticorpo humanizado enxertada com CDR possuindo um domínio de regiões variável compreendendo uma estrutura receptora humana (especialmente uma estrutura receptora humana EU) e regiões dadoras de ligação de antigénio hTNFl em que a estrutura compreende resíduos dadores hTNFl nas posições 3,
    42 e 49.
    - 21 3 58
    Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se obter uma molécula de anticorpo humanizado enxertada com CDR compreendendo pelo menos uma cadeia pesada humanizada enxertada com CDR quando preparada de acordo com a reivindicação 19 e pelo menos uma cadeia ligeira humanizada enxertada com CDR quando preparada de acordo com a reivindicação 20.
    - 22 a Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se obter uma cadeia pesada de anticorpo humanizado enxertada com CDR possuindo um domínio de regiões variável compreendendo uma estrutura receptora humana (especialmente uma estrutura receptora humana KOL) e regiões de ligação de antigénio 101,4 em que a estrutura compreende 101,4 resíduos dadores nas posições 4, 11, 23, 24, 28, 73, 77, 78, 79, 91, 93 e 94.
    - 23 a Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se obter uma cadeia ligeira de anticorpo humanizado enxertada com CDR possuindo um domínio de regiões variável compreendendo uma estrutura receptora humana (especialmente uma estrutura receptora humana REI) e resíduos dadores 101,4 nas posições 1, 3, 4 e 73.
    - 24 â Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se obter uma molécula de anticorpo humanizado enxertada com CDR compreendendo pelo menos uma cadeia pesada humanizada enxertada com CDR quando preparada de acordo com a reivindicação 22 e pelo menos uma cadeia ligeira humanizada enxertada com CDR quando preparada de acordo com a reivindicação 23.
    - 25 â Sequência de ADN carcterizada por codificar para uma molécula de anticorpo de cadeia pesada ou ligeira que tem uma especificidade para TNFa humano.
    - 26 * Sequência de ADN caracterizada por codificar para uma cadeia pesada enxertada com CDR quando preparada de acordo com qualquer das reivindicações 6 a 10, 19 ou 22, ou uma cadeia ligeira enxertada com CDR quando preparada de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 17, 20 ou
    23.
    - 27 3 Vector de clonação ou de expressão caracterizado por se incorporar uma sequência de ADN de acordo com a reivindicação 26.
    - 28 a Célula hospedeira caracterizada por ser transformada com uma sequência de ADN de acordo com a reivindicação 26.
    - 29 a Processo para a preparação de um anticorpo enxertado com CDR caracterizado por se expressar uma sequência de ADN de acordo com as reivindicações 25 ou 26 numa célula hospedeira transformada.
    - 30 â Processo para a preparação de uma composição terapêutica ou de diagnóstico caracterizado por se incorporar uma mistura de uma molécula de anticorpo recombinante quando preparada de acordo com a reivindicação 1 em associação com um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitáveis.
    - 31 3 Molécula de anticorpo recombinante preparada de acordo com a reivindicação 1 ou composição terapêutica preparada de acordo com a reivindicação 31 para utilização na melhoria dos efeitos secundários associados com a produção de TNF durante a terapia neoplástica.
    - 32 3 Molécula de anticorpo recombinante preparada de acordo com a reivindicação 1 ou composição terapêutica preparada de acordo com a reivindicação 31 para utilização na eliminação ou melhoria dos sintomas relacionados com o choque associado com a terapia antilinfócita.
    - 33 3 Molécula de anticorpo recombinante preparada de acordo com a reivindicação 1 ou composição terapêutica preparada de acordo com a reivindicação 31 para utilização no tratamento da deficiência de vários órgãos..
    - 34 a Molécula de anticorpo recombinante preparada de acordo com a reivindicação 1 ou composição terapêutica preparada de acordo com a reivindicação 31 para utilização no tratamento da sépsia ou choque séptico/endotóxico.
    A requerente reivindica as prioridades dos pedidos PCT/GB e britânico apresentados em 21 de Dezembro de 1990 e 3 de Maio de 1991, sob os Nos 90/02017 e 9109645.3, respectivamente.
    Lisboa, 23 de Dezembro de 1991
    RESUMO
    PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO ANTI-hTNFa
    RECOMBINANTE OU HUMANIZADO»
    A invenção refere-se a um processo para a preparação de um produto de anticorpo anti-hTNFa recombinante ou humanizado que compreende:
    a) produzir num vector de expressão um operão tendo uma sequência de ADN que codifica uma cadeia pesada de anticorpo anti-hTNFa, e/ou
    b) produzir num vector de expressão um operão tendo uma sequência de ADN que codifica uma cadeia ligeira complementar de anticorpo anti-hTNFa;
    c) incorporar uma célula hospedeira com o vector ou com cada vector, e
    d) efectuar a cultura da linha de células incorporada para se obter o produto de anticorpo de antihTNFa .
    ENXERTO
    COM CDR DE hTNF-1
    Dados de Cadeia Ligeira!
    1 EU DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITCRASQSI.....NTWLA WYQQKPGKAPK htnfl DIMMSQSPSS LAVSVGEKVTMS CKSSQSLLYSNNQKNYLA WYQQKPGQSPK g EU DIMMTQSPST LSASVGDRVTIT CKSSQSLLYSNNQKNYLA WYQQKPGQAPK
    EU htnfl gEu
    LLMYKASSLE SGVPSRFIGS GSGTEFTLTI LLISWASTRES GVPDRFTGS GSGTDFTLTI LLISWASTRES GVPSRFIGS GSGTEFTLTI
    SSLQPDDFAT YYCQQYNSDS SSVKAEDLAV YYCQQYYDYP SSLQPDDVAT YYCQQYYDYP
    3 EU htnfl g Eu
    KMFGQG TKVEVKG..CKAPPA]
    WTFGGG SKLEIK.....seg<
    WTFGQG TKVEIKR. . {KAPPA}
    TNF· arrti-humano resíduos de estrutura alterados C$ =Kabat) a partir de
    Chgs 3/42/48/49/83/106/108
    Dados de Cadeia Pesada!
    EU QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFSRSAII WVRQA PGQGLEWMGG htnfl EVLLQQSGPE LVKPGASVKI PCKASGYTFTDYNVD WVKQS HGKSLQWIGN 2hEug QVQLVQSGAE VVKPGSSVKV SCKASGYTFTDYNVD WVKQA PGQGLQWIGN
    EU IVPMFGPPNYAQKFQG RVTITADESTNTAYMELSSLRSED htnfl INPNNGGTIYNQKFKG KGTLTVDKSSSTAYMELRSLTSED 2hEug INPNNGGTIYNQKFKG KGTLTVDKSTSTAYMELSSLTSED
    TAFYFCAGGY
    TAVYYCARSA
    TAVYYCARSA
    Eu GIYSPE htnfl FYNNYEYFDV 2hEug FYNNYEYFDV
    WGQGTLVTVSS. grp lKabat cdr chg frwK4
    WGAGTTVTVSS
    WGQGTTVTVSS resíduos de estrutura alterados Ç·# =Kabat) chgs 12/27/30/38/46/48/66/67/69/71/73/76/83/89/91/94/108
    Fig. 1
    ENXERTO COM CDR DE 101.4
    Dados de Cadeia Ligeira.*
    1 rei DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQDI.....IKYLNW YQQTPGKAPK
    101/4 QIVLTQSPPI MSASPGEKVT MTCSASSSVSFMY W YQQKPGSSPR gl014 QIVLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASSSVSFMY W YQQKPGKAPK
  2. 2 rei LLIYEASNLQA GVPSRFSGS GSGTDYTFTI SSLQPEDIAT YYCQQYQSLP 101/4 LLIYDASILAS GVPVRFSGS GSGTSYSLTI SRMEAEDVAT YYCQQWSDYS gl014 LLIYDASILAS GVPSRFSGS GSGTDYTLTI SSLQPEDIAT YYCQQWSDYS
  3. 3 rei YTFGQGTKLQ ITR.. tecn. cél. rei
    101/4 PRTFGGGTKLE IKR.....ISTO É .JSE DE RATO CINSERQAO EM CDR3) g!014 PRTFGQGTKVE IKR.. tecn. cél. rei resíduos de estrutura alterados (Φ =Kabat)
    1/3/4/39/73/104/105/107
    RESUMO DE CADEIA PESADA
    23 48
    KOL QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCSSSGFIFSSYAMY WVRQA PGKGLEWVAI 101/4 EVKIEESGGG WVQPGGSMKL SCIASGFTFSNYWMN WVRQS PEKGLEWVAE gl014 QVQIVESGGG WVQPGRSLRL SCIASGFTFSNYWMN WVRQA PGKGLEWVAE
    71 88
    KOL IWDDGSDQHYADSVKG RFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPED TGVYFCARDG 101/4 VRLQSDNFTTHYAESVKGRFTISRDDSKSGVYLQMNNLGAED TGIYYCTPFA Ç1014 VRLQSDNFTTHYAESVKGRFTISRDDSKNGVYLQMDSLRPED TGVYYCTPFA
    KOL GHGFCSSASCFGPDY WGQGTPVTVSS... HUMANO Cdef. CDR Kabat} 101/4 Y WGQGTLVTVSP. . . RATO seq gl014 Y WGQGTLVTVSS resíduos de estrutura alterados =Kabat)
  4. 4/11/23/24/28/73/77/78/79/91/93/94/108
    Fig. 2
    61Ε71
PT99934A 1990-12-21 1991-12-23 Processo para a producao de um anticorpo anti-htnf alfa recombinante ou humanizado PT99934B (pt)

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Families Citing this family (123)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US7192584B2 (en) 1991-03-18 2007-03-20 Centocor, Inc. Methods of treating psoriasis with anti-TNF antibodies
US5919452A (en) * 1991-03-18 1999-07-06 New York University Methods of treating TNFα-mediated disease using chimeric anti-TNF antibodies
US6284471B1 (en) 1991-03-18 2001-09-04 New York University Medical Center Anti-TNFa antibodies and assays employing anti-TNFa antibodies
US6277969B1 (en) 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
US6800738B1 (en) 1991-06-14 2004-10-05 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
WO1994004679A1 (en) * 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US6270766B1 (en) 1992-10-08 2001-08-07 The Kennedy Institute Of Rheumatology Anti-TNF antibodies and methotrexate in the treatment of arthritis and crohn's disease
GB9221654D0 (en) * 1992-10-15 1992-11-25 Scotgen Ltd Recombinant human anti-cytomegalovirus antibodies
PT614984E (pt) † 1993-03-05 2001-12-28 Bayer Ag Anticorpos humanos anti-tnf
DE4307508A1 (de) * 1993-03-10 1994-09-15 Knoll Ag Verwendung von anti-TNF-Antikörpern als Arzneimittel bei der Behandlung von Herzinsuffizienz (Herzmuskelschwäche)
US6180377B1 (en) * 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
US5463063A (en) 1993-07-02 1995-10-31 Celgene Corporation Ring closure of N-phthaloylglutamines
ATE240395T1 (de) 1994-03-29 2003-05-15 Celltech Therapeutics Ltd Antikörper gegen e-selektin
CA2210484C (en) * 1995-01-23 2012-12-04 Xenotech Incorporated Composition to ameliorate osteolysis and metastasis
US5641751A (en) * 1995-05-01 1997-06-24 Centocor, Inc. Tumor necrosis factor inhibitors
US5817789A (en) 1995-06-06 1998-10-06 Transkaryotic Therapies, Inc. Chimeric proteins for use in transport of a selected substance into cells
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US20140212413A1 (en) * 1995-12-11 2014-07-31 New York University Methods of Treating TNF-alpha-Mediated Diseases Using Chimeric TNF-alpha Antibodies
DK0929578T3 (da) 1996-02-09 2003-08-25 Abbott Lab Bermuda Ltd Humane antistoffer, der binder human TNFalfa
US7608262B2 (en) 1996-02-16 2009-10-27 The Kennedy Institute Of Rheumatology Methods of preventing or treating thrombosis with tumor necrosis factor antagonists
EP0791360A3 (en) * 1996-02-29 1997-09-24 Bayer Corporation Treatment of septic shock with anti-TNF antibodies
HU228769B1 (en) 1996-07-24 2013-05-28 Celgene Corp Substituted 2(2,6-dioxopiperidin-3-yl)phthalimides and -1-oxoisoindolines and their use for production of pharmaceutical compositions for mammals to reduce the level of tnf-alpha
DE69740140D1 (de) 1996-07-24 2011-04-14 Celgene Corp Substituierte 2-(2,6-Dioxopiperidin-3-yl)-phthalimide und Oxoisoindoline und Verfahren zur Verringerung der TNF-Alpha-Stufen
EP2177517B1 (en) 1996-07-24 2011-10-26 Celgene Corporation Amino substituted 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-phthalimide for reducing TNF alpha levels
CN1224712C (zh) 1997-06-04 2005-10-26 牛津生物医学（英国）有限公司 载体
WO2001036486A2 (en) 1999-11-18 2001-05-25 Oxford Biomedica (Uk) Limited Scfv antibodies against disease associated molecules
US7276488B2 (en) 1997-06-04 2007-10-02 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector system
DE19739685A1 (de) * 1997-09-10 1999-03-11 Eichel Streiber Christoph Von Monoklonale Antikörper zur Therapie und Prophylaxe von Erkrankungen durch Clostridium difficile
DE19746868A1 (de) * 1997-10-23 1999-04-29 Knoll Ag Verwendung von TNF-Antagonisten als Arzneimittel zur Behandlung von septischen Erkrankungen
EP1030684A4 (en) * 1997-11-14 2004-09-15 Euro Celtique Sa MODIFIED ANTIBODIES WITH IMPROVED CAPACITY TO TRIGGER ANTI-IDIOTYPE RESPONSE
CZ20013338A3 (cs) * 1999-03-18 2002-03-13 Celgene Corporation Substituované 1-oxo-a l,3-dioxoisoindoliny a jejich pouľití ve farmaceutických prostředcích pro sníľení koncentrací zánětlivých cytokinů
US20040220103A1 (en) 1999-04-19 2004-11-04 Immunex Corporation Soluble tumor necrosis factor receptor treatment of medical disorders
JP2001299349A (ja) * 2000-04-19 2001-10-30 Suntory Ltd 新規組換え型抗体とそのｃｄｒのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子
GB0013810D0 (en) * 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
AU2001278980A1 (en) 2000-07-21 2002-02-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Coumarin derivatives useful as tnfalpha inhibitors
UA81743C2 (uk) 2000-08-07 2008-02-11 Центокор, Инк. МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО ЛЮДИНИ, ЩО СПЕЦИФІЧНО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З ФАКТОРОМ НЕКРОЗУ ПУХЛИН АЛЬФА (ФНПα), ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, ЩО ЙОГО МІСТИТЬ, ТА СПОСІБ ЛІКУВАННЯ РЕВМАТОЇДНОГО АРТРИТУ
US6709655B2 (en) 2001-02-28 2004-03-23 Instituto Bioclon, S.A. De C.V. Pharmaceutical composition of F(ab1)2 antibody fragments and a process for the preparation thereof
CA2868614A1 (en) 2001-06-08 2002-12-08 Abbott Laboratories (Bermuda) Ltd. Methods of administering anti-tnf.alpha. antibodies
US20060073141A1 (en) * 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
TWI334439B (en) 2001-08-01 2010-12-11 Centocor Inc Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
GB2378949B (en) * 2001-08-16 2005-09-07 Morten Steen Hanefeld Dziegiel Recombinant anti-plasmodium falciparum antibodies
US20040018195A1 (en) * 2002-03-26 2004-01-29 Griswold Don Edgar Diabetes-related immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses
US20030206898A1 (en) 2002-04-26 2003-11-06 Steven Fischkoff Use of anti-TNFalpha antibodies and another drug
US7601817B2 (en) 2002-05-28 2009-10-13 Ucb Pharma S.A. Antibody peg positional isomers, compositions comprising same, and use thereof
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
US20040033228A1 (en) 2002-08-16 2004-02-19 Hans-Juergen Krause Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders
MY150740A (en) 2002-10-24 2014-02-28 Abbvie Biotechnology Ltd Low dose methods for treating disorders in which tnf? activity is detrimental
ES2347239T3 (es) 2002-12-02 2010-10-27 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos dirigidos al factor de necrosis tumoral y usos de los mismos.
WO2004063335A2 (en) * 2003-01-08 2004-07-29 Applied Molecular Evolution TNF-α BINDING MOLECULES
WO2004098578A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-18 Altana Pharma Ag Composition comprising a pde4 inhibitor and a tnf-alfa antagonist selected from infliximab, adalimumab, cdp870 and cdp517
US7892563B2 (en) 2003-05-20 2011-02-22 Wyeth Holdings Corporation Methods for treatment of severe acute respiratory syndrome (SARS)
CA2561531C (en) 2004-02-10 2017-05-02 The Regents Of The University Of Colorado Inhibition of factor b, the alternative complement pathway and methods related thereto
TW201705980A (zh) 2004-04-09 2017-02-16 艾伯維生物技術有限責任公司 用於治療ＴＮＦα相關失調症之多重可變劑量療法
GB0425972D0 (en) * 2004-11-25 2004-12-29 Celltech R&D Ltd Biological products
ATE499385T1 (de) * 2004-12-29 2011-03-15 Yuhan Corp Tumornekrosefaktor-alpha spezifische humanisierte antikörper
US7431927B2 (en) 2005-03-24 2008-10-07 Epitomics, Inc. TNFα-neutralizing antibodies
CA2903138A1 (en) 2005-05-16 2006-11-23 Abbvie Biotechnology Ltd. Use of tnfa inhibitor for treatment of erosive polyarthritis
AU2016204739C1 (en) * 2005-06-07 2017-10-19 Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc Stable and soluble antibodies inhibiting TNFalpha
CN102924597A (zh) 2005-06-07 2013-02-13 艾斯巴技术,爱尔康生物医药研究装置有限责任公司 抑制TNFα的稳定和可溶的抗体
AU2013207650B2 (en) * 2005-06-07 2016-04-21 Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc Stable and soluble antibodies inhibiting TNFalpha
AU2011265593B2 (en) * 2005-06-07 2013-08-15 Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc Stable and soluble antibodies inhibiting TNFalpha
CA2862540C (en) 2005-09-21 2018-07-31 The Regents Of The University Of California Systems, compositions, and methods for local imaging and treatment of pain
US20090286962A1 (en) * 2005-12-20 2009-11-19 Woolven Benjamin P Chimeric antibodies with part new world primate binding regions
NZ569988A (en) 2006-02-01 2011-09-30 Cephalon Australia Pty Ltd Domain antibody construct which binds to human TNF-alpha and contains a modified hinge region sequence and a truncated CH1 domain
SG170837A1 (en) 2006-04-05 2011-05-30 Abbott Biotech Ltd Antibody purification
US9399061B2 (en) 2006-04-10 2016-07-26 Abbvie Biotechnology Ltd Methods for determining efficacy of TNF-α inhibitors for treatment of rheumatoid arthritis
EP2007426A4 (en) 2006-04-10 2010-06-16 Abbott Biotech Ltd COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF PSORIASTIC POLYARTHRITIS AND THEIR APPLICATIONS
US9605064B2 (en) 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
MY157173A (en) * 2006-05-25 2016-05-13 Glaxo Group Ltd Modified humanised anti-interleukin-18
US8680252B2 (en) 2006-12-10 2014-03-25 Dyadic International (Usa), Inc. Expression and high-throughput screening of complex expressed DNA libraries in filamentous fungi
US8168415B2 (en) 2007-02-07 2012-05-01 The Regents Of The University Of Colorado Axl fusion proteins as Axl tyrosine kinase inhibitors
JP2010528647A (ja) 2007-06-06 2010-08-26 ドマンティス リミテッド ポリペプチド、抗体可変ドメインおよびアンタゴニスト
WO2008154543A2 (en) 2007-06-11 2008-12-18 Abbott Biotechnology Ltd. Methods for treating juvenile idiopathic arthritis
CA2960659C (en) 2007-11-09 2021-07-13 The Salk Institute For Biological Studies Use of tam receptor inhibitors as immunoenhancers and tam activators as immunosuppressors
NZ586828A (en) 2008-01-15 2012-12-21 Abbott Gmbh & Co Kg Powdered antibody compositions and methods of making same
US9365644B2 (en) * 2008-04-23 2016-06-14 Epitomics, Inc. Anti-TNFα antibody
JPWO2009142186A1 (ja) * 2008-05-20 2011-09-29 株式会社カネカ 細胞障害性組成物
HUE039692T2 (hu) * 2008-06-25 2019-01-28 Esbatech Alcon Biomed Res Unit TNF-et gátló stabil és oldható ellenanyagok
EP2671891A3 (en) 2008-06-27 2014-03-05 Amgen Inc. Ang-2 inhibition to treat multiple sclerosis
US8415291B2 (en) 2008-10-31 2013-04-09 Centocor Ortho Biotech Inc. Anti-TNF alpha fibronectin type III domain based scaffold compositions, methods and uses
RU2012147249A (ru) 2010-04-07 2014-05-20 Эббви Инк. TNF-α- СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ
CN102675460B (zh) * 2011-02-28 2015-08-19 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 抗肿瘤坏死因子α的人源化抗体
EP2702077A2 (en) 2011-04-27 2014-03-05 AbbVie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
WO2013158279A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
WO2013176754A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Abbvie Inc. Novel purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
AU2013309506A1 (en) 2012-09-02 2015-03-12 Abbvie Inc. Methods to control protein heterogeneity
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
AU2013381687A1 (en) 2013-03-12 2015-09-24 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human TNF-alpha and methods of preparing the same
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
US8921526B2 (en) 2013-03-14 2014-12-30 Abbvie, Inc. Mutated anti-TNFα antibodies and methods of their use
WO2014151878A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
EP3052640A2 (en) 2013-10-04 2016-08-10 AbbVie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US8946395B1 (en) 2013-10-18 2015-02-03 Abbvie Inc. Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography
CA3185700A1 (en) 2013-11-06 2015-05-14 Astute Medical, Inc. Assays for igfbp7 having improved performance in biological samples
WO2015073884A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
GB201522394D0 (en) 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
US10465003B2 (en) 2016-02-05 2019-11-05 Janssen Biotech, Inc. Anti-TNF antibodies, compositions, methods and use for the treatment or prevention of type 1 diabetes
RS61412B1 (sr) 2016-03-17 2021-03-31 Tillotts Pharma Ag Anti-tnf alfa-antitela i njihovi funkcionalni fragmenti
US10759852B2 (en) 2016-03-17 2020-09-01 Numab Innovation Ag Anti-TNF-alpha-antibodies and functional fragments thereof
US10787508B2 (en) 2016-03-17 2020-09-29 Numab Innovation Ag Anti-TNFα-antibodies and functional fragments thereof
DK3219726T3 (da) 2016-03-17 2020-12-07 Tillotts Pharma Ag Anti-TNF-alfa-antistoffer og funktionelle fragmenter deraf
SG11201808041UA (en) 2016-03-17 2018-10-30 Numab Innovation Ag ANTI-TNFa-ANTIBODIES AND FUNCTIONAL FRAGMENTS THEREOF
AU2017274442B2 (en) 2016-06-02 2021-08-19 Abbvie Inc. Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
EP3573658A4 (en) 2017-01-30 2021-07-21 Janssen Biotech, Inc. ANTI-TNF ANTIBODIES, COMPOSITIONS, AND METHODS FOR TREATMENT OF ACTIVE PSORIATIC ARTHRITIS
JP2020506947A (ja) 2017-02-07 2020-03-05 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 活動性強直性脊椎炎を治療するための抗ｔｎｆ抗体、組成物、及び方法
EP3409688A1 (en) 2017-05-31 2018-12-05 Tillotts Pharma Ag Topical treatment of inflammatory bowel disease using anti-tnf-alpha antibodies and fragments thereof
EP3456739A1 (en) 2017-09-19 2019-03-20 Tillotts Pharma Ag Use of anti-tnfalpha antibodies for treating wounds
EP3459529A1 (en) 2017-09-20 2019-03-27 Tillotts Pharma Ag Preparation of sustained release solid dosage forms comprising antibodies by spray drying
EP3459528B1 (en) 2017-09-20 2022-11-23 Tillotts Pharma Ag Preparation of solid dosage forms comprising antibodies by solution/suspension layering
EP3459527B1 (en) 2017-09-20 2022-11-23 Tillotts Pharma Ag Method for preparing a solid dosage form comprising antibodies by wet granulation, extrusion and spheronization
EP3884962A1 (en) 2017-12-01 2021-09-29 AbbVie Inc. Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
US20210070854A1 (en) * 2017-12-29 2021-03-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Antimicrobial nanobodies
WO2020114616A1 (en) 2018-12-07 2020-06-11 Tillotts Pharma Ag Topical treatment of immune checkpoint inhibitor induced diarrhoea, colitis or enterocolitis using antibodies and fragments thereof
IT201900000651A1 (it) 2019-01-16 2019-04-16 Pastore Lucio Tecnologia di trasferimento genico
SG11202107995SA (en) 2019-01-31 2021-08-30 Numab Therapeutics AG Multispecific antibodies having specificity for tnfa and il-17a, antibodies targeting il-17a, and methods of use thereof
CN113874073A (zh) 2019-05-23 2021-12-31 詹森生物科技公司 用针对IL-23和TNFα的抗体的联合疗法治疗炎性肠病的方法
JP2023554200A (ja) 2020-12-09 2023-12-26 エイチケー イノ．エヌ コーポレーション 抗ＯＸ４０Ｌ抗体、抗ＯＸ４０Ｌ及び抗ＴＮＦαの二重特異性抗体、並びにこれらの用途

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4965271A (en) * 1986-12-31 1990-10-23 Hoechst Roussel Pharmaceuticals, Inc. Method of inhibiting the activity of leukocyte derived cytokines
AU625613B2 (en) * 1988-01-05 1992-07-16 Novartis Ag Novel chimeric antibodies
GB8805792D0 (en) * 1988-03-11 1988-04-13 Celltech Ltd Medicaments
AU4182289A (en) * 1988-08-19 1990-03-23 Celltech Limited Pharmaceutical products for anti-neoplastic therapy
CA2018248A1 (en) * 1989-06-07 1990-12-07 Clyde W. Shearman Monoclonal antibodies against the human alpha/beta t-cell receptor, their production and use
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5958413A (en) * 1990-11-01 1999-09-28 Celltech Limited Use of antibodies to TNF or fragments derived thereof and xanthine derivatives for combination therapy and compositions therefor
GB9023783D0 (en) * 1990-11-01 1990-12-12 Celltech Ltd Pharmaceutical product
EP0610201B2 (en) * 1991-03-18 2007-09-26 New York University Monoclonal and chimeric antibodies specific for human tumor necrosis factor
PT614984E (pt) * 1993-03-05 2001-12-28 Bayer Ag Anticorpos humanos anti-tnf

Also Published As

Publication number Publication date
NO20012882D0 (no) 2001-06-11
JPH05507418A (ja) 1993-10-28
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AU669083B2 (en) 1996-05-23
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GB9217880D0 (en) 1992-10-28
CA2129554C (en) 1998-12-29
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ES2190434T3 (es) 2003-08-01
GB9109645D0 (en) 1991-06-26
HU211626A9 (en) 1995-12-28
DE69117284D1 (de) 1996-03-28
AU7772394A (en) 1995-03-09
BR9106232A (pt) 1993-03-30
EP0626389B1 (en) 2002-12-04
OA09666A (en) 1993-05-15
GB2257145B (en) 1995-06-14
GB2257145A (en) 1993-01-06
CA2076540C (en) 2001-03-27
ATE228853T1 (de) 2002-12-15
EP0516785A1 (en) 1992-12-09
NZ260226A (en) 1995-04-27
NL9120013A (nl) 1992-11-02
CA2076540A1 (en) 1992-06-22
DE4193302T1 (de) 1993-02-18
EP0626389A1 (en) 1994-11-30
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CA2129554A1 (en) 1992-06-22
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JP3383795B2 (ja) 2003-03-04
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ES2084338T3 (es) 1996-05-01
AU9108491A (en) 1992-07-22
NZ241147A (en) 1995-04-27
CA2329482A1 (en) 1992-06-22
JP3145401B2 (ja) 2001-03-12
WO1992011383A1 (en) 1992-07-09
DK0626389T3 (da) 2003-03-31
NO923231L (no) 1992-10-20
HU9202605D0 (en) 1992-10-28
FI923737A (fi) 1992-08-20
DE69133167D1 (de) 2003-01-16
GR3019066T3 (en) 1996-05-31
DE69133167T2 (de) 2003-07-24
PT99934A (pt) 1993-01-29
HUT62661A (en) 1993-05-28
EP0927758A2 (en) 1999-07-07
US20030199679A1 (en) 2003-10-23
EP0516785B1 (en) 1996-02-21
EP0927758A3 (en) 2001-02-21

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