ES2347239T3

ES2347239T3 - Anticuerpos dirigidos al factor de necrosis tumoral y usos de los mismos.

Info

Publication number: ES2347239T3
Application number: ES03796574T
Authority: ES
Inventors: John S. Babcook; Jaspal S. Kang; Orit Foord; Larry Green; Xiao Feng; Scott Klakamp; Mary Haak-Frendscho; Palaniswami Rathanaswami; Craig Pigott; Meina L. Liang; Rozanne Lee; Kathy Manchulencho; Raffaella Faggioni; Giorgio Senaldi; Quiaojuan Jane Su
Original assignee: Amgen Fremont Inc
Current assignee: Amgen Fremont Inc
Priority date: 2002-12-02
Filing date: 2003-12-02
Publication date: 2010-10-27
Anticipated expiration: 2023-12-02
Also published as: JP4754219B2; US20080187531A1; EP1578799A4; HK1083023A1; WO2004050683A2; AU2003298816C1; RU2377253C2; JP2006508167A; AU2003298816A1; MXPA05005921A; CA2508375A1; US20050049402A1; EP1578799B8; CN100434440C; EP1578799A2; AU2003298816B2; ATE472556T1; DE60333228D1; US8101178B2; WO2004050683A3

Abstract

Anticuerpo monoclonal humano que se une de manera específica al factor de necrosis tumoral α (TNFα) y comprende un polipéptido de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 70 y 74; y un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, en el que dicho anticuerpo monoclonal humano se une al TNFα con una Kd inferior a 10-11 M.

Description

Anticuerpos dirigidos al factor de necrosis tumoral y usos de los mismos.

Campo

La presente invención se refiere a anticuerpos dirigidos al antígeno factor de necrosis tumoral alfa (a continuación en el presente documento TNFa, factor de necrosis tumoral \alpha o TNF\alpha) y a usos de tales anticuerpos. Más específicamente, la presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales totalmente humanos dirigidos al antígeno TNFa y a usos de estos anticuerpos. Los aspectos de la invención también se refieren a hibridomas u otras líneas celulares que expresan tales anticuerpos. Los anticuerpos del presente documento son útiles como diagnósticos y como tratamientos para enfermedades asociadas con la actividad y/o sobreproducción del TNFa.

Antecedentes

Se ha demostrado que el TNFa está implicado en enfermedades infecciosas, trastornos inmunitarios, patologías autoinmunitarias, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), neoplasia/cáncer y caquexia asociada al cáncer. Véase, Feldman M., 2002 Nat. Rev. Immunol., 2:364. En particular, los niveles de TNFa se inducen de manera espectacular en septicemia por Gram negativas, choque endotóxico (Véase, Michie et al., 1989 Br. J. Surg. 76:670) enfermedad de Crohn y artritis reumatoide. Las implicaciones del TNFa en una amplia variedad de este tipo de indicaciones resalta la importancia de desarrollar agentes terapéuticos biológicos específicos que seleccionan como diana esta citocina inflamatoria.

Varios investigadores notifican la caracterización de anticuerpos monoclonales contra el TNFa que neutralizan su actividad in vitro. Véase, Liang CM, et al., 1986, Biochem. Biophys Res. Commun., 137:847, y Meager A, et al., 1987 Hybridoma 6:305. Algunos de estos anticuerpos se usaron para mapear epítopos de TNFa humano y desarrollar inmunoensayos enzimáticos y para ayudar en la purificación del TNFa recombinante. Véase Fendly BM, et al., 1987 Hybridoma, 6:359; Hirai M, et al., 1987 J. Immunol Methods, 96:57; Moller A, et al., 1990 Cytokine, 2:162; Bringman TS y Aggarwal BB, 1987, Hybridoma, 6:489. Desafortunadamente, los anticuerpos generados para estos estudios no serían útiles como anticuerpos anti-TNFa neutralizantes terapéuticos para tratar pacientes humanos puesto que derivaron de especies no humanas y carecen de especificidad para el TNFa.

Los antisueros neutralizantes o AcM frente al TNFa han mostrado eficacia en mamíferos no humanos suprimiendo acontecimientos fisiopatológicos adversos y evitando la muerte tras una exposición letal en endotoxemia experimental. Estos efectos se han demostrado en sistemas de modelos de primates no humanos y roedores. Véase, Beutler B, et al., 1985 Science, 229:869; Tracey KJ, et al., 1987 Nature, 330:662; Mathison JC, et al., 1988 J. Clin. Invest., 81:1925; Shimamoto Y, et al., 1988, Immunol. Lett., 17:311; Opal SM, et al., 1990, J. Infect. Dis., 161:1148; Silva AT, et al., 1990, J. Infect. Dis., 162:454; Hinshaw LB, et al., 1990, Circ. Shock, 30:279.

Actualmente existen diversas formas de anticuerpos neutralizantes y se revisan por Feldman. Véase, Feldman M, 2002, Nat. Rev. Immunol., 2:364. Tal como se describe en esta revisión, se ha dedicado un enorme esfuerzo para crear un anticuerpo neutralizante que produjera un anticuerpo terapéuticamente adecuado para la administración prolongada a seres humanos. Por ejemplo, se han preparado anticuerpos quiméricos, en los que las regiones variables de las cadenas de anticuerpo se derivan de murino y las regiones constantes de las cadenas de anticuerpo se derivan de ser humano, (Knight, D. M, et al. (1993) Mol. Immunol. 30:1443-1453; publicación PCT n.º WO 92/16553 por Daddona, P. E., et al.). Adicionalmente, se han producido anticuerpos humanizados, en los que los dominios hipervariables de las regiones variables de anticuerpo se derivan de murino pero el resto de las regiones variables y las regiones constantes de anticuerpo se derivan de humano (publicación PCT n.º WO 92/11383 por Adair, J. R., et al.). Sin embargo, debido a que estos anticuerpos quiméricos y humanizados todavía contienen algunas secuencias de murino, pueden provocar una reacción inmunitaria no deseada, la reacción de anticuerpos anti-quiméricos humanos (HACA), especialmente cuando se administra durante períodos prolongados, por ejemplo, para indicaciones crónicas, tales como artritis reumatoide (véase por ejemplo, Elliott, M. J., et al. (1994) Lancet 344:1125-1127; Elliot, M. J., et al., (1994) Lancet 344:1105-1110).

Los autoanticuerpos monoclonales totalmente humanos contra el hTNFa se han preparado usando técnicas de hibridoma humano (Boyle, P., et al. (1993) Cell. Immunol. 152:556-568; Boyle, P., et al. (1993) Cell. Immunol. 152:569-581; publicación de solicitud de patente europea n.º 614 984 A2 por Boyle, et al.). Se han descrito anticuerpos humanos recombinantes que se unen al hTNFa (Griffiths, A. D., et al. (1993) EMBO J. 12:725-734). Sin embargo, debido a sus cinéticas de disociación relativamente rápidas, estos anticuerpos no pueden ser adecuados para su uso terapéutico. Adicionalmente, se ha descrito un anticuerpo anti-hTNFa humano recombinante que no neutraliza la actividad del hTNFa, sino más bien potencia la unión del hTNFa a la superficie de células y potencia la internalización del hTNFa (Lidbury, A., et al. (1994) Biotechnol. Ther. 5:27-45; publicación PCT n.º WO 92103145 por Aston, R. et al). Actualmente, las proteínas de fusión anticuerpo/TNFR (fcIg/TNFR) (Enbrel) han mostrado cierta utilidad, pero se enfrentan a una corta semivida en el suero conduciendo a una administración frecuente (por ejemplo, dos veces a la semana) del fármaco. Un anticuerpo terapéutico neutralizante frente al TNFa para tratamiento prolongado superaría el problema de la semivida (una inyección a las 3-4 semanas) siempre que el propio anticuerpo no fuera inmunógeno. Otros han intentado crear anticuerpos neutralizantes frente al TNFa que tengan las características deseadas de baja/ninguna inmunogenicidad y una semivida típica de sus homólogos endógenos sin éxito. Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen quimeras de ratón/ser humano, tales como infliximab (cA2 o Remicade), y el anticuerpo humanizado CDP571. Se ha dado a conocer la producción de anticuerpos humanos, tales como anticuerpos humanos recombinantes, que se unen al hTNFa soluble y neutralizan la actividad del hTNFa, incluyendo la citotoxicidad inducida por el hTNFa (in vitro e in vivo) y la activación celular inducida por el hTNFa en la patente estadounidense 6.258.562. Éstos representan intentos para crear anticuerpos terapéuticos neutralizantes que se asemejen estrechamente a sus homólogos
humanos.

Desafortunadamente, el potencial completo de estos fármacos no puede llevarse a cabo debido a su inmunogenicidad potencial inherente, semivida comprometida y/o avidez/afinidad reducida por el TNFa. Las respuestas inmunitarias del huésped inducidas por estos anticuerpos quiméricos pueden conducir al aclaramiento de los anticuerpos de la circulación y hacen a la administración repetida inadecuada para terapia debido a la pérdida de eficacia. En última instancia, estos problemas reducen el beneficio terapéutico al paciente. También pueden encontrarse problemas adicionales en el aumento a escala y la fabricación usando anticuerpos o fragmentos de los mismos, tal como los mencionados anteriormente.

Por tanto, por los motivos anteriores, existe una necesidad en la técnica de proporcionar una alternativa a los pacientes en poblaciones clínicamente indicadas en los que el TNFa es responsable de la fisiopatología de una enfermedad particular. Los anticuerpos monoclonales neutralizantes, de alta afinidad, totalmente humanos, o fragmentos de los mismos, para administración prolongada proporcionan las características deseadas de una opción terapéutica no inmunógena con una semivida adecuada para una administración menos frecuente.

Sumario

Las realizaciones de la invención se refieren a anticuerpos monoclonales humanos que se unen de manera específica al factor de necrosis tumoral \alpha (denominado en el presente documento factor de necrosis tumoral alfa, TNFa o TNF\alpha) y comprenden un polipéptido de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 70 y 74; y un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, en los que dichos anticuerpos monoclonales humanos se unen al TNFa con una Kd inferior a 10^{-11} M. Un ejemplo no limitativo de un anticuerpo monoclonal humano de este tipo es el anticuerpo 299v2.

Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales humanos según la presente invención que se unen de manera específica al factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha) pueden comprender un polipéptido de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 70; y un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, en los que dichos anticuerpos monoclonales humanos se unen al TNFa con una Kd inferior a 10^{-11} M. Alternativamente, los anticuerpos monoclonales humanos según la presente invención que se unen de manera específica al factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha) pueden comprender un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 74; y un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, en los que dichos anticuerpos monoclonales humanos se unen al TNF\alpha, con una Kd inferior a 10^{-11} M.

La invención proporciona además métodos para someter a ensayo el nivel de factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) en una muestra de un paciente, que comprenden poner en contacto un anticuerpo anti-TNFa con una muestra biológica de un paciente, y detectar el nivel de unión entre dicho anticuerpo y el TNFa en dicha muestra. En realizaciones más específicas, la muestra biológica es sangre.

En otras realizaciones la invención proporciona composiciones, que incluyen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Las realizaciones adicionales incluyen anticuerpos de la invención para su uso en el tratamiento eficaz de enfermedades inflamatorias inmunomediadas en un animal, incluyendo artritis reumatoide, glomerulonefritis, aterosclerosis, psoriasis, reestenosis, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad de Crohn, reacciones injerto-huésped, choque septicémico, caquexia, anorexia, uveítis, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, vasculitis y esclerosis múltiple. Las realizaciones particulares adicionales incluyen anticuerpos de la invención para su uso en el tratamiento eficaz de enfermedades inflamatorias inmunomediadas en un animal, incluyendo artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis psoriásica o espondilitis anquilosante.

Usos adicionales de los anticuerpos del presente documento pueden ser para la preparación de un medicamento para el tratamiento eficaz de enfermedades inflamatorias inmunomediadas en un animal, en los que dicho anticuerpo monoclonal se une de manera específica al factor de necrosis tumoral alfa (TNFa). Las enfermedades inflamatorias inmunomediadas que pueden tratarse pueden incluir artritis reumatoide, glomerulonefritis, aterosclerosis, psoriasis, reestenosis, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad de Crohn, reacciones injerto-huésped, choque septicémico, caquexia, anorexia, uveítis, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, vasculitis y esclerosis múltiple. En realizaciones particulares adicionales, los anticuerpos de la invención se usan para la preparación de un medicamento para el tratamiento eficaz de enfermedades inflamatorias inmunomediadas en un animal, incluyendo artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis psoriásica o espondilitis anquilosante.

Las realizaciones de la invención descritas en el presente documento se refieren a anticuerpos monoclonales que se unen al TNFa y afectan a la función del TNFa. Otras realizaciones se refieren a anticuerpos anti-TNFa totalmente humanos y preparaciones de anticuerpos anti-TNFa con propiedades deseables desde una perspectiva terapéutica, incluyendo una fuerte afinidad de unión por el TNFa, la capacidad de neutralizar el TNFa in vitro e in vivo, y la capacidad de inhibir la apoptosis inducida por el TNFa.

En una realización preferida, los anticuerpos descritos en el presente documento se unen al TNFa con afinidades muy altas (Kd). Se mostró que los anticuerpos 299 V.1 y 299 V.2 presentan afinidades en el intervalo de 10^{-13} o bajo 10^{-12} (M). Las mediciones de afinidad y/o avidez pueden medirse mediante KinExA® y/o BIACORE®, tal como se describe en el presente documento.

Por consiguiente, una realización descrita en el presente documento incluye anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de aquellos anticuerpos, que se unen al TNFa. Tal como se conoce en la técnica, los anticuerpos son de manera ventajosa anticuerpos monoclonales, totalmente humanos. Las realizaciones de la invención descritas en el presente documento también proporcionan células para producir estos anticuerpos.

Se apreciará que las realizaciones de la invención no se limitan a ninguna forma particular de un anticuerpo o método de generación o producción. Por ejemplo, el anticuerpo anti-TNFa puede ser un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, que tiene una región Fc humana intacta) o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un Fab, Fab' o F(ab')_{2}). Además, el anticuerpo puede fabricarse a partir de un hibridoma que secreta el anticuerpo, o a partir de una célula producida de manera recombinante que se ha transformado o transfectado con un gen o genes que codifican para el anticuerpo.

Otra realización de la invención incluye un método de diagnosticar enfermedades o estados en los que se utiliza un anticuerpo preparado tal como se describe en el presente documento para detectar el nivel de TNFa en una muestra de un paciente. En una realización, la muestra del paciente es sangre o suero sanguíneo. En realizaciones adicionales, se presentan métodos para la identificación de factores de riesgo, diagnóstico de la enfermedad, y clasificación del estadio de la enfermedad que implican la identificación de la sobreexpresión del TNFa usando anticuerpos
anti-TNFa.

La solicitud da a conocer métodos, herramientas y kits para diagnosticar un estado asociado con la expresión del TNFa en una célula poniendo en contacto la célula con un anticuerpo anti-TNFa, y después de eso detectar la presencia de TNFa. Los estados preferidos incluyen, pero no se limitan a, enfermedades neoplásicas incluyendo, sin limitación, tumores, cánceres, tales como cáncer de mama, de ovario, de estómago, endometrial, de glándulas salivales, de pulmón, de riñón, de colon, colorrectal, de tiroides, pancreático, de próstata y de vejiga. En otra realización, puede usarse un anticuerpo anti-TNFa para diagnosticar un estado inflamatorio incluyendo, pero sin limitarse a, aterosclerosis, reestenosis, enfermedad autoinmunitaria, enfermedades inflamatorias inmunomediadas (IMID) incluyendo, pero sin limitarse a, artritis reumatoide, psoriasis, uveítis (por ejemplo, infantil y seronegativa), lupus y otras enfermedades mediadas por complejos inmunitarios tales como pénfigo y glomerulonefritis, hipertiroidismo congénito (CH), hipersensibilidad de tipo retardada (DTH) tal como hipersensibilidad por contacto, sarcoidosis, enfermedad de Behcet, artritis crónica, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, enfermedad de Still del adulto, enfermedad de Sjögren primaria, esclerodermia, arteritis de células gigantes, síndrome de SAPHO, cirrosis biliar primaria (PBC), sarcoidosis, síndromes mielodisplásicos, síndrome de Wegener y otras vasculitis, neoplasias malignas hematológicas, trastornos cocleovestibulares, síndrome de la activación de macrófagos, asma, enfermedad pulmonar intersticial, hepatitis C, fibrosis pulmonar, inducción de ovulación, síndromes mielodisplásicos, enfermedad de Crohn, reacciones injerto-huésped, choque septicémico, caquexia, anorexia y esclerosis múltiple. Otros estados que los anticuerpos pueden diagnosticar se dan a conocer en la patente estadounidense n.º 6.090.382 concedida a Salfeld et al., y la patente estadounidense n.º 5.436.154 concedida a Barbanti, et al.

En otra realización, la invención da a conocer un kit de ensayo para detectar el TNFa y miembros de la familia del TNFa en tejidos o células de mamífero para detectar enfermedades neoplásicas o estados inflamatorios. El kit incluye un anticuerpo que se une al TNFa y un medio para indicar la reacción del anticuerpo con el TNFa, si está presente. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En particular, el anticuerpo que se une al TNFa está marcado. Alternativamente, el anticuerpo es un primer anticuerpo no marcado y el kit incluye además un medio para detectar el primer anticuerpo. El medio incluye un segundo anticuerpo marcado que es un anticuerpo anti-inmunoglobulina. Preferiblemente, el anticuerpo se marca con un marcador seleccionado del grupo que consiste en un fluorocromo, una enzima, un radionúclido y un material radiopaco.

Otras realizaciones de la invención incluyen composiciones farmacéuticas que tienen una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-TNFa en mezcla con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, pueden usarse tales anticuerpos para el tratamiento de estados inflamatorios incluyendo, pero sin limitarse a, aterosclerosis, reestenosis, enfermedad autoinmunitaria, enfermedades inflamatorias inmunomediadas (IMID) incluyendo, pero sin limitarse a, artritis reumatoide, psoriasis, uveítis (por ejemplo, infantil y seronegativa), lupus y otras enfermedades mediadas por complejos inmunitarios tales como pénfigo y glomerulonefritis, hipertiroidismo congénito (CH), hipersensibilidad de tipo retardada (DTH) tal como hipersensibilidad por contacto, sarcoidosis, enfermedad de Behcet, artritis crónica, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, enfermedad de Still del adulto, enfermedad de Sjögren primaria, esclerodermia, arteritis de células gigantes, síndrome de SAPHO, cirrosis biliar primaria (PBC), sarcoidosis, síndromes mielodisplásicos, síndrome de Wegener y otras vasculitis, neoplasias malignas hematológicas, trastornos cocleovestibulares, síndrome de la activación de macrófagos, asma, enfermedad pulmonar intersticial, hepatitis C, fibrosis pulmonar, inducción de ovulación, síndromes mielodisplásicos, enfermedad de Crohn, reacciones injerto-huésped, choque septicémico, caquexia, anorexia y esclerosis múltiple. Otros estados que los anticuerpos pueden tratar se dan a conocer en la patente estadounidense n.º 6.090.382 concedida a Salfeld et al., y la patente estadounidense n.º 5.436.154 concedida a Barbanti, et al. En particular, la presente invención engloba anticuerpos para su uso en el tratamiento eficaz de enfermedades inflamatorias inmunomediadas en un animal, en el que dichas enfermedades se seleccionan del grupo que consiste en artritis reumatoide, glomerulonefritis, aterosclerosis, psoriasis, reestenosis, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad de Crohn, reacciones injerto-huésped, choque septicémico, caquexia, anorexia, uveítis, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, vasculitis y esclerosis múltiple.

Las realizaciones particulares adicionales incluyen los anticuerpos de la invención para su uso en el tratamiento eficaz de enfermedades inflamatorias inmunomediadas en un animal, incluyendo artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis psoriásica o espondilitis anquilosante. Por consiguiente, la presente invención engloba el uso de anticuerpos según la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento eficaz de enfermedades inflamatorias inmunomediadas en un animal, en el que dichas enfermedades se seleccionan del grupo que consiste en artritis reumatoide, glomerulonefritis, aterosclerosis, psoriasis, reestenosis, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad de Crohn, reacciones injerto-huésped, choque septicémico, caquexia, anorexia, uveítis, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, vasculitis y esclerosis múltiple.

Más particularmente, los anticuerpos de la invención se usan para la preparación de un medicamento para el tratamiento eficaz de enfermedades inflamatorias inmunomediadas en un animal, incluyendo artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis psoriásica o espondilitis anquilosante.

Aún otra realización incluye métodos para tratar enfermedades o estados asociados con la expresión del TNFa en un paciente, administrando al paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-TNFa. El método puede realizarse in vivo y el paciente es preferiblemente un paciente humano. En una realización preferida, el método se refiere al tratamiento de enfermedades inflamatorias inmunomediadas (IMID) incluyendo, pero sin limitarse a, artritis reumatoide, psoriasis, uveítis (por ejemplo, infantil y seronegativa), lupus y otras enfermedades mediadas por complejos inmunitarios tales como pénfigo y glomerulonefritis, hipertiroidismo congénito (CH), hipersensibilidad de tipo retardada (DTH) tal como hipersensibilidad por contacto, sarcoidosis, enfermedad de Behcet, artritis crónica, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, enfermedad de Still del adulto, enfermedad de Sjögren primaria, esclerodermia, arteritis de células gigantes, síndrome de SAPHO, cirrosis biliar primaria (CBP), sarcoidosis, síndromes mielodisplásicos, síndrome de Wegener y otras vasculitis, neoplasias malignas hematológicas, trastornos cocleovestibulares, síndrome de la activación de macrófagos, asma, enfermedad pulmonar intersticial, hepatitis C, fibrosis pulmonar, inducción de ovulación, síndromes mielodisplásicos, enfermedad de Crohn, reacciones injerto-huésped, choque septicémico, caquexia, anorexia y esclerosis múltiple. Otros estados que los anticuerpos pueden tratar se dan a conocer en la patente estadounidense n.º 6.090.382 concedida a Salfeld et al., y la patente estadounidense n.º 5.436.154 concedida a Barbanti, et al. En particular, la presente invención engloba anticuerpos para su uso en el tratamiento eficaz de una enfermedad asociada con la expresión del factor de necrosis tumoral alfa en un animal, en el que dichas enfermedades se seleccionan del grupo que consiste en artritis reumatoide, glomerulonefritis, aterosclerosis, psoriasis, reestenosis, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad de Crohn, reacciones injerto-huésped, choque septicémico, caquexia, anorexia, uveítis, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, vasculitis y esclerosis múltiple.

Las realizaciones particulares adicionales incluyen los anticuerpos de la invención para su uso en el tratamiento eficaz de una enfermedad asociada con la expresión del factor de necrosis tumoral alfa en un animal, incluyendo artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis psoriásica o espondilitis anquilosante.

Por consiguiente, la presente invención engloba el uso de anticuerpos según la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento eficaz de una enfermedad asociada con la expresión del factor de necrosis tumoral alfa en un animal, en el que dichas enfermedades are se seleccionan del grupo que consiste en artritis reumatoide, glomerulonefritis, aterosclerosis, psoriasis, reestenosis, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad de Crohn, reacciones injerto-huésped, choque septicémico, caquexia, anorexia, uveítis, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, vasculitis y esclerosis múltiple.

Más particularmente, los anticuerpos de la invención se usan para la preparación de un medicamento para el tratamiento eficaz de una enfermedad asociada con la expresión del factor de necrosis tumoral alfa en un animal, incluyendo artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis psoriásica o espondilitis anquilosante.

La invención da a conocer un artículo de fabricación que incluye un envase. El envase incluye una composición que contiene un anticuerpo anti-TNFa, y un prospecto o etiqueta que indica que la composición puede usarse para tratar enfermedades neoplásicas o inflamatorias caracterizadas por la sobreexpresión del TNFa.

El anticuerpo anti-TNFa se administra a un paciente, tras la administración de un agente de aclaramiento para eliminar el exceso de anticuerpo circulante de la sangre.

Los anticuerpos anti-TNFa pueden modificarse para potenciar su capacidad de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En una realización, pueden modificarse anticuerpos anti-TNFa, tal como mediante una sustitución de aminoácidos, para alterar su aclaramiento del organismo. Alternativamente, algunas otras sustituciones de aminoácidos pueden retardar el aclaramiento del anticuerpo del cuerpo.

Aún otra realización es el uso de un anticuerpo anti-TNFa en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades tales como estados inflamatorios. En una realización específica, el estado inflamatorio incluye, pero no se limita a, aterosclerosis, reestenosis, enfermedad autoinmunitaria, enfermedades inflamatorias inmunomediadas (IMID) incluyendo, pero sin limitarse a artritis reumatoide, psoriasis, uveítis (por ejemplo, infantil y seronegativa), lupus y otras enfermedades mediadas por complejos inmunitarios tales como pénfigo y glomerulonefritis, hipertiroidismo congénito (CH), hipersensibilidad de tipo retardada (DTH) tal como hipersensibilidad por contacto, sarcoidosis, enfermedad de Behcet, artritis crónica, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, enfermedad de Still del adulto, enfermedad de Sjögren primaria, esclerodermia, arteritis de células gigantes, síndrome de SAPHO, cirrosis biliar primaria (PBC), sarcoidosis, síndromes mielodisplásicos, síndrome de Wegener y otras vasculitis, neoplasias malignas hematológicas, trastornos cocleovestibulares, síndrome de la activación de macrófagos, asma, enfermedad pulmonar intersticial, hepatitis C, fibrosis pulmonar, inducción de ovulación, síndromes mielodisplásicos, enfermedad de Crohn, reacciones injerto-huésped, choque septicémico, caquexia, anorexia y esclerosis múltiple. Otros estados que los anticuerpos pueden tratar se dan a conocer en la patente estadounidense n.º 6.090.382 concedida a Salfeld et al., y la patente estadounidense n.º 5.436.154 concedida a Barbanti, et al.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico de barras que ilustra el efecto que diversos anticuerpos de unión anti-TNFa humanos, derivados de hibridomas tienen en la neutralización de la apoptosis celular inducida por TNFa en células WM266 humanas. El gráfico muestra la actividad caspasa como una medida de la apoptosis inducida por TNFa.

La figura 2 es un gráfico de puntos que compara la unión a antígeno limitado por anticuerpo anti-TNFa entre anticuerpos en sobrenadantes de cultivo de células B con la de un anticuerpo control (4.17 IgG2) a lo largo de un intervalo de concentración. Los triángulos representan los clones del sobrenadante del cultivo de células B, y los bloques representan anticuerpo Bar (4.17 IgG2). Los clones de sobrenadantes de cultivo de células B con puntos por encima de la curva de anticuerpos en barra se clasifican como que tienen una afinidad potencialmente
superior.

La figura 3 es un gráfico de barras representativo que compara la eficacia de diversos sobrenadantes de cultivo de células B de XENOMAX® en la inhibición de la apoptosis celular inducida por TNFa en células MCF-7 humanas.

La figura 4 es un gráfico de puntos representativo que muestra comparaciones de potencia calculadas para la neutralización de la apoptosis inducida por TNFa en células MCF-7 humanas mediante sobrenadantes de cultivo de células B de XENOMAX®. Los triángulos representan la potencia de los sobrenadantes de cultivo de células B, mientras que los cuadrados representan la potencia de un control en barra, 3.2 IgG2.

La figura 5 es un gráfico lineal de reactivos anti-TNF que se unen a TNF humano soluble expresado por E. coli mediante ELISA.

La figura 6 es un gráfico lineal de reactivos anti-TNF que se unen y que reaccionan de manera cruzada con TNF de mono macaco cynomolgus soluble expresado por E. coli mediante ELISA.

La figura 7 es un gráfico lineal representativo que muestra un ejemplo de curvas de valoración de anticuerpo anti-TNFa neutralizante usadas para generar valores de CI_{50}. Se incubaron previamente los reactivos anti-TNFa con 100 pg/ml del TNFa durante 1 hora a 37ºC. Se sometió a ensayo la neutralización usando células MCF-7 y se detectó como una razón de yoduro de propidio y tinción con Heochst 33342.

La figura 8 es un gráfico lineal representativo que muestra un ejemplo de curvas de valoración de reactivos anti-TNFa neutralizantes usadas para generar valores de CI_{50}. Se incubaron previamente los anticuerpos anti-TNFa con 100 pg/ml del TNFa durante 18 horas a 37ºC. Se sometió a ensayo la neutralización usando células MCF-7 y se detectó como una razón de yoduro de propidio y tinción con Heochst 33342.

La figura 9 es un gráfico de barras que muestra los valores de CI_{50} promedio para la neutralización de anticuerpo anti-TNFa. Se realizaron los cálculos de neutralización y de CI_{50} tal como se describió en la breve descripción de la figura 8.

La figura 10 es un gráfico de barras que muestra los valores de CI_{50} promedio para la neutralización de anticuerpo anti-TNFa. Se realizó la neutralización en células WM266 humanas y se midió la actividad caspasa como una indicación de la apoptosis inducida por TNFa. Se realizaron los cálculos de CI_{50} del anticuerpo tal como se describió en la breve descripción de la figura 7.

La figura 11 es un gráfico lineal que representa un ensayo de sangre completa para determinar la inhibición de la inducción de IL-8 por el TNF, medida mediante ELISA. Se usaron curvas de valoración para generar valores de
CI_{50}.

La figura 12 es un gráfico lineal representativo de la inhibición in vivo de la insuficiencia hepática inducida por TNFa usando reactivos anti-TNF. La lesión hepática inducida por TNFa y D-GaIN se evaluó midiendo las actividades enzimáticas en suero de alanina aminotransferasa (ALT). Se usaron curvas de valoración para generar valores de CI_{50}.

La figura 13 es un gráfico lineal representativo de la inhibición in vivo de IL-6 inducida por TNFa usando reactivos anti-TNF y medida mediante ELISA. Se usaron curvas de valoración para generar valores de CI_{50}.

Descripción detallada

Las realizaciones de la invención proporcionan anticuerpos anti-TNFa monoclonales humanos y preparaciones de anticuerpos anti-TNFa con propiedades deseables desde una perspectiva terapéutica, incluyendo una fuerte afinidad de unión por el TNFa, la capacidad de neutralizar el TNFa in vitro, la capacidad de inhibir la lesión hepática inducida por TNFa in vivo, y la capacidad de inhibir la producción de IL-6 inducida por TNFa in vivo.

Por consiguiente, las realizaciones de la invención incluyen anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de aquellos anticuerpos, que se unen al TNFa. Tal como se conoce en la técnica, los anticuerpos pueden ser de manera ventajosa anticuerpos monoclonales totalmente humanos. Las realizaciones de la invención también proporcionan células para producir estos anticuerpos.

Además, las realizaciones de la invención proporcionan el uso de estos anticuerpos para el tratamiento de una enfermedad. Por ejemplo, las realizaciones de la invención proporcionan métodos y anticuerpos para inhibir la expresión del TNFa asociado con enfermedades infecciosas, trastornos inmunitarios, patologías autoinmunitarias, enfermedad del injerto contra huésped (GVHD), caquexia asociada, septicemia por Gram negativas, choque endotóxico, enfermedad de Crohn y artritis reumatoide. Preferiblemente, los anticuerpos se usan para tratar estados inflamatorios, incluyendo, pero sin limitarse a, artritis reumatoide, glomerulonefritis, aterosclerosis, psoriasis, trasplantes de órganos, reestenosis y enfermedades autoinmunitarias. En asociación con tal tratamiento, se proporcionan artículos de fabricación que incluyen anticuerpos tal como se describe en el presente documento. Adicionalmente, se proporciona un kit de ensayo que tiene anticuerpos tal como se describen en el presente documento para detectar tumores y estados inflamatorios.

Adicionalmente, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento, y fragmentos y variantes de los mismos, pueden usarse, a modo de ejemplo no limitativo, (a) para dirigir la biosíntesis de las proteínas, polipéptidos, fragmentos y variantes codificados correspondientes como productos génicos recombinantes o heterólogos, (b) como sondas para la detección y cuantificación de los ácidos nucleicos dados a conocer en el presente documento, (c) como moldes de secuencia para preparar moléculas antisentido, y similares. Tales usos se describen más completamente en la siguiente descripción.

Además, las proteínas y los polipéptidos descritos en el presente documento, y fragmentos y variantes de los mismos, pueden usarse de maneras que incluyen (a) servir como inmunógeno para estimular la producción de un anticuerpo anti-TNFa, (b) un antígeno de captura en un ensayo inmunógeno para un anticuerpo de este tipo, (c) como diana para la selección de sustancias que se unen a un polipéptido de TNFa descrito en el presente documento, y (d) una diana para un anticuerpo específico para el TNFa tal que el tratamiento con el anticuerpo afecta a la función molecular y/o celular mediada por la diana.

Realizaciones, características, y similares adicionales referentes a los anticuerpos anti-TNFa, se proporcionan con mayor detalle a continuación.

Lista de secuencias

Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada de anticuerpos anti-TNFa humanos representativos se proporcionan en la lista de secuencias, cuyo contenido se resume a continuación en la tabla 1.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

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Definiciones

A menos que se indique lo contrario, los términos científicos y técnicos usados en el presente documento deben tener los significados que se entienden comúnmente por los expertos en la técnica. Además, a menos que se requiera lo contrario por el contexto, los términos singulares deben incluir plurales y los términos plurales deben incluir el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, y química e hibridación de proteínas y oligo o polinucleótido descritas en el presente documento son aquéllas bien conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Las técnicas convencionales se usan para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos, y transformación y cultivo tisular (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan según las especificaciones del fabricante o tal como se efectúan comúnmente en la técnica o tal como se describe en el presente documento. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan generalmente según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y tal como se describe en diversas referencias generales y más específicas que las citadas y comentadas a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos y las técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química médica y farmacéutica descritas en el presente documento son aquéllas bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Las técnicas convencionales se usan para síntesis químicas, análisis químicos, administración, formulación y preparación farmacéutica, y tratamiento de pacientes.

Tal como se utiliza según la presente descripción, debe entenderse que los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, tienen los siguientes significados:

El término "TNFa" se refiere a la citocina, factor de necrosis tumoral alfa (Pennica, D. et al., 1984, Nature 312: 724-729). El TNFa también se conoce en la técnica como caquectina.

El término "neutralizante" cuando se refiere a un anticuerpo se refiere a la capacidad un anticuerpo de eliminar o reducir significativamente una función efectora de un antígeno diana al que se une. Por consiguiente, un anticuerpo anti-TNFa "neutralizante" puede eliminar o reducir significativamente una función efectora, tal como la actividad del TNFa.

La expresión "polinucleótido aislado" tal como se usa en el presente documento debe significar un polinucleótido de origen genómico, ADNc, o sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen el "polinucleótido aislado" (1) no se asocia con todo o una parte de un polinucleótido en el que el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) esté operativamente unido a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza, o (3) no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia más grande.

La expresión "proteína aislada" a la que se hace referencia en el presente documento significa una proteína de origen de ADNc, ARN recombinante, o de origen sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen, o fuente de derivación, la "proteína aislada" (1) no se asocia con proteínas encontradas en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo libre de proteínas de murino, (3) se expresa mediante una célula de una especie diferente, o (4) no se produce en la naturaleza.

El término "polipéptido" se usa en el presente documento como un término genérico para referirse a la proteína nativa, fragmentos, o análogos de una secuencia de polipéptido. Por tanto, la proteína nativa, fragmentos, y análogos son especies del género polipeptídico. Los polipéptidos preferidos según la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada humana y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera de kappa humana, así como moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera de kappa, y viceversa, así como fragmentos y análogos de las mismas.

La expresión "que se produce de manera natural" tal como se usa en el presente documento tal como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se han modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio o que se produce de otro modo de manera natural.

La expresión "operativamente unido" tal como se usa en el presente documento se refiere a las posiciones de los componentes descritos de tal manera que están en una relación que les permite funcionar de su manera prevista. Por ejemplo, una secuencia control "operativamente unida" a una secuencia codificante se conecta de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias control.

La expresión "secuencia control" tal como se usa en el presente documento se refiere a secuencias de polinucleótido que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de las secuencias codificantes con las que se conectan. La naturaleza de tales secuencias control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, tales secuencias control generalmente incluyen promotor, sitio de unión ribosómico, y secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente, tales secuencias control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. La expresión "secuencias control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de componentes de fusión.

El término "polinucleótido" tal como se hace referencia en el presente documento significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, o bien ribonucleótidos o desoxinucleótidos o bien una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas mono y bicatenarias de ADN.

El término "oligonucleótido" al que se hace referencia en el presente documento incluye nucleótidos que se producen de manera natural, y modificados, unidos entre sí mediante enlaces de oligonucleótidos que se producen de manera natural, y que se producen de manera no natural. Los oligonucleótidos son generalmente un subconjunto de polinucleótidos que comprende una longitud de 200 bases o menos. Preferiblemente, los oligonucleótidos son de 10 a 60 bases de longitud y lo más preferiblemente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son habitualmente monocatenarios, por ejemplo para sondas; aunque los oligonucleótidos pueden ser bicatenarios, por ejemplo para su uso en la construcción de un mutante génico. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos o bien sentido o bien antisentido.

La expresión "nucleótidos que se producen de manera natural" a la que se hace referencia en el presente documento incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. La expresión "nucleótidos modificados" a la que se hace referencia en el presente documento incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y similares. La expresión "enlaces de oligonucleótidos" a la que se hace referencia en el presente documento incluye enlaces de oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, y similares. Véase por ejemplo, LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Olygonucleotides and Analogues: A Practical Approach, págs. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. patente estadounidense n.º 5.151.510; Uhlmann y Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Un oligonucleótido puede incluir una etiqueta para su detección, si se desea.

La expresión "hibridar selectivamente" a la que se hace referencia en el presente documento significa unir de manera detectable y específica. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos hibridan selectivamente con cadenas de ácido nucleico en condiciones de hibridación y lavado que minimizan cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Pueden usarse condiciones de alta rigurosidad para lograr condiciones de hibridación selectiva tal como se conoce en la técnica y como se comenta en el presente documento. Generalmente, la homología de secuencia de ácido nucleico entre los polinucleótidos, oligonucleótidos, o fragmentos de anticuerpo y una secuencia de ácido nucleico de interés será de al menos el 80%, y más normalmente con homologías preferiblemente crecientes de al menos el 85%, 90%, 95%, 99% y 100%.

Dos secuencias de aminoácidos son "homólogas" si hay una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, una homología del 85% significa que el 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para la máxima coincidencia. Se permiten espacios (en cualquiera de las dos secuencias que se están haciendo coincidir) para maximizar la coincidencia; se prefieren longitudes de espacio de 5 o menos siendo más preferido con 2 o menos. Alternativa y preferiblemente, dos secuencias de proteína (o secuencias de polipéptido derivadas de las mismas de al menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud) son homólogas, tal como se usa este término en el presente documento, si tienen una puntuación de alineamiento de más de 5 (en unidades de desviación estándar) usando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y una penalización por espacio de 6 o superior. Véase Dayhoff, M. O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, págs. 101-110 (volumen 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) y el suplemento 2 de este volumen, págs. 1-10. Las dos secuencias o partes de las mismas son más preferiblemente homólogas si sus aminoácidos son superiores a o igual al 50% idénticos cuando se alinean de manera óptima usando el programa ALIGN.

La expresión "corresponde a" se usa en el presente documento en el sentido de que una secuencia de polinucleótido es homóloga (es decir, es idéntica, no estrictamente relacionada evolutivamente) a toda o una parte de una secuencia de polinucleótido de referencia, o que una secuencia de polipéptido es idéntica a una secuencia de polipéptido de referencia.

En contraposición, la expresión "complementario a" se usa en el presente documento en el sentido de que la secuencia complementaria es homóloga a toda o una parte de una secuencia de polinucleótido de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótidos "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA".

Las siguientes expresiones se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de polinucleótido o aminoácidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia", e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como base para una comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de un ADNc de longitud completa o una secuencia génica facilitada en una lista de secuencias o puede comprender un ADNc completo o una secuencia génica. Generalmente, una secuencia de referencia es de al menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos de longitud, frecuentemente de al menos 24 nucleótidos u 8 aminoácidos de longitud, y a menudo al menos 48 nucleótidos o 16 aminoácidos de longitud. Puesto que dos secuencias de polinucleótido o aminoácidos pueden cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una parte de la secuencia completa de polinucleótido o aminoácidos) que es similar entre las dos moléculas, y (2) pueden comprender además una secuencia que es divergente entre las dos secuencias de polinucleótido o aminoácidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) moléculas se realizan normalmente comparando las secuencias de las dos moléculas a través de una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones localizadas de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", tal como se usa presente documento, se refiere a un segmento conceptual de al menos aproximadamente 18 posiciones de nucleótidos contiguas o aproximadamente 6 aminoácidos en los que la secuencia de polinucleótido o la secuencia de aminoácidos se compara con una secuencia de referencia de secuencias de al menos 18 nucleótidos contiguos o 6 aminoácidos y en la que la parte de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede incluir adiciones, deleciones, sustituciones, y similares (es decir, espacios) del 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento óptimo de las secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el método para la búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 85:2444 (1988), mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el software Wisconsin Genetics Package versión 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), paquetes de software de GENEWORKS^{TM}, o MACVECTOR®), o mediante inspección, y se selecciona el mejor alineamiento (es decir, el que da como resultado el más alto porcentaje de homología a través de la ventana de comparación) generado mediante los diversos métodos.

La expresión "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de polinucleótido o de aminoácidos son idénticas (es decir, nucleótido a nucleótido o residuo a residuo) a través de la ventana de comparación. La expresión "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias alineadas de manera óptima a través de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) o residuo de aminoácido en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana), y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia. La expresión "identidad sustancial" tal como se usa en el presente documento denota una característica de una secuencia de polinucleótido o aminoácidos, en la que el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene al menos el 85 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos del 90 al 95 por ciento de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos el 99 por ciento de identidad de secuencia, en comparación con una secuencia de referencia a través de una ventana de comparación de al menos 18 posiciones de nucleótido (6 aminoácidos), frecuentemente a través de una ventana de al menos 24-48 posiciones de nucleótido (8-16 aminoácidos), en las que el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir deleciones o adiciones que suman el 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia a través de la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande.

Tal como se usa en el presente documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology - A Synthesis (2ª edición, E. S. Golub y D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Los esteroisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos \alpha-,\alpha-disustituidos, N-alquil-aminoácidos, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, \gamma-carboxiglutamato, \varepsilon-N,N,N-trimetilisina, \varepsilon-N-acetilisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, \sigma-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en el presente documento, la dirección a la izquierda es la dirección amino-terminal y la dirección a la derecha es la dirección carboxilo-terminal, según la convención y el uso convencional.

De manera similar, a menos que se especifique lo contrario, el extremo a la izquierda de secuencias de polinucleótido monocatenarias es el extremo 5'; la dirección a la izquierda de secuencias de polinucleótido de bicatenarias se denomina la dirección 5'. La dirección de la adición de 5' a 3' de los transcritos de ARN naciente se denomina la dirección de transcripción; las regiones de secuencia en la hebra de ADN que tiene la misma secuencia que el ARN y que están en sentido de 5' hasta el extremo 5' del transcrito de ARN se denominan "secuencias en sentido 5'"; las regiones de secuencia en la hebra de ADN que tiene la misma secuencia que el ARN y que están en sentido de 3' hasta el extremo 3' del transcrito de ARN se denominan "secuencias en sentido 3'".

Tal como se aplica a los polipéptidos, la expresión "identidad sustancial" significa que dos secuencias de péptido, cuando se alinean de manera óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando pesos por defecto de espacio, comparten al menos el 80 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos el 90 por ciento de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos el 95 por ciento de identidad de secuencia, y lo más preferiblemente al menos el 99 por ciento de identidad de secuencia. Preferiblemente, las posiciones de residuos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas. Las sustituciones de aminoácidos conservativas se refieren a la capacidad de intercambio de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales hidroxi-alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Grupos de sustitución de aminoácidos conservativa preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutámico-aspártico y asparagina-glutamina.

Tal como se comenta en el presente documento, se contempla que variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina se engloban por la presente invención, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, 90%, 95%, y lo más preferiblemente el 99% de identidad de secuencia con los anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina descritos en el presente documento. En particular, se contemplan sustituciones de aminoácidos conservativas. Las sustituciones conservativas son aquéllas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que tienen cadenas laterales relacionadas. Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en familias: (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) no polares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Familias más preferidas son: serina y treonina son una familia hidroxi-alifática; asparagina y glutamina son una familia que contiene amida; alanina, valina, leucina e isoleucina son una familia alifática; y fenilalanina, triptófano y tirosina son una familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que una sustitución aislada de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina, o una sustitución similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado no tendrá un efecto importante en la función de unión o propiedades de la molécula resultante, especialmente si la sustitución no implica un aminoácido dentro de un sitio de la región de entramado. Puede determinarse fácilmente si un cambio de aminoácidos da como resultado un péptido funcional sometiendo a ensayo la actividad específica del derivado de polipéptido. En el presente documento se describen con detalle ensayos. Fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina pueden prepararse fácilmente por los expertos en la técnica. Los extremos amino y carboxilo-terminales preferidos de fragmentos o análogos aparecen cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse mediante la comparación de los datos de secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos con bases de datos de secuencias públicas o privadas. Preferiblemente, se usan métodos de comparación informatizada para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación de proteína predicha que aparecen en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Se conocen métodos para identificar secuencias de proteína que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie et al. Science 253:164 (1991). Por tanto, los ejemplos anteriores demuestran que los expertos en la técnica pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que pueden usarse para definir dominios estructurales y funcionales según los anticuerpos descritos en el presente documento.

Las sustituciones de aminoácidos preferidas son aquéllas que: (1) reducen la sensibilidad a proteólisis, (2) reducen la sensibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran las afinidades de unión, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir diversas muteínas de una secuencia que no sea la secuencia de péptido que se produce de manera natural. Por ejemplo, sustituciones de un solo aminoácido o de múltiples aminoácidos (preferiblemente sustituciones de aminoácidos conservativas) pueden llevarse a cabo en la secuencia que se produce de manera natural (preferiblemente en la parte del polipéptido fuera del/de los dominio(s) que forma(n) contactos intermoleculares. Una sustitución de aminoácidos conservativa no debe cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia original (por ejemplo, un aminoácido de sustitución no debe tender a romper una hélice que aparece en la secuencia original, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracterizan la secuencia original). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptido reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al., Nature 354:105 (1991).

La expresión "fragmento de polipéptido" tal como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxilo-terminal, pero en la que la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia que se produce de manera natural deducida, por ejemplo, a partir de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos normalmente son de al menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de longitud, preferiblemente de al menos 14 aminoácidos de longitud, más preferiblemente de al menos 20 aminoácidos de longitud, habitualmente de al menos 50 aminoácidos de longitud, e incluso más preferiblemente de al menos 70 aminoácidos de longitud. El término "análogo" tal como se usa en el presente documento se refiere a polipéptidos que están compuestos por un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene identidad sustancial con respecto a una parte de una secuencia de aminoácidos deducida y que tiene al menos una de las siguientes propiedades: (1) unión específica a un TNFa, en condiciones de unión adecuadas, (2) capacidad para bloquear la unión al TNFa adecuada, o (3) capacidad para inhibir la actividad del TNFa. Normalmente, los análogos de polipéptido comprenden una sustitución (o adición o deleción) de aminoácidos conservativa con respecto a la secuencia que se produce de manera natural. Los análogos normalmente son de al menos 20 aminoácidos de longitud, preferiblemente de al menos 50 aminoácidos de longitud o más, y a menudo pueden ser tan largos como un polipéptido que se produce de manera natural de longitud completa.

Los análogos de péptido se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido de molde. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan "miméticos de péptido" o "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS pág. 392 (1985); y Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Tales compuestos se desarrollan a menudo con la ayuda de modelización molecular informatizado. Los miméticos de péptido que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica), tal como un anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces peptídicos sustituidos opcionalmente por un enlace seleccionado del grupo que consiste en: -CH_{2}NH-, -CH_{2}S-, -CH_{2}-CH_{2}-, -CH=CH-(cis y trans), -COCH_{2}-, -CH(OH)CH_{2}-, y -CH_{2}SO-, mediante métodos bien conocidos en la técnica. Puede usarse la sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) para generar péptidos más estables. Además, pueden generarse péptidos limitados que comprenden una secuencia consenso o una variación de secuencia consenso sustancialmente idéntica mediante métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992); por ejemplo, añadiendo residuos de cisteína internos que pueden formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.

"Anticuerpo" o "péptido(s) de anticuerpo" se refieren a un anticuerpo intacto, o un fragmento de unión del mismo, que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica. Los fragmentos de unión se producen mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab', F(ab')_{2}, Fv, y anticuerpos de cadena simple. Un anticuerpo que no sea un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" se entiende que tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos. Un anticuerpo inhibe sustancialmente la adhesión de un receptor a un contrarreceptor cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de receptor unido al contrarreceptor en al menos aproximadamente el 20%, 40%, 60% u 80%, y más habitualmente más de aproximadamente el 85% (tal como se mide en un ensayo de unión competitivo in vitro).

El término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína que puede unirse de manera específica a una inmunoglobulina o receptor de célula T. Los determinantes epitópicos habitualmente consisten en agrupaciones de superficies químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Se dice que un anticuerpo se une de manera específica a un antígeno cuando la constante de disociación es \leq 1 \muM, preferiblemente \leq 100 nM y lo más preferiblemente \leq 10 nM.

El término "agente" se usa en el presente documento para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto preparado a partir de materiales biológicos.

"Activo" o "actividad" con respecto al polipéptido del TNFa se refiere a una parte de un polipéptido del TNFa que tiene una actividad biológica o inmunológica de un polipéptido del TNFa nativo. Cuando se usa "biológico" en el presente documento se refiere a una función biológica que resulta de la actividad del polipéptido del TNFa nativo. Una actividad biológica preferida del TNFa incluye, por ejemplo, apoptosis inducida por TNFa.

Cuando se usa "mamífero" en el presente documento se refiere a cualquier animal que se considera un mamífero. Preferiblemente, el mamífero es humano.

La digestión de anticuerpos con la enzima, papaína, da como resultado dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, también conocidos como fragmentos "Fab", y un fragmento "Fc", que no tiene ninguna actividad de unión a antígeno pero que tiene la capacidad de cristalizar. La digestión de anticuerpos con la enzima, pepsina, da como resultado el fragmento F(ab')_{2} en el que los dos brazos de la molécula de anticuerpo permanecen unidos y comprenden dos sitios de unión a antígeno. El fragmento F(ab')_{2} tiene la capacidad de reticular el antígeno.

Cuando se usa "Fv" en el presente documento se refiere al fragmento mínimo de un anticuerpo que conserva los sitios de tanto reconocimiento de antígeno como de unión a antígeno.

Cuando se usa "Fab" en el presente documento se refiere a un fragmento de un anticuerpo que comprende el dominio constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada.

El término "AcM" se refiere a anticuerpo monoclonal.

La descripción de las secuencias de anticuerpo de XENOMAX® se codifica tal como sigue: "AB" refiriéndose a anticuerpo, "TNFa" refiriéndose a la especificidad de unión del anticuerpo, "X" refiriéndose al derivado de XENOMOUSE®, "G1" refiriéndose al isotipo IgG1 o "G2" refiriéndose al isotipo IgG2, refiriéndose los últimos tres dígitos al número de células individuales a partir del cual se derivó el anticuerpo, por ejemplo: AB-TNFa-XG1-015.

El término "SC" se refiere a una sola célula y un anticuerpo derivado de XENOMAX® particular puede denominarse SC seguido por tres dígitos, o sólo tres dígitos, refiriéndose al número de células individuales a partir del cual se derivó el anticuerpo en este caso.

La descripción de las secuencias de anticuerpo derivado de hibridoma se codifica tal como sigue: "AB" refiriéndose a anticuerpo, "TNFa" se refiere a la especificidad de unión del anticuerpo, "X" se refiere al derivado de XENOMOUSE®, "G1" se refiere al isotipo IgG1 o "G2" refiriéndose al isotipo IgG2, "K" se refiere a kappa, "L" se refiere a lambda, refiriéndose los últimos tres dígitos al clon a partir del cual se derivó el anticuerpo, por ejemplo: AB-TNFa-XG2K-4.17.

Cuando se usa "liposoma" en el presente documento se refiere a una vesícula pequeña que puede ser útil para el suministro de fármacos que pueden incluir el polipéptido del TNFa de la invención o anticuerpos frente a un polipéptido del TNFa de este tipo para un mamífero.

"Marcador" o "marcado" tal como se usa en el presente documento se refiere a la adición de un resto detectable a un polipéptido, por ejemplo, un radiomarcador, marcador fluorescente, marcador enzimático, marcador quimioluminiscente o un grupo biotinilo. Los radioisótopos o radionúclidos pueden incluir ^{3}H, ^{14}C, ^{15}N, ^{35}S, ^{90}Y, ^{99}Tc, ^{111}In, ^{125}I, ^{131}I, los marcadores fluorescentes pueden incluir rodamina, fósforos lantánidos o FITC y los marcadores enzimáticos pueden incluir peroxidasa del rábano, \beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina.

La expresión "fármaco o agente farmacéutico" tal como se usa en el presente documento se refiere a una composición o compuesto químico que puede inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente. En el presente documento se usan otros términos químicos según el uso convencional en la técnica, tal como se muestra a modo de ejemplo en The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

Tal como se usa en el presente documento, "sustancialmente puro" significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y preferiblemente una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie objeto comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferiblemente más de aproximadamente el 85%, 90%, 95% y 99%. Lo más preferiblemente, la especie objeto se purifica hasta homogeneidad esencial (las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición mediante métodos de detección convencionales) en la que la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.

El término "paciente" incluye sujetos humanos y de veterinaria.

El término "SLAM®" se refiere al "Selected Lymphocyte Antibody Method" (método de anticuerpos a partir de linfocitos seleccionados) (Babcook et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, i93:7843-7848 (1996), y Schrader, patente estadounidense n.º 5.627.052).

El término "XENOMAX®" se refiere al uso del "Selected Lymphocyte Antibody Method" (método de anticuerpos a partir de linfocitos seleccionados) (Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, i93:7843-7848 (1996)), cuando se usa con animales de XENOMOUSE®.

Estructura de anticuerpo

Se conoce que la unidad estructural básica de anticuerpo comprende un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa). La parte amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígeno. La parte carboxilo-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variables y constantes se unen mediante una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo la cadena pesada también una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase en general, Fundamental Immunology Cap. 7 (Paul, W., ed., 2ª ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo.

Por tanto, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son iguales.

Todas las cadenas presentan la misma estructura general de regiones de entramado (FR) relativamente conservadas unidas mediante tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par se alinean mediante las regiones de entramado, lo que permite la unión a un epítopo específico. Desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal, las cadenas tanto ligera como pesada comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es según las definiciones de las secuencias de Kabat de proteínas de interés inmunológico (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989).

Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante una variedad de métodos incluyendo la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). La producción de anticuerpos biespecíficos puede ser un procedimiento intensivo relativamente laborioso en comparación con la producción de anticuerpos convencionales y los rendimientos y el grado de pureza son generalmente inferiores para anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos no existen en forma de fragmentos que tienen un único sitio de unión (por ejemplo, Fab, Fab' y Fv).

Anticuerpos humanos y humanización de anticuerpos

Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con anticuerpos que presentan regiones constantes y/o variables de ratas o murinas. La presencia de tales proteínas derivadas de ratas o murinas puede conducir al aclaramiento rápido de los anticuerpos o puede conducir a la generación de una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo por un paciente. Con el fin de evitar la utilización de anticuerpos derivados de ratas o murinos, pueden generarse anticuerpos totalmente humanos a través de la introducción de la función de anticuerpo humano en un roedor de modo que el roedor produce anticuerpos totalmente humanos.

Un método para generar anticuerpos totalmente humanos es a través del uso de cepas de XENOMOUSE® de ratones, que se han modificado mediante ingeniería para contener fragmentos de configuración de línea germinal de tamaño de 245 kb y 190 kb del locus de cadena pesada de ser humano y locus de cadena ligera kappa. Véase Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994). Las cepas de XENOMOUSE® están disponibles de Abgenix, Inc. (Fremont, CA).

La producción de XENOMOUSE® se comenta y se define adicionalmente en las solicitudes de patente estadounidense n.^{os} de serie 07/466.008, presentada el 12 de enero de 1990, 07/610.515, presentada el 8 de noviembre de 1990, 07/919.297, presentada el 24 de julio de 1992, 07/922.649, presentada el 30 de julio de 1992, 08/031.801, presentada el 15 de marzo de 1993, 08/112.848, presentada el 27 de agosto de 1993, 08/234.145, presentada el 28 de abril de 1994, 08/376.279, presentada el 20 de enero de 1995, 08/430.938, 27 de abril de 1995, 08/464.584, presentada el 5 de junio de 1995, 08/464.582, presentada el 5 de junio de 1995, 08/463.191, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462.837, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486.853, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486.857, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486.859, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462.513, presentada el 5 de junio de 1995, 08/724.752, presentada el 2 de octubre de 1996, y 08/759.620, presentada el 3 de diciembre de 1996 y las patentes estadounidenses n.^{os} 6.162.963, 6.150.584, 6.114.598, 6.075.181 y 5.939.598 y las patentes japonesas n.^{os} 3 068 180 B2, 3 068 506 B2 y 3 068 507 B2. Véase también Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) y Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998). Véase también la patente europea n.º, EP 0 463 151 B1, concesión publicada el 12 de junio de 1996, solicitud de patente internacional n.º, WO 94/02602, publicada el 3 de febrero de 1994, solicitud de patente internacional n.º, WO 96/34096, publicada el 31 de octubre de 1996, documento WO 98/24893, publicado el 11 de junio de 1998, documento WO 00/76310, publicado el 21 de diciembre de 2000. Las descripciones de cada una de las solicitudes, patentes citadas anteriormente.

En un enfoque alternativo, otros, incluyendo GenPharm International, Inc., han utilizado un enfoque "minilocus". En el enfoque minilocus, un locus de Ig exógeno se mimetiza a través de la inclusión de piezas (genes individuales) del locus de Ig. Por tanto, uno o más genes V_{H}, uno o más genes D_{H}, uno o más genes J_{H}, una región constante mu, y una segunda región constante (preferiblemente una región constante gamma) se forman en una constructo para la inserción en un animal. Este enfoque se describe en la patente estadounidense n.º 5.545.807 concedida a Surani et al. y las patentes estadounidenses n.^{os} 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.877.397, 5.874.299 y 6.255.458 cada una concedida a Lonberg y Kay, las patentes estadounidenses n.^{os} 5.591.669 y 6.023.010 concedida a Krimpenfort y Bems, las patentes estadounidenses n.^{os} 5.612.205, 5.721.367, y 5.789.215 de Berns et al., y la patente estadounidense n.º 5.643.763 de Choi y Dunn, y las solicitudes de patente estadounidense de GenPharm International n.^{os} de serie 07/574.748, presentada el 29 de agosto de 1990, 07/575.962, presentada el 31 de agosto de 1990, 07/810.279, presentada el 17 de diciembre de 1991, 07/853.408, presentada el 18 de marzo de 1992, 07/904.068, presentada el 23 de junio de 1992, 07/990.860, presentada el 16 de diciembre de 1992, 08/053.131, presentada el 26 de abril de 1993, 08/096.762, presentada el 22 de julio de 1993, 08/155.301, presentada el 18 de noviembre de 1993, 08/161.739, presentada el 3 de diciembre de 1993, 08/165.699, presentada el 10 de diciembre de 1993, 08/209.741, presentada el 9 de marzo de 1994. Véase también la patente europea n.º 0 546 073 B1, las solicitudes de patente internacional n.º WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 y WO 98/24884 y la patente estadounidense n.º 5.981.175. Véase además Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994), y Tuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996).

Kirin también ha demostrado la generación de anticuerpos humanos a partir de ratones en los que, a través de la fusión microcelular, se han introducido grandes piezas de cromosomas, o cromosomas enteros. Véanse las solicitudes de patente europea n.^{os} 773 288 y 843 961.

Las respuestas del anticuerpo humano anti-ratón (HAMA) han conducido a la industria a preparar anticuerpos quiméricos o humanizados de otro modo. Mientras que los anticuerpos quiméricos tienen una región constante de ser humano y una región variable de murino, se espera que se observen determinadas respuestas del anticuerpo humano anti-quimérico (HACA), particularmente en utilizaciones prolongadas o de múltiples dosis del anticuerpo. Por tanto, sería deseable proporcionar anticuerpos totalmente humanos contra el TNFa con el fin de menoscabar las preocupaciones y/o efectos de la respuesta de HAMA o HACA.

Agentes terapéuticos de anticuerpo

Tal como se comenta en el presente documento, la función del anticuerpo del TNFa parece importante para al menos una parte de su modo de funcionamiento. Por función, se entiende, a modo de ejemplo, la actividad del anticuerpo del TNFa en funcionamiento con el TNFa. Por consiguiente, en determinados aspectos, puede ser deseable en relación con la generación de anticuerpos como candidatos terapéuticos contra el TNFa que los anticuerpos puedan fijar el complemento y participar en la CDC. Existen varios isotipos de anticuerpos que pueden hacerlo, incluyendo, sin limitación, los siguientes: IgM de murino, IgG2a de murino, IgG2b de murino, IgG3 de murino, IgM de ser humano, IgG1 de ser humano, e IgG3 de ser humano. Se apreciará que los anticuerpos que se generan no necesitan presentar inicialmente un isotipo de este tipo sino, más bien, el anticuerpo cuando se genera puede presentar cualquier isotipo y después de eso puede cambiarse el isotipo el anticuerpo usando técnicas convencionales que se conocen bien en la técnica. Tales técnicas incluyen el uso de técnicas recombinantes directas (véase por ejemplo, la patente estadounidense n.º 4.816.397), técnicas de fusión célula a célula (véanse por ejemplo, las patentes estadounidenses n.^{os} 5.916.771 y 6.207.418), entre otras.

En la técnica de fusión célula a célula, se prepara un mieloma u otra línea celular que presenta una cadena pesada con cualquier isotipo deseado y se prepara otro mieloma u otra línea celular que presenta la cadena ligera. Tales células pueden, después de eso, fusionarse y puede aislarse una línea celular que expresa un anticuerpo intacto.

A modo de ejemplo, el anticuerpo del TNFa comentado en el presente documento es un anticuerpo IgG2 humano anti-TNFa. Si tal anticuerpo presenta la unión deseada a la molécula del TNFa, podría cambiarse el isotipo fácilmente para generar una IgM de ser humano, IgG1 de ser humano o isotipo IgG3 de ser humano, mientras que todavía presenta la misma región variable (que define la especificidad del anticuerpo y parte de su afinidad). Luego tal molécula podría fijar el complemento y participar en la CDC.

Por consiguiente, a medida que se generan los candidatos de anticuerpo que cumplen los atributos "estructurales" deseados tal como se comentó anteriormente, generalmente pueden dotarse de al menos algunos de los atributos "funcionales" deseados a través del cambio de isotipo.

Diseño y generación de otros agentes terapéuticos

Según la presente invención y basándose en la actividad de los anticuerpos que se producen y caracterizan en el presente documento con respecto al TNFa, se facilita el diseño de otras modalidades terapéuticas más allá de los restos de anticuerpo. Tales modalidades incluyen, sin limitación, agentes terapéuticos de anticuerpo avanzados, tales como anticuerpos biespecíficos, inmunotoxinas, y agentes terapéuticos radiomarcados, generación de agentes terapéuticos peptídicos, terapias génicas, particularmente intracuerpos, agentes terapéuticos antisentido, y moléculas pequeñas.

En relación con la generación de agentes terapéuticos de anticuerpo avanzados, en los que la fijación del complemento es un atributo deseable, puede ser posible esquivar la dependencia en el complemento para la destrucción celular a través del uso de por ejemplo, biespecíficos, immunotoxinas o radiomarcadores.

Por ejemplo, en relación con anticuerpos biespecíficos, pueden generarse anticuerpos biespecíficos que comprenden (i) dos anticuerpos uno con una especificidad para TNFa y otro para una segunda molécula que se conjugan entre sí, (ii) un solo anticuerpo que tiene una cadena específica para TNFa y una segunda cadena específica para una segunda molécula, o (iii) un anticuerpo de una sola cadena que tiene especificidad para TNFa y la otra molécula. Tales anticuerpos biespecíficos pueden generarse usando técnicas que se conocen bien; por ejemplo, en relación con (i) y (ii) véase por ejemplo, Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) y Wright y Harris, anteriormente, y en relación con (iii) véase por ejemplo, Traunecker et al. Int. J. Cancer (supl.) 7: 51-52 (1992). En cada caso, la segunda especificidad puede hacerse para los receptores de activación de la cadena pesada, incluyendo, sin limitación, CD16 o CD64 (véase por ejemplo, Deo et al. 18:127 (1997)) o CD89 (véase por ejemplo, Valerius et al. Blood 90:4485-4492 (1997)). Los anticuerpos biespecíficos preparados según lo anterior probablemente destruirían las células que expresan el TNFa.

En relación con immunotoxinas, pueden modificarse los anticuerpos para actuar como inmunotoxinas utilizando técnicas que se conocen bien en la técnica. Véase por ejemplo, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Véase también la patente estadounidense n.º 5.194.594. En relación con la preparación de anticuerpos radiomarcados, tales anticuerpos modificados también pueden prepararse fácilmente utilizando técnicas que se conocen bien en la técnica. Véase por ejemplo, Junghans et al., en Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2ª edición, Chafner y Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). Véanse también las patentes estadounidenses n.^{os} 4.681.581, 4.735.210, 5.101.827, 5.102.990 (RE 35.500), 5.648.471, y 5.697.902. Cada una de las inmunotoxinas y moléculas radiomarcadas probablemente destruirían las células que expresan el TNFa.

Preparación de anticuerpos

Los anticuerpos, tal como se describen en el presente documento, se prepararon a través de la utilización de la tecnología XENOMOUSE®, tal como se describe a continuación. Entonces, tales ratones, pueden producir moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos humanos y son deficientes en la producción de moléculas de inmunoglobulinas y anticuerpos de murino. Las tecnologías utilizadas para lograr esto se dan a conocer en las patentes, solicitudes y referencias dadas a conocer en la sección de antecedentes del presente documento. Sin embargo, en particular, se da a conocer una realización preferida de producción transgénica de ratones y anticuerpos a partir de los mismos en la solicitud de patente estadounidense n.º de serie 08/759.620, presentada el 3 de diciembre de 1996 y las solicitudes de patente internacional n.^{os} WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998 y WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000. Véase también Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997).

A través del uso de tal tecnología, se han producido anticuerpos monoclonales totalmente humanos frente a una variedad de antígenos. Esencialmente, se inmunizan las líneas XENOMOUSE® de ratones con un antígeno de interés (por ejemplo TNFa), se recuperan células linfáticas (tales como células B) a partir de los ratones que expresaron anticuerpos, y las líneas celulares recuperadas se fusionan con una línea celular de tipo mieloide para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales. Estas líneas celulares de hibridoma se analizan y seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que producían anticuerpos específicos frente al antígeno de interés. En el presente documento se proporcionan métodos para la producción de múltiples líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos frente al TNFa. Además, se proporciona en el presente documento la caracterización de los anticuerpos producidos por tales líneas celulares, incluyendo análisis de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de tales anticuerpos.

Alternativamente, en lugar de fusionarse a células de mieloma para generar hibridomas, se examinan adicionalmente las células recuperadas, aisladas a partir de líneas XENOMOUSE® inmunizadas de ratones, para determinar la reactividad contra el antígeno inicial, preferiblemente la proteína TNFa. Tal examen incluye ELISA con la proteína TNFa, un ensayo de competición con anticuerpos conocidos que se unen al antígeno de interés, la neutralización in vitro de la apoptosis inducida por TNFa y la unión in vitro a células CHO transfectadas de manera transitoria que expresan el TNFa de longitud completa. Las células B individuales que secretan anticuerpos de interés se aíslan entonces usando un ensayo de placa hemolítica específica para el TNFa (Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, i93:7843-7848 (1996)). Las células seleccionadas como diana para la lisis son preferiblemente glóbulos rojos de carnero (SRBC) recubiertos con el antígeno TNFa. En presencia de un cultivo de células B que secretan la inmunoglobulina y el complemento de interés, la formación de una placa indica la lisis mediada por TNFa-específica de las células diana. Puede aislarse la célula plasmática específica de antígeno individual en el centro de la placa y se aísla la información genética que codifica para la especificidad del anticuerpo a partir de la célula plasmática individual. Usando PCR de transcriptasa inversa, puede clonarse el ADN que codifica para la región variable del anticuerpo secretado. Tal ADN clonado puede insertarse entonces adicionalmente en un vector de expresión adecuado, preferiblemente un casete de vector tal como un ADNpc, más preferiblemente un vector de ADNpc de este tipo que contiene los dominios constantes de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina. Después puede transfectarse el vector generado en células huésped, preferiblemente células CHO, y cultivarse en medios de nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican para las secuencias deseadas. En el presente documento, se describe el aislamiento de múltiples células plasmáticas individuales que producen anticuerpos específicos frente al TNFa. Además, se aísla el material genético que codifica para la especificidad del anticuerpo anti-TNFa, y se introduce en un vector de expresión adecuado que entonces se transfecta en
células huésped.

En general, los anticuerpos producidos mediante las líneas celulares mencionadas anteriormente presentan cadenas pesadas de IgG1 o IgG2 totalmente humanas con cadenas ligeras kappa humanas. Los anticuerpos presentaban altas afinidades, presentando normalmente Kd de desde aproximadamente 10^{-9} hasta aproximadamente 10^{-13} M, cuando se mide mediante o bien fase sólida o bien fase de disolución.

Tal como se apreciará, los anticuerpos anti-TNFa pueden expresarse en líneas celulares que no sean líneas celulares de hibridoma. Pueden usarse secuencias que codifican para anticuerpos particulares para la transformación de una célula huésped de mamífero adecuada. La transformación puede ser mediante cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped, incluyendo, por ejemplo empaquetar el polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y transducir una célula huésped con el virus (o vector) o mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica, tal como se muestra a modo de ejemplo por las patentes estadounidenses n.^{os} 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 y 4.959.455. El procedimiento de transformación usado depende del huésped que va transformarse. Los métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamífero se conocen bien en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, encapsulación del/de los polinucleótido(s) en liposomas, y microinyección directa del ADN en los núcleos.

Las líneas celulares de mamífero disponibles como huéspedes para la expresión se conocen bien en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), incluyendo, pero sin limitarse a, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), y varias líneas celulares distintas. Las líneas celulares de preferencia particular se seleccionan a través de la determinación de qué líneas celulares tienen altos niveles de expresión y producen anticuerpos con propiedades de unión al TNFa constitutivas.

Los anticuerpos anti-TNFa son útiles en la detección del TNFa en muestras de un paciente y por consiguiente son útiles como diagnósticos para estados patológicos tal como se describe en el presente documento. Además, basándose en su capacidad para neutralizar significativamente la actividad del TNFa (tal como se demuestra en los ejemplos a continuación), los anticuerpos anti-TNFa tendrán efectos terapéuticos en el tratamiento de síntomas y estados que resultan del TNFa. En realizaciones específicas, los anticuerpos y métodos del presente documento se refieren al tratamiento de síntomas que resultan del TNFa incluyendo: fiebre, dolor muscular, letargo, dolor de cabeza, náuseas, e inflamación. Realizaciones adicionales implican el uso de los anticuerpos y métodos descritos en el presente documento para tratar: caquexia, anorexia, enfermedades reumáticas tales como artritis, enfermedades inflamatorias tales como enfermedad de Crohn, y enfermedades autoinmunitarias, tales como psoriasis, reacciones injerto-huésped y choque septicémico.

Administración terapéutica y formulaciones

Los anticuerpos anti-TNFa biológicamente activos tal como se describe en el presente documento pueden usarse en una formulación o preparación farmacéutica estéril para reducir el nivel de TNFa en suero tratando de ese modo de manera eficaz estados patológicos en los que, por ejemplo, el TNFa en suero está elevado de manera anómala. Los anticuerpos anti-TNFa presentan preferiblemente una afinidad adecuada para reprimir potencialmente el TNFa a dentro del intervalo terapéutico objetivo, y preferiblemente tienen una duración adecuada de acción para permitir una dosificación poco frecuente. Una duración prolongada de acción permitirá programas de dosificación menos frecuentes y más convenientes alternando vías parenterales tales como inyección subcutánea o intramuscular.

Cuando se usa para administración in vivo, la formulación de anticuerpo debe ser estéril. Esto se logra fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estéril, antes de o tras la liofilización y reconstitución. El anticuerpo se almacenará habitualmente en forma liofilizada o en disolución. Las composiciones de anticuerpo terapéuticas generalmente se colocan en un envase que tiene una abertura de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o vial que tiene un adaptador que permite la recuperación de la formulación, tal como un tapón que puede perforarse por una aguja de inyección hipodérmica.

La vía de administración de anticuerpo es según métodos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, intratecal, inhalación o intralesional, o mediante sistemas de liberación sostenida tal como se observa a continuación. El anticuerpo se administra preferiblemente de manera continua por infusión o por inyección en bolo.

Una cantidad eficaz de anticuerpo que va a emplearse dependerá terapéuticamente, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración, y el estado del paciente. Por consiguiente, se prefiere que el terapeuta valore la dosificación y modifique la vía de administración tal como se requiere para obtener el efecto terapéutico óptimo. Normalmente, el médico administrará anticuerpo hasta que se alcance una dosificación que logre el efecto deseado. El progreso de está terapia se monitoriza fácilmente mediante ensayos convencionales o mediante los ensayos descritos en el presente documento.

Anticuerpos, tal como se describen en el presente documento, pueden prepararse en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición terapéutica puede administrarse por vía intravenosa o a través de la nariz o el pulmón, preferiblemente como un líquido o aerosol en polvo (liofilizado). La composición también puede administrarse por vía parenteral o subcutánea según se desee. Cuando se administra de manera sistémica, la composición terapéutica debe ser estéril, libre de pirógenos y estar en una disolución parenteralmente aceptable que tiene debidamente en cuenta el pH, isotonicidad y estabilidad. Estas condiciones se conocen por los expertos en la técnica. En resumen, las formulaciones de dosificación de los compuestos descritos en el presente documento se preparan para el almacenamiento o la administración mezclando el compuesto que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables. Tales materiales no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como TRIS, HCl, fosfato, citrato, acetato y otras sales ácidas orgánicas; antioxidantes tales como ácido ascórbico; péptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente diez residuos) tales como poliarginina, proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidinona; aminoácidos tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico, o arginina; monosacáridos, disacáridos, y otros hidratos de carbono incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones tales como sodio y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN, PLURONICS o polietilenglicol.

Las composiciones estériles para inyección pueden formularse según la práctica farmacéutica convencional tal como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20ª ed., Lippincott Williams & Wilkens Publishers (2003)). Por ejemplo, puede desearse la disolución o suspensión del compuesto activo en un vehículo tal como agua o aceite vegetal que se produce de manera natural como aceite de sésamo, de cacahuate, o de semilla de algodón o un vehículo graso sintético como oleato de etilo o similares. Pueden incorporarse tampones, conservantes, antioxidantes y similares según la práctica farmacéutica aceptada.

Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) tal como se describe por Langer et al., J. Biomed Mater. Res., (1981) 15:167-277 y Langer, Chem. Tech., (1982) 12:98-105, o poli(alcohol vinílico)), poliláctidas (patente estadounidense n.º 3.773.919, documento EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, (1983) 22:547-556), etileno - acetato de vinilo no degradable (Langer et al., anteriormente), copolímeros de ácido láctico - ácido glicólico degradables tales como el LUPRON de Depot^{TM} (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico - ácido glicólico y acetato de leuprolida), y poli-(ácido D-(-)-3-hidroxibutírico) (documento EP 133.988).

Mientras que polímeros tales como etileno - acetato de vinilo y ácido láctico - ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando proteínas encapsuladas permanecen en el organismo durante mucho tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a humedad a 37ºC, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden inventarse estrategias racionales para la estabilización de proteínas dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlace S-S intermolecular a través del intercambio de disulfuro, puede lograrse la estabilización modificando residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de disoluciones ácidas, controlando el contenido en humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz de polímero específicas.

Las composiciones de liberación sostenida también incluyen preparaciones de cristales del anticuerpo suspendido en formulaciones adecuadas que pueden mantener cristales en suspensión. Estas preparaciones, cuando se inyectan por vía subcutánea o intraperitoneal pueden producir un efecto de liberación sostenida. Otras composiciones también incluyen anticuerpos atrapados en liposomas. Los liposomas que contienen tales anticuerpos se preparan mediante métodos conocidos per se: patente estadounidense n.º DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4030-4034; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; 142,641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patentes estadounidenses. n.º 4.485.045 y 4.544.545; y EP 102,324.

La dosificación de la formulación de anticuerpo para un paciente dado se determinará por el médico encargado tomando en consideración diversos factores conocidos para modificar la acción de fármacos incluyendo la gravedad y el tipo de enfermedad, peso corporal, sexo, dieta, tiempo y vía de administración, otras medicaciones y otros factores clínicos relevantes. Pueden determinarse las dosificaciones terapéuticamente eficaces mediante métodos o bien in vitro o bien in vivo.

Una cantidad eficaz de los anticuerpos, descritos en el presente documento, que van a emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración, y el estado del paciente. Por consiguiente, se prefiere que el terapeuta valore la dosificación y modifique la vía de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación diaria típica puede oscilar desde aproximadamente 0,001 mg/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Normalmente, el médico administrará el anticuerpo terapéutico hasta que se alcance una dosificación que logre el efecto deseado. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante ensayos convencionales o tal como se describe en el presente documento.

Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas según las composiciones y métodos del presente documento se administrarán con vehículos, excipientes, y otros agentes adecuados que se incorporan en formulaciones para proporcionar transferencia, suministro, tolerancia, y similares, mejorados. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípido (catiónico o aniónico) (tal como Lipofectin^{TM}), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de agua en aceite y aceite en agua, emulsiones carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos, y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias según la presente invención, siempre que el principio activo en la formulación no se inactive por la formulación y la formulación sea compatible y tolerable fisiológicamente con la vía de administración. Véase también Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance". Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals". Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts". J Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) y las citas en los mismos para información adicional relativa a formulaciones, excipientes y vehículos bien conocidos para los químicos farmacéuticos.

Se espera que los anticuerpos descritos en el presente documento tengan efecto terapéutico en el tratamiento de síntomas y estados que resultan del TNFa. En realizaciones específicas, los anticuerpos y métodos del presente documento se refieren al tratamiento de síntomas que resultan del TNFa incluyendo: fiebre, dolor muscular, letargo, dolor de cabeza, náuseas e inflamación. Realizaciones adicionales, implican el uso de los anticuerpos y métodos descritos en el presente documento para tratar: caquexia, anorexia, enfermedades reumáticas tales como artritis, enfermedades inflamatorias tales como enfermedad de Crohn, enfermedades autoinmunitarias, tales como psoriasis, reacciones injerto-huésped y choque septicémico.

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos realizados y resultados logrados se proporcionan sólo para fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitativos tras las enseñanzas del presente documento.

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Ejemplo 1 Preparación de antígeno Preparación de antígeno TNFa-KLH para la inmunización de animales XENOMOUSE®

Se obtuvo TNFa humano recombinante de R&D Systems (Mineápolis, MN n.º de cat. 210-TA/CF). Se preparó el antígeno TNFa-KLH, usado para la inmunización de animales XENOMOUSE®, tal como sigue: se mezcló TNF-\alpha humano (200 \mug) (R&D) con 50 \mug de hemocianina de lapa californiana (KLH; Pierce, Rockford, IL) para obtener un volumen final de 165 \mul usando agua destilada. Se añadieron 250 \mul de tampón de conjugación (MES 0,1 M, NaCl 0,9 M, pH 4,7) y se reticularon TNFa y KLH mediante la adición de 25 \mul de 10 mg/ml de disolución madre de clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC, Pierce, Rockford, IL). Se incubó el conjugado durante 2 horas a temperatura ambiente y se eliminó EDC sin reaccionar mediante centrifugación a través de un filtro de 1 kDa (Centrifugal filter; Millipore, Bedford, MA) usando PBS a pH 7,4.

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Preparación de antígeno TNFa-TCE para la inmunización de animales XENOMOUSE®

Se generó de manera recombinante TNFa humano como una proteína de fusión en marco con un epítopo de células T universal (TCE) (J. Immunol 1992 148(5):1499) para la inmunización de animales XENOMOUSE®.

Se clonó TNFa humano a partir de células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMC). Se aisló ARNm a partir de hPBMC purificadas y se generó ADNc mediante transcripción inversa. Se amplificó de manera específica el TNFa humano mediante PCR y se clonó en marco con un epítopo de células T universal (TCE) derivado de toxina del tétanos en el vector de expresión pGEX (Amersham Pharmacia). Se expresó la proteína de fusión en E. Coli, se purificó en perlas de glutatión Sepharose (n.º de cat. 17-0756-01, Amersham Pharmacia), se escindió con trombina (Sigma) y se eluyó tal como se describe por el fabricante (Amersham Pharmacia).

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Ejemplo 2 Generación de anticuerpos Inmunización

Se desarrollaron anticuerpos monoclonales humanos contra TNFa humano inmunizando secuencialmente ratones XENOMOUSE® (XMG2L3 o 3B-3L3 de XENOMOUSE® Abgenix, Inc. Fremont, CA).

Para generar hibridomas, se inmunizaron cohortes de ratones XMG2L3 y 3B-L3 de XENOMOUSE® con el TNFa solo o TNFa con CPG por la almohadilla de la pata. La inmunización inicial fue con 10 \mug de antígeno mezclado 1:1 v/v con TITERMAX GOLD® (Sigma, Oakville, ON) por ratón. Se realizaron cuatro inmunizaciones de refuerzo posteriores con 10 \mug de antígeno mezclado con alumbre (Sigma, Oakville, ON), adsorbido durante la noche, por ratón, seguido por una inyección con TNFa en TITERMAX GOLD®, una inyección con alumbre y entonces una inmunización de refuerzo final de 10 \mug de TNFa en PBS por ratón.

Las cohortes que recibieron TNFa con CPG se inmunizaron en primer lugar con TNFa y TITERMAX GOLD® tal como anteriormente, las seis inmunizaciones de refuerzo siguientes fueron con TNFa absorbido en alumbre tal como se indicó anteriormente junto con CPG. La inmunización de refuerzo final fue con TNFa en PBS y CPG. En particular, se inmunizaron los animales en los días 0, 3, 9, 16, 21, 25, 30 y 35. Se extrajo sangre de los animales en los días 28 y 39 para obtener sueros para la selección de la recogida tal como se describe a continuación.

Para generar AcM mediante XENOMAX®, se inmunizaron cohortes de ratones XMG2 de XENOMOUSE® con TNFa a través de la almohadilla de la pata (FP), TNFa-KLH (tal como se preparó en el ejemplo 1) a través de la base de la cola mediante inyección subcutánea e intraperitoneal (BIP), o con TNFa-TCE (tal como se preparó en el ejemplo 1) a través de la base de la cola mediante inyección subcutánea e intraperitoneal. Para las inmunizaciones por la almohadilla de la pata con TNFa, la inmunización inicial fue con 2 \mug de antígeno mezclado 1:1 v/v con TITERMAX GOLD® por ratón. Se realizaron cuatro inmunizaciones de refuerzo posteriores con 2 \mug de antígeno mezclado con alumbre (Sigma, Oakville, ON), adsorbido durante la noche, por ratón, seguido por una inyección con TNFa en TITERMAX GOLD®, una inyección con alumbre y entonces una inmunización de refuerzo final de 2 \mug de TNFa en PBS por ratón. En particular, se inmunizaron los animales en los días 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21 y 24. Se extrajo sangre de los animales en el día 19 para obtener sueros para la selección de la recogida tal como se describe a continuación.

Se mezcló la inmunización BIP inicial con 2 ó 5 \mug de TNFa-KLH o TNFa-TCE respectivamente 1:1 v/v con adyuvante completo de Freund (CFA, Sigma, Oakville, ON) por ratón. Se realizaron en primer lugar inmunizaciones de refuerzo posteriores con 2 ó 5 \mug de antígeno respectivamente, se mezclaron 1:1 v/v con adyuvante incompleto de Freund (IFA, Sigma, Oakville, ON) por ratón, seguido por una inmunización de refuerzo final en PBS por ratón. Se inmunizaron los animales en los días 0, 14, 28, 42, 56, y día 75 ó 93 (inmunización de refuerzo final). Se extrajo sangre de los animales en el día 63 para obtener sueros para la selección de la recogida tal como se describe a continuación.

Para generar anticuerpos monoclonales de conejo anti-hTNFa mediante SLAM, se inmunizó una cohorte de conejos blancos de Nueva Zelanda tal como sigue. Se administró una primera inmunización de refuerzo que consistía en 250 \mug de TNFa-TCE, emulsionado 1:1 v/v con adyuvante completo de Freund (CFA), por vía subcutánea en cuatro lugares a lo largo del cuerpo en la zona dorsal del conejo. Éstas fueron seguidas por 3 inmunizaciones con 125 \mug de TNFa-TCE emulsionado 1:1 v/v con adyuvante incompleto de Freund (IFA) por vía intramuscular por las patas traseras. Cada una de las inmunizaciones de refuerzo se separaron 21 días. Se extrajo sangre de los animales antes de la cuarta inmunización para serología, véase la tabla 9 a continuación.

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Selección de animales para la recogida

Se determinaron títulos de anticuerpo anti-hTNFa mediante ELISA. Se recubrió hTNFa sobre placas de 96 pocillos de poliestireno de unión Costar Labcoat Universal (Coming, Acton, MA) durante la noche a cuatro grados. Se eliminó la disolución que contenía TNFa no unido y se trataron las placas con luz UV (365 nm) durante 4 minutos (4000 microjulios). Se lavaron las placas cinco veces con dH_{2}O. Se valoraron sueros XENOMOUSE® de los animales inmunizados con TNFa, o animales XENOMOUSE® que no se inmunizaron en leche al 2%/PBS en diluciones 1:2 por duplicado a partir de una dilución inicial 1:100. Se dejó en blanco el último pocillo. Se lavaron las placas cinco veces con dH_{2}O. Se añadió un anticuerpo conjugado con peroxidasa del rábano específica de Fc de IgG de cabra anti-ser humano (HRP, Pierce, Rockford, IL) a una concentración final de 1 \mug/ml durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron las placas cinco veces con dH_{2}O. Se revelaron las placas con la adición de sustrato cromogénico TMB (Gaithersburg, MD) durante 30 minutos y se detuvo el ELISA mediante la adición de ácido fosfórico 1 M. Se determinó el título específico de animales XENOMOUSE® individuales a partir de la densidad óptica a 450 nm y se muestran en las tablas 2 a 8. El título representa la dilución reciproca del suero y por tanto cuanto mayor sea el número será mayor la respuesta inmunitaria humoral frente al hTNFa.

Se determinaron los títulos de anticuerpo de conejo anti-TNFa tal como anteriormente, pero para la detección del anticuerpo primario, se usó un reactivo de peroxidasa de rábano (HRP, Pierce, Rockford, IL) específico de cadena ligera y pesada de IgG de cabra anti-conejo en lugar del reactivo anti-ser humano, véase la tabla 9.

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TABLA 2

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Se seleccionaron todos los animales XENOMOUSE® en la tabla 2 para la recogida y generación de hibridomas.

TABLA 3

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Se seleccionaron todos los animales XENOMOUSE® en la tabla 3 para la recogida y generación de hibridomas.

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TABLA 4

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Se seleccionaron todos los animales XENOMOUSE® en la tabla 4 para la recogida y generación de hibridomas.

TABLA 5

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Se seleccionaron todos los animales XENOMOUSE® en la tabla 5 para la recogida y generación de hibridomas.

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TABLA 6

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Se seleccionaron los animales XENOMOUSE® (0651-2, 0651-3, 0651-5 y 0651-9) para recogidas de
XENOMAX® basadas en los datos serológicos en la tabla 6.

TABLA 7

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Se seleccionaron los animales XENOMOUSE® (O797-4, O797-6, O797-7 y O797-10) para recogidas de
XENOMAX® basadas en los datos serológicos en la tabla 7.

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TABLA 8

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Se seleccionaron los animales XENOMOUSE® (O796-2, O796-4, O796-7, O796-8 y O796-10) para recogidas de XENOMAX® basadas en los datos serológicos en la tabla 8.

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TABLA 9

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Se recogió sangre del conejo IPI-5 para generar anticuerpos monoclonales de conejo mediante SLAM.

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Ejemplo 3 Generación de anticuerpos anti-TNF\alpha humano Generación de anticuerpos anti-hTNF\alpha mediante hibridoma Recuperación de linfocitos, aislamientos de células B, fusiones y generación de hibridomas

Se sacrificaron ratones inmunizados mediante luxación cervical, y se recogieron y juntaron los ganglios linfáticos de cada cohorte. Se disociaron las células linfoides moliendo en DMEM para liberar las células de los tejidos y se suspendieron las células en DMEM. Se contaron las células, y se añadieron 0,9 ml de DMEM por 100 millones de linfocitos al sedimento celular para resuspender suave pero completamente las células. Usando 100 \mul de perlas magnéticas de CD90^{+} por 100 millones de células, se marcaron las células incubando las células con las perlas magnéticas a 4ºC durante 15 minutos. Se cargó la suspensión celular marcada magnéticamente que contenía hasta 10^{8} células positivas (o hasta 2 x 10^{9} células totales) en una columna LS^{+} y se lavó la columna con DMEM. Se recogió el efluente total así como la fracción negativa para CD90 (la mayoría de estás células son células B).

Se combinaron células de mieloma P3 y células de ganglio linfático enriquecidas con células B en una razón de 1:1 (mieloma:ganglios linfáticos) en un tubo cónico de 50 ml en DMEM. Se centrifugaron las células combinadas a 800xg (2000 rpm) durante 5-7 min., y se eliminó inmediatamente el sobrenadante del sedimento resultante. Se añadieron de dos a cuatro ml de disolución de pronasa (CalBiochem, n.º de cat. 53702; 0,5 mg/ml en PBS) a las células para resuspender suavemente el sedimento celular. Se permitió avanzar el tratamiento enzimático durante no más de dos minutos y se detuvo la reacción mediante la adición de 3-5 ml de FBS. Se añadió disolución de ECF suficiente para obtener el volumen total de 40 ml y se centrifugó la mezcla a 800xg (2000 rpm) durante 5-7 min. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento celular suavemente con un volumen pequeño de disolución de ECF, seguido por disolución de ECF suficiente para obtener un volumen total de 40 ml. Se mezclaron bien y contaron las células, entonces se centrifugaron a 800xg (2000 rpm) durante 5-7 min. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron las células en un volumen pequeño de disolución de ECF. Se añadió disolución de ECF adicional suficiente para ajustar la concentración a 2 x 10^{6} células/ml.

Entonces se colocaron las células en un generador de fusión electrocelular (ECF) (Modelo ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA) y se fusionaron según las instrucciones del fabricante. Tras la ECF, se eliminaron cuidadosamente las suspensiones celulares de la cámara de fusión en condiciones estériles y se transfirieron hacia un tubo estéril que contenía el mismo volumen del medio de hibridoma en DMEM. Se incubaron las células durante 15-30 minutos a 37ºC, entonces se centrifugaron a 400xg (1000 rpm) durante cinco minutos. Se resuspendieron suavemente las células en un volumen pequeño de medio ½ HA (1 botella de 50X de HA de Sigma, n.º de cat. A9666 y 1 litro de sobre 5 x 10^{6} células B por placa de 96 pocillos y 200 \mul por pocillo). Se mezclaron bien las células y se pipetearon en placas de 96 pocillos
y se dejaron crecer. En el día 7 ó 10, se eliminó la mitad del medio, y se realimentaron las células con medio ½ HA.

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Selección de anticuerpos candidatos mediante ELISA

Tras 14 días de cultivo, se seleccionaron sobrenadantes de hibridoma para anticuerpos monoclonales específicos para el TNFa. Se recubrieron las placas de ELISA (Fisher, n.º de cat. 12-565-136) con 50 \mul/pocillo del TNFa (2 \mug/ml) en tampón de recubrimiento (tampón carbonato 0,1 M, pH 9,6, NaHCO_{3} 8,4 g/l), entonces se incubaron a 4ºC durante la noche. Tras la incubación, se lavaron las placas con tampón de lavado (Tween 20 al 0,05% en PBS) 3 veces. Se añadieron 200 \mul/pocillo de tampón de bloqueo (BSA al 0,5%; Tween 20 al 0,1%; Thimerosal al 0,01% en 1x PBS) y se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la incubación, se lavaron las placas tres veces con tampón de lavado. Se añadieron 50 \mul/pocillo de sobrenadantes de hibridoma, y controles positivos y negativos y se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 2 horas.

Tras la incubación, se lavaron las placas tres veces con tampón de lavado. Se añadieron 100 \mul/pocillo de anticuerpo de detección de cabra anti-huIgGfc-HRP (Caltag, n.º de cat. H10507), IgG cabra anti-ser humano-HRP (Southern Biotechnology, n.º de cat. 2060-05) y IgG lambda de cabra anti-ser humano (Southern Biotechnology, n.º de cat. 2070-05) y se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la incubación, se lavaron las placas tres veces con tampón de lavado. Se añadieron 100 \mul/pocillo de TMB (BioFX Lab. n.º de cat. TMSK-0100-01) y se dejaron revelar las placas durante aproximadamente 10 minutos (hasta que los pocillos control negativos empiecen meramente a mostrar color), entonces se añadieron 50 \mul/pocillo de disolución de parada (TMB Stop Solución (BioFX Lab. n.º de cat. STPR-0100-01) y se leyeron las placas en un lector de placas de ELISA a una longitud de onda de 450 nm. Se presenta el número de pocillos positivos en la tabla 10.

TABLA 10

24

Selección secundaria para determinar el isotipo y el uso de la cadena ligera para los sobrenadantes de hibridoma anti-TNFa usando Luminex

La plataforma Luminex es una perla de fluorescencia basada en tecnología que permite ejecutar múltiples ensayos a la vez. El lector de Luminex puede determinar acontecimientos de señalización positivos en diferentes microesferas codificadas. Esto permite recubrir cada perla por separado, entonces mezclar entre sí las microesferas recubiertas de manera diferente y luego en una etapa someter a ensayo el anticuerpo que se une a cada una de las diferentes microesferas. Para clasificar por isotipo los anticuerpos, se recubrieron microesferas de tal manera que cada perla podía unirse de manera específica un isotipo de cadena pesada o cadena ligera particular. Entonces se mezclaron entre sí las microesferas y se añadió sobrenadante de hibridoma para cada anticuerpo. Tras una incubación de 20 minutos, se lavaron las microesferas, y se detectó el anticuerpo unido usando un anticuerpo secundario marcado de manera fluorescente. Entonces se leyeron las microesferas usando el lector de Luminex. La tabla 10 muestra el número de cada isotipo encontrado para los diferentes grupos de fusión.

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Neutralización de ensayos de apoptosis inducida por TNFa mediante anticuerpos anti-TNFa de hibridoma

Se evaluaron 47 anticuerpos de hibridoma anti-TNFa para determinar su capacidad de neutralizar el efecto biológico de la apoptosis inducida por TNFa en células WM 266.4 humanas. Se enriqueció IgG en primer lugar a partir de cada sobrenadante de hibridoma mediante la purificación en proteína A Swell-Gel (Pierce), y después se eluyó, neutralizó, y cuantificó. Se cultivaron en placa 20.000 células WM266.6 en placas de 96 pocillos en medios completos (RPMI1640/FBS al 10%/Gln/P/S) y se incubaron a 37ºC/CO_{2} al 10% durante la noche. Se eliminaron los medios y se añadieron 50 \mul de anticuerpos de prueba y el TNFa (preincubado durante 30' a temperatura ambiente) en medios libres de suero (RPMI1640/Gln/P/S). Se incubaron placas con 50 \mul de ciclohexamida durante la noche tal como anteriormente en las siguientes condiciones de ensayo final V=100 \mul, ciclohexamida = 6 \mug/ml, TNFa = 600 pg/ml = 11,4 pM como trímero, las concentraciones de anticuerpos de prueba varían tal como se describe. Se añadieron a cada pocillo 100 \mul de tampón caspasa y 0,3 \mul de sustrato caspasa (APO-ONE, Promega).

Se determinó la actividad caspasa en un lector de placas Victor Wallac con la longitud de onda de excitación a 485 nm y la longitud de onda de emisión a 530 nm. Un ejemplo de la neutralización de apoptosis mediante anticuerpos derivados de hibridoma se proporciona en la figura 1. La figura 1 muestra un gráfico de barras que ilustra el efecto que diversos anticuerpos frente al TNFa tenían sobre la apoptosis neutralizante en células WM 266.4 humanas. Un control (pos) muestra la inducción de apoptosis por TNFa en presencia de ciclohexamida sola. Otro control muestra la inhibición de la apoptosis por 6 nM de anticuerpo de ratón anti-hTNFa (R&D). El eje Y representa la cantidad relativa de la 3/7 actividad de caspasa como una indicación de apoptosis inducida por TNFa. Tal como ilustra la figura 1, los anticuer-
pos, incluyendo 3.2, 3.7 y 4.17 eran muy potentes en la neutralización de la apoptosis inducida por TNFa a 3 nM.

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Neutralización de apoptosis mediante el ensayo de incorporación de yoduro de propidio

Se sometieron a ensayo adicionalmente los 47 sobrenadantes de anticuerpos de hibridoma anti-hTNFa para determinar su capacidad para neutralizar el efecto biológico de la apoptosis inducida por TNFa en células MCF-7 humanas. Se sembraron placas de 96 pocillos a 5000 células/pocillo, 200 \mul/pocillo con DMEM libre de rojo de fenol + FCS al 10%. Se incubaron las células durante la noche a 37ºC + CO_{2} al 5%. Se sometió a ensayo en cada placa una valoración del anticuerpo de hibridoma (cuantificado mediante ELISA de captura, tal como se describió en el ejemplo 2, y comparado con una curva convencional de Ac control) al lado del Ac control 014 de conejo desde 10 \mug/ml hasta obtener una concentración final de 0,005 ng/ml (valoración 1:5) en medio de apoptosis (FCS al 2,5%, CHX 5 \mug/ml en DMEM libre de rojo de fenol), por triplicado, a una concentración constante de 100 pg/ml (1,9 pM como trímero) del TNFa. También se incluyeron placas de seis pocillos con TNFa solo y 6 pocillos con medio de apoptosis solo. Se preincubó el anticuerpo neutralizante anti-TNFa +/- durante 1 hora a 37ºC + CO_{2} al 5%. Entonces se transfirieron 200 \mul de anticuerpo a las células y se incubó durante la noche a 37ºC + CO_{2} al 5%.

Se tiñeron las células con PI 0,5 \mug/ml y Heochst 33342 2,5 \mug/ml durante una hora. Se determinó el porcentaje de apoptosis contando el número de células muertas (PI + ve) y dividiendo entre el número total de células (Heochst + ve). Se midió la capacidad de anticuerpos de unión anti-TNFa humanos, derivados de hibridoma para neutralizar la apoptosis inducida por TNFa de células MCF-7 mediante la captación de yoduro de propidio como una razón del número de células totales mediante la tinción con Heochst 33342. El AcM de conejo derivado de SLAM, R014, así como diversos otros AcM humanos, incluyendo 3.2, 4.17 y 3.7 eran muy potentes en la neutralización de la apoptosis inducida por TNFa de células MCF-7.

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Cambio de isotipo y expresión de hibridomas de IgG2 4.17 y 3.2

Se extrajo ARNm de hibridomas 4.17 y 3.2. Se realizó PCR de transcriptasa inversa para generar ADNc. Se amplificó de manera específica el ADNc que codificaba para las cadenas pesada y ligera variables usando PCR. Se clonó la región de cadena pesada variable en un vector de expresión de IgG1. Se generó este vector clonando el dominio constante de la IgG1 humana en el sitio de clonación múltiple del pcDNA3.1+/Hygro (Invitrogen, Burlington, ON). Se clonó la región de cadena ligera variable en un vector de expresión de IgK o Ig\lambda. Se generaron estos vectores clonando el dominio constante del sitio de clonación múltiple de la IgK o Ig\lambda humana del pcDNA3.1+/Neo (Invitrogen, Burlington, ON). Entonces se lipofectaron conjuntamente los vectores de expresión de la cadena pesada y cadena ligera en una placa de 60 mm, con células 293 de riñón embrionario humano confluentes al 70% y se dejaron secretar las células transfectadas un anticuerpo recombinante con la especificidad idéntica a la de la célula plasmática original durante 24-72 horas. Se recogió el sobrenadante (3 ml) de las células HEK 293 y se demostró la secreción de un anticuerpo intacto con un ELISA sándwich para detectar de manera específica IgG humana. Se evaluó la especificidad a través de la unión del anticuerpo recombinante al TNFa usando ELISA.

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Generación de anticuerpos anti-hTNF\alpha mediante XENOMAX® Cultivo y selección de células B

Se recogieron y cultivaron células B de los animales. Se aislaron aquellos anticuerpos específicos de TNFa de secreción tal como se describe en Babcook et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 93:7843-7848 (1996). Se usó ELISA para identificar pocillos específicos para el TNFa primario. Se cultivaron aproximadamente 18 millones de células B de animales XENOMOUSE® en 480 placas de 96 pocillos a 500 ó 150 células/pocillo, y se examinaron respecto a TNFa para identificar los pocillos específicos de antígeno. 3.825 pocillos mostraron DO significativamente por encima del fondo, una muestra representativa de los cuales se muestra en la tabla 11. También se evaluaron células B de conejo para determinar su capacidad de secretar anticuerpos anti-TNFa y se sometieron a ensayo los positivos adicionalmente tal como se describe a continuación.

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25

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Normalización de concentraciones de anticuerpo específico de antígeno

Usando un método ELISA, se normalizaron sobrenadantes para la concentración de anticuerpo específico de antígeno. Usando un anticuerpo anti-diana (TNFa) de concentración conocida valorada en paralelo, puede generarse una curva patrón y puede compararse la cantidad de anticuerpo específico de antígeno en el sobrenadante con el patrón y determinarse su concentración, véase la tabla 12 a continuación.

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TABLA 12

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Ensayo de antígeno limitado

El análisis de antígeno limitado es un método que clasifica la afinidad de los anticuerpos específicos de antígeno preparados en sobrenadantes de cultivo de células B en relación con todos los otros anticuerpos específicos de antígeno. En presencia de un recubrimiento muy bajo de antígeno, sólo los anticuerpos de más alta afinidad deben poder unirse a cualquier nivel detectable en equilibrio. (Véase, por ejemplo, la publicación PCT WO/03048730A2 titulada "IDENTIFICATION OF HIGH AFFINITY MOLECULES BY LIMITED DILUTION SCREENING" publicada el 12 de junio de 2003).

Se unió TNFa biotinilado a placas de estreptavidina en tres concentraciones; 1 ng/ml, 0,1 ng/ml y 0,01 ng/ml durante 1 hora a temperatura ambiente en placas de cultivo de 96 pocillos. Se lavó cada placa 5 veces con dH_{2}O, se añadieron a la placa antes 45 \mul de leche al 1% en PBS con azida de sodio al 0,05%, seguido por 5 \mul de sobrenadante de células B a añadido a cada pocillo. Tras 18 horas a temperatura ambiente en un agitador, de nuevo se lavaron las placas 5 veces con dH_{2}O. Se añadieron a cada pocillo 50 \mul de anticuerpo Gt anti-ser humano (Fc)-HRP a 1 \mug/ml. Tras 1 hora a temperatura ambiente, de nuevo se lavaron las placas 5 veces con dH_{2}O y se añadieron 50 \mul de sustrato TMB a cada pocillo. Se detuvo la reacción mediante la adición de 50 \mul de ácido fosfórico 1 M a cada pocillo y se leyeron las placas a una longitud de onda de 450 nm para dar los resultados mostrados en la tabla 13.

TABLA 13

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Análisis de antígeno limitado

Se prepararon sobrenadantes de cultivo de células B que tenían concentraciones de anticuerpo específico de antígeno que oscilaban desde 10 ng/ml hasta 1000 ng/ml. Se compararon los resultados generados a partir del análisis del antígeno limitado con una valoración del anticuerpo derivado de hibridoma 4.17. En este ensayo, muchos de los anticuerpos no pudieron proporcionar unión detectable, sin embargo, hubo varios pocillos incluyendo 401A7 y 433F4, que eran claramente superiores tal como se medían mediante D.O. con respecto a los otros sobrenadantes de cultivo y anticuerpos recombinantes en todas las concentraciones (tabla 13). Se analizaron adicionalmente los clones restantes combinando los datos altos de antígeno que miden la concentración de anticuerpo específico, (para más detalles véase lo anterior) y la salida de antígeno limitado. De esta manera fue posible comparar los anticuerpos en sobrenadantes de cultivo de células B con los de anticuerpo control a lo largo de un intervalo de concentración tal como se muestra en la figura 2. La figura 2 es un gráfico de puntos que compara la unión a antígeno limitado por anticuerpo anti-TNFa entre anticuerpos en sobrenadantes de cultivo de células B con la de un anticuerpo control (4.17 IgG2) a lo largo de un intervalo de concentración. Los triángulos representan los clones de sobrenadantes de cultivo de células B, y los bloques representan el anticuerpo Bar (4.17 IgG2). Los clones de sobrenadantes de cultivo de células B con puntos por encima de la curva del anticuerpo Bar se clasifican como que tienen afinidad potencialmente superior.

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Neutralización de la apoptosis mediante el ensayo de incorporación de yoduro de propidio

Se sometieron a ensayo adicionalmente los 1455 anticuerpos anti-hTNFa identificados a partir de sobrenadantes de pocillos de cultivo de células B de ratones inmunizados en la almohadilla de la pata para determinar su capacidad de neutralizar el efecto biológico de la apoptosis inducida por TNFa en células MCF-7 humanas. Además, tras el análisis de antígeno limitado de los 2.370 anticuerpo anti-hTNFa identificados a partir de animales inmunizados BIP, se analizaron adicionalmente 145 anticuerpos que tenían la categoría cinética más alta para determinar la neutralización de la actividad del TNFa. Se sembraron placas de 96 pocillos a 5000 células MCF-7/pocillo, 200 \mul/pocillo con DMEM libre de rojo de fenol + FCS al 10%. Se incubaron las placas durante la noche a 37ºC + CO_{2} al 5%. Se sometió a ensayo en cada placa el sobrenadante de anticuerpos de cultivo de células B al lado de los anticuerpos de hibridoma anti-TNFa neutralizantes más potentes, 4.17 y 3.2 y/o control 014 de conejo en medio de apoptosis (FCS al 2,5%, 5 \mug/ml de CHX DMEM libre de rojo de fenol), a una concentración constante de 100 pg/ml (1,9 pM como trímero) de TNFa. Se incluyeron pocillos por duplicado con el TNFa en medios de apoptosis y pocillos con medio de apoptosis solo como controles. Se preincubó la muestra de prueba del TNFa +/- durante 1 hora a 37ºC + CO_{2} al 5%. Se transfirieron 200 \mul del TNFa +/- a células y se incubó durante la noche a 37ºC + CO_{2} al 5%.

Se tiñeron células con PI 0,5 \mug/ml y Heochst 33342 2,5 \mug/ml durante una hora. Se determinó el porcentaje de apoptosis contando el número de células muertas (PI + ve) y dividiendo entre el número total de células (Heochst + ve). Se muestra un ejemplo en la figura 3 que muestra un gráfico de barras representativo que compara la eficacia de diversos sobrenadantes de cultivo de células B de XENOMAX® en la inhibición de la apoptosis celular inducida por TNFa en células MCF-7 humanas. Varios sobrenadantes de pocillo de cultivo de células B mostraron la capacidad de neutralizar la apoptosis inducida por TNFa. Estos sobrenadantes incluían: 164C7, 179B1, 401A7, 410B1, 439A3 y 460A12.

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Determinación de la potencia de neutralización de la apoptosis inducida por TNFa mediante anticuerpos anti-hTNFa en disoluciones policlonales

Usando las concentraciones extrapoladas de los anticuerpos específicos de antígeno en sobrenadantes de cultivo de células B policlonales, se calculó la potencia aparente de neutralización de la apoptosis inducida por TNFa en células MCF-7. Realizando el ensayo en paralelo con un reactivo anti-diana patrón, en este caso el anticuerpo derivado de hibridoma 3.2 IgG2, fue posible establecer una barra de potencia y buscar anticuerpos con potencia potencial superior que el patrón.

Se muestra un ejemplo de comparaciones de potencias calculadas para la neutralización de la apoptosis inducida por TNFa en células MCF-7 en la figura 4. La figura 4 es un gráfico de puntos representativo que muestra comparaciones de potencias calculadas para la neutralización de la apoptosis inducida por TNFa en células MCF-7 humanas mediante sobrenadantes de cultivo de células B de XENOMAX®. Los triángulos representan la potencia de los sobrenadantes de cultivo de células B, mientras que los cuadrados representan la potencia de un control en barra, 3.2 IgG2. Varios sobrenadantes de cultivo de células B mostraron mayor neutralización de la apoptosis inducida por TNFa a menores concentraciones de anticuerpo anti-TNFa que la de la curva patrón de control 3.2, indicando una mayor potencia.

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Inhibición de la unión del TNFa a p55 (receptor I del TNFa) mediante anticuerpos de conejo

Se encontraron anticuerpos neutralizantes de conejo anti-TNFa examinando si los anticuerpos de los sobrenadantes de cultivo de células B podían o no inhibir la unión del TNFa a su receptor p55. Se siguió el siguiente procedimiento. Se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos durante la noche con el TNFa. Al día siguiente, se lavaron las placas y se incubaron anticuerpos anti-TNFa +/- durante 1 hora. Después se colocó biotina-p55 en las placas durante 1 hora, se lavaron con agua y se detectó el p55 unido usando estreptavidina-HRP. Entonces se lavaron las placas y se revelaron tal como se hizo con otros ensayos ELISA descritos anteriormente. Los anticuerpos que inhibían la unión de p55 se denominaron neutralizantes, véase la tabla 14.

TABLA 14

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Ensayo de placa hemolítica específica del TNFa

Se usaron varios reactivos especializados para realizar este ensayo. Se prepararon estos reactivos tal como sigue.

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Biotinilación de glóbulos rojos de carnero (SRBC)

Se almacenaron SRBC en medios RPMI como una disolución madre al 25%. Se obtuvieron 250 \mul de sedimento celular empaquetado de SRBC llevando alícuotas de 1,0 ml de SRBC a un tubo Eppendorf nuevo. Se sedimentaron los SRBC con un centrifugado por impulsos a 8000 rpm (6800 rcf) en microfuga, se extrajo el sobrenadante, se resuspendió el sedimento en 1,0 ml de PBS a pH 8,6, y se repitió la centrifugación. Se repitió el ciclo de lavado 2 veces, entonces se transfirió el sedimento de SRBC a un tubo Falcon de 15 ml y se llegó hasta 5 ml con PBS pH 8,6. En un tubo Falcon de 50 ml separado, se añadieron 2,5 mg de sulfo-NHS biotina hasta obtener 45 ml de PBS pH 8,6. Una vez que se disolvió la biotina completamente, se añadieron los 5 ml de los SRBC y se giró el tubo a TA durante 1 hora. Se centrifugaron los SRBC a 3000 rpm durante 5 min. y se extrajo el sobrenadante. Se transfirieron los SRBC biotinilados a un tubo Eppendorf y se lavaron 3 veces tal como anteriormente pero con PBS pH 7,4 y luego hasta obtener 5 ml con medios de células inmunitarias (RPMI 1640) en un tubo Falcon de 15 ml (disolución madre de B-SRBC al 5%). Se almacenó la disolución madre a 4ºC hasta necesitarse.

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Recubrimiento con estreptavidina (SA) de B-SRBC

Se transfirió 1 ml de la disolución madre de B-SRBC al 5% a un tubo Eppendorf nuevo. Se lavaron las células B-SRBC 3 veces tal como anteriormente y se resuspendieron en 1,0 ml de PBS a pH 7,4 dando una concentración final del 5% (v/v). Se añadieron 10 \mul de una disolución madre de estreptavidina 10 mg/ml (CalBiochem, San Diego, CA) y se mezcló y giró el tubo a TA durante 20 min. Se repitieron las etapas de lavado y se resuspendieron los SA-SRBC en 1 ml de PBS a pH 7,4 (5% (v/v)).

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Recubrimiento con TNFa humano de SA-SRBC

Se recubrieron los SA-SRBC con el TNFa biotinilado a 10 \mug/ml, se mezclaron y giraron a TA durante 20 min. Se lavaron los SRBC dos veces con 1,0 ml de PBS a pH 7,4 tal como anteriormente. Se resuspendieron los SRBC recubiertos con el TNFa en RPMI (+ FCS al 10%) hasta obtener una concentración final del 5% (v/v).

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Determinación de la calidad de TNFa-SRBC mediante inmunofluorescencia (IF)

Se añadieron 10 \mul de SA-SRBC al 5% y 10 \mul de SRBC recubiertos con el TNFa al 5% cada uno en un tubo Eppendorf de 1,5 ml separado que contenía 40 \mul de PBS. Se añadió un anticuerpo anti-TNFa humano control a cada muestra de los SRBC a 45 \mug/ml. Se hicieron girar los tubos a TA durante 25 min., y entonces se lavaron las células tres veces con 100 \mul de PBS. Se resuspendieron las células en 50 \mul de PBS y se incubaron con 40 \mug/ml de anticuerpo Fc de IgG de Gt anti-ser humano conjugado con Alexa 488 (Molecular Probes, Eugene, OR). Se hicieron girar los tubos a TA durante 25 min., y entonces se lavaron con 100 \mul de PBS y se resuspendieron las células en 10 \mul de PBS. Se colocaron 10 \mul de las células teñidas sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio, cubierto con un cubreobjetos de vidrio, se observó bajo luz fluorescente, y se puntuó en una escala arbitraria de 0-4.

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Preparación de células plasmáticas

Se recogió el contenido de un pocillo de microcultivo individual que se identificó previamente mediante diversos ensayos que contenía un clon de células B que secretaban la inmunoglobulina de interés. Usando una pipeta pipetman de 100-1000 \mul, se recuperó el contenido del pocillo añadiendo RPMI (FCS al 10%) a 37ºC. Se resuspendieron las células pipeteando y luego se transfirieron a un tubo Eppendorf de 1,5 ml nuevo (volumen final de aproximadamente 500-700 \mul). Se centrifugaron las células en una microfuga a 2500 rpm (660 rcf) durante 1 minuto a temperatura ambiente, entonces se hizo girar el tubo 180 grados y se centrifugó de nuevo durante 1 minuto a 2500 rpm. Se extrajo el medio congelado y se resuspendieron las células inmunitarias en 100 \mul de RPMI (FCS al 10%), luego se centrifugaron. Se repitió este lavado con RPMI (FCS al 10%) y se resuspendieron las células en 60 \mul de RPMI (FCS al 10%) y se almacenaron en hielo hasta que estuvieron listas para usar.

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Ensayo en placa

Se prepararon portaobjetos de vidrio (2 x 3 pulgadas) por adelantado con bordes de silicona y se dejaron solidificar durante la noche a TA. Antes de usarse se trataron los portaobjetos con aproximadamente 5 \mul de SigmaCoat (Sigma, Oakville, ON) limpiados uniformemente en la superficie de vidrio, se dejaron secar y entonces se limpiaron vigorosamente. A una muestra de 60 \mul de células se le añadieron 60 \mul de cada uno de SRBC recubierto con el TNFa (disolución madre al 5% v/v), disolución madre de complemento de cobaya 4x (Sigma, Oakville, ON) preparada en RPMI (FCS al 10%), y disolución madre de sueros de potenciación 4x (1:150 en RPMI (FCS al 10%)). Se colocó la mezcla -) (10-15 \mul) sobre los portaobjetos preparado y se cubrieron las manchas con aceite de parafina no diluida. Se incubaron los portaobjetos a 37ºC durante un mínimo de 45 minutos.

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Resultados del ensayo en placa

Se usaron glóbulos rojos de carnero recubiertos con el TNFa para identificar células plasmáticas específicas de antígeno de los pocillos (véase la tabla 15).

TABLA 15

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Expresión de anticuerpos anti-TNFa recombinantes

Tras el aislamiento de las células plasmáticas individuales, se extrajo ARNm y se realizó la PCR de transcriptasa inversa para generar ADNc que codifica para las cadenas pesada y ligera variables. Se clonó la región de cadena pesada variable humana y se cambió el isotipo en un vector de expresión de IgG1. Se generó este vector clonando el dominio constante de la IgG1 humana en el sitio de clonación múltiple de pcDNA3.1+/Hygro (Invitrogen, Burlington, ON). Se clonó la región de cadena ligera variable humana en un vector de expresión IgK. Se generaron estos vectores clonando el dominio constante de la IgK humana en el sitio de clonación múltiple del pcDNA3.1+/Neo (Invitrogen, Burlington, ON). Entonces se lipofectaron conjuntamente los vectores de expresión de la cadena pesada y la cadena ligera en una placa de 60 mm de células 293 de riñón embrionario humano confluentes al 70% y se dejó que las células transfectadas secretaran un anticuerpo recombinante con la especificidad idéntica a la de la célula plasmática original durante 24-72 horas. Se recogió el sobrenadante (3 ml) de las células HEK 293 y se demostró la secreción de un anticuerpo intacto con un ELISA sándwich para detectar de manera específica IgG humana (tabla 16). Se evaluó la especificidad a través de la unión del anticuerpo recombinante al TNFa usando ELISA.

TABLA 16

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Se realizaron las pruebas de ELISA de secreción tal como sigue. Se recubrieron las placas control con 2 mg/ml de H+L de IgG de cabra anti-ser humano durante la noche tal como para las placas de unión, se recubrió hTNFa sobre placas de 96 pocillos de poliestireno de unión Costar Labcoat Universal y se mantuvieron durante la noche a 4ºC. Se lavaron las placas cinco veces con dH_{2}O. Se valoraron los anticuerpos recombinantes 1:2 para 7 pocillos a partir del sobrenadante de minilipofección no diluido. Se lavaron las placas cinco veces con dH_{2}O. Se añadió un anticuerpo específico de Fc de IgG de cabra anti-ser humano conjugado con HRP a una concentración final de 1 \mug/ml durante 1 hora a TA para la secreción y los dos ensayos de unión. Se lavaron las placas cinco veces con dH_{2}O. Se revelaron las placas con la adición de TMB durante 30 minutos y se detuvo el ELISA mediante la adición de ácido fosfórico 1 M. Se analizó cada placa de ELISA para determinar la densidad óptica de cada pocillo a 450 nm.

Se rescataron, se clonaron y se expresaron genes de anticuerpo de conejo tal como anteriormente, pero se clonaron en vectores que contenían regiones constantes kappa o constantes pesadas de IgG1 de conejo. Se aislaron, se clonaron y se expresaron las células del pocillo 7A4 (tabla 14), como un anticuerpo totalmente de conejo, R014 (AB-TNFa-R014).

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Purificación de anticuerpos anti-TNFa recombinantes

Para la producción a mayor escala, se lipofectaron vectores de expresión de cadenas pesada y ligera (2,5 \mug de cada cadena/placa) en diez placas de 100 mm que eran confluentes al 70% con células HEK 293. Se incubaron las células transfectadas a 37ºC durante 4 días, se recogió el sobrenadante (6 ml) y se sustituyó por 6 ml de medio nuevo. El día 7, se eliminó y se reunió el sobrenadante con la recogida inicial (120 ml en total de 10 placas). Se purificó cada anticuerpo a partir del sobrenadante usando una cromatografía de afinidad (1 ml) de proteína-A Sepharose (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Se eluyó el anticuerpo de la columna de proteína-A con 500 mcl de glicina 0,1 M a pH 2,5. Se dializó el eluato en PBS a pH 7,4 y se esterilizó en filtro. Se analizó el anticuerpo mediante SDS-PAGE no reductora para evaluar la pureza y el rendimiento. También se midió la concentración mediante análisis UV a DO 250.

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Ejemplo 4 Unión de anticuerpos anti-TNFa a TNFa transmembrana

Tanto el TNFa unido a la membrana como el soluble pueden interaccionar con receptores de TNFa y contribuir a efectos proinflamatorios del TNFa. Por tanto, era importante establecer si 299v2 y 263 pueden unirse de manera eficaz al TNFa unido a la membrana, además de la versión soluble de la molécula. Con este fin, se usaron células CHO transfectadas con TNFa así como células T activadas.

Se midió la unión de reactivos de anti-TNFa al TNFa mutante transmembrana expresado sobre la superficie de células CHO. De manera específica, se sometieron a ensayo anticuerpos de hibridoma de IgG2 lambda y kappa cuantificados y purificados así como anticuerpos recombinantes IgG1 derivados de XENOMAX® y de hibridoma de isotipo cambiado para determinar su capacidad de unirse al TNFa transmembrana expresado sobre la superficie de las células de ovario de hámster chino, CHO. Se mutó el ADNc del TNFa en diversas posiciones para evitar la escisión del TNFa de la superficie de células. Entonces se clonó el ADNc en un vector de expresión. Se transfectaron las células CHO y se colocaron las células de expresión estable bajo una selección de fármaco para generar una línea celular de DTNFa. Se valoraron los anticuerpos anti-TNFa, así como etanercept y se añadieron a las células DTNFa-CHO en hielo durante 1 ó 18 horas. Se lavaron las células en PBS frío y se incubó adicionalmente una IgG humana o anti-conejo biotinilada secundaria en hielo durante 10 minutos, se lavó y se añadió un anticuerpo marcado con SA-PE terciario en hielo durante 10 minutos adicionales. Se usó citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS) para determinar los perfiles de unión y tinción con anticuerpos a diversas concentraciones.

A bajas concentraciones, los anticuerpos humanos, así como infliximab quimérico y R014 de conejo, se unieron a la forma transmembrana del TNFa en células, mientras etanercept mostró claramente una señal de unión inferior. Se incubaron 299v2, 263, infliximab, adalimumab y etanercept 18 horas a 4 grados Celsius en las células DTNF-CHO a 0,1 \mug/ml. Con referencia a los anticuerpos monoclonales, aparentemente 299v2 y adalumimab se tiñeron menos que 263 e infliximab. Los datos resultantes sugieren que los efectos mediados por Fc tales como citotoxicidad dependiente de anticuerpo (CDC) y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) deben observarse en células que expresan el TNFa transmembrana. Varios de los anticuerpos generados pueden tener efectos mediados por Fc más potentes que infliximab y etanercept. Esto puede ser de beneficio particular para el tratamiento de enfermedades en las que el
TNFa de superficie celular puede desempeñar un papel fisiopatológico tal como enfermedad de Crohn o psoriasis.

Para el tratamiento de indicaciones de enfermedad en las que las formas solubles de TNFa pueden mediar la mayoría de los estados patológicos, puede ser deseable un anticuerpo con función efectora mediada por Fc baja. Esto podría lograrse expresando el anticuerpo anti-TNFa como un isotipo IgG2 o IgG4.

También se midió la unión de reactivos anti-TNFa con PBMC activadas. Se aislaron las PBMC a partir de un donante normal y se incubaron con un anticuerpo anti-CD3 para activar las células T. La activación de las células T implica la expresión de TNFa de superficie del TNFa unido a la membrana. De nuevo se evaluó la capacidad de los reactivos anti-TNFa de unirse al TNFa unido a la membrana en diversas concentraciones mediante análisis FACS, seleccionando linfocitos en el fondo de dispersión de la luz y usando un anticuerpo secundario IgG anti-ser humano conjugado con PE. Los datos de tinción resultantes indicaron que todos los anticuerpos monoclonales 299v2, 263, infliximab y adalumimab tiñeron linfocitos tras la activación de células T, mientras que etanercept no lo hizo. Ningún anticuerpo anti-TNFa teñía linfocitos si no se sometía a la activación de células T.

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Ejemplo 5 Ensayos de unión de epítopos Mapeo de epítopos de anticuerpos anti-TNFa

Lo siguiente describe el método usado para mapear epítopos de anticuerpos anti-TNFa. Se construyeron y se expresaron proteínas TNFa quiméricas, usando TNFa humano y de ratón. En la tabla 17 se proporciona un alineamiento del TNFa humano y de ratón.

TABLA 17

32

Se usaron sitios de escisión de restricción comunes en genes de TNFa-a humano y murino para la construcción de proteínas quiméricas TNFa de fusión en marco. Se prepararon siete constructos: TNFa humano, TNFa de ratón, H/M BglI, M/H BglI, H/M HincII, H/M PvuII, M/H PvuII. Se expresaron y se secretaron todas las proteínas en niveles detectables medidos mediante un ensayo ELISA usando anticuerpos policlonales contra el TNFa humano y de ratón. Proteínas TNFa quiméricas: los puntos de unión de aminoácido están en las posiciones: BglI-36/37, HincII-90/92, PvuII-124/126. La diferencia en un aminoácido en los dos últimos casos se debe a la ausencia del residuo de histidina en la posición 73 en la secuencia del TNFa de murino. Un ejemplo de anticuerpos anti-TNFa que se unen a estas proteínas mediante ELISA está en la tabla 18.

TABLA 18

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Con el fin de definir el sitio de unión para anticuerpos diferentes, se mutaron varios residuos de hTNFa usando mutagénesis dirigida al sitio. Se examinó un panel de anticuerpos para determinar la unión mediante un ensayo ELISA. Se sustituyeron los residuos humanos por los residuos de murino en las posiciones 27, 31 y 131. Se eliminó histidina en la posición 73, se ilustra un ejemplo en la tabla 19.

TABLA 19

36

Tal como se ilustra mediante la tabla 19, los sitios de unión para 014 de conejo, 4.17, SC291, SC299 y SC313 se ubican en los primeros 36 residuos de aminoácido del TNFa humano. Se ha demostrado que los aminoácidos 31-35 están implicados en el reconocimiento del receptor y desencadenamiento de la respuesta biológica (Jones, E. Y., Stuart, D. I., y Walker, NPC., (1992) en Tumor Necrosis Factors: Structure, Function and Mechanism of Action (Aggarwal, B. B., y Vilcek, J., eds) págs 93-127, Marcel Dekker, Inc., Nueva York se introdujo un cambio no conservativo de Arg31 para el mapeo de epítopos adicional. Se demostró que el cambio de aminoácido individual en la posición 31 desactivaba la unión de SC291, SC299 y SC313 completamente, mientras que el AcM 4.17 sólo perdía el 80% de su actividad de unión, se requirió un cambio adicional en la posición 27 para el bloqueo de la actividad de 4.17.

El sitio de unión del AcM 3.2 se encuentra entre los residuos 1-91. Aunque la sustitución de Gln27 y arg31 no afectó a su unión al TNFa humano, el extremo N-terminal parece ser necesario para su actividad de unión. El epítopo de AcM 3.7 se encuentra entre los residuos 36-157.

Ninguna de las quimeras pudo neutralizarse usando los anticuerpos monoclonales SC250, SC263, SC269, SC282, SC283 e infliximab. Todos estos anticuerpos son altamente específicos para el TNFa humano, y sus epítopos son una constelación de residuos ubicados en una posición diferente, no contigua del polipéptido del TNFa. Gln27, Arg31, His73 y Arg131 no están implicados en el sitio de unión neutralizante.

La tabla 20 resume los resultados del mapeo de epítopos adicional realizado en 299v2, 263, etanercept, infliximab y adalimumab. Tal como se muestra en la tabla 20, 299v2, etanercept y adalimumab se unen a las proteínas quiméricas que contienen la región del TNF humano entre aa 1 y aa 36, mientras que 263 e infliximab no se unen a ninguna de las proteínas quiméricas. Todos los anticuerpos anti-TNF se unen al TNF humano, pero ninguno al TNF de murino. Estos resultados indican que las regiones de unión de 299v2, etanercept y adalimumab están muy probablemente comprendidas dentro de los primeros 36 aa del TNF, mientras que los de 263 e infliximab se dispersan por toda la molécula completa. Todos los anticuerpos anti-TNF se unen a regiones sensibles a la desnaturalización de proteínas, indicando que sus regiones de unión son conformacionales.

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TABLA 20

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Se analizaron adicionalmente los receptores del TNFa p75-hFc y p55-hFc (número de catálogo 372-RI-050 y 372-RI/CF de R&D) para determinar la unión a proteínas TNFa tal como se muestra en la tabla 21.

TABLA 21

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Ejemplo 6 Reactividad cruzada de la unión de TNFa a anticuerpo anti-macaco Unión a TNFa recombinante soluble de ser humano y de mono

También se sometieron a prueba anticuerpos anti-TNFa para determinar su capacidad de unirse al TNFa recombinante soluble. Se expresaron el TNFa de ser humano y de mono (macaco cinomolgous) en E. coli como proteínas de fusión con GST. Se evaluó la unión mediante ELISA. Se incubaron 299v2, 263, etanercept, infliximab y adalumimab ("anticuerpos anti-TNFa") en placas de 96 pocillos recubiertas durante la noche con 0,5 \mug/ml de GST-TNFa de ser humano, 2 \mug/ml de GST-TNFa de mono, y 10 \mug/ml de GST. Se detectó el anticuerpo unido usando un anticuerpo de cabra IgG anti-ser humano conjugado con HRP. Los resultados mostraron que todos los anticuerpos anti-TNFa se unen al TNFa humano con una respuesta a la dosis similar (figura 5). Los anticuerpos anti-TNFa se unen de manera diferente al TNFa de mono. Mientras que 299v2, etanercept y Adalumimab se unen al TNFa de macaco cinomolgus de una manera similar, 263 e infliximab parecen no unirse al TNFa de macaco cinomolgous (figura 6).

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Ejemplo 7 Análisis cinético

Se evaluaron las mediciones cinéticas de los anticuerpos anti-TNFa usando tecnologías KinExA® y BIACORE®. El método KinExA® implica la determinación basada en disolución de las mediciones de afinidad formales en equilibrio. Para medir la cinética de unión de cada anticuerpo anti-TNFa humano, se realizaron dos experimentos por triplicado. En ambos experimentos se valoró una concentración conocida de antígeno y se añadió una concentración de anticuerpo diferente a cada valoración de antígeno y se dejó alcanzar el equilibrio de unión. Para determinar las mediciones de K_{d} en el TNFa humano, se calculó la K_{d} usando una concentración de sitio de unión del TNFa molar de un trímero (52,5 kDa), véase la tabla 22, o tres monómeros (17,5 kDa), véase la tabla 23. Se analizaron los resultados mediante análisis de curva doble. Las mediciones cinéticas para el anticuerpo R014 de conejo se realizaron esencialmente tal como anteriormente, sin embargo, el método de concentración de antígeno desconocido se realizó usando la concentración del anticuerpo conocido para calcular la K_{d}. Además, para negar la posibilidad de efectos de avidez, se generaron fragmentos Fab mediante la escisión con papaína y se repitió el análisis cinético (véase la tabla 24).

También se calcularon constantes cinéticas adicionales a partir de datos de BIACORE® usando los métodos descritos en su bibliografía de productos. Una constante de velocidad de asociación (k_{a}) se basa en las cinéticas de reacción antígeno-anticuerpo. Una constante de velocidad de disociación (k_{d}) es el valor que representa la fuerza (el grado) de disociación de este anticuerpo monoclonal del antígeno diana tal como se calcula basándose en la cinética de la reacción antígeno-anticuerpo. La constante de disociación (K_{d}) es el valor obtenido dividiendo el valor (k_{d}) de la constante de velocidad de disociación de la constante de velocidad de asociación (k_{a}), véase la tabla 25.

TABLA 22

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TABLA 23

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TABLA 24

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TABLA 25

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También se midió la afinidad de unión de 299v2 para el TNFa de macaco cinomolgus, puesto que se había encontrado que este anticuerpo podía unir el TNFa de mono en un ELISA. También se usó el método KinExA para medir la K_{d} que describe esta afinidad de unión. 299v2 unido al TNFa de mono con una afinidad de 626 pM, considerando el TNFa como un monómero, que es por tanto aproximadamente 200 veces inferior que la afinidad por el TNFa humano.

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Ejemplo 8 Caracterización de anticuerpos anti-HTNFa in vitro Inhibición de la apoptosis inducida por TNFa en células MCF-7 humanas

Se cultivaron en masa, se purificaron y se cuantificaron hibridomas de IgG2 kappa y lambda tal como se describió anteriormente. Se expresaron, purificaron y cuantificaron anticuerpos recombinantes IgG1 derivados de XENOMAX® y de hibridoma de isotipo cambiado, tal como se describió anteriormente. Se sometieron a ensayo adicionalmente anticuerpos para determinar su capacidad de neutralizar el efecto biológico de la apoptosis inducida por TNFa en células MCF-7 humanas. Se sembraron placas de 96 pocillos a 5000 células MCF-7/pocillo, 200 \mul/pocillo con DMEM libre de rojo de fenol + FCS al 10%. Se incubaron las placas durante la noche a 37ºC + CO_{2} al 5%. En cada placa, se sometió a ensayo una valoración de cada anticuerpo, en concentraciones finales de desde 0,005 ng/ml hasta 10 \mug/ml. Se diluyeron reactivos anti-TNF en medio de apoptosis (FCS al 2,5%, CHX 5 \mug/ml en DMEM libre de rojo de fenol), por triplicado o hasta réplicas de seis, a una concentración constante de 100 pg/ml (1,9 pM como trímero) del TNFa. También se incluyeron placas de 6 pocillos con el TNFa solo en medios de apoptosis y placas de 6 pocillos con medio de apoptosis solo. Se preincubó el anticuerpo neutralizante anti-TNFa +/- durante 1 hora o durante 18 horas a 37ºC + CO_{2} al 5%. Se transfirieron 200 \mul del anticuerpo neutralizante anti-TNFa +/- a células y se incubó durante la noche a 37ºC + CO_{2} al 5%.

Se tiñeron las células con PI 0,55 \mug/ml y Heochst 33342 2,5 \mug/ml durante una hora. Se determinó el porcentaje de apoptosis contando el número de células muertas (PI + ve) y dividiendo entre el número total de células (Heochst + ve). Se sometió a ensayo la neutralización usando células MCF-7 y se detectó como una razón de yoduro de propidio y tinción con Heochst 33342. Un ejemplo de curvas de valoración de anticuerpo neutralizante usadas para generar valores de CI_{50} mediante el ajuste de curvas de cuatro parámetros en las figuras 7 y 8, como gráficos lineales.

Los resultados mostrados en la tabla 26 son los promedios de los datos obtenidos de diferentes experimentos de inhibición in vitro de la apoptosis inducida por TNF en células MCF-7 a un punto de tiempo de preincubación de anticuerpo de 1 hora o 18 horas con el TNF. La preincubación de 18 horas más larga puede permitir observar más fácilmente las diferencias de afinidad, ya que la unión del anticuerpo-antígeno está más cerca del equilibrio. 299v2 demostró las CI_{50} más bajas de todos los AcM totalmente humanos así como infliximab. También se observa una correlación fuerte entre la afinidad y potencia de neutralización.

TABLA 26

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En la figura 9 se representa un ejemplo de los valores de CI_{50} promedio para la neutralización del anticuerpo anti-TNFa de la apoptosis, un gráfico de barras. Tal como indica la figura 9, todos los anticuerpos son neutralizadores potentes de la apoptosis inducida por TNFa. En particular, el anticuerpo 299v2 parece tener una mejor potencia promedio que infliximab, adalimumab o etanercept.

La tabla 27 muestra la inhibición de la apoptosis inducida por TNF en células MCF-7 mediante el AcM R014 de conejo tras 1 hora de preincubación con el TNF.

TABLA 27

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Inhibición de la apoptosis inducida por TNFa en células WM 266.4 humanas

Se cultivaron en masa, se purificaron y se cuantificaron hibridomas de IgG2 kappa y lambda tal como se describió anteriormente. Se expresaron, purificaron y cuantificaron anticuerpos recombinantes IgG1 derivados de XENOMAX® y de hibridomas de isotipo cambiado tal como anteriormente. Se sometieron a ensayo adicionalmente anticuerpos para determinar su capacidad de neutralizar el efecto biológico de la apoptosis inducida por TNFa en células WM 266.4 humanas. Se sembraron en placa 20.000 células WM 266.6 en placas de 96 pocillos en medios completos (RPMI 1640/FBS al 10%/Gln/P/S) y se incubaron a 37ºC/CO_{2} al 10% durante la noche. Se eliminaron los medios y se añadieron 50 \mul de anticuerpos de prueba más el TNFa (preincubado durante 30' a temperatura ambiente) en medios libres de suero (RPMI 1640/Gln/P/S). Se incubaron 50 \mul de placas de ciclohexamida durante la noche como las condiciones del ensayo final anteriores: V=100 \mul, ciclohexamida = 6 \mug/ml, TNFa = 600 pg/ml = 11,4 pM como trímero. Las concentraciones de los anticuerpos de prueba varían tal como se describe. Se añadieron 100 \mul de tampón caspasa y 0.3 \mul de sustrato de caspasa (APO-ONE, Promega) por pocillo. Se determinó la actividad caspasa en el aparato Victor Wallac; longitud de onda de excitación a 485 nm; longitud de onda de emisión a 530 nm. En la figura 10 se muestra un ejemplo de la capacidad de los anticuerpos de neutralizar la apoptosis. La figura 10 es un gráfico de barras que muestra los valores de CI_{50} promedio para la neutralización del anticuerpo anti-TNFa. Se realizó la neutralización en células WM266 humanas y se midió la actividad caspasa como una indicación de la apoptosis inducida por TNFa. Se realizaron los cálculos de CI_{50} de anticuerpo tal como se describe en la breve descripción de la figura 7.

Un control muestra inducción de la apoptosis mediante el TNFa y la ciclohexamida sola. Otros controles incluyen Ac 014 de conejo así como infliximab y p75-hFc (R&D), como un sustituto de etanercept. El gráfico muestra la actividad caspasa como una medición de la apoptosis inducida por TNFa. Tal como puede observarse en la figura 10, los anticuerpos SC299V1 y SC299V2 son similares de manera consecuente entre sí y además R014, 263 y quizá 234 son más potentes que infliximab y p75-hFc. 4.17 IgG2, SC282 y 3.2 IgG2 eran más potentes que p75-hFc. Tal como también se indica en la figura 10, todos los anticuerpos son neutralizadores potentes de la apoptosis inducida por TNFa.

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Inhibición de la producción de IL-8 inducida por TNFa en sangre completa humana

Los cultivos de sangre completa humana reproducen condiciones que se producen de manera natural de relevancia clínica que pueden no estar presentes en cultivos celulares o en animales experimentales. Se usaron cultivos de sangre completa para evaluar la eficacia de anticuerpos anti-TNFa para neutralizar la producción de IL-8 inducida por TNFa. Se obtuvo sangre completa de donantes normales mediante venopunción, se recogió en tubos con EDTA, y se sembró en placa en placas de 96 pocillos. Se diluyeron anticuerpos anti-TNFa en medio RPMI y se mezclaron con la sangre completa. Se usó un anticuerpo IgG1 humano irrelevante como control. Esto se siguió mediante la adición del TNFa (concentración final 100 pg/ml, que corresponde a 1,9 pM considerando el TNFa como trímero). Entonces se incubaron las placas durante 6 horas a 37ºC. Tras la incubación, se añadió Triton X-100 a los cultivos a una concentración final del 0,5% v/v para provocar lisis celular. Se midió la producción de IL-8 mediante ELISA. Para expresar los resultados, se estableció la IL-8 inducida por el TNFa en presencia del control IgG1 como el 100%. La tabla 28 notifica las CI_{50} para los anticuerpos anti-TNFa calculadas usando curvas de inhibición (figura 11). 299v2 y el sustituto de etanercept mostraron las CI_{50} más bajas y las potencias más altas.

TABLA 28

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Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo

Se sometieron a ensayo anticuerpos anti-TNFa para determinar su capacidad de soportar la destrucción de células CHO transfectadas con TNFa mediada por PBMC, principalmente células NK. En resumen, se obtuvieron PBMC humanas de un donante normal y se resuspendieron a una concentración calibrada de modo que, añadidas a las células efectoras, proporcionarían razones 1:100 de células efectoras/diana. Al mismo tiempo, las células CHO transfectadas con TNFa, que expresan de manera estable TNFa unido a la membrana, se marcaron con el colorante de membrana PKH-26. Entonces se sembraron células CHO en placas de 96 pocillos por triplicado con o sin anticuerpo 5 \mug/ml. Tras una incubación de 30 min., se añadieron células efectoras, y se dejó producir la reacción de ADCC durante la noche a 37ºC. En este punto, se reunieron las muestras por triplicado, se tiñeron con el colorante TOPO-3 por instrucción del fabricante y se analizaron mediante FACS. Se calcularon las razones del número de células positivas dobles PKH-26 y TOPO-3 (células diana muertas) frente a células PKH-26 positivas simples (células diana vivas) y se usaron para expresar los resultados como porcentajes. Los resultados indican que los anticuerpos monoclonales tienen la capacidad de soportar ADCC en desacuerdo notable con p75-hFc, que se usó como sustituto de etanercept (tabla 29).

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Citotoxicidad dependiente del complemento

También se sometieron a ensayo anticuerpos anti-TNFa para determinar la capacidad de fijar el complemento y por tanto mediar la destrucción de células CHO transfectadas con TNFa. En resumen, se sembraron células CHO a 125000/pocillo en placas de 96 pocillos y se les añadió anticuerpo 5 \mug/ml por duplicado. Tras 3 horas de incubación en hielo, se añadió complemento de conejo hasta una concentración final del 10%, y se dejó producir la reacción de CDC durante 30 min., a temperatura ambiente. En este punto, se tiñeron las células con 0,5 \mug/ml de PI y 2,5 \mug/ml de Heochst 33342 durante 1 hora y se contaron usando Autoscope. Los experimentos se realizaron por triplicado. Se calcularon los resultados y se expresaron tal como se describió anteriormente para el ensayo de apoptosis inducida por TNFa. Como en el caso de ADCC, los resultados indican que los anticuerpos monoclonales tienen la capacidad de incitar CDC en desacuerdo con p75-hFc, que se usó como sustituto de etanercept (tabla 29).

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TABLA 29

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Ejemplo 9 Caracterización de anticuerpos anti-HTNFa in vivo Inhibición de la lesión hepática inducida por TNFa en ratones

Para someter a prueba si anticuerpos anti-TNFa humano neutralizan el TNFa humano in vivo, se estudió la capacidad de anticuerpos anti-TNFa humano para proteger contra la lesión hepática inducida por la administración de TNFa humano y D-galactosamina (D-GalN) en ratones (Lehmann V et al., J. Exp. Med., 1987 165(3): 657-63). La administración de TNFa con D-GalN induce lesión hepática fulminante que se parece a la lesión hepática inducida por LPS y D-GalN, caracterizada por muerte apoptótica generalizada de hepatocitos, finalmente dando como resultado choque y letalidad. El tratamiento con D-GalN convierte a ratones 100-1000 más sensibles a los efectos letales de lipopolisacáridos (LPS) así como al TNFa de murino (Lehmann V, et al., J. Exp. Med., 1987 165(3): 657-63). Se ha demostrado que la lesión hepática apoptótica inducida por LPS y D-GalN es dependiente del TNFa producido de manera endógena (Leist M, et al., Am. J Pathol., 1995, 146(5): 1220-34.). También se ha demostrado que esta lesión hepática es exclusivamente dependiente de la señalización del TNFa secretado a través del receptor p55 (Nowak M, et al., Am. J. Physiol. 2000, 278(5): R1202-9), sugiriendo que D-GalN también sensibiliza frente a los efectos letales del TNFa humano, que en ratones se une sólo al receptor p55 del TNFa. Se evaluó la lesión hepática inducida por el hTNFa y D-GalN midiendo la actividad de la enzima sérica alanina aminotransferasa (ALT).

Se realizaron los experimentos tal como se describe. Se obtuvieron ratones hembras Balb/c de 8 a 10 semanas de edad, que pesaban aproximadamente 20 g, de Charles River Laboratories. Se usaron 8-10 ratones por grupo. Se definieron la dosis y vía de administración así como el tiempo para la medición de los niveles de ALT en el suero en experimentos preliminares. Los ratones se inyectaron con D-GalN (Sigma) (900 mg/kg, ip) 90 min., antes del TNF humano (R&D System) (1 mg/ratón, iv). La administración intravenosa de 1 \mug/ratón del TNF dio como resultado niveles circulantes del TNF de 19 nM (considerando TNF como trímero). Se evaluó el daño de hepatocitos 6 horas tras la administración del TNF/ GalN midiendo ALT usando un kit de diagnóstico comercial (Sigma). Para comparar la capacidad de 299v2, 263, etanercept, adalimumab e infliximab para inhibir in vivo el TNFa, se realizaron experimentos de respuesta a la dosis inyectando reactivos anti-TNF (1-10 i.v. \mug/ratón) 90 min. antes del TNF (1 \mug/ratón, iv). Los ratones control recibieron solución salina antes del TNF. Se expresaron los datos como % de control y se generaron curvas de neutralización (figura 12). Se calcularon las CI_{50} usando una curva de ajuste de cuatro parámetros. La tabla 30 muestra las CI_{50} para los diferentes reactivos anti-TNF promediados de diferentes experimentos.

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Inhibición de la producción de IL-6 inducida por TNFa en ratones

Como otro enfoque para someter a prueba la capacidad de anticuerpos anti-TNFa para inhibir in vivo el TNFa, se usaron anticuerpos anti-TNFa para bloquear la producción de IL-6 inducida en ratones por ser humano. El TNFa engendra muchas acciones biológicas agudas, incluyendo la inducción de IL-6 (Benigni et al., J. Immunol. 157:5563, 1996). Se usaron 8-10 ratones por grupo. Tal como se estableció inicialmente en experimentos en el transcurso del tiempo, la inyección del TNFa humano en ratones provoca un aumento rápido de los niveles de IL-6 en suero que llegan al máximo en 2 horas tras la inyección. Basándose en los resultados de otros experimentos preliminares encaminados para definir la dosis y la vía de administración del TNFa, se inyectaron por vía intravenosa a ratones con 1 \mug/ratón del TNFa humano. Se midieron los niveles de IL-6 tras 2 horas de la administración del TNFa usando un kit de ELISA comercial (R&D System). Se realizaron experimentos de respuesta a la dosis inyectando anticuerpos anti-TNFa (1-10 i.v. \mug/ratón) 90 min. antes del TNFa (1 \mug/ratón, iv). Los ratones control recibieron solución salina antes del TNFa. Se expresaron los datos como porcentaje de control y se generaron curvas de neutralización (figura 13). Se calcularon las CI_{50} usando una curva de ajuste de cuatro parámetros. La tabla 30 muestra las CI_{50} para los diferentes anticuerpos anti-TNF promediados de diferentes experimentos.

TABLA 30

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Ejemplo 10 Análisis estructural de anticuerpos anti-TNFa

Se secuenciaron las cadenas pesadas variables y las cadenas ligeras variables de los anticuerpos mostrados en la tabla 1 anterior para determinar sus secuencias de ADN. La información de secuencia completa para todos los anticuerpos anti-TNFa se muestra en la lista de secuencias presentada junto con el presente documento, incluyendo secuencias de nucleótidos y aminoácidos.

La tabla 31 es una tabla que compara diversas regiones de cadena pesada de anticuerpo derivado de XENOMAX® con una región de cadena pesada de línea germinal particular. La tabla 32 es una tabla que compara diversas regiones de cadena ligera de anticuerpo derivado de XENOMAX® con una región de cadena ligera de línea germinal particular. La tabla 33 es una tabla que compara diversas regiones de cadena pesada de anticuerpo derivado de hibridoma con una región de cadena pesada de línea germinal particular. La tabla 34 es una tabla que compara diversas regiones de cadena ligera de anticuerpo derivado de hibridoma con una región de cadena ligera de línea germinal particular.

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Ejemplo 11 Determinación de clases canónicas de anticuerpos

Chothia, et al han descrito la estructura de anticuerpos en términos de "clases canónicas" para las regiones hipervariables de cada cadena de inmunoglobulina (J Mol Biol. 20 de agosto de 1987; 196(4):901-17). Se analizaron las estructuras atómicas de los fragmentos Fab y VL de una variedad de inmunoglobulinas para determinar la relación entre sus secuencias de aminoácidos y las estructuras tridimensionales de sus sitios de unión a antígeno. Chothia, et al., encontraron que había relativamente pocos residuos que, a través de su empaquetamiento, enlaces de hidrógeno o la capacidad de asumir conformaciones inusuales phi, psi u omega, eran responsables principalmente de las conformaciones de la cadena principal de las regiones hipervariables. Se encontró que estos residuos aparecían en sitios dentro de las regiones hipervariables y en la estructura principal de lámina beta conservada. Examinando las secuencias de inmunoglobulinas que tienen estructura desconocida, Chothia, et al., muestran que muchas inmunoglobulinas tienen regiones hipevariables que son similares en tamaño a una de las estructuras conocidas y adicionalmente contenían residuos idénticos en los sitios responsables de la conformación observada.

Su descubrimiento implica que esas regiones hipervariables tienen conformaciones próximas de aquellas en las estructuras conocidas. Para cinco de las regiones hipervariables, el repertorio de conformaciones parecía limitarse a un número relativamente pequeño de clases estructurales diferenciadas. Estas conformaciones de cadena principal que se producen comúnmente de las regiones hipervariables se denominaron "estructuras canónicas". Trabajo adicional de Chothia, et al. (Nature. 21-28 de diciembre de 1989;342(6252):877-83) y otros (Martin, et al. J Mol Biol. 15 de noviembre de 1996; 263(5):800-15) confirmaron que hay un repertorio pequeño de conformaciones de la cadena principal para al menos cinco de las seis regiones hipervariables de anticuerpos.

Se analizó cada uno de los anticuerpos descritos anteriormente para determinar la clase canónica para cada una de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo. Tal como se sabe, las clases canónicas sólo se han asignado para CDR1 y CDR2 de la cadena pesada de anticuerpo, junto con CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de anticuerpo. A continuación, las tablas (35 y 36) resumen los resultados del análisis. Los datos de clase canónica están en forma de *HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR3, en la que "HCDR" se refiere a la CDR de cadena pesada y "LCDR" se refiere a la CDR de cadena ligera. Por tanto, por ejemplo, una clase canónica de 1-3-2-1-5 se refiere a un anticuerpo que tiene una HCDR1 que se encuentra dentro de la clase canónica 1, una HCDR2 que se encuentra dentro de la clase canónica 3, una LCDR1 que se encuentra dentro de la clase canónica 2, una LCDR2 que se encuentra dentro de la clase canónica 1 y una LCDR3 que se encuentra dentro de la clase canónica 5.

Se hicieron las asignaciones a una clase canónica particular cuando había una identidad del 70% o mayor de los aminoácidos en el anticuerpo con los aminoácidos definidos para cada clase canónica. Cuando había una identidad inferior al 70%, se marca la asignación de la clase canónica con un asterisco ("*") para indicar que se hizo la mejor estimación de la clase canónica apropiada, basándose en la longitud de cada CDR y la totalidad de los datos. Los aminoácidos definidos para cada anticuerpo pueden encontrarse, por ejemplo, en los artículos de Chothia, et al., a los que se hizo referencia anteriormente.

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TABLA 35

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Ejemplo 12 Análisis de dominio de anticuerpos anti-TNF-\alpha A través de la expresión y ensayos de unión de epítopos del TNF-\alpha Resultados de secuenciación/unión

Las regiones variables (V) de las cadenas de inmunoglobulina se codifican mediante múltiples segmentos de ADN de línea germinal, que se unen en regiones variables funcionales (V_{H}DJ_{H} o V_{K}J_{K}) durante la ontogenia de células B. Se estudió en detalle la diversidad molecular y genética de la respuesta de anticuerpo frente al TNF-\alpha. Estos ensayos revelaron varios puntos específicos para el anticuerpo anti-TNF-\alpha. El análisis de 65 anticuerpos individuales específicos para el TNF-\alpha proporcionó 13 genes de VH de línea germinal, 54 de ellos de la familia VH3, usando 34 de ellos el segmento génico VH3-33. El gen más frecuente, el gen de línea germinal VH3-33 se expresó en 34 de los 65 anticuerpos analizados, y se limitó a 2 celdas diferentes con enlace claro al tipo de la cadena ligera implicada en la unión (kappa A30 frente a L2 o lambda). La selección de anticuerpos funcionales y la separación en celdas mostró que los anticuerpos en depósito específico expresaban el mismo la misma Ig V_{H} y en algunos casos las mismas redisposiciones V_{H}DJ_{H}. Además, también se descubrió que los pares de cadenas H y L se conservaron dentro de la celda. Estos hallazgos sugieren que, para cualquier epítopo dado, sólo unos pocos miembros del repertorio de línea germinal se usaron para formar el parátopo correspondiente, y para cada epítopo antigénico un número limitado de genes de cadena L y H puede emparejarse para formar un parátopo específico.

Se evaluó la ubicación de epítopos biológicamente relevantes en el TNF-\alpha humano mediante el ensayo de expresión y unión de los AcM específicos para el TNF-\alpha humano a un conjunto de moléculas de TNF-\alpha humano/de ratón quiméricas. Los anticuerpos descritos anteriormente se encuentran dentro de 4 grupos principales de separación en celdas, todos para varios sitios cruciales para la actividad biológica del hTNF-\alpha. Se encontró que el dominio N-terminal del TNF-\alpha estaba implicado en la unión del receptor.

En los anticuerpos del primer grupo, que neutralizan la actividad del TNF-\alpha a través de la unión directa al dominio de unión del receptor del TNF-\alpha, todas las secuencias reconocidas en los primeros 36 residuos de la molécula del TNF-\alpha secretada. Los resultados mostraron que ambos receptores se unen a la misma región N-terminal. Van Ostade et al., ((1993) Nature, 361:266-269) notificaron que el dominio de unión del receptor P75 se ubicaba en bucles en la base de la molécula, y que las sustituciones de amino individuales en la posición 29 y 32 redujeron las actividades de unión con el receptor p75. Todos los anticuerpos en el grupo I (VH3-33/JH6b acoplados con cadena kappa A30/JK4) tienen la clase canónica 1-3-2-1-1. Todos los anticuerpos sometidos a prueba presentan unión a los primeros 36 residuos, con Lys11 y Arg31 presentes. Los anticuerpos que expresaban VH3-33/Jh6b acoplados con lambda como cadena ligera mostraron especificidad diferente.

Van Ostade et al., ((1991) EMBO 10:827-836) demostraron que por medio de mutagénesis dirigida al sitio y aleatoria, la integridad de cuatro regiones de aminoácidos 32-34, 84-91, 117-119 y 143-148 es importante para mantener la actividad biológica. Se demostró que anticuerpos usando el VH3-33/JH4b acoplado con la cadena L2 kappa reconocían diferentes dominios discontinuos de la molécula del TNF-\alpha. Estos anticuerpos eran altamente específicos para el TNF-\alpha humano, y su epítopo es una constelación de residuos ubicados en posiciones diferentes, no contiguas del polipéptido del TNF.

El tercer grupo de anticuerpos incluye anticuerpos que utilizan VH3-33 acoplado a la cadena ligera lambda como AcM 3.2. El sitio de unión de este grupo se encuentra entre los residuos 1-91. Aunque la sustitución de Gln27 y arg31 no afectó a la unión al TNF-\alpha humano, el extremo N-terminal parecía importante para su actividad de unión. Los resultados se proporcionan a continuación en la tabla 36.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 36

66

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Ejemplo 13 Usos de anticuerpos anti-TNFa y conjugados del anticuerpo para el tratamiento de artritis

Para determinar los efectos in vivo del tratamiento con anticuerpo anti-TNFa en pacientes humanos con artritis, se inyecta a tales pacientes humanos a lo largo de una determinada cantidad de tiempo una cantidad eficaz de anticuerpo anti-TNFa. En momentos periódicos durante el tratamiento, se monitorizan los pacientes humanos para determinar si está tratándose su artritis.

Un paciente artrítico tratado con anticuerpos anti-TNFa tiene un nivel inferior de síntomas artríticos, incluyendo inflamación, en comparación con pacientes artríticos tratados con anticuerpos control. Los anticuerpos control que pueden usarse incluyen anticuerpos del mismo isotipo que los anticuerpos anti-TNFa sometidos a prueba y además, pueden no tener la capacidad de unirse al antígeno TNFa.

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Ejemplo 14 Uso de anticuerpos anti-TNFa como agente de diagnóstico Detección del antígeno TNFa en una muestra

Puede desarrollarse un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para la detección del antígeno TNFa en una muestra. En el ensayo, los pocillos de una placa de microtitulación, tal como una placa de microtitulación de 96 pocillos o una placa de microtitulación de 384 pocillos, se adsorben durante varias horas con un primer anticuerpo monoclonal totalmente humano dirigido contra el antígeno. El anticuerpo inmovilizado sirve como anticuerpo de captura para cualquiera de los antígenos que pueden estar presentes en una muestra de prueba. Se enjuagan y se tratan los pocillos con un agente de bloqueo tal como proteína de la leche o albúmina para evitar la adsorción no específica del analito.

Posteriormente se tratan los pocillos con una muestra de prueba que se sospecha que contiene el antígeno, o con una disolución que contiene una cantidad patrón del antígeno. Una muestra de este tipo puede ser, por ejemplo, una muestra de suero de un sujeto que se sospecha que tiene niveles de antígeno circulante considerado como diagnóstico de una patología.

Tras enjuagar la muestra de prueba o el patrón, se tratan los pocillos con un segundo anticuerpo anti-TNFa monoclonal totalmente humano que se marca mediante conjugación con biotina. El anticuerpo anti-TNFa marcado sirve como anticuerpo de detección. Tras enjuagar el exceso del segundo anticuerpo, se tratan los pocillos con peroxidasa del rábano (HRP) conjugada con avidina y un sustrato cromogénico adecuado. La concentración del antígeno en las muestras de prueba se determina por comparación con una curva patrón desarrollada a partir de las muestras patrón.

Este ensayo ELISA proporciona un ensayo altamente específico y muy sensible para la detección del antígeno TNFa en una muestra de prueba.

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Determinación de la concentración del antígeno TNFa en pacientes

Se desarrolla un ELISA sándwich para cuantificar los niveles de TNFa en suero humano. Los 2 anticuerpos anti-TNFa monoclonales totalmente humanos del ELISA sándwich, reconocen diferentes epítopos en la molécula del TNFa. Se realiza el ELISA tal como sigue: se aplican 50 \mul de anticuerpo anti-TNFa de captura en tampón de recubrimiento (NaHCO_{3} 0,1 M, pH 9,6) a una concentración de 2 \mug/ml sobre placas de ELISA (Fisher). Tras la incubación a 4ºC durante la noche, se tratan las placas con 200 \mul de tampón de bloqueo (BSA al 0,5%, Tween 20 al 0,1%, Timerosal al 0,01% en PBS) durante 1 hora a 25ºC. Se lavan las placas (3x) usando Tween 20 al 0,05% en PBS (tampón de lavado, TL). Se diluyen sueros normales o de pacientes (Clinomics, Bioreclaimation) en tampón de bloqueo que contiene suero humano al 50%. Se incuban las placas con muestras de suero durante la noche a 4ºC, se lavan con TL, y entonces se incuban con 100 \mul/pocillo de anticuerpo anti-TNFa de detección biotinilado durante 1 hora a 25ºC. Tras el lavado, se incuban las placas con HRP-estreptavidina durante 15 min., se lavan como antes, y entonces se tratan con 100 \mul/pocillo de o-fenilendiamina en H_{2}O_{2} (disolución reveladora de Sigma) para la generación de color. Se detiene la reacción con 50 \mul/pocillo de H_{2}SO_{4} (2 M) y se analiza usando un lector de placas de ELISA a 492 nm. Se calcula la concentración del antígeno TNFa en muestras de suero por comparación con diluciones del antígeno TNFa purificado usando un programa de ajuste de curvas de cuatro parámetros.

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Equivalentes

La memoria descriptiva escrita anterior se considera suficiente para permitir a un experto en la técnica poner en práctica la invención. La descripción y los ejemplos anteriores detallan determinadas realizaciones preferidas de la invención y describen el mejor modo contemplado por los inventores. Sin embargo, se apreciará que sin importar cuán detallado puede aparecer lo anterior en el texto, la invención puede ponerse en práctica de muchas maneras y la invención debe interpretarse según las reivindicaciones adjuntas.

<110> Abgenix, Inc.

\hskip1cm

John S. Babcook

\hskip1cm

Jaspal S. Kang

\hskip1cm

Orit Foord

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Larry Green

\hskip1cm

Xiao Feng

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Scott Klakamp

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Mary Haak-Frendscho

\hskip1cm

Palaniswami Rathanaswami

\hskip1cm

Craig Pigott

\hskip1cm

Meina Liang

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Rozanne Lee

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Kathy Manchulencho

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Raffaella Faggioni

\hskip1cm

Giorgio Senaldi

\hskip1cm

Qiaojuan Jane Su

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<120> ANTICUERPOS DIRIGIDOS AL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL Y USOS DE LOS MISMOS

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<130> ABGENIX.073VPC

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<140> Desconocido

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<141> 02-12-2003

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<150> 60/430729

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<151> 02-12-2002

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<160> 320

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<170> FastSEQ para versión windows 4.0

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<210> 1

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<211> 384

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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68

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<210> 2

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<211> 128

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

69

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<210> 3

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<211> 321

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

70

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<210> 4

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<211> 107

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

71

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<210> 5

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<211> 375

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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72

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<210> 6

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<211> 125

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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73

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<210> 7

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<211> 321

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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74

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<210> 8

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<211> 107

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

75

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<210> 9

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<211> 384

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

76

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<210> 10

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<211> 128

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

77

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<210> 11

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<211> 321

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

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78

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<210> 12

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<211> 107

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 12

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79

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<210> 13

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<211> 369

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 13

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80

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<210> 14

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<211> 123

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 14

81

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<210> 15

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<211> 321

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 15

82

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<210> 16

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<211> 107

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 16

83

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<210> 17

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<211> 351

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 17

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84

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<210> 18

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<211> 117

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 18

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85

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<210> 19

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<211> 342

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 19

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86

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<210> 20

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<211> 114

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 20

87

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<210> 21

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<211> 369

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 21

88

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<210> 22

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<211> 123

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 22

89

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<210> 23

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<211> 321

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 23

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90

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<210> 24

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<211> 107

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 24

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91

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<210> 25

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<211> 384

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 25

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92

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<210> 26

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<211> 128

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 26

93

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<210> 27

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<211> 321

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 27

94

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<210> 28

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<211> 107

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 28

95

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<210> 29

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<211> 384

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 29

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96

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<210> 30

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<211> 128

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 30

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97

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<210> 31

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<211> 321

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 31

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98

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<210> 32

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<211> 107

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 32

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99

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<210> 33

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<211> 366

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 33

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101

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<210> 34

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<211> 122

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 34

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102

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<210> 35

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<211> 333

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 35

103

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<210> 36

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<211> 111

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 36

104

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 244

337

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 245

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 366

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 245

\vskip1.000000\baselineskip

338

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 246

\vskip1.000000\baselineskip

339

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 247

\vskip1.000000\baselineskip

340

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 248

\vskip1.000000\baselineskip

341

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<210> 249

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<211> 366

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 249

\vskip1.000000\baselineskip

342

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<210> 250

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<211> 122

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 250

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343

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<210> 251

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<211> 321

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 251

\vskip1.000000\baselineskip

345

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<210> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 252

\vskip1.000000\baselineskip

346

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<210> 253

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 402

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 253

\vskip1.000000\baselineskip

347

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<210> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 134

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 254

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348

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<210> 255

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<211> 321

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 255

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349

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 256

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 256

\vskip1.000000\baselineskip

350

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 348

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 257

\vskip1.000000\baselineskip

351

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<210> 258

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 258

352

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 259

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 321

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 259

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353

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<210> 260

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<211> 107

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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354

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<210> 261

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<211> 366

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 261

\vskip1.000000\baselineskip

356

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<210> 262

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<211> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 262

357

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 263

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 321

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 263

358

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 264

359

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 265

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 265

360

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 266

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 266

361

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 267

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 267

362

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 268

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 268

363

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 269

364

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 270

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 270

\vskip1.000000\baselineskip

365

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 271

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 271

\vskip1.000000\baselineskip

366

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 272

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 272

\vskip1.000000\baselineskip

367

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 273

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 273

\vskip1.000000\baselineskip

368

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 274

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 274

\vskip1.000000\baselineskip

369

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 275

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 101, 102

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 275

370

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 276

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 276

371

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 277

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 277

372

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 278

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 278

\vskip1.000000\baselineskip

373

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 279

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 279

\vskip1.000000\baselineskip

374

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 280

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 280

375

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 281

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 281

376

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 282

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 282

377

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 283

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 283

\vskip1.000000\baselineskip

378

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 284

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 284

\vskip1.000000\baselineskip

379

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 285

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 285

380

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 286

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 286

381

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 287

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 287

\vskip1.000000\baselineskip

382

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 288

\vskip1.000000\baselineskip

383

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 289

\vskip1.000000\baselineskip

384

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 290

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 290

385

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 291

386

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 292

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 292

387

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 293

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 293

\vskip1.000000\baselineskip

388

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 294

\vskip1.000000\baselineskip

390

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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391

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<210> 296

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<210> 297

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<211> 108

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<210> 298

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 298

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394

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<211> 108

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<210> 301

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<210> 303

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<211> 111

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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400

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<211> 107

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<210> 308

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<211> 107

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<212> PRT

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405

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<213> Homo sapiens

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<400> 309

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<210> 310

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<213> Homo sapiens

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<400> 320

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417

Claims

1. Anticuerpo monoclonal humano que se une de manera específica al factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha) y comprende un polipéptido de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 70 y 74; y un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, en el que dicho anticuerpo monoclonal humano se une al TNF\alpha con una Kd inferior a 10^{-11} M.

2. Anticuerpo monoclonal humano de la reivindicación 1, que comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 70.

3. Anticuerpo monoclonal humano de la reivindicación 1, que comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 74.

4. Método para someter a ensayo el nivel de factor de necrosis tumoral alfa (TNF\alpha) en una muestra de un paciente, que comprende poner en contacto un anticuerpo anti-TNF\alpha de la reivindicación 1, con una muestra biológica de un paciente, y detectar el nivel de unión entre dicho anticuerpo y el TNF\alpha en dicha muestra.

5. Método según la reivindicación 5, en el que la muestra biológica es sangre.

6. Composición, que comprende un anticuerpo de la reivindicación 1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. Uso de un anticuerpo de la reivindicación 1, en la preparación de medicamento para el tratamiento eficaz de enfermedades inflamatorias inmunomediadas en un paciente, en el que dichas enfermedades se seleccionan del grupo que consiste en artritis reumatoide, glomerulonefritis, aterosclerosis, psoriasis, reestenosis, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad de Crohn, reacciones injerto-huésped, choque septicémico, caquexia, anorexia, uveítis, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, vasculitis y esclerosis múltiple, y en el que dicho anticuerpo monoclonal se une de manera específica al factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha).

8. Uso de un anticuerpo de la reivindicación 1, en la preparación de medicamento para el tratamiento eficaz de una enfermedad asociada con la expresión del factor de necrosis tumoral alfa en un paciente, en el que dichas enfermedades se seleccionan del grupo que consiste en artritis reumatoide, glomerulonefritis, aterosclerosis, psoriasis, reestenosis, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad de Crohn, reacciones injerto-huésped, choque septicémico, caquexia, anorexia, uveítis, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, vasculitis y esclerosis múltiple, y en el que dicho anticuerpo monoclonal se une de manera específica al factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha).

9. Uso de la reivindicación 8 ó 9, en el que la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis psoriásica y espondilitis anquilosante.