ES2476892T3 - Anticuerpos que se unen a PAR-2 - Google Patents

Abstract

Una proteína ligante de antígeno aislada, que es un anticuerpo monoclonal, que se une al receptor 2 activado por proteinasas (PAR-2) y produce antagonismo de la activación proteolítica del mismo, en donde la proteína ligante de antígeno aislada se une al PAR-2 de longitud completa que se expone en la ID. SEC. nº 2 y se une en menor grado al PAR-2 que se expone en la ID. SEC. nº 2 cuando es escindido entre R36 y S37

Description

Anticuerpos que se unen a PAR-2

Campo de la invención

Esta solicitud proporciona composiciones y métodos relativos a anticuerpos anti-PAR-2.

5 Antecedentes de la invención

La familia de receptores activados por proteinasas (PAR; del inglés, proteinase-activated receptors) es una parte de la superfamilia de receptores acoplados a proteínas G, de siete dominios transmembranales. Actualmente hay cuatro PARs conocidos, de los cuales tres (PARs-1, -3 y -4) son activados por trombina; un cuarto (PAR-2) es activado por tripsina o por triptasa de mastocito, pero no por trombina. Los PARs est�n ampliamente distribuidos por

10 una diversidad de tejidos y participan en diversos fenómenos fisiológicos o patofisiol�gicos tales como agregación plaquetaria, inflamación y funciones cardiovasculares, digestivas o respiratorias.

Los PARs difieren de otros receptores en que la activación es iniciada por escisión proteol�tica del extremo N del PAR, que forma luego un ligando atado que interacciona con la región extracelular (bucle 2) del mismo polip�ptido receptor. La escisión de PAR-2 se produce entre los restos R y S del dominio de escisión por proteasas, SKGRSLIG

15 (amino�cidos 33 a 40 de la ID. SEC. n� 2), que est� conservado entre los PAR-2 humano, murino y de rata. Se ha mostrado que p�ptidos que remedan el ligando atado presentan efectos agonistas sobre PAR-2 [Saifeddine et al., Br. J. Pharmacol. 118 (3): 521-30 (1996); McGuire et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 309 (3): 1124-31 (2004)].

El PAR-2 activa las vías de transducci�n de señales comunes mediadas por receptores acoplados a proteínas G, la producción de inositol 1,4,5-trifosfato y la movilización de Ca (2+), as� como múltiples vías de cinasas, incluyendo 20 ERK, p38MAPK, JNK e IKK. Est� presente en células epiteliales y endoteliales, miocitos, fibroblastos, células inmunes, neuronas y células gliales, en el ri��n, el páncreas, el estómago, el intestino, las vías aéreas, la piel, la vejiga y el cerebro. La proteasa que activa PAR-2 est� presente durante la inflamación, y PAR-2 es suprarregulado por factores inflamatorios tales como el factor alfa de necrosis tumoral, la interleucina 1 alfa y el lipopolisac�rido. Además, estudios en que se han usado ratones deficientes en PAR-2 o que lo sobreexpresan, confirman una

25 función de este receptor en la inflamación [Schmidlin et al., J. Immunol. 169, 5315-5321 (2002); Ferrell et al., J. Clin. Invest. 111, 35-41 (2003)]. En consecuencia, en la técnica existe la necesidad de desarrollar antagonistas de la activación de PAR-2, que sean útiles en el tratamiento o la mejoría de estados inflamatorios.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 proporciona una transferencia Western en que se compara la unión de varios anticuerpos PAR-2 a PAR30 2 de longitud completa frente a PAR-2 cortado/Fc.

La Figura 2 demuestra esa capacidad de un anticuerpo PAR-2 para producir antagonismo de la activación de PAR-2 en un ensayo FLIPR, usando diversas células que expresan PAR-2.

La Figura 3 presenta los resultados de una transferencia Western para un anticuerpo PAR-2 antagónico as� como para un anticuerpo que no produce antagonismo de PAR-2.

35 La Figura 4 compara esa capacidad de varios anticuerpos PAR-2 para producir antagonismo de la activación de PAR-2 en un ensayo FLIPR.

Sumario de la invención

En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína ligante de ant�geno aislada, como es definida por las reivindicaciones, que se une al receptor 2 activado por proteinasa (PAR-2). La proteína ligante de ant�geno aislada,

40 cuando se une a un PAR-2 humano, inhibe la escisión proteol�tica y la subsiguiente se�alizaci�n a través de dicho PAR-2 humano. La proteína ligante de ant�geno aislada se une a PAR-2 de longitud completa y se une en menor grado a PAR-2 escindido.

En otro aspecto de la invención, la proteína ligante de ant�geno aislada se une específicamente al PAR-2 de un primate no humano, un macaco cangrejero, un chimpancé, un mamífero no primate, un roedor, un ratón, una rata,

45 un h�mster, un cobayo, un gato o un perro. En otra realización, la proteína ligante de ant�geno aislada comprende: un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un fragmento de anticuerpo ligante de ant�geno, un fragmento Fab, o un fragmento F(ab')2.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula aislada que secreta una proteína ligante de ant�geno que se une a PAR-2. En otra realización, la célula es un hibridoma. En otra realización, la presente invención

50 proporciona un método para preparar una proteína ligante de ant�geno que se une a PAR-2 humano, que comprende incubar dicha célula aislada bajo unas condiciones que permiten que exprese dicha proteína ligante de ant�geno.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína ligante de ant�geno. En una realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de un estado de un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto dicha composición farmacéutica, en donde dicho estado es tratable por reducción de la actividad de PAR-2 en dicho sujeto. En otra realización, dicho sujeto es un ser humano. En otra realización, dicho estado es un estado inflamatorio de la piel, las articulaciones, el sistema gastrointestinal y/o las vías aéreas. El método puede comprender además administrar a dicho sujeto un segundo tratamiento. Dicho segundo tratamiento se administra a dicho sujeto antes de que, y/o simultáneamente con, y/o después de que, se administre dicha composición farmacéutica a dicho sujeto. Dicho segundo tratamiento puede comprender un agente antiinflamatorio. Dicha segunda composición farmacéutica comprende un agente seleccionado del grupo que consiste en fármacos antiinflamatorios no esteroideos, esteroides, y agentes inmunomoduladores. Dicho método puede comprender administrar a dicho sujeto un tercer tratamiento.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para disminuir la actividad de PAR-2 en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto dicha composición farmacéutica.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para disminuir la se�alizaci�n de PAR-2 en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto dicha composición farmacéutica.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para inhibir la activación proteol�tica de PAR-2 en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto dicha composición farmacéutica.

Descripci�n detallada de la invención

La presente descripción proporciona composiciones, kits y métodos relativos a moléculas que se unen al receptor 2 activado por proteinasa ("PAR-2"), incluyendo moléculas que presentan agonismo o antagonismo sobre PAR-2, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y derivados de anticuerpo anti-PAR-2, tales como, por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o derivados de anticuerpo anti-PAR-2 antagónicos. También se proporcionan ácidos nucleicos, y derivados y fragmentos de los mismos, que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica todo, o una porción de, un polip�ptido que se une a PAR-2, tal como, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica todo, o parte de, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-PAR-2, pl�smidos y vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos, y células o líneas celulares que comprenden dichos ácidos nucleicos y/o vectores y pl�smidos. Los métodos proporcionados incluyen, por ejemplo, métodos para preparar, identificar o aislar moléculas que se unen a PAR-2, tales como anticuerpos anti-PAR-2, métodos para determinar si una molécula se une a PAR-2, métodos para determinar si una molécula presenta agonismo o antagonismo sobre PAR-2, métodos para preparar composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, que comprenden una molécula que se une a PAR-2, y métodos para administrar una molécula que se une a PAR-2 a un sujeto, por ejemplo, métodos para tratar un estado mediado por PAR-2 y para producir agonismo o antagonismo de una actividad biológica de PAR-2, in vivo o in vitro.

Las secuencias polinucleot�dicas y polipept�dicas se indican usando abreviaturas estándares de una o tres letras. A menos que se indique otra cosa, cada secuencia polipept�dica tiene un extremo am�nico a la izquierda y un extremo carbox�lico a la derecha; cada secuencia de ácido nucleico de cadena sencilla, y la cadena superior de cada secuencia de ácido nucleico de cadena doble, tienen un extremo 5' a la izquierda y un extremo 3' a la derecha. También se puede describir una secuencia polipept�dica o polinucleot�dica particular explicando cómo difiere de una secuencia de referencia.

A menos que se defina otra cosa en esta memoria, las expresiones científicas y técnicas usadas en relación con la presente invención tendrán los significados que son comúnmente entendidos por quienes tienen una experiencia normal en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera otra cosa, las expresiones singulares incluirán pluralidades y las expresiones plurales incluirán el singular. En general, las nomenclaturas usadas en relación con, y las técnicas de, el cultivo de células y tejidos, la biología molecular, la inmunolog�a, la microbiología, la genética, y la química y la hibridación de proteínas y ácidos nucleicos, descritas en esta memoria, son aquéllas bien conocidas y comúnmente usadas en este campo técnico. Los métodos y técnicas se llevan generalmente a cabo de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en este campo técnico y del modo descrito en diversas referencias generales y más específicas que se citan y discuten a lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se indique otra cosa. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2� edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), y Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1990). Las reacciones enzim�ticas y las técnicas de purificación se llevan a cabo de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes, del modo habitualmente realizado en este campo técnico, o del modo descrito en esta memoria. La terminología usada en relación con, y los procedimientos de laboratorio y las técnicas de, química analítica, química orgánica sintética y química m�dica y farmacéutica, descritos en esta memoria, son aquellos bien conocidos y comúnmente usados en este campo técnico. Se pueden usar técnicas estándares para las síntesis químicas, los análisis químicos, la preparación, formulación y distribución farmacéuticas, y el tratamiento de pacientes.

A menos que se indique otra cosa, se debe entender que las expresiones siguientes tienen los significados

siguientes:

La expresión "molécula aislada" (donde la molécula es, por ejemplo, un polip�ptido, un polinucle�tido o un anticuerpo) es una molécula que, en virtud de su origen o fuente de derivación, (1) no est� asociada con componentes naturalmente asociados que la acompañan en su estado nativo, (2) est� sustancialmente exenta de 5 otras moléculas de la misma especie, (3) es expresada por una célula de una especie diferente, o (4) no se encuentra en la naturaleza. De este modo, una molécula que sea químicamente sintetizada, o sea sintetizada en un sistema celular diferente de la célula de la cual se origina naturalmente, estar� "aislada" de sus componentes naturalmente asociados. Mediante aislamiento, usando técnicas de purificación bien conocidas en este campo técnico, también se puede hacer que una molécula est� sustancialmente exenta de componentes naturalmente

10 asociados. Se puede examinar la pureza u homogeneidad de una molécula mediante diversos medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede examinar la pureza de una muestra polipept�dica usando electroforesis en gel de poliacrilamida y tiñendo el gel para visualizar el polip�ptido, usando técnicas bien conocidas en este campo técnico. Para ciertas finalidades, se puede proporcionar una mayor resolución usando HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica para purificación.

15 Las expresiones "inhibidor de PAR-2" y "antagonista de PAR-2" se usan indistintamente. Cada una es una molécula que inhibe detectablemente al menos una función de PAR-2. Por el contrario, un "agonista de PAR-2" es una molécula que aumenta detectablemente al menos una función de PAR-2. No es necesario que la inhibición causada por un inhibidor de PAR-2 sea completa con tal de que sea detectable utilizando un ensayo. Se puede utilizar cualquier ensayo de una función de PAR-2, ejemplos de los cuales se proporcionan en esta memoria. Los ejemplos

20 de funciones de PAR-2 que pueden ser inhibidas por un inhibidor de PAR-2, o aumentadas por un agonista de PAR2, incluyen la unión de ligandos activada por proteasas, la se�alizaci�n corriente abajo, etcétera. Los ejemplos de tipos de inhibidores de PAR-2 y agonistas de PAR-2 incluyen, pero no se limitan a, polip�ptidos ligantes de PAR-2 tales como proteínas ligantes de ant�geno (por ejemplo, proteínas ligantes de ant�geno que inhiben PAR-2), anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y derivados de anticuerpo.

25 Cada uno de los términos "p�ptido", "polip�ptido" y "proteína" se refiere a una molécula que comprende dos o más restos de amino�cido unidos entre s� por enlaces pept�dicos. Estos términos abarcan, por ejemplo, proteínas nativas y artificiales, fragmentos proteicos y compuestos polipept�dicos análogos (tales como mute�nas, variantes, y proteínas de fusión) de una secuencia proteica, as� como proteínas postraduccionalmente, o si no covalente o no covalentemente, modificadas. Un p�ptido, polip�ptido o proteína puede ser mon�mero o pol�mero.

30 La expresión "fragmento polipept�dico", como se utiliza en esta memoria, se refiere a un polip�ptido que tiene una supresión amino-terminal y/o carboxilo-terminal en comparación con la correspondiente proteína de longitud completa. Los fragmentos pueden tener una longitud de, por ejemplo, al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 150 o 200 amino�cidos. Los fragmentos pueden tener además una longitud de, por ejemplo, a lo sumo 1000, 750, 500, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 14, 13, 12, 11 o 10

35 amino�cidos. Un fragmento puede comprender además, en cualquiera de sus extremos o en ambos, uno o más amino�cidos adicionales, tal como, por ejemplo, una secuencia de amino�cidos de una diferente proteína presente en la naturaleza (por ejemplo, un Fc o un dominio de cremallera de leucina) o una secuencia de amino�cidos artificial (por ejemplo, una secuencia conectora artificial o una etiqueta proteica).

Los polip�ptidos incluyen polip�ptidos que han sido modificados de algún modo y por alguna razón para, por

40 ejemplo: (1) reducir la susceptibilidad a la prote�lisis, (2) reducir la susceptibilidad a la oxidación, (3) alterar la afinidad ligante para formar complejos proteicos, (4) alterar afinidades ligantes, y (4) conferir o modificar otras propiedades fisicoqu�micas o funcionales. Los compuestos análogos incluyen mute�nas de un polip�ptido. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de un sólo amino�cido o múltiples amino�cidos (por ejemplo, sustituciones de amino�cidos conservativas) en la secuencia presente en la naturaleza [por ejemplo, en la porción del polip�ptido

45 fuera del (de los) dominio(s) que forma(n) contactos intermoleculares]. Una "sustitución de amino�cido conservativa" es una que no cambia sustancialmente las características estructurales de la secuencia originaria (por ejemplo, un amino�cido de sustitución no debería presentar tendencia a romper una hélice que se encuentra en la secuencia originaria ni a alterar otros tipos de estructura secundaria que caracterizan a la secuencia originaria o son necesarios para su funcionalidad). En "Proteins, Structures and Molecular Principles" [redactado por Creighton, W. H. Freeman

50 and Company, New York (1984)], "Introduction to Protein Structure" [redactado por C. Branden y J. Tooze, Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)] y Thornton et al., Nature 354: 105 (1991), se describen ejemplos de estructuras polipept�dicas secundarias y terciarias reconocidas en la técnica.

La presente solicitud también proporciona compuestos análogos no pept�dicos de polip�ptidos ligantes de PAR-2. En la industria farmacéutica se usan habitualmente compuestos análogos no pept�dicos como fármacos con 55 propiedades análogas a las del p�ptido molde. Estos tipos de compuestos no pept�dicos son denominados "miméticos pept�dicos" o "peptidomim�ticos"; véanse, por ejemplo, Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber y Freidinger, TINS, página 392 (1985); y Evans et al., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987). Se pueden usar miméticos pept�dicos que sean estructuralmente similares a p�ptidos terapéuticamente útiles, para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. En general, los peptidomim�ticos son estructuralmente similares a un 60 polip�ptido paradigmático (es decir, un polip�ptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacol�gica

deseada), tal como un anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces pept�dicos opcionalmente sustituidos por un enlace seleccionado del grupo que consiste en: --CH2NH--, --CH2S--, --CH2--CH2--, --CH=CH--(cis y trans), --COCH2--, --CH(OH)CH2-- y --CH2SO--, mediante métodos bien conocidos en la técnica. También se puede utilizar la sustitución sistemática de uno o más amino�cidos de una secuencia de consenso por un D-amino�cido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina), para generar p�ptidos más estables. Además, se pueden generar p�ptidos forzados que comprendan una secuencia de consenso o una variación de secuencia de consenso sustancialmente idéntica, mediante métodos conocidos en la técnica [Rizo y Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992)], por ejemplo, añadiendo restos de ciste�na internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que producen la ciclaci�n del p�ptido.

Una "variante" de un polip�ptido (por ejemplo, un anticuerpo) comprende una secuencia de amino�cidos en donde uno o más restos de amino�cido han sido insertados en, suprimidos de, y/o sustituidos en, la secuencia de amino�cidos con respecto a otra secuencia polipept�dica. Las variantes incluyen proteínas de fusión.

Un "derivado" de un polip�ptido es un polip�ptido (por ejemplo, un anticuerpo) que ha sido químicamente modificado por medio de, por ejemplo, conjugación con otro componente químico (tal como, por ejemplo, polietilenglicol o albúmina, por ejemplo, albúmina s�rica humana), fosforilaci�n y glicosilaci�n. A menos que se indique otra cosa, el término "anticuerpo" incluye, además de anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, derivados, variantes, fragmentos y mute�nas de los mismos, ejemplos de los cuales se describen más adelante.

Una "proteína ligante de ant�geno" es una proteína que comprende una porción que se une a un ant�geno y, opcionalmente, una porción de andamio o armazón que permite que la porción ligante de ant�geno adopte una conformación que promueve la unión de la proteína ligante de ant�geno al ant�geno. Los ejemplos de proteínas ligantes de ant�geno incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, una porción ligante de ant�geno de un anticuerpo), derivados de anticuerpo y compuestos análogos de anticuerpo. La proteína ligante de ant�geno puede comprender, por ejemplo, un andamio artificial o andamio proteico alternativo con CDRs o derivados de CDR injertados. Dichos andamios incluyen, pero no se limitan a, andamios derivados de anticuerpo que comprenden mutaciones introducidas para, por ejemplo, estabilizar la estructura tridimensional de la proteína ligante de ant�geno, as� como andamios totalmente sintéticos que comprenden, por ejemplo, un pol�mero biocompatible. Véanse, por ejemplo, Korndorfer et al., 2003, "Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, volumen 53, publicación 1: 121129, y Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20: 639-654. Además, se pueden usar miméticos pept�dicos de anticuerpo (PAMs; del inglés, peptide antibody mimetics) as� como andamios basados en miméticos de anticuerpo utilizando componentes de unión a fibronectina como un andamio.

Una proteína ligante de ant�geno puede tener, por ejemplo, la estructura de una inmunoglobulina presente en la naturaleza. Una "inmunoglobulina" es una molécula tetr�mera. En una inmunoglobulina presente en la naturaleza, cada tetr�mero est� compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipept�dicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa). La porción aminoterminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más amino�cidos, esencialmente responsable del reconocimiento antig�nico. La porción carboxilo-terminal de cada cadena de cine una región constante esencialmente responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican en cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican en mu, delta, gamma, alfa y �psilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes est�n unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más amino�cidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 amino�cidos más. Véase, en general, "Fundamental Immunology", capítulo 7 [redactado por W. Paul, 2� edición, Raven Press, New York (1989)]. Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio ligante del anticuerpo, de modo que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios ligantes.

Las cadenas inmunoglobul�nicas presentes en la naturaleza muestran la misma estructura general de regiones de armazón (FR; del inglés, framework regions) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de la complementariedad o CDRs (del inglés, complementarity determining regions). Del extremo N al extremo C, tanto las cadenas ligeras como las pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de amino�cidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5� edición, US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, Publicación n� 91-3242 del NIH, 1991.

Se pueden obtener anticuerpos presentes en la naturaleza de fuentes, tales como suero y plasma, que contienen inmunoglobulinas que tienen una especificidad antig�nica variada. Si dichos anticuerpos son sometidos a una purificación por afinidad, pueden resultar enriquecidos en cuanto a una especificidad antig�nica concreta. Dichas preparaciones de anticuerpos enriquecidas est�n normalmente compuestas de menos de aproximadamente un 10% de anticuerpo que tiene actividad ligante específica hacia el ant�geno concreto. A los anticuerpos preparados de esta manera se hace a menudo referencia como "monoespec�ficos".

Un "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una porción ligante de ant�geno de la misma que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica, a menos que se especifique otra cosa. Se pueden producir porciones ligantes de ant�geno mediante técnicas de DNA recombinante o mediante la escisión enzim�tica o química de anticuerpos intactos. Las porciones ligantes de ant�geno incluyen, inter alia, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio (dAbs; del inglés, domain antibodies), y fragmentos de región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena única (scFv; del inglés, single-chain Fv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos,

5 triacuerpos, tetracuerpos, y polip�ptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir una unión antig�nica específica al polip�ptido.

Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd tiene los dominios VH y CH1; un fragmento Fv tiene los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; y un

10 fragmento dAb tiene un dominio VH, un dominio VL, o un fragmento ligante de ant�geno de un dominio VH o VL (Patentes de EE.UU. números 6.846.634 y 6.696.245, Publicaciones de Solicitud de EE.UU. números 05/0202512, 04/0202995, 04/0038291, 04/0009507 y 03/0039958, Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989).

Un anticuerpo de cadena única (scFv) es un anticuerpo en que una región VL y una región VH est�n unidas por medio de un conector (por ejemplo, una secuencia sintética de restos de amino�cido) para formar una cadena 15 proteica continua en donde el conector es lo suficientemente largo para permitir que la cadena proteica se pliegue sobre s� misma y forme un sitio ligante de ant�geno monovalente (véanse, por ejemplo, Bird et al., 1988, Science

242: 423-26, y Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83). Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes que comprenden dos cadenas polipept�dicas, en donde cada cadena polipept�dica comprende dominios VH y VL unidos por un conector que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre dos dominios de la 20 misma cadena, lo que permite que cada dominio se aparee con un dominio complementario de otra cadena polipept�dica (véanse, por ejemplo, Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-48, y Poljak et al., 1994, Structure 2: 1121-23). Si las dos cadenas polipept�dicas de un diacuerpo son idénticas, un diacuerpo que resulte de su apareamiento tendr� entonces dos sitios ligantes de ant�geno idénticos. Se pueden usar cadenas polipept�dicas que tengan secuencias diferentes para preparar un diacuerpo con dos sitios ligantes de ant�geno diferentes.

25 Similarmente, los tricuerpos y tetracuerpos son anticuerpos que comprenden tres y cuatro cadenas polipept�dicas, respectivamente, y que forman tres y cuatro sitios ligantes de ant�geno, respectivamente, que pueden ser iguales o diferentes.

Se pueden identificar regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) y regiones de armazón (FR) de un anticuerpo dado utilizando el sistema descrito por Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5� 30 edición, US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, Publicación n� 91-3242 del NIH, 1991. Se pueden incorporar uno o más CDRs a una molécula, covalente o no covalentemente, para convertirla en una proteína ligante de ant�geno. Una proteína ligante de ant�geno puede llevar incorporada(s) la(s) CDR(s) como parte de una cadena polipept�dica más grande, puede llevar unida(s) covalentemente la(s) CDR(s) a otra cadena polipept�dica, o puede llevar incorporada(s) la(s) CDR(s) no covalentemente. Las CDRs permiten que la proteína ligante de ant�geno se

35 una específicamente a un ant�geno de interés concreto.

Una proteína ligante de ant�geno puede tener uno o más sitios ligantes. Si hay más de un sitio ligante, los sitios ligantes pueden ser idénticos entre s� o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina humana presente en la naturaleza tiene típicamente dos sitios ligantes idénticos, mientras que un anticuerpo "biespec�fico" o "bifuncional" tiene dos sitios ligantes diferentes.

40 La expresión "anticuerpo humano" incluye todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes procedentes de secuencias inmunoglobul�nicas humanas. En una realización, todos los dominios variables y constantes proceden de secuencias inmunoglobul�nicas humanas (un anticuerpo completamente humano). Estos anticuerpos se pueden preparar de diversas maneras, ejemplos de las cuales se describen más adelante, incluyendo por medio de la inmunizaci�n, con un ant�geno de interés, de un ratón que ha sido

45 genéticamente modificado para que exprese anticuerpos derivados de genes que codifican cadenas pesadas y/o ligeras humanas.

Un anticuerpo humanizado tiene una secuencia que difiere de la secuencia de un anticuerpo procedente de una especie no humana en una o más sustituciones, supresiones y/o adiciones de amino�cidos, por lo que es menos probable que el anticuerpo humanizado induzca una respuesta inmune y/o el anticuerpo humanizado induce una 50 respuesta inmune menos intensa, en comparación con el anticuerpo de especie no humana, cuando se administra a un sujeto humano. En una realización, para producir el anticuerpo humanizado se mutan ciertos amino�cidos del armazón y de los dominios constantes de las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo de especie no humana. En otra realización, se fusiona(n) el(los) dominio(s) constante(s) de un anticuerpo humano con el(los) dominio(s) variable(s) de una especie no humana. En otra realización, se cambian uno o más restos de amino�cido en una o 55 más secuencias de CDR de un anticuerpo no humano para reducir la probable inmunogenicidad del anticuerpo no humano cuando se administra a un sujeto humano, en donde los restos de amino�cido cambiados no son críticos para la unión inmunoespec�fica del anticuerpo con su ant�geno, o los cambios que se hacen en la secuencia de amino�cidos son cambios conservativos, de modo que la unión del anticuerpo humanizado con el ant�geno no es significativamente peor que la unión del anticuerpo no humano con el ant�geno. En las Patentes de EE.UU. números

60 6.054.297, 5.886.152 y 5.877.293 se pueden encontrar ejemplos de cómo preparar anticuerpos humanizados.

La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más anticuerpos distintos. En una realización, una o más de las CDRs proceden de un anticuerpo humano anti-PAR-2. En otra realización, todas las CDRs proceden de un anticuerpo humano anti-PAR-2. En otra realización, las CDRs de más de un anticuerpo humano anti-PAR-2 se mezclan y encajan en un anticuerpo 5 quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo humano anti-PAR-2, una CDR2 y una CDR3 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo humano anti-PAR-2, y las CDRs de la cadena pesada de un tercer anticuerpo anti-PAR-2. Además, las regiones de armazón pueden proceder de uno de los mismos anticuerpos anti-PAR-2, de uno o más anticuerpos diferentes, tal como un anticuerpo humano, o de un anticuerpo humanizado. En un ejemplo de un anticuerpo quimérico, una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a, o procede de, un anticuerpo de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a, o procede de, un(os) anticuerpo(s) de otra especie o que pertenece(n) a otra clase o subclase de anticuerpo. También se incluyen fragmentos de dichos anticuerpos que presentan la deseada actividad biológica (es decir, la capacidad para unirse específicamente a PAR-2). Véanse, por ejemplo, la Patente de EE.UU. n� 4.816.567,

15 y Morrison, 1985, Science 229: 1202-07.

Un "anticuerpo neutralizante" o un "anticuerpo inhibitorio" es un anticuerpo que inhibe la activación proteol�tica de PAR-2 cuando un exceso del anticuerpo anti-PAR-2 reduce la cantidad de activación en al menos aproximadamente 20% al utilizar un ensayo tal como el descrito en los Ejemplos de esta memoria. En diversas realizaciones, la proteína ligante de ant�geno reduce la cantidad de activación proteol�tica de PAR-2 en al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% y 99,9%.

Quienes tienen una experiencia normal en la técnica pueden preparar fácilmente fragmentos o compuestos análogos de anticuerpos siguiendo las enseñanzas de esta memoria descriptiva y usando técnicas bien conocidas en este campo técnico. Los extremos amino y carboxilo preferidos de fragmentos o compuestos análogos se encuentran cerca de los límites de dominios funcionales. Se pueden identificar dominios estructurales y funcionales por

25 comparación de los datos de secuencias de nucleótidos y/o amino�cidos con bases de datos secuenciales públicas o privadas. Se pueden utilizar métodos de comparación inform�ticos para identificar motivos secuenciales o dominios de prevista conformación proteica que se encuentran en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen métodos para identificar secuencias proteicas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Véase, por ejemplo, Bowie et al., 1991, Science 253: 164.

Un "anticuerpo con CDR injertada" es un anticuerpo que comprende una o más CDRs procedentes de un anticuerpo de una especie o isotipo particular, y el armazón de otro anticuerpo de igual o diferente especie o isotipo.

Un "anticuerpo multiespec�fico" es un anticuerpo que reconoce más de un ep�topo en uno o más ant�genos. Una subclase de este tipo de anticuerpo es un "anticuerpo biespec�fico" que reconoce dos ep�topos distintos en ant�genos iguales o diferentes.

35 Una proteína ligante de ant�geno "se une específicamente" a un ant�geno (por ejemplo, PAR-2 humano) si se une al ant�geno con una constante de disociaci�n de 1 nanomolar o menos.

Un "dominio ligante de ant�geno", una "región ligante de ant�geno" o un "sitio ligante de ant�geno" es una porción de una proteína ligante de ant�geno que contiene restos de amino�cido (u otros componentes) que interaccionan con un ant�geno y contribuyen a la especificidad y afinidad de la proteína ligante de ant�geno por el ant�geno. Para un anticuerpo que se une específicamente a su ant�geno, esto incluir� al menos parte de al menos uno de sus dominios CDR.

Un "ep�topo" es la porción de una molécula a la que se une una proteína ligante de ant�geno (por ejemplo, un anticuerpo). Un ep�topo puede comprender porciones no contiguas de la molécula (por ejemplo, en un polip�ptido, restos de amino�cido que no son contiguos en la secuencia primaria del polip�ptido pero que, en el contexto de las

45 estructuras terciaria y cuaternaria del polip�ptido, est�n lo suficientemente cerca entre s� para que a ellos se una una proteína ligante de ant�geno).

El "porcentaje de identidad" de dos secuencias polinucleot�dicas o dos secuencias polipept�dicas se determina comparando las secuencias usando el programa inform�tico GAP [una parte del GCG Wisconsin Package, versión

10.3 (Accelrys, San Diego, California)], utilizando sus parámetros por omisión.

Las expresiones "polinucle�tido", "oligonucle�tido" y "ácido nucleico" se usan indistintamente en esta memoria e incluyen moléculas de DNA (por ejemplo, cDNA o DNA gen�mico), moléculas de RNA (por ejemplo, mRNA), compuestos análogos del DNA o RNA generados usando compuestos nucleot�dicos análogos (por ejemplo, ácidos nucleicos pept�dicos y compuestos nucleot�dicos análogos que no se encuentran en la naturaleza), e híbridos de los mismos. La molécula de ácido nucleico puede ser de cadena sencilla o cadena doble. En una realización, las

55 moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden un marco de lectura abierto contiguo que codifica un anticuerpo, o un fragmento, derivado, mute�na o variante del mismo, de la invención.

Dos polinucle�tidos de cadena sencilla son uno "el complemento" del otro si sus secuencias se pueden alinear en una orientación antiparalela de modo que cada nucleótido de un polinucle�tido est� enfrente de su nucleótido complementario del otro polinucle�tido, sin la introducción de huecos y sin nucleótidos desapareados en el extremo 5' o 3' de cada secuencia. Un polinucle�tido es "complementario" de otro polinucle�tido si los dos polinucle�tidos se pueden hibridar entre s� bajo condiciones moderadamente rigurosas. De este modo, un polinucle�tido puede ser

5 complementario de otro polinucle�tido sin ser su complemento.

Un "vector" es un ácido nucleico que se puede utilizar para introducir en una célula otro ácido nucleico unido a él. Un tipo de vector es un "pl�smido", que se refiere a una molécula de DNA lineal o circular de cadena doble a la que se pueden ligar segmentos de ácido nucleico adicionales. Otro tipo de vector es un vector v�rico (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados, defectuosos en cuanto a la replicaci�n), en cuyo genoma v�rico se 10 pueden introducir segmentos de DNA adicionales. Ciertos vectores son capaces de replicaci�n autónoma en una célula huésped en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que comprenden un origen de replicaci�n bacteriano y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamífero) se integran en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la célula huésped, y se replican por ello junto con el genoma del huésped. Un "vector de expresión" es un tipo de vector que puede dirigir la expresión de un

15 polinucle�tido escogido.

Una secuencia nucleot�dica est� "operativamente unida" a una secuencia regulativa si la secuencia regulativa afecta a la expresión (por ejemplo, el nivel, la regulaci�n temporal, o la posición de la expresión) de la secuencia nucleot�dica. Una "secuencia regulativa" es un ácido nucleico que afecta a la expresión (por ejemplo, el nivel, la regulaci�n temporal o la posición de la expresión) de un ácido nucleico al cual est� operativamente unido. Por 20 ejemplo, la secuencia regulativa puede ejercer sus efectos directamente sobre el ácido nucleico regulado, o a través de la acción de una o más moléculas distintas (por ejemplo, polip�ptidos que se unen a la secuencia regulativa y/o el ácido nucleico). Los ejemplos de secuencias regulativas incluyen promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilaci�n). En, por ejemplo, Goeddel, 1990, "Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California, y Baron et al., 1995, Nucleic Acids

25 Res. 23: 3605-06, se describen otros ejemplos de secuencias regulativas.

Una "célula huésped" es una célula que se puede utilizar para que se exprese un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico de la invención. Una célula huésped puede ser un procarionte, por ejemplo, E. coli, o puede ser un eucarionte, por ejemplo, un eucarionte unicelular (por ejemplo, una levadura u otro hongo), una célula vegetal (por ejemplo, una célula vegetal de tabaco o tomate), una célula animal (por ejemplo, una célula humana, una célula de 30 mono, una célula de h�mster, una célula de rata, una célula de ratón o una célula de insecto) o un hibridoma. Los ejemplos de células huésped incluyen la línea COS-7 de células renales de mono (ATCC CRL 1651) (véase Gluzman et al., 1981, Cell 23: 175), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de h�mster chino (CHO; del inglés, Chinese hamster ovary) o sus derivados tales como Veggie CHO y líneas celulares relacionadas que crecen en medios exentos de suero (véase Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28: 31) o la 35 cepa DX-B11 de CHO, que es deficiente en DHFR (véase Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci USA 77: 421620), células HeLa, líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), la línea celular CV1/EBNA derivada de la línea celular CV1 de ri��n de mono verde africano (ATCC CCL 70) (véase McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821), células renales embrionarias humanas tales como 293, 293 EBNA y MSR 293, células epid�rmicas humanas A431, células Colo205 humanas, otras líneas celulares de primate transformadas, células diploides normales, cepas celulares derivadas del 40 cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, y células HL-60, U937, HaK y Jurkat. Típicamente, una célula huésped es una célula cultivada que puede ser transformada o transfectada con un ácido nucleico que codifica un polip�ptido, el cual se puede luego expresar en la célula huésped. La frase "célula huésped recombinante" se puede utilizar para significar una célula huésped que ha sido transformada o transfectada con un ácido nucleico que se va a expresar. Una célula huésped puede ser también una célula que comprenda el ácido nucleico pero no lo exprese en 45 un nivel deseado a menos que se introduzca una secuencia regulativa en la célula huésped para que llegue a unirse operativamente con el ácido nucleico. Se entiende que la expresión "célula huésped" se refiere no sólo a la célula objetivo particular sino también a la progenie o potencial progenie de dicha célula. Puesto que se pueden producir ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a, por ejemplo, una mutación o influencia ambiental, puede que, en realidad, dicha progenie no sea idéntica a la célula originaria, pero est� aún incluida dentro del

50 alcance de la expresión como se usa en esta memoria.

PAR-2

Como se discutió previamente, el PAR-2 es un miembro de la superfamilia de receptores acoplados a proteínas G, de siete dominios transmembranales; la activación se inicia por escisión proteol�tica del extremo N para formar un ligando atado. En las ID. SEC. números 1 y 2 se muestran las secuencias de nucleótidos y amino�cidos del PAR-2

55 humano; la secuencia de amino�cidos del PAR-2 de ratón se muestra en la ID. SEC. n� 3 y la del PAR-2 de rata se muestra en la ID. SEC. n� 4. La escisión proteol�tica produce la forma activa de este receptor, a la que en esta memoria se hace referencia indistintamente como PAR-2 "escindido" o "recortado".

Prote�nas ligantes de ant�geno

En un aspecto, la presente descripción proporciona proteínas ligantes de ant�geno (por ejemplo, anticuerpos, 60 fragmentos de anticuerpo, derivados de anticuerpo, mute�nas de anticuerpo y variantes de anticuerpo) que se unen

a PAR-2, por ejemplo, a PAR-2 humano.

Las proteínas ligantes de ant�geno de acuerdo con la presente descripción incluyen proteínas ligantes de ant�geno que inhiben una actividad biológica de PAR-2. Los ejemplos de tales actividades biológicas incluyen la activación de vías de transducci�n de señales comunes mediadas por receptores acoplados a proteínas G, tales como la producción de inositol 1,4,5-trifosfato y la movilización de Ca(2+), y la activación de múltiples vías de cinasas, incluyendo ERK, p38MAPK, JNK e IKK. Otras actividades biológicas incluyen las mediadas por PAR-2 in vivo, tales como la respuesta a traumas e inflamaciones; en particular, el PAR-2 est� implicado en los sistemas cardiovascular, pulmonar y gastrointestinal, donde controla la inflamación y la nocicepci�n (percepción de dolor). La activación de PAR-2 también desempeña un papel en la respuesta inflamatoria, cuya activación crónica puede conducir a estados morbosos.

Diferentes proteínas ligantes de ant�geno se pueden unir a diferentes dominios o ep�topos de PAR-2 o actuar mediante diferentes mecanismos de acción. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, proteínas ligantes de ant�geno que interfieren en la activación proteol�tica de PAR-2 o que inhiben la transducci�n de señales. El sitio de acción puede ser, por ejemplo, intracelular (por ejemplo, al interferir en una cascada de se�alizaci�n intracelular) o extracelular. No es necesario que una proteína ligante de ant�geno inhiba completamente la actividad inducida por PAR-2 para resultar útil en la presente invención; en lugar de ello, también se consideran útiles las proteínas ligantes de ant�geno que reducen una actividad particular de PAR-2 (las discusiones de esta memoria en cuanto a mecanismos particulares de acción de las proteínas ligantes de ant�geno que se unen a PAR-2 en el tratamiento de enfermedades particulares son sólo ilustrativas, y los métodos presentados en esta memoria no est�n vinculados a ellas).

Otros derivados de anticuerpos anti-PAR-2 incluyen productos de conjugación covalentes o agregativos de anticuerpos anti-PAR-2, o fragmentos de los mismos, con otras proteínas o polip�ptidos, tal como por expresión de proteínas de fusión recombinantes que comprenden polip�ptidos heter�logos fusionados con el extremo N o el extremo C de un anticuerpo polipept�dico anti-PAR-2. Por ejemplo, el p�ptido conjugado puede ser un polip�ptido señal (o líder) heter�logo, por ejemplo, el líder del factor alfa de levadura, o un p�ptido tal como una etiqueta epit�pica. Las proteínas de fusión que contienen proteína ligante de ant�geno pueden comprender p�ptidos añadidos para facilitar la purificación o identificación de la proteína ligante de ant�geno (por ejemplo, poli-His). Una proteína ligante de ant�geno puede estar también unida al p�ptido FLAG Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (ID. SEC. n� 7), como se describe en Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988, y en la Patente de EE.UU. n�

5.011.912. El p�ptido FLAG es muy antig�nico y proporciona un ep�topo al que se une reversiblemente un anticuerpo monoclonal (mAb; del inglés, monoclonal antibody) específico, lo que permite un rápido ensayo y una fácil purificación de la proteína recombinante expresada. Se dispone comercialmente (Sigma, St. Louis, Missouri) de reactivos útiles para preparar proteínas de fusión en las que est� fusionado el p�ptido FLAG con un polip�ptido dado.

Como antagonistas de PAR-2 se pueden emplear olig�meros que contienen una o más proteínas ligantes de ant�geno. Los olig�meros pueden estar en forma de d�meros, tr�meros u olig�meros superiores, covalentemente enlazados o no covalentemente enlazados. Se contemplan para uso los olig�meros que comprenden dos o más proteínas ligantes de ant�geno, siendo un ejemplo un homod�mero. Otros olig�meros incluyen heterod�meros, homotr�meros, heterotr�meros, homotetr�meros, heterotetr�meros, etc.

Una realización se dirige a olig�meros que comprenden múltiples proteínas ligantes de ant�geno unidas por medio de interacciones covalentes o no covalentes entre componentes pept�dicos fusionados con las proteínas ligantes de ant�geno. Dichos p�ptidos pueden ser conectores (espaciadores) pept�dicos o p�ptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerizaci�n. Las cremalleras de leucina y ciertos polip�ptidos derivados de anticuerpos est�n entre los p�ptidos que pueden promover la oligomerizaci�n de proteínas ligantes de ant�geno fijadas a los mismos, como se describe más adelante con mayor detalle.

En realizaciones particulares, los olig�meros comprenden de dos a cuatro proteínas ligantes de ant�geno. Las proteínas ligantes de ant�geno del olig�mero pueden estar en cualquier forma, tal como en cualquiera de las formas anteriormente descritas, por ejemplo, variantes o fragmentos. Preferiblemente, los olig�meros comprenden proteínas ligantes de ant�geno que tienen actividad ligante de PAR-2.

En una realización, se prepara un olig�mero usando polip�ptidos derivados de inmunoglobulinas. La preparación de proteínas de fusión que comprenden ciertos polip�ptidos heter�logos fusionados con diversas porciones de polip�ptidos derivados de anticuerpos (incluyendo el dominio Fc) ha sido descrita, por ejemplo, por Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88: 10.535; Byrn et al., 1990, Nature 344: 677; y Hollenbaugh et al., 1992, "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins" en Current Protocols in Immunology, suplemento 4, páginas 10.19.1-10.19.11.

Una realización se dirige a un d�mero que comprende dos proteínas de fusión creadas al fusionar un fragmento ligante de PAR-2 de un anticuerpo anti-PAR-2 con la región Fc de un anticuerpo. El d�mero puede ser preparado, por ejemplo, insertando en un vector de expresión apropiado una fusión g�nica que codifica la proteína de fusión, haciendo que se exprese la fusión g�nica en células huésped transformadas con el vector de expresión recombinante, y dejando que la proteína de fusión expresada se ensamble igual que moléculas de anticuerpo, con lo cual se forman enlaces disulfuro intercatenarios entre los componentes de Fc para producir el d�mero.

La expresión "polip�ptido de Fc", como se usa en esta memoria, incluye formas nativas y mute�nicas de polip�ptidos derivados de la región Fc de un anticuerpo. También se incluyen formas truncadas de dichos polip�ptidos que contienen la región bisagra que promueve la dimerizaci�n. Las proteínas de fusión que comprenden componentes

5 de Fc (y los olig�meros formados a partir de ellas) presentan la ventaja de una fácil purificación por cromatograf�a de afinidad en columnas de proteína A o proteína G.

Un polip�ptido de Fc adecuado, descrito en la solicitud PCT WO 93/10151 (incorporada por referencia en esta memoria), es un polip�ptido de cadena sencilla que se extiende desde la región bisagra N-terminal hasta el extremo C nativo de la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano. Otro polip�ptido de Fc útil es la mute�na de Fc descrita en la

10 Patente de EE.UU. n� 5.457.035 y en Baum et al., 1994, EMBO J. 13: 3992-4001. La secuencia de amino�cidos de esta mute�na es idéntica a la secuencia de Fc nativa presentada en el documento WO 93/10151 salvo por que el amino�cido 19 ha sido cambiado de Leu a Ala, el amino�cido 20 ha sido cambiado de Leu a Glu, y el amino�cido 22 ha sido cambiado de Gly a Ala. La mute�na presenta una afinidad reducida por receptores de Fc.

En otras realizaciones, la porción variable de las cadenas pesadas y/o ligeras de un anticuerpo anti-PAR-2 puede 15 sustituir a la porción variable de una cadena pesada y/o ligera de anticuerpo.

Alternativamente, el olig�mero es una proteína de fusión que comprende múltiples proteínas ligantes de ant�geno, con o sin conectores pept�dicos (p�ptidos espaciadores). Entre los conectores pept�dicos adecuados est�n los descritos en las Patentes de EE.UU. números 4.751.180 y 4.935.233.

Otro método para preparar proteínas olig�meras ligantes de ant�geno implica el uso de una cremallera de leucina.

20 Los dominios de cremallera de leucina son p�ptidos que promueven la oligomerizaci�n de las proteínas en que se hallan. Las cremalleras de leucina fueron originalmente identificadas en varias proteínas ligantes de DNA (Landschulz et al., 1988, Science 240: 1759), y desde entonces han sido halladas en una diversidad de diferentes proteínas. Entre las cremalleras de leucina conocidas est�n p�ptidos presentes en la naturaleza y derivados de los mismos que se dimerizan o trimerizan. En la solicitud PCT WO 94/10308 se describen ejemplos de dominios de

25 cremallera de leucina adecuados para producir proteínas olig�meras solubles, y en Hoppe et al., 1994, FEBS Letters

344: 191, se describe la cremallera de leucina derivada de la proteína D tensioactiva (SPD; del inglés, surfactant protein D) de pulmón, documentos incorporados por referencia en esta memoria. En Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6: 267-78, se describe el uso de una cremallera de leucina modificada que permite una trimerizaci�n estable de una proteína heter�loga fusionada con ella. En un planteamiento, se expresan proteínas de fusión

30 recombinantes que comprenden un fragmento o derivado de anticuerpo anti-PAR-2 fusionado con un p�ptido de cremallera de leucina, en células huésped adecuadas, y se recuperan del sobrenadante del cultivo los fragmentos o derivados olig�meros solubles de anticuerpo anti-PAR-2 que se forman.

En un aspecto, la presente descripción proporciona proteínas ligantes de ant�geno que interfieren en la activación proteol�tica de un PAR-2. Dichas proteínas ligantes de ant�geno pueden ser preparadas contra PAR-2, o un 35 fragmento, variante o derivado del mismo, y exploradas en ensayos convencionales en cuanto a la capacidad para interferir en la activación proteol�tica de PAR-2. Son ejemplos de ensayos adecuados los ensayos en que se examinan las proteínas ligantes de ant�geno en cuanto a la capacidad para inhibir la activación proteol�tica de células que expresan PAR-2, o se examinan las proteínas ligantes de ant�geno en cuanto a la capacidad para reducir una respuesta biológica o celular que resulta de la activación proteol�tica de receptores PAR-2 de la

40 superficie celular. Ensayos adicionales en que se examinan las proteínas ligantes de ant�geno, varios ejemplos de los cuales se describen en esta memoria, incluyen aquellos en que se compara cualitativa o cuantitativamente la unión de una proteína ligante de ant�geno a un polip�ptido PAR-2 maduro de longitud completa, con la unión de aquélla a un polip�ptido PAR-2 proteol�ticamente escindido.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona una proteína ligante de ant�geno que presenta selectividad de

45 especie. En una realización, la proteína ligante de ant�geno se une a uno o más PAR-2 de mamífero, por ejemplo, a PAR-2 humano y uno o más de PAR-2 de ratón, rata, cobayo, h�mster, jerbo, gato, conejo, perro, cabra, oveja, vaca, caballo, camello y primate no humano. En otra realización, la proteína ligante de ant�geno se une a uno o más PAR-2 de primate, por ejemplo, a PAR-2 humano y uno o más de PAR-2 de macaco cangrejero, tití, macaco rhesus y chimpancé. En otra realización, la proteína ligante de ant�geno se une específicamente a PAR-2 de ser humano,

50 macaco cangrejero, tití, macaco rhesus o chimpancé. En otra realización, la proteína ligante de ant�geno no se une a uno o más de PAR-2 de ratón, rata, cobayo, h�mster, jerbo, gato, conejo, perro, cabra, oveja, vaca, caballo, camello y primate no humano. En otra realización, la proteína ligante de ant�geno no se une a una especie de mono del Nuevo Mundo, tal como un tití. En otra realización, la proteína ligante de ant�geno no presenta unión específica con ninguna proteína presente en la naturaleza que no sea PAR-2. En otra realización, la proteína ligante de ant�geno no

55 presenta unión específica con ninguna proteína presente en la naturaleza que no sea PAR-2 de mamífero. En otra realización, la proteína ligante de ant�geno no presenta unión específica con ninguna proteína presente en la naturaleza que no sea PAR-2 de primate. En otra realización, la proteína ligante de ant�geno no presenta unión específica con ninguna proteína presente en la naturaleza que no sea PAR-2 humano. En otra realización, la proteína ligante de ant�geno se une específicamente a PAR-2 de ratón, rata, macaco cangrejero y ser humano. En

60 otra realización, la proteína ligante de ant�geno se une específicamente a PAR-2 de ratón, rata, macaco cangrejero y ser humano con una afinidad ligante similar. En otra realización, la proteína ligante de ant�geno bloquea la unión de la activación proteol�tica de PAR-2 de ratón, rata, macaco cangrejero y ser humano. En otra realización, la proteína ligante de ant�geno tiene una IC50 similar sobre PAR-2 de ratón, rata, macaco cangrejero y ser humano en un ensayo de movilización de Ca2+.

5 Se puede determinar la selectividad de una proteína ligante de ant�geno hacia un PAR-2 usando métodos bien conocidos en la técnica y siguiendo las enseñanzas de la memoria descriptiva. Por ejemplo, se puede determinar la selectividad usando transferencia Western, FACS, ELISA o RIA.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona una proteína ligante de ant�geno que se une a PAR-2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PAR-2), que tiene una o más de las características siguientes: se une tanto a PAR-2

10 humano como a PAR-2 murino, inhibe la activación proteol�tica de PAR-2 humano, inhibe la activación proteol�tica de PAR-2 murino, se une a, o cerca de, el sitio de escisión proteol�tica de PAR-2, y causa una infrarregulaci�n relativamente pequeña del PAR-2 expresado en la superficie celular.

Se pueden producir fragmentos ligantes de ant�geno de proteínas ligantes de ant�geno de la invención mediante técnicas convencionales. Los ejemplos de tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab y F(ab')2.

15 También se contemplan fragmentos y derivados de anticuerpo producidos mediante técnicas de ingeniería genética.

Realizaciones adicionales incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales no humanos (por ejemplo, murinos). Dichos anticuerpos humanizados pueden ser preparados mediante técnicas conocidas y presentan la ventaja de una inmunogenicidad reducida cuando se administran los anticuerpos a seres humanos. En una realización, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende el dominio 20 variable de un anticuerpo murino (o todo, o parte de, el sitio ligante de ant�genos del mismo) y un dominio constante derivado de un anticuerpo humano. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio ligante de ant�genos de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento de dominio variable (que carece del sitio ligante de ant�geno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales quiméricos y otros genéticamente modificados incluyen los descritos por Riechmann et al., 1988,

25 Nature 332: 323, Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439, Larrick et al., 1989, Bio/Technology 7: 934, y Winter et al., 1993, TIPS 14: 139. En una realización, el anticuerpo quimérico es un anticuerpo con CDR injertado. En, por ejemplo, la Solicitud de Patente de EE.UU. n� 10/194.975 (publicada el 27 de febrero de 2003), las Patentes de EE.UU. números 5.869.619, 5.225.539, 5.821.337 y 5.859.205, Padlan et al., 1995, FASEB J. 9: 133-39, y Tamura et al., 2000, J. Immunol. 164: 1432-41, se discuten técnicas para humanizar anticuerpos.

30 Se han desarrollado procedimientos para generar anticuerpos humanos o parcialmente humanos en animales no humanos. Por ejemplo, se han preparado ratones en que uno o más genes inmunoglobul�nicos end�genos han sido inactivados por diversos medios. Se han introducido genes inmunoglobul�nicos humanos en los ratones para sustituir a los genes de ratón inactivados. Los anticuerpos producidos en el animal llevan incorporadas cadenas polipept�dicas de inmunoglobulina humana codificadas por el material genético humano introducido en el animal. En

35 una realización, se inmuniza un animal no humano, tal como un ratón transg�nico, con un polip�ptido de PAR-2 para que se generen en el animal anticuerpos dirigidos contra el polip�ptido de PAR-2. Un ejemplo de un inmun�geno adecuado es un PAR-2 humano soluble, tal como un polip�ptido que comprende el sitio de escisión proteol�tica de PAR-2, u otro fragmento inmunog�nico de PAR-2. Otro ejemplo de un inmun�geno adecuado es el de células que expresan niveles elevados de PAR-2, o preparaciones de membranas celulares procedentes de aquéllas. En las

40 Patentes de EE.UU. números 5.814.318, 5.569.825 y 5.545.806, Davis et al., 2003, Production of human antibodies from transgenic mice en "Antibody Engineering: Methods and Protocols", redactado por Lo, Humana Press, New Jersey: 191-200, Kellermann et al., 2002, Curr. Opin. Biotechnol. 13: 593-97, Russel et al., 2000, Infect. Immun. 68: 1820-26, Gallo et al., 2000, Eur. J. Immun. 30: 534-40, Davis et al., 1999, Cancer Metastasis Rev. 18: 421-25, Green, 1999, J. Immunol. Methods 231: 11-23, Jakobovits, 1998, Advanced Drug Delivery Reviews 31: 33-42, Green

45 et al., 1998, J. Exp. Med. 188: 483-95, A. Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7: 607-14, Tsuda et al., 1997, Genomics 42: 413-21, Mendez et al., 1997, Nat. Genet. 15: 146-56, Jakobovits, 1994, Curr. Biol. 4: 761-63, Arbones et al., 1994, Immunity 1: 247-60, Green et al., 1994, Nat. Genet. 7: 13-21, Jakobovits et al., 1993, Nature 362: 25558, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-55; J. Chen, M. Trounstine, F. W. Alt, F. Young, C. Kurahara, J. Loring, D. Huszar, "Immunoglobulin gene rearrangement in B cell deficient mice generated by targeted

50 deletion of the JH locus", International Immunology 5 (1993): 647-656; Choi et al., 1993, Nature Genetics 4: 117-23, Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14: 845-51, Harding et al., 1995, Annals of the New York Academy of Sciences, Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-59, Lonberg, 1994, Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies en Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, Lonberg et al., 1995, Internal. Reviews of Immunology 13: 65-93, Neuberger, 1996, Nature Biotechnology 14: 826, Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Research

55 20: 6287-95, Taylor et al., 1994, International Immunology 6: 579-91, Tomizuka et al., 1997, Nature Genetics 16: 133-43, Tomizuka et al., 2000, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 97: 722-27, Tuaillon et al., 1993, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 90: 3720-24, y Tuaillon et al., 1994, Journal of Immunology 152: 2912-20, se describen ejemplos de técnicas para la producción y el uso de animales transg�nicos para la producción de anticuerpos humanos o parcialmente humanos.

60 La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales que se unen a PAR-2. Se pueden producir anticuerpos

monoclonales utilizando cualquier técnica conocida en este campo técnico, tal como, por ejemplo, inmortalizando células espl�nicas recogidas del animal transg�nico tras la compleción del programa de inmunizaci�n. Las células espl�nicas pueden ser inmortalizadas usando cualquier técnica conocida en este campo técnico, tal como, por ejemplo, fusion�ndolas con células de mieloma para producir hibridomas. Las células de mieloma para uso en procedimientos de fusión para producir hibridomas son preferiblemente no productoras de anticuerpo, y presentan una elevada eficacia de fusión y deficiencias enzim�ticas que las hacen incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que sólo soportan el crecimiento de las células fusionadas deseadas (hibridomas). Los ejemplos de líneas celulares adecuadas para uso en fusiones de ratón incluyen Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; los ejemplos de líneas celulares usadas en fusiones de rata incluyen R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210. Otras líneas celulares útiles para fusiones celulares son U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6.

En una realización, se produce una línea celular de hibridoma al inmunizar un animal (por ejemplo, un animal transg�nico que tiene secuencias inmunoglobul�nicas humanas) con un inmun�geno de PAR-2; recoger células espl�nicas del animal inmunizado; fusionar las células espl�nicas recogidas con una línea celular de mieloma, para generar por ello células de hibridoma; establecer líneas celulares de hibridoma a partir de las células de hibridoma; e identificar una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo que se une a un polip�ptido de PAR-2. Dichas líneas celulares de hibridoma, y los anticuerpos monoclonales anti-PAR-2 por ellas producidos, quedan abarcados por la presente invención.

Los anticuerpos monoclonales secretados por una línea celular de hibridoma pueden ser purificados usando cualquier técnica conocida en este campo técnico. Se pueden explorar adicionalmente hibridomas o mAbs para identificar mAbs con propiedades particulares, tal como la capacidad para bloquear una actividad inducida por PAR

2. En los ejemplos posteriores se proporcionan ejemplos de dichas exploraciones.

Tambi�n se pueden producir anticuerpos monoclonales utilizando un procedimiento al que se hace referencia como inmunizaci�n genética. Por ejemplo, se puede incorporar a un vector v�rico (tal como un vector adenov�rico) un ácido nucleico que codifica el ant�geno de interés. Luego se utiliza el vector resultante para desarrollar una respuesta inmune contra el ant�geno de interés en un animal huésped adecuado [por ejemplo un ratón diabético no obeso, o NOD (del inglés, non-obese diabetic)]. Esta técnica es sustancialmente descrita por Ritter et al., Biodrugs 16 (1): 310 (2002), cuya descripción se incorpora a esta memoria por referencia.

La evolución molecular de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) en el centro del sitio ligante del anticuerpo ha sido empleada para aislar anticuerpos con una afinidad aumentada, por ejemplo, anticuerpos que tienen una afinidad aumentada por c-erB-2, como describen Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263: 551. En consecuencia, tales técnicas son útiles para preparar anticuerpos hacia PAR-2.

Se pueden usar proteínas ligantes de ant�geno dirigidas contra un PAR-2 en, por ejemplo, ensayos para detectar la presencia de polip�ptidos de PAR-2, sea in vitro o sea in vivo. Las proteínas ligantes de ant�geno pueden ser también empleadas en la purificación de proteínas PAR-2 por cromatograf�a de inmunoafinidad. Aquellas proteínas ligantes de ant�geno que pueden bloquear además la activación proteol�tica de PAR-2 pueden ser usadas para inhibir una actividad biológica que resulte de dicha unión. En los métodos de la presente invención se pueden usar proteínas ligantes de ant�geno bloqueantes. Dichas proteínas ligantes de ant�geno que actúan como antagonistas de PAR-2 pueden ser empleadas en el tratamiento de cualquier estado inducido por PAR-2, incluyendo, pero sin limitarse a, estados inflamatorios. En una realización, se emplea un anticuerpo monoclonal humano anti-PAR-2, generado mediante procedimientos que implican la inmunizaci�n de ratones transg�nicos, en el tratamiento de dichos estados.

Se pueden emplear proteínas ligantes de ant�geno en un procedimiento in vitro o se pueden administrar in vivo para inhibir una actividad biológica inducida por PAR-2. De esta manera se pueden tratar trastornos causados o exacerbados (directa o indirectamente) por la activación proteol�tica de PAR-2, ejemplos de los cuales se proporcionan en esta memoria. En una realización, la presente invención proporciona un método terapéutico que comprende la administración in vivo de una proteína ligante de ant�geno que bloquea PAR-2 a un mamífero que lo necesita, en una cantidad eficaz para reducir una actividad biológica inducida por PAR-2.

Las proteínas ligantes de ant�geno incluyen anticuerpos monoclonales parcialmente humanos y totalmente humanos que inhiben una actividad biológica de PAR-2. Una realización se dirige a un anticuerpo monoclonal humano que bloquea al menos parcialmente la activación proteol�tica de PAR-2 humano. En una realización, los anticuerpos se generan al inmunizar un ratón transg�nico con un inmun�geno de PAR-2. En otra realización, el inmun�geno es un polip�ptido de PAR-2 humano (por ejemplo, un fragmento soluble que comprende todo, o parte de, el sitio de escisión de PAR-2). También se proporcionan en esta memoria líneas celulares de hibridoma derivadas de dichos ratones inmunizados, en donde el hibridoma secreta un anticuerpo monoclonal que se une a PAR-2.

Aunque los anticuerpos humanos, parcialmente humanos o humanizados ser�n adecuados para muchas aplicaciones, particularmente aquéllas en que est� implicada la administración del anticuerpo a un sujeto humano. Otros tipos de proteínas ligantes de ant�geno ser�n adecuados para ciertas aplicaciones. Los anticuerpos no humanos de la invención pueden derivar de, por ejemplo, cualquier animal que produzca anticuerpos, tal como un

rat�n, una rata, un conejo, una cabra, un burro o un primate no humano [tal como un mono (por ejemplo, un macaco cangrejero o un macaco rhesus) o un simio (por ejemplo, un chimpancé)]. Los anticuerpos no humanos de la invención se pueden usar, por ejemplo, en aplicaciones in vitro y basadas en cultivo celular, o en cualquier otra aplicación donde no se produzca, sea insignificante, se pueda evitar, no sea un asunto de interés o se desee, una respuesta inmune al anticuerpo de la invención. En una realización, se administra un anticuerpo no humano a un sujeto no humano. En otra realización, el anticuerpo no humano no provoca una respuesta inmune en el sujeto no humano. En otra realización, el anticuerpo no humano es de la misma especie que el sujeto no humano; por ejemplo, se administra un anticuerpo de ratón de la invención a un ratón. Se puede preparar un anticuerpo de una especie concreta, por ejemplo, inmunizando un animal de esa especie con el inmun�geno deseado (por ejemplo, un polip�ptido de PAR-2 soluble), o usando un sistema artificial para generar anticuerpos de esa especie (por ejemplo, un sistema basado en presentación en bacterias o fagos para generar anticuerpos de una especie concreta), o convirtiendo un anticuerpo de una especie en un anticuerpo de otra especie al sustituir, por ejemplo, la región constante del anticuerpo por una región constante de la otra especie o al sustituir uno o más restos de amino�cido del anticuerpo para que se parezca más fielmente a la secuencia de un anticuerpo de la otra especie. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico que comprende secuencias de amino�cidos derivadas de anticuerpos de dos o más especies diferentes.

Se pueden preparar proteínas ligantes de ant�geno mediante cualquiera de diversas técnicas convencionales. Por ejemplo, se pueden purificar a partir de células que las expresan naturalmente (por ejemplo, se puede purificar un anticuerpo a partir de un hibridoma que lo produce) o se pueden producir en sistemas de expresión recombinantes, usando cualquier técnica conocida en este campo técnico. Véanse, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, redactado por Kennet et al., Plenum Press, New York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, redactado por Harlow y Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988).

Para preparar los polip�ptidos recombinantes de la invención se puede usar cualquier sistema de expresión conocido en la técnica. En general, se transforman células huésped con un vector de expresión recombinante que comprende DNA que codifica un polip�ptido deseado. Entre las células huésped que se pueden emplear est�n procariontes, levaduras y células eucari�ticas superiores. Los procariontes incluyen organismos Gram negativos y Gram positivos, tales como, por ejemplo, E. coli y bacilos. Las células eucari�ticas superiores incluyen células de insecto y líneas celulares establecidas de origen mamífero. Los ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero adecuadas incluyen la línea COS-7 de células renales de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., 1981, Cell 23: 175), células L, células 293, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de h�mster chino (CHO) células HeLa, líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), y la línea celular CVI/EBNA derivada de la línea celular CVI de ri��n de mono verde africano (ATCC CCL 70), como describen McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821. Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985) describen vectores de clonaci�n y expresión apropiados para uso con huéspedes celulares de bacteria, hongo, levadura y mamífero.

Las células transformadas pueden ser cultivadas bajo unas condiciones que promuevan la expresión del polip�ptido, y el polip�ptido puede ser recuperado mediante procedimientos convencionales para purificación de proteínas. Uno de dichos procedimientos de purificación incluye el uso de cromatograf�a de afinidad, por ejemplo, sobre una matriz que tenga todo, o una porción de (por ejemplo, el dominio extracelular), el PAR-2 unido a ella. Los polip�ptidos considerados para uso en esta memoria incluyen polip�ptidos de anticuerpo recombinante de mamífero anti-PAR-2 sustancialmente homogéneos y sustancialmente exentos de materiales end�genos contaminantes.

Se pueden preparar proteínas ligantes de ant�geno, y se pueden explorar en cuanto a propiedades deseadas, mediante cualquiera de diversas técnicas conocidas. Algunas de las técnicas implican aislar un ácido nucleico que codifica una cadena polipept�dica (o una porción de la misma) de una proteína ligante de ant�geno de interés (por ejemplo, un anticuerpo anti-PAR-2) y manipular el ácido nucleico por medio de tecnología de DNA recombinante. El ácido nucleico puede ser fusionado con otro ácido nucleico de interés o puede ser alterado (por ejemplo, mediante mutag�nesis u otras técnicas convencionales) para, por ejemplo, añadir, suprimir o sustituir uno o más restos de amino�cido.

En un aspecto, la presente descripción proporciona fragmentos ligantes de ant�geno de un anticuerpo anti-PAR-2. Dichos fragmentos pueden consistir totalmente en secuencias derivadas de anticuerpo o pueden comprender secuencias adicionales. Los ejemplos de fragmentos ligantes de ant�geno incluyen Fab, F(ab')2, anticuerpos de cadena única, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, y anticuerpos de dominio. En Lunde et al., 2002, Biochem. Soc. Trans. 30: 500-06, se proporcionan otros ejemplos.

Se pueden formar anticuerpos de cadena única al unir fragmentos de dominio variable (región Fv) de cadenas pesadas y ligeras por medio de un puente de amino�cidos (conector pept�dico corto), para dar lugar a una sola cadena polipept�dica. Se han preparado dichos Fvs de cadena única (scFvs) al fusionar DNA que codifica un conector pept�dico entre DNAs que codifican los dos polip�ptidos de dominio variable (VL y VH). Los polip�ptidos resultantes se pueden plegar sobre s� mismos para formar mon�meros ligantes de ant�geno, o pueden formar mult�meros (por ejemplo, d�meros, tr�meros o tetr�meros), dependiendo de la longitud de un conector flexible entre los dos dominios variables (Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10: 423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18: 95-108). Al

combinar polip�ptidos que comprenden VL y VH diferentes, se pueden formar scFvs mult�meros que se unan a ep�topos diferentes (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18: 31-40). Las técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos de cadena única incluyen las descritas en la Patente de EE.UU. n� 4.946.778; Bird, 1988, Science

242: 423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879; Ward et al., 1989, Nature 334: 544; y de Graaf et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178: 379-87.

Las proteínas ligantes de ant�geno (por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y derivados de anticuerpo) pueden comprender cualquier región constante conocida en la técnica. La región constante de cadena ligera puede ser, por ejemplo, una región constante de cadena ligera de tipo kappa o lambda, por ejemplo, una región constante de cadena ligera de tipo kappa o lambda humana. La región constante de cadena pesada puede ser, por ejemplo, una región constante de cadena pesada de tipo alfa, delta, �psilon, gamma o mu, por ejemplo, una región constante de cadena pesada de tipo alfa, delta, �psilon, gamma o mu humana. En una realización, la región constante de cadena ligera o pesada es un fragmento, derivado, variante o mute�na de una región constante presente en la naturaleza.

Se conocen técnicas para obtener un anticuerpo de una subclase o isotipo diferente a partir de un anticuerpo de interés, es decir, realizar un cambio de subclase. De esta manera, por ejemplo, se pueden obtener anticuerpos IgG a partir de un anticuerpo IgM, y viceversa. Dichas técnicas permiten la preparación de nuevos anticuerpos que poseen las propiedades ligantes de ant�geno de un anticuerpo dado (el anticuerpo originario) pero que también presentan propiedades biológicas asociadas con un isotipo o subclase de anticuerpo diferente del isotipo o subclase del anticuerpo originario. Se pueden emplear técnicas de DNA recombinante. En dichos procedimientos se puede emplear DNA clonado que codifica polip�ptidos de anticuerpo particulares, por ejemplo, DNA que codifica el dominio constante de un anticuerpo del isotipo deseado. Véase también Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178: 303-16. Además, si se desea una IgG4, puede ser también deseable introducir una mutación puntual (CPSCP --> CPPCP) en la región bisagra, como describen Bloom et al., 1997, Protein Science 6: 407, para aliviar una tendencia a formar enlaces disulfuro intra-cadenas H que puedan conducir a heterogeneidad en los anticuerpos IgG4.

Adem�s, también se conocen técnicas para obtener proteínas ligantes de ant�geno que tengan propiedades diferentes (es decir, afinidades variables por el ant�geno al cual se unen). Una de dichas técnicas, a la que se hace referencia como "barajadura de cadenas", implica presentar repertorios g�nicos de dominios variables inmunoglobul�nicos en la superficie de un bacteri�fago filamentoso, a lo que a menudo se hace referencia como "presentación en fagos". Se ha utilizado la barajadura de cadenas para preparar anticuerpos de alta afinidad por el hapteno 2-feniloxazol-5-ona, como describen Marks et al., 1992, BioTechnology 10: 779.

En realizaciones particulares, las proteínas ligantes de ant�geno tienen una afinidad ligante (Ka) por PAR-2 de al menos 106. En otras realizaciones, las proteínas ligantes de ant�geno presentan una Ka de al menos 107, al menos 108, al menos 109 o al menos 1010. En otra realización, la proteína ligante de ant�geno presenta una Ka sustancialmente igual a la de un anticuerpo descrito en los Ejemplos de esta memoria.

Se describe una proteína ligante de ant�geno que tiene una baja velocidad de disociaci�n de PAR-2. En una realización, la proteína ligante de ant�geno tiene una Koff de 1x10-4 s-1 o menos. En otra realización, la Koff es 5x10-5 s-1 o menos. En otra realización, la Koff es sustancialmente la misma que la de un anticuerpo descrito en los Ejemplos de esta memoria. En otra realización, la proteína ligante de ant�geno se une a PAR-2 con una Koff sustancialmente igual a la de un anticuerpo descrito en los Ejemplos de esta memoria.

Otro aspecto proporciona una proteína ligante de ant�geno que inhibe una actividad de PAR-2, por ejemplo, la movilización de Ca2+. En una realización, la proteína ligante de ant�geno tiene una IC50 de 1000 nM o menos. En otra realización, la IC50 es 100 nM o menos; en otra realización, la IC50 es 10 nM o menos. En otra realización, la IC50 es sustancialmente la misma que la de un anticuerpo descrito en los Ejemplos de esta memoria. En otra realización, la proteína ligante de ant�geno inhibe una actividad de PAR-2 con una IC50 sustancialmente igual a la de un anticuerpo descrito en los Ejemplos de esta memoria.

Otra realización proporciona una proteína ligante de ant�geno que se une a PAR-2 de longitud completa y se une en menor grado a PAR-2 escindido. En diversas realizaciones, la proteína ligante de ant�geno se une al PAR-2 de longitud completa al menos un 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% y 99,9% menos de lo que se une al PAR-2 escindido.

Otro aspecto proporciona una proteína ligante de ant�geno que se une a, o cerca de, el sitio de escisión por proteasas del PAR-2 humano. Se pueden preparar proteínas ligantes de ant�geno que se unan al sitio de escisión por proteasas usando cualquier técnica conocida en este campo técnico. Por ejemplo, dichas proteínas ligantes de ant�geno pueden ser aisladas usando el polip�ptido PAR-2 de longitud completa (por ejemplo, en una preparación unido a membranas), un fragmento soluble de dominio extracelular de PAR-2, o un fragmento más pequeño del dominio extracelular de PAR-2 que comprende, o consiste en, el sitio de escisión por proteasas (ejemplos de los cuales se proporcionan en esta memoria). Las proteínas ligantes de ant�geno as� aisladas pueden ser exploradas para determinar su especificidad de unión usando cualquier método conocido en la técnica (ejemplos de los cuales se proporcionan en esta memoria).

Otra realización proporciona una proteína ligante de ant�geno que compite por unirse a PAR-2 con un anticuerpo descrito en esta memoria. Dicha capacidad competitiva puede ser determinada mediante métodos que son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por competición en cuanto a unirse a PAR-2/Fc en una transferencia Western (u otro ensayo de base pept�dica) o por competición en un ensayo de flujo de Ca2+ como el descrito en esta

5 memoria. En un aspecto, una proteína ligante de ant�geno que compite por unirse a PAR-2 con un anticuerpo descrito en esta memoria se une al mismo ep�topo que el anticuerpo. En otro aspecto, la proteína ligante de ant�geno que compite por unirse a PAR-2 con un anticuerpo descrito en esta memoria inhibe la activación proteol�tica de PAR-2.

Otro aspecto proporciona una proteína ligante de ant�geno que se une a PAR-2 humano expresado en la superficie

10 de una célula y que, cuando est� as� unida, inhibe la actividad de se�alizaci�n de PAR-2 en la célula sin causar una reducción significativa en la cantidad de PAR-2 sobre la superficie de la célula. Se puede utilizar cualquier método para determinar o estimar la cantidad de PAR-2 en la superficie y/o el interior de la célula. En una realización, la presente invención proporciona una proteína ligante de ant�geno que se une a, o cerca de, el sitio de escisión por proteasas de un PAR-2 humano expresado en la superficie de una célula y que, cuando est� as� unida, inhibe la

15 actividad de se�alizaci�n de PAR-2 en la célula sin aumentar significativamente el índice de internalizaci�n del PAR2 desde la superficie de la célula. En otras realizaciones, la unión de la proteína ligante de ant�geno a la célula que expresa PAR-2 causa que se internalice menos de aproximadamente el 75%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% o 0,1% del PAR-2 de la superficie celular.

Otro aspecto proporciona una proteína ligante de ant�geno que tiene una semivida de al menos un día in vitro o in

20 vivo (por ejemplo, cuando se administra a un sujeto humano). En una realización, la proteína ligante de ant�geno tiene una semivida de al menos tres días. En otra realización, la proteína ligante de ant�geno tiene una semivida de cuatro días o más. En otra realización, la proteína ligante de ant�geno tiene una semivida de ocho días o más. En otra realización, la proteína ligante de ant�geno es derivatizada o modificada para que tenga una semivida mayor en comparación con la proteína ligante de ant�geno no derivatizada o no modificada. En otra realización, la proteína

25 ligante de ant�geno contiene una o más mutaciones puntuales para aumentar su semivida en suero, tal como se describe en el documento WO 00/09560, publicado el 24 de febrero de 2000.

La presente descripción proporciona además proteínas ligantes de ant�geno multiespec�ficas, por ejemplo, proteínas ligantes de ant�geno biespec�ficas, por ejemplo, proteínas ligantes de ant�geno que se unen a dos ep�topos diferentes de PAR-2, o a un ep�topo de PAR-2 y un ep�topo de otra molécula, a través de dos sitios o regiones 30 ligantes de ant�geno diferentes. Además, una proteína ligante de ant�geno biespec�fica como la descrita en esta memoria puede comprender un sitio ligante de PAR-2 de uno de los anticuerpos descritos en esta memoria y una segunda región ligante de PAR-2 de otro de los anticuerpos descritos en esta memoria. Alternativamente, una proteína ligante de ant�geno biespec�fica puede comprender un sitio ligante de ant�geno de uno de los anticuerpos descritos en esta memoria y un segundo sitio ligante de ant�geno de otro anticuerpo PAR-2 que es conocido en la

35 técnica, o de un anticuerpo que se prepara mediante métodos conocidos o mediante los métodos descritos en esta memoria.

Se conocen en la técnica y se discuten en la Solicitud de Patente de EE.UU. 09/839.632, presentada el 20 de abril de 2001, numerosos métodos para preparar anticuerpos biespec�ficos. Dichos métodos incluyen el uso de hibridomas-híbridos como los descritos por Milstein et al., 1983, Nature 305: 537, y otros (Patente de EE.UU. n�

40 4.474.893 y Patente de EE.UU. n� 6.106.833), y la copulaci�n química de fragmentos de anticuerpo (Brennan et al., 1985, Science 229: 81; Glennie et al., 1987, J. Immunol. 139: 2367; y Patente de EE.UU. n� 6.010.902). Además, se pueden producir anticuerpos biespec�ficos a través de medios recombinantes, por ejemplo, usando componentes de cremalleras de leucina (es decir, de las proteínas Fos y Jun, que forman preferentemente heterod�meros; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547) u otras estructuras de dominios interactivos de cerradura y llave como las descritas

45 en la Patente de EE.UU. n� 5.582.996. Técnicas útiles adicionales incluyen las descritas en Kortt et al., 1997, supra; la Patente de EE.UU. n� 5.959.083 y la Patente de EE.UU. n� 5.807.706.

En otro aspecto, la proteína ligante de ant�geno comprende un derivado de un anticuerpo. El anticuerpo derivatizado puede comprender cualquier molécula o sustancia que imparta una propiedad deseada al anticuerpo, tal como una semivida aumentada en un uso concreto. El anticuerpo derivatizado puede comprender, por ejemplo, un 50 componente detectable (o de etiquetado) {por ejemplo, una molécula radiactiva, colorim�trica, antig�nica o enzim�tica, un glóbulo detectable [tal como un glóbulo magnético o electrodenso (por ejemplo, de oro)], o una molécula que se une a otra molécula (por ejemplo, biotina o estreptavidina)}, un componente terapéutico o diagnóstico (por ejemplo, un componente radiactivo, citot�xico o farmac�uticamente activo), o una molécula que aumenta la idoneidad del anticuerpo para un uso concreto (por ejemplo, la administración a un sujeto, tal como un 55 sujeto humano, u otros usos in vivo o in vitro). Los ejemplos de moléculas que se pueden utilizar para derivatizar un anticuerpo incluyen albúmina (por ejemplo, albúmina s�rica humana) y polietilenglicol (PEG). Se pueden preparar derivados unidos a albúmina y PEGilados de anticuerpos usando técnicas bien conocidas en este campo técnico. En una realización, el anticuerpo es conjugado con, o de otro modo unido a, transtirretina (TTR) o una variante de TTR. La TTR o variante de TTR puede ser químicamente modificada con, por ejemplo, un compuesto químico 60 seleccionado del grupo que consiste en dextrano, poli(N-vinilpirrolidona), polietilenglicoles, homopol�meros de propilenglicol, copol�meros de poli(óxido de propileno/óxido de etileno), polioles polioxietilados y poli(alcoholes

vin�licos) (Solicitud de Patente de EE.UU. n� 20030195154.

Otro aspecto proporciona métodos de exploración para una molécula que se une a PAR-2, usando las proteínas ligantes de ant�geno de la presente invención. Se puede utilizar cualquier técnica de exploración adecuada. En una realización, se pone en contacto una molécula de PAR-2, o un fragmento de la misma al cual se une una proteína 5 ligante de ant�geno de la presente invención, con la proteína ligante de ant�geno de la invención y con otra molécula, en donde la otra molécula se une a PAR-2 si reduce la unión de la proteína ligante de ant�geno a PAR-2. La unión de la proteína ligante de ant�geno puede ser detectada usando cualquier método adecuado, tal como, por ejemplo, un ELISA. La detección de la unión de la proteína ligante de ant�geno a PAR-2 puede ser simplificada al etiquetar detectablemente la proteína ligante de ant�geno, como se discutió anteriormente. En otra realización, la molécula

10 ligante de PAR-2 es adicionalmente analizada para determinar si inhibe la activación y/o se�alizaci�n de PAR-2.

�cidos nucleicos

Un aspecto proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas. Los ácidos nucleicos comprenden, por ejemplo, polinucle�tidos que codifican toda, o parte de, una proteína ligante de ant�geno, tal como, por ejemplo, una o ambas cadenas de un anticuerpo, o un fragmento, derivado, mute�na o variante del mismo, polinucle�tidos suficientes para 15 uso como sondas de hibridación, cebadores de PCR o cebadores de secuenciaci�n para identificar, analizar, mutar

o multiplicar un polinucle�tido que codifica un polip�ptido, ácidos nucleicos antisentido para inhibir la expresión de un polinucle�tido, y secuencias complementarias de los precedentes. Los ácidos nucleicos pueden tener cualquier longitud. Pueden tener una longitud de, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1500, 3000, 5000 o más nucleótidos, y/o pueden comprender una o

20 más secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias regulativas, y/o ser parte de un ácido nucleico más grande, por ejemplo, un vector. Los ácidos nucleicos pueden ser de cadena sencilla o cadena doble y pueden comprender nucleótidos de RNA y/o DNA, y variantes artificiales de los mismos (por ejemplo, ácidos nucleicos pept�dicos).

Se pueden aislar ácidos nucleicos que codifiquen polip�ptidos de anticuerpo (por ejemplo, una cadena pesada o ligera, sólo un dominio variable, o la longitud completa), a partir de células B de ratones que hayan sido inmunizados

25 con PAR-2. El ácido nucleico puede ser aislado mediante procedimientos convencionales, tal como mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction).

Se proporcionan además ácidos nucleicos que se hibridan con otros ácidos nucleicos bajo condiciones de hibridación particulares. Los métodos para hibridar ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York (1989), 6.3.1-6.3.6. Como se define 30 en esta memoria, en una condición de hibridación moderadamente rigurosa se usa una disolución de prelavado que contiene cloruro sádico/citrato sádico (SSC) 5X, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH de 8,0), tampón de hibridación de formamida a aproximadamente el 50%, SSC 6X, y una temperatura de hibridación de 55 �C (u otras disoluciones de hibridación similares, tal como una que contiene formamida a aproximadamente el 50%, con una temperatura de hibridación de 42 �C), y unas condiciones de lavado de 60 �C en SSC 0,5X, SDS al 0,1%. En una condición de 35 hibridación rigurosa se hibrida en SSC 6X a 45 �C, lo que va seguido de uno o más lavados en SSC 0,1X, SDS al 0,2%, a 68 �C. Además, quien tiene experiencia en la técnica puede manipular las condiciones de hibridación y/o lavado para aumentar o disminuir el rigor de la hibridación de modo que los ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que tienen una identidad de al menos 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99% entre s� permanezcan típicamente hibridados entre s�. Los parámetros básicos que afectan a la elección de las condiciones

40 de hibridación y las directrices para idear condiciones adecuadas son expuestos, por ejemplo, por Sambrook, Fritsch y Maniatis (1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, capítulos 9 y 11), y Ausubel et al. (redactores) ("Current Protocols in Molecular Biology", 1995, John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4), y pueden ser fácilmente determinados por quienes tienen una experiencia normal en la técnica basándose en, por ejemplo, la longitud y/o la composición de bases del DNA.

45 Se pueden introducir cambios por mutación en un ácido nucleico, lo que conduce a cambios en la secuencia de amino�cidos de un polip�ptido (por ejemplo, una proteína ligante de ant�geno) que codifica. Se pueden introducir mutaciones usando cualquier técnica conocida en este campo técnico. En una realización, se cambian uno o más restos de amino�cido concretos usando, por ejemplo, un protocolo de mutag�nesis dirigida al sitio. En otra realización, se cambian uno o más restos aleatoriamente seleccionados usando, por ejemplo, un protocolo de

50 mutag�nesis aleatoria. De cualquier modo que se haga, se puede expresar un polip�ptido mutante y se puede explorar en cuanto a una propiedad deseada (por ejemplo, la unión a PAR-2 o el bloqueo de la activación proteol�tica de PAR-2).

Se pueden introducir mutaciones en un ácido nucleico sin alterar significativamente la actividad biológica de un polip�ptido que codifica. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de nucleótidos que conduzcan a sustituciones 55 de amino�cidos en restos de amino�cido no esenciales. En una realización, una secuencia de nucleótidos, o un fragmento, variante o derivado deseado de la misma, es mutado de modo que codifique una secuencia de amino�cidos que comprenda una o más supresiones o sustituciones de restos de amino�cido. En otra realización, la mutag�nesis permite insertar un amino�cido adyacente a uno o más restos de amino�cido. Alternativamente, se pueden introducir una o más mutaciones en un ácido nucleico que cambien selectivamente la actividad biológica 60 (por ejemplo, la unión de PAR-2, la inhibición de la activación proteol�tica de PAR-2, etcétera) de un polip�ptido que

codifica. Por ejemplo, la mutación puede cambiar cuantitativa o cualitativamente la actividad biológica. Los ejemplos de cambios cuantitativos incluyen aumentar, reducir o eliminar la actividad. Los ejemplos de cambios cualitativos incluyen cambiar la especificidad antig�nica de una proteína ligante de ant�geno.

Otro aspecto proporciona moléculas de ácido nucleico que son adecuadas para uso como cebadores o sondas de hibridación para la detección de secuencias de ácido nucleico de la invención. Una molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender sólo una porción de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polip�ptido de longitud completa de la invención, por ejemplo, un fragmento que pueda ser utilizado como una sonda o cebador o un fragmento que codifique una porción activa (por ejemplo, una porción ligante de PAR-2) de un polip�ptido de la invención.

Se pueden usar sondas basadas en la secuencia de un ácido nucleico de la invención para detectar el ácido nucleico o ácidos nucleicos similares, por ejemplo, transcritos que codifican un polip�ptido de la invención. La sonda puede comprender un grupo etiqueta, por ejemplo, un radiois�topo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzim�tico. Dichas sondas pueden ser utilizadas para identificar una célula que expresa el polip�ptido.

Otro aspecto proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico que codifica un polip�ptido de la invención o una porción del mismo. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, pl�smidos, vectores v�ricos, vectores no episomales de mamífero y vectores de expresión, por ejemplo, vectores de expresión recombinantes.

Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped. Los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias regulativas, seleccionadas basándose en las células huésped que se van a utilizar para la expresión, que est�n operativamente unidas a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. Las secuencias regulativas incluyen aquéllas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped (por ejemplo, el potenciador g�nico precoz del SV40, el promotor del virus del sarcoma de Rous y el promotor del citomegalovirus), aquéllas que sólo dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos en ciertas células huésped (por ejemplo, secuencias regulativas tisularmente específicas; véanse Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11: 287, y Maniatis et al., 1987, Science 236: 1237, incorporados en sus totalidades por referencia en esta memoria), y aquéllas que dirigen la expresión inducible de una secuencia de nucleótidos en respuesta a un tratamiento o un estado particulares [por ejemplo, el promotor de metalotione�na en células de mamífero y el promotor sensible a tet y/o sensible a estreptomicina en sistemas tanto procari�ticos como eucari�ticos (véase id.). Quienes tienen experiencia en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se va a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión se pueden introducir en células huésped para producir por ello proteínas o p�ptidos, incluyendo proteínas o p�ptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como los descritos en esta memoria.

Otro aspecto proporciona células huésped en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Una célula huésped puede ser cualquier célula procari�tica (por ejemplo, E. coli) o célula eucari�tica [por ejemplo, células de levadura, insecto o mamífero (por ejemplo, células CHO)]. Se puede introducir un DNA vector en células procari�ticas o eucari�ticas por medio de técnicas de transformación o transfecci�n convencionales. Para la transfecci�n estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfecci�n utilizados, sólo una pequeña fracción de células puede integrar el DNA extraño en su genoma. Con objeto de identificar y seleccionar estos productos de integración, se introduce generalmente un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, para resistencia a antibióticos) en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato). Las células establemente transfectadas con el ácido nucleico introducido pueden ser identificadas mediante selección con fármacos (por ejemplo, las células que han incorporado el gen del marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán), entre otros métodos.

Indicaciones

En un aspecto, la presente descripción proporciona métodos para tratar a un sujeto. El método puede tener, por ejemplo, un efecto generalmente saludable sobre el sujeto; por ejemplo, puede aumentar la esperada longevidad del sujeto. Alternativamente, el método puede servir, por ejemplo, para tratar, prevenir, curar, aliviar o mejorar ("tratar") una enfermedad, trastorno, estado o mal ("un estado"). Entre los estados que se van a tratar de acuerdo con la presente invención est�n los estados caracterizados por una inapropiada expresión o actividad de PAR-2. En algunos de dichos estados, el nivel de expresión o actividad es demasiado elevado y el tratamiento comprende administrar un antagonista de PAR-2 como el descrito en esta memoria.

Las enfermedades y estados m�dicos específicos que son tratables o prevenibles con las proteínas ligantes de ant�geno de esta invención incluyen estados inflamatorios del sistema gastrointestinal, incluyendo enfermedad cel�aca, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, gastroparesia idiop�tica, pancreatitis, incluyendo pancreatitis crónica, enfermedad inflamatoria intestinal y úlceras, incluyendo úlceras gástricas y duodenales. Las proteínas ligantes de ant�geno de esta invención son también útiles para tratar o mejorar estados inflamatorios de las vías aéreas, tales como asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y similares.

Los trastornos reumáticos que son tratables con las proteínas ligantes de ant�geno de esta invención incluyen artritis reumatoides adulta y juvenil, esclerodermia, lupus sist�mico eritematoso, gota, osteoartritis, polimialgia reumática, espondiloartropat�as seronegativas, incluyendo espondilitis anquilosante, y enfermedad de Reiter, artritis psori�sica y artritis crónica de Lyme. La enfermedad de Still y la uve�tis asociada con artritis reumatoide son también tratables o

5 prevenibles con estos polip�ptidos. Además, las terapias polipept�dicas de la invención se usan para tratar trastornos que dan lugar a inflamación del músculo voluntario y otros músculos, incluyendo dermatomiositis, miositis por cuerpos de inclusión, polimiositis y linfangioleiomiomatosis.

Los trastornos descritos en esta memoria pueden ser tratados con las proteínas ligantes de ant�geno de esta invención en combinación con otras citocinas, inhibidores citoc�nicos y reactivos (a los que también se hace

10 referencia en esta memoria como inmunomoduladores). Por ejemplo, los inmunomoduladores incluyen antagonistas de IL-18 tales como el receptor soluble de IL-18, anticuerpos contra IL-18 o el receptor de IL-18, y proteína ligante de IL-18; inhibidores de TNF, incluyendo ENBREL�; inhibidores de IL-1, incluyendo formas solubles de IL-1R de tipo I, IL-1R de tipo II, anticuerpos contra IL-1 y anticuerpos contra IL-1R de tipo I; y otros agentes activos que son eficaces en el tratamiento de las enfermedades y estados m�dicos descritos.

15 Las composiciones y/o métodos se pueden también utilizar, por ejemplo, en tratamientos cosméticos, en tratamientos veterinarios, para aumentar la longevidad, para tratar defectos reproductivos, y para tratar una diversidad de trastornos relacionados con PAR-2. Además, en algunos de dichos estados, el nivel de expresión o actividad de PAR-2 es demasiado bajo y el tratamiento comprende administrar un agonista de PAR-2; dichos tratamientos est�n también comprendidos en esta memoria.

20 Métodos terapéuticos y administración de proteínas ligantes de ant�geno

Ciertos métodos proporcionados en esta memoria comprenden administrar una proteína ligante de ant�geno que se une a PAR-2 a un sujeto, reduciendo por ello una respuesta biológica inducida por PAR-2 que desempeña una función en un estado particular. En realizaciones particulares, los métodos implican poner PAR-2 end�geno en contacto con una proteína ligante de ant�geno que se une a PAR-2, por ejemplo, por medio de la administración a un

25 sujeto o en un procedimiento ex vivo.

El término "tratamiento" abarca el alivio o la prevención de al menos un síntoma u otro aspecto de un trastorno, o la reducción de la gravedad de una enfermedad, y similares. No es necesario que una proteína ligante de ant�geno efectúe una curación completa, ni que erradique todo síntoma o manifestación de una enfermedad, para que constituya un agente terapéutico viable. Como se reconoce en el campo pertinente, los fármacos empleados como 30 agentes terapéuticos pueden reducir la gravedad de un estado morboso dado, pero no es necesario que supriman toda manifestación de la enfermedad para que sean considerados agentes terapéuticos útiles. Similarmente, no es necesario que un tratamiento profil�cticamente administrado sea completamente eficaz en cuanto a prevenir el inicio de un estado para que constituya un agente profiláctico viable. Basta simplemente con reducir el impacto de una enfermedad (por ejemplo, reduciendo el número o la gravedad de sus síntomas, o aumentando la eficacia de otro

35 tratamiento, o produciendo otro efecto beneficioso) o reducir la probabilidad de que la enfermedad aparezca o empeore en un sujeto. Una realización de la invención se dirige a un método que comprende administrar a un paciente un antagonista de PAR-2 en una cantidad y durante un tiempo suficientes para provocar una mejoría continua con respecto a la línea de base de un indicador que refleja la gravedad del trastorno concreto.

Como se entiende en el campo pertinente, se administran composiciones farmacéuticas que comprenden las

40 moléculas de la invención a un sujeto de un modo apropiado a la indicación. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo, pero sin limitarse a, parenteral y típicamente, y por inhalaci�n. Si se inyecta, la composición farmacéutica se puede administrar, por ejemplo, por las vías intraarticular, intravenosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal y subcutánea, mediante la inyección de bolos o mediante infusión continua. Se contempla la administración localizada, por ejemplo, en un sitio de una enfermedad o

45 lesión, como se contemplan la distribución transd�rmica y la liberación ininterrumpida desde implantes. La distribución por inhalaci�n incluye, por ejemplo, la inhalaci�n nasal u oral, el uso de un nebulizador, la inhalaci�n del antagonista en forma de aerosol, y similares. Otras alternativas incluyen gotas oculares; preparaciones orales, incluyendo píldoras, jarabes, pastillas y chicles; y preparaciones típicas tales como lociones, geles, composiciones pulverizables y ungüentos.

50 También se contempla el uso de proteínas ligantes de ant�geno en procedimientos ex vivo. Por ejemplo, se puede poner la sangre u otro fluido corporal de un paciente en contacto con una proteína ligante de ant�geno que se une a PAR-2 ex vivo. La proteína ligante de ant�geno puede estar unida a una matriz insoluble o un material de soporte sólido adecuados.

De forma ventajosa, las proteínas ligantes de ant�geno se administran en forma de una composición que comprende

55 uno o más componentes adicionales, tal como un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable. Opcionalmente, la composición comprende además uno o más agentes fisiológicamente activos, por ejemplo, una segunda sustancia que inhibe la inflamación o la respuesta inmune, una sustancia anti-angiog�nica, una sustancia analgésica, etc., ejemplos no exclusivos de los cuales se proporcionan en esta memoria. En diversas realizaciones particulares, la composición comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis agentes fisiológicamente activos además

de una proteína ligante de ant�geno que se une a PAR-2.

En una realización, la composición farmacéutica comprende una proteína ligante de ant�geno de la invención junto con una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en un tampón, un antioxidante tal como ácido asc�rbico, un polip�ptido de bajo peso molecular (tal como aquellos que tienen menos de 10 amino�cidos), una proteína, un amino�cido, un carbohidrato tal como glucosa, sacarosa o dextrinas, un agente quelante tal como EDTA, glutati�n, un estabilizante y un excipiente. La disolución salina tamponada neutra y la disolución salina mezclada con albúmina s�rica de la misma especie son ejemplos de diluyentes apropiados. De acuerdo con normas industriales apropiadas, también se pueden añadir conservantes tales como el alcohol benc�lico. La composición puede ser formulada como un producto de liofilización usando apropiadas disoluciones de excipiente (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes. Los componentes adecuados son at�xicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. En Remington's Pharmaceutical Sciences, 16� edición (1980) y 20� edición (2000), Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, se presentan más ejemplos de componentes que se pueden emplear en formulaciones farmacéuticas.

Los kits para uso por facultativos incluyen una sustancia inhibidora de PAR-2 de la invención y un prospecto u otras instrucciones para uso en el tratamiento de cualquiera de los estados discutidos en esta memoria. En una realización, el kit incluye una preparación estéril de una o más proteínas ligantes de ant�geno que se unen a PAR-2, que puede estar en forma de una composición como la anteriormente descrita, y puede estar en uno o más viales.

Las dosis y la frecuencia de administración pueden variar de acuerdo con factores tales como la vía de administración, las proteínas ligantes de ant�geno particulares empleadas, la naturaleza y la gravedad de la enfermedad que se va a tratar, si el estado es agudo o crónico, y el tamaño y el estado general del sujeto. Las dosis apropiadas se pueden determinar mediante procedimientos conocidos en la técnica pertinente, por ejemplo, en pruebas clónicas que pueden implicar estudios de elevación de dosis.

Se puede administrar una sustancia inhibidora de PAR-2 de la invención, por ejemplo, una vez o más de una vez, por ejemplo, a intervalos regulares durante un periodo de tiempo. En realizaciones particulares, se administra una proteína ligante de ant�geno durante un periodo de al menos un mes o más, por ejemplo, durante uno, dos o tres meses o incluso indefinidamente. Para tratar estados crónicos, el tratamiento de larga duración es generalmente el más eficaz. Sin embargo, para tratar estados agudos, puede bastar la administración durante periodos más cortos, por ejemplo, de una a seis semanas. En general, la proteína ligante de ant�geno se administra hasta que el paciente manifiesta un grado m�dicamente relevante de mejoría con respecto a la línea de base del indicador o los indicadores elegidos.

Realizaciones particulares implican administrar una proteína ligante de ant�geno en una dosis de aproximadamente 1 ng de proteína ligante de ant�geno por kg de peso del sujeto al día ("1 ng/kg/día") a aproximadamente 10 mg/kg/día, más preferiblemente de aproximadamente 500 ng/kg/día a aproximadamente 5 mg/kg/día, y lo más preferiblemente de aproximadamente 5 μg/kg/día a aproximadamente 2 mg/kg/día, a un sujeto. En realizaciones adicionales, se administra una proteína ligante de ant�geno a adultos una vez a la semana, dos veces a la semana, o tres veces o más a la semana, para tratar una enfermedad, estado o trastorno mediado por PAR-2, por ejemplo, un trastorno m�dico descrito en esta memoria. Si se inyecta, la cantidad eficaz de proteína ligante de ant�geno por dosis de adulto puede estar en el intervalo de 1-20 mg/m2, y preferiblemente es aproximadamente 5-12 mg/m2. Alternativamente, se puede administrar una dosis fija; la cantidad puede estar en el intervalo de 5-100 mg/dosis. Un intervalo para una dosis fija es aproximadamente 20-30 mg por dosis. En una realización de la invención, se administra repetidamente una dosis fija de 25 mg/dosis por inyección. Si se utiliza una vía de administración distinta de la inyección, la dosis es apropiadamente ajustada de acuerdo con prácticas m�dicas estándares. Un ejemplo de un régimen terapéutico implica inyectar una dosis de aproximadamente 20-30 mg de proteína ligante de ant�geno de una a tres veces a la semana durante un periodo de al menos tres semanas, aunque puede ser necesario un tratamiento durante períodos más prolongados para provocar el grado deseado de mejoría. Para sujetos pediátricos (4-17 años de edad), un régimen adecuado ejemplar implica la inyección subcutánea de 0,4 mg/kg, hasta una dosis máxima de 25 mg de proteína ligante de ant�geno administrados dos o tres veces a la semana.

Realizaciones particulares de los métodos proporcionados en esta memoria implican la inyección subcutánea de 0,5 mg a 10 mg, preferiblemente de 3 a 5 mg, de una proteína ligante de ant�geno, una o dos veces a la semana. Otra realización se dirige a la administración pulmonar (por ejemplo, mediante un nebulizador) de 3 mg o más de proteína ligante de ant�geno una vez a la semana.

Los ejemplos de regímenes terapéuticos proporcionados en esta memoria comprenden la inyección subcutánea de una proteína ligante de ant�geno una vez a la semana, en una dosis de 1,5 a 3 mg, para tratar un estado en que la se�alizaci�n de PAR-2 desempeña un papel. En esta memoria se proporcionan ejemplos de dichos estados, que incluyen, por ejemplo, estados reumáticos como los previamente descritos y otros estados en que una inflamación excesiva desempeña un papel (descritos en esta memoria; por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal, pancreatitis, etc.). Se continúa la administración semanal de proteína ligante de ant�geno hasta que se alcanza un resultado deseado, por ejemplo, la remisión de síntomas del sujeto. Se puede reanudar el tratamiento cuando sea necesario o, alternativamente, se pueden administrar dosis de mantenimiento.

Otros ejemplos de regímenes terapéuticos proporcionados en esta memoria comprenden la administración subcutánea o intravenosa de una dosis de 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 o 20 miligramos de un inhibidor de PAR-2 de la presente invención por kilogramo de masa corporal del sujeto (mg/kg). La dosis se puede administrar una vez al sujeto o más de una vez con un cierto intervalo, por ejemplo, una vez al día, tres veces a la semana, dos veces a

5 la semana, una vez a la semana, tres veces al mes, dos veces al mes, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada seis meses, o una vez al año. La duración del tratamiento y cualesquier cambios en la dosis y/o la frecuencia del tratamiento se pueden alterar o variar durante el curso del tratamiento con objeto de satisfacer las necesidades concretas del sujeto.

En otra realización, se administra una proteína ligante de ant�geno al sujeto en una cantidad y durante un tiempo

10 suficientes para provocar una mejoría, preferiblemente una mejoría continua, en al menos un indicador que refleja la gravedad del trastorno que se est� tratando. Se pueden evaluar diversos indicadores que reflejan el grado del mal, la enfermedad o el estado del sujeto, para determinar si la cantidad y el tiempo del tratamiento son suficientes. Dichos indicadores incluyen, por ejemplo, indicadores cl�nicamente reconocidos de gravedad de la enfermedad, síntomas, o manifestaciones del trastorno en cuestión. En una realización se considera que una mejoría es continua

15 si el sujeto presenta la mejoría en al menos dos ocasiones separadas por un periodo de dos a cuatro semanas. El grado de mejoría es generalmente determinado por un m�dico, quien puede hacer esta determinación basándose en signos, síntomas, biopsias u otros resultados de ensayos, y quien puede emplear además cuestionarios que se administran al sujeto, tales como cuestionarios de calidad de vida desarrollados para una enfermedad dada.

Unos niveles elevados de PAR-2 y/o activación de PAR-2 se asocian con diversos trastornos, que incluyen, por

20 ejemplo, estados inflamatorios de la piel, las articulaciones, el sistema gastrointestinal y/o las vías aéreas. Los sujetos con un trastorno dado pueden ser examinados para identificar aquellos individuos que tienen una activación de PAR-2 elevada, identific�ndose por ello los sujetos que más se pueden beneficiar del tratamiento con una proteína ligante de ant�geno que se une a PAR-2. De esta manera, los métodos de tratamiento proporcionados en esta memoria comprenden opcionalmente una primera operación de medir los niveles de activación de PAR-2 de un

25 sujeto. Se puede administrar una proteína ligante de ant�geno a un sujeto en quien la activación de PAR-2 est� elevada por encima de lo normal.

Se pueden controlar los niveles de actividad de PAR-2 de un sujeto antes, durante y/o después del tratamiento con una proteína ligante de ant�geno, para detectar cambios, si los hubiera, en la actividad de PAR-2. Para algunos trastornos, la incidencia de una actividad de PAR-2 elevada puede variar de acuerdo con factores tales como la fase

30 de la enfermedad y la forma concreta de la enfermedad. Se pueden emplear técnicas conocidas para medir la actividad de PAR-2 en, por ejemplo, muestras de suero, sangre o tejido de un sujeto. La actividad de PAR-2 se puede medir usando cualquier técnica adecuada.

Realizaciones particulares de métodos y composiciones implican el uso de una proteína ligante de ant�geno y uno o más antagonistas de PAR-2 adicionales, por ejemplo, dos o más proteínas ligantes de ant�geno de la invención, o 35 una proteína ligante de ant�geno de la invención y uno o más antagonistas de PAR-2 distintos. En otras realizaciones, la proteína ligante de ant�geno se administra sola o en combinación con otros agentes útiles para tratar el estado que afecta al paciente. Los ejemplos de tales agentes incluyen fármacos tanto proteicos como no proteicos. Cuando se coadministran múltiples compuestos terapéuticos, se pueden ajustar las dosis en consecuencia, como es reconocido en la técnica pertinente. La "coadministraci�n" y la terapia de combinación no se

40 limitan a la administración simultánea sino que también incluyen regímenes de tratamiento en que se administra una proteína ligante de ant�geno al menos una vez durante el curso de un tratamiento que implica administrar al menos un agente terapéutico distinto al paciente.

Los ejemplos de otros agentes que se pueden coadministrar con una proteína ligante de ant�geno son otras proteínas ligantes de ant�geno y polip�ptidos terapéuticos que se eligen de acuerdo con el estado concreto que se

45 va a tratar. Alternativamente, se pueden coadministrar fármacos no proteicos que sean útiles en el tratamiento de uno de los estados particulares anteriormente discutidos, con un antagonista de PAR-2.

Terapia de combinación

Otro aspecto proporciona un método para tratar a un sujeto con una proteína ligante de ant�geno que inhibe PAR-2 y uno o más tratamientos distintos. En una realización, dicha terapia de combinación consigue una sinergia o un

50 efecto aditivo al, por ejemplo, atacar múltiples sitios o dianas moleculares de un tumor. Los tipos de terapias de combinación que se pueden utilizar en relación con la presente invención incluyen inhibir o activar (según sea apropiado) múltiples centros en una sola vía relacionada con la enfermedad, múltiples vías en una célula diana y múltiples tipos celulares en un tejido diana.

En otra realización, un método de terapia de combinación comprende administrar al sujeto dos, tres, cuatro, cinco,

55 seis o más de los agonistas o antagonistas de PAR-2 descritos en esta memoria. En otra realización, el método comprende administrar al sujeto dos o más tratamientos que inhiben o activan conjuntamente (directa o indirectamente) la transducci�n de señales mediada por PAR-2. Los ejemplos de dichos métodos incluyen utilizar combinaciones de dos o más proteínas ligantes de ant�geno que inhiben PAR-2, de una proteína ligante de ant�geno que inhibe PAR-2 y uno o más componentes terapéuticos distintos que tienen propiedades antiinflamatorias (por

ejemplo, agentes antiinflamatorios no esteroideos, esteroides y/o inmunomoduladores), o de una proteína ligante de ant�geno que inhibe PAR-2 y uno o más tratamientos distintos (por ejemplo, cirugía, ultrasonidos, o un tratamiento eficaz para reducir la inflamación). Además, se pueden usar uno o más anticuerpos o derivados de anticuerpo anti-PAR-2 en combinación con una o más moléculas u otros tratamientos, en donde la(s) otra(s) molécula(s) y/o tratamiento(s) no se une(n) o afecta(n) directamente a PAR-2, combinación que sin embargo es eficaz para tratar o prevenir el estado que se trata. En una realización, una o más de las moléculas y/o tratamientos trata(n) o evita(n) un estado que es causado por una o más de las otras moléculas o tratamientos en el curso de la terapia, por ejemplo, náuseas, fatiga, alopecia, caquexia, insomnio, etc. En todos los casos en que se usa una combinación de moléculas y/o otros tratamientos, la(s) molécula(s) y/o el (los) tratamiento(s) individuales se pueden administrar en cualquier orden, durante cualquier período de tiempo, que sea eficaz, por ejemplo, simultánea, consecutiva o alternativamente. En una realización, el método de tratamiento comprende completar un primer curso de tratamiento con una molécula u otro tratamiento antes de comenzar un segundo curso de tratamiento. El período de tiempo entre el final del primer curso de tratamiento y el comienzo del segundo curso de tratamiento puede ser cualquier período de tiempo que permita que el curso total de la terapia sea eficaz, tal como, por ejemplo, segundos, minutos, horas, días, semanas, meses o incluso años.

En otra realización, el método comprende administrar uno o más de los antagonistas de PAR-2 descritos en esta memoria y uno o más tratamientos distintos (por ejemplo, un tratamiento terapéutico o paliativo). Cuando un método comprende administrar más de un tratamiento a un sujeto, se ha de entender que el orden, la regulaci�n temporal, el número, la concentración y el volumen de las administraciones est�n solo limitados por los requisitos m�dicos y las limitaciones del tratamiento; es decir, se pueden administrar dos tratamientos al sujeto, por ejemplo, simultánea, consecutiva o alternativamente o de acuerdo con cualquier otro régimen.

Los ejemplos siguientes, tanto reales como de predicción, se proporcionan con el fin de ilustrar realizaciones o características específicas de la presente invención y no limitan su alcance.

Ejemplo 1: Preparación de anticuerpos monoclonales

Se pueden emplear polip�ptidos de PAR-2 como inmun�genos para generar anticuerpos monoclonales mediante técnicas convencionales, por ejemplo, mediante técnicas descritas en la Patente de EE.UU. n� 5.599.905. En este campo técnico se conocen técnicas adicionales, tal como, por ejemplo, la estrategia de Inmunizaciones Repetitivas en Múltiples Sitios (RIMMS; del inglés, Repetitive Immunizations Multiple Sites) (Kilpatrick et al., Hybridoma 16 (4): 381-9, 1997). Se reconoce que como inmun�genos se pueden emplear polip�ptidos en distintas formas, por ejemplo, proteínas de longitud completa, fragmentos de las mismas, proteínas de fusión tales como fusiones de Fc, células que expresan la proteína recombinante en la superficie celular, etc.

Para resumir un ejemplo de dicho procedimiento, un p�ptido del bucle 1 de PAR-2 (TNRSSKGRSLIGKVDGTS; amino�cidos 29 a 46 de la ID. SEC. n� 2), que tiene un resto de ciste�na C-terminal adicional para facilitar la conjugación, es conjugado con hemocianina de lapa Fissurella (KLH; del inglés, keyhole limpet hemocyanin; obtenible, por ejemplo, de Pierce Biotechnology Inc., Rockford, Illinois), activada con maleimida, para obtener un inmun�geno de PAR-2. Para una primera inmunizaci�n, se emulsionan 100 microgramos de inmun�geno (que contiene 50 microgramos de p�ptido) en adyuvante completo de Freund (CFA; del inglés, complete Freund's adjuvant) en relación vol�mica 1:1 y se inyectan subcut�neamente en un volumen final de 200 microlitros a cada ratón.

Los animales inmunizados son estimulados de tres a cuatro veces más con inmun�geno adicional para aumentar la respuesta específica al ant�geno, a intervalos de dos a cuatro semanas (aunque se pueden emplear intervalos mayores). Por ejemplo, se inyecta subcut�neamente a cada ratón, aproximadamente cuatro semanas después de la inmunizaci�n primaria, una segunda inyección de 50 microgramos de inmun�geno (que contiene 25 microgramos de p�ptido) mezclado con adyuvante incompleto de Freund en un volumen final de 200 μl. Se puede administrar por vía subcutánea y/o intraperitoneal, de aproximadamente 14 a aproximadamente 28 días después de la segunda inyección, una tercera inyección (20 microgramos de inmun�geno que contiene 10 microgramos de p�ptido, mezclado con un adyuvante tal como adyuvante Ribi). Si se desea, se puede administrar por vía subcutánea y/o intraperitoneal, de aproximadamente 14 a aproximadamente 28 días después de la tercera inyección, una cuarta inyección (20 microgramos de inmun�geno que contiene 10 microgramos de p�ptido, mezclado con adyuvante incompleto de Freund). Se administra una inyección final por vía intraperitoneal, normalmente aproximadamente cinco días antes de la fusión, utilizando 50 microgramos de inmun�geno que contiene 25 microgramos de p�ptido en PBS.

Para evaluar el título de anticuerpos, se pueden tomar periódicamente muestras de suero por sangría retroorbital o escisión en la punta de la cola para ensayo mediante ELISA (ensayo de inmunoabsorci�n ligado a enzimas; del inglés, enzyme-linked immunosorbent assay) para p�ptidos u otro ensayo adecuado. En el momento de la fusión, se sacrifican los animales y se recogen esplenocitos y se fusionan con la línea celular SP2/O de mieloma murino (ATCC CRL 1581) u otra línea celular adecuada, varias de las cuales son conocidas en la técnica. Las líneas celulares de hibridoma resultantes son sembradas en múltiples placas para microtitulaci�n, en medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina), para facilitar la proliferaci�n de células híbridas de célula espl�nica-mieloma.

Los clones de hibridoma as� generados son explorados en cuanto a reactividad con PAR-2. En la exploración inicial de los sobrenadantes de hibridomas se puede utilizar un ELISA para p�ptidos, un ELISA para células completas y/o un ensayo de base celular adecuado para exploración de alto rendimiento [tecnología de ensayo fluorom�trico en microvol�menes o FMAT (del inglés, fluorometric microvolume assay technology), sustancialmente del modo descrito 5 por Fiscella et al., Nature Biotechnology 21: 302-307, 2003). Los hibridomas que son positivos en este método de exploración pueden ser adicionalmente cultivados para obtener mayores cantidades de anticuerpo, el cual puede ser luego purificado del modo descrito más adelante y ser explorado mediante un(os) ensayo(s) de base celular adicional(es) (por ejemplo, un ensayo de resolución rápida en placa usando células que coexpresan apoaequorina, una fotoprote�na sensible a Ca2+, sustancialmente del modo descrito por Le Poul et al., J. Biomol. Screen. 7 (1): 57

10 65, 2002, y PAR-2) o un ensayo con un lector de placas mediante obtención de imágenes fluorom�tricas (FLIPR; del inglés, fluorometric imaging plate reader), que se utiliza para determinar cambios en los niveles de Ca2+ intracelular, sustancialmente del modo descrito por S. Pitchford, Genetic Engineering News, volumen 18, número 15 (1998), y/o Sullivan et al., Methods in Molecular Biology, volumen 114, páginas 125-133 (1999).

Los hibridomas seleccionados pueden ser adicionalmente clonados y examinados para asegurar la producción

15 estable de anticuerpo monoclonal. Los hibridomas pueden ser cultivados in vitro, o subcultivados como fluido ascético en mamíferos huésped adecuados. Los anticuerpos monoclonales resultantes pueden ser purificados mediante precipitación con sulfato am�nico seguida de cromatograf�a de exclusión en gel, y/o mediante cromatograf�a de afinidad basada, por ejemplo, en la unión del anticuerpo a proteína G. Se generaron diversos hibridomas y se examinaron en cuanto a la unión en un ELISA con células completas usando células que

20 expresaban PAR-2, y en un ensayo de resolución rápida en placa; los resultados se muestran a continuación en la Tabla 1.

Tabla 1

ID del clon

Unión Bloqueo en ensayo de resolución rápida

n� 47

+ +

n� 21

+ no disponible

n� 48

+ +

n� 6

+ +

n� 15

+ no disponible

n� 13

+ +/–

n� 49

+ +

n� 10

+ –

n� 46

+ +/–

Ejemplo 2: Purificación de anticuerpos de hibridoma anti-PAR-2 para exploración

25 Se cultivan células de hibridoma durante un tiempo y bajo unas condiciones para obtener una muestra de aproximadamente 35 ml de fluido sobrenadante de hibridoma. Se añaden 12 ml de tampón 4x para unión de proteína A (ácido cítrico 1,6 M, Tris 100 mM, pH de 9,15) y aproximadamente 300 μl de una suspensión de medio MabSelect™ (GE Healtcare, Piscataway, New Jersey) al 67% a cada muestra. La suspensión resultante es hecha girar suavemente durante la noche a 4 �C.

30 Después de la incubaci�n durante la noche, las muestras son centrifugadas para que sedimenten la resina y los anticuerpos monoclonales unidos a ella, por ejemplo, a 2000 rpm en un rotor de centrífuga G3.8 (Beckman Coulter, Fullerton, California) durante 5 minutos a 4 �C sin freno. Se separa todo salvo aproximadamente 300 μl del fluido sobrenadante y se resuspende la resina para formar una suspensión concentrada.

Se transfiere la suspensión concentrada a un tubo de microcentr�fuga y se añade suficiente tampón 1x para unión de

35 proteína A (ácido cítrico 400 mM, Tris 25 mM, pH de 8,9) para llevar el volumen total hasta aproximadamente 1 ml. La suspensión es resuspendida y es luego centrifugada a aproximadamente 14.000 g durante 5 segundos. El fluido sobrenadante es separado del sedimento de centrifugaci�n resultante, que es lavado un total de tres veces de un modo similar (es decir, resuspendiendo en aproximadamente 1 ml de tampón 1x para unión de proteína A, centrifugando, separando el sobrenadante y resuspendiendo en tampón fresco).

40 Después de tres lavados, se resuspende el sedimento de centrifugaci�n en 400 μl de tampón de eluci�n (ácido f�rmico 200 mM) y se agita la suspensión durante 10 minutos a temperatura ambiental y luego se centrifuga a

14.000 g durante 5 segundos. El sobrenadante es cuidadosamente separado como producto de eluci�n, y el sedimento de centrifugaci�n es eluido de nuevo de un modo similar al anteriormente descrito para un total de tres ciclos de eluci�n. Los productos de eluci�n de los tres ciclos de eluci�n son combinados, centrifugados a 14.000 g

45 durante 5 minutos a temperatura ambiental y transferidos a un tubo nuevo. Se ajusta el pH a 7,8-8,2 añadiendo Tris

base 2 M (235 mMf) y mezclando rápidamente. Las muestras son de nuevo centrifugadas a 14.000 g durante 5 minutos a temperatura ambiental y son denominadas "Soluble por Cambio de pH". Se lleva a cabo un barrido espectral de cada muestra (diluida al añadir 20 μl de la muestra a 700 μl de agua), de 250 a 350 nm, y se verifica la concentración de proteína cargando 0,5 μg de cada muestra que contiene anticuerpo en un gel reductor al 4-20% para SDS-PAGE con un apropiado anticuerpo patrón.

Ejemplo 3: Purificación y transferencia Western del polip�ptido PAR-2/Fc

Se hace que se exprese el polip�ptido PAR-2 N-terminal de longitud completa/Fc (ID. SEC. n� 5) en células CHO. Los sobrenadantes de expresión de las células de expresión CHO cultivadas en medios exentos de suero contienen una serina proteasa de tipo tripsina de células CHO que escinde PAR-2/Fc por el enlace Arg-Ser de activación, lo que genera la versión "recortada" del polip�ptido PAR-2/Fc. Las células de expresión CHO cultivadas en suero de ternera fetal al 10% (que contiene niveles normales de inhibidores plasm�ticos de proteinasas en concentraciones muy superiores a la concentración de la serina proteasa de tipo tripsina de células CHO) expresan PAR-2 N-terminal de longitud completa/Fc en los sobrenadantes de los cultivos. Tanto las proteínas recortadas como las de longitud completa son purificadas usando la resina MabSelect™, sustancialmente del modo previamente descrito (véase el Ejemplo 2). Las construcciones de Fc purificadas resultantes son analizadas por análisis amino-terminal de secuencias (degradación de Edman), cromatograf�a de exclusión por tamaños, barrido espectral de absorbancias, y espectrometr�a de masas.

Se someten diversas cantidades de PAR-2 N-terminal de longitud completa y recortado/Fc purificado a SDS-PAGE usando geles de poliacrilamida al 8-16% en gradiente (geles Novex, Invitrogen Life Technologies) en un sistema tampón de Tris-glicocola. También se incluyen carriles de gel que contienen patrones See Blue (Novex, Invitrogen Life Technologies) para la identificación de pesos moleculares. Después de la electroforesis, se transfieren las proteínas de los geles a membranas de nitrocelulosa usando un módulo de transferencia Novex XCell II (Invitrogen Life Technologies). Se bloquean las membranas con tampón de bloqueo Odyssey (OBB; del inglés, Odyssey blocking buffer) (LI-COR Biosciences):disolución salina tamponada con Tris (TBS; del inglés, Tris buffer saline), 1:1, durante la noche a 4 �C con sacudimiento. Los anticuerpos que se van a analizar son diluidos en OBB:TBS 1:1 a una concentración final deseada durante 1 hora a temperatura ambiental. Las membranas son lavadas a fondo con Tween 20 al 0,1% en TBS (3-4 cambios de 100 ml a lo largo de ~ 1 hora). Las membranas son luego expuestas al apropiado producto de conjugación de anticuerpo secundario (IgG anti-conejo generada en cabra, o IgG anti-ratón generada en cabra)-Alexa 680 (Molecular Probes, Invitrogen Life Technologies), diluido a 1:5000 en OBB:TBS (1:1), durante 1 hora a temperatura ambiental. Las membranas son lavadas del modo anteriormente descrito y, si se desea, son analizadas usando un sistema LI-COR Odyssey para obtención de imágenes infrarrojas (LI-COR Biosciences).

Ejemplo 4: Comparación de anticuerpos PAR-2

Se examinaron varios anticuerpos PAR-2 en diferentes formatos de ensayo; en la Tabla 2 se resumen los resultados.

Tabla 2

IC50

Unión al sitio de escisión

N� de ID del clon

(preclonaci�n) Cadena arriba Cadena abajo

47

8 nM xxx –

49

35 nM xx –

6

40 nM xx –

13

50 nM xx –

15

50 nM xx –

48

60 nM xx –

10

> 1 mM xx xxx

46

> 0,5 mM xxx xx

Se determinaron los valores de IC50 mediante el ensayo FLIPR para movilización de Ca2+ previamente descrito; se determin� la unión a la región cadena arriba del sitio de escisión frente a la región cadena abajo del sitio de escisión usando el ensayo por transferencia Western previamente descrito. En la Figura 1 se muestran resultados más detallados para un anticuerpo seleccionado. En la Figura 2 se presentan resultados de transferencias Western en que se analizaron varios anticuerpos por transferencia Western frente al PAR-2 escindido (indicado "clip")/Fc y el PAR-2 de longitud completa (indicado FL; del inglés, full-length)/Fc. En la Figura 3 se presentan resultados adicionales de transferencias Western y también comparaciones de las características de dos anticuerpos monoclonales que presentan un contraste en el reconocimiento de PAR-2 de longitud completa frente al recortado/Fc, que, como se detalla en la transparencia, se corresponde con la capacidad para producir antagonismo sobre PAR-2. De este modo, el clon 10 era un débil antagonista en un ensayo de resolución rápida en placa, se unía a células que expresan PAR-2 humano (células HCT116), y a células CHO transfectadas con PAR-2 por medio de FACS, pero no a células CHO originarias, y se unía a las versiones tanto recortada como de longitud completa de PAR-2/Fc por transferencia Western. Por contraste, el clon 33 era un potente antagonista en un ensayo de

5 resolución rápida en placa, se unía a células que expresan PAR-2 humano (células HCT116), y a células CHO transfectadas con PAR-2 por medio de FACS, pero no a células CHO originarias, y sólo se unía a la versión de longitud completa de PAR-2/Fc por transferencia Western.

Ejemplo 5: Comparación de subclones de anticuerpos PAR-2

Se subclonaron diversos anticuerpos PAR-2 y se examinaron en cuanto a la capacidad para inhibir la activación de 10 PAR-2 inducida por tripsina; en la Tabla 3 se resumen los resultados.

Tabla 3

IC50

IC50

N� de ID del clon

HCT-116 KNRK

13-8 prep 1

8 nM 471 nM

13-8 prep 2

12 nM 188 nM

6-6

3 nM 1556 nM

21-5

8 nM 340 nM

47.6

2 nM 254 nM

47.7

2 nM 48 nM

49.2

5 M 152 nM

SAM11

> 2 μM > 2 μM

Se determinaron los valores de IC50 mediante un ensayo FLIPR en que se controla la movilización de Ca2+, del modo previamente descrito, usando células que expresan end�genamente PAR-2 humano (HCT-116) o células KNRK de 15 rata establemente transfectadas que expresan PAR-2 (KNRK-PAR2). Se usaron dos preparaciones de purificación diferentes del subcl�n 13-8; una (prep n� 1) fue cultivada y purificada a una escala mayor que la previamente descrita, pero sustancialmente de la misma manera. SAM11 es un anticuerpo monoclonal comercialmente asequible hacia PAR-2 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, California, EE.UU.), generado contra la secuencia del ligando atado de PAR-2 humano. En las transferencias Western en que se usaron las formas recortada y de longitud

20 completa de PAR-2 (previamente descritas), SAM11 se unía a las versiones tanto recortada como de longitud completa de PAR-2/Fc, lo que confirma que el ep�topo del anticuerpo SAM11 est� cadena abajo del sitio de escisión por proteasas. En la Figura 4 se muestran los resultados de un experimento similar usando células HCT-116. En este experimento también se incluye un antisuero monoespec�fico policlonal generado contra el p�ptido de 16 mon�meros del bucle 1, descrito en el Ejemplo 1.

LISTA DE SECUENCIAS

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una proteína ligante de ant�geno aislada, que es un anticuerpo monoclonal, que se une al receptor 2 activado por proteinasas (PAR-2) y produce antagonismo de la activación proteol�tica del mismo, en donde la proteína ligante de ant�geno aislada se une al PAR-2 de longitud completa que se expone en la ID. SEC. n� 2 y se une en menor grado

   5 al PAR-2 que se expone en la ID. SEC. n� 2 cuando es escindido entre R36 y S37.
2. 2. La proteína ligante de ant�geno aislada de la Reivindicación 1, que se une específicamente al PAR-2 de un primate no humano, un macaco cangrejero, un chimpancé, un mamífero no primate, un roedor, un ratón, una rata, un h�mster, un cobayo, un gato o un perro.
3. 3. La proteína ligante de ant�geno aislada de la Reivindicación 1, en donde dicha proteína ligante de ant�geno 10 comprende:

   a.

   un anticuerpo humanizado;

   b.

   un anticuerpo quimérico;

   c.

   un fragmento de anticuerpo, ligante de ant�geno;

   d. un fragmento Fab; o 15 e. un fragmento F(ab')2.

4. 4.

   Una célula aislada que secreta una proteína ligante de ant�geno de la Reivindicación 1, en donde la célula es un hibridoma.

5. 5.

   Un método para preparar una proteína ligante de ant�geno que se une a PAR-2, que comprende incubar la célula aislada de la Reivindicación 4 bajo unas condiciones que la permiten expresar la proteína ligante de ant�geno.

   20 6. Una composición farmacéutica que comprende la proteína ligante de ant�geno de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.

6. 7.

   La composición farmacéutica de la Reivindicación 6 para uso en el tratamiento de un estado de un sujeto, en donde el estado es tratable por reducción de la actividad de PAR-2 en el sujeto.

7. 8.

   La composición de la Reivindicación 7, en donde el sujeto es un ser humano.

   25 9. La composición de la Reivindicación 8, en donde dicho estado es seleccionado del grupo que consiste en estados inflamatorios de la piel, las articulaciones, el sistema gastrointestinal y/o las vías aéreas.

8. 10. La composición de la Reivindicación 8, en donde la reducción de la actividad de PAR-2 en el sujeto es por disminución de la se�alizaci�n de PAR-2 en el sujeto.

   Figura 1

   Figura 2

   Figura 3

   Figura 4