CN112229996A - 蛋白酶激活受体2作为宫颈癌转移检测标志物的应用 - Google Patents

蛋白酶激活受体2作为宫颈癌转移检测标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了蛋白酶激活受体2作为宫颈癌转移检测标志物的应用。本申请研究发现一种新的宫颈癌转移检测标志物，即蛋白酶激活受体2，通过检测蛋白酶激活受体2的表达情况，不仅可以准确有效的检测宫颈癌转移，而且能够预测宫颈癌转移部位，评估宫颈癌转移的风险；为宫颈癌检测、治疗和预后提供了一种新的方案。

Description

蛋白酶激活受体2作为宫颈癌转移检测标志物的应用
技术领域
本申请涉及宫颈癌检测技术领域，具体涉及蛋白酶激活受体2作为宫颈癌转移检测标志物的应用。
背景技术
转移是恶性肿瘤的主要特征，也是影响患者治疗效果和预后的主要原因。除了癌细胞的遗传背景外，微环境的改变已成为调节肿瘤转移进程的重要因素。在过去的十年里，人们越来越关注癌细胞周围的微环境及其在肿瘤转移中的作用。肿瘤浸润前沿的微环境可能使癌细胞获得异常高的运动能力，并穿透周围基质。值得注意的是，肿瘤的浸润前沿富含多种蛋白酶，通过细胞外基质的重塑促进肿瘤的侵袭和转移，促进细胞的迁移。
宫颈癌(缩写CESC)起源于子宫颈，子宫颈是子宫的下端，与上阴道接触。根据世界卫生组织2018年的统计，出处参考http://gco.iarc.fr/today/home，宫颈癌在全球所有女性癌症发病率和死亡率中排名第四。预测和控制癌症转移可有效降低宫颈癌患者的死亡率。
但是，目前缺乏有效的宫颈癌转移检测方案，难以准确预测宫颈癌的转移，不利于宫颈癌的治疗、控制和预后评估。
发明内容
本申请的目的提供一种新的宫颈癌转移检测标志物及其应用。
为了实现上述目的，本申请采用了一下技术方案：
本申请的第一方面公开了蛋白酶激活受体2(缩写PAR2)作为宫颈癌转移检测标志物的应用。
需要说明的是，本申请研究发现在肿瘤组织的侵袭边缘前面能够观察到大量的PAR2高表达的阳性细胞，PAR2的异常表达与宫颈癌转移紧密相关，并通过随机森林模型验证了PAR2可以作为宫颈癌转移的预后因子；因此，本申请创造性的提出将PAR2作为宫颈癌转移检测标志物，为宫颈癌转移检测提供了一种新的方向和思路。
本申请的第二方面公开了蛋白酶激活受体2在制备宫颈癌转移检测试剂中的应用。
需要说明的是，本申请研究发现PAR2可以作为宫颈癌转移检测标志物，因此，在此基础上，本领域技术人员可以根据PAR2的检测技术研发出相应的用于检测宫颈癌转移的试剂。
优选的，本申请的蛋白酶激活受体2在制备宫颈癌转移检测试剂中的应用，主要包括通过检测蛋白酶激活受体2的表达情况，判断宫颈癌是否有转移、宫颈癌的转移部位或宫颈癌转移的可能性。
本申请的第三方面公开了蛋白酶激活受体2在制备宫颈癌治疗或宫颈癌转移控制的药物中的应用。
需要说明的是，本申请研究发现PAR2的异常表达与宫颈癌转移紧密相关，因此，可以通过检测PAR2的表达情况判断宫颈癌的治疗效果或者宫颈癌转移控制的效果，起到药物筛选或评估的作用，从而可以用于制备相应的药物。
优选的，本申请的蛋白酶激活受体2在制备宫颈癌治疗或宫颈癌转移控制的药物中的应用，主要包括通过检测蛋白酶激活受体2的表达情况，筛选或评估所述药物对宫颈癌治疗或宫颈癌转移控制的效果。
本申请的第四方面公开了一种用于宫颈癌转移检测的试剂盒，包括能够特异性的检测蛋白酶激活受体2表达情况的抗体和/或核苷酸片段。
需要说明的是，本申请研究发现PAR2的异常表达与宫颈癌转移紧密相关，因此，可以将检测PAR2表达情况的试剂组装成试剂盒，以便于宫颈癌转移检测。可以理解，对于PAR2表达情况检测，一般包括两种方案，即基于抗体和抗原免疫反应的检测，以及基因表达量的检测。因此，本申请的试剂盒中可以是能够特异性的检测蛋白酶激活受体2表达情况的抗体，或者能够特异性的检测蛋白酶激活受体2表达情况的核苷酸片段，或者两者同时具备。其中，核苷酸片段主要是指特异性检测蛋白酶激活受体2基因的引物和探针。具体的引物和探针序列可以根据现有的蛋白酶激活受体2基因序列，按照引物和探针的常规设计方案获得，在此不作具体限定。
优选的，本申请的试剂盒中，抗体包括独立包装的一抗和二抗，一抗为兔抗人多克隆抗体PAR2；二抗为two-step
Figure BDA0002649872530000021
Poly-HRP抗鼠/兔IgG。
需要说明的是，本申请限定的一抗和二抗只是本申请的一种实现方式中具体采用的能够特异性检测蛋白酶激活受体2表达情况的抗体，不排除还可以采取其它抗体。
优选的，本申请的试剂盒还包括独立包装的用于组织免疫染色、蛋白质印迹、蛋白芯片或Western Blot检测的试剂。
需要说明的是，针对基于抗体和抗原免疫反应的检测，本申请的试剂盒中根据具体采用的免疫检测方案，还可以包括相应的常规试剂，以便于宫颈癌转移检测，例如组织免疫染色试剂、蛋白质印迹检测试剂、蛋白芯片检测试剂或Western Blot检测试剂等；当然，这些试剂也可以直接通过市售购买获得。
优选的，本申请的试剂盒还包括独立包装的用于核酸检测的试剂。
需要说明的是，针对基因表达量检测的方案，本申请的试剂盒中根据具体的核酸检测技术，还可以包括相应的核酸检测试剂，以便于宫颈癌转移检测，例如实时荧光PCR检测试剂、基因芯片检测试剂等；当然，这些试剂也可以直接通过市售购买获得。
优选的，本申请的试剂盒还包括独立包装的已知浓度的蛋白酶激活受体2阳性对照或已知拷贝数的蛋白酶激活受体2基因重组质粒阳性对照。
其中，已知浓度的蛋白酶激活受体2阳性对照主要用于针对基于抗体和抗原免疫反应的检测；已知拷贝数的蛋白酶激活受体2基因重组质粒阳性对照主要用于针对基因表达量检测的方案。可以理解，阳性对照的作用是判断检测过程是否正确，可以根据需要增加到本申请的试剂盒中，也可以在使用时自行设计阳性样品作为对照，在此不作具体限定。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请研究发现一种新的宫颈癌转移检测标志物，即蛋白酶激活受体2，通过检测蛋白酶激活受体2的表达情况，不仅可以准确有效的检测宫颈癌转移，而且能够预测宫颈癌转移部位，评估宫颈癌转移的风险。
附图说明
图1为本申请实施例中慢性宫颈炎组织中的PAR2表达染色结果图；
图2为本申请实施例中宫颈癌相邻宫颈黏膜的PAR2表达染色结果图；
图3为本申请实施例中宫颈癌组织中的PAR2表达染色结果图；
图4为本申请实施例中高分化的宫颈癌组织中的PAR2表达染色结果图；
图5为本申请实施例中中分化的宫颈癌组织中的PAR2表达染色结果图；
图6为本申请实施例中低分化的宫颈癌组织中的PAR2表达染色结果图；
图7为本申请实施例中有转移的宫颈癌组织中的PAR2表达染色结果图；
图8为本申请实施例中无转移的宫颈癌组织中的PAR2表达染色结果图；
图9为本申请实施例中宫颈癌侵袭前沿中的PAR2表达染色结果图；
图10为本申请实施例中PAR2模型与CEA模型的ROC曲线；
图11为本申请实施例中PAR2模型与CEA模型的Bootstrap重复采样500次的预测宫颈癌转移的曲线图；
图12为本申请实施例中利用机器学习在随机森林模型中对PAR2模型各个预测变量的重要性排序图；
图13为本申请实施例中PAR2模型与CEA模型的临床实用性比较的决策曲线分析图。
具体实施方式
蛋白酶激活受体(PARs)是G蛋白偶联受体(GPCRs)的一个亚组，是由活性和柔性肿瘤微环境中存在的可溶性和基质固定化蛋白酶激活的四个成员的家族。到目前为止，发现了四个PAR家族成员：PAR1、PAR2、PAR3和PAR4。研究显示，PAR2在结肠癌细胞的维持中起重要作用，PAR1和PAR4基因的高表达在宫颈癌的发生发展中起到一定的作用；但是，PAR2在宫颈癌或宫颈癌转移中的作用尚未有相关研究和报道。
本申请的发明人使用组织芯片鉴定PAR2的表达和临床病理分期的关系，并且通过分析TCGA数据库中宫颈癌患者信息，显示PAR2在CESC转移准确性方面的预测价值。因此，PAR2表达模式是导致SECSC患者预后较差的危险因素。
基于以上研究和认识，本申请创造性的提出蛋白酶激活受体2作为宫颈癌转移检测标志物的应用，为准确有效的检测宫颈癌转移提供了一种新的方向和思路。
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。除非特别说明，以下实施例中采用的仪器、材料都是实验室常规使用的器材。
实施例
一、材料和方法
1.主要材料
组织芯片购自Outdo Biotech Co.,Ltd；兔抗人多克隆抗体PAR2购自Abcam Co.,Cambridge,MA,USA；two-step
Figure BDA0002649872530000041
Poly-HRP抗鼠/兔IgG检测系统购自无锡OriGene；119例宫颈癌患者标本由深圳市第二人民医院提供。
2.PAR2表达水平与宫颈癌转移试验
对宫颈癌组织芯片进行PAR2免疫组化研究。所有标本均按肿瘤转移TNM分类系统进行分类，免疫组化步骤如下：
(1)烤片：75℃，30分钟；
(2)脱蜡：TO(I)浸泡，15分钟；TO(II)浸泡，15分钟；
(3)复水：100％乙醇浸泡，1分钟；90％乙醇浸泡，1分钟；80％乙醇浸泡，1分钟；70％乙醇浸泡，1分钟；蒸馏水浸泡，1分钟；
(4)抗原修复：采用福州迈新科技修复液5mL+去离子水245mL配制本例的修复液；采用本例配制的修复液修复抗原，具体的，100℃预热修复液3分钟20秒，放入组织芯片，100℃加热20秒，修复抗原，取出室温冷却20分钟；
(5)浸泡入H2O2，封闭15分钟；
(6)封闭完成后，采用0.01M的PBS洗涤组织芯片3分钟；
(7)滴加数滴一抗，4℃孵育15-17小时；本例采用的一抗为兔抗人多克隆抗体PAR2(Abcam Co.,Cambridge,MA,USA)，按照1:100稀释使用；
(8)复温至室温，30-60分钟；
(9)0.01M的PBS洗涤，3分钟，洗3次；
(10)加入2滴二抗，室温孵育15分钟；本例采用的二抗为two-step
Figure BDA0002649872530000051
Poly-HRP抗鼠/兔IgG检测系统，购自OriGene,无锡；
(11)0.01M PBS洗涤，3分钟，洗3次；
(12)DAB显色试剂盒购自福州迈新科技，按照1：1：1配制显色液，滴加数滴，显色1-5分钟；
(13)观察颜色变化，加入蒸馏水冲洗，终止反应；
(14)滴加苏木素复染5-10秒；
(15)去离子水洗涤10分钟；
(16)脱水：70％乙醇浸泡，1分钟；80％乙醇浸泡，1分钟；90％乙醇浸泡，1分钟；100％乙醇，1分钟；TO(I)，1分钟；TO(II)，1分钟；
(17)中性树胶封片。
染色结果由两位独立的有经验的病理医师在光学显微镜下随机选取5个视野中进行独立阅片。
3.PAR2模型的构建
为了确定PAR2是否可以作为宫颈癌的转移性预后因子，本例从TCGA数据库下载了127名宫颈癌患者的数据，并进行ROC诊断分析。根据下载获得的127名宫颈癌患者的数据，本例建立了两个预测模型，分析PAR2在宫颈癌转移中的预测价值，即CEA模型和PAR2模型。CEA模型作为对照参考，本例的CEA模型，主要是指CEACAM5；其模型数据中包括诊断年龄、身体质量指数(缩写BMI)、妊娠总次数、患者吸烟史类别、肿瘤类型、原发淋巴结评估、癌症状态和代表典型癌胚抗原的CEACAM5表达水平。PAR2模型中，将CEA模型中的CEACAM5表达水平替换为PAR2表达水平，其他纳入因素与CEA模型一致。并采用机器学习方法验证PAR2模型中危险因素的重要性。
所有统计分析均使用Empower Stats软件(www.Empower Stats.com、X&Ysolutions，Inc.BostonMA)进行。数据结果显示为mean±SD，P值小于0.05被认为具有统计学意义。
二、试验结果
1.TNM分类结果
本例对进行试验的119例宫颈癌患者标本进行TNM系统分类，结果如表1所示。表1的结果显示，T1-T2期为96例，T3-T4为23例；N0为97例，N1为22例；M0为119例。
表1宫颈癌患者TNM分类情况
Figure BDA0002649872530000061
Figure BDA0002649872530000071
2.宫颈癌组织芯片染色结果
本例采用组织芯片(TMA)免疫组织化学染色法检测119例宫颈癌患者标本和相邻宫颈黏膜的PAR2表达。IHC染色结果显示PAR2在宫颈癌组织中表达较强，但在宫颈粘膜正常上皮组织和慢性宫颈炎组织中表达较弱，结果如图1至图3所示；其中，图1为在慢性宫颈炎组织中的PAR2表达染色结果图，图2为相邻宫颈黏膜的PAR2表达染色结果图，即癌旁的正常上皮组织，图3为在宫颈癌组织中的PAR2表达染色结果图。
此外，PAR2在低分化肿瘤中的表达要比在高分化或中度分化的宫颈肿瘤中更容易观察到，结果如图4至图6所示；其中，图4为在高分化的宫颈癌组织中的PAR2表达染色结果图，图5为在中分化的宫颈癌组织中的PAR2表达染色结果图，图6为在低分化的宫颈癌组织中的PAR2表达染色结果图。本例没有发现肿瘤Ⅰ期和Ⅱ期的表达差异，但在Ⅲ期，淋巴转移组与非转移组相比表达上调，结果如图7和图8所示；其中，图7为在淋巴转移组有转移的宫颈癌组织中的PAR2表达染色结果图，图8为在非转移组无转移的宫颈癌组织中的PAR2表达染色结果图。值得注意的是，较大数量的PAR2阳性细胞通常在肿瘤组织的侵袭边缘前面观察到，结果如图9所示；图9为在宫颈癌侵袭前沿中的PAR2表达染色结果图，其中，左图为100倍放大视图，右图为400倍放大视图。
以上结果显示，PAR2的异常表达与CESC转移部位紧密相关，通过PAR2表达情况的检测可以判断宫颈癌是否有转移，预测宫颈癌转移部位，对宫颈癌转移的可能性进行评估。
3.PAR2模型
本例采用127名宫颈癌患者的数据进行CEA模型和PAR2模型构建，其中，127名宫颈癌患者的统计数据如表2所示。
表2 127名宫颈癌患者的模型数据
Figure BDA0002649872530000081
Figure BDA0002649872530000091
Figure BDA0002649872530000101
表2中，转移分期代码：0＝无远处转移，1＝远处转移；BMI(Kg/cm2)；吸烟史类别：1＝从未吸烟，2＝当前吸烟(包括规律吸烟者和偶尔吸烟者)，3＝戒烟>15年，4＝戒烟<15年，5＝戒烟，戒烟时间不详；肿瘤类别：1＝宫颈腺鳞癌，2＝宫颈鳞状细胞癌，3＝宫颈内膜腺癌，4＝宫颈内膜粘液性腺癌，5＝子宫内膜腺癌，6＝普通宫颈内膜腺癌；原发淋巴结评估：0＝在原发疾病时进行了淋巴结评估，1＝在原发疾病时未进行淋巴结评估；患者癌症状态：0＝无肿瘤，1＝有肿瘤。
模型构建结果显示，在CEA模型中，其曲线下面积(AUC)为0.790(95％CI＝0.712-0.870)，在最佳cut-off值的敏感性为55.0％，特异性为89.6％；在PAR2模型中，AUC为0.833(95％CI＝0.763～0.903)，在相应阈值下的敏感性为70％，特异性为85.1％；结果如图10和图11所示；其中，曲线下面积(area under the curve，AUC)分析基于TCGA数据库队列；图10为观测者操作特性曲线(Receiver operating characteristic，ROC)，图11为PAR2模型与CEA模型的Bootstrap重复采样500次的预测宫颈癌转移的曲线图。两个预测模型的P值都小于0.05(P＝0.028)。PAR2模型与CEA模型相比，在最佳cut-off值下特异性接近，而灵敏度增加了27.3％(81.6％～67.3％)。在图11中，Bootstrap重复采样500次表现出相同的结果，即CEA模型的AUC＝0.792，95％CI＝0.713-0.856，特异性＝0.896，灵敏度＝0.550，PAR2模型的AUC＝0.830，95％CI＝0.765-0.893，特异性＝0.851，灵敏度＝0.700；P＝0.045。以上结果显示，PAR2可以作为预测宫颈癌癌症患者转移可能性的重要指标。
采用机器学习方法验证PAR2模型中危险因素的重要性，结果如图12所示，图12为利用机器学习在随机森林模型中对PAR2模型各个预测变量的重要性排序。图12的结果显示，PAS2表达水平作为随机森林模型中除BMI外的第二个重要预测变量。以上结果说明，PAR2可以作为宫颈癌转移的预后因子。
对比分析临床决策曲线分析PAR2模型与CEA模型对宫颈癌转移的预测价值，结果如图13所示；图13为两种模型的临床实用性比较的决策曲线分析图，其X轴上绘制了癌转移的阈值概率，Y轴绘制了模型的标准净效益。图13中，模型曲线、全线治疗和无线治疗之间的面积代表了每个模型的临床有用性。图13的结果显示，在相对较大的阈值下，PAR2模型比CEA模型具有更好的成本效益。即，假定选择预测概率为80％诊断CESC转移并进行提前干预，那么每100人使用PAR2模型进行预测的患者，有21人能从中获益而不损伤任何其它人的利益；而使用CEA模型的患者，每100人中仅有4人能从中获益而不损伤任何其它人的利益。以上结果说明，相对于CEA模型，本例构建的PAR2模型具有更高的宫颈癌转移预测临床实用性和使用价值，PAR2能够更准确有效的预测宫颈癌转移。
以上试验证实了PAR2能够作为宫颈癌转移检测的标志物，通过PAR2表达情况的检测，能够判断宫颈癌是否有转移，预测宫颈癌转移部位，并对宫颈癌转移的可能性进行评估，PAR2可以作为宫颈癌转移的预后因子。可以理解，在此基础上，根据PAR2设计检测其表达情况的抗体或引物探针，即可获得用于宫颈癌转移检测的试剂；也就是说，蛋白酶激活受体2能够用于制备宫颈癌转移检测的试剂或试剂盒。进一步的，由于PAR2的异常表达与宫颈癌转移紧密相关，通过检测PAR2的表达情况，即可判断待测药物对宫颈癌治疗或者宫颈癌转移控制的效果，因此，蛋白酶激活受体2能够用于筛选或评估待测药物，从而制备出治疗效果良好的宫颈癌治疗药物或宫颈癌转移控制药物。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (10)

1.蛋白酶激活受体2作为宫颈癌转移检测标志物的应用。
2.蛋白酶激活受体2在制备宫颈癌转移检测试剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：包括通过检测蛋白酶激活受体2的表达情况，判断宫颈癌是否有转移、宫颈癌的转移部位或宫颈癌转移的可能性。
4.蛋白酶激活受体2在制备宫颈癌治疗或宫颈癌转移控制的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：包括通过检测蛋白酶激活受体2的表达情况，筛选或评估所述药物对宫颈癌治疗或宫颈癌转移控制的效果。
6.一种用于宫颈癌转移检测的试剂盒，其特征在于：包括能够特异性的检测蛋白酶激活受体2表达情况的抗体和/或核苷酸片段。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述抗体包括独立包装的一抗和二抗，所述一抗为兔抗人多克隆抗体PAR2；所述二抗为two-step
Figure FDA0002649872520000011
Poly-HRP抗鼠/兔IgG。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：还包括独立包装的用于组织免疫染色、蛋白质印迹、蛋白芯片或Western Blot检测的试剂。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：还包括独立包装的用于核酸检测的试剂。
10.根据权利要求6-9任一项所述的试剂盒，其特征在于：还包括独立包装的已知浓度的蛋白酶激活受体2阳性对照或已知拷贝数的蛋白酶激活受体2基因重组质粒阳性对照。
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