JP6691337B2 - 膀胱癌患者の予後を予測するための方法 - Google Patents
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Description
(1)DJ−1タンパク質に対する特異的結合物質を有効成分として含有する、尿路上皮癌診断薬。
(2)被検者由来の血清又は血漿を試料に用いるものである、(1)に記載の尿路上皮癌診断薬。
(3)逆相タンパク質アレイ用である、(1)又は(2)に記載の尿路上皮癌診断薬。
(4)被検者由来の生体試料を固相に固定する工程と、DJ−1タンパク質に対する特異的結合物質を前記生体試料に接触させる工程と、前記生体試料に結合した前記特異的結合物質の量が対照と比較して多い場合に、前記生体試料は尿路上皮癌患者由来のものであると判定する工程と、を備える、生体試料の判定方法。
(5)前記生体試料は血清又は血漿である、(4)に記載の判定方法。
(6)膀胱癌患者の予後を予測する方法であって、前記患者由来の膀胱癌組織試料におけるDJ−1タンパク質の発現を検出する工程と、前記試料中の腫瘍細胞の核におけるDJ−1タンパク質の発現が、対照と比較して低下していた場合に、前記患者の予後が不良であると予測する工程と、を備える方法。
(7)前記予測する工程が、前記試料中の腫瘍細胞の核におけるDJ−1タンパク質の発現が、対照と比較して低下しており、且つ前記試料中の腫瘍細胞の細胞質におけるDJ−1タンパク質の発現が、対照と比較して増加していた場合に、前記患者の予後が不良であると予測する工程である、(6)に記載の方法。
1実施形態において、本発明は、DJ−1タンパク質に対する特異的結合物質を有効成分として含有する、尿路上皮癌診断薬を提供する。
1実施形態において、本発明は、被検者由来の生体試料を固相に固定する工程(a)と、DJ−1タンパク質に対する特異的結合物質を前記生体試料に接触させる工程(b)と、前記生体試料に結合した前記特異的結合物質の量が対照と比較して多い場合に、前記生体試料は尿路上皮癌患者由来のものであると判定する工程(c)と、を備える、生体試料の判定方法を提供する。
本工程において、被検者由来の生体試料を固相に固定する。固相としては、スライドガラス、イムノプレート、膜、ビーズ等が挙げられる。固相は、タンパク質を吸着しやすいよう表面処理を施されていることが好ましい。
本工程において、上記固相に固定した生体試料とDJ−1タンパク質に対する特異的結合物質とを接触させる。特異的結合物質としては上述したものが挙げられる。
本工程において、生体試料に結合した特異的結合物質の量が対照と比較して多い場合に、生体試料は尿路上皮癌患者由来のものであると判定する。
1実施形態において、本発明は、膀胱癌患者の予後を予測する方法であって、前記患者由来の膀胱癌組織試料におけるDJ−1タンパク質の発現を検出する工程と、前記試料中の腫瘍細胞の核におけるDJ−1タンパク質の発現が、対照と比較して低下していた場合に、前記患者の予後が不良であると予測する工程と、を備える方法を提供する。
(膀胱癌組織)
北里大学病院において外科的に摘出された92例の膀胱癌組織(以下、「膀胱癌外科組織」という場合がある。)と経尿道的膀胱腫瘍切除術(TUR−BT)で得られた60例のpT1 High Grade(G3)の膀胱癌組織(以下、「T1 G3 TUR−BT組織」という場合がある。)を用いた。それぞれの臨床病理学的因子について表1及び表2に示す。
北里大学病院において採取された、192例の尿路上皮癌患者血清、並びに、非腫瘍性疾患として20例の尿路結石患者血清及び100例の健常者血清を用いた。用いた血清の内訳を表3に示す。
《免疫組織化学染色法》
10%ホルマリン固定後パラフィン包埋された膀胱癌組織を厚さ3μmに薄切した切片を用いて免疫組織化学染色を行った。
外科摘出組織中の腫瘍細胞の核の染色においては、同一症例中に含まれる正常尿路上皮、末梢神経組織又は血管内皮細胞の核の染色性をインターナルコントロールとし、コントロールと同程度又はより強い染色性を示す症例を発現陽性群(+群)とした。また、コントロールよりも低い染色性又は染色性の消失を示す症例を発現陰性群(−群)とした。
《逆相タンパク質アレイ法》
膀胱癌患者血清、尿路結石患者血清、健常者血清をそれぞれ、0.01% Triton X−100/D−PBS(−)を用いて15倍希釈後、1症例につき4スポットずつ専用の装置(型式「VP478A」、V&P Scientific社)を用いてRPPA用のスライドグラス(型式「DNAマイクロアレイ用コートスライドグラス」MATSUNAMI GLASS社)にドットした。
濃度既知のDJ−1タンパク質を段階希釈して得られた検量線において、希釈濃度0.3ng/μLから10ng/μLの間で直線性が得られたため、アレイ用スキャナーにより得られた、DJ−1タンパク質1ng/μLにおける平均のシグナル値を計算し、それぞれの症例におけるシグナル値からDJ−1タンパク質の濃度を算出した。算出後、濃度が0.3ng/μL以下のものは測定限界であるとして0ng/μLとした。また、10ng/μLを測定上限として、それ以上の症例は全て10ng/μLとした。
《T24細胞株へのDJ−1 siRNAの導入》
膀胱癌由来細胞株T24を、24ウェルプレート(住友ベークライト株式会社)に細胞数が1.0×105個/ウェルとなるように播種し、10%非動化ウシ胎児血清を添加したRPMI−1640培地(和光純薬)で37℃、5%CO2/95%空気の条件下で24時間培養した。
siRNA導入群と未導入群の各細胞からタンパク質を抽出し、SDS−PAGE及び免疫ブロット法により、DJ−1をノックダウンできていることを確認した。
24ウェルプレートにBD Falcon Cell Culture Inserts(BDバイオサイエンス社)を挿入し、Corning Matrigel基底膜マトリックス(Corning社)を入れ、2時間室温でコーティングした。
BD Falcon Cell Culture Insertsの下面に浸潤した細胞数を、顕微鏡を用いて倍率200倍で任意の5視野分数えて浸潤細胞数の平均を算出した。
トランスフェクション後24時間経過した、DJ−1タンパク質の発現が抑制された細胞と未処理の細胞が入ったウェルを200μLのピペットチップで引っ掻いて細胞をはがし、一定幅の溝を作製した。その後24時間培養し、実験開始直後(0時間)と24時間後の溝の修復度合いをカメラで撮影し、評価した。
免疫組織化学染色における臨床病理学的因子との関連性はカイ2乗検定により算出し、患者の予後に関しては全生存期間Overall Survival(OS)と5年生存率について細胞内における染色性の違いに基づきKaplan−Meier曲線を描き、Log−rank testにより評価した。
(膀胱癌外科摘出組織の免疫組織化学染色)
膀胱癌外科摘出組織を免疫組織化学染色し、DJ−1タンパク質の発現を検討した。図1(a)〜(e)は、免疫組織化学染色の結果を示す写真である。図1(a)は正常尿路上皮の写真であり、図1(b)〜(e)は膀胱癌組織の写真である。スケールバーは50μmを示す。
(T1 G3 TUR−BT組織における免疫組織化学染色)
T1 G3 TUR−BT組織を免疫組織化学染色し、DJ−1タンパク質の発現を検討した。図3(a)及び(b)は、免疫組織化学染色の結果を示す写真である。
(逆相タンパク質アレイ法による血中DJ−1タンパク質量の測定)
続いて、健常者血清、尿路結石患者血清及び原発性膀胱癌患者血清中のDJ−1タンパク質量を逆相タンパク質アレイ法により測定した。
(DJ−1特異的siRNAを用いた細胞浸潤アッセイ)
T24細胞株にDJ−1特異的siRNAを導入し、細胞浸潤アッセイを行った。対照にはsiRNAを導入していないT24細胞株を用いた。
(DJ−1特異的siRNAを用いたWound Healing Assay)
T24細胞株にDJ−1特異的siRNAを導入し、Wound Healing Assayを行った。対照にはsiRNAを導入していないT24細胞株を用いた。
Claims (2)
- 膀胱癌患者の予後を予測するための方法であって、
前記患者由来の膀胱癌組織試料におけるDJ−1タンパク質の発現を検出する工程を備え、
前記試料中の腫瘍細胞の核におけるDJ−1タンパク質の発現が、対照と比較して低下していたことが、前記患者の予後が不良であることを示す、方法。 - 前記試料中の腫瘍細胞の核におけるDJ−1タンパク質の発現が、対照と比較して低下しており、且つ前記試料中の腫瘍細胞の細胞質におけるDJ−1タンパク質の発現が、対照と比較して増加していたことが、前記患者の予後が不良であることを示す、請求項1に記載の方法。
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