CN111373056A - 基于过表达gcc2基因或蛋白的外泌体的用于诊断肺癌或预测预后的标志物组合物 - Google Patents

基于过表达gcc2基因或蛋白的外泌体的用于诊断肺癌或预测预后的标志物组合物 Download PDF

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Abstract

根据本发明的一实施例，提供一种用于诊断肺癌或预测预后的组合物，包括：特异性地结合至外泌体(exosome)内GCC2(GRIP and coiled‑coil domain‑containing protein)基因或蛋白的引物、探针或抗体。

Description

基于过表达GCC2基因或蛋白的外泌体的用于诊断肺癌或预测 预后的标志物组合物
技术领域
本发明涉及基于过表达GCC2基因或蛋白的外泌体的用于诊断肺癌或预测预后的标志物组合物。
背景技术
肿瘤(tumor)是非正常细胞过剩导致的不可控且无序的细胞增殖的产物，当这样的肿瘤具有破坏性的增殖性、扩散性以及转移性时，将被分类为恶性肿瘤(malignanttumor)，即癌症。
目前，通过X光、内窥镜检查、病理检查等方法诊断癌症。尽管上述检查方法的检查过程相对简单，但诊断成功率不高，还存在卫生问题，并且在检查过程中患者会感到痛苦，因此，需要研发出替代上述方法的癌症诊断方法。
为了治疗癌症，在进行治疗之前需要进行具备很高的敏感性与特异性的癌症诊断。只有通过这样的诊断在早期发现癌症，才能够提高治愈率。
因此，目前需要开发出一种方法，能够非侵入性地以高敏感性与特异性在早期诊断出癌症，但目前仍然缺乏能够在早期特异性地检测出病灶，从而判断是否发病的分子诊断技术，特别是仍未开发出特异性地适用于特定癌症的方法。
发明的内容
要解决的技术问题
本发明用于解决上述现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种能够通过非侵入性方法提高肺癌诊断的准确度的标志物组合物。
然而，本发明要解决的问题并不限于上述技术问题，未言及的其他技术问题能够通过下面的说明被本领域普通技术人员所明确理解。
解决问题的技术方法
根据本发明的一实施例，提供一种用于诊断肺癌或预测预后的标志物组合物，包括过表达含GRIP和卷曲螺旋域2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein，GCC2)蛋白的外泌体。
根据本发明的一实施例，提供一种用于诊断肺癌或预测预后的组合物，包括：特异性地结合至外泌体(exosome)内含GRIP和卷曲螺旋域2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein，GCC2)基因的引物或探针。
根据本发明的一实施例，提供一种用于诊断肺癌或预测预后的组合物，包括：特异性地结合至外泌体(exosome)内含GRIP和卷曲螺旋域2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein，GCC2)蛋白的抗体。
根据本发明的一实施例，提供一种包括所述组合物的用于诊断肺癌或预测预后的试剂盒。
根据一侧面，所述试剂盒是从由RT-PCR试剂盒、微阵列芯片试剂盒、DNA试剂盒及蛋白芯片试剂盒组成的组中选择的一种以上。
根据本发明的一实施例，提供一种诊断肺癌或预测预后所需信息的提供方法，包括以下步骤：(a)从生物样本分离外泌体(exosome)；以及(b)测量所述外泌体内含GRIP和卷曲螺旋域2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein，GCC2)基因或蛋白的表达水平。
根据一侧面，所述生物样本可以是从由全血、血清、血浆、唾液、尿液、痰、淋巴液和细胞组成的组中选择的一种以上。
根据本发明的一实施例，提供一种肺癌治疗剂筛选方法，包括以下步骤：(a)在从肺癌患者采集的生物样本中处理肺癌治疗剂候选物质；(b)从所述生物样本分离外泌体(exosome)；以及(c)测量所述外泌体内含GRIP和卷曲螺旋域2(GRIP and coiled-coildomain-containing protein，GCC2)基因或蛋白的表达水平。
发明的效果
本发明的标志物组合物包括肺癌患者的外泌体中过表达的基因以及蛋白，通过测量其表达水平，能够非侵入性地准确诊断肺癌或预测预后。
然而，本发明要的效果并不限于上述效果，应包括能够基于本发明的具体实施方式或权利要求的记载推导出的全部效果。
附图说明
图1是显示根据本发明的一实施例的外泌体内GCC2基因表达水平的测量结果的附图。
图2是显示根据本发明的一实施例的外泌体分泌量的测量结果的附图。
图3是根据本发明的一实施例的为了外泌体内GCC2蛋白定量而算出的标准曲线(standard curve)。
图4是显示根据本发明的一实施例的外泌体内GCC2蛋白表达水平的测量结果的附图。
图5是显示根据本发明的一实施例的测量外泌体内GCC2蛋白表达水平的西方墨点法结果的附图。
图6是显示根据本发明的一实施例的测量外泌体内GCC2蛋白表达水平的酶联免疫吸附测定(ELISA)结果的附图。
图7是显示根据本发明的一实施例的根据癌症发展阶段测量的外泌体内GCC2蛋白表达水平的ELISA结果的附图。
具体实施方式
下面参照附图对实施例进行详细说明。各附图中相同的附图标记表示相同部件。
能够对下面说明的实施例进行多种变更。本发明的实施形式并不限于下面的实施例，而应包括对下列实施例的所有变更、其等同物乃至其替代物。
实施利中使用的术语仅用于说明特定实施例，并非用于限定保护范围。在内容中没有特别说明的情况下，单数表达包括复数含义。在本说明书中，“包括”或者“具有”等术语用于表达存在说明书中所记载的特征、数字、步骤、操作、构成要素、配件或其组合，并不排除还具有一个或一个以上其他特征、数字、步骤、操作、构成要素、配件或其组合或附加功能。
在没有其他定义的情况下，包括技术或者科学术语在内的本文使用的全部术语，都具有本领域普通技术人员所理解的通常含义。通常使用的如词典定义的术语，应理解为相关技术内容中的含义，在本说明书中没有明确定义的情况下，不能解释为理想化或过于形式化的含义。
并且，在参照附图进行说明的过程中，与附图标记无关，相同的构成要素使用相同的附图标记，并省略重复说明。在说明实施例的过程中，当判断对于相关公知技术的具体说明会不必要地混淆实施例时，省略其详细说明。
根据本发明的一实施例，提供一种用于诊断肺癌或预测预后的标志物组合物，包括过表达含GRIP和卷曲螺旋域2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein，GCC2)基因或蛋白的外泌体。
本说明书中使用的术语“过表达GCC2基因或蛋白的外泌体”是指相比存在于正常细胞内的外泌体能够实现更高水平的GCC2基因或蛋白表达的外泌体。
外泌体(exosome)是大部分细胞分泌的纳米大小的小膜泡。众所周知，在外泌体内部及磷脂双层膜中包括来源于细胞的多种蛋白、遗传物质(DNA、mRNA、miRNA)、脂质等。并且，来源于组织的外泌体能够反映分泌其的组织状态，因此能够用于诊断疾病。
由此，本发明人发现利用来源于肺癌的外泌体所特异性地表达的GCC2基因或蛋白，能够准确迅速地诊断癌症或预测预后，由此完成了本发明。
在本说明书中使用的术语“诊断”是指确认是否存在病理状态或病理状态的特征，即确认是否患有肺癌。并且，“预后”是指判断肺癌治疗后相应个体是否出现复发、转移、药物反应、耐药性等。即通过测量从个体样本分离的外泌体内的GCC2表达水平，由此来判断相应个体是否患有肺癌，并预测相应个体生存后预后是否良好。
通过测量所述GCC2基因或蛋白的表达水平能够诊断肺癌或预测预后，可以将特异性地结合至该基因的引物或探针、或特异性地结合至蛋白的抗体用于诊断肺癌或预测预后的组合物。
不仅如此，能够通过将特异性地结合至GCC2基因的引物、探针或特异性地结合至GCC2蛋白的抗体适用于试剂盒来提供用于诊断肺癌或预测预后的试剂盒。
所述试剂盒的非限制性示例可包括RT-PCR试剂盒、微阵列芯片试剂盒、DNA试剂盒、蛋白芯片试剂盒等。所述试剂盒能够确认相当于标志物的GCC2基因或蛋白在外泌体内的表达水平并进行检测，从而诊断肺癌或预测预后。
为了诊断肺癌或预测预后，所述试剂盒包括选择性地识别标志物的引物、探针或抗体，不仅如此，还包括适合用于分析方法的一种或多种其他成分的组合物、溶液或装置。
为了进行抗体的免疫学检测，所述试剂盒可以包括底物、合适的缓冲溶液、用显色酶或荧光物质标记的二抗，以及显色底物。作为底物，可以使用硝酸纤维素膜、由聚乙烯树脂合成的96孔板、由聚苯乙烯树脂合成的96孔板以及由玻璃制成的载玻片；显色酶可以使用过氧化物酶(peroxidase)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)等；荧光物质可以使用异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明异硫氰酸酯(RITC)等；显色底物可以使用ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)或OPD(邻苯二胺)、TMB(四甲基联苯胺)。
根据本发明的一实施例，提供一种诊断肺癌或预测预所需信息的提供方法，包括如下步骤：(a)从生物样本分离外泌体(exosome)的步骤；以及(b)测量所述外泌体内GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein)基因或蛋白的表达水平的步骤。
所述生物样本可以是从由全血、血清、血浆、唾液、尿液、痰、淋巴液和细胞组成的组中选择的一种或多种，并且优选可以是全血或细胞，但不限于此。
测量基因表达水平是为了诊断肺癌或预测预后，从生物样本确认是否存在GCC2基因的mRNA及其表达程度的过程，是指测量mRNA的表达量。
为此所使用的分析方法的非限制性示例包括反转录－聚合酶链式反应(RT-PCR)、竞争性RT-PCR(Competitive RT-PCR)、实时RT-PCR(Real-time RT-PCR)和RNA酶保护分析法(RPA，RNase protection assay)、Northern印迹法(Northern blotting)、DNA芯片等。
并且，测量所述蛋白的表达水平是为了诊断肺癌或预测预后，确认生物样本中是否存在GCC2蛋白及其表达程度的过程。
所述蛋白的表达水平的测量方法或比较分析方法的非限制性示例包括：蛋白芯片分析法、免疫测量法、配体结合分析法、基质辅助激光解吸-电离飞行时间质谱(MatrixAssisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF)分析、表面增强激光解吸-电离飞行时间质谱(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，SELDI-TOF)分析、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、奥氏(ouchterlony)免疫扩散法、火箭免疫电泳、免疫组织染色法、补体固定法、二维电泳分析、液相色谱-质谱(liquid chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS)、液相色谱-质谱/质谱(liquid chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry，LC-MS/MS)、西方墨点法和酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)等。
测量所述GCC2的基因或蛋白表达水平后，与正常对照组进行比较，当其表达水平高时，可以判断其肺癌发病或发病可能性较高。
并且，根据本发明的一实施例，提供一种肺癌治疗剂筛选方法，包括以下步骤：(a)在采集的肺癌患者生物样本中处理肺癌治疗剂候选物质的步骤；(b)从所述生物样本分离外泌体(exosome)的步骤；以及(c)测量所述外泌体内GCC2(GRIP and coiled-coildomain-containing protein)基因或蛋白的表达水平的步骤。
对诊断肺癌或预测预后的所需信息的提供方法进行延伸，可以用作筛选所述治疗剂候选物质。即，将肺癌治疗剂候选物质处理至从肺癌患者分离的生物样本后，当在存在于其中的外泌体中确认GCC2基因或蛋白的表达水平的减少时，能够确认相应候选物质作为肺癌治疗剂有效地发挥功能。
下面，通过实施例对本发明进行更详细地说明。下面的实施例用于对本发明进行示例，本发明的范围并非限定于此。
实施例1：准备分离外泌体及分析蛋白质组
将5种肺癌细胞株(H522、A549、H1650、PC9、H1299)分别在150㎜直径的培养皿中培养。此时，利用超高速离心分离机于120000g离心分离4小时，将去除外泌体的胎牛血清(FBS，Fetal Bovine Serum)的上清液作为培养液进行使用。利用所述培养液连续培养2-3天，直到细胞融汇度达到70-80％。
将得到的培养液于10000g离心分离30分钟，去除细胞碎片(cell debris)，依次通过0.45μm、0.22μm过滤器优先去除体积较大的物质。之后，过滤后的细胞培养液利用Amicon管100K(Amicon tube 100K)(Millipore公司，美国)只保留中所需大小的粒子后进行浓缩。
之后，将浓缩细胞培养液利用柱液相色谱法(column liquid chromatography)只分离外泌体大小(50-100μm)的粒子，利用Amicon管100K再次浓缩。
利用RIPA裂解液(RIPAlysis buffer，Thermo Fisher Scientific公司,美国)从浓缩的外泌体中获取蛋白，委托韩国基础科学研究院(KBSI)获得蛋白质组分析结果。
以此为基础，在仅在肺癌细胞株表达的5种蛋白质组中最终筛选出预计与外泌体生成过程相关的GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein 2)。
之后，为了确认肺癌患者血浆中分离的外泌体特性，采集医院的20名1期至3期肺癌患者血液，利用Exoquick(Systembio公司，美国)从血浆分离外泌体。
实施例2：测量细胞内GCC2基因的表达水平
为了确认根据所述实施例1筛选的GCC2基因的细胞内表达水平，进行定量逆转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)。
具体地，利用Trizol(Thermo Fisher Scientific公司，美国)根据生产商说明分离RNA，利用逆转录聚合酶链式反应获得50ng/100μl的cDNA。
在StepOne Plus实时PCR系统(StepOne Plus Real-Time PCR System，AppliedBiosystems公司，加拿大)上利用KAPASYBR FAST qPCR Master Mix(2x)试剂盒根据生厂商说明执行3次qRT-PCR。用于反应的一对引物的碱基序列如下表1，qRT-PCR的执行结果如图1所示。
【表1】
引物 碱基序列
GCC2-正向(Forward) 5'-CGAGCTGTAGCTATGGAGACG-3'
GCC2-反向(Reverse) 5'-CGTAGGCTCTACTGCAGGTC-3'
参照图1，能够确认到肺癌细胞株内的GCC2表达相比正常细胞株(HPAECs)更高。这个结果能够给出GCC2基因表达水平能够提供用于诊断肺癌或预测预后所需的必要信息的启示。
实施例3：测量外泌体分泌量
猜测GCC2蛋白与外泌体生成有关，因此测量了正常细胞株(HPAECs)与肺癌细胞株(H1299、H522)中的外泌体分泌量。利用动态光散射(DLS，Dynamic Light Scattering)间接测量了外泌体分泌量。
具体地，接种(seeding)等量的正常细胞株与肺癌细胞株并暴露在1.5ml的培养液中24小时后，对未浓缩的1ml培养液只进行外泌体分离，利用DLS测量计数率(count rate)。如果溶液内存在多数的粒子则计数率(count rate)增加，由此，能够间接比较各个细胞株的外泌体量。并且，粒子量是通过count rate除以回收培养液的时间点为基准的细胞数得出的值(average)来计算，其各个结果在表2及图2中显示。
【表2】
细胞 HPAECs H1299 H522
接种(seeding) 100000 100000 100000
计数率(count rate) 545000 1080000 650000
平均(average) 3.05 8.05 16.8
CR/# 0.559633 0.74537 2.584615
参照所述表2及图2，能够确认肺癌细胞株的粒子量相比正常细胞株更多，这意味着肺癌细胞株相比正常细胞株更加活跃地分泌外泌体。通过这样的结果，能够估计仅在肺癌细胞株外泌体中表达的GCC2对外泌体分泌产生影响。
实施例4：测量外泌体内GCC2蛋白的表达水平
为了确认根据所述实施例1获得的外泌体内GCC2蛋白的表达水平，实施西方墨点法。
具体地，使用包括蛋白分解酶抑制剂鸡尾酒的RIPA裂解液(RIPA lysis buffer)从肺癌细胞株与正常细胞株中提取外泌体，分别分解外泌体来获得蛋白。
使用Bradford法(Bradford assay)对获得的蛋白进行定量。所获得的标准曲线(standard curve)如图3所示，公式为y＝0.321+0.0119x，并且R平方(R-square)为0.956。
将从外泌体获得的蛋白稀释为100分之1并进行定量，获得如下表3所示的OD值。计算的HPAECs、H1299、H522的浓度结果分别为1013.574μg/ml、2318.93μg/ml、2137.177μg/ml。以此为基础，分别加热从细胞获得的蛋白20μg、从外泌体获得的蛋白15μg使其失活，由此准备样本。
【表3】
区分 HPAECs H1299 H522
OD值(OD value) 0.4415 0.5975 0.576
在10％SDS-聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE gel)将总蛋白分解物加载至各个泳道并按照大小进行分辨。将分离的蛋白附着至PVDF膜，并用含有5％脱脂乳的Tris缓冲盐水Tween 20进行封闭。将GCC2(1：500，Santa Cruz公司)、CD63(1：500，Santa Cruz公司)、α-微管蛋白(α-tubulin)(1：500，Santa Cruz公司)作为一抗于4℃整夜处理所述PVDF膜。之后，利用抗兔IgG-HRP结合二抗处理后进行洗涤，并与ECL缓冲液(ECL buffer，Bio-rad公司，美国)一起反应，利用FluorChem E系统(proteinsimple公司，美国)获得的图像如图4所示。
参照图4，在细胞溶解物中，正常细胞株与肺癌细胞株之间的GCC2蛋白表达水平未显示差异，但在外泌体溶解物中，出现了与作为外泌体标志物的CD63类似的特征。
由此，能够得知在等量的蛋白内，正常细胞与肺癌细胞的蛋白构成比例不同，GCC2蛋白与外泌体标志物CD63显示了类似的倾向。即，癌细胞与正常细胞相比，具有不同的蛋白结构，尤其是GCC2得到很强的表达。
实施例5：测量来源于血液的外泌体内GCC2蛋白的表达水平
为了确认包括GCC2蛋白的外泌体是否能用作诊断肺癌或预测预后的标志物，进行了如下实验。
将GCC2多克隆抗体(poly clonal antibody)以0/N放置在96孔板上进行涂覆后，在每个孔中用封闭(blocking)溶液进行封闭。从1至3期肺癌患者的血液和手术后患者的血液，以及正常患者的血液中提取外泌体后，加入每个孔中50μl，反应2小时后充分洗涤。之后，将单克隆(monoclonal)GCC2抗体作为检测抗体(detection antibody)来确认外泌体的GCC2蛋白。使用标准GCC2(Standard GCC2)溶液画出标准曲线，利用该曲线的趋势线(y＝0.008x+0.1157，R2＝0.9937)计算外泌体中GCC2蛋白的表达。
确认正常组(n＝4)与肺癌患者组(n＝20)的血液中提取的外泌体内蛋白表达水平的结果，在肺癌患者组能够确认到GCC2的表达增加(图5)。
另外，对相同受试对象进行酶联免疫吸附测定(ELISA，Enzymelinkedimmunoassay)，其结果同样能够确认在肺癌患者组中的GCC2表达得到提高(图6)。
另一方面，早期肺癌(T1N0)的GCC2敏感性较低，而3期转移性癌症(T3N0)的敏感性较高，随着癌症的进展，与正常人的差异更大(图7)。
综上，通过有限的附图对实施例进行了说明，本领域普通技术人员能够基于所述记载进行多种技术修改与变形。例如，所说明的技术按照与说明的方法不同的顺序执行，和/或所说明的构成要素按照与说明的方法不同的形态进行结合或组合，或者由其他构成要素或者等同物置换或代替，也能得到适当的结果。
因此，其他体现、其他实施例及与权利要求的等同物均属于所附权利要求书的范围。

Claims (8)

1.一种用于诊断肺癌或预测预后的标志物组合物，包括：
过表达GCC2蛋白的外泌体。
2.一种用于诊断肺癌或预测预后的组合物，包括：
特异性地结合至外泌体内GCC2基因的引物或探针。
3.一种用于诊断肺癌或预测预后的组合物，包括：
特异性地结合至外泌体内GCC2蛋白的抗体。
4.一种用于诊断肺癌或预测预后的试剂盒，包括权利要求2或3所述的组合物。
5.根据权利要求4所述的用于诊断肺癌或预测预后的试剂盒，其中所述试剂盒是从RT-PCR试剂盒、微阵列芯片试剂盒、DNA试剂盒及蛋白芯片试剂盒组成的组中选择的一种以上。
6.一种诊断肺癌或预测预后所需信息的提供方法，包括：
(a)从生物样本分离外泌体的步骤；以及
(b)测量所述外泌体内GCC2基因或蛋白的表达水平的步骤。
7.根据权利要求6所述的诊断肺癌或预测预后所需信息的提供方法，所述生物样本是从由全血、血清、血浆、唾液、尿液、痰、淋巴液和细胞组成的组中选择的一种以上。
8.一种肺癌治疗剂筛选方法，包括：
(a)在从肺癌患者采集的生物样本中处理肺癌治疗剂候选物质的步骤；
(b)从所述生物样本分离外泌体的步骤；以及
(c)测量所述外泌体内GCC2基因或蛋白的表达水平的步骤。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007026896A1 (ja) * 2005-09-02 2007-03-08 Toray Industries, Inc. 腎ガン診断、腎ガン患者予後予測のための組成物および方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009085237A2 (en) * 2007-12-21 2009-07-09 Cell Genesys, Inc. Methods and compositions for identifying lung cancer or a humoral immune response against lung cancer
WO2010115077A2 (en) * 2009-04-02 2010-10-07 The Johns Hopkins University Biomarker panels for barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma
ES2749181T3 (es) * 2012-04-27 2020-03-19 Millennium Pharm Inc Moléculas de anticuerpo anti-GCC y uso de las mismas para ensayar la susceptibilidad a una terapia dirigida a GCC
KR20160133740A (ko) * 2015-05-13 2016-11-23 경북대학교 산학협력단 파이브로넥틴 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물
WO2017181183A1 (en) * 2016-04-15 2017-10-19 Exosome Diagnostics, Inc. Plasma-based detection of anaplastic lymphoma kinase (alk) nucleic acids and alk fusion transcripts and uses thereof in diagnosis and treatment of cancer

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007026896A1 (ja) * 2005-09-02 2007-03-08 Toray Industries, Inc. 腎ガン診断、腎ガン患者予後予測のための組成物および方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUNHONG JIANG等: "GCC2-ALK as a targetable fusion in lung adenocarcinoma and its enduring clinical responses to ALK inhibitors", 《LUNG CANCER.》 *
RADHA MUNAGALA等: "Exosomal miRNAs as biomarkers of recurrent lung cancer", 《TUMOUR BIOL》 *

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