JP6908785B2

JP6908785B2 - Ｇｃｃ２遺伝子又はタンパク質を過発現するエクソソーム基盤肺癌診断又は予後予測用マーカー組成物

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Publication number: JP6908785B2
Application number: JP2020524788A
Authority: JP
Inventors: ヒュン・ク・キム; スン・フェ・ホン; ヨン・パク; ヨン・ホ・チェ; ジ・ホ・パク; ビョン・ヒョン・チェ; ヘ・スン・ジョン
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST; Korea University Research and Business Foundation
Current assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST; Korea University Research and Business Foundation
Priority date: 2017-11-07
Filing date: 2018-11-02
Publication date: 2021-07-28
Anticipated expiration: 2038-11-02
Also published as: KR102080887B1; KR20190051641A; US20210018505A1; US20220196664A1; JP2021501897A; WO2019093717A3; WO2019093717A2; CN111373056A

Description

本発明は、ＧＣＣ２遺伝子又はタンパク質を過発現するエクソソーム基盤肺癌診断又は予後予測用マーカー組成物に関する。

腫瘍（ｔｕｍｏｒ）は、異常な細胞の過剰により発生する非制御的で、かつ無秩序な細胞増殖の産物であり、このような腫瘍が破壊的な増殖性、浸潤、及び転移性を有すると、悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔｔｕｍｏｒ）、すなわち、癌に分類されることになる。

現在の癌を診断するための検査手段として、Ｘ線撮影、内視鏡検査、組織検査などを用いる方法がある。しかし、このような方法は、検査過程が比較的簡単であるという長所にもかかわらず、診断の成功率が高くないか、衛生上の問題及び検査が行われる過程で患者の苦痛が伴うという問題があるため、これを代替するための癌の診断方法が求められている。

癌を治療するためには、治療以前の段階で高い敏感度と特異度を有する癌の診断が重要であり、このような診断を介して初期段階で癌の発見が優先されることにより、高い完治率を達成することができる。
したがって、非侵襲性、高感度、及び高特異性における癌の早期診断法の開発が求められている実状であるが、現在まで、癌の診断において早期に特異的に病巣を検知し、発病可否を判断する分子的な診断技術はほとんどなく、さらに、特定の癌に特異的に適用される方法は存在しない状況である。

WO2017/181183

本発明は、前述した従来技術の問題を解決するためのもので、本発明の目的は、比侵襲的な方法で利用しながらも、肺癌診断の正確度を向上させることのできるマーカー組成物を提供することにある。

しかし、本発明が解決しようとする課題は、以上で言及した課題に制限されることなく、言及されない更なる課題は下記の記載によって当技術分野の通常の知識を有する者に明確に理解されるものである。

本発明の一実施形態によれば、ＧＣＣ２（ＧＲＩＰａｎｄｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質の過発現エクソソームを含む、肺癌診断又は予後予測用マーカー組成物が提供される。

本発明の一実施形態によれば、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）内のＧＣＣ２（ＧＲＩＰａｎｄｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子に特異的に結合するプライマー又はプローブを含む、肺癌診断又は予後予測用組成物が提供される。

本発明の一実施形態によれば、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）内のＧＣＣ２（ＧＲＩＰａｎｄｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質に特異的に結合する抗体を含む、肺癌診断又は予後予測用組成物が提供される。

本発明の一実施形態によれば、前記組成物を含む、肺癌診断又は予後予測用キットが提供される。

一実施形態によれば、前記キットは、ＲＴ−ＰＣＲキット、マイクロアレイチップキット、ＤＮＡキット、及びタンパク質チップキットからなる群から選択される１つ以上であり得る。

本発明の一実施形態によれば、（ａ）生物学的試料からエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を分離するステップと、（ｂ）前記エクソソーム内のＧＣＣ２（ＧＲＩＰａｎｄｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子又はタンパク質の発現水準を測定するステップとを含む、肺癌診断又は予後の予測に必要な情報を提供する方法が提供される。

一実施形態によると、前記生物学的試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、喀痰、リンパ液、及び細胞からなる群から選択される１つ以上であり得る。

本発明の一実施形態によれば、（ａ）肺癌患者から採取した生物学的試料に肺癌治療剤候補物質を処理するステップと、（ｂ）前記生物学的試料からエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を分離するステップと、（ｃ）前記エクソソーム内のＧＣＣ２（ＧＲＩＰａｎｄｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子又はタンパク質の発現水準を測定するステップとを含む、肺癌治療剤のスクリーニング方法が提供される。

本発明のマーカー組成物は、肺癌患者のエクソソームで過発現される遺伝子ないしタンパク質を含んでいるため、この発現水準測定を介して比侵襲的でありながらも高い正確度で肺癌を診断したり予後を予測することができる。

本発明の効果は、前記効果に限定されるものではなく、本発明の詳細な説明又は請求範囲に記載されている発明の構成から推論可能な全ての効果を含むものとして理解されなければならない。

本発明の一実施形態に係るエクソソーム内のＧＣＣ２遺伝子発現水準を測定した結果を示すものである。本発明の一実施形態に係るエクソソーム分泌量測定結果を示すものである。本発明の一実施形態に係るエクソソーム内のＧＣＣ２タンパク質定量のために算出されたｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅである。本発明の一実施形態に係るエクソソーム内のＧＣＣ２タンパク質発現水準を測定した結果を示すものである。本発明の一実施形態に係るエクソソーム内のＧＣＣ２タンパク質発現水準を測定したウエスタンブロットの結果を示すものである。本発明の一実施形態に係るエクソソーム内のＧＣＣ２タンパク質発現水準を測定したＥＬＩＳＡの結果を示すものである。本発明の一実施形態に係るエクソソーム内のＧＣＣ２タンパク質発現水準を癌進行段階により測定したＥＬＩＳＡの結果を示すものである。

下記で説明する実施形態は様々な変更が加えられ得る。特許出願の範囲はこのような実施形態によって制限も限定もされない。各図面に提示した同じ参照符号は同じ部材を示す。

本明細書で開示する特定の構造的又は機能的な説明は単に実施形態を説明するための目的として例示したものであり、実施形態は様々な異なる形態で実施され、本発明は本明細書で説明した実施形態に限定されるものではない。

本明細書で用いる用語は、単に特定の実施形態を説明するために用いられるものであって、本発明を限定しようとする意図はない。単数の表現は、文脈上、明白に異なる意味をもたない限り複数の表現を含む。本明細書において、「含む」又は「有する」等の用語は明細書上に記載した特徴、数字、ステップ、動作、構成要素、部品、又はこれらを組み合わせたものが存在することを示すものであって、一つ又はそれ以上の他の特徴や数字、ステップ、動作、構成要素、部品、又はこれらを組み合わせたものなどの存在又は付加の可能性を予め排除しないものとして理解しなければならない。

異なる定義がされない限り、技術的であるか又は科学的な用語を含むここで用いる全ての用語は、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的に用いられる予め定義された用語は、関連技術の文脈上で有する意味と一致する意味を有するものと解釈すべきであって、本明細書で明白に定義しない限り、理想的又は過度に形式的な意味として解釈されることはない。

また、図面を参照して説明する際に、図面符号に拘わらず同じ構成要素は同じ参照符号を付与し、これに対する重複する説明は省略する。実施形態の説明において関連する公知技術に対する具体的な説明が本発明の要旨を不要に曖昧にすると判断される場合、その詳細な説明は省略する。

本発明の一実施形態によれば、ＧＣＣ２（ＧＲＩＰａｎｄｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子又はタンパク質の過発現エクソソームを含む、肺癌診断又は予後予測用マーカー組成物が提供される。

本明細書で使用された用語の「ＧＣＣ２遺伝子又はタンパク質の過発現エクソソーム」は、正常細胞内に存在するエクソソームに比べて、ＧＣＣ２遺伝子やタンパク質を高いレベルに発現するエクソソームを意味する。

エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）は、多くの細胞で分泌されるナノサイズ（３０〜１５０ｎｍ）の小さい小包体である。エクソソームの内部及び燐脂質二重側膜には細胞から由来した様々な種類のタンパク質、遺伝物質（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、脂質などが含まれていると知られている。また、組織由来のエクソソームは、これを分泌した組織の状態を反映しているため、病気の診断に用いられると報告されている。

ここで、本発明者は、肺癌由来のエクソソームにおいて特異的に発現するＧＣＣ２遺伝子又はタンパク質を用いる場合、正確かつ迅速に癌を診断したり、予後を予測できることを確認することで本発明を完成した。

本明細書で使用された用語の「診断」は、病理状態の存在又は特徴、すなわち、肺癌の発病の有無を確認することを意味する。また、「予後」は、肺癌の治療後、当該個体の再発、転移、薬物反応性、耐性可否を判断することを意味する。これは個体の試料から分離されたエクソソーム内のＧＣＣ２の発現水準を測定することで、当該個体の肺癌発病の有無のみならず、今後の当該個体の生存予後が良いか否かに対して予測する概念まで含み得る。

前記ＧＣＣ２遺伝子又はタンパク質の発現水準測定を介して肺癌を診断したり予後を予測することができるため、この遺伝子に特異的に結合するプライマーやプローブ、又は、タンパク質に特異的に結合する抗体を肺癌診断又は予後予測用組成物として利用することができる。

それだけではなく、ＧＣＣ２遺伝子に特異的に結合するプライマー、プローブ、又はＧＣＣ２タンパク質に特異的に結合する抗体をキットに適用することで、肺癌診断又は予後予測用キットを提供することもできる。

前記キットは、ＲＴ−ＰＣＲキット、マイクロアレイチップキット、ＤＮＡキット、タンパク質チップキットなどを含むことができるが、これに限定されることはない。前記キットは、マーカーに該当するＧＣＣ２遺伝子又はタンパク質のエクソソーム内の発現水準を確認し、これを検知することで肺癌診断又は予後を予測することができる。

前記キットには、肺癌診断又は予後の予測のために選択的にマーカーを認知するプライマー、プローブ又は抗体だけでなく、分析方法に適する一種類又はそれ以上の他の構成成分の組成物、溶液、又は装置を含んでもよい。

また、前記キットは、抗体の免疫学的な検出のために、基質、適当な緩衝溶液、発色酵素又は蛍光物質で標識された２次抗体、及び発色基質などを含んでもよい。前記基質は、ニトロセルロース膜、ポリビニール樹脂で合成された９６ウェルプレート、ポリスチレン樹脂で合成された９６ウェルプレート、及びガラスからなるスライドグラスなどが用いられ、発色酵素は、ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）などが用いられ、蛍光物質は、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣなどが用いられ、発色基質液は、ＡＢＴＳ（２、２’−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾールリン−６−スルホン酸））又はＯＰＤ（Ｏ−フェニレンジアミン）、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）が用いられてもよい。

前記生物学的試料は。全血、血清、血漿、唾液、尿、喀痰、リンパ液及び細胞からなる群から選択される１つ以上であってもよく、好ましくは、全血又は細胞であってもよいが、これに限定されることはない。

前記遺伝子発現水準の測定は、肺癌診断又は予後の予測のために生物学的試料からＧＣＣ２遺伝子のｍＲＮＡ存在の有無と発現程度を確認する過程であって、ｍＲＮＡの発現量を測定することを意味する。

これを分析する方法として、逆転写重合酵素反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、競争的な逆転写重合酵素反応（ＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写重合酵素反応（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｓｓａｙ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＤＮＡチップなどが挙げられるが、これに限定されることはない。

また、前記タンパク質発現水準の測定は、肺癌診断又は予後の予測のために生物学的試料からＧＣＣ２タンパク質の存在の有無と発現程度を確認する過程を意味する。

前記タンパク質の発現水準測定又は比較分析方法として、タンパク質チップ分析、免疫測定法、リガンド結合試験（Ｌｉｇａｎｄｂｉｎｄｉｎｇａｓｓａｙ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＭａｔｒｉｘＡｓｓｉｓｔｅｄＬａｓｅｒＤｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ＩｏｎｉｚａｔｉｏｎＴｉｍｅｏｆＦｌｉｇｈｔＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）分析、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ（ＳｕｌｆａｃｅＥｎｈａｎｃｅｄＬａｓｅｒＤｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ＩｏｎｉｚａｔｉｏｎＴｉｍｅｏｆＦｌｉｇｈｔＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）分析、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、補体固定分析法、２次元電気泳動分析、液体クロマトグラフィー質量分析（ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＬＣ−ＭＳ）、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ／ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、ウェスタンブロッティング、及びＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）などが挙げられるが、これに限定されることはない。

前記ＧＣＣ２の遺伝子又はタンパク質発現水準を測定した後、正常の対照群と比較して、その発現水準が高い場合、肺癌が発病したり発病可能性の高いものとして判断することができる。

また、本発明の一実施形態によれば、（ａ）肺癌患者から採取した生物学的試料に肺癌治療剤候補物質を処理するステップと、（ｂ）前記生物学的試料からエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を分離するステップと、（ｃ）前記エクソソーム内のＧＣＣ２（ＧＲＩＰａｎｄｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子又はタンパク質の発現水準を測定するステップとを含む、肺癌治療剤のスクリーニング方法が提供される。

肺癌診断又は予後の予測に必要な情報を提供する方法の延長線で、前記治療剤候補物質のスクリーニングが適用されてもよい。すなわち、肺癌治療剤候補物質を肺癌患者から分離した生物学的試料に処理した後、その内部に存在するエクソソームからＧＣＣ２遺伝子又はタンパク質の発現水準の減少を確認する場合、前記候補物質が肺癌治療剤として効率よく機能することを確認できる。

以下、実施形態によって本発明をより詳細に説明することにする。下記の実施形態は、本発明を例示するための目的として記述されたものであり、本発明の範囲がこれに限定されることはない。

実施形態１：エクソソームの分離及びプロテオーム分析準備
５種の肺癌細胞株（Ｈ５２２、Ａ５４９、Ｈ１６５０、ＰＣ９、Ｈ１２９９）をそれぞれ直径１５０ｍｍのディッシュで培養した。ここで、超高速遠心分離機を用いて１２０、０００ｇで４時間の間に遠心分離し、エクソソームを除去したＦＢＳ（ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ）の上層液を培養液として使用した。前記培養液を用いて、細胞が７０−８０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ状態になるよう２−３日間連続培養した。

取得された培養液を１０、０００ｇで３０分間遠心分離してｃｅｌｌｄｅｂｒｉｓを除去し、０．４５ｕｍ、０．２２ｕｍのフィルタへ順に通過させて相対的に体積の大きい物質を優先的に除去した。その後、濾過された細胞培養液は、Ａｍｉｃｏｎｔｕｂｅ１００Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を用いて所望する大きさの粒子のみを残して濃縮した。

次に、濃縮された細胞培養液をｃｏｌｕｍｎｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ方法を用いてエクソソームの大きさ（５０−１００ｎｍ）の粒子のみを分離し、Ａｍｉｃｏｎｔｕｂｅ１００Ｋを用いて再び濃縮した。

濃縮されたエクソソームは、ＲＩＰＡｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いてタンパク質を取得し、韓国基礎科学支援研究院（ＫＢＳＩ）に依頼してプロテオームの分析結果を取得した。

これに基づいて肺癌細胞株だけで発現するプロテオームの５個のうち、エクソソームの生成過程に関連のあるものとして推測可能なＧＣＣ２（ＧＲＩＰａｎｄｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ２）を最終選別した。

次に、肺癌患者の血漿から分離したエクソソームの特性を確認するため、病院に来院する１〜３期の肺癌患者２０人から血液を採取し、Ｅｘｏｑｕｉｃｋ（Ｓｙｓｔｅｍｂｉｏ、ＵＳＡ）を用いて血漿からエクソソームを分離した。

実施形態２：細胞内のＧＣＣ２遺伝子発現水準の測定
前記実施形態１により選別したＧＣＣ２遺伝子の細胞内の発現水準を確認するため、定量的な逆転写重合酵素連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を行った。

具体的に、Ｔｒｉｚｏｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いてメーカーの指針に従いＲＮＡを分離し、逆転写重合酵素連鎖反応を用いて５０ｎｇ／１００ｕｌだけのｃＤＮＡを収得した。

ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＲｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ）上でＫＡＰＡＳＹＢＲＦＡＳＴｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（２ｘ）ｋｉｔを用いて製造者の指針に従い、ｑＲＴ−ＰＣＲを３回行った。反応に用いられたプライマー対の塩基配列は下記の表１に示し、ｑＲＴ−ＰＣＲの実行結果は図１に示した。

図１を参照すると、肺癌細胞株内でＧＣＣ２の発現が正常細胞株（ＨＰＡＥＣｓ）に比べて高く示されていることが確認され、このような結果は、ＧＣＣ２遺伝子発現水準が肺癌診断や予後の予測に必要な情報を提供する可能性があることを示唆する。

実施形態３：エクソソーム分泌量の測定
ＧＣＣ２は、エクソソームの生成に関わっているものと推定されるタンパク質であるため、正常細胞株（ＨＰＡＥＣｓ）と肺癌細胞株（Ｈ１２９９、Ｈ５２２）におけるエクソソームの分泌量を測定した。エクソソームの分泌量は、ＤＬＳ（ＤｙｎａｍｉｃＬｉｇｈｔＳｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を用いて間接的に測定した。

具体的に、同量の正常細胞株と肺癌細胞株をシード（ｓｅｅｄｉｎｇ）して２４時間の間に１．５ｍｌの培養液に露出させた後、１ｍｌの培養液を濃縮することなく、エクソソームのみを分離してＤＬＳでｃｏｕｎｔｒａｔｅを測定した。溶液内に複数の粒子が存在すれば、ｃｏｕｎｔｒａｔｅが増加するため、これによって、各細胞株のエクソソームの量を間接的に比較することができる。また、培養液を回収した時点の細胞数を基準にして、ｃｏｕｎｔｒａｔｅを割った値（ａｖｅｒａｇｅ）を介して粒子量を算出し、それぞれの結果を下記の表２及び図２に示した。

前記表２及び図２を参照すると、肺癌細胞株において正常細胞株に比べて粒子量が多いことが確認され、これは肺癌細胞株において正常細胞株に比べて活発なエクソソームの分泌が起きていることを意味する。このような結果により、肺癌細胞株のエクソソームだけで発現するＧＣＣ２がエクソソームの分泌に影響を及ぼすということが予想され得る。

実施形態４：エクソソーム内のＧＣＣ２タンパク質発現水準の測定
前記実施形態１により収得したエクソソーム内のＧＣＣ２タンパク質の発現水準を確認するため、ウェスタンブロッティングを実施した。

具体的に、タンパク質分解酵素の阻害剤カクテルを含むＲＩＰＡｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒを用いて肺癌細胞株と正常細胞株からエクソソームを抽出し、それぞれのエクソソームを溶解してタンパク質を収得した。

収得されたタンパク質は、Ｂｒａｄｆｏｒｄａｓｓａｙ法を用いて定量した。ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅは、図３に示すように取得され、式はｙ＝０．３２１＋０．０１１９ｘであり、Ｒ−ｓｑｕａｒｅ値は０．９５６に算出された。

エクソソームから取得したタンパク質は１００分の１に希釈して定量し、下記の表３のようなＯＤ値を取得した。ＨＰＡＥＣｓ、Ｈ１２９９、Ｈ５２２の濃度を算出した結果、それぞれ１０１３．５７４μｇ／ｍｌ、２３１８．９３μｇ／ｍｌ、２１３７．１７７μｇ／ｍｌのように確認された。これに基づいて、細胞から取得されたタンパク質２０μｇ、エクソソームから取得したタンパク質１５μｇのそれぞれを熱で不活性させ、サンプルを準備した。

１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥｇｅｌに総タンパク質の分解物を各レーンにロードして大きさごとに分別した。ＰＶＤＦ膜に分離したタンパク質を付着し、５％脱脂乳を含むトリス緩衝食塩水−Ｔｗｅｅｎ２０でブロックした。ＧＣＣ２（１：５００、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、ＣＤ６３（１：５００、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、α−ｔｕｂｕｌｉｎ（１：５００、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）一次抗体で前記ＰＶＤＦ膜を４℃で夜通し処理した。その後、抗ウサギのＩｇＧ−ＨＲＰ結合の二次抗体で処理した後、洗浄し、ＥＣＬｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ、ＵＳＡ）と反応させ、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍＥｓｙｓｔｅｍ（ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｍｐｌｅ、ＵＳＡ）を用いて取得したイメージを図４に示した。

図４を参照すると、細胞溶解物では、正常細胞株と肺癌細胞株との間のＧＣＣ２タンパク質発現水準に差が示されないが、エクソソーム溶解物ではエクソソームマーカーであるＣＤ６３と類似の態様を示すことが確認される。

これにより、同量のタンパク質内に正常細胞と肺癌細胞のタンパク質の構成比率が互いに相違であることが分かり、ＧＣＣ２タンパク質がエクソソームマーカーＣＤ６３と類似の傾向を示すことが分かる。すなわち、癌細胞が正常細胞と異なるタンパク構成を有しており、特に、ＧＣＣ２が強く発現されることが確認された。

実施形態５：血液由来エクソソーム内のＧＣＣ２タンパク質発現水準の測定
ＧＣＣ２タンパク質を含むエクソソームが肺癌診断又は予後予測用マーカーとして利用可能であるか否かを確認するため、下記のような試験を行った。

９６ウェルプレートにＧＣＣ２多クローン性抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ）を０／Ｎに放置してコーティングした後、各ウェルに遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）溶液を用いて遮断した。肺癌段階１〜３期の患者及び手術後の患者の血液及び正常な人の血液からエクソソームを抽出した後、各ウェルに５０ｕｌずつ入れて２時間反応させてから十分に洗浄した。その後、検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｔｉｂｏｄｙ）で単クローン（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）ＧＣＣ２抗体を用いてエクソソームのＧＣＣ２タンパク質を確認した。ＳｔａｎｄａｒｄＧＣＣ２溶液を用いて標準曲線を描き、その曲線の傾向線（ｙ＝０．００８ｘ＋０．１１５７、Ｒ^２＝０．９９３７）を用いて血中エクソソームのＧＣＣ２タンパク質の発現を算出した。

正常群（ｎ＝４）と肺癌患者群（ｎ＝２０）の血液から抽出したエクソソーム内のタンパク質発現水準を確認した結果、肺癌患者群でＧＣＣ２の発現が増加したことが確認できた（図５）。

また、同一の対象に対して、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）分析を行った結果においても、同様に肺癌患者群でＧＣＣ２の発現が増加したことが確認できた（図６）。

一方、ＧＣＣ２は、初期肺癌（Ｔ１Ｎ０）の場合に低い敏感度を見せ、転移性癌である３期（Ｔ３Ｎ０）で高い敏感度を示し、癌が行われるほど正常な人ともっと有意的な差を示した（図７）。

上述したように、たとえ限定された図面に基づいて実施形態が説明されたが、当技術分野で通常の知識を有する者であれば、前記記載から様々な修正及び変形が可能である。例えば、説明された技術が説明された方法と異なる順に実行されたり、及び／又は説明されたシステム、構造、表示装置、回路などの構成要素が説明された方法と異なる形態に組み合わせたり、他の構成要素又は均等物によって置き換えたり置換されても適切な結果を達成することができる。

したがって、他の実現、他の実施形態及び請求の範囲と均等なものなども後述する請求の範囲の範囲に属する。

Claims

エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）内のＧＣＣ２（ＧＲＩＰａｎｄｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質からなる、肺癌診断用マーカー組成物。
エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）内のＧＣＣ２（ＧＲＩＰａｎｄｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質に特異的に結合するプライマー又はプローブを含む、肺癌診断用組成物。
エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）内のＧＣＣ２（ＧＲＩＰａｎｄｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質に特異的に結合する抗体を含む、肺癌診断用組成物。
請求項２又は請求項３の組成物を含む、肺癌診断用キット。
前記キットは、ＲＴ−ＰＣＲキット、マイクロアレイチップキット、ＤＮＡキット、及びタンパク質チップキットからなる群から選択される１つ以上である、請求項４に記載の肺癌診断用キット。
（ａ）生物学的試料からエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を分離するステップと、
（ｂ）前記エクソソーム内のＧＣＣ２（ＧＲＩＰａｎｄｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質の発現水準を測定するステップとを含む、肺癌診断に必要な情報を提供する方法。
前記生物学的試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、喀痰、リンパ液、及び細胞からなる群から選択される１つ以上である、請求項６に記載の肺癌診断に必要な情報を提供する方法。