CN117778558A - Igfbp3基因在制备筛查宫腔粘连的相关产品的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了IGFBP3基因在制备筛查宫腔粘连的相关产品的应用。本发明属于生物医药领域,涉及IGFBP3基因在制备筛查宫腔粘连的相关产品的应用,所述产品应用于IUA的筛查和/或辅助筛查、诊断和/或辅助诊断;与正常子宫内膜组织相比,IGFBP3蛋白在IUA患者的子宫内膜组织中高表达。体外功能实验表明,IGFBP3过表达显著提高了纤维化标志物蛋白的表达,IGFBP3敲低可以改善子宫内膜基质纤维化,降低纤维化标志物蛋白的表达,表明IGFBP3可作为IUA的筛查和诊断的标志物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及IGFBP3基因在制备筛查宫腔粘连的相关产品的应用。
背景技术
宫腔粘连(Intrauterine adhesion,IUA)是一种常见的妇科疾病,其特征是子宫内膜基底层损伤和子宫肌层暴露,表现为月经过少、闭经、不孕、反复流产、腹痛等,严重影响女性生殖生理及身心健康。IUA通常是由于创伤和感染引起子宫内膜基底层损伤和子宫肌层暴露,同时伴有炎性细胞浸润,进而使得子宫内膜和血管再生减少,最终发展为子宫内膜纤维化,导致IUA。由于IUA的发病机制尚未完全阐明,尽管治疗方法不断进步,但疗效及预后仍不理想。迄今为止,诊断IUA的生物标记物尚未开发和在临床上使用。因此,迫切需要更深入的研究IUA的致病机理,找到IUA的相关蛋白质,促进对IUA发病机制的认识,从分子水平找到IUA的病因,真正做到诊断、治疗和预防的三位一体,为女性不孕患者提供精准的个体化治疗。
胰岛素样生长因子结合蛋白(Insulin like growth factor binding protein,IGFBP)家族可调控胰岛素样生长因子(Insulin like growth factors,IGFs)信号系统,其中胰岛素样生长因子结合蛋白3(Insulin-like growth factor binding protein-3,IGFBP3)是IGFBP系列中最主要的一种,在体内循环中占很高的比例,是IGFs的主要结合受体。研究表明,IGFBP3在调节细胞的增殖、生长、分化、凋亡和迁移等方面发挥重要的生物学作用。但IGFBP3在IUA中的作用未见相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何筛查和/或辅助筛查、诊断和/或辅助诊断IUA。
为解决上述技术问题,本发明首先提供了检测IGFBP3基因的物质在制备筛查和/或辅助筛查IUA产品的应用。
本发明还提供了检测IGFBP3基因的物质在制备诊断和/或辅助诊断IUA产品的应用。
上述应用中,所述IGFBP3的mRNA核苷酸序列可为GenBank AccessionNo.NM_001013398.2(Update Date:18-JUL-2022)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001013398.2)。
上述应用中,所述物质可为下述任一种:
(1)用于检测所述基因的mRNA表达水平的试剂;
(2)用于检测所述基因的蛋白质表达水平的试剂。
具体地,所述mRNA表达水平是指在转录水平上检测基因转录的mRNA的丰度;所述蛋白质表达水平是指在翻译水平上检测基因编码的蛋白质的丰度。
本发明可基于cDNA和RNA的测序技术,检测所述基因的表达水平。所述测序技术为核酸测序技术,包括链终止子(Sanger)测序技术和染料终止子测序技术,本领域的普通技术人员所知晓的是,由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击,因此,在测序前通常将RNA逆转录成DNA,此外,所述测序技术还包括下一代测序技术(即深度测序/高通量测序技术)。高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术。基于专有的可逆终止化学反应原理,测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面,这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后,在玻璃表面形成数以亿计的簇,每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇,然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸,通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。本发明可使用二代测序和三代测序,检测cDNA中的转录组,进而检测所述基因的表达水平。本发明也可使用纳米孔(Nanopore)测序技术,直接检测RNA表达水平,从而对所述基因的表达水平进行定量。
上述应用中,所述物质包括通过逆转录-聚合酶链反应、实时荧光定量PCR、转录组测序技术、Northern blot、原位杂交技术、基因芯片技术、Nanopore测序技术、PacBio测序技术、免疫印迹法、免疫组化法、免疫荧光法、放射免疫测定法、免疫共沉淀法、酶联免疫吸附试验、酶免疫测定法、流式细胞术、高效液相色谱法、毛细管凝胶电泳法、近红外光谱法、质谱法、免疫化学发光法、胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术、表面等离子共振技术、免疫-PCR技术和生物素-亲和素技术检测所述基因的试剂。
上述应用中,所述产品可包括试剂盒、基因芯片、蛋白质芯片、免疫层析诊断试纸、高通量测序平台和生物传感器。
所述试剂盒可为基因检测试剂盒或蛋白免疫检测试剂盒;所述基因检测试剂盒包括用于检测所述基因转录水平的试剂;所述蛋白免疫检测试剂盒包括抗所述IGFBP3的特异性抗体。
所述基因芯片包括固相载体和固定在所述固相载体的核苷酸探针,所述寡核苷酸探针包括用于检测所述基因的核苷酸探针。
所述蛋白质芯片包括固相载体和固定在所述固相载体的抗IGFBP3的特异性抗体。
所述免疫层析诊断试纸包括抗IGFBP3的特异性抗体。
所述高通量测序平台包括用于检测所述基因的试剂。
所述生物传感器包括用于检测所述基因的试剂。
本文所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体,还可以是抗体可变区Fv、单链抗体ScFv、抗原结合片段Fab或Fab’、F(ab’)2、Fab-SH等抗体片段以及抗体衍生物等。
上述应用中,所述产品可包括所述物质。
上述应用中,所述产品的检测样本可来源于具有下述至少一种症状的患者:月经过少、闭经、复发性流产、不孕、盆腔疼痛。
所述产品的检测样本可为血液样本或组织样本。
用于IUA的筛查、诊断或辅助诊断的装置也是本发明的保护范围,所述装置包括所述物质和存储有计算机程序的计算机可读存储介质,所述计算机程序使计算机执行如下步骤:根据所述基因的表达水平进行IUA的筛查、诊断或辅助诊断。
本发明对临床IUA组织和对照组织进行RNA测序。以TGF-β处理的人子宫内膜基质细胞株(Human endometrial fibroblasts,T HESCs)作为IUA细胞模型。高通量QPCR(HT-QPCR)用于验证从RNA测序获得的差异表达基因(Differential Expressed Genes,DEGs)。多个联合生物信息分析发现IGFBP3靶点。采用CCK8和EDU检测细胞活力。Transwell分析用于检测细胞迁移率。用膜联蛋白V-FICT检测细胞凋亡。Western blot检测纤维化标志物的表达水平。对IGFBP3敲低的IUA细胞模型进行RNA测序,以探索IGFBP3的下游效应器。
通过HT-QPCR测定干细胞条件培养液干预IUA细胞后相应的mRNA改变以筛选和验证潜在的致病基因IGFBP3,这也是脐带间充质干细胞条件培养基(Conditioned Medium ofUmbilical Cord Mesenchyme Stem cells,CM-UCMSCs)干预治疗IUA的靶点。突破IUA治疗现状,为靶向治疗IUA提供研究靶点,推动干细胞治疗IUA领域研究进展。
附图说明
图1为临床收集的IUA样本的RNA测序(RNAseq)。其中a.火山图显示,596个mRNA显著上调,283个mRNA显著下调(IUA vs Con,p<0.05,|log2折叠更改|>1.0);b.是前40个上调mRNA和前20个下调mRNA的聚类图;c.RNA测序后通过生物信息学分析测定的DEGs的Go富集分析结果;d.RNA测序后通过生物信息学分析测定的KEGG富集分析结果。
图2为临床样本和细胞模型样本测序后的高通量QPCR验证。其中a.临床组织样本(IUA n=5vs Con n=4)RNAseq的前40上调和前20下调mRNA在临床组织样本(IUA n=8vsCon n=8)中采用HT-QPCR验证的结果,如交集饼图所示,饼图中左侧圆形代表RNAseq的结果,右侧圆形代表HT-QPCR验证结果;b.临床组织(IUA vs Con)和细胞模型样本(T HESCs+TGF-βvs T HESCs)中mRNA的HT-QPCR二次验证概述图;c.通过HT-QPCR系统检测到的IUA细胞模型中CM-UCMSCs潜在干预靶点的相对mRNA水平。
图3为29份IUA患者的子宫内膜组织样本和31份健康女性(Con)的子宫内膜组织样本中IGFBP3蛋白含量进行ROC曲线分析结果。
图4为IGFBP3敲低(si-IGFBP3)对TGF-β诱导的T HESCs(IUA细胞模型)的抑制纤维化的作用。其中,a.在临床收集的IUA组织和正常子宫内膜组织上进行IGFBP3的免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色。放大倍数为200×;b.QPCR验证了不同siRNA序列对IGFBP3的干扰效率。测量数据以均值±SD,n=3;****P<0.0001,si-IGFBP3 vs NC组(si-NC)表示;c.ELISA检测相关炎症因子;d.免疫印迹检测IGFBP3下调的IUA细胞中IGFBP3和纤维化标志物α-SMA、collagen I、CTGF的表达;e.对IGFBP3敲低或不敲低的IUA模型细胞的CCK8检测,测量数据以均值±SD,n=5;****P<0.0001,si-IGFBP3 vs NC组(si-NC)表示;f.使用膜联蛋白V-FITC来检测IGFBP3敲低或不敲低的IUA细胞模型的凋亡情况;g.凋亡率测定结果,测量数据为均值±SD,n=3;**P<0.01vs NC组(si-NC);h和i.采用EDU染色检测IGFBP3敲低或不敲低的IUA模型细胞的增殖情况,放大倍数为100×,测量数据以均值±SD,n=3表示;*P<0.05vs NC组(si-NC);j和k.跨孔系统中迁移实验检测有或没有IGFBP3下调的IUA细胞模型的活力和运动,放大率为100×,测量数据为均值±SD,n=3;*P<0.05vs NC组(si-NC)。
图5为IGFBP3过表达(IGFBP3-OV)对IUA细胞模型的作用。其中,a.采用QPCR确认IGFBP3过表达模型的成功构建,测量数据以均值±SD,n=3;****P<0.0001,IGFBP3-OV vsNC-OV表示;b.CCK8检测CM-UCMSCs处理下IGFBP3过表达IUA模型细胞的相对存活率,测量数据为均值±SD,n=5;***P<0.001,****P<0.0001;c和d.跨孔系统中迁移实验检测IGFBP3过表达IUA细胞模型的活力和运动,放大倍数为100×,测量数据为均值±SD,n=3;**P<0.01,****P<0.0001;e.蛋白印迹检测IGFBP3和纤维化标志物α-SMA、Collagen I、CTGF,判断IGFBP3过表达细胞模型有或没有CM-UCMSCs治疗的结果;f.e图数据(即灰色数据)进行统计分析,测量数据为均值±SD,n=3;*P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。
图6为探索IGFBP3的下游效应器。a.火山图显示IGFBP3沉默组与NC组相比有214个mRNA表达上调,416个mRNA表达下调。(si-IGFBP3相对于si-NC,p<0.05,|log2FoldChange|>1.0)。b.IGFBP 3沉默后前60位差异表达的mRNA的聚类图。c.QPCR用于验证从RNA-seq推断的下游目标因子MMP1、MMP10、KLF6和KLF2,测量数据表示为平均值±SD,n=3;所示组之间**P<0.01,***P<0.001。d.用string软件绘制的蛋白质相关图。e.Western blot验证各组MMP1和KLF2的表达。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料和试剂等,如无特殊说明均可从商业途径得到。
实施例1、IGFBP3基因与宫腔粘连(IUA)病理参数相关性的研究
一、收集临床标本。
2021年4月至6月在江西省妇幼保健院收集临床标本宫腔粘连(IUA:n=8)和正常对照(Con:n=8)子宫内膜组织。所有患者均签署了知情同意书,并获得了江西省妇幼保健院伦理委员会(批准号:EC-KT-202143)的批准。所有涉及的临床实验都是根据《赫尔辛基宣言》的原则进行的。
IUA标本纳入标准:所有标本来源的患者年龄≤38岁,经宫腔镜检查(金标准)诊断为IUA。
正常对照标准:以要求上宫内节育器且子宫内膜病理检查正常的健康志愿者为对照,所有标本来源患者年龄≤38岁。临床标本在室温下切除后立即在-80℃下冷冻保存,后续行RNA-seq和QPCR准备。
二、收集临床宫腔粘连组织(IUA组织)和对照组织(Con组织)进行RNA测序和相关生物信息学分析
1.分别从临床收集的8例IUA组织和8例对照组织中各随机抽取5例提取总RNA进行测序,IUA组(n=5)和Con组织(n=5)中提取总RNA。
具体提取组织样品的总RNA步骤如下:
(1)匀浆处理:将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1mL TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。
(2)将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
(3)于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清(上清中含有RNA)。
(4)每使用1mL TRIzol加入0.2mL氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
(5)2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。
(6)把水相转移到新管中。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mL TRIzol加入0.5mL异丙醇,室温放置10分钟。
(7)2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
(8)用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1mL TRIzol至少加1mL 75%乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟,弃上清。
(9)室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大约晾5-10分钟即可。加入25-200μL无RNase的水或0.5%SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解。-70℃保存。
2.IUA组织(n=5)和Con组织(n=4)进行RNA测序
RNA质量检查后,Con组织中有1例不合格,因而共对IUA组织(n=5)和Con组织(n=4)进行RNA测序(RNA-seq)。通过专业的生物信息学分析,获得了596个显著上调的mRNA和283个显著下调的mRNA(IUA vs Con,p<0.05,|log2FoldChange|>1.0)(图1中a)。随后进行聚类分析,根据表达变化倍数绘制上调mRNA前40位和下调前20位,再次对IUA和Con组间存在典型差异的mRNA进行注释和澄清(图1中b)。RNA测序后通过生物信息学分析测定的DEGsGo和KEGG富集分析结果见图1中c和d。
三、高通量通用实时定量PCR验证宫腔粘连(IUA)靶点mRNA
1.使用RNAsimple总RNA试剂盒从19例样本中提取总RNA(8例IUA患者宫腔组织、8例对照的宫腔组织,1例正常T HESCs,1例TGF-β处理过的T HESCs,1例CM-UCMSCs+TGF-β处理过的T HESCs)中提取总RNA,然后使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒进行反转录。
使用WaferGen Smartchip超高通量QPCR平台进行实时定量PCR,以测量目标mRNA的表达水平。使用的引物序列如下表1。IGFBP3正向引物:5’-CAGCTCCAGGAAATGCTAGTG-3’(序列表中序列1),反向引物:5’-GTCAACTTTGTAGCGCTGGC-3’(序列表中序列2)。
表1特异性引物序列
在WaferGenHT-QPCR系统上验证19个样本中的RNA,其中样本分为A-E共5组:
A:临床采集的IUA样本(n=8)准备及处理如本实施例中步骤二,
B:临床采集的对照Con样本(n=8)准备及处理如本实施例中步骤二,
C:T HESCs阴性对照细胞(NC样本)(n=1)准备及处理如下:
(1)细胞:在培养板中直接加入1mL Buffer RZ或者离心收集细胞沉淀,加入1mLBuffer RZ,充分振荡混匀(细胞个数在106数量级);
(2)将匀浆样品在15-30℃放置5min,使得核酸蛋白复合物完全分离;4℃,12000rpm离心5min,取上清,转入一个新的RNase-free的离心管中;
(3)加入200μL氯仿,盖好管盖,剧烈振荡15S,室温放置3min;
(4)4℃,12000rpm离心10min,样品会分成三层:黄色的有机相,中间层和无色的水相,RNA主要在水相中,水相的体积约为所用Buffer RZ试剂的50%。把水相转移到新RNase-free管中,进行下一步操作;
(5)缓慢加入0.5倍体积无水乙醇,混匀。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中,4℃,12000rpm离心30s。若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱CR3,请分两次转入;
(6)向吸附柱CR3中加入500μL去蛋白液RD(使用前请先检查是否已加入乙醇),4℃,12000rpm离心30s,弃废液并将CR3重新放回收集管中;
(7)向吸附柱CR3中加入500μL Buffer RW,室温静置2min,4℃,12000rpm离心30s,弃废液;
(8)重复操作步骤7;
(9)将CR3放回收集管中,4℃,12000rpm离心2min,丢弃收集管;
(10)室温开盖,平放在纸上,干燥5min;
(11)将吸附柱CR3转入一新RNase-free1.5mL离心管中,加50μL RNase-Free H2O,室温放置2min,4℃,12000rpm离心2min;
注:洗脱缓冲液体积不应少于30μL,体积过小影响回收效率,且RNA应保存在-80℃,以防降解。
D:T HESCs致病细胞模型样本(T HESCs+TGF-β样本)(n=1)准备及处理如下:使用10ng/mLTGF-β诱导的T HESCs细胞构建IUA细胞模型,处理方法同T HESCs阴性对照细胞(NC样本)处理步骤。
E:CM-UMSCs干预细胞模型样本(T HESCs+TGF-β+75% CM样本)(n=1)准备及处理如下:使用10ng/mLTGF-β诱导的T HESCs细胞构建了IUA细胞模型,处理方法同T HESCs阴性对照细胞(NC样本)处理步骤,CM-UMSCs用DMEM/F12以3:1的比例稀释至75%。然后,将THESCs致病细胞模型样本(TGF-β样本)与CM-UMSCs培养基孵育48小时,获得CM-UMSCs干预细胞。
在罗氏Light Cycler 480系统中,使用SYBR Green Supermix进行HT-QPCR。进行3个独立实验,并使用相对定量比较Ct方法来量化靶基因IGFBP3的相对mRNA水平。表1中列出了引物序列。QPCR测量数据表示为平均值±标准偏差(n=3)。
根据临床IUA样本的RNAseq(如实施例一步骤二中2所述)结果显示,在RNAseq获得的top20下调mRNA中,HT-QPCR验证了15个重叠mRNA;在RNAseq获得的top40上调mRNA中,HT-QPCR验证了25个重叠mRNA;(图2中a)在第一轮筛选后,获得了40个后续mRNA进行研究。进一步,用WaferGen HT-QPCR系统在IUA细胞模型样本中再次验证了40个重叠mRNA。因此,在组织中通过HT-QPCR验证的15个下调mRNA(IUA vs Con)中,10个mRNA在体外被再次确认(THESCs+TGF-βvs T HESCs),25个mRNA在组织中通过HT-QPCR验证(IUA vs Con),只有4个mRNA在体外被再次确认(T HESCs+TGF-βvs T HESCs)。经过HT-QPCR验证,其余26个mRNA在组织和细胞水平上未能获得一致的结果(图2中b)。第二轮筛选后,继续关注的mRNA数量减少到14个。最后,为了寻找CM-UCMSCs在IUA细胞模型中的潜在干预靶点,通过HT-QPCR找出最后14个mRNA中哪些在IUA细胞模型中(T HESCs+TGF-βvs T HESCs)增强(或降低),哪些在CM-UCMSCs干预组(T HESCs+TGF-βvs T HESCs+TGF-β+75%CM-UCMSCs)中恢复性下调(或上调)。结果显示,14个候选基因中有11个符合预设的表达趋势,这可能是CM-UCMSCs对IUA细胞积极干预作用的关键靶点(图2中c)。与正常细胞相比,IUA细胞模型的IGFBP3水平增加了28倍,然而,当用CM-UCMSCs处理IUA细胞模型时,IGFBP3的相对mRNA水平显著恢复。结果表明,IGFBP3可能是IUA的关键致病靶点,也是IUA模型中CM-UCMSCs的独特靶点之一。
四、IHC免疫组化检测正常及中、重度IUA子宫内膜组织中的IGFBP3蛋白表达情况
临床样本:从江西省妇幼保健院的生物样本库中,共收集了29份来自IUA患者的子宫内膜组织样本和31份来自健康对照女性(Con)的子宫内膜组织样本。
所有患者均签署了知情同意书,并获得了江西省妇幼保健院伦理委员会(批准号:EC-KT-202143)的批准。所有涉及的临床实验都是根据《赫尔辛基宣言》的原则进行的。
样本纳入标准:
IUA患者(IUA):所有样本来源的患者年龄≤35岁,经宫腔镜检查(金标准)诊断为中、重度IUA。中国IUA诊断分级评分标准见表2。
健康对照(Con):以要求上宫内节育器且子宫内膜病理检查正常的健康志愿者为对照,所有标本来源患者年龄≤35岁。
表2中国宫腔粘连(IUA)诊断分级评分标准
注:轻度:总分0-8分;中度:总分9-18分;重度:总分19-28分
IHC免疫组化染色法具体实验步骤如下:收集IUA患者的子宫内膜组织进行固定、石蜡包埋和切片(5μm连续切片),随后进行IHC染色。滴加抗IGFBP3特异性抗体(美国ImmunoWay公司,YT5518,1:100),实验结束时,在全景扫描系统下观察并拍摄所有载玻片。
免疫组化染色评价采用改良型免疫组织化学评分(组织病理染色评分)系统进行。该系统通过对病理切片的染色强度以及阳性细胞的百分比定量赋分后进行评估,其中依据染色强度可定义为0分、1分、2分、3分,分别对应于染色阴性、染色弱阳、染色中阳及染色强阳。同时,统计每个强度阳性细胞的百分比。所有的免疫组化染色切片均经3位专业的病理学家平行评估,且病理学家事先不了解患者的临床信息。若3位病理学家对切片的解读有分歧,3位病理学家将一起对该切片重新评估,直到达成共识。化学评分计算公式为:IGFBP3基因的表达分值=1×弱阳性百分率+2×中阳性百分率+3×强阳性百分率。样本的基本信息和IGFBP3基因的表达分值结果见表3。
表3样本的基本信息和IGFBP3基因的表达分值
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受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)反映了灵敏度与特异度间的平衡,ROC曲线下面积是重要的试验准确度指标,ROC曲线下面积越大,试验的诊断价值越大。
灵敏度(真阳性率):实际患病而按试验标准被正确判断为患病的百分率,灵敏度越大越好,理想灵敏度为100%。
特异度(真阴性率):实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率,特异度越大越好,理想特异度为100%。
用SPSS16.0软件以31例Con为对照组(真阴性)、29例IUA患者为疾病组(真阳性),对样本中的IGFBP3基因表达水平进行ROC曲线分析,曲线下面积AUC=0.924(图3)。此时,判定为IUA患者的阈值为IGFBP3基因的表达分值>25.549798,灵敏度为93.1%、特异度为80.6%。在实际应用中,筛查标准可为IGFBP3基因的表达分值大于25.5的检测对象疑似为IUA患者,IGFBP3基因的表达分值小于或等于25.5的检测对象候选为非IUA患者。
免疫组化结果如图4中a所示,正常子宫内膜组织中IGFBP3没有明显的阳性信号,而IGFBP3在中度IUA组织中表达增强,在重度IUA组织中IGFBP3表达最强。说明IGFBP3基因可作为中、重度IUA组织的筛查标志物。
实施例2、IGFBP3的敲低与过表达
一、IGFBP3的敲低细胞模型和过表达细胞模型构建
1.为了探究IGFBP3在IUA中的作用,在TGF-β处理的T HESCs中构建了IGFBP3功能缺失细胞模型,即IGFBP3敲低(简称si-IGFBP3),构建方法如下:
(1)引物设计
上游引物:5’-CAGCTCCAGGAAATGCTAGTG-3’;
下游引物:5’-GTCAACTTTGTAGCGCTGGC-3’;
内参引物及序列如下:
上游引物hsa-β-actin-FP:5’-TTCCTTCCTGGGCATGGAGTC-3’;
下游引物hsa-β-actin-RP:5’-TCTTCATTGTGCTGGGTGCC-3’;
(2)Q-PCR实验步骤
RNA提取后进行反转录(cDNA第一链的合成):操作规范参考Thermo公司反转录酶说明书,LncRNA/mRNA:在冰上配制如下反应体系(65℃,5min,立即置于冰上:RNA1000ng;Random Hexamer Primer1μL;NF-H2O Up to 12μL25℃。5min,42℃60min,70℃5min:5×Reaction Buffer4μL;RiboLock RNase inhibitor1μL;dNTP mix(10mM)2μL;RevertAid M-MuLV RT(200U/μL)1μL),并按照相应反应条件进行操作:
在冰上配制如下实时荧光定量PCR反应体系:总反应体系10μL:2×SuperRealPreMix Plus 5μL;Primer F+R(10μM)0.3μL;cDNA0.5μL;H2O 4.2μL。反应条件设置:温度95℃,时间15min,循环数1Cycles,不采集荧光信号;温度95℃,时间10S,循环数45Cycles,不采集荧光信号;温度60℃,时间30S,循环数45Cycles,不采集荧光信号;温度72℃,时间30S,循环数45Cycles,采集荧光信号。
通过将IGFBP3的三个特异性siRNA序列(具体序列见表4)转染到T HESCs中,获得了IGFBP3敲低细胞模型。
表4特异性si-RNAs序列
最终获得IGFBP3敲低模型:si-IGFBP3-557,si-IGFBP3-713,si-IGFBP3-986。采用QPCR验证不同siRNA序列对IGFBP3的干扰效率,即IGFBP3敲低效率,结果如图4中b所示。测量数据以均值±SD,n=3;****P<0.0001。
2.在TGF-β处理的T HESCs中构建了IGFBP3过表达细胞模型,简称IGFBP3-OV,构建方法如下:
(1)引物设计
上游引物:5’-CAGCTCCAGGAAATGCTAGTG-3’;
下游引物:5’-GTCAACTTTGTAGCGCTGGC-3’;
内参引物及序列如下:
上游引物hsa-β-actin-FP:5’-TTCCTTCCTGGGCATGGAGTC-3’;
下游引物hsa-β-actin-RP:5’-TCTTCATTGTGCTGGGTGCC-3’。
(2)Q-PCR实验:
提取RNA后,进行反转录,操作规范参考Thermo公司反转录酶说明书。LncRNA/mRNA:在冰上配制如下反应体系,并按照相应反应条件进行操作:总反应体系:20μL,RNA1000ng,65℃5min,立即至于冰上:Random Hexamer Primer1μL,NF-H2O Up to 12μL;25℃5min,42℃60min,70℃5min:5×Reaction Buffer4μL,RiboLock RNase inhibitor1μL,dNTP mix(10mM)2μL,RevertAid M-MuLV RT(200U/μL)1μL。
(3)实时荧光定量PCR反应LncRNA/mRNA:在冰上配制如下反应体系:总反应体系10μL:2×SuperReal PreMix Plus5μL,Primer mix(10uM)0.3μL,cDNA0.5μL,H2O 4.2μL。
反应条件设置:温度95℃,时间15min,循环数1Cycles,不采集荧光信号;温度95℃,时间10S,循环数45Cycles,不采集荧光信号;温度60℃,时间30S,循环数45Cycles,不采集荧光信号;温度72℃,时间30S,循环数45Cycles,采集荧光信号。
将IGFBP3过表达合成质粒转染T HESCs,获得IGFBP3功能细胞模型IGFBP3-OV。随后,通过qPCR和western blot证实了IGFBP3在T HESCs中的成功过表达(IGFBP3-OV),如图5中a所示,通过CCK8测定,与阴性对照IUA细胞(NC-OV)相比,CM-UCMSCs对IGFBP3过表达的IUA细胞的生存促进作用显著减弱(图5中b)。
二、IGFBP3敲低与过表达的IUA细胞模型的生物学功能研究
IGFBP3在子宫内膜基质细胞(T HESCs)中的敲低和过表达后,进行IGFBP3敲低与过表达IUA细胞模型的生物学功能研究。
受试细胞为:A:IGFBP3敲低的IUA细胞(si-IGFBP3);B:未做处理的IGFBP3的IUA细胞(NC对照);C:IGFBP3过表达的IUA细胞(IGFBP3-OV);D:未做处理的IGFBP3的IUA细胞(NC对照)
1.IUA细胞的经典炎症因子ELISA检测和蛋白印迹(western blot,WB)实验
(1)采用ELISA检测受试细胞的存活率。受试细胞为IGFBP3敲低或过表达的细胞模型。
ELISA检测具体实验步骤如下:收集受试细胞培养上清液,在TGF-β处理48小时后,根据制造商的说明,使用IL-β、IL-6、TNF-αELISA试剂盒进行炎症因子的ELISA检测。
(2)蛋白印迹(western blot,WB)实验
使用WB实验检测受试细胞模型中IGFBP3和纤维化标志物CTGF、胶原-I(Collagen-I)、α-SMA的蛋白表达,β-肌动蛋白为内参蛋白。表5列出了使用的主要抗体。β-肌动蛋白为内参蛋白。
表5western blot实验所用抗体
2.细胞存活和凋亡实验
(1)采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)方法来检测受试细胞的存活率。受试细胞为IGFBP3敲低或过表达的细胞模型。
将受试细胞在96孔培养板(1×103受试细胞/孔)中培养。在预定时间点,用100μLDMEM/F12(含10μL CCK-8试剂)替换培养基。培养3小时后,测量450nm处的光吸收率OD450。所有试验至少进行三次。
(2)annexin-V细胞凋亡试验评估细胞活力。
具体步骤如下:
1)离心收集悬浮细胞,微量离心机转速2000RPM,离心时间5min,弃培养基。
2)用冷PBS洗涤细胞两次。
3)用400μL 1×Binding Buffer悬浮细胞,浓度大约为1×10cells/mL。
4)在细胞悬浮液中加入5μLAnnexinV-FITC,轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育15分钟。
5)加入10μLPI后轻轻混匀于2-8℃避光条件下孵育5分钟,在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
3.细胞增殖实验
采用EDU掺入实验评估细胞增殖能力。受试细胞为IGFBP3敲低或过表达的细胞模型。
将不同实验组的受试细胞与10μM EDU孵育4小时,然后用3.7%的甲醛固定15分钟。EDU公司根据制造商的说明进行了测试。在共焦激光扫描显微镜系统(日本东京尼康)上进行成像。对EDU和Hoechst 33342均呈阳性的ESC使用图像J进行计数,并用于计算EDU阳性细胞的百分比。
4.IUA细胞迁移实验
首先将1.0×105/mL受试转染的细胞接种于37℃培养的6孔培养板(2mL/孔)中,直至约80%汇合,然后用TGF-β(10ng/mL)处理48h;随后收集细胞并以1.5×104/100μL稀释,然后添加到transwell上腔。在上腔中加入300μL无血清培养基或CM-UCMSCs。将含有20%FBS的500μL培养基加入下室,在37℃、5%CO2中培养48h;transwell腔室用PBS清洗3次,添加4%的组织固定液多聚甲醛,并在室温下固定20分钟;添加0.1%结晶紫15分钟,然后用显微镜成像。
5.统计分析
本研究中列出的所有实验结果均以平均值±SD表示。使用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析。对两种情况进行T检验比较。采用Bonferroni后验方差分析进行多重比较。P值<0.05被认为具有统计学意义。
三、IGFBP3敲低的IUA细胞模型中的生物学功能研究结果分析
1.经典炎症因子的ELISA检测(图4中c)发现,在IGFBP3敲低的IUA细胞(si-IGFBP3)中,IL-1β、IL-6和TNF-α均明显降低。
2.蛋白印迹实验表明,与未下调IGFBP3的IUA细胞(si-NC)相比,IGFBP3敲低(si-IGFBP3)的IUA细胞中纤维化标志物α-SMA、胶原-I和CTGF的表达也明显降低(图4中d)。
3.CCk8和annexin-V细胞凋亡实验显示,与未下调IGFBP3的IUA细胞(si-NC)相比,IGFBP3敲低(si-IGFBP3)的IUA细胞的细胞活力增强,细胞凋亡受到明显抑制(图4中e-g)。
4.EDU染色进行评估细胞增殖和相对结果显示,即使采用相同的TGF-β处理,显示红色EDU荧光信号IGFBP3敲除后的T HESCs活细胞的比例明显高于对照组(si-NC,图4中h和i)。
5.细胞迁移实验显示,在跨孔系统中,IGFBP3敲低细胞(si-IGFBP3)通过中间膜的IUA细胞数量远远多于没有IGFBP3敲低(si-NC)的IUA细胞,表明细胞活力有显著改善(图4中j和k)。
四、IGFBP3过表达的IUA细胞模型中的生物学功能研究结果分析
1.CCK8检测如图5中b所示,与阴性对照IUA细胞(NC-OV)相比,CM-UCMSCs对IGFBP3过表达的IUA细胞(IGFBP3-OV)的生存促进作用明显减弱。
2.细胞迁移实验结果如图5中c和d显示,在未经CM-UCMSCs处理的情况下,过表达IGFBP3可以明显减少通过中间膜的IUA细胞数量。当加入75%的CM-UCMSCs进行干预时,对于过表达IGFBP3的IUA细胞,CM-UCMSCs可增加通过中间膜的IUA细胞数量。
3.使用WB实验检测IGFBP3过表达的IUA细胞(IGFBP3-OV)模型中IGFBP3和纤维化标志物CTGF、胶原-I(Collagen-I)、α-SMA的蛋白表达。
结果如图5中e和f所示,IGFBP3过表达显著提高了纤维化标志物蛋白的表达。经CM-UCMSCs干预后,纤维化标志物蛋白的表达均显著降低。但是过表达IGFBP3的IUA细胞(IGFBP3-OV+CM-UCMSCs)的纤维化标志蛋白的表达仍明显强于对照组的IUA细胞(NC-OV+CM-UCMSCs)。这些结果表明,IGFBP3过表达在一定程度上抑制了CM-UCMSCs对IUA细胞模型的积极作用。
实施例3、探索IGFBP3的下游效应器
一、对IGFBP3敲低的IUA细胞模型进行RNA测序
1.提取T HESCs阴性对照细胞和IGFBP3敲低的细胞模型样本的RNA
A.T HESCs阴性对照细胞(si-NC样本)(n=2)准备及处理如下:处理方法同实施例1的高通量通用实时定量PCR验证宫腔粘连(IUA)靶点mRNA步骤中T HESCs阴性对照细胞(NC样本)处理步骤。
B.IGFBP3敲低的细胞模型(si-IGFBP3样本)(n=2)准备及处理如下:
处理方法同实施例1的高通量通用实时定量PCR验证宫腔粘连(IUA)靶点mRNA步骤中T HESCs阴性对照细胞(NC样本)处理步骤。
2.RNA测序
RNA质量检查后,共对si-NC样本(n=2)和si-IGFBP3样本(n=2)进行RNA测序(RNA-seq)。
二、验证IGFBP3下游效应器的相关研究
1.Q-PCR验证KLF1、KLF2、MMP1、MMP10表达情况
分组:A:si-NC+TGF-β
B:si-IGFBP3+TGF-β
C:si-NC
D:si-IGFBP3
按以上分组进行RNA提取,提取步骤同实施例1的高通量通用实时定量PCR验证宫腔粘连(IUA)靶点mRNA步骤中T HESCs阴性对照细胞(NC样本)处理步骤。
(1)引物设计
目标引物如下:
使用的KLF2、KLF6、MMP1、MMP10正向引物及反向引物序列见表1。
内参引物及序列如下:
hsa-β-actin-FP:TTCCTTCCTGGGCATGGAGTC
hsa-β-actin-RP:TCTTCATTGTGCTGGGTGCC
(2)Q-PCR实验步骤
T HESCs阴性对照细胞(si-NC样本)和IGFBP3敲低的细胞模型(si-IGFBP3样本)进行RNA提取后进行反转录(cDNA第一链的合成):操作规范参考Thermo公司反转录酶说明书,LncRNA/mRNA:在冰上配制如下反应体系(65℃,5min,立即置于冰上:RNA1000ng;RandomHexamer Primer1μL;NF-H2O Up to 12μL25℃。5min,42℃60min,70℃5min:5×ReactionBuffer4μL;RiboLock RNase inhibitor1μL;dNTP mix(10mM)2μL;RevertAid M-MuLV RT(200U/μL)1μL),并按照相应反应条件进行操作:
在冰上配制如下实时荧光定量PCR反应体系:总反应体系10μL:2×SuperRealPreMix Plus 5μL;Primer F+R(10μM)0.3μL;cDNA0.5μL;H2O 4.2μL。反应条件设置:温度95℃,时间15min,循环数1Cycles,不采集荧光信号;温度95℃,时间10S,循环数45Cycles,不采集荧光信号;温度60℃,时间30S,循环数45Cycles,不采集荧光信号;温度72℃,时间30S,循环数45Cycles,采集荧光信号。
2.WB验证MMP1与KLF2与IGFBP3相关性
使用WB实验检测正常对照组织和IGFBP3敲低的细胞模型中KLF2与IGFBP3蛋白表达。使用的主要抗体见表5。β-肌动蛋白为内参蛋白。
三、测序以及相关结果分析
通过专业的生物信息学分析,获得了214个显著上调的mRNA和416个显著下调的mRNA(IUA vs Con,p<0.05,|log2FoldChange|>1.0)(图6中a)。随后,进行聚类分析,根据si-IGFBP3和si-NC组之间的p值,绘制并澄清前60个差异表达的mRNA(图6中b)。结合文献筛选与Q-PCR实验证实后,KLF2、KLF6、MMP1、MMP10可能是IGFBP3的下游效应器(图6中c),与对照组相比,MMP1与MMP10在IGFBP3敲低模型中呈显著上升趋势,在加入TGF-β后,与正常对照组相比,在IGFBP3敲低模型中四个基因的表达均呈显著上升趋势,这表明,在宫腔粘连环境中,IGFBP3的表达可能抑制了KLF2、KLF6、MMP1、MMP10的表达,而在正常环境中,敲低IGFBP3后,MMP1与MMP10表达显著上升,表明MMP1和MMP10可能是IGFBP3的直接下游效应器,KLF2、KLF6可能不直接与IGFBP3直接相关,但是在发生宫腔粘连时,敲低IGFBP3后,IGFBP3的另外某种下游基因可能得以表达/沉默,作用于KLF2、KLF6,使KLF2、KLF6显著上升,也就是说,IGFBP3间接作用于KLF2、KLF6。结合相关文献,发现IGFBP3可能通过TP53抑制KLF2、KLF6的表达(图6中d)。进一步的western blot实验表明,在敲低IGFBP3后,MMP1,KLF2的表达升高(图6中e),这证明了MMP1与KLF2是IGFBP3的下游或下游相关基因,并且IGFBP3对MMP1与KLF2的表达呈抑制作用。以上结果提示,CM-UCMSCs通过抑制IGFBP3缓解IUA,引起其下游靶点MMP1、KLF2的表达改变,从而对TGF-β诱导的T HESCs具有积极的治疗作用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。
Claims (8)
1.检测IGFBP3或其基因的物质在制备筛查和/或辅助筛查IUA产品的应用。
2.检测IGFBP3或其基因的物质在制备诊断和/或辅助诊断IUA产品的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述物质为下述任一种:
(1)用于检测所述基因的mRNA表达水平的试剂;
(2)用于检测所述基因的蛋白质表达水平的试剂。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述物质包括通过免疫组化法、逆转录-聚合酶链反应、实时荧光定量PCR、转录组测序技术、Northern blot、原位杂交技术、基因芯片技术、Nanopore测序技术、PacBio测序技术、免疫印迹法、免疫荧光法、放射免疫测定法、免疫共沉淀法、酶联免疫吸附试验、酶免疫测定法、流式细胞术、高效液相色谱法、毛细管凝胶电泳法、近红外光谱法、质谱法、免疫化学发光法、胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术、表面等离子共振技术、免疫-PCR技术或生物素-亲和素技术检测所述基因的试剂。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用,其特征在于,所述产品包括试剂盒、基因芯片、蛋白质芯片、免疫层析诊断试纸、高通量测序平台或生物传感器。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用,其特征在于,所述产品包括所述物质。
7.根据权利要求1-6中任一所述的应用,其特征在于,所述产品的检测样本来源于具有下述至少一种症状的患者:月经过少、闭经、盆腔疼痛、复发性流产和不孕。
8.用于IUA的筛查、诊断或辅助诊断的装置,其特征在于,所述装置包括权利要求1-4中任一所述的物质和存储有计算机程序的计算机可读存储介质,所述计算机程序使计算机执行如下步骤:检测具有下述至少一种症状的受试者进行IGFBP3或其基因的表达量的检测,根据所述表达量进行IUA的筛查、诊断或辅助诊断:月经过少、闭经、盆腔疼痛、复发性流产和不孕。
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CN (1) | CN117778558A (zh) |
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2023
- 2023-12-19 CN CN202311754632.2A patent/CN117778558A/zh active Pending
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