CN108728523B - Bcl-3作为诊断早期肾纤维化的标志物的应用 - Google Patents

Bcl-3作为诊断早期肾纤维化的标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及Bcl‑3作为诊断早期肾纤维化的标志物的应用。与现有的肾纤维化诊断标志物相比，血清Bcl‑3水平能够在肾纤维化的更早阶段反映出疾病的发生，是一种良好的诊断标志物。

Description

Bcl-3作为诊断早期肾纤维化的标志物的应用
技术领域
本发明属于诊断领域，更具体地，本发明涉及Bcl-3作为诊断早期肾纤维化的标志物的应用。
背景技术
慢性肾脏疾病(chronic kidney disease，CKD)通常会导致肾纤维化，最终不可逆转地发展成为晚期的肾衰竭，同时伴随一些心血管的并发症，增加病人的死亡风险，是一个世界性的难题。在中国慢性肾脏疾病的发病率居高不下，每年都有超过百万人死于慢性肾脏疾病及其并发症，有报道预测在2010年到2030年的20年内世界范围内慢性肾脏疾病患者将激增近一倍。
慢性肾损伤是一种进行性的肾脏疾病，主要是由于I型胶原蛋白和其他胞外基质蛋白的积累导致肾脏结构和功能的改变，最终导致肾衰竭，以肾小球硬化和肾小管间质的纤维化程度为标志。从发病机制上看，导致肾纤维化的主要原因是由于一些损伤刺激引起肾脏炎症的产生，表现为免疫细胞的浸润到受损组织和一些炎症因子的分泌；另外，实质结构的破坏后会肾脏局部缺氧、缺血等状况导致细胞的凋亡从而引起肾衰竭。对于肾纤维化的研究主要集中在研究肾纤维化过程中TGF-β信号通路的变化：TGF-β是一种多肽生长因子，参与调节多种细胞生物学过程包括细胞的分化、增殖、凋亡，黏附和迁移等，从而促进细胞外基质积聚、诱导上皮细胞到间充质细胞的转化以及调节免疫功能等从而加剧纤维化(经典TGF-β/Smad信号通路的激活过程大致为：TGF-β与TGF-βRⅡ结合使得TGF-βRⅡ发生二聚化，然后导致自身磷酸化，磷酸化的TGF-βRⅡ能够进一步磷酸化激活TGF-βRI的GS区，导致TGF-βRI受体丝氨酸/苏氨酸激酶的激活从而特异性识别并通过磷酸化其MH2区SSXS结构激活Smad2/3，激活后的Smad2/3与受体解离并与细胞质内Smad4结合，形成异源复合物，二者共同入核与核内相应转录因子结合 启动调控基因的表达)。
单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction，UUO)模型是目前研究肾纤维化疾病常用的经典模型，利用小鼠构建UUO模型是研究肾纤维化发病机理最常用且简便的方法。
目前，临床上对肾纤维化的诊断仍以肾组织病理活检为主，但它作为一种侵入性的诊断方法会对患者造成一定程度的身体创伤甚至死亡，并且难以动态连续地观察病程进展。检测血清中肌酸酐和尿素的含量也是临床上常用的诊断方法，但难以保证诊断的有效性及准确性，而通过核磁共振的方法全面检测分析尿液的代谢组分成本过高，难以普及。另外，这些检测方法能够检测到的病理现象大都是由于肾功能衰减后引起的伴随现象，很难在肾纤维化的早期检测到病情的发生。
因此，找到可以应用于临床的并且能够有效诊断早期肾纤维化的标志物对于疾病的及时发现和治疗都具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供Bcl-3作为诊断早期肾纤维化的标志物的应用。
在本发明的第一方面，提供Bcl-3蛋白或其编码基因在制备诊断试剂或试剂盒中的用途，所述的诊断试剂或试剂盒用于诊断肾纤维化。
在一个优选例中，所述的诊断试剂或试剂盒用于诊断血清Bcl-3含量。
在本发明的另一方面，提供特异性识别或扩增或结合Bcl-3蛋白或其编码基因的诊断试剂的用途，用于制备诊断肾纤维化的试剂盒。
在一个优选例中，所述的肾纤维化是早期肾纤维化。
在另一个优选例中，所述的诊断试剂选自：
特异性扩增Bcl-3蛋白的编码基因的引物；或
特异性识别Bcl-3蛋白的编码基因或其转录本的探针；或
特异性抗Bcl-3蛋白的抗体。
在另一个优选例中，所述的特异性扩增Bcl-3蛋白的编码基因的引物是引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
在另一个优选例中，所述的特异性抗Bcl-3蛋白的抗体是单抗或多抗。
在本发明的另一方面，提供一种用于诊断肾纤维化的试剂盒，所述的试剂盒中含有：检测Bcl-3蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂；其选自：
特异性扩增Bcl-3蛋白的编码基因的引物；或
特异性识别Bcl-3蛋白的编码基因或其转录本的探针；或
特异性抗Bcl-3蛋白的抗体。
在另一个优选例中，所述的试剂盒中还包括：
核酸抽提试剂；和/或
聚合酶链反应试剂；和/或
蛋白免疫印迹试剂；和/或
酶链免疫反应试剂。
在另一个优选例中，所述的肾纤维化是早期肾纤维化。
在本发明的另一方面，提供一种测定肾纤维化的方法，所述方法包括：检测待测样品(较佳地，为血清)中的Bcl-3蛋白或其编码基因的表达情况或表达量，若存在显著性升高，则表明存在肾纤维化。
在另一个优选例中，所述的肾纤维化是早期肾纤维化。
在另一优选例中，所述的方法还包括设置对照，该对照是正常人的血清Bcl-3表达水平。
在另一优选例中，所述的检测待测样品中的Bcl-3蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的方法包括：免疫印迹法，PCR法，染色法。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、肾纤维化模型中差异基因的表达以及在NF-kB信号通路上的富集。
(A)假手术组与结扎2天及8天组的小鼠比较后找出的1736个差异基因(采用原始数据作图)。
(B)将差异基因通过通路富集找到了37个与NF-kB信号通路相关的差异基因。
图2、小鼠肾纤维化模型(UUO)的建立。
(A)对C57-WT小鼠进行左侧单侧输尿管结扎，然后15天后取其肾脏；其中，L表示结扎一侧肾脏即左侧肾脏，NL表示未结扎一侧肾脏即右侧肾脏；sham表示假手术组，UUO表示肾纤维化模型组。
(B)对实验组和对照组的肾脏切片进行H&E和Sirius red染色，比例尺为50微米。
(C)通过免疫组织化学法观察实验组和对照组肾脏中平滑肌动蛋白(α-SMA)的表达，比例尺为50微米。
(D)通过RT-PCR的方法检测Wfdc2，Snai1，Rela，Bcl-3，Acta2，Col1α1，Tgfb1，P21和Twist1这9种基因的mRNA表达水平。
图3检测结扎不同时间点的小鼠肾纤维化模型中Bcl-3的mRNA的表达水平。
(A)结扎策略：对小鼠左侧输尿管结扎不同天数(1，3，7，11及15天)，构建结扎不同时间点的模型。
(B)如图所示是对小鼠左侧输尿管结扎不同时间点后取出其左侧及右侧肾脏。
(C-H)通过RT-PCR的方法检测Wfdc2，Snai1，Rela，Bcl-3，Acta2，Col1α1，Tgfb1，P21和Twist1这9种基因的mRNA表达水平。
图4、检测结扎不同时间点的小鼠肾纤维化模型中Bcl-3的蛋白表达水平。
(A)对结扎不同时间点及假手术组的小鼠的肾脏组织切片进行H&E和Sirius red染色，比例尺为50微米。
(B-D)通过免疫组织化学法观察结扎不同时间点及假手术组的小鼠的肾脏组织中平滑肌动蛋白(α-SMA)，人附睾蛋白4(HE4)及B细胞淋巴瘤因子(Bcl-3)的表达，比例尺为50微米。
图5、用免疫印迹(WB)的方法检测结扎不同时间点的小鼠肾纤维化模型组织及血清中Bcl-3的蛋白表达水平。
(A)通过WB的方法检测结扎不同时间点小鼠模型的肾脏组织中Ⅰ型胶原蛋白，α-SMA，HE4和Bcl-3的表达。
(B，C)通过测定条带的灰度值对a图中的结果进行量化处理。
(D，F)通过WB的方法检测结扎不同时间点小鼠模型血清(1微升)中HE4和Bcl-3的含量。
(E，G)通过测定条带的灰度值对d和f图中的结果进行量化处理。
图6A、用WB的方法检测结扎肾纤维化病人血清中HE4和Bcl-3的蛋白表达水平。
图6B、31个CKD病人及每个病人相应的正常人血清中Bcl-3的含量。图中数据均为测定条带灰度值的原始数据。
图6C、31个CKD病人及25个正常人血清中HE4和Bcl-3含量相关性的分析表明两者相关性显著。
图6D、分析21个病人的血清(CKD2，CKD3)以及对应的正常人的血清Bcl-3的ROC曲线。
图6E、通过分析31个病人及25个正常人血清中Bcl-3的ROC曲线分析表明：Bcl-3可以作为诊断早期肾纤维化的标志物。
图7、Bcl-3在EMT调控网络中的作用。
(A)分析了Bcl-3基因与83种在EMT过程中起重要作用的基因之间的相互关系。
(B)从83种在EMT过程中起重要作用的基因中找到了22种与Bcl-3有相互作用的基因。
具体实施方式
本发明人通过分析研究，首次发现血清Bcl-3能够作为诊断标志物，用于诊断肾纤维化，尤其是诊断早期肾纤维化。与现有的肾纤维化诊断标志物相比，血清Bcl-3能够在肾纤维化的更早阶段反映出疾病的发生，是一种良好的诊断标志物。
如本文所用，“早期肾纤维化”是按照根据eGFR(肾小球滤过率)的指标，处于CKD3级或CKD2级的肾纤维化。eGFR的指标是目前临床上用于划定肾纤维化病人分期的指标。例如，临床上关于分期的常用方法：CKD2，eGFR为60-89mL/min/1.73m2；CKD3，eGFR为30-59mL/min/1.73m2；CKD4，eGFR 15-29mL/min/1.73m2；及CKD5，eGFR<15mL/min/1.73m2。
Bcl-3
Bcl-3(B-cell CLL/lymphoma 3)是非经典IkB家族成员之一，本发明人在研究中意外地发现，Bcl-3在肾纤维化的早期就有高差异表达，可以作为诊断早期肾纤维化的标志物。
Bcl-3作为一种核蛋白可以在炎症发生以及肿瘤发展等生物学过程中起重要作用。在肾纤维化发生发展过程中，Bcl-3可以通过稳定Smad3直接调控TGF-β信号通路并且通过与在EMT的发生发展过程中起重要作用的基因(如，Smad2/3，Tgfb1，Akt和Cd44等)从而直接参与调控肾纤维化过程中炎症发生。另外，Bcl-3作为一种核蛋白是通过何种机制被释放到血清中还不清楚，但是本发明人推测Bcl-3可能是通过外泌体的形式被释放到血清。
本发明人通过构建UUO小鼠模型发现并验证了Bcl-3作为检测早期肾纤维化标志物的可行性，本发明人也在患有不同程度慢性肾脏疾病的病人血清中验证了这一点。在本发明的具体实施例中，通过左侧单侧输尿管结扎的方法，本发明人在WT-C57小鼠中构建了结扎不同时间点(分别是：1，3，7，11和15天)的UUO模型及相应的假手术模型，在这些模型中探讨了Bcl-3在mRNA及蛋白水平出现高表达的时间点，并且在患有慢性肾脏疾病的病人 血清中验证了Bcl-3分子作为诊断早期肾纤维化标志物的可行性。结果显示：在小鼠模型中，纤维化肾脏组织中的Bcl-3的mRNA在结扎1d后就有显著高表达，纤维化肾脏组织的Bcl-3蛋白在结扎3天后有显著高表达，血清中的Bcl-3蛋白在结扎3天后也有显著的差异。另外，本发明人在正常人(n＝25)和病人(n＝31)血清标本中也进行了验证，在CKD2，CKD3病人血清中Bcl-3蛋白开始上调。因此，血清中Bcl-3蛋白可以作为诊断早期肾纤维化的标志物。
本发明人发现，与其他的诊断肾纤维化的方法相比，Bcl-3有以下三大优点：一是，与其他诊断标志物相比(如HE4)，Bcl-3在患有早期慢性肾脏疾病病人的血清中就能够检测到上调，可以与已有的成熟的诊断标志物进行联合检测；二是，与肾组织病理活检相比，用Bcl-3作为诊断标志物具有非侵入性，仅需要取少量甚至微量的病人血清，不会对病人身体健康造成危害；三是，与核磁共振的方法分析尿液的代谢组分相比，检测血清中标志物的方法成本更低，检测方法更加灵活，时效性高而且也更容易普及。
在本发明中，术语“Bcl-3蛋白”的氨基酸序列与GenBank登录号NP_005169或SEQID NO:23(人)提供的蛋白序列基本上相同，或与AAC79694.1或SEQ ID NO:24(鼠)提供的蛋白序列基本上相同，也包括Bcl-3蛋白的同源蛋白。
基于本发明人的新发现，可以以Bcl-3蛋白或其编码基因作为测定肾纤维化，特别是检测早期肾纤维化的标志物。通过分析待测样品(样本)中Bcl-3蛋白或其编码基因的表达情况，从而得知受试者的患病状况，为疾病的诊断或预后提供依据。所述的待测样品或待测样本是患者的体液，较佳地是血清。
可采用各种技术来检测Bcl-3的表达情况，这些技术均包含在本发明中。检测核酸可用的已有技术如(但不限于)：基因芯片技术、探针杂交技术、聚合酶链反应(PCR)、Northern Blot等方法。检测蛋白可借助于质谱分析仪器等，或可通过Western Blot或ELISA等方法。
作为本发明的一种选择方式，通过定量或半定量的聚合酶链反应(PCR)法来分析样品中Bcl-3基因的表达情况以及表达量，从而可做出判断。较佳 地，通过实时定量Realtime-PCR实现检测。
基于本发明的新发现，本发明还提供了特异性识别Bcl-3蛋白或其编码基因的试剂。任何可识别Bcl-3蛋白或其编码基因的试剂均包含在本发明中，用作检测肾纤维化，尤其是早期肾纤维化的标志物。所述的特异性识别Bcl-3蛋白或其编码基因的试剂例如是：特异性扩增Bcl-3蛋白的编码基因的引物；或特异性识别Bcl-3蛋白的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗Bcl-3蛋白的抗体。
本发明还提供了一种特异性识别Bcl-3蛋白或其编码基因的试剂的用途，用于检测肾纤维化，尤其是早期肾纤维化或选择出相关高危人群。
作为本发明的一种实施方式，所述的试剂是抗Bcl-3的抗体；更特别的例如是单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的抗原可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生，所述的动物如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。
所述的抗体可用于免疫化学技术中，检测标本中的Bcl-3水平，从而用于诊断肾纤维化，尤其是早期肾纤维化。
作为本发明的另一种实施方式，所述的试剂是特异性扩增Bcl-3基因的引物。作为本发明的更优选方式，所述的引物是引物对，具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。所述的引物对能够扩增获得合适长度的扩增产物，检测的特异性良好。
也可利用基因芯片技术来进行Bcl-3的检测。在得知了Bcl-3的核苷酸序列后，人们易于基于此设计出探针。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后点样仪将其点在修饰玻片或硅片，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的基因芯片。如果寡核苷酸探针不含 氨基修饰，则其制备方法也可参照现有公知技术。
利用所述的抗体、探针或引物，可以检测体液中Bcl-3蛋白或Bcl-3基因的水平，因而可用于检测肾纤维化，尤其是早期肾纤维化，或者用于制备检测制剂或试剂盒等。
本发明还提供了用于检测肾纤维化，尤其是早期肾纤维化的试剂盒，该试剂盒包括：特异性识别Bcl-3蛋白或其编码基因的试剂。所述的特异性识别Bcl-3蛋白或其编码基因的试剂例如是：特异性扩增Bcl-3蛋白的编码基因的引物；或特异性识别Bcl-3蛋白的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗Bcl-3蛋白的抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)。
所述的试剂盒中还可含有：核酸抽提试剂(如核酸抽提液)；和/或聚合酶链反应试剂(如dNTP，Taq酶)；和/或蛋白免疫印迹试剂；和/或酶链免疫反应试剂(如显色液或杂交液)。
作为一种优选方式，所述的试剂盒中还可含有：用于免疫化学分析的试剂，所述的试剂例如：第二抗体、染色剂、显色剂等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书等。更具体地，所述的试剂盒可以是一种基于酶联免疫反应(ELISA)技术的试剂盒。ELISA技术以及基于该技术的检测试剂对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
作为另一种优选方式，所述的试剂盒中还可含有：(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于：Taq酶，PCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶等；或(B)各种提取DNA或RNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于：酚、氯仿、异戊醇、NaCl等；或(C)提取DNA或RNA的试剂盒。
所述的特异性识别Bcl-3蛋白或其编码基因的试剂也可固定于试纸上，制备成免疫胶体金试纸或类似检测材料。
此外，所述的试剂盒中还可含有本发明的试剂盒的使用说明书和/或标准操作程序。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实 验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
方法与材料
1、实验动物
选用6-8周雄性C57-WT小鼠。所有的动物都是饲养在无菌环境中(SPF级)，并且严格遵循保护动物福利的原则，遵从上海生科院伦理委员会关于动物饲养与实验的相关规定。
2、Real-Time PCR分析
用购买的商业化的RNA抽提试剂盒(Invitrogen，15596-018)按照相应的说明书上的操作抽提RNA。用购买的商业化的反转录试剂盒(TransGen Biotech，AT301)将RNA反转录为cDNA。所有的上机操作都是由7900Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems)完成，并且实时定量PCR所用到的一切试剂及耗材都是由Applied Biosystems购买。每个样品的检测都经历至少3次的独立重复实验。误差线代表标准差，P值的计算是由双尾的t-test检验完成，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。RT-PCR的引物序列如下(碱基序列方向均为5’-3’，第一条为Forward单链序列，第二条为Reverse单链序列)：
Mouse Bcl-3:
GAGTAGGCAGGTTCAGCAGC(SEQ ID NO:3)；
CCGGAGGCCCTTTACTACC(SEQ ID NO:4)。
Mouse Rela:
TAGGTCCTTTTGCGCTTCTC(SEQ ID NO:5)；
GCTCCTGTTCGAGTCTCCAT(SEQ ID NO:6)。
Mouse Cdkn1a：
GTGGCCTTGTCGCTGTCTT(SEQ ID NO:7)；
GCGCTTGGAGTGATAGAAATCTG(SEQ ID NO:8)。
Mouse Twist1：
CTGCCCTCGGACAAGCTGAG(SEQ ID NO:9)；
CTAGTGGGACGCGGACATGG(SEQ ID NO:10)。
Mouse Snai-1:
CTCTTCACATCCGAGTGGGT(SEQ ID NO:11)；
TGGAAAGGCCTTCTCTAGGC(SEQ ID NO:12)。
Mouse Acta2:
GTTCAGTGGTGCCTCTGTCA(SEQ ID NO:13)；
ACTGGGACGACATGGAAAAG(SEQ ID NO:14)。
Mouseβ-actin:
GGCTGTATTCCCCTCCATCG(SEQ ID NO:15)；
CCAGTTGGTAACAATGCCATGT(SEQ ID NO:16)。
Mouse HE4:
AACCAATTACGGACTGTGTGTT(SEQ ID NO:17)；
TCGCTCGGTCCATTAGGCT(SEQ ID NO:18)。
Mouse Col1a1:
GCTCCTCTTAGGGGCCACT(SEQ ID NO:19)；
CCACGTCTCACCATTGGGG(SEQ ID NO:20)。
Mouse Tgfb1:
CACGTGGAAATCAACGGGAT(SEQ ID NO:21)；
GCGCACAATCATGTTGGACA(SEQ ID NO:22)。
Human Bcl-3:
GTGCAGATGAGGACGGAGA(SEQ ID NO:1)；
GCCGGACCACAGACGGTAAT(SEQ ID NO:2)。
3、Western blotting
肾脏组织由pH＝7.4的PBS冲洗，然后用蛋白裂解液(主要成分为20mM，pH＝7.4的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，12.5mM的β-甘油磷酸盐，0.5％Triton X-100，150mM NaCl，1.5mMMgCl2，2mM EGTA等)置于冰上裂解30分钟，然后在14，000rmp，4℃的条件下离心15分钟，然后将收集的蛋白变性用变性胶分析样品，具体操作按照严格的实验室流程进行。具体一抗分别购买于以下公司：TypeⅠcollagen(Proteintech Group，USA)，α-SMA(Abcam，UK)，Bcl-3(Santa Cruz Biotechnology，CA)，HE4(Proteintech Group，USA)。
4、Histology and immunohistochemistry
收集的肾脏组织置于4％PFA中脱水24小时，然后用石蜡进行包埋，切片(5μm厚)，将其展片到载玻片上，放于60℃培养箱中烘干4小时后进行脱蜡处理，将处理好的样品应用于各种染色和组化，分析组织的形态学变化及各种蛋白的表达。用购买的商业化试剂盒进行天狼猩红(Sigma-Aldrich)及免疫组化染色(UltraTek；Scytek)。图片是用ZEN LightEdition software(Carl Zeiss)进行拍摄。图上的比例尺都代表50微米的长度。
5、试剂
实施例中所用到的试剂如表1。
表1
Figure DEST_PATH_GDA0001294365300000121
Figure DEST_PATH_GDA0001294365300000131
实施例1、基因筛选
基于GSE79443所记载的数据，本发明人分析了肾纤维化小鼠模型全转录组差异基因分析的数据。结合本发明人的经验，在分析过程中，采用严格的筛选方案(P<0.01，foldchange>1.5倍)，从大约40,000个基因中筛选出1736个差异基因，部分分析结果如图1A。
然后，本发明人将这些差异基因通过通路富集(https://david.ncifcrf.gov/)的方法，确定了37个与NF-kB信号通路相关的差异基因，如图1B。分析这37个差异基因，本发明人发现，Bcl-3的mRNA在肾纤维化早期就有显著的高表达，具有十分明显的优势。
实施例2、异常表达基因的筛选
实验选用6-8周雄性C57-WT小鼠进行左侧单侧输尿管结扎，对于对照组小鼠进行假手术，结扎15天之后取出两侧的肾脏。实验选用4.0的手术线进行结扎或者游离结扎。
输尿管结扎15天的小鼠左侧的肾脏与对侧肾脏相比，肾盂中尿液大量积聚，肾脏皮质区变薄，肾盂肾盏明显扩张，肾实质部分萎缩，肾小管和间 质结构消失，皮质髓质之间的界限分不清楚，纤维化程度十分明显，如图2A。
本发明人对假手术组的左肾及右肾和结扎15天小鼠的左肾和右肾进行H&E及Sirius染色，观察单侧输尿管结扎后肾脏皮质区整体的结构及形态学的改变。染色结果表明：与假手术组的肾脏及其对侧肾脏相比，结扎15天后的肾脏肾小管上皮细胞空泡变性、坏死，小管萎缩，间质细胞浸润，肾小球系膜细胞增多，肾小管间质部分充满一些炎症细胞及细胞碎片，间质部分纤维化程度剧烈，同时结扎15天小鼠的对侧肾脏与假手术组的肾脏相比没有明显差别，如图2B。
免疫组织化学法观察实验组和对照组肾脏中平滑肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果发现，与假手术组及对侧肾脏相比，结扎一侧肾脏皮质区的肾小管及间质区细胞浆内α-SMA(由Acta2编码)表达明显，而肾小球没有明显表达，如图2C。
在肾纤维化的发生发展过程中TGF-β信号通路的活化，会有部分表皮细胞向间质细胞转化(EMT)。因此，本发明人抽提了结扎一侧肾脏及对侧肾脏的mRNA，通过RT-PCR的方法检测了已有报道的肾脏纤维化的标志分子(如，Wfdc2，Snai1)、表皮及间质细胞表达的标志分子和TGF-β信号通路相关的一些基因，这些基因均有明显的高表达，如图2D。
另外，本发明人也检测了NF-kB信号通路相关的一些基因，发现与对侧肾脏相比在纤维化的肾脏中Bcl-3的mRNA有显著的高表达。
实施例3、检测结扎不同时间点的小鼠肾纤维化模型中Bcl-3的表达
如前实施例，本发明人在mRNA水平上检测结扎15天的肾脏与其对侧肾脏中一些基因的表达，确定了在纤维化的肾脏中Bcl-3有显著高表达，如图2D。之后，本发明人想探讨Bcl-3开始差异表达的时间。本发明人对小鼠左侧输尿管结扎不同天数(1，3，7，11，15天)，构建结扎不同时间点的模型。具体如下：
如图3A，选用6-8周雄性C57-WT小鼠(n＝40，体重20-25g)，这些小鼠被随机地分成六组(即：结扎1，3，7，11，15天和假手术组)，结扎不同时间点的实验组每组5只，对应的假手术组每组3只。在手术前对小鼠进行麻 醉(5％戊巴比妥钠，30mg/kg)，然后统一对小鼠的左侧输尿管进行结扎或假手术操作。实验选用4.0的手术线进行结扎或者游离结扎。在一定时间后对小鼠进行安乐死，剖开腹腔取出肾脏用PBS冲洗之后用液氮研磨的方法磨碎后直接冻于液氨以用于后续实验。
对小鼠左侧输尿管结扎不同时间点后取出其左侧及右侧肾脏如图3B所示，并检测模型中Bcl-3的mRNA表达水平。结果发现：在结扎1天时，以假手术组作为对照UUO组结扎一侧肾脏与对侧肾脏相比Bcl-3的mRNA有两倍以上的高表达(图3C，3D，3E)；在结扎3天时，与Wfdc2，Snai1相比Bcl-3的mRNA差异表达已经十分显著(图3F，3G，3H)，在mRNA水平上作为诊断早期肾纤维化的标志物具有十分明显的优势。
实施例4、检测结扎不同时间点的纤维化模型中Bcl-3蛋白表达水平
对结扎不同时间点及假手术组的小鼠的肾脏组织切片进行H&E和Sirius red染色。结果表明，在结扎3天的小鼠肾脏开始出现轻微的肾纤维化，在结扎7天的小鼠肾脏的肾小球和肾小管已经出现严重的形态学上的改变，纤维化已经十分剧烈，如图4A，4B。本发明人通过免疫组化的方法分析了结扎不同时间点的肾脏中α-SMA(由Acta2编码)，HE4(由Wfdc2编码)以及Bcl-3的表达情况。
结果发现，作为纤维化的标志分子，胞浆内α-SMA表达明显地随着时间呈梯度上调，如图4C；作为已经报道并应用于临床的肾纤维化标志物，HE4的蛋白水平在结扎7天以后才开始有所上调，如图4D；而Bcl-3的蛋白水平在结扎3天时就开始上调。
因此，在蛋白水平上Bcl-3作为检测早期肾纤维化具有显著优势。
实施例5、用免疫印迹(WB)的方法检测结扎不同时间点的肾纤维化模型组织及血清中Bcl-3的蛋白表达水平
在用RT-PCR以及IHC的方法分析了不同时间点的小鼠肾纤维化模型中Bcl-3的表达情况后，本发明人又用WB的方法检测结扎不同时间点的小鼠肾纤维化模型组织及血清中Bcl-3的蛋白表达水平。
首先，本发明人用WB的方法检测结扎不同时间点的小鼠肾纤维化模型组织中TypeI collagen(由Col1a1编码)，α-SMA，HE4以及Bcl-3的表达情况，TypeI collagen和α-SMA表达明显地随着时间成梯度上调，如图5A，这与之前的免疫组化的结果一致(图4A，4B)。
同时，本发明人也检测了这些组织中的HE4以及Bcl-3的表达情况，发现：与HE4在第7天有上调相比，Bcl-3蛋白水平在3天就有显著上调，如图5A，这也与之前的组化结果一致(图4D)。
同时，本发明人对这些WB结果进行了定量分析(图5B，5C)。然后，本发明人用WB的方法检测结扎不同时间点的小鼠肾纤维化模型血清中Bcl-3的蛋白表达水平，结果表明血清中Bcl-3的蛋白表达水平在3天就有显著上调，如图5D，与HE4相比具有一定的优势，如图5F。
然后，本发明人对此结果也进行了量化，如图5E，5G。
上述结果表明，Bcl-3不但可以作为早期诊断的标志物，更可以作为肾纤维化液体活检的标志物。
实施例6、用Western Blotting(WB)的方法检测结扎肾纤维化病人血清中Bcl-3的蛋白表达水平
本实施例中，本实验收集了25个正常人的血清以及31个患有不同程度慢性肾脏疾病的病人血清，根据eGFR的指标将这些病人分成四组(CKD2，CKD3，CKD4，CKD5；数字由小到大表示肾纤维化的进程由早到晚)。对他们的年龄和性别进行统计并检测了一些肾纤维化的临床指标，包括血清胱抑素，血肌酸酐，尿素氮以及HE4的含量。这些受试者的具体分组信息如表2所示。
收集该25个正常人和31个肾纤维化病人(CKD)的血清
表2、病人分组信息及一些检测指标
Figure DEST_PATH_GDA0001294365300000161
Figure DEST_PATH_GDA0001294365300000171
*：31个病人及其对应的正常人的年龄组成的两组数据间p＝0.067。
本发明人用WB的方法分析了不同个体血清中Bcl-3和HE4的蛋白表达水平(每孔1μL)。结果如图6A，与对照组相比，CKD病人血清中Bcl-3蛋白表达水平明显上调。图中列出了其中的9个CKD病人及相应的9个正常人的血清WB图。
通过WB的方法检测31个CKD病人及相对应的正常人血清(1微升)中Bcl-3的含量后通过测定条带的灰度值对WB图中条带结果进行量化处理。结果如图6B。
通过WB的方法检测31个CKD病人及相对应的25个正常人血清(1微升)中HE4和Bcl-3的含量后，通过测定条带的灰度值对WB图中条带结果进行量化处理，最后通过皮尔森相关系数分析这31个CKD病人及25个正常人血清中HE4和Bcl-3含量的相关性及相关P值。结果如图6C，表明两者相关性显著。
本发明人分析了21个病人的血清(CKD2，CKD3)以及对应的正常人的血清。Bcl-3的ROC曲线面积为0.8322(p＝0.00023)，而HE4的ROC曲线面积为0.6984(p＝0.028)，如图6D。这表明，Bcl-3可以作为诊断早期肾纤维化的 标志物，且灵敏度更理想。
本发明人分析了31个病人的血清以及对应的25个正常人的血清。Bcl-3的ROC曲线面积0.7440(p＝0.00097)，而HE4的ROC曲线面积为0.6556(p＝0.035)，如图6E。这表明，Bcl-3可以作为诊断早期肾纤维化的标志物，且灵敏度更理想。
上述结果说明，病人血清中Bcl-3作为诊断肾纤维化的指标，与HE4相比，能够更为早期地测定出肾纤维化。
实施例7、Bcl-3在EMT调控网络中的作用
从细胞水平上看，肾纤维化发生的原因在于成纤维细胞在纤维化肾脏间质的聚集，而成纤维细胞主要来源于肾脏间质本身的成纤维细胞的增殖以及骨髓来源的成纤维细胞，另外还有一少部分来源于EMT的成纤维细胞在纤维化过程中也起着十分重要的作用，因此本发明人找到了83种在EMT过程中起主要作用的基因，并通过网站(http://genemania.org/)分析了在小鼠基因调控网中Bcl-3与这86种基因的关系(图7A)，由此本发明人发现在这83种基因中有22种基因与Bcl-3相互影响，其中有9种基因(如，Smad2/3，Stat3，Sox9等)与Bcl-3有共表达。网站预测的结果表明，在这22种基因中有16种基因(如，Tgfb1，Akt，Cd44，Gsk3b等)还可能与Bcl-3有共表达，共定位，直接结合等多种作用(图7B)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> Bcl-3作为诊断早期肾纤维化的标志物的应用
<130> 171952
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 1
gtgcagatga ggacggaga 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 2
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<211> 20
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<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 4
ccggaggccc tttactacc 19
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
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<211> 20
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<220>
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<211> 19
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<221> misc_feature
<223> 引物
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cacgtggaaa tcaacgggat 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 22
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<210> 23
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<212> PRT
<213> 人
<400> 23
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Arg Thr Arg Pro Lys Ala Ala Gly Leu Pro Gly Ala Ala Leu Pro Leu
20 25 30
Arg Lys Arg Pro Leu Arg Ala Pro Ser Pro Glu Pro Ala Ala Pro Arg
35 40 45
Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Pro Leu Asp Pro Leu Arg Gly Gly Cys
50 55 60
Asp Leu Pro Ala Val Pro Gly Pro Pro His Gly Leu Ala Arg Pro Glu
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Tyr Pro Gly Ala Leu Leu Pro Leu Tyr Pro Thr Arg Ala
85 90 95
Met Gly Ser Pro Phe Pro Leu Val Asn Leu Pro Thr Pro Leu Tyr Pro
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Met Met Cys Pro Met Glu His Pro Leu Ser Ala Asp Ile Ala Met Ala
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130 135 140
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225 230 235 240
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245 250 255
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275 280 285
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305 310 315 320
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325 330 335
Leu Lys Asn Cys His Asn Asp Thr Pro Leu Met Val Ala Arg Ser Arg
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<211> 448
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 24
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1 5 10 15
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20 25 30
Arg Pro Leu Arg Pro Ala Ser Pro Glu Pro Ala Thr Thr Arg Ser Pro
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Ser Pro Leu Ile His Ala Val Glu Asn Asn Ser Leu Asn Met Val Gln
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Arg Gly Pro Gly Arg Pro Val Pro Pro Ser Pro Ala Pro Gly Ser Ser
435 440 445

Claims (8)

1.特异性识别或结合Bcl-3蛋白的诊断试剂的用途，用于制备诊断肾纤维化的试剂盒；所述的肾纤维化是早期肾纤维化，所述早期肾纤维化是按照根据肾小球滤过率的指标，处于CKD3级或CKD2级的肾纤维化；所述诊断试剂或试剂盒为血清诊断试剂或血清诊断试剂盒。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的诊断试剂为特异性抗Bcl-3蛋白的抗体。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的特异性抗Bcl-3蛋白的抗体是单克隆抗体。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的特异性抗Bcl-3蛋白的抗体是多克隆抗体。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：蛋白免疫印迹试剂。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：酶链免疫反应试剂。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的酶链免疫反应试剂包括：显色液或杂交液。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：使用说明书。
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